CN114306588A

CN114306588A - Eb病毒疫苗及其应用

Info

Publication number: CN114306588A
Application number: CN202011070034.XA
Authority: CN
Inventors: 杨晓天
Original assignee: Basic Treatment Co ltd
Current assignee: Basic Treatment Co ltd
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-04-12
Also published as: WO2022068922A1

Abstract

本发明涉及预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病或癌症的疫苗、用途和方法。一方面，本发明涉及EB病毒疫苗，其包含细菌菌影和EB病毒抗原，用于预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病或癌症。另一方面，本发明涉及包含细菌菌影和EB病毒抗原的组合物在制备用于预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病或癌症的疫苗中的用途。另一方面，本发明涉及预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病或癌症的方法，包括向受试者施用预防有效量或治疗有效量的EB病毒疫苗。另一方面，本发明涉及制备包含细菌菌影和EB病毒抗原的疫苗的方法。

Description

EB病毒疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及预防或治疗EB病毒感染或其引发的疾病、肿瘤或癌症的疫苗、组合物、用途和方法。

背景技术

恶性疾病仍是世界各地的主要健康问题。未来20年内，全世界的肿瘤发病率将增长57％(1)。标准的癌症治疗策略，包括手术，化学疗法，放射疗法和靶向疗法，通常不会导致大多数患者(尤其是处于疾病晚期的患者)对疾病的长期控制。

当前的研究和临床数据表明，免疫系统，尤其是Th1型细胞毒性免疫反应，对于控制癌症的生长至关重要，因此对于当前的标准癌症治疗方法的治疗活性也至关重要(2-3)。一般认为，癌细胞逃避免疫监视的高能力是导致癌症治疗失败和疾病复发或发展的主要因素(4-5)。

肿瘤免疫疗法旨在通过引发针对肿瘤特异性肿瘤相关抗原(tumor associatedantigen，TAA)的功能强大的免疫反应来激活患者的免疫系统，这将使免疫抑制性肿瘤微环境偏向针对肿瘤的免疫活性状态，从而实现免疫介导的癌症控制，完全地或部分地消除残留的癌细胞或持久稳定的疾病(6)。

作为最有前途的免疫治疗方法之一，治疗性癌症疫苗接种旨在重新教育和重新激活树突状细胞(dendritic cell，DC)以启动抗肿瘤免疫应答。DC是最有效的专业抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)，具有出色的免疫刺激和免疫调节特性，并在维持主动免疫和免疫耐受之间的微妙平衡中起着至关重要的作用(7)。许多离体产生的基于DC的癌症疫苗已在临床试验中进行了测试(8)。选择合适的TAA和诱导最佳DC成熟都是治疗性癌症疫苗接种的关键步骤(7)。

细菌菌影(bacterial ghost，BG)是无生命的细菌空细胞膜，它是通过细胞包膜中的通道释放细菌细胞质而产生的。这些空细胞膜可通过在革兰氏阴性细菌中受控地产生噬菌体phi X174裂解蛋白E而生成(9-10)，或通过基于革兰氏阳性细菌中化学物质临界浓度的方法而生成(11-12)。

细菌菌影仍具有细菌细胞表面的完整的抗原结构，可以直接用作疫苗(13-15)。细菌菌影也是装载生物大分子(例如抗原，药物和DNA)的良好的递送系统(16-19)。更重要的是，细菌菌影包含众所周知的先天性免疫刺激成分，因此具有作为有效佐剂的巨大潜力。免疫应答的激发不仅取决于抗原的分子特性或宿主的免疫原性，还取决于抗原制剂的组成。因此，大多数疫苗制剂包含免疫调节成分，广泛地称为佐剂，以增强针对弱免疫原性抗原的免疫应答。佐剂可通过刺激宿主免疫系统细胞中的先天免疫受体来增强疫苗抗原的免疫原性(20-21)。细菌菌影保留了细菌菌影膜成分的抗原性，例如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，鞭毛蛋白，肽聚糖等，它们是各种模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)的配体，被统称为病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，因此与天然细菌的成分相同(18-19，22)。这些包膜结构可被免疫细胞和非免疫细胞有效地识别和吸收(23-25)，它们主要通过Toll样受体2(toll-like receptor 2，TLR2)和Toll样受体4(toll-like receptor，TLR4)途径刺激细胞(26-27)，存在于免疫细胞和非免疫细胞上的多个Toll样受体(TLR)构成了这些包膜结构佐剂活性的基础。因此，细菌菌影不仅是极好的抗原递送系统，而且还是治疗性疫苗的有效佐剂。此外，细菌菌影的颗粒性质使其成为吞噬抗原呈递细胞(如树突状细胞和巨噬细胞)的理想体内靶向载体。

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是最成功的病毒之一，可感染90％以上的人类并持续存在一生。EBV与淋巴或上皮起源的多种良性和恶性疾病有关(28)。像所有疱疹病毒一样，EBV在其生命周期中也有潜伏阶段和生产阶段(裂解阶段)，前者在宿主中长期维持病毒，而后者则影响病毒的产生和传播。一组独特的潜伏基因(EBNA1，EBNA2，EBNA3a，EBNA3b，EBNA3c，EBNA-LP，LMP1和LMP2)赋予EBV致癌潜能以及在体外诱导B淋巴细胞永生化的能力。尽管如此，EBV仍在全世界几乎每个人中建立了无害的终生感染，除非宿主病毒之间的平衡失调，否则很少引起疾病。

最近的数据表明，通过模仿B细胞抗原激活途径，病毒进入了长寿的记忆B细胞库，通过严格限制自身基因的表达来逃避免疫消除。EBV与多种人类恶性肿瘤的发展有关，包括伯基特氏淋巴瘤，霍奇金病，鼻咽癌，一些T细胞淋巴瘤，移植后淋巴增生性疾病，以及最近的某些恶性胃癌和平滑肌癌(29)。

由于EBV在癌症发展中的致病作用，近年来EBV已成为癌症治疗的目标，例如，将癌症作为传染病治疗(30-31)。例如，已证明潜伏膜蛋白(latent membrane protein，LMP)特异的自体细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)能有效地治疗复发的鼻咽癌患者(32)，基于LMP1的治疗性疫苗也抑制了小鼠模型中的肿瘤生长和转移(33)，还开发了用于人类癌症控制的基于EBV的疫苗，目前正对其进行临床试验，以评估其在经过初始治疗的鼻咽癌患者中预防复发的治疗性疫苗的效果(34)。

但是，这些疫苗未被用作预防疾病的预防性疫苗。迄今为止，预防性疫苗仅通过靶向EBV gp350针对传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)，而不针对EBV相关的恶性肿瘤(35-36)。

发明内容

一方面，本发明提供EB病毒疫苗，其包括细菌菌影和EB病毒抗原。在一些实施方式中，EB病毒抗原装载于细菌菌影内。在一些实施方式中，EB病毒抗原包括EB病毒裂解期蛋白、EB病毒潜伏期蛋白和/或EB病毒糖蛋白。在一些实施方式中，EB病毒抗原选自由EBNA1、LMP2a、gp350/220和BMRF1组成的组。在一些实施方式中，EB病毒抗原为EBNA1、LMP2a、gp350/220或BMRF1。在一些实施方式中，EB病毒抗原通过重组方式制备。在一些实施方式中，本发明的疫苗进一步包括一种或多种佐剂。在一些实施方式中，佐剂为TLR9激动剂。在一些实施方式中，佐剂装载于细菌菌影内。在一些实施方式中，本发明的疫苗进一步包括肿瘤细胞或癌细胞裂解物。在一些实施方式中，肿瘤细胞裂解物装载于细菌菌影内。在一些实施方式中，细菌菌影来源于革兰氏阳性菌。在一些实施方式中，本发明的疫苗用于人或哺乳动物。在一些实施方式中，本发明的疫苗可用于预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病、肿瘤或癌症。在一些实施方式中，EB病毒感染诱发的疾病、肿瘤或癌症包括传染性单核细胞增多症、艾滋病相关的淋巴增生性疾病、伯基特地方性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌。在一些实施方式中，本发明的疫苗为冻干品。在一些实施方式中，本发明的疫苗可用于预防或治疗黑色素瘤。

另一方面，本发明提供装载有EB病毒抗原的细菌菌影在制备用于预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病、肿瘤或癌症，或黑色素瘤的疫苗中的用途。在一些实施方式中，EB病毒抗原包括EB病毒裂解期蛋白、EB病毒潜伏期蛋白和/或EB病毒糖蛋白。在一些实施方式中，EB病毒抗原选自由EBNA1、LMP2a、gp350/220和BMRF1组成的组。在一些实施方式中，EB病毒抗原为EBNA1、LMP2a、gp350/220或BMRF1。在一些实施方式中，细菌菌影装载有一种或多种佐剂。在一些实施方式中，佐剂为TLR9激动剂。在一些实施方式中，细菌菌影装载有肿瘤细胞或癌细胞裂解物。在一些实施方式中，EB病毒抗原通过重组方式制备。在一些实施方式中，细菌菌影来源于革兰氏阳性菌。在一些实施方式中，疫苗的受试者为人或哺乳动物。在一些实施方式中，EB病毒感染诱发的疾病、肿瘤或癌症包括传染性单核细胞增多症、艾滋病相关的淋巴增生性疾病、伯基特地方性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、黑色素瘤和胃癌。在一些实施方式中，疫苗的受试者为未感染EB病毒的受试者，已感染EB病毒但未患有EB病毒诱发的疾病、肿瘤或癌症的受试者，或患有EB病毒诱发的疾病、肿瘤或癌症的受试者。在一些实施方式中，疫苗的受试者为未患有或已患有黑色素瘤的受试者。

另一方面，本发明提供治预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病、肿瘤或癌症，或黑色素瘤的方法，包括向受试者施用预防有效量或治疗有效量的本发明的EB病毒疫苗，施用方式、次数和剂量根据受试者的情况而定。在一些实施方式中，本方法的受试者为人或哺乳动物。在一些实施方式中，本方法能预防或治疗EB病毒感染、传染性单核细胞增多症、艾滋病相关的淋巴增生性疾病、伯基特地方性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、黑色素瘤和胃癌。在一些实施方式中，本方法的受试者为未感染EB病毒的受试者，已感染EB病毒但未患有EB病毒诱发的疾病、肿瘤或癌症的受试者，或患有EB病毒诱发的疾病、肿瘤或癌症的受试者。在一些实施方式中，本方法的受试者为未患有或已患有黑色素瘤的受试者。

另一方面，本发明提供将蛋白质装载至细菌菌影内的方法，所述方法包括：将蛋白质溶液加入冷冻干燥的细菌菌影中，孵育，冷冻，然后冷冻干燥过夜。在一些实施方式中，所述方法包括将蛋白质溶液加入冷冻干燥的细菌菌影中，在约4℃下孵育，然后在约-80℃下冷冻，然后冷冻干燥过夜。在一些实施方式中，所述方法包括：1)将细菌菌影溶液在约-80℃下冷冻约1小时，然后冷冻干燥过夜；2)将蛋白质溶液加入步骤1)中获得的冻干的细菌菌影中，并在约4℃下孵育约2小时，然后在约-80℃下冷冻约30分钟，然后冷冻干燥过夜。在一些实施方式中，蛋白质为病毒抗原。在一些实施方式中，病毒抗原为EB病毒抗原。在一些实施方式中，EB病毒抗原包括EB病毒裂解期蛋白、EB病毒潜伏期蛋白和/或EB病毒糖蛋白。在一些实施方式中，EB病毒抗原选自由EBNA1、LMP2a、gp350/220和BMRF1组成的组。在一些实施方式中，EB病毒抗原为EBNA1、LMP2a、gp350/220或BMRF1。在一些实施方式中，步骤2)中的蛋白质溶液进一步包含一种或多种佐剂。在一些实施方式中，步骤2)中的蛋白质溶液可为含有表达病毒抗原的肿瘤细胞的裂解物。在一些实施方式中，所述佐剂为TLR9激动剂。在一些实施方式中，细菌菌影来源于革兰氏阳性菌。在一些实施方式中，所述方法用于制备疫苗，特别是用于制备上述EB病毒疫苗，或用于制备上述用途或方法中所述的装载有EB病毒抗原的细菌菌影。在一些实施方式中，本方法的细菌菌影或蛋白质溶液为细菌菌影或蛋白质的水溶液，其可进一步包含药学上可接受的载体或使细菌菌影或蛋白质在冻干过程中保持稳定的稳定剂。

本发明通过将EB病毒特异性蛋白加载到细菌菌影中，设计了能预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病、肿瘤或癌症的疫苗。该疫苗满足有效疫苗的两个关键要求：肿瘤或癌症特异性抗原(EB病毒表达的病毒蛋白)和激活抗原呈递细胞(例如树突状细胞和巨噬细胞)的能力(细菌菌影上呈递的病原体相关分子模式可激活多个TLR)。如实施例所展示的，本发明的疫苗具有非常好的预防和治疗效果。本发明的疫苗为通用型广谱疫苗，通过选择在已知的EB病毒诱发的疾病、肿瘤和癌症中都表达的EB病毒特异性蛋白作为抗原，本发明的疫苗对已知的EB病毒诱发的疾病、肿瘤或癌症的都能产生预防和治疗效果。此外，本发明的抗原装载采用冻干方式，不仅其抗原装载量远远高于常规方法，并且具有释放动力学上的优势。具体地，由于从递送载体注射到体内到被抗原呈递细胞吞噬需要一定的时间，理想的递送载体对抗原蛋白的释放不能过快，而根据本发明制备的装载有蛋白的细菌菌影的释放时间表，其被抗原呈递细胞吞噬时依然能释放足够的抗原蛋白。进一步地，由于本发明的最终产品是冻干产品，短途运输或短期保存(一个月内)不需要冷链运输或低温保存，而目前的疫苗产品都需要冷链保存运输。更进一步地，本发明的疫苗直接皮下注射到体内产生免疫反应，对比现有技术需要先在体外与树突状细胞产生反应来形成树突状细胞疫苗具有许多优点。具体而言，当前大多数治疗性肿瘤或癌症疫苗都需要使用在体外衍生自外周血单核细胞的树突状细胞，并在体外将抗原装载至这些树突状细胞内然后将其注射回患者体内。由于这些疫苗本质上是树突状细胞，因此需要一直保存在-80℃下直至使用。而本发明的基于细菌菌影的疫苗利用了抗原呈递细胞对颗粒状物质的独特吞噬能力，其中细菌菌影不仅充当抗原装载载体，而且能在体内将抗原有效地、特异性地递送至抗原呈递细胞。此外，细菌菌影上的病原体相关分子模式也会在体内激活抗原呈递细胞。本发明的疫苗由细菌菌影和抗原蛋白组成，因此可以在室温下短时间保存，长期保存的条件为4℃。

发明详述

“EB病毒”(Epstein-Barr virus，EBV)(又称“爱泼斯坦-巴尔病毒”)是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员，基因组为DNA。EB病毒是传染性单核细胞增多症的病原体，还可能导致各种非恶性、恶变前和恶性的淋巴增生性疾病(例如伯基特淋巴瘤、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、艾滋病相关的淋巴增生性疾病)、非淋巴瘤恶性肿瘤(例如胃癌和鼻咽癌)以及与人类免疫缺陷病毒相关的疾病(例如毛状白斑和中枢神经系统淋巴瘤)。该病毒还与爱丽丝梦游仙境综合症和急性小脑共济失调的儿童期疾病有关，并且可能使罹患某些自身免疫性疾病的风险升高，特别是皮肌炎、系统性红斑狼疮、类风湿病关节炎、干燥综合征和多发性硬化症。本文中使用的“EB病毒”应当被理解为涵盖各种种类的EB病毒，例如EB病毒种类1(EBV type 1或EBV-1)，EB病毒种类2(EBV type 2或EBV-2)。

“抗原”指能引起免疫系统产生针对其的免疫反应或抗体的任何物质，包扩大分子化学物质、小分子化学物质、有机物质、无机物质、病毒、细菌、花粉、肿瘤细胞相关抗原、蛋白质、RNA、DNA等。

“EB病毒抗原”指来自EB病毒的抗原，其可包括完整的EB病毒和来自EB病毒的任何的完整的或不完整的物质，例如DNA、RNA、蛋白质等。在一些实施方式中，所述RNA包括各种非编码RNA，例如EBV编码的小RNA(EBV-encoded small RNA，EBER)(例如EBER1、EBER2)、BamHI-A向右转录(BamHI-A Rightward Transcript，BART)RNA、BamHI-H向右框架1(BamHI-H Rightward Frame 1，BHRF1)miRNA和BART miRNA。在一些实施方式中，所述蛋白质为EB病毒裂解期蛋白、EB病毒潜伏期蛋白和/或EB病毒糖蛋白。

“EB病毒糖蛋白”指EB病毒表达的含有碳水化合物基团的蛋白，其包括的具体蛋白是本领域技术人员所熟知的，例如：gp350/220、gB、gH、gL、gp42、gM、gN、BMRF2、BDLF2、BDLF3、BILF2、BILF1、BARF1等。

“EB病毒裂解期蛋白”指EB病毒在裂解期(lytic phase/lytic cycle)表达的蛋白，其包括的具体蛋白是本领域技术人员所熟知的，例如：：BMLF1、BMRF1、BNRF1、BORF1、BcLF1、BXLF1、Zta、Rta、BGLF5/DNase、BALF3、BARF等。

“EB病毒潜伏期蛋白”指EB病毒在潜伏期(latency)表达的蛋白，其包括的具体蛋白是本领域技术人员所熟知的，例如：BZLF1、BRFL1、BMRF1、BcRF1、EBNA2、BHRF1、EBNA-LP、EBNA1、EBNA2、EBNA3a、EBNA3b、EBNA3c、EBNA-LP、LMP1、LMP2a、LMP2b等。

“细菌菌影”(bacterial ghost，BG)(又称“细菌菌蜕”)指不包含核酸及细胞质等细胞内容物的的细菌空壳。细菌菌影可来源于革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。制备细菌菌影的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，基于噬菌体PhiX174的裂解基因E表达裂解蛋白的方法，其包括将裂解基因E克隆至表达调控系统，实现裂解基因E的可控表达，从而裂解革兰氏阴性菌。裂解基因E的表达调控系统已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎克雷伯氏菌、幽门螺旋杆菌、胸膜肺炎放射杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、迟钝爱德华菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌等。又如，也可采用非依赖裂解基因E的化学制备方法，化学制备方法突破了依赖裂解基因E制备菌影的局限性，能有效地应用于革兰氏阳性菌，例如，金黄葡萄球菌、斯特菌菌、肺炎链球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌及破伤风杆菌等。本发明的细菌菌影包括各种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的菌影，例如，各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎克雷伯氏菌、幽门螺旋杆菌、胸膜肺炎放射杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、迟钝爱德华菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、金黄葡萄球菌、斯特菌菌、肺炎链球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌及嗜酸乳杆菌等的菌影。

“佐剂”指同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质，其包括的具体物质是本领域技术人员所熟知的，例如：Toll样受体激动剂、铝盐、磷酸钙、水包油乳液、弗氏佐剂、灭活的细菌、细胞因子IL-1、IL-2、IL-12等。

“激动剂”通常是指结合细胞受体并诱导应答的物质。此类应答可能是由受体介导的活性的增加。激动剂通常模拟天然存在的物质(如配体)的作用。

“TLR9激动剂”指Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR9)的激动剂。TLR9识别特定的未甲基化的CpG寡核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)序列，以区分微生物DNA和哺乳动物DNA，因此TLR9激动剂包括各种CpG ODN。示例性TLR9激动剂在美国专利号8,420,615、7,566,702、7,498,425、7,498,426、7,405,285、7,427,405中有描述，包括各自的表1和2A-2D，其全部内容通过引用以其整体并入本文。

“肿瘤细胞裂解物”或“癌细胞裂解物”指肿瘤细胞或癌细胞经裂解处理后获得的细胞内容物。制备肿瘤细胞或癌细胞裂解物的方法是本领域熟知的。本发明的细胞裂解物可由本领域的常规方法制得，例如，机械裂解法(热休克法，超声波法等)；化学裂解法，包括使用包含去污剂的裂解缓冲液。本领域熟知的裂解缓冲液包括NP-40裂解缓冲液、RIPA裂解缓冲液、SDS裂解缓冲液、ACK裂解缓冲液等；本领域常见的去污剂包括Triton X-100，CHAPS等。用于制备裂解物的肿瘤细胞或癌细胞可经病毒转导或其他基因重组技术表达外源蛋白质，例如，各种本发明的抗原蛋白。肿瘤或癌细胞可来源于各种EB病毒感染诱发的肿瘤或癌症，包括传染性单核细胞增多症、艾滋病相关的淋巴增生性疾病、伯基特地方性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌；也可来源于黑色素瘤。肿瘤细胞或癌细胞裂解物由于包含肿瘤或癌症的抗原，能进一步激活免疫系统，增强免疫反应。

“疫苗”指包含抗原的生物制剂或药学制剂。本发明的疫苗包括预防性疫苗和治疗性疫苗，预防性疫苗可在病原体微生物感染前，或疾病、肿瘤或癌症出现前提供针对特定病原体微生物、疾病、肿瘤或癌症的获得性免疫力，预防性疫苗可在已感染病原体微生物后，或已出现某种疾病、肿瘤或癌症后治疗或防止该感染、疾病、肿瘤或癌症的恶化。在一些实施方式中，本发明的疫苗为冻干的产品，或为将冻干的产品重悬于药学上可接受的溶液或载体中获得的待注射的产品。本发明的冻干产品在制备时也可包含使用药学上可接受的载体或溶液。

“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，在合理的医学判断范围内，它们适用于接触人和动物组织，而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，具有合理的益处/风险比。

“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、配制助剂(例如润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或牵涉将本发明的肽从身体的一器官或部分携带或转运至身体另一器官或部分的溶剂包囊材料。载体各自必须是“可接受的”，其含义是与制剂的其它成分相容且对患者无害。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(9)乙醇；(20)pH缓冲溶液(例如PBS等)；(21)聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酐类；和(22)其它用于药物制剂的无毒性相容性物质。本发明的疫苗可以以各种剂型存在，包括液体剂型、冻干剂型、口服剂型等，并可根据相应的剂型合理地选择施用途径，例如，口服施用、皮内注射、皮下注射、肌内注射、静脉注射、鼻腔给药等。本发明的疫苗的用量、施用次数等可根据受试者的具体情况决定。

“治疗有效量”指使受试者产生免疫反应，并能缓解或治愈某种疾病、癌症、肿瘤的量，所述缓解是与不采用同一治疗剂的情况相比。

“预防有效量”指使受试者产生免疫反应，并能预防某种疾病、癌症、肿瘤的量。

“冷冻干燥”(“冻干”)指将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。冷冻干燥的方法和设备是本领域熟知的。

“约”在本文中的意思为所述数值的±20％、±18％、±15％、±12％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或±0.5％的范围，所述范围包扩所述范围的端点及所述范围内的任一数值。

“孵育”和“培养”在本文中可互换使用，都表示将反应物置于特定条件下一段时间。

附图说明

通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明，其中：

图1：A.荧光显微镜下用表达EBNA1和GFP的慢病毒转导的B16细胞；B.转导的或未转导的B16细胞的蛋白免疫印记分析

图2：不同的细菌菌影装载方法的蛋白装载量的荧光读数

图3：A.在荧光显微镜下装载有FITC-抗生物素蛋白的细菌菌影；B.细菌菌影的蛋白质释放动力学

图4：不同组小鼠的肺B16肿瘤结节的代表性图片；A.仅注射B16，B.仅注射细菌菌影，C.注射细菌菌影+EBNA1+ODN2395

图5：不同组小鼠(仅B16、仅细菌菌影、细菌菌影+EBNA1+ODN2395)的存活曲线

图6：A.荧光显微镜下用表达LMP2a和mCFP的慢病毒转导的B16细胞；B.转导的或未转导的B16细胞的蛋白免疫印记分析

图7：不同组小鼠(仅B16、仅细菌菌影、细菌菌影+B16、细菌菌影+LMP2a/B16)的存活曲线

图8：BG+gp350/220、gp350/220+弗氏完全佐剂、及BG免疫诱导的抗体滴度

图9：BG+BMRF1、BMRF1+弗氏完全佐剂、及BG免疫诱导的抗体滴度

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

实施例1：EBNA1/B16细胞系的构建

在24孔板的一个孔中，将5x 10⁴B16细胞接种在DMEM加10％FBS培养液中并培养过夜。随后以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为5的比例加入来自GenTarget(Cat#：LVP1134-GP)(加利福尼亚州，圣地亚哥)的表达EBV核抗原1基因(EBNA1)的慢病毒颗粒以转导B16细胞。转导24小时后，将嘌呤霉素以10μg/ml的浓度加入培养液中以选择转导成功的B16细胞，继续培养直到形成菌落并且在荧光显微镜下或流式细胞仪检测下菌落中所有细胞呈绿色(图1A)。使用蛋白质印记分析(Western blot)确认EBNA1在B16中表达(图1B)。一抗是来自Santa Cruz(sc-81581)的小鼠单克隆抗体。二抗是HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)。

实施例2：通过冷冻干燥法装载细菌菌影

细菌菌影制备：

菌影来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。首先测定几种化合物的临界浓度(氢氧化钠，碳酸钙，十二烷基硫酸钠)，然后通过化学法来制备菌影。基本的实验方案基于Chen et al.(FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE Volume 14，Number1，2017)。接下来的实施例中使用的细菌菌影都由此方法制备。

细菌菌影装载：

1)将5mg细菌菌影悬浮于ddH₂O中，然后在微量离心管中(Eppendorf tube)在-80℃下冷冻1小时，然后冷冻干燥过夜。

2)将200μl FITC-亲和素(sigma A2050)(200-350μg/100μl)加入步骤1)中获得的冻干的细菌菌影中，并在4℃下培养2小时，然后在-80℃下冷冻30分钟，然后冷冻干燥过夜，以将FITC-亲和素装载至细菌菌影内。

测定上述方法的蛋白质装载量：

将装载有200μl FITC-亲和素(sigma A2050)(200-350μg/100μl)的5mg细菌菌影用ddH2O洗涤3次，并在最终洗涤后将细菌菌影沉淀物用100μl B-PER^TM细菌蛋白提取试剂(Fisher Scientific)溶解，并在室温下培养15分钟。以15,000×g离心5分钟后，收集上清液用以测定细菌菌影中装载的亲和素蛋白。作为比较，200μl FITC-亲和素与5mg细菌菌影混合后在4℃培育过夜，然后细菌菌影用ddH2O洗涤3次，并在最终洗涤后将细菌菌影沉淀物同样用100μl B-PER^TM细菌蛋白提取试剂溶解，并在室温下培养15分钟。以15,000×g离心5分钟后，收集上清液用以测定细菌菌影中装载的亲和素蛋白。用WALLAC Victor2 1420多标记计数器测量荧光，每组重复三次，结果如图2所示：使用冻干方法装载的细菌菌影的荧光读数平均值为31078，远远高于使用4℃共同培养方法装载的细菌菌影的荧光度数平均值12098。

实施例3：细菌菌影的蛋白质释放动力学

2)将100μl FITC-亲和素(sigma A2050)(200-350μg/100μl)加入步骤1)中获得的冻干的细菌菌影中，并在4℃下培养2小时，然后在-80℃下冷冻30分钟，然后冷冻干燥过夜，以将FITC-亲和素装载至5mg细菌菌影中。图3A为在荧光显微镜下装载有FITC-亲和素的细菌菌影。

3)将步骤2)中获得的装载有FITC-亲和素的细菌菌影用ddH₂O洗涤3次，并在最终洗涤后重悬于200μl ddH₂O中。按前述步骤同时准备多个200μl的样品。每30分钟(即在0、30、60、90、120、150分钟时)，取其中一个样品，将重悬的细菌菌影以1000xg离心5分钟。弃掉上清液后，将细菌菌影沉淀物用100μl B-PER^TM细菌蛋白提取试剂(Fisher Scientific)溶解，并在室温下培养15分钟，以15,000×g离心5分钟后，收集上清液，并用WALLAC Victor21420多标记计数器测量荧光，结果如图3B所示。图3B的X轴代表时间点(分钟)，Y轴代表留存于细菌菌影内的蛋白质的量。从图3B中可以清楚地看出，在最初的30分钟内，虽然装载的蛋白的释放较快，但此后释放变得非常慢，这说明通过本发明的方法制备的装载有生物分子的细菌菌影具有释放动力学上的优势，因为从递送载体注射到体内到被抗原递呈细胞吞噬需要一定的时间，理想的递送载体对抗原蛋白的释放不能过快，而本发明制备的装载有抗原蛋白的细菌菌影被抗原递呈细胞吞噬时依然有足够的抗原蛋白。

实施例4：小鼠黑色素瘤转移模型中的预防性免疫

EBNA1蛋白装载：

1)将5mg细菌菌影悬浮于ddH₂O中，然后在微量离心管(Eppendorf tube)中在-80℃下冷冻1小时，然后冷冻干燥过夜。

2)将100μg重组EBNA1(Recombinant EBV Nuclear Antigen/EBNA1 protein(ab138345)from Abcam(Abcam，Cambridge，MA))和6μg TLR9激动剂ODN2395(Invivogen)溶于200μl ddH₂O。

然后将2)中获得的蛋白溶液经一次装载或两次装载装载到细菌菌影内。

a.一次装载：

3)将步骤2)中获得的200μl蛋白溶液加入步骤1)中获得的冻干的细菌菌影中，并在4℃下培养2小时，然后在-80℃下冷冻30分钟，然后冷冻干燥过夜。

b.两次装载：

3)取100μl步骤2)中获得的蛋白溶液，加入步骤1)中获得的冻干的细菌菌影中，并在4℃下培养2小时，然后在-80℃下冷冻30分钟，然后冷冻干燥过夜。

4)再将另100μl步骤1)中获得的蛋白溶液，加入上述步骤3)获得的冻干品中，并在4℃下培养2小时，然后在-80℃下冷冻30分钟，然后冷冻干燥过夜，以进一步将更多的重组蛋白装载到细菌菌影内。

小鼠免疫：

1)将上述获得的5mg装载有EBNA1和TLR9激动剂的细菌菌影重悬于150μl PBS中，并在辅助淋巴结附近皮内注射到1只C57BL/6J小鼠中，共注射5只小鼠作为实验组(BG+EBNA1+ODN2395)。对另5只C57BL/6J小鼠以相同方式每只注射5mg空细菌菌影(仅BG)，作为对照组。对另5只小鼠在与处理组相同的条件下进行培养并在与处理组相同的时间接种肿瘤细胞，作为对照组(仅B16)。

2)14天后再次用步骤1)的方案对小鼠进行注射。

3)在第二次注射7天后，对每只小鼠经静脉注射4x 10⁵B16肿瘤细胞。

4)小鼠静脉接受4x 10⁵B16肿瘤细胞三周后处死小鼠，并计数小鼠肺部B16肿瘤结节数，如表1所示。

图4为不同组小鼠的肺B16肿瘤结节的代表性图片；A：仅注射B16，B：仅注射细菌菌影；C：注射细菌菌影+EBNA1+ODN2395

表1：不同组小鼠的B16肿瘤结节数平均值

治疗方案	B16肿瘤结节数
		仅B16	＞120，＞120，＞120，＞120，＞120
仅BG	32，45，39，35，40
		BG+EBNA1+ODN2395	2，0，0，0，1

实施例5：小鼠黑色素瘤存活模型中的治疗性免疫

使用3组C57BL/6J小鼠(仅B16对照，n＝5，仅细菌菌影n＝5，和细菌菌影+EBNA1+ODN2395，n＝5)进行了存活研究，所有小鼠均通过静脉注射接受了5x 10⁵B16黑色素瘤细胞。对照组未接种疫苗，而其他治疗组则在注射肿瘤细胞1周后开始每周一次接受总共3次5mg细菌菌影+EBNA1+ODN2395疫苗或5mg细菌菌影注射。监控并记录小鼠的存活数据。

从存活曲线来看(图5)，仅B16组的中位存活天数为23天，仅细菌菌影组中位存活天数为23天，细菌菌影+EBNA1+ODN2395组中位存活天数为51天。对于仅B16注射组，在第21天死亡1例，在第23天死亡4例。对于仅细菌菌影注射组，在第23天死亡3例，在第26天死亡2例。对于细菌菌影+EBNA1+ODN2395疫苗组，第42天有1例死亡，第46天有1例死亡，第51天有1例死亡，第63天有1例死亡，最后一只小鼠在120天后仍然存活。

实施例6：LMP2a/B16细胞系的构建

LMP2a慢病毒表达载体的构建：

EBV LMP2a序列(GeneID：3783751)由Genscript(Piscataway，NJ，USA)合成并将ECOR I位点和Xho I位点整合到该序列的上游和下游中，并克隆到pUC57简单载体的ECORV位点中。用EcoRI和Xho I切割LMP2a序列，并将其克隆到同样用EcoR I和Xho I切割的pLenti-C-mCFP-P2A-BSD慢病毒基因表达载体(Origene，Rockville，MD，USA)中。使用Lenti-vpak包装试剂盒(Origene，Rockville，MD，USA)将所得的载体pLenti-C-mCFP-P2A-BSD-LMP2a转染到HEK293T细胞中。携带LMP2a的慢病毒颗粒用超纯慢病毒纯化试剂盒(Ultra-Pure Lentivirus Purification Kit)(Applied Biological Materials Inc，Richmond，BC，Canada)纯化，病毒滴度用qPCR慢病毒滴定(滴定)试剂盒(qPCR LentivirusTitration(Titer)Kit)(Applied Biological Materials Inc，Richmond，BC，Canada)测定。

LMP2a/B16细胞系的构建：

在24孔板的一个孔中，将5x 10⁴B16细胞接种至DMEM加10％FBS培养液中并培养过夜。以MOI为5的比例加入上述制备的表达LMP2a的慢病毒以转导B16细胞。转导24小时后，将杀稻瘟菌素(Blasticidin)以10μg/ml的浓度加入培养物中以选择转导成功的B16细胞，继续培养直至形成菌落并且在荧光显微镜下或通过流式细胞术检测下菌落中所有细胞呈红色(图6A)。使用蛋白质印记分析确认LMP2a在B16中表达(图6B)。一抗是来自Abcam(ab59028；Abcam，Cambridge，UK)的大鼠单克隆抗体。二抗是HRP偶联的山羊抗大鼠IgG(H+L)(ab205720)。

实施例7：小鼠黑色素瘤转移模型中的预防性免疫

准备B16裂解物：

对在T25培养瓶中长满的B16细胞离心沉淀，并加入200μl0.5％Tritonx-100，将沉淀在冰上静置30分钟。在Eppendorf5417R离心机上以14000rpm的转速在4℃下离心20分钟。检测上清中蛋白质浓度并将最终浓度调整为10μg/μl。

小鼠免疫：

1)根据实施例2或4中装载细菌菌影的方法，将B16肿瘤细胞裂解物或用LMP2a慢病毒转导的B16肿瘤细胞裂解物以100μg裂解物/5mg细菌菌影装载到细菌菌影中。

2)将装载不同裂解物的5mg的细菌菌影重悬于150μl的PBS中，并在辅助淋巴结附近皮内注射到C57BL/6J小鼠中。对5只小鼠分别注射5mg装载有B16/LMP2a肿瘤细胞裂解物的细菌菌影作为实验组(LMP2a/B16+BG)，对另5只小鼠分别注射5mg装载有B16肿瘤细胞裂解物的细菌菌影(B16+BG)，对另5只小鼠分别注射5mg空细菌菌影作为对照(仅BG)。对另5只小鼠在与处理组相同的条件下进行培养并在与处理组相同的时间接种肿瘤细胞，作为对照组(仅B16)。

3)第14天后再次用步骤2)的方案再对小鼠进行注射。

4)在第二次注射7天后，对每只小鼠经静脉注射4x 10⁵B16肿瘤细胞。

5)三周后处死小鼠，并计数B16肿瘤结节数，如表2所示。

表2：不同组小鼠的B16肿瘤结节数平均值

治疗方案	B16肿瘤结节数
		LMP2a/B16+BG	1，0，2，0，1
B16+BG	3，2，1，4，2
		仅BG	＞100，＞100，＞100，＞100，＞100
仅B16	＞120，＞120，＞120，＞120，＞120

实施例8：小鼠黑色素瘤存活模型中的治疗性免疫

使用4组C57BL/6J小鼠(仅B16对照，n＝5；仅细菌菌影，n＝5；细菌菌影+B16裂解物，n＝5；细菌菌影+LMP2a/B16裂解物，n＝5)进行存活研究。所有小鼠均通过静脉注射接受5x 10⁵B16黑色素瘤细胞。仅B16对照组不接种疫苗，而其他治疗组则在注射肿瘤细胞后1周开始接受每周1次的3次疫苗接种。监控并记录小鼠的存活数据。

从存活曲线来看(图7)，仅B16组的中位存活天数为23天，仅细菌菌影组的中位存活天数为23天，细菌菌影+B16组的中位存活天数为34天，细菌菌影+LMP2a/B16组的中位存活天数为51天，其中2只小鼠存活超过120天。

实施例9：用EBV gp350或EBV BMRF1蛋白进行小鼠免疫和抗体滴度测量

EBV感染可诱导病毒蛋白的特异性抗体和T细胞。糖蛋白gp350是针对B细胞EBV感染的中和抗体的主要靶标。注射gp350抗体可预防免疫受损小鼠模型中的淋巴增生性疾病。gp42抗体也可以中和B细胞的感染，而gH/gL和BMRF1的抗体可以中和上皮细胞的EBV感染。

将重组EBV gp350/220(RBD，a.a.4-450)[His](Creative diagnostics，NY11967，USA)和重组EBVBMRF1蛋白(MyBiosource(cat#MBS1003113)(MyBiosourceinc.，SanDiego，CA))用于小鼠免疫。将重组EBV gp350/220或重组EBV BMRF1蛋白以10μg蛋白/5mg细菌菌影的浓度装载到细菌菌影中。

使用5组C57BL/6J小鼠，没组6只。给一组小鼠皮下注射装载有重组EBV gp350/220的细菌菌影(5mg/小鼠)，给另一组小鼠皮下注射装载有重组EBV BMRF1的细菌菌影(5mg/小鼠)，给另一组小鼠皮下注射EBV gp350/220加上弗氏完全佐剂(Imject^TM Freund′sComplete Adjuvant，Fisher Scientific)(1∶1混合)(10μg蛋白/小鼠)，给另一组小鼠皮下注射EBV BMRF1加上弗氏完全佐剂(1∶1混合)(10μg蛋白/小鼠)，给另一组小鼠皮下注射空细菌菌影(5mg细菌菌影/小鼠)。14天后，以同样的方案进行第二次注射。第二次注射14天后，从小鼠尾巴中收集血清，并用涂有重组EBV gp350/220或重组EBV BMRF1蛋白(浓度为1μg蛋白/ml)的ELISA板进行ELISA分析。

通过酶联免疫吸附测定法确定了针对重组EBV gp350/220或重组EBV BMRF1蛋白的抗体滴度。将涂有100μl重组EBV gp350/220或重组EBV BMRF1蛋白每孔的96孔Costar平板置于4℃过夜。洗涤并用封闭液培养后，将100μl不同稀释度的血清添加到每个孔中。使用碱性磷酸酶偶联的二抗和TMB底物进行显色。用ELISA读取器记录450nm的OD值(图8-9)。

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Claims

1.EB病毒疫苗，其包括细菌菌影和EB病毒抗原。

2.权利要求1所述的疫苗，其中所述EB病毒抗原装载于所述细菌菌影内。

3.权利要求1或2所述的疫苗，其中所述EB病毒抗原包括EB病毒裂解期蛋白、EB病毒潜伏期蛋白和/或EB病毒糖蛋白。

4.权利要求1-3中任一项所述的疫苗，其中所述EB病毒抗原选自由EBNA1、LMP2a、gp350/220和BMRF1组成的组。

5.权利要求1-4中任一项所述的疫苗，其中所述EB病毒抗原为EBNA1、LMP2a、gp350/220或BMRF1。

6.权利要求1-5中任一项所述的疫苗，其进一步包括一种或多种佐剂。

7.权利要求1-6中任一项所述的疫苗，其中所述佐剂为TLR9激动剂。

8.权利要求1-7中任一项所述的疫苗，其中所述TLR9激动剂装载于所述细菌菌影内。

9.权利要求1-8中任一项所述的疫苗，其可用于人或哺乳动物。

10.装载有EB病毒抗原的细菌菌影在制备用于预防或治疗EB病毒感染或其诱发的疾病或癌症的疫苗中的用途。

11.权利要求10所述的用途，其中所述EB病毒抗原包括EB病毒裂解期蛋白、EB病毒潜伏期蛋白和/或EB病毒糖蛋白。

12.权利要求10或11所述的用途，其中所述EB病毒抗原选自由EBNA1、LMP2a、gp350/220和BMRF1组成的组。

13.权利要求10-12中任一项所述的用途，其中所述EB病毒抗原为EBNA1、LMP2a、gp350/220或BMRF1。

14.权利要求10-13中任一项所述的用途，其中所述细菌菌影装载有一种或多种佐剂。

15.权利要求10-14中任一项所述的用途，其中所述佐剂为TLR9激动剂。

16.权利要求10-15中任一项所述的用途，其中所述疫苗的受试者为人或哺乳动物。

17.权利要求10-16中任一项所述的用途，其中所述EB病毒感染引发的疾病或癌症为传染性单核细胞增多症、艾滋病相关的淋巴增生性疾病、伯基特地方性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌。

18.将蛋白质装载至细菌菌影内的方法，所述方法包括：

将蛋白质溶液加入冷冻干燥的细菌菌影中，孵育，冷冻，然后冷冻干燥过夜。

19.权利要求18所述的方法，所述蛋白质为病毒抗原。

20.权利要求18或19所述的方法，其中所述病毒抗原为EB病毒抗原。

21.权利要求20所述的方法，其中所述EB病毒抗原包括EB病毒裂解期蛋白、EB病毒潜伏期蛋白和/或EB病毒糖蛋白。

22.权利要求21所述的方法，其中所述EB病毒抗原选自由EBNA1、LMP2a、gp350/220和BMRF1组成的组。

23.权利要求22所述的方法，其中所述EB病毒抗原为EBNA1、LMP2a、gp350/220或BMRF1。

24.权利要求19-23中任一项所述的方法，所述蛋白质溶液进一步包括一种或多种佐剂。

25.权利要求24所述的方法，其中所述佐剂为TLR9激动剂。

26.权利要求18-25中任一项所述的方法，用于制备疫苗。