CN108392499A - 一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：S1、粉碎：将自然晒干的海藻粉碎后，密封保存；S2、浸提：称取藻粉38～42g，加入到800ml的乙醇溶液中，浸泡提取2～4天后抽滤，得到滤液；S3、蒸发浓缩：将滤液在38～42℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至近干；S4、冷冻干燥：用少量乙醇溶液溶解后转移至收集管内，经冷冻干燥后，得到海藻的乙醇提取物，保存于‑42～‑38℃冰箱中备用。本发明的优点在于：海藻提取物具有抗病毒效果显著、成分天然易吸收以及毒性小等特点，尤其是浓度为40mg/kg的羊栖菜提取物，到180h死亡率仍低于10％，呈现出了极佳的抗病毒效果。

Description

一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及，特别是一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法。
背景技术
对虾养殖业是我国沿海省份水产养殖的支柱产业，但是病毒性疾病尤其是白斑综合征病毒(WSSV)近年来对我国对虾养殖业造成了很大打击，目前国内养殖较广泛的南美白对虾总体养殖成活率也已经跌至50％以下，至今仍无有效的防治手段，严重威胁着对虾养殖业的可持续发展。该病目前已经发展为一种常见的潜伏性病毒病原，且可以感染多种甲壳动物包括青蟹，会导致感染青蟹的直接死亡以及感染后长期的免疫力水平低下，开发一种能抗白斑综合征病毒的制剂对于青蟹养殖的健康发展至关重要。海藻是海洋中常见的植物，其中含有多种抗病毒、抗细菌、抗肿瘤的活性物质，如海藻多糖类、多酚类、蛋白类、萜类、甾醇类物质，是现代医药学研究的热点领域。但是关于海藻提取物抗白斑综合征病毒的研究报道还比较少，海藻提取物是海洋中的天然产物，很容易被青蟹等海洋生物所吸收和利用，相关领域有很大的开发前景。化学制剂如色醇对甲壳动物多少有一些毒性作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1、粉碎：将自然晒干的海藻粉碎后，密封保存；
S2、浸提：称取藻粉38～42g，加入到800ml的乙醇溶液中，浸泡提取2～4天后抽滤，得到滤液；
S3、蒸发浓缩：将滤液在38～42℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至近干；
S4、冷冻干燥：用少量乙醇溶液溶解后转移至收集管内，经冷冻干燥后，得到海藻的乙醇提取物，保存于-42～-38℃冰箱中备用。
进一步地，步骤S1中，海藻粉碎后，其粒度在200～400目之间。
进一步地，步骤S2中，所述乙醇溶液为体积浓度为85％的乙醇溶液。
进一步地，步骤S2中，浸提时，得到的滤渣再重复浸提一次，将再次浸提得到的滤液与初次浸提得到的滤液合并。
进一步地，步骤S2中，浸提时，每天摇瓶1～2次。
进一步地，步骤S3中，旋转蒸发仪在浓缩过程中，减压至400～600mm汞柱，旋转转速为50～160rpm。
进一步地，所述海藻为羊栖菜。
本发明具有以下优点：
1、相对于传统的化学制剂和复方中草药制剂，海藻提取物具有抗病毒效果显著、成分天然易吸收以及毒性小等特点，尤其是浓度为40mg/kg的羊栖菜提取物，到180h死亡率仍低于10％，呈现出了极佳的抗病毒效果，能有效地降低青蟹的死亡率。
附图说明
图1为本发明的不同海藻提取物的WSSV感染死亡率示意图；
图2为本发明的不同浓度的羊栖菜提取物的WSSV感染死亡率示意图一；
图3为本发明的不同浓度的羊栖菜提取物的WSSV感染死亡率示意图二。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
【实施例1】
一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1、粉碎：将自然晒干的海藻粉碎后，用400目筛过滤，使其粒度为400目，密封保存；
S2、浸提：称取藻粉38g，加入到800ml的乙醇溶液中，乙醇溶液为体积浓度为85％的乙醇溶液，浸泡提取2天后抽滤，每天摇瓶1次，得到的滤渣再重复浸提一次，将再次浸提得到的滤液初次浸提得到的滤液合并，得到滤液；
S3、蒸发浓缩：将滤液在38℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至近干，旋转蒸发仪在浓缩过程中，减压至400mm汞柱，旋转转速为160rpm；
S4、冷冻干燥：用少量乙醇溶液溶解后转移至收集管内，使用乙醇溶液的量以刚好溶解为准，经冷冻干燥后，得到海藻的乙醇提取物，保存于-38℃冰箱中备用。
所述海藻为羊栖菜。
【实施例2】
一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1、粉碎：将自然晒干的海藻粉碎后，用300目筛过滤，使其粒度为300目，密封保存；
S2、浸提：称取藻粉40g，加入到800ml的乙醇溶液中，乙醇溶液为体积浓度为85％的乙醇溶液，浸泡提取3天后抽滤，每天中午和晚上各摇瓶1次，得到的滤渣再重复浸提一次，将再次浸提得到的滤液初次浸提得到的滤液合并，得到滤液；
S3、蒸发浓缩：将滤液在40℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至近干，旋转蒸发仪在浓缩过程中，减压至500mm汞柱，旋转转速为100rpm；
S4、冷冻干燥：用少量乙醇溶液溶解后转移至收集管内，经冷冻干燥后，得到海藻的乙醇提取物，保存于-40℃冰箱中备用。
所述海藻为羊栖菜。
【实施例3】
一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1、粉碎：将自然晒干的海藻粉碎后，用200目筛过滤，使其粒度为200目，密封保存；
S2、浸提：称取藻粉42g，加入到800ml的乙醇溶液中，乙醇溶液为体积浓度为85％的乙醇溶液，浸泡提取4天后抽滤，每天中午和晚上各摇瓶1次，得到的滤渣再重复浸提一次，将再次浸提得到的滤液初次浸提得到的滤液合并，得到滤液；
S3、蒸发浓缩：将滤液在42℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至近干，旋转蒸发仪在浓缩过程中，减压至600mm汞柱，旋转转速为50rpm；
S4、冷冻干燥：用少量乙醇溶液溶解后转移至收集管内，经冷冻干燥后，得到海藻的乙醇提取物，保存于-42℃冰箱中备用。
所述海藻为羊栖菜。
【实施例4】
一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1、粉碎：将自然晒干的海藻粉碎后，用200目筛过滤，使其粒度为200目，密封保存；
S2、浸提：称取藻粉40g，加入到800ml的乙醇溶液中，乙醇溶液为体积浓度为85％的乙醇溶液，浸泡提取2天后抽滤，每天摇瓶1次，得到的滤渣再重复浸提一次，将再次浸提得到的滤液初次浸提得到的滤液合并，得到滤液；
S3、蒸发浓缩：将滤液在42℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至近干，旋转蒸发仪在浓缩过程中，减压至500mm汞柱，旋转转速为120rpm；
S4、冷冻干燥：用少量乙醇溶液溶解后转移至收集管内，经冷冻干燥后，得到海藻的乙醇提取物，保存于-42～-38℃冰箱中备用。
所述海藻为羊栖菜。
验证抗白斑综合征病毒的海藻提取物的有效性：
1、青蟹感染试验
健康的蟹随机分成20组(每组n＝16)，按照实验青蟹的体质量注射海藻提取物溶液，提取物注射量以mg提取物/kg青蟹体质量表示，提取物浓度梯度为1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg。海藻提取物+WSSV组注射不同浓度梯度的海藻提取物和WSSV。对照组单独注射磷酸盐缓冲液(PBS)(阴性对照)，WSSV组注射PBS和WSSV(阳性对照)。每天观察实验动物两次，观察疾病和死亡的临床症状，记录死亡个数。
为评价海藻提取物对感染WSSV病毒青蟹死亡率的影响，各组青蟹先后注射了不同剂量的海藻提取物后感染WSSV病毒。各组累计死亡率如图1所示。204小时以后，空白组(PBS组)累计死亡率为6％，对照组(WSSV组)累计死亡率为100％。204h实验结束后，羊栖菜组10mg/kg海藻提取物实验组最终死亡率分别为70％。其余的受试海藻提取物实验组攻毒后几无存活青蟹。
2、海藻提取物的注射最佳浓度测定
如图2所示，实验结果显示注射10mg/kg浓度的羊栖菜基本上没有明显效果，20mg/kg浓度的羊栖菜略微有部分效果，其中40mg/kg浓度的羊栖菜效果最明显，且到了180h死亡率仍低于10％，呈现出了很好的抗病毒效果。
如图3所示，实验效果显示注射10mg/kg浓度的羊栖菜提取物基本上没有明显效果，50mg/kg浓度的羊栖菜提取物效果最明显，但在168h的死亡率高于40mg/kg浓度的羊栖菜提取物作用于青蟹的死亡率；100mg/kg浓度的羊栖菜提取物的死亡率甚至高于单注WSSV组，说明此浓度的羊栖菜提取物已经对青蟹产生了较大的毒性，另外100mg/kg的羊栖菜基本上是最大溶解浓度。综合上述结果，最佳的羊栖菜提取物使用浓度应该是40mg/kg。

Claims (7)

1.一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、粉碎：将自然晒干的海藻粉碎后，密封保存；
S2、浸提：称取藻粉38～42g，加入到800ml的乙醇溶液中，浸泡提取2～4天后抽滤，得到滤液；
S3、蒸发浓缩：将滤液在38～42℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至近干；
S4、冷冻干燥：用少量乙醇溶液溶解后转移至收集管内，经冷冻干燥后，得到海藻的乙醇提取物，保存于-42～-38℃冰箱中备用。
2.根据权利要求1所述的一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，其特征在于：步骤S1中，海藻粉碎后，其粒度在200～400目之间。
3.根据权利要求1所述的一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述乙醇溶液为体积浓度为85％的乙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，其特征在于：步骤S2中，浸提时，得到的滤渣再重复浸提一次，将再次浸提得到的滤液与初次浸提得到的滤液合并。
5.根据权利要求1或4所述的一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，其特征在于：步骤S2中，浸提时，每天摇瓶1～2次。
6.根据权利要求1所述的一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，其特征在于：步骤S3中，旋转蒸发仪在浓缩过程中，减压至400～600mm汞柱，旋转转速为50～160rpm。
7.根据权利要求1所述的一种抗白斑综合征病毒的海藻提取物的制备方法，其特征在于：所述海藻为羊栖菜。
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郭媛媛，等: "转vp28蓝藻口服剂对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力及免疫反应的影响", 《水产学报》 *

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