CN115006532A - 蛋白酶体抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白酶体抑制剂的应用。本发明具体涉及蛋白酶体抑制剂在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用，所述蛋白酶体抑制剂为Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米和奥普佐米中的至少一种。本发明的发明人首次发现Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米、奥普佐米，均能特异且以nM的浓度的高活性显著抑制LPS致敏、Nigericin诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化，最终抑制caspase‑1的活化以及成熟IL‑1β的释放，对于临床治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病具有良好的防治作用，尤其是对于银屑病和腹膜炎，具有显著的防治效果。

Description

蛋白酶体抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及蛋白酶体抑制剂的应用。

背景技术

泛素-蛋白酶体信号通路参与调节真核细胞中的多种生理过程，如催化细胞内错误折叠蛋白质的降解，NF-kB信号转导通路、细胞周期的调控等。蛋白酶体由20S催化颗粒以及调节颗粒组成，20S核心颗粒与调节颗粒相互作用被激活后发挥对蛋白质的降解作用。蛋白酶体主要的存在形式26S蛋白酶体由一个20S核心颗粒以及两个19S调节颗粒组成。19S调节颗粒负责识别带有泛素链标记的蛋白质底物，将其去折叠并最终传送至20S核心颗粒中进行降解。20S催化颗粒由两个α外环和两个β内环，共28个蛋白质成员组成，其中，位于内环的β1，β2，β5是催化蛋白质降解的主要活性亚基，分别具有半胱氨酸蛋白酶样活性(Caspase-like)、胰蛋白酶样活性(Trypsin-like)、糜蛋白酶样活性(Chymotrypsin-like)，负责切断酸性、碱性、疏水氨基酸羧基端的肽链，能够抑制26S蛋白酶体活性的化合物称为蛋白酶体抑制剂。

本发明中的伊沙佐米是第一个可以口服的蛋白酶体抑制剂，是一种患者易接受和耐受的蛋白酶体抑制剂；卡非佐米是一种新型蛋白酶体抑制剂，可选择性地、不可逆地与组成型蛋白酶体和免疫蛋白酶体结合，临床上主要用于甲状腺未分化癌、乳腺癌、肝癌、套细胞淋巴瘤的治疗；Marizomib是一种脑渗透蛋白酶体抑制剂，被FDA批准用于恶性胶质瘤的治疗。炎症小体是宿主固有免疫系统的重要组成部分，是一类通过各种病原体感染或细胞压力刺激激活的高分子蛋白质复合物。NLRP3炎症小体是目前研究最为透彻的炎症小体，由三部分组成：Nod样受体家族含热蛋白结构域蛋白3(NLR family pyrin domain contains3；NLRP3)、ASC和pro-caspase-1。NLRP3炎症小体是一种模式识别受体(patternrecognition receptor；PRR)，能被多种危险相关分子模式(danger-associatedmolecular patterns；DAMP)和病原体相关分子模式(pathogen-associated molecularpatterns；PAMP)激活，包括晶体和颗粒物质(例如尿酸晶体，硅石，石棉和明矾)、细胞外ATP、成孔毒素以及病毒、细菌、真菌和原生动物病原体等。在细胞应对外界危险信号时，NLRP3能活化caspase-1，通过调节IL-1β和IL-18等促炎性细胞因子的成熟与释放，参与先天性免疫防御，但是，NLRP3炎症小体异常活化和功能失调，会与多种获得性炎症性疾病和遗传性NLRP3突变引起的自身免疫性疾病的病理过程密切相关，现有很多研究发现，NLRP3炎症小体的异常活化和功能失调，与银屑病、腹膜炎、自身免疫性疾病、神经退行性疾病的发生发展密切相关。尽管在基础研究中发现许多NLRP3炎症小体抑制剂，均能对NLRP3炎症小体相关的疾病都有一定的缓解作用，但现阶段发现的NLRP3炎症小体抑制剂的半数抑制活性大多数都在uM级别，并且目前尚无高效特异地抑制NLRP3炎症小体活化的药物上市。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供蛋白酶体抑制剂在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的新应用。

具体技术方案如下：

蛋白酶体抑制剂在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述蛋白酶体抑制剂为Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米和奥普佐米中的至少一种。

在其中一些实施例中，蛋白酶体抑制剂在制备防治NLRP3炎症小体活化相关疾病的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为皮炎。

在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为银屑病。

在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为腹膜炎。

在其中一些实施例中，所述腹膜炎为急性腹膜炎。

在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为盆腔炎。

在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为肝炎、脊柱炎、关节炎、肠炎、肺炎、心肌炎、阿尔兹海默症、石棉肺、硅肺、白塞病、紫外线所诱导的皮肤晒伤、接触性超敏反应、帕金森病、抑郁症、非酒精性脂肪肝病或酒精性肝病。

在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为肾病、家族性冷自发炎症综合征、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤和关节综合征、新生儿发作多系统炎性疾病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化、哮喘或急性呼吸窘迫征。

本发明的另一目的是提供一种防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物，包括活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分为蛋白酶体抑制剂。

在其中一些实施例中，所述活性成分为Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米或奥普佐米。

在其中一些实施例中，所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、乳液、溶液、悬浮液或酊剂。

在其中一些实施例中，所述辅料包括赋形剂、填料、增溶剂、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、悬浮剂、矫味剂或香料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人首次发现Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米、奥普佐米，均能特异性且在nM浓度下高效显著抑制LPS致敏、Nigericin诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化，最终抑制caspase-1的活化以及成熟IL-1β的释放，对于临床治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病具有良好的防治作用。同时，Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米、奥普佐米通过靶向NLRP3炎症小体活化能从根本上抑制IL-1、IL-18、IL-33和HMGB1等介导的相关疾病，取得更好更特异的药物治疗效果，对临床治疗NLRP3相关疾病具有重要意义，可用于相关药物开发。

附图说明

图1是Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米、奥普佐米对LPS+Nigericin诱导的J774A.1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的抑制作用的细胞培养上清中IL-1β抑制率统计图。

图2是Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米、奥普佐米对LPS+Nigericin诱导的J774A.1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的抑制作用的细胞培养上清中IL-1β的水平图(图中*表示统计P值的范围，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001)。

图3是地兰佐米、伊沙佐米对LPS+Nigericin诱导的J774A.1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的抑制作用的免疫印迹分析图。

图4是地兰佐米、伊沙佐米对LPS诱导的NF-kB信号通路的影响，图示为细胞培养上清中TNF-α的水平图。

图5是地兰佐米、伊沙佐米对LPS+沙门氏菌以及LPS+Poly A:T和诱导的J774A.1巨噬细胞NLRC4炎症小体(图A)和AIM2炎症小体(图B)激活的抑制作用的细胞培养上清中IL-1β的水平图(图中*表示统计P值的范围，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001)；

图6是地兰佐米、伊沙佐米抑制IMQ诱导的银屑病的皮肤效果图；

图7是地兰佐米、伊沙佐米抑制IMQ诱导的银屑病的皮肤组织病理HE染色效果图；

图8是地兰佐米、伊沙佐米抑制IMQ诱导的银屑病的皮肤红斑和鳞屑评分统计图；

图9是地兰佐米、伊沙佐米抑制IMQ诱导的银屑病的皮肤组织中IL-1β的产生的统计图(图中*表示统计P值的范围，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001)；

图10是地兰佐米、伊沙佐米抑制LPS诱导的腹膜炎中腹腔液和血清中IL-1β产生的统计图(图中*表示统计P值的范围，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001)。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本实施方式提供蛋白酶体抑制剂在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

在其中一些实施方式中，所述蛋白酶体抑制剂为Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米和奥普佐米中的至少一种。

在其中一些实施方式中，蛋白酶体抑制剂在制备防治NLRP3炎症小体活化相关疾病的药物中的应用。

在本发明中，术语“NLRP3炎症小体活化”指的是在激活剂(如LPS+Nigericin)作用下，NLRP3、ASC与Pro-caspase-1结合组装形成多蛋白功能复合体，Pro-caspase-1自剪切为活性形式Caspase-1p20/p10，活化的Caspase-1剪切Pro-IL-1β为活性因子IL-1β并释放至细胞外。

在本发明中，所述蛋白酶体抑制剂特异地抑制NLRP3炎症小体的活化，而不抑制NLRC4炎症小体和AIM2炎症小体中的活化。

本发明中，蛋白酶体抑制剂的给药处理为体内给药和/或体外接触。其中，所述的体内给药处理的方式可以通过给药途径实现，对所述蛋白酶体抑制剂体内给药方式没有特别的限定，例如，所述给药途径可以包括静脉注射、肌肉注射和皮下注射、腹腔注射、灌胃中的至少一种。

本发明的一种防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物，包括活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分为Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米或奥普佐米。

在其中一些实施方式中，所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、乳液、溶液、悬浮液或酊剂。

在其中一些实施例中，所述药物的剂型为溶液；和/或，所述药物的给药方式为口服；和/或，所述药物用于哺乳动物或人。

在其中一些实施例中，所述辅料包括赋形剂、填料、增溶剂、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、悬浮剂、矫味剂或香料。

具体地，所述辅料可选自以下组分中的至少一种：

(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；

(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；

(c)保湿剂，例如，甘油；

(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；

(e)缓溶剂，例如石蜡；

(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；

(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；

(h)吸附剂，例如，高岭土；

(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

本发明的药物除了活性成分外，液体剂型的辅料还包含惰性稀释剂，如水或其他溶剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二佳佳甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，辅料还可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、矫味剂、甜味剂和香料。

本发明的药物除了活性成分外，悬浮液的辅料可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇、脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂中的至少一种。

本发明的药物用于肠胃外注射，辅料可包含生理上可接受的无菌水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，或用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。辅料可包含水或非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂，例如水、乙醇和多元醇中的至少一种。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

地兰佐米、伊沙佐米、奥普佐米、卡非佐米粉末均购自上海陶素生化科技有限公司。

Marizomib购自Med Chem Express公司。

LPS购自Sigma公司。

Nigericin(尼日利亚菌素)购自Invitrogen公司。

抗鼠IL-1β抗体(AF-401-NA)购自R&D公司。

抗NLRP3抗体(AG-20B-0014)、抗Caspase-1抗体(AG-20B-0042)购自Adipogen公司。

抗ASC抗体(67824)购自Cell Signaling Technology公司。

抗β-actin抗体(P30002)购自Abmart公司。

ELISA试剂盒(IL-1β、TNF-α)购自InvivoGen公司。

J774A.1细胞购自Jennio-bio。

咪喹莫特(Imiquimod；IMQ)乳膏购自四川明欣药业有限公司。

甲氨蝶呤溶液配制：0.1mg/ml，0.22mg甲氨蝶呤粉末+22ul DMSO+220ul PEG300+1.958ml生理盐水。

地兰佐米溶液配制：0.5mg/ml，2.2mg地兰佐米粉末+44ul DMSO+440ul PEG300+3.916ml生理盐水。

伊沙佐米溶液配制：1mg/ml，4.4mg伊沙佐米粉末+44ul DMSO+440ul PEG300+3.916ml生理盐水。

LPS溶液配制：1mg/ml，5mg LPS+1ml PBS。

实施例1酶联免疫吸附测定蛋白酶体抑制剂抑制NLRP3炎症小体活化的半数抑制浓度

(1)第一天，将J774A.1细胞接种到96孔细胞培养板内，每个孔2.5×10⁴个细胞；

(2)孔板内细胞生长增殖24小时后，细胞大多数呈梭形，少数圆形，状态良好可进行后续处理，弃上清，每孔加入100ul含细菌脂多糖(1ug/ml)的含10％血清的DMEM培养基，然后加入不同浓度的蛋白酶体抑制剂处理1小时，再加入尼日利亚菌素(Nigericin，10uM)处理1小时；

(3)步骤(2)处理后，收集细胞上清液，采用mouse IL-1βELISA试剂盒测定IL-1β含量后计算各化合物的半数抑制浓度，其实验操作步骤按照试剂盒说明书进行，结果见图1。

图1结果显示，Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米、奥普佐米均能抑制LPS和Nigericin刺激的IL-1β的释放，并且这种抑制效果呈现剂量依赖性，尤其是Marizomib抑制效果最佳，实现了半数抑制浓度(IC₅₀)为2.32nmol/L抑制水平，其次是地兰佐米和伊沙佐米，分别实现了IC₅₀为33.09nmol/L和50.59nmol/L抑制水平。

实施例2酶联免疫吸附测定蛋白酶体抑制剂抑制NLRP3炎症小体活化的IL-1β的释放

(1)第一天，将J774A.1细胞接种到96孔细胞培养板内，每个孔2.5×10⁴个细胞；

(2)孔板内细胞生长增殖24小时后，细胞大多数呈梭形，少数圆形，状态良好可进行后续处理，弃上清，每孔加入100ul含细菌脂多糖(LPS)(1ug/ml)的含10％血清的DMEM培养基，然后加入不同浓度的蛋白酶体抑制剂处理1小时，再加入尼日利亚菌素(Nigericin，10uM)处理1小时；

(3)步骤(2)处理后，收集细胞上清液，采用mouse IL-1βELISA试剂盒测定IL-1β含量，其操作步骤按照试剂盒说明书进行，结果见图2。

图2结果显示，在LPS预处理和第二信号Nigericin的共同作用下，NLRP3炎症小体活化，IL-1β成熟并分泌到上清之中。随着不同浓度的蛋白酶体抑制剂的加入，能有效地抑制IL-1β成熟和分泌，并且，这种抑制效果呈现剂量依赖性。尤其是Marizomib抑制效果最佳，仅仅2nM即可非常显著地抑制IL-1β的释放。其次是地兰佐米，仅仅5nM即可显著地抑制IL-1β的释放。

实施例3免疫印迹测定蛋白酶体抑制剂抑制NLRP3炎症小体的活化

(1)第一天，将J774A.1细胞接种到35mm直径的细胞培养皿中，每个皿内6.3×10⁵个细胞；

(2)细胞培养皿内细胞生长增殖24小时后，细胞大多数呈梭形，少数圆形，状态良好可进行后续处理，弃上清，每个皿加入1ml含细菌脂多糖(LPS)(1ug/ml)的含10％血清的DMEM培养基处理5小时，然后加入不同浓度的蛋白酶体抑制剂处理1小时，再加入尼日利亚菌素(Nigericin，10uM)处理1小时；

(3)步骤(2)处理后，收集细胞上清液和细胞裂解液，上清液和裂解液按常规方法提取上清蛋白和细胞裂解蛋白，用抗IL-1β抗体、抗Caspase-1抗体、抗NLRP3抗体和抗ASC抗体进行Western blotting分析，结果见图3。

图3结果显示，在LPS预处理和第二信号Nigericin的共同作用下，NLRP3炎症小体活化，Caspase-1和IL-1β成熟并分泌到上清中，随着不同浓度的地兰佐米和伊沙佐米的加入，能有效的抑制Caspase-1和IL-1β成熟和分泌，并且，这种抑制效果呈现剂量依赖性。

实施例4酶联免疫吸附测定蛋白酶体抑制剂对LPS诱导的TNF-α的释放水平

(1)第一天，将J774A.1细胞接种到96孔细胞培养板内，每个孔2.5×10⁴个细胞；

(2)孔板内细胞生长增殖24小时后，细胞大多数呈梭形，少数圆形，状态良好可进行后续处理，弃上清，然后加入不同浓度的(0nM、5nM、50nM、500nM、1uM、10uM)蛋白酶体抑制剂处理1小时；

(3)随后弃去上清，每孔加入100ul含细菌脂多糖(LPS)(1ug/ml)的含10％血清的DMEM培养基处理5小时；

(4)步骤3处理后，收集细胞上清液，采用mouse TNF-αELISA试剂盒测定TNF-α含量，其操作步骤按照试剂盒说明书进行，结果见图4。

图4结果显示，J774A.1巨噬细胞在LPS处理下，NF-kB信号通路活化，大量TNF-α分泌到上清中，随着不同浓度的地兰佐米或伊沙佐米的加入，对TNF-α的分泌水平影响很小，说明蛋白酶体抑制剂地兰佐米或伊沙佐米抑制NLRP3炎症小体的活化作用强。

实施例5蛋白酶体抑制剂对NLRP3炎症小体活化的抑制作用的特异性研究

(1)第一天，将J774A.1细胞接种到96孔细胞培养板内，每个孔2.5×10⁴个细胞；

(2)孔板内细胞生长增殖24小时后，细胞大多数呈梭形，少数圆形，状态良好可进行后续处理，弃上清，每孔加入100ul含细菌脂多糖(LPS)(1ug/ml)的含10％血清的DMEM培养基，然后加入不同浓度的(0nM、5nM、50nM、500nM、1uM、10uM)蛋白酶体抑制剂处理1小时，再分别加入0.25ug/ml的poly A:T和2.5ug/ml的沙门氏菌处理4小时；

(3)步骤(2)处理后，收集细胞上清液，采用mouse IL-1βELISA试剂盒测定IL-1β含量，其操作步骤按照试剂盒说明书进行，结果见图5。

图5结果显示，在LPS预处理和沙门氏菌或Poly A:T的共同作用下，NLRC4和AIM2炎症小体活化，IL-1β成熟并分泌到上清之中。随着不同浓度的蛋白酶体抑制剂的加入，并不能抑制NLRC4炎症小体(图A)和AIM2炎症小体(图B)活化产生的IL-1β的释放，说明蛋白酶体抑制剂地兰佐米和伊沙佐米能特异性的抑制NLRP3炎症小体的活化。

实施例6蛋白酶体抑制剂地兰佐米和伊沙佐米对NLRP3炎症小体抑制作用的体内研究——地兰佐米和伊沙佐米抑制咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病

取6-8周龄C57BL/6雄性小鼠，称重，分为9组(阴性对照组、模型组、甲氨蝶呤阳性对照组、模型给药1组、模型给药2组、模型给药3组、模型给药4组、模型给药5组、模型给药6组)，每组6只小鼠，然后剃去小鼠背部毛发，每只小鼠毛发剃除的面积为2cm×4cm。阴性对照组：62.5mg/鼠/天的凡士林涂抹于小鼠背部暴露的皮肤上，连续涂抹6天；模型组：62.5mg/鼠/天的IMQ乳膏涂抹于小鼠背部暴露的皮肤上，连续涂抹6天；甲氨蝶呤阳性对照组：同模型组造模程序一致，但涂抹IMQ乳膏后2h腹腔注射甲氨蝶呤溶液(Methotrexate，1mg/kg)，每天给药1次，连续给药6天；模型给药1组：同模型组造模程序一致，伊沙佐米溶液给药在第一次涂抹IMQ乳膏前的第5天和第2天以及第一次涂抹IMQ乳膏后的第3天和第6天，每次腹腔注射1mg/kg；模型给药2组：同模型组造模程序一致，伊沙佐米给药在第一次涂抹IMQ乳膏前的第5天和第2天以及第一次涂抹IMQ乳膏后的第3天和第6天，每次腹腔注射5mg/kg；模型给药3组：同模型组造模程序一致，伊沙佐米给药在第一次涂抹IMQ乳膏前的第5天和第2天以及第一次涂抹IMQ乳膏后的第3天和第6天，每次腹腔注射10mg/kg；模型给药4组：同模型组造模程序一致，地兰佐米溶液给药在第一次涂抹IMQ乳膏前的第5天和第2天以及第一次涂抹IMQ乳膏后的第3天和第6天，每次腹腔注射1mg/kg；模型给药5组：同模型组造模程序一致，地兰佐米给药在第一次涂抹IMQ乳膏前的第5天和第2天以及第一次涂抹IMQ乳膏后的第3天和第6天，每次腹腔注射3mg/kg；模型给药6组：同模型组造模程序一致，地兰佐米给药在第一次涂抹IMQ乳膏前的第5天和第2天以及第一次涂抹IMQ乳膏后的第3天和第6天，每次腹腔注射5mg/kg。

第7天时，拍摄小鼠背部皮肤情况，称量小鼠体重，随后让小鼠过量吸入二氧化碳并颈椎脱臼处死小鼠；

3、取下步骤2的小鼠背部皮肤，测定皮肤厚度，冻存到液氮中保存30分钟以上，随后取出皮肤组织，加入裂解液并用组织研磨器研磨充分后，1200rpm离心10分钟，取上清进行ELISA测定皮肤组织中IL-1β的水平；

4、取下步骤2处死后的小鼠脾脏，拍照，称重，随后冻存到液氮中保存。

从图6的结果看，伊沙佐米和地兰佐米呈浓度依赖性地明显改善小鼠皮肤表面的鳞屑和红斑。

从图7的结果看，模型组皮肤组织角质层细胞核残留固缩，角化不全，表皮棘层肥厚呈现银屑病样增生，而伊沙佐米和地兰佐米能浓度梯度性的改善银屑病小鼠的皮肤病理情况，有效减轻皮肤角质层的增生，使角化减少，表皮棘层变薄。

从图8的结果看，伊沙佐米和地兰佐米能有效降低小鼠背部皮肤的红斑和鳞屑的评分(采用临床银屑病面积和严重程度指数(PASI)方法来评估小鼠背部皮肤的严重程度，主要对红斑、鳞屑进行0—4的评分；0分表示无红斑、无鳞屑；1分表示轻微红斑、轻微鳞屑；2分表示中度红斑、中度鳞屑；3分表示重度红斑、重度鳞屑；4分表示极重度红斑、极重度鳞屑；该评分作为衡量银屑病严重程度的标准)，并且在伊沙佐米为10mg/kg和地兰佐米为5mg/kg的给药剂量下其疗效比阳性对照药甲氨蝶呤的好。

从图9的结果看，伊沙佐米和地兰佐米能有效抑制小鼠背部皮肤组织的IL-1β的水平。

实施例7蛋白酶体抑制剂地兰佐米和伊沙佐米对NLRP3炎症小体抑制作用的体内研究——地兰佐米和伊沙佐米抑制LPS诱导的腹膜炎

1、取6-8周龄C57BL/6雌鼠，称重，分为8组(阴性对照组、模型组、模型给药1组、模型给药2组、模型给药3组、模型给药4组、模型给药5组、模型给药6组)，每组6只小鼠，阴性对照组：对照组在第1，4，8天腹腔注射含有10％DMSO的PBS溶液200ul，第9天腹腔注射等量的PBS溶液；模型组：在第1，4，8天腹腔注射含有10％DMSO的PBS溶液200ul，第9天腹腔注射LPS溶液，20mg/kg每只鼠；模型给药1组：在第1，4，8天分别腹腔一次1mg/kg的伊沙佐米溶液，第9天腹腔注射LPS溶液，20mg/kg每只鼠；模型给药2组：在第1，4，8天分别腹腔一次5mg/kg的伊沙佐米溶液，第9天腹腔注射LPS溶液，20mg/kg每只鼠；模型给药3组：在第1，4，8天分别腹腔一次10mg/kg的伊沙佐米溶液，第9天腹腔注射LPS溶液，20mg/kg每只鼠；模型给药4组：在第1，4，8天分别腹腔一次1mg/kg的地兰佐米溶液，第9天腹腔注射LPS溶液，20mg/kg每只鼠；模型给药5组：在第1，4，8天分别腹腔一次3mg/kg的地兰佐米溶液，第9天腹腔注射LPS溶液，20mg/kg每只鼠；模型给药6组：在第1，4，8天分别腹腔一次5mg/kg的伊沙佐米溶液，第9天腹腔注射LPS溶液，20mg/kg每只鼠；

2、6小时后，摘除眼球取血，并收集血液，取血完毕后颈椎脱臼处死小鼠。血液放于室温静置30min，然后3000rpm离心30min，收集血清；

3、用1ml生理盐水冲洗腹腔，吸出的生理盐水，3000rpm离心5分钟，收集上清液；

4、步骤2得到的血清和步骤3得到的腹腔灌洗上清液用ELISA的方法进行IL-1β的测定，结果见图10。

从图10的结果看，腹腔注射LPS后，IL-1β等炎性细胞因子水平有明显的升高，而伊沙佐米和地兰佐米能有效的抑制血清和腹腔液中IL-1β的水平，表明伊沙佐米和地兰佐米可以有效地抑制LPS诱导的腹腔炎。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.蛋白酶体抑制剂在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白酶体抑制剂为Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米和奥普佐米中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体相关疾病为腹膜炎。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述腹膜炎为急性腹膜炎。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体相关疾病为盆腔炎。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体相关疾病为皮炎。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体相关疾病为银屑病。

8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体相关疾病为肝炎、脊柱炎、关节炎、肠炎、阿尔兹海默症、石棉肺、硅肺、白塞病、肺炎、心肌炎、紫外线所诱导的皮肤晒伤、接触性超敏反应、帕金森病、抑郁症、非酒精性脂肪肝病或酒精性肝病。

9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体相关疾病为肾病、家族性冷自发炎症综合征、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤和关节综合征、新生儿发作多系统炎性疾病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化、哮喘或急性呼吸窘迫征。

10.防治NLRP3炎症小体相关疾病的药物，其特征在于，包括活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分为蛋白酶体抑制剂。

11.根据权利要求10所述的药物，其特征在于，所述蛋白酶体抑制剂为Marizomib、地兰佐米、伊沙佐米、卡非佐米或奥普佐米。

12.根据权利要求10或11所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、乳液、溶液、悬浮液或酊剂。

13.根据权利要求10或11所述的药物，其特征在于，所述辅料包括赋形剂、填料、增溶剂、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、悬浮剂、矫味剂或香料。

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