KR20150093695A - Malt1의 소분자 억제제 - Google Patents

Malt1의 소분자 억제제 Download PDF

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Abstract

MALT1 절단 활성은 활성화된 B-세포-유사 미만성 거대 B-세포 림프종 (ABC-DLBCL), DLBCL의 화학요법-내성인 형태의 발병기전과 연관된다. 본 발명자들은 MALT1 활성 검정을 개발하고 화학적으로 다양한 MALT1 억제제를 확인하였다. 선택된 선도 화합물 MI-2는 MALT1로의 직접 결합 및 그의 프로테아제 기능의 억제를 특징으로 한다. MI-2는 인간 ABC-DLBCL 세포 내에 집중되고 MALT1 기질의 절단을 비가역적으로 억제시킨다. 이는 NF-κB 리포터 활성의 억제, c-REL의 핵 국재화의 억제 및 NF-κB 표적 유전자 시그너처의 하향조절에 의해 달성된다. 특히, MI-2는 마우스에 비독성이고, 시험관내에서 ABC-DLBCL 세포주 및 생체내에서 이종기관이식된 ABC-DLBCL 종양에 대해 강력하고 특이적인 활성을 나타냈다. 화합물은 또한 생체외에서 원발성 인간 비-GCB-DLBCL에 대해 효과적이었다.

Description

MALT1의 소분자 억제제 {SMALL MOLECULE INHIBITORS OF MALT1}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2012년 11월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/724,650을 우선권 주장하며, 상기 개시내용은 그 전문이 참조로서 본원에 포함된다.
비-호지킨 림프종 (NHL)은 7번째로 가장 빈번한 암이다 (문헌 [Siegel et al., 2012]). 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)은 전체 림프종 케이스의 ~25%를 차지하는 NHL의 가장 흔한 하위유형이다 (문헌 [Swerdlow, 2008]). 유전자 발현 프로파일링은 DLBCL에 대한 개별적인 분자 하위유형, 예를 들어, 배 중심 B-세포-유사 (GCB) DLBCL, 활성화된 B-세포-유사 (ABC) DLBCL 및 원발성 종격 B-세포 림프종 (PMBL)으로의 하위분류를 가능하게 한다 (문헌 [Alizadeh et al., 2000; Rosenwald et al., 2003]). 이들 하위유형은 그의 반복되는 체세포 돌연변이의 스펙트럼, 상이한 신호전달 경로에 대한 의존성 및 현재 표준 치료에 대한 반응에 있어서 상당히 상이하다 (문헌 [Lenz et al., 2008b; Wright et al., 2003]). GCB 하위유형을 갖는 환자는 ABC 하위유형을 갖는 환자와 비교하여 훨씬 더 나은 전체 생존을 나타낸다 (문헌 [Alizadeh et al., 2000; Rosenwald et al., 2002]). 모든 DLBCL에 대해 개선된 치료가 필요하지만, 가장 화학요법-내성인 ABC-DLBCL에 대한 개선된 치료가 가장 시급하다.
ABC-DLBCL은 몇몇 상이한 메카니즘을 통한 NF-κB 경로의 종양원성 활성화에 대한 그의 의존성에 의해 특징화된다. 이들은 대부분 B-세포 수용체 (BCR)의 신호전달 하류에 참여하는 분자에서의 체세포 돌연변이를 수반하며, 예를 들어 CARMA1/CARD11 (문헌 [Lenz et al., 2008a]) 및 CD79A/B (문헌 [Davis et al., 2010])의 돌연변이 활성화, TNFAIP3/A20 (문헌 [Compagno et al., 2009; Honma et al., 2009])의 동형접합 결실/비활성화 돌연변이 또는 톨-유사 수용체 (문헌 [Ngo et al., 2011])의 MYD88 하류의 돌연변이 활성화를 수반한다. CARMA1은 CBM 복합체 (CARMA1-BCL10-MALT1)의 일부를 형성하고, B-세포 수용체, T-세포 수용체 (문헌 [Ruefli-Brasse et al., 2003; Ruland et al., 2003]) 및 ITAM-커플링된 NK 세포 수용체 (문헌 [Gross et al., 2008])의 NF-κB 활성화 하류를 매개한다. MALT1 서브유닛은 CBM 복합체의 활성 신호전달 성분 (문헌 [Lucas et al., 2001])이며, NF-κB 신호전달 경로의 억제제, 예컨대 TNFAIP3/A20 (문헌 [Coornaert et al., 2008]), CYLD (문헌 [Staal et al., 2011]) 및 RELB (문헌 [Hailfinger et al., 2011]) 또는 BCL10 단백질 (문헌 [Rebeaud et al., 2008])을 절단하고 비활성화시켜, NF-κB 신호전달을 간접적으로 활성화 시키는 프로테아제 활성을 특징으로 한다. MALT1 전위 (API2-MALT1 융합을 생성하는 t(11;18)(q21;q21) 및 IGH-MALT1 전위를 초래하는 t(14;18)(q32;q21))는 MALT-유형 림프종을 갖는 환자의 최대 55%에서 발견된다 (문헌 [Farinha and Gascoyne, 2005]). 이러한 전위는 MALT1의 과다발현을 야기하고, API2-MALT1 전위의 경우에, 경로의 구성적 활성화를 야기한다 (문헌 [Dierlamm et al., 1999; Sanchez-Izquierdo et al., 2003; Streubel et al., 2003]). 마우스에서의 MALT1 구성적 발현은 인간에서의 MALT 림프종과 유사한 질환을 유도하고, p53 널(null) 배경에서 ABC-유사 DLBCL을 유도한다 (문헌 [Vicente-Duenas et al., 2012]). MALT1은 DLBCL에 대해 돌연변이 또는 전위가 발견된 적은 없지만, BCL2과 함께 얻어지며 이러한 낮은 카피수 증폭은 ABC-DLBCL 표현형과 연관된다 (문헌 [Dierlamm et al., 2008]). 또한, ABC-DLBCL 세포주는 MALT1 촉매 활성에 대한 의존성을 나타낸다 (문헌 [Ferch et al., 2009; Hailfinger et al., 2009; Ngo et al., 2006]).
MALT1은 프로테아제의 카스파제 (시스테인-아스파르트산 프로테아제) 패밀리와 관련된 파라카스파제(paracaspase)이지만, 이는 아스파르테이트 대신에 아르기닌 또는 리신 잔기 이후를 절단한다 (문헌 [Rebeaud et al., 2008]). MALT1 널 동물은 B 및 T 세포 기능에 결함을 나타내지만, 그 외에는 건강하며 (문헌 [Ruefli-Brasse et al., 2003; Ruland et al., 2003]), MALT1은 인간 게놈에서 유일한 파라카스파제이다. 이들 요소는 MALT1 표적화 요법이 독성이 거의 없거나 또는 관리가능한 독성을 갖도록 허용할 가능성이 높다는 것을 시사한다. 결론적으로, MALT1은 ABC-DLBCL 및 MALT 림프종에 대한 잠재적으로 중요한 치료 표적을 대표한다.
개요
MALT1은 ABC-DLBCL에서의 비정상적인 종양원성 신호전달을 유도하는 독특한 파라카스파제 단백질이다. 본 발명자들은 본원에서 소분자 억제제에 대한 차단을 가능하게 하는 MALT1의 구성적으로 활성화된 형태의 개발을 개시하고, MALT1 억제 화합물 및 의학적 장애, 예컨대 B-세포 림프종의 치료를 위한 그의 용도를 청구한다. 화합물 MI-2, 비가역적 MALT1 프로테아제 억제제는 세포-기반 검정에서의 나노몰 활성 및 ABC-DLBCL에 대한 선택적 활성을 갖는 선도 화합물로서 확인되었다. 중요하게는 본 발명자들은 MALT1 억제제가 시험관내 및 생체내에서 ABC-DLBCL을 사멸시키고, 동물에 대해서 비-독성이고, 또한 원발성 인간 비 GCB-DLBCL 시편을 억제한다는 것을 보여준다. 따라서 본 발명자들은 MALT1이 실제적 치료 표적이고, B-세포 림프종을 위한 치료제의 신규한 부류의 기초를 형성하는 선도 화합물을 제공한다는 것을 증명한다.
본 발명은, 다양한 실시양태에서, MALT1을 유효한 양 또는 농축도의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체와 접촉시키는 것을 포함하는, MALT1을 조절하는 방법을 제공한다.
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서,
파선 결합은 결합이 존재할 수 있거나 부재할 수 있음을 나타내고;
Y1 및 Y2 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, Y1은 N 또는 CR이고, Y2는 C이고, Ar1은 존재하며; Y1 및 Y2 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, Y1은 CR2이고, Y2는 O 또는 S이고, Ar1은 부재하고, 각각 독립적으로 선택되는 R은 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
R1은 알킬, 알콕시알킬, 또는 아릴알킬이며, 여기서 임의의 알킬, 알콕시알킬, 또는 아릴알킬은 할로 또는 (C1-C6)알콕시로 단일-치환 또는 독립적으로 다중-치환될 수 있되, 단 산소 원자, 및 Y3을 포함하는 고리 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R1은 부재하고, Ar3은 존재하며, 산소 원자 및 고리 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, R1은 존재하고, Y3, 및 산소 원자를 보유한 탄소 원자 사이에 이중 결합이 존재하고, Ar3은 부재하고;
Ar1은 1-3개의 J1 기로 치환된 페닐이고; J1은 할로 또는 (C1-C6)알콕시이고;
Ar2는 1-3개의 J2 기로 치환된 페닐이고; J2는 화학식 -N(R)C(O)-R2의 기이고, R2는 알킬, 아릴, 또는 아릴아미노이며, 여기서 임의의 알킬, 아릴, 또는 아릴아미노는 0-2개의 할로, 니트로, 또는 (C1-C6)알콕시 기로 치환되고;
Ar3은 1-3개의 J3 기로 치환된 페닐이고; J3은 할로 또는 (C1-C6)알콕시이다.
본 발명은 추가로, 다양한 실시양태에서, 유효 용량의 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 암은 림프종, 예컨대 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)일 수 있다.
본 발명은 추가로, 다양한 실시양태에서, 형광원 AMC (7-아미노-4-메틸쿠마린)에 연결된 MALT1 기질 펩티드 LRSR을 사용하여, 류신 지퍼 이량체화 모티프와 융합된 MALT1 (340-789)의 재조합 형태 (LZ-MALT1) 및 후보 조절제 화합물을 접촉시키는 것을 포함하며, MALT1에 의한 Ac-LRSR-AMC 기질의 절단이 AMC 및 형광 신호의 방출을 초래하고, 여기서 후보 조절제의 존재 하에 MALT1의 재조합 형태에 의한 Ac-LRSR-AMC 기질의 절단의 감소는 후보 조절제가 MALT1의 소분자 조절제임을 나타내는 것인, MALT1의 소분자 조절제를 확인하는 방법을 제공한다.
도 1a는 이량체화 및 활성화를 촉진하는, 류신 지퍼 이량체화 모티프와 융합된 MALT1 (340-789)의 재조합 형태 (LZ-MALT1)의 구조의 2개의 사시도를 도시한다.
도 1b는 LZ-MALT1을 사용하여 농도 반응 검정으로 확인하기 위해 화합물 라이브러리로부터 324개의 후보 화합물을 선택한 결과의 그래프 표현이다.
도 1c는 추가의 확인을 위해 19개의 화합물을 그의 생화학적 활성 (IC50 <20 μM)에 기반하여 선택한 결과의 그래프 표현이다.
도 1d는 화합물 MI-2의 화학 구조를 나타낸다.
도 1e는 MI-2가 MALT1-매개 절단에서 용량-의존성 감소를 유발한다는 것을 입증하는 겔 전기영동 결과의 웨스턴 블롯 사진을 나타내며, 웨스턴 블롯 데이터의 그래프 표현에서 나타낸 바와 같이 절단되지 않은 CYLD 단백질의 증가 및 절단된 형태의 단백질의 감소에 주목하였다.
도 2a는 MI-2와 동등하거나 또는 더 높은 활성을 나타내는 19개의 유사체를 선택한 결과의 그래프 표현이다.
도 2b는 세포 증식 검정에서 추가의 특성화를 위해 선택된 MI-2와 유사한 범위 내의 생화학적 IC50을 갖는 MI-2의 5개의 유사체 (MI-2A1 내지 MI-2A5) 및 동일한 용량 범위에 걸쳐 세포 증식에 영향을 미치지 않는 화학적 대조군으로서 사용된 시험관내 LZ-MALT1 억제 활성을 갖지 않는 2개의 유사체 화합물 (MI-2A6 및 MI-2A7)의 화학 구조를 나타낸다.
도 2c는 화합물 MI-2A1 내지 MI-2A5의 생물검정 결과의 그래프 표현이다.
도 2d는 절단 억제와 관련하여, 5개의 화합물 MI-2A1 내지 MI-2A5를 5 μM로 8시간 동안 양성 대조군으로서 사용된 Z-VRPR-FMK MALT1 차단 펩티드 (50 μM)와 함께 투여하여 얻은 결과의 그래프 표현이다.
도 3a는 MALT1의 파라카스파제 도메인 (잔기 329-728)에 결합한 MI-2의 이핵성 단일 양자 간섭성(Heteronuclear Single Quantum Coherence) (HSQC) 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트로그램이다.
도 3b는 불활성 유사체 MI-2A6 및 MI-2A7에 의해, MALT1의 파라카스파제 도메인 (잔기 329-728)의 결합의 부재를 증명하는 NMR 스펙트로그램을 나타낸다.
도 3c는 55,988.4 Da의 주요 피크가 존재하는 MALT1 파라카스파제 도메인 (329-728)을 가리키고, 화합물 MI-2와 인큐베이션 시에는 MALT1의 주요 피크가 419.1 Da 증가한 56,407.5 Da으로 이동하는 것을 가리키는 질량 분석 데이터를 나타낸다.
도 3d는 분자 모델링 프로그램 오토도크(AutoDock) 4.2의 분자 도킹 루틴에 의해 계산된 바와 같은, MALT1 파라카스파제 도메인에 대한 MI-2의 결합의 잠재적 모드의 이미지를 나타내고, 여기서 MI-2는 파라카스파제 도메인에서 활성 부위 C464와 가까운 활성 부위 틈에 그의 클로로메틸 기로 결합하는 것을 나타낸다.
도 3e는 LZ-MALT1을 다양한 농도의 MI-2 (비가역적 억제) 대 MI-2A2 (가역적 억제)로 5 내지 80분 동안 예비-인큐베이션 한 다음, 형광 리포터 기질 Ac-LRSR-AMC를 첨가했을 때의 효소 활성의 시간 경과를 나타낸다.
도 4a는 MI-2 (2 μM) 또는 비히클에 30분 동안 노출시킨 다음, MI-2에 대한 노출 동안 절단된 형태의 MALT1 기질의 축적을 허용하기 위해 5 μM MG-132에 추가의 1시간 (레인 2, 3), 또는 2시간 (레인 4, 5) 동안 노출시킨, HBL-1 및 TMD8 세포주에서의 절단 생성물의 시각화를 가능하게 하기 위해 프로테아솜 억제제 MG-132를 사용한 겔 전기영동 결과의 웨스턴 블롯 사진을 나타낸다.
도 4b는 HBL-1 세포를 200 nM의 MI-2, 50 μM의 Z-VRPR-FMK (양성 대조군) 또는 비히클에 24시간 동안 노출시킨 다음, 전세포 또는 단리된 핵에 대한 c-REL 유동 세포측정법에 따른 실험 결과를 나타낸다. MI-2 및 Z-VRPR-FMK는 둘 다 이러한 단백질의 전세포 수준에는 영향을 미치지 않으면서 핵 c-REL을 유사한 정도로 감소시켰다.
도 4c는 24시간 동안 GI50 농도의 MI-2 (HBL-1에 대해서는 200 nM, TMD8에 대해서는 500 nM)로 처리한 HBL-1 및 TMD8 세포의 핵 추출물의 c-REL 및 p65에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 두 세포주에서 MI-2에 대한 노출은 p65 수준에 영향을 미치지 않으면서 핵 c-REL의 명백한 감소를 유발하였다.
도 4d는 PMA/이오노마이신에 의해 유도된 NF-κB 활성화를 약화시키는 MI-2의 영향에 대한 데이터의 그래프 표현이며, 여기서 293T 세포는 NF-κB 리포터 벡터 (NF-κB)5-luc2CP-pGL4 및 TK-pRL 대조군을 사용하여 BCL10 및 MALT1WT 또는 MALT1C464A (불활성 돌연변이체) 중 하나를 발현시키는 플라스미드와 함께 형질감염시켰다.
도 4e는 PMA/이오노마이신에 의해 유도된 NF-κB 활성화를 약화시키는 MI-2의 영향에 대한 데이터의 그래프 표현이며, 여기서 HBL-1 세포는 NF-κB 리포터 벡터 (NF-κB)5-luc2CP-pGL4 및 TK-pRL 대조군으로 형질감염시켰다.
도 4f는 각각의 세포주에 대해, MI-2와 비히클-처리된 세포 사이의 배수 변화로 사전에 순위 매겨진 모든 유전자의 차등 발현에 대한 Z-VRPR-FMK 시그너처의 유전자 세트 농축 분석 (GSEA)의 결과를 나타낸다. Z-VRPR-FMK 시그너처는 세포주 둘 다에 대한 MI-2 처리 후에 하향조절된 유전자 중에서 현저하게 풍부해졌다 (HBL-1:FDR<0.0001; 및 TMD8:FDR<0.0001).
도 5a는 8개의 세포주를 증가하는 농도의 MI-2 (단일 용량)에 노출시키고, 세포 증식을 48시간째에 ATP-기반 대사 발광 검정을 사용하여 측정한 실험의 결과의 그래프 표현을 나타낸다.
도 5b는 MI-2 세포내 농축 실험 결과의 그래프 표현이며, 여기서 HBL-1 세포를 0.02, 0.2 또는 2 μM의 MI-2에 2시간 동안 노출시키고, 3회 세척하고, MI-2를 LC-MS에 의해 측정하였다.
도 5c, 5cc 및 5ccc는 HBL-1, TMD8, OCI-Ly10 및 GCB-DLBCL 세포주 OCI-Ly1을 증가하는 농도의 MI-2로 처리한 실험의 결과를 나타낸다. 48, 72 및 96시간 경과시에 생존 세포에 대해 유동 세포측정법에 의한 CFSE 희석 검정을 이용하여 세포 증식을 조사하였다. MI-2는 HBL-1, TMD8 및 OCI-Ly10의 증식은 실질적으로 억제한 반면, OCI-Ly1에는 영향을 미치지 않았다
도 5d는 세포 주기를 평가하기 위해 BrdU 혼입 - DAPI 염색 및 유동 세포측정법을 사용한 실험 결과의 그래프 표현을 나타내며, 이는 MI-2가 S기의 용량-의존성 감소 및 G1-0 및 Sub-G0의 세포 비율의 상반된 증가를 유도하였음을 증명하였다.
도 5e는 MI-2가 OCI-Ly1 세포에 대해 아무런 영향이 없었던 반면, HBL-1 및 TMD8 세포 둘 다를 크게 억제하였으며, 이 때 전자는 아폽토시스 세포 풍부성을 보다 이르게 및 보다 더 크게 나타낸다는 것을 입증하는 실험의 그래프 결과를 나타낸다.
도 6은 5마리의 C57BL/6 마우스를 10일의 기간에 걸쳐 누적 용량이 51.1 mg/kg이 되도록 하는 0.05에서 25 mg/kg까지의 범위의 증가하는 용량의 MI-2의 매일의 복강내 (IP) 투여에 노출시키고, 또 다른 5마리 마우스를 비히클 (5% DMSO, n=5)에만 노출시킨 실험의 결과를 나타낸다 (도 6a, 독성 1). 기면, 체중 감소 (도 6b, 독성 1) 또는 병을 암시하는 기타 신체적 징후의 증거는 없었다. 최대 투여된 25 mg/kg의 용량이 14-일 스케줄에서 안전한지 확인하기 위해, 본 발명자들은 10마리 마우스를 14일에 걸쳐 누적 용량이 350 mg/kg이 되도록 하는 25 mg/kg의 MI-2의 매일의 IP 투여에 노출시키고, 대조군으로서 비히클만이 주사된 5마리 마우스를 사용하였다 (도 6a, 독성 2). 14일 기간의 MI-2 투여 후에 5마리 마우스를 (5마리 대조군과 함께) 희생시키고, 다른 5마리 마우스를 10일 휴약 기간 후에 희생시켜 지연 독성을 평가하였다. 체중 감소 (도 6b, 독성 2) 또는 조직 손상 (육안 또는 현미경에 의한)을 비롯한 독성 효과 또는 다른 병의 징후는 전혀 눈에 띄지 않았다 (도 6c, 6cc). 뇌, 심장, 폐, 간, 신장, 장, 비장, 흉선 및 골수 조직을 검사하였다.
도 7a는 MI-2는 비히클에 비해 TMD8 (p=0.015, t-시험) 및 HBL1 (p=0.014, t-시험) ABC-DLBCL 이종이식편 둘 다의 성장을 매우 억제한 반면, OCI-Ly1 종양 (p=0.47, t-시험)의 성장에 대해서는 영향을 주지 않았음을 입증하는 그래프 데이터를 나타낸다.
도 7b는 비히클에 비하여 MI-2-처리된 HBL-1 (p=0.0008, t-시험) 및 TMD8 (p<0.0001, t-시험) 이종이식편의 아폽토시스 세포는 현저한 증가를 나타내지만, OCI-Ly1 이종이식편 (p=0.5580, t-시험)에서는 그렇지 않았음을 나타낸, 아폽토시스 세포를 검출하기 위해 튜넬(TUNEL) 검정을 사용한 조직학적 검사의 그래프 결과를 나타낸다.
도 7c는 비히클과 비교하여 HBL-1 (p<0.0001, t-시험) 및 TMD8 이종이식편 (p=0.0006, t-시험)의 Ki-67 염색으로 측정한 바 상당한 증식의 감소를 증명하지만, OCI-Ly1 이종이식편 (p=1.0, t-시험)에서는 어떤 차이도 관찰되지 않는 그래프 결과를 나타낸다.
도 7d는 MI-2 처리된 종양이 감소된 c-REL 핵 단백질을 나타내는 염색된 전자사진을 나타낸다.
도 7e는 GCB 대 비-GCB 상태를 한스(Hans) 기준을 사용하여 면역조직화학에 의해 알 수 있는 5명의 DLBCL 환자의 림프절 생검으로부터의 단세포 현탁액에서 수득한 그래프 데이터를 나타내며, 여기서 림프종 세포를 단리하여 4벌로 0.8 μM의 MI-2 또는 비히클에 노출시켰다. 48시간의 노출 후에, 세포 수 및 생존율을 트리판 블루를 사용하여 결정하였다.
상세한 설명
개관
다양한 실시양태에서, 본 발명은 MALT1을 유효한 양 또는 농축도의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체와 접촉시키는 것을 포함하는, MALT1을 조절하는 방법을 제공한다.
<화학식 I>
Figure pct00002
상기 식에서,
파선 결합은 결합이 존재할 수 있거나 부재할 수 있음을 나타내고;
Y1 및 Y2 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, Y1은 N 또는 CR이고, Y2는 C이고, Ar1은 존재하며; Y1 및 Y2 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, Y1은 CR2이고, Y2는 O 또는 S이고, Ar1은 부재하고, 각각 독립적으로 선택되는 R은 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
R1은 알킬, 알콕시알킬, 또는 아릴알킬이며, 여기서 임의의 알킬, 알콕시알킬, 또는 아릴알킬은 할로 또는 (C1-C6)알콕시로 단일-치환 또는 독립적으로 다중-치환될 수 있되, 단 산소 원자, 및 Y3을 포함하는 고리 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R1은 부재하고, Ar3은 존재하며, 산소 원자 및 고리 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, R1은 존재하고, Y3, 및 산소 원자를 보유한 탄소 원자 사이에 이중 결합이 존재하고, Ar3은 부재하고;
Ar1은 1-3개의 J1 기로 치환된 페닐이고; J1은 할로 또는 (C1-C6)알콕시이고;
Ar2는 1-3개의 J2 기로 치환된 페닐이고; J2는 화학식 -N(R)C(O)-R2의 기이고, R2는 알킬, 아릴, 또는 아릴아미노이며, 여기서 임의의 알킬, 아릴, 또는 아릴아미노는 0-2개의 할로, 니트로, 또는 (C1-C6)알콕시 기로 치환되고;
Ar3은 1-3개의 J3 기로 치환된 페닐이고; J3은 할로 또는 (C1-C6)알콕시이다.
보다 구체적으로, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체일 수 있다.
<화학식 IA>
Figure pct00003
상기 식에서, R1, Ar1, 및 Ar2는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
보다 구체적으로, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 IB의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체일 수 있다.
<화학식 IB>
Figure pct00004
상기 식에서, Ar2 및 Ar3은 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
예를 들어, 본 발명의 방법을 수행하는 데 사용되는 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 중 임의의 것 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체일 수 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
예를 들어, 본 발명의 방법을 수행함에 있어서, MALT1은 살아있는 동물 내에 배치될 수 있고, 예컨대 여기서 살아있는 동물은 암, 예컨대 미만성 거대 B-세포 림프종을 앓는 인간이다.
따라서, 본 발명은 다양한 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물; 예를 들어, 화학식 I, 화학식 IA, 화학식 IB의 화합물, 또는 사용될 수 있는 화합물의 특정 예 중 임의의 것의 유효 용량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다.
예를 들어, 암은 림프종, 예컨대 미만성 거대 B-세포 림프종일 수 있다.
명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약"은, 수치 값 또는 범위를 지칭하는 경우, 값 또는 범위에서 어느 정도, 예를 들어 언급된 값 또는 언급된 범위의 한계치의 10% 이내 또는 5% 이내의 가변성을 허용한다.
본원에 사용된 (치료의 대상체로서의) "개체" 또는 "환자"는 포유동물 및 비-포유동물 둘 모두를 의미한다. 포유동물은, 예를 들어 인간; 비-인간 영장류, 예를 들어 유인원 및 원숭이; 및 비-영장류, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 및 염소를 포함한다. 비-포유동물은, 예를 들어 어류 및 조류를 포함한다.
용어 "질환" 또는 "장애" 또는 "상태이상(malcondition)"은 호환적으로 사용되며, MALT1에 대한 작용에 의해 치료상 유익한 효과가 달성될 수 있도록 MALT1이 질환 또는 상태이상 또는 그의 증상(들)에 관련된 생화학적 메카니즘에서 일정 역할을 하는 것인 질환 또는 상태를 지칭하는 데 사용된다. MALT1"에 대한 작용", 또는 MALT1 "조절"은 생체내에서의 MALT1에 대한 결합 및/또는 MALT1 생물활성의 억제 및/또는 MALT1 생물활성의 알로스테릭 조절을 포함할 수 있다.
표현 "유효량"은, 장애를 앓는 개체에 대한 요법을 기재하는 데 사용된 경우, 상기 장애에 관련된 MALT1이 활성인 개체의 조직에서 MALT1을 억제하거나 또는 MALT1에 달리 작용하는 데 유효한 본 발명의 화합물의 양을 지칭하며, 여기서 이러한 억제 또는 다른 작용은 유익한 치료 효과를 생성하기에 충분한 정도로 일어난다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 완전히 또는 거의 완전히를 의미하는데; 예를 들어, 한 성분이 "실질적으로 없는" 조성물은 상기 성분을 전혀 갖지 않거나 또는 조성물의 어떠한 관련된 기능적 특성도 그 존재에 의해 영향을 받지 않을 만큼 미량을 함유하거나, 또는 화합물이 "실질적으로 순수"하다는 것은 무시가능한 미량의 불순물만이 존재한다는 것이다.
본원의 의미 내에서 "치료하는" 또는 "치료"는 장애 또는 질환과 연관된 증상의 완화, 또는 그 증상의 추가의 진행 또는 악화의 억제, 또는 질환 또는 장애의 예방 또는 프로필락시스(prophylaxis), 또는 질환 또는 장애의 치유를 지칭한다. 유사하게, 본원에 사용된 본 발명의 화합물의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 장애 또는 상태와 연관된 증상을 전부 또는 부분적으로 완화시키거나, 또는 그 증상의 추가의 진행 또는 악화를 중단시키거나 또는 늦추거나, 또는 장애 또는 상태를 예방하거나 또는 그에 대한 프로필락시스를 제공하는 화합물의 양을 지칭한다. 특히, "치료 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하는 데 필요한 투여랑 및 기간으로서의 유효한 양을 지칭한다. 치료 유효량은 또한, 본 발명의 화합물의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다.
합성 방법의 문맥에서 본원에 사용된 "제공하는 데 적합한 조건 하에" 또는 "수득하기에 충분한 조건 하에" 등과 같은 어구는, 조건을 변화시키는 실험자에게 있어 통상의 기술 범위 내에 있으며 유용한 양 또는 수율의 반응 생성물을 제공하는 반응 조건, 예컨대 시간, 온도, 용매, 반응물 농도 등을 지칭한다. 목적 반응 생성물이 단리될 수 있거나 또는 달리 추가로 사용될 수 있다면, 목적 반응 생성물이 유일한 반응 생성물이거나 또는 출발 물질이 완전히 소모될 필요는 없다.
"화학적으로 실현가능한"은 유기 구조의 보편적으로 알려진 규칙이 위반되지 않는 결합 배열 또는 화합물을 의미하는데; 예를 들어, 특정 상황에서 자연에 존재하지 않는 5가 탄소 원자를 함유하는 청구항 정의 내의 구조는 청구범위 내에 없는 것으로 이해될 것이다. 본원에 개시된 구조는 그의 모든 실시양태에서 "화학적으로 실현가능한" 구조만을 포함하는 것으로 의도되며, 예를 들어 가변 원자 또는 기로 나타낸 구조에서 화학적으로 실현가능하지 않은 임의의 열거된 구조는 본원에 개시 또는 청구된 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 화학 구조의 "유사체"는, 모 구조로부터 합성적으로 용이하게 유도될 수 없을지라도 모 구조와의 실질적 유사성을 보존하고 있는 화학 구조를 지칭한다. 모 화학 구조로부터 합성적으로 용이하게 유도되는 관련된 화학 구조는 "유도체"로 지칭된다.
치환기가 그 정체가 특정된 원자 또는 원자들, "또는 결합"인 것으로 특정되는 경우, 치환기가 "결합"인 경우로 지칭되는 배위는 특정된 치환기에 인접한 기가 화학적으로 실현가능한 결합 배위로 서로 직접 연결되어 있는 배위이다.
특정한 입체화학 또는 이성질체 형태가 구체적으로 표시되지 않는 한, 구조의 모든 단일 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 라세미 형태가 의도된다. 몇몇 경우에, 구체적으로 청구된 화합물 중에 개별 입체이성질체가 기재될지라도, 입체화학적 지정은 다른 이성질체 형태가 덜 바람직하거나, 바람직하지 않거나, 또는 청구되지 않음을 암시하는 것은 아니다. 본 발명에 사용된 화합물은, 도시된 것으로부터 명백한 바와 같은 임의의 또는 모든 비대칭 원자에서의 풍부한 또는 분할된 광학 이성질체를 임의의 풍부화 정도로 포함할 수 있다. 라세미 및 부분입체이성질체 혼합물 둘 다, 뿐만 아니라 개별적 광학 이성질체는 그의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 파트너가 실질적으로 존재하지 않도록 단리 또는 합성될 수 있고, 이들 모두 본 발명의 범위 내이다.
"소분자"는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 또는 복수의 반복 단위로 구성된 합성 중합체가 아닌, 분자량 약 2 kDa 미만의 유기금속 화합물을 비롯한 유기 화합물을 지칭한다.
하나 이상의 치환기를 함유하는 본원에 기재된 임의의 기에 대하여, 그러한 기는 입체적으로 비현실적이고/거나 합성적으로 실현불가능한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 함유하지 않음을 이해해야 한다. 또한, 이 개시된 대상의 화합물은 이러한 화합물의 치환으로부터 발생한 모든 입체화학적 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로 단리되는 것 및 효과적인 치료제로의 제제화를 견디기에 충분하게 강건한 화합물을 가리키고자 하는 것이다. 안정한 화합물만이 본원에서 고려된다.
하나 초과의 분자 구조를 생성하는 구조 내 하나 초과의 배향으로 존재할 수 있는 기, 예를 들어 카르복스아미드 기 C(=O)NR이 언급될 때, 그 기는 문맥상 분자 구조 내 기의 배향이 분명히 제한되지 않는 한, 임의의 가능한 배향, 예를 들어 X-C(=O)N(R)-Y 또는 X-N(R)C(=O)-Y로 존재할 수 있다.
자연에서의 원자의 자연 발생 동위원소 분포와 상이한 분자 내 하나 이상의 원자의 동위원소 형태의 포함은 분자의 "동위원소 표지된 형태"로서 지칭된다. 원자의 구체적인 동위원소 형태가 표시되지 않는 한, 원자의 모든 동위원소 형태가 임의의 분자의 조성 내에 옵션으로서 포함된다. 예를 들어, 분자 내 임의의 수소 원자 또는 그의 세트는 수소의 동위원소 형태, 즉 임의 조합의 경수소 (1H), 중수소 (2H) 또는 삼중수소 (3H) 중 임의의 것일 수 있다. 유사하게, 분자 내 임의의 탄소 원자 또는 그의 세트는 탄소의 동위원소 형태, 예컨대 11C, 12C, 13C 또는 14C 중 임의의 것일 수 있거나, 또는 분자 내 임의의 질소 원자 또는 그의 세트는 질소의 동위원소 형태, 예컨대 13N, 14N 또는 15N 중 임의의 것일 수 있다. 분자는 분자를 구성하는 성분 원자 내에 임의 조합의 동위원소 형태를 포함할 수 있고, 분자를 형성하는 모든 원자의 동위원소 형태는 독립적으로 선택된다. 화합물의 다중-분자 샘플에서, 모든 개별 분자가 반드시 동일한 동위원소 조성을 갖는 것은 아니다. 예를 들어, 화합물의 샘플은, 거시적 샘플을 구성하는 분자 세트의 일부 분획만이 방사성 원자를 함유하는 것인 삼중수소 또는 14C 방사성표지된 샘플에서와 같이, 다양한 상이한 동위원소 조성을 함유하는 분자를 포함할 수 있다. 또한, 인공적으로 동위원소 농축된 것이 아닌 다수의 원소는 자연 발생 동위원소 형태, 예컨대 14N 및 15N, 32S 및 34S 등의 혼합물임을 이해해야 한다. 본원에 언급된 바와 같은 분자는 분자 내 각 위치에서 그의 모든 구성성분 원소의 동위원소 형태를 포함하는 것으로 정의된다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 동위원소 표지된 화합물은 동위원소 표지된 전구체 분자를 치환하는 것을 제외하고는, 통상의 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 방사성표지된 또는 안정한 동위원소는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 핵 반응기 내 전구체 핵종의 중성자 흡수, 사이클로트론 반응, 또는 질량 분광측정법과 같은 동위원소 분리에 의한 생성에 의해 수득될 수 있다. 동위원소 형태는 임의의 특정한 합성 경로에서의 사용에 요구되는 바와 같은 전구체로 혼입된다. 예를 들어, 14C 및 3H는 핵 반응기에서 생성된 중성자를 사용하여 제조될 수 있다. 핵 변환 후에, 14C 및 3H는 전구체 분자로 혼입되고, 필요에 따라 추가의 정교화가 이어진다.
일반적으로, "치환된"은 내부에 함유된 수소 원자에 대한 하나 이상의 결합이 비-수소 원자, 예컨대 비제한적으로 할로겐 (즉, F, Cl, Br 및 I); 히드록실 기, 알콕시 기, 아릴옥시 기, 아르알킬옥시 기, 옥소(카르보닐) 기, 카르복실산, 카르복실레이트 및 카르복실레이트 에스테르를 비롯한 카르복실 기와 같은 기에서의 산소 원자; 티올 기, 알킬 및 아릴 술피드 기, 술폭시드 기, 술폰 기, 술포닐 기 및 술폰아미드 기와 같은 기에서의 황 원자; 아민, 히드록실아민, 니트릴, 니트로 기, N-옥시드, 히드라지드, 아지드 및 엔아민과 같은 기에서의 질소 원자; 및 다양한 다른 기에서의 다른 헤테로원자에 대한 하나 이상의 결합에 의해 대체된 것인, 본원에 정의된 바와 같은 유기 기를 지칭한다. 치환된 탄소 (또는 다른) 원자에 결합될 수 있는 치환기 J1, J2 및 J3의 비제한적 예는 F, Cl, Br, I, OR', OC(O)N(R')2, CN, NO, NO2, ONO2, 아지도, CF3, OCF3, R', O (옥소), S (티오노), 메틸렌디옥시, 에틸렌디옥시, N(R')2, SR', SOR', SO2R', SO2N(R')2, SO3R', C(O)R', C(O)C(O)R', C(O)CH2C(O)R', C(S)R', C(O)OR', OC(O)R', C(O)N(R')2, OC(O)N(R')2, C(S)N(R')2, (CH2)0- 2N(R')C(O)R', (CH2)0- 2N(R')N(R')2, N(R')N(R')C(O)R', N(R')N(R')C(O)OR', N(R')N(R')CON(R')2, N(R')SO2R', N(R')SO2N(R')2, N(R')C(O)OR', N(R')C(O)R', N(R')C(S)R', N(R')C(O)N(R')2, N(R')C(S)N(R')2, N(COR')COR', N(OR')R', C(=NH)N(R')2, C(O)N(OR')R' 또는 C(=NOR')R'를 포함하고, 여기서 R'는 수소 또는 탄소-기재 모이어티일 수 있고, 여기서 탄소-기재 모이어티는 그 자체가 추가로 치환될 수 있는데; 예를 들어, R'는 수소, 알킬, 아실, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로시클릴, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬일 수 있고, 여기서 임의의 알킬, 아실, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로시클릴, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나; 또는 질소 원자 또는 인접한 질소 원자에 결합된 2개의 R' 기는 질소 원자 또는 원자들과 함께 헤테로시클릴을 형성할 수 있고, 이는 J로 일-치환 또는 독립적으로 다중-치환될 수 있다.
다양한 실시양태에서, J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로 할로, 니트로, 시아노, OR, NR'2 또는 R'일 수 있거나, 또는 C(O)OR', C(O)NR'2, OC(O)OR', OC(O)NR'2, N(R')C(O)OR', N(R')C(O)NR'2 또는 그의 티오/티오노 유사체이다. "그의 티오/티오노 유사체"란, O를 함유하는 기와 관련하여, 기 내의 임의의 또는 모든 O 원자가 S 원자에 의해 대체될 수 있음을 의미하는데; 예를 들어, 기 C(O)OR에 대한 "그의 티오/티오노 유사체"는 C(S)OR, C(O)SR 및 C(S)SR을 포함하고; 예를 들어, 기 OC(O)NR2에 대한 "그의 티오/티오노 유사체"는 SC(O)NR2, OC(S)NR2 및 SC(S)NR2를 포함하는 식이다.
다양한 실시양태에서, J1, J2 및 J3은 할로, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)할로알킬, 히드록시(C1-C6)알킬, 알콕시(C1-C6)알킬, (C1-C6)알카노일, (C1-C6)알카노일옥시, 시아노, 니트로, 아지도, R'2N, R2NC(O), R'2NC(O)O, R'2NC(O)NR, (C1-C6)알케닐, (C1-C6)알키닐, (C6-C10)아릴, (C6-C10)아릴옥시, (C6-C10)아로일, (C6-C10)아릴(C1-C6)알킬, (C6-C10)아릴(C1-C6)알콕시, (C6-C10)아릴옥시(C1-C6)알킬, (C6-C10)아릴옥시(C1-C6)알콕시, (3- 내지 9-원)헤테로시클릴, (3- 내지 9-원)헤테로시클릴(C1-C6)알킬, (3- 내지 9-원)헤테로시클릴(C1-C6)알콕시, (5- 내지 10-원)헤테로아릴, (5- 내지 10-원)헤테로아릴(C1-C6)알킬, (5- 내지 10-원)헤테로아릴(C1-C6)알콕시 또는 (5- 내지 10-원)헤테로아로일 중 임의의 것이다. 예를 들어, R'는 각 경우에 독립적으로 H, (C1-C6)알킬 또는 (C6-C10)아릴일 수 있고, 여기서 임의의 알킬 또는 아릴 기는 0-3개의 J로 치환된다.
치환기가 1가, 예컨대, 예를 들어 F 또는 Cl인 경우, 그것은 그것이 치환하는 원자에 단일 결합에 의해 결합된다. 치환기가 1가 초과, 예컨대 2가인 O인 경우, 그것은 그것이 치환하는 원자에 1개 초과의 결합에 의해 결합될 수 있는데, 즉 2가 치환기는 이중 결합에 의해 결합되고; 예를 들어, O로 치환된 C는 카르보닐 기인 C=O를 형성하며, 이는 또한 "CO", "C(O)" 또는 "C(=O)"로서 기재될 수 있고, 여기서 C 및 O는 이중 결합된다. 탄소 원자가 이중-결합된 산소 (=O) 기로 치환된 경우, 산소 치환기는 "옥소" 기로 명명된다. NR'와 같은 2가 치환기가 탄소 원자에 이중-결합된 경우, 생성된 C(=NR') 기는 "이미노" 기로 명명된다. S와 같은 2가 치환기가 탄소 원자에 이중-결합된 경우, 생성된 C(=S) 기는 "티오카르보닐" 또는 "티오노" 기로 명명된다.
대안적으로, O 또는 S와 같은　2가 치환기는 2개의 단일 결합에 의해 2개의 상이한 탄소 원자에 연결될 수 있다. 예를 들어, 2가 치환기인 O는 2개의 인접한 탄소 원자 각각에 결합되어 에폭시드 기를 제공할 수 있거나, 또는 O는 인접 또는 비-인접 탄소 원자 사이에 "옥시" 기로 명명된 가교 에테르 기를 형성할 수 있는데, 예를 들어 시클로헥실 기의 1,4-탄소를 가교시켜 [2.2.1]-옥사비시클로 시스템을 형성한다. 추가로, 임의의 치환기가 링커, 예컨대 (CH2)n 또는 (CR'2)n에 의해 탄소 또는 다른 원자에 결합될 수 있고, 여기서 n은 1, 2, 3, 또는 그 초과이고, 각각의 R'는 독립적으로 선택된다.
또 다른 2가 치환기는 C=로 나타내어지는 알킬리덴 탄소이고, 이는 2개의 추가의 기를 또한 보유하는 이렇게 표시된 탄소 원자가 제3의 기에 이중 결합됨을 의미한다. 예를 들어, (CH3)2C=는 또 다른 탄소 또는 질소 원자에 결합된 이소프로필리덴 기를 가리킨다.
C(O) 및 S(O)2　기는 또한 탄소 원자가 아닌 1 또는 2개의 헤테로원자, 예컨대 질소 또는 산소에 결합될 수 있다. 예를 들어, C(O) 기가 1개의 탄소 및 1개의 질소 원자에 결합된 경우, 생성된 기는 "아미드" 또는 "카르복스아미드"로 불린다. C(O) 기가 2개의 질소 원자에 결합된 경우, 관능기는 "우레아"로 명명된다. C(O)가 1개의 산소 및 1개의 질소 원자에 결합된 경우, 생성된 기는 "카르바메이트" 또는 "우레탄"으로 명명된다. S(O)2　기가 1개의 탄소 및 1개의 질소 원자에 결합된 경우, 생성된 단위는 "술폰아미드"로 명명된다. S(O)2　기가 2개의 질소 원자에 결합된 경우, 생성된 단위는 "술파미드"로 명명된다.
치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬 및 시클로알케닐 기 뿐만 아니라 다른 치환된 기는 또한 수소 원자에 대한 하나 이상의 결합이 탄소 원자 또는 헤테로원자, 예컨대 비제한적으로 카르보닐 (옥소), 카르복실, 에스테르, 아미드, 이미드, 우레탄 및 우레아 기에서의 산소; 이민, 히드록시이민, 옥심, 히드라존, 아미딘, 구아니딘 및 니트릴에서의 질소에 대한 이중 또는 삼중 결합을 비롯한 하나 이상의 결합에 의해 대체된 것인 기를 포함한다.
치환된 고리 기, 예컨대 치환된 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴 및 헤테로아릴 기는 또한 수소 원자에 대한 결합이 탄소 원자에 대한 결합으로 대체된 것인 고리 및 융합된 고리계를 포함한다. 따라서, 치환된 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴 및 헤테로아릴 기는 또한 본원에 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐 및 알키닐 기로 치환될 수 있다.
기, 예를 들어 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴 등 내의 탄소 원자 수가 범위로서 명시된 경우에는, 탄소 원자 수를 나타내는 각각의 개별적 정수가 의도된다. 예를 들어, (C1-C4)알킬 기의 언급은 알킬 기가 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸 중 임의의 것일 수 있음을 가리킨다. 탄소 원자 수의 명시는 정수여야 함을 이해해야 한다.
알킬 기는 1 내지 약 20개의 탄소 원자, 전형적으로 1 내지 12개의 탄소, 또는 일부 실시양태에서는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 분지형 알킬 기 및 시클로알킬 기를 포함한다. 직쇄 알킬 기의 예는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 것, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸 기를 포함한다. 분지형 알킬기의 예는 이소프로필, 이소-부틸, sec-부틸, t-부틸, 네오펜틸, 이소펜틸 및 2,2-디메틸프로필 기를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬"은 n-알킬, 이소알킬 및 안테이소알킬 기 뿐만 아니라 알킬의 다른 분지쇄 형태를 포괄한다.
대표적인 치환된 알킬 기는 상기 나열된 임의의 기, 예를 들어 아미노, 히드록시, 시아노, 카르복시, 니트로, 티오, 알콕시, 및 할로겐 기로 1회 이상 치환될 수 있다. 예시적인 알킬 기는 본원에서 각각 C1- 6알킬, C1- 4알킬 및 C1- 3알킬이라 지칭되는, 1-6개, 1-4개 또는 1-3개 탄소 원자의 직쇄형 또는 분지형 탄화수소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알킬 기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 2-메틸-1-부틸, 3-메틸-2-부틸, 2-메틸-1-펜틸, 3-메틸-1-펜틸, 4-메틸-1-펜틸, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 2,2-디메틸-1-부틸, 3,3-디메틸-1-부틸, 2-에틸-1-부틸, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
아릴 기는 고리 내에 헤테로원자를 함유하지 않는 시클릭 방향족 탄화수소이다. 따라서, 아릴 기는 페닐, 아줄레닐, 헵탈레닐, 비페닐, 인다세닐, 플루오레닐, 페난트레닐, 트리페닐레닐, 피레닐, 나프타세닐, 크리세닐, 비페닐레닐, 안트라세닐, 및 나프틸 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 아릴 기는 기의 고리 부분에 약 6개 내지 약 14개의 탄소를 함유한다. 아릴 기는 상기 정의된 바와 같이 치환되지 않을 수도 있고 치환될 수도 있다. 대표적인 치환된 아릴 기는 일치환 또는 1회 초과 치환될 수 있고, 예를 들어 탄소 또는 비-탄소 기, 예컨대 상기 나열한 것들로 치환될 수 있는 2-, 3-, 4-, 5-, 또는 6-치환된 페닐 또는 2-8 치환된 나프틸 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
아르알킬 기는 알킬 기의 수소 또는 탄소 결합이 상기 정의된 바와 같은 아릴 기로의 결합으로 대체된, 상기 정의된 바와 같은 알킬 기이다. 대표적인 아르알킬 기는 벤질 및 페닐에틸 기 및 융합된 (시클로알킬아릴)알킬 기, 예컨대 4-에틸-인다닐을 포함한다. 아르알케닐 기는 알킬 기의 수소 또는 탄소 결합이 상기 정의된 바와 같은 아릴 기로의 결합으로 대체된, 상기 정의된 바와 같은 알케닐 기이다.
용어 "알콕시" 또는 "알콕실"은 시클로알킬 기를 포함하는 상기 정의된 바와 같은 알킬 기에 산소 원자가 연결된 것을 지칭한다. 선형 알콕시 기의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜틸옥시, 헥실옥시 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 분지형 알콕시의 예는 이소프로폭시, sec-부톡시, tert-부톡시, 이소펜틸옥시, 이소헥실옥시 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알콕시 기는 본원에서 각각 C1- 6알콕시 및 C2- 6알콕시라 지칭되는, 1-6개 또는 2-6개 탄소 원자의 알콕시 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 알콕시 기는 메톡시, 에톡시, 이소프로폭시 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
알콕시 기는 산소 원자에 결합된 1개 내지 약 12-20개의 탄소 원자를 포함할 수 있고, 이중 또는 삼중 결합을 추가로 포함할 수 있으며, 또한 헤테로원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 알릴옥시 기는 본원에서의 의미상 알콕시 기이다. 메톡시에톡시 기 또한 본원에서의 의미상 알콕시 기이고, 메틸렌디옥시 기는 해당 구조의 2개의 인접 원자가 치환된 것이라는 의미에서 마찬가지이다.
달리 언급되지 않는 한, 그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서의 용어 "할로" 또는 "할로겐" 또는 "할라이드"는 플루오린, 염소, 브로민, 또는 아이오딘 원자, 바람직하게는 플루오린, 염소, 또는 브로민을 의미한다.
"할로알킬" 기는 모노-할로 알킬 기, 모든 할로 원자가 동일하거나 상이할 수 있는 폴리-할로 알킬 기, 및 모든 수소 원자가 할로겐 원자, 예컨대 플루오로로 대체되는 퍼-할로 알킬 기를 포함한다. 할로알킬의 예는 트리플루오로메틸, 1,1-디클로로에틸, 1,2-디클로로에틸, 1,3-디브로모-3,3-디플루오로프로필, 퍼플루오로부틸 등을 포함한다.
"할로알콕시" 기는 모노-할로 알콕시 기, 모든 할로 원자가 동일하거나 상이할 수 있는 폴리-할로 알콕시 기, 및 모든 수소 원자가 할로겐 원자, 예컨대 플루오로로 대체되는 퍼-할로 알콕시 기를 포함한다. 할로알콕시의 예는 트리플루오로메톡시, 1,1-디클로로에톡시, 1,2-디클로로에톡시, 1,3-디브로모-3,3-디플루오로프로폭시, 퍼플루오로부톡시 등을 포함한다.
용어 "아민" 또는 "아미노"는 예를 들어 화학식 N(기)3 (여기서, 각각의 기는 독립적으로 H일 수도 있고 H 이외의 것, 예컨대 알킬, 아릴 등일 수 있음)을 갖는 1급, 2급, 및 3급 아민을 포함한다. 아민은 R'-NH2, 예를 들어 알킬아민, 아릴아민, 알킬아릴아민; R'2NH (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 선택됨), 예컨대 디알킬아민, 디아릴아민, 아르알킬아민, 헤테로시클릴아민 등; 및 R'3N (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 선택됨), 예컨대 트리알킬아민, 디알킬아릴아민, 알킬디아릴아민, 트리아릴아민 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "아민"은 또한 본원에서 사용된 바와 같은 암모늄 이온을 포함한다.
"아미노" 기는 형태 -NH2, -NHR', -NR'2, -NR'3 + (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 선택됨) 및 양성자화될 수 없는 -NR'3 +를 제외한 각각의 양성자화 형태의 치환기이다. 따라서, 아미노 기로 치환된 임의의 화합물이 아민으로 간주될 수 있다. 본원에서의 의미상, "아미노 기"는 1급, 2급, 3급 또는 4급 아미노 기일 수 있다. "알킬아미노" 기는 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 및 트리알킬아미노 기를 포함한다.
"암모늄" 이온은 비치환된 암모늄 이온 NH4 +를 포함하지만, 달리 명시되지 않는 한은 또한 아민의 임의의 양성자화 또는 4급화 형태를 포함한다. 따라서, 본원에서의 의미상, 트리메틸암모늄 히드로클로라이드 및 테트라메틸암모늄 클로라이드는 암모늄 이온이면서 또한 아민이다.
용어 "아미드" (또는 "아미도")는 C- 및 N-아미드 기, 즉 각각 -C(O)NR'2, 및 -NR'C(O)R' 기를 포함한다. 따라서, 아미드 기는 1급 카르복스아미드 기 (-C(O)NH2) 및 포름아미드 기 (-NHC(O)H)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "카르복스아미도" 기는 화학식 C(O)NR'2 (여기서, R'는 H, 알킬, 아릴 등일 수 있음)의 기이다.
관련 기술분야에도 공지되어 있는 바와 같이, "염"은 이온 형태의 유기 화합물, 예컨대 카르복실산, 술폰산, 또는 아민을 반대이온과 함께 포함한다. 예를 들어, 음이온성 형태의 산은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예를 들어 나트륨, 칼륨 등, 암모늄 염, 예컨대 NH4 + 또는 다양한 아민의 양이온, 예를 들어 테트라알킬 암모늄 염, 예컨대 테트라메틸암모늄, 또는 다른 양이온, 예컨대 트리메틸술포늄 등과 염을 형성할 수 있다. "제약상 허용되는" 또는 "약리학상 허용되는" 염은 인간 사용에 대해 승인을 받은 이온으로부터 형성된 염이고, 일반적으로 비-독성, 예컨대 클로라이드 염 또는 나트륨 염이다. "쯔비터이온"은 예를 들어 서로 균형을 맞추는 기능을 하는 적어도 2개의 이온화가능한 기, 음이온을 형성하는 기 및 양이온을 형성하는 다른 기를 갖는 분자 내에 형성될 수 있는 것과 같은 내부 염이다. 예를 들어, 아미노산, 예컨대 글리신은 쯔비터이온 형태로 존재할 수 있다. "쯔비터이온"은 본원에서의 의미상 염이다. 본 발명의 화합물은 염의 형태일 수 있다. 용어 "염"은 본 발명의 화합물인 유리 산 또는 유리 염기의 부가염을 포함한다. 염은 "제약상 허용되는 염"일 수 있다. 용어 "제약상 허용되는 염"은 제약 용도에서 유용성을 갖는 범위 내의 독성 프로파일을 보유하는 염을 지칭한다. 그러나, 제약상 허용되지 않는 염이 본 발명의 실시에 유용성, 예컨대 예를 들어 본 발명의 화합물의 합성, 정제 또는 제제화 과정에 유용성을 갖는 특성, 예컨대 높은 결정화도를 가질 수 있다.
"제약상 또는 약리학상 허용되는"은 동물 또는 적절하다면 인간에게 투여시 유해하거나, 알레르기성이거나, 또는 기타 부반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 포함한다. 인간 투여의 경우, 제제는 생물체의 FDA (FDA Office of Biologics) 기준이 요구하는 멸균성, 발열원성, 및 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
"수화물"은 물 분자를 갖는 조성으로 존재하는 화합물이다. 상기 조성은 화학량론적 양의 물을 포함 (예컨대, 1수화물 또는 2수화물)할 수도 있고, 또는 무작위 양의 물을 포함할 수도 있다. 본원에서 용어 "수화물"이 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 고체 형태를 지칭하며, 즉 물 용액 중 화합물은 수화될 수 있어도 본원에서의 내용상 수화물이 아니다.
추가로, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬(Markush) 군의 방식으로 기재되는 경우, 관련 기술분야의 숙련가는 이에 의해서 본 발명이 또한 해당 마쿠쉬 군의 임의의 개별적 구성원, 또는 구성원들의 하위군 방식으로 기재된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, X가 브로민, 염소, 및 아이오딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 기재된다면, X가 브로민인 청구항 및 X가 브로민 및 염소인 청구항이 완전하게 기재된 것이다. 더욱이, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 군의 방식으로 기재되는 경우, 관련 기술분야의 숙련가는 이에 의해서 본 발명이 또한 해당 마쿠쉬 군의 개별적 구성원, 또는 구성원들의 하위군의 임의의 조합 방식으로 기재된다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 예를 들어, X가 브로민, 염소, 및 아이오딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 기재되고, Y가 메틸, 에틸, 및 프로필로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 기재된다면, X가 브로민이고 Y가 메틸인 청구항이 완전하게 기재된 것이다.
반드시 정수인 변수의 값, 예를 들어 알킬 기 내 탄소 원자의 수 또는 고리상의 치환기 수는 범위, 예를 들어 0 내지 4로서 기재되는데, 이는 0 내지 4 내에 포함되는 임의의 정수일 수 있는 값, 즉, 0, 1, 2, 3, 또는 4를 의미한다.
다양한 실시양태에서, 예컨대 본 발명의 방법에서 사용되는 바와 같은 화합물 또는 화합물들의 세트는 상기 언급된 실시양태의 임의의 조합 및/또는 하위 조합 중 임의의 하나일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 임의의 실시예 또는 예시적인 화합물에 나타낸 화합물이 제공된다. 임의의 개시된 카테고리 또는 실시양태에서 임의의 하나 이상의 다른 상기 개시된 실시양태 또는 실시형태가 제외될 수 있는 경우, 단서 조항이 이러한 카테고리 또는 실시양태에 적용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 본원에 기재된 화합물은 본원에 제시된 교시내용 및 관련 기술분야에 공지된 합성 절차를 기초로 하는 수많은 방식으로 제조될 수 있다. 하기 기재하는 합성 방법의 설명에서, 용매, 반응 분위기, 반응 온도, 실험 기간 및 후처리 절차의 선택을 비롯한 모든 제안된 반응 조건은 달리 나타내지 않는 한은 해당 반응에 표준적인 조건으로 선택될 수 있다는 것이 이해된다. 유기 합성 분야의 숙련가라면, 분자의 다양한 부분에 존재하는 관능성은 제안된 시약 및 반응과 상용가능해야 한다는 것을 이해할 것이다. 해당 반응 조건과 상용가능하지 않은 치환기는 관련 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이고, 이에 따라 대안적 방법이 적용된다. 출발 물질은 예를 들어 상업적으로 입수가능하거나 공지된 물질로부터 표준 방법에 의해 쉽게 제조된다. 모든 상업적으로 입수가능한 화학물질은 알드리치(Aldrich), 알파 애사르(Alfa Aesare), 와코(Wako), 아크로스(Acros), 피셔(Fisher), 플루카(Fluka), 메이브릿지(Maybridge) 등으로부터 구입하였고, 언급한 경우를 제외하고는 추가 정제 없이 사용하였다. 무수 용매는 예를 들어 이것들을 활성 알루미나 컬럼에 통과시켜 수득하였다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 단리된 화합물을 포함한다. 표현 "단리된 화합물"은 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물들의 혼합물의 제제를 지칭하며, 여기서의 단리된 화합물은 해당 화합물(들)의 합성 동안 사용된 시약 및/또는 형성된 부산물로부터 분리된 것이다. "단리된"은 해당 제제가 기술적으로 순수 (균질)하다는 의미는 아니지만, 치료학적으로 사용될 수 있는 형태의 화합물로는 충분히 순수하다. 바람직하게는, "단리된 화합물"은 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물들의 혼합물을 총 중량의 적어도 10 중량%의 양으로 함유하는, 상기 화합물, 또는 본 발명의 화합물들의 혼합물의 제제를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 제제는 상기 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 제제의 총 중량의 적어도 50 중량%의 양으로 함유하고, 보다 바람직하게는 제제의 총 중량의 적어도 80 중량%, 가장 바람직하게는 제제의 총 중량의 적어도 90 중량%, 적어도 95 중량% 또는 적어도 98 중량%의 양으로 함유한다.
본 발명의 화합물 및 중간체는 그의 반응 혼합물로부터 단리될 수 있고, 표준 기술, 예컨대 여과, 액체-액체 추출, 고체 상 추출, 증류, 재결정화 또는 크로마토그래피, 예컨대 플래쉬 칼럼 크로마토그래피, 또는 HPLC에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 화합물이 하나 이상의 키랄 중심을 함유하는 경우, 상기 화합물이 단일의 실질적으로 순수한 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 형태로서 또는 라세미 혼합물로서 존재할 수 있고, 그와 같이 단리될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 임의의 가능한 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 함유할 수 있으며, 따라서 입체이성질체로서 존재할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "입체이성질체"는 모든 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로 이루어진다. 이들 화합물은 입체생성 탄소 원자 주변의 치환기 배위에 따라 기호 "(+)", "(-)", "R" 또는 "S"로 지정될 수 있지만, 통상의 기술자라면 해당 구조가 키랄 중심을 함축적으로 나타낼 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명은 이들 화합물의 다양한 입체이성질체 및 이들의 혼합물을 포함한다.
거울상이성질체 또는 부분입체이성질체의 혼합물은 명명시에 "(±)"로 지정될 수 있지만, 통상의 기술자라면 해당 구조가 키랄 중심을 함축적으로 나타낼 수 있음을 인식할 것이다.
본 개시내용의 화합물은 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있으며, 따라서 탄소-탄소 이중 결합 주변의 치환기 배열로 인해 생성되는 기하 이성질체로서 존재할 수 있다. 기호
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는 본원에 기재된 바와 같이 단일, 이중 또는 삼중 결합일 수 있는 결합을 나타낸다. 탄소-탄소 이중 결합 주변의 치환기는 "Z" 또는 "E" 배위인 것으로 지정되며, 여기서 용어 "Z" 및 "E"는 IUPAC 표준에 따라 사용된다. 달리 명시되지 않는 한, 이중 결합이 도시된 구조는 "E" 및 "Z" 이성질체 둘 다를 포함할 수 있다. 대안적으로, 탄소-탄소 이중 결합 주변의 치환기는 "시스" 또는 "트랜스"로 지칭될 수 있으며, 여기서 "시스"는 이중 결합의 동일한 측면 상에 있는 치환기를 나타내고, "트랜스"는 이중 결합의 반대 측면 상에 있는 치환기를 나타낸다.
본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 화합물은 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 함유할 수 있으며, 따라서 고리 주변의 치환기 배열로 인해 생성되는 기하 이성질체로서 존재할 수 있다. 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리 주변의 치환기 배열은 "Z" 또는 "E" 배위인 것으로 지정되며, 여기서 용어 "Z" 및 "E"는 IUPAC 표준에 따라 사용된다. 달리 명시되지 않는 한, 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리가 도시된 구조는 "Z" 및 "E" 이성질체 둘 다를 포함한다. 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리 주변의 치환기는 또한 "시스" 또는 "트랜스"로 지칭될 수 있으며, 여기서 용어 "시스"는 고리면의 동일한 측면 상에 있는 치환기를 나타내고, 용어 "트랜스"는 고리면의 반대 측면 상에 있는 치환기를 나타낸다. 치환기가 고리면의 동일한 측면 및 반대 측면 둘 다에 배치되어 있는 화합물의 혼합물은 "시스/트랜스"로 지칭된다.
고려되는 화합물의 개별 거울상이성질체 및 부분입체이성질체는 비대칭 또는 입체생성 중심을 함유하는 상업적으로 입수가능한 출발 물질로부터 합성에 의해 제조될 수 있거나, 또는 라세미 혼합물을 제조한 후, 관련 기술분야의 숙련가에게 널리 공지된 분할 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 분할 방법으로서 (1) 거울상이성질체의 혼합물의 키랄 보조제로의 부착, 재결정화 또는 크로마토그래피에 의해 생성된 부분입체이성질체의 혼합물의 분리, 및 보조제로부터 광학적으로 순수한 생성물의 유리, (2) 광학 활성 분할제를 이용하는 염 형성, (3) 키랄 액체 크로마토그래피 칼럼 상에서 광학 거울상이성질체의 혼합물의 직접 분리, 또는 (4) 입체선택적 화학 또는 효소 시약을 이용하는 동역학적 분할을 예로 들 수 있다. 라세미 혼합물은 또한 널리 공지된 방법, 예컨대 키랄-상 액체 크로마토그래피, 또는 키랄 용매 중에서 화합물의 결정화에 의해 그의 성분 거울상이성질체로 분할될 수 있다. 입체선택적 합성으로서, 단일 반응물이 새로운 입체중심을 생성하는 동안 또는 기존 입체중심을 변환하는 동안에 입체이성질체의 불균등 혼합물을 형성하는 화학 또는 효소 반응이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 입체선택적 합성은 거울상이성질체-선택적 및 부분입체이성질체-선택적 변환 둘 다를 포함하며, 키랄 보조제의 사용과 관련이 있을 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carreira and Kvaerno, Classics in Stereoselective Synthesis, Wiley-VCH: Weinheim, 2009]을 참조한다.
키랄 중심의 존재로 인해 생성되는 이성질체는 "거울상이성질체"로 지칭되는 중첩되지 않는 이성질체의 쌍을 포함한다. 순수한 화합물의 단일 거울상이성질체는 광학 활성이며, 즉, 이들은 평면 편광면에서 회전가능하다. 단일 거울상이성질체는 칸-인골드-프렐로그(Cahn - Ingold - Prelog) 시스템에 따라 지정된다. 치환기의 우선 순위는 원자량을 기준으로 결정되며, 체계적인 절차에 따라 측정시 원자량이 클 수록 우선순위가 더 높다. 4개의 기의 우선순위를 결정할 때, 가장 낮은 순위를 갖는 기가 보는 이로부터 멀리 떨어져 있도록 분자는 배향시킨다. 이어서, 다른 기들의 순위 순서가 시계방향으로 낮아지는 경우, 분자는 (R) 절대 배위를 갖는 것으로 지정되고, 다른 기들의 순위가 시계 반대방향으로 낮아지는 경우, 분자는 (S) 절대 배위를 갖는 것으로 지정된다. 하기 도식의 예에서, 칸-인골드-프렐로그 순위는 A > B > C > D이다. 가장 낮은 순위의 원자 D를 보는 이로부터 멀리 배향시킨다.
Figure pct00012
Figure pct00013
(R) 배위 (S) 배위
상기 도시된 바와 같이 A-D 원자를 보유하는 탄소 원자는 "키랄" 탄소 원자로 공지되고, 분자에서 그러한 탄소 원자의 위치는 "키랄 중심"으로 지칭된다. 본 발명의 화합물은 1개 초과의 키랄 중심을 함유할 수 있고, 각각의 키랄 중심에서의 배위는 동일한 방식으로 기재된다.
본 발명은 부분입체이성질체 뿐만 아니라, 그의 라세미 및 분할된, 부분입체이성질체적으로 및 거울상이성질체적으로 순수한 형태 및 그의 염을 포함하는 것으로 의도된다. 부분입체이성질체 쌍은 공지된 분리 기술, 예컨대 정상 및 역상 크로마토그래피, 및 결정화에 의해 분할될 수 있다.
"단리된 광학 이성질체" 또는 "단리된 거울상이성질체"는 동일한 화학식을 갖는 상응하는 광학 이성질체(들)로부터 실질적으로 정제된 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 이성질체는 적어도 약 80 중량%, 보다 바람직하게는 적어도 90 중량% 거울상이성질체적으로 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 98 중량% 거울상이성질체적으로 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 약 99 중량% 거울상이성질체적으로 순수한 것이다. "거울상이성질체 순도"는 화합물의 광학 이성질체의 거울상이성질체 혼합물 중에서 우세한 거울상이성질체의 백분율을 의미한다. 순수한 단일 거울상이성질체는 100%의 거울상이성질체 순도를 갖는다.
단리된 광학 이성질체는 널리 공지된 키랄 분리 기술에 의해 라세미 혼합물로부터 정제된 형태일 수 있다. 그러한 한 방법에 따라, 본 발명의 화합물 또는 그의 키랄 중간체의 라세미 혼합물은 적절한 키랄 칼럼, 예를 들어 다이셀(DAICEL®) 키랄팩(CHIRALPAK®) 패밀리 시리즈 칼럼의 일원 (다이셀 케미칼 인더스트리즈, 리미티드(Daicel Chemical Industries, Ltd.), 일본 도쿄)을 사용하는 HPLC에 의해 99 중량% 순수한 광학 이성질체로 분리된다. 상기 칼럼은 제조업체의 지시에 따라 작동된다.
별개의 실질적으로 순수한 광학 이성질체를 수득하는 또 다른 널리 공지된 방법은 전형적인 분할이며, 이로써 이온화된 관능기, 예컨대 양성자화된 아민 또는 카르복실레이트 기를 함유하는 키랄 라세미 화합물은 반대되는 이온화된 키랄 비라세미 첨가제와 부분입체이성질체 염을 형성한다. 이어서, 생성된 부분입체이성질체 염 형태를 표준 물리적 수단, 예컨대 용해도 차이에 의해 분리한 다음, 키랄 비라세미 첨가제를 표준 화학적 수단에 의해 제거하거나 대안적인 반대이온으로 교체시키거나, 또는 대안적으로 부분입체이성질체 염 형태를 치료제로서 또는 치료제의 전구체로서 사용되는 염으로 유지시킬 수 있다.
본 발명의 실시양태의 또 다른 측면은 본 발명의 화합물을 단독으로 또는 또 다른 의약과의 조합으로 갖는 조성물을 제공한다. 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 입체이성질체, 호변이성질체, 용매화물, 전구약물, 제약상 허용되는 염 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은 통상의 기술에 의해, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., 1995] 또는 그의 후속 버젼에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 상기 조성물은 통상적인 형태, 예를 들어 캡슐, 정제, 에어로졸, 용액, 현탁액 또는 국소 적용제일 수 있다.
전형적인 조성물은 본 발명의 화합물, 및 담체 또는 희석제일 수 있는 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 예를 들어, 활성 화합물을 보통 담체와 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 또는 앰플, 캡슐, 사쉐, 종이 또는 다른 용기의 형태일 수 있는 담체 내에 동봉시킨다. 활성 화합물을 담체와 혼합하는 경우, 또는 담체가 희석제로 작용하는 경우에는, 이는 활성 화합물에 대해 비히클, 부형제 또는 배지로서 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 활성 화합물을 과립상 고체 담체 상에 흡착시키거나, 예를 들어 사쉐 내에 함유시킬 수 있다. 적합한 담체의 일부 예는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리히드록시에톡실화 피마자 오일, 땅콩 오일, 올리브 오일, 젤라틴, 락토스, 테라 알바, 수크로스, 덱스트린, 탄산마그네슘, 당, 시클로덱스트린, 아밀로스, 스테아르산마그네슘, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 스테아르산 또는 셀룰로스의 저급 알킬 에테르, 규산, 지방산, 지방산 아민, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌, 히드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈이다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 지속 방출 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와의 혼합으로 포함할 수 있다.
제제는 활성 화합물과 유해하게 반응하지 않는 보조제와 혼합될 수 있다. 그러한 첨가제에는 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제 및/또는 착색 물질 보존제, 감미제 또는 향미제가 포함될 수 있다. 조성물은 또한 경우에 따라 멸균될 수 있다.
투여 경로는 본 발명의 활성 화합물을 적절한 또는 목적하는 작용 부위로 효과적으로 수송하는 임의의 경로일 수 있으며, 예컨대 경구, 비측, 폐, 협측, 피하, 피내, 경피 또는 비경구, 예를 들어, 직장, 데포, 피하, 정맥내, 요도내, 근육내, 비강내, 안과 용액 또는 연고일 수 있고, 경구 경로가 바람직하다.
경구 투여를 위해 고체 담체를 사용하는 경우, 제제를 타정하고, 경질 젤라틴 캡슐에 분말 또는 펠릿 형태로 넣을 수 있거나, 또는 제제는 트로키 또는 로젠지 형태일 수 있다. 액체 담체를 사용하는 경우, 제제는 시럽, 에멀젼, 연질 젤라틴 캡슐 또는 멸균 주사액, 예컨대 수성 또는 비-수성 액체 현탁액 또는 용액의 형태일 수 있다.
일반적으로, 주사가능한 투여 형태는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 제조될 수 있는 수성 현탁액 또는 유성 현탁액을 포함한다. 주사가능한 형태는 용액 상이거나 또는 현탁액 형태일 수 있으며, 이는 용매 또는 희석제를 사용하여 제조된다. 허용가능한 용매 또는 비히클에는 멸균수, 링거액, 또는 등장성 수성 염수 용액이 포함된다. 대안적으로, 멸균 오일을 용매 또는 현탁화제로서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 오일 또는 지방산은 비-휘발성 오일, 예컨대 천연 또는 합성 오일, 지방산, 모노-, 디- 또는 트리-글리세리드이다.
주사용 제제는 또한 상기 기재된 바와 같은 적절한 용액과의 재구성에 적합한 분말일 수 있다. 이들의 예로는 동결 건조, 회전 건조 또는 분무 건조된 분말, 무정형 분말, 과립, 침전물, 또는 미립자가 포함되나 이들로 제한되지는 않는다. 주사용 제제는 임의로 안정화제, pH 조절제, 계면활성제, 생체이용률 개질제 및 이들의 조합을 함유할 수 있다. 상기 화합물은 주사에 의한, 예컨대 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사용 단위 투여 형태는 앰플 또는 다중-용량 용기일 수 있다.
본 발명의 제제는 관련 기술분야에서 익히 공지된 절차를 사용하여 환자에게 투여 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공하도록 설계될 수 있다. 따라서, 제제는 또한 제어 방출성 또는 서방성으로 제제화될 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 조성물은 예를 들어, 미셀 또는 리포솜, 또는 일부 다른 캡슐화된 형태를 포함할 수 있거나, 또는 연장 방출 형태로 투여되어 장기적 저장 및/또는 전달 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 제제는 펠릿 또는 실린더로 압착될 수 있고, 데포 주사로서 근육내로 또는 피하로 이식될 수 있다. 그러한 이식편은 공지된 불활성 물질, 예컨대 실리콘 및 생분해성 중합체, 예를 들어, 폴리락티드-폴리글리콜리드를 사용할 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예로는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다.
비강 투여용 제제는 에어로졸 적용을 위해, 본 발명의 화합물을 액체 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해 또는 현탁시켜 함유할 수 있다. 담체는 첨가제, 예컨대 가용화제, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 계면활성제, 흡수 증진제, 예컨대 레시틴 (포스파티딜콜린) 또는 시클로덱스트린, 또는 보존제, 예컨대 파라벤을 함유할 수 있다.
비경구 적용에 대해, 폴리히드록실화 피마자 오일에 활성 화합물이 용해된 주사액 또는 현탁액, 바람직하게는 수용액이 특히 적합하다.
활석 및/또는 탄수화물 담체 또는 결합제 등을 갖는 정제, 당의정 또는 캡슐제가 경구 적용에 대해 특히 적합하다. 정제, 당의정 또는 캡슐제에 바람직한 담체로는 락토스, 옥수수 전분, 및/또는 감자 전분이 포함된다. 감미된 비히클이 사용되는 경우에 시럽제 또는 엘릭시르제가 사용될 수 있다.
통상적인 정제 기술에 의해 제조될 수 있는 전형적인 정제는 하기를 함유할 수 있다:
Figure pct00014
경구 투여용의 전형적인 캡슐제는 본 발명의 화합물 (250 mg), 락토스 (75 mg) 및 스테아르산마그네슘 (15 mg)을 함유한다. 상기 혼합물은 60 메쉬 체를 통해 통과되어 No. 1 젤라틴 캡슐 안에 충전된다. 전형적인 주사가능한 제제는 본 발명의 화합물 250 mg을 바이알 내에 무균 상태로 도입하고, 무균 동결-건조시키고, 씰링함으로써 제조된다. 사용을 위해서, 바이알의 내용물을 멸균 생리 염수 2 mL와 혼합하여 주사가능한 제제를 제조한다.
본 개시내용은 본 발명의 방법의 실시에서 유용한 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화된, 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 상기 방법에 대한, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화된 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이들 제제는 경구, 직장, 국소, 협측, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 피내 또는 정맥내), 직장, 질, 또는 에어로졸 투여에 적합한 것을 포함하지만, 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 투여 형태는 치료될 정도 및 증상의 중증도에 따라, 및 사용될 특정 화합물의 특성에 따라 좌우된다. 예를 들어, 개시된 조성물은 단위 용량으로 제형화될 수 있고/거나, 경구 또는 피하 투여용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 상기 상태이상의 치료, 예방, 제거, 완화 또는 개선이 필요한 포유동물, 특히 인간에게 투여될 수 있다. 그러한 포유동물로는 또한 가축, 예를 들어 애완 동물, 사육 동물, 및 비-가축, 예컨대 야생 동물과 같은 동물이 포함된다.
본 발명의 화합물은 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 유효하다. 예를 들어, 성인 인간의 치료시, 1일 약 0.05 내지 약 5000 mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 2000 mg, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 2000 mg의 투여량이 사용될 수 있다. 전형적인 투여량은 1일 약 10 mg 내지 약 1000 mg이다. 환자에 대한 치료요법을 선택하는데 있어, 종종 보다 높은 투여량으로 시작하고, 증상이 제어된 경우 투여량을 감소시키는 것이 필요할 수 있다. 정확한 투여량은 화합물의 활성, 투여 방식, 목적 요법, 투여되는 형태, 치료할 대상체 및 치료할 대상체의 체중, 및 담당 의사 또는 수의사의 기호 및 경험에 따라 달라질 것이다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 단위 투여량 당 약 0.05 mg 내지 약 1000 mg의 활성 성분을 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 단위 투여 형태로 분배된다.
통상적으로, 경구, 비측, 폐 또는 경피 투여에 적합한 투여 형태는 약 125 μg 내지 약 1250 mg, 바람직하게는 약 250 μg 내지 약 500 mg, 보다 바람직하게는 약 2.5 mg 내지 약 250 mg의 화합물을 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합하여 포함한다.
투여 형태는 매일 또는 1일 1회 초과, 예컨대 1일 2회 또는 3회 투여될 수 있다. 대안적으로, 투여 형태는 처방 의사에 의해 바람직하다고 밝혀진 경우, 매일보다 더 적은 빈도로, 예컨대 격일로, 또는 주 1회 투여될 수 있다.
상기 기재되거나 과학 문헌에서 발견된 절차를 사용하여 MALT1의 억제 및 다양한 세포 검정에서의 유효성에 대해 본원에 개시 및 청구된 특정 화합물을 평가하는 것은 통상의 지식 내에 있다. 따라서, 당업자는 과도한 실험 없이 임의의 청구된 화합물을 제조하고 평가할 수 있다.
MALT1의 효과적인 억제제인 것으로 밝혀진 특정 화합물은 마찬가지로 연구원의 기술 및 경험을 사용하여 동물 모델 및 인간 임상 연구에서 테스트하여 투여량의 선택 및 치료 요법을 유도할 수 있다.
생화학적 스크리닝으로 MALT1 단백질분해 활성의 저분자량 억제제를 확인함
본 발명자들은 MALT1 소분자 억제제가 MALT1 생물학을 연구하고 MALT1 중독된 종양을 치료하는데 유용한 화학적 도구임을 추론하였다. 그러나, 전장 MALT1 및 그의 파라카스파제 도메인 (아미노산 340-789)은 매우 낮은 단백질분해 활성을 갖는 단량체로서 생리 식염수에 천연 존재한다. 카스파제는 일반적으로 최대 촉매 활성을 위해 호모이량체화되어야 하며 (문헌 [Pop et al., 2006; Walker et al., 1994; Yin et al., 2006]), 이에 따라 펩티드 억제제와 복합된 MALT1의 파라카스파제 도메인의 최근 보고된 구조는 이량체이다 (문헌 [Wiesmann et al., 2012; Yu et al., 2011]). 효과적 검정을 위해 촉매적으로 활성인 MALT1을 생성하여 억제제에 대해 스크리닝하기 위해, 본 발명자들은 그의 이량체화 및 활성화를 촉진하는 류신 지퍼 이량체화 모티프와 융합된 MALT1 (340-789)의 재조합 형태 (LZ-MALT1)를 생화학적으로 엔지니어링하였다 (도 1a). 본 발명자들은 형광원 AMC (7-아미노-4-메틸쿠마린)에 연결된 MALT1 기질 펩티드 LRSR을 사용하여 MALT1 활성 검정을 전개하였다. MALT1에 의한 Ac-LRSR-AMC 기질의 절단은 AMC 및 형광 신호의 방출을 야기하였다.
고처리량 스크리닝에 대한 최적 조건은 2차원 그리드에서 효소 및 기질의 체계적 변화에 의해 결정하였다. 형광 측정을 60분 동안 45초마다 취하였다. 측정은 시간의 함수로서 플롯팅하였다. 형광 및 시간 사이의 선형 관계로의 조건은 스크리닝에 적절하게 고려하였다. 품질은 Z'-인자, 검정의 역학적 범위의 반사 계수 및 데이터의 편차를 사용하여 평가하고 (문헌 [Zhang et al., 1999]), 식 Z'-인자 = 1-3*(σp+σn)/(|μp-μn|) (여기서, σp /n, 양성 및 음성 대조군에 대한 표준 편차; μp /n, 양성 및 음성 대조군에 대한 평균값)에 의해 계산하였다. 이 스크린에 대한 Z'-인자는 0.738이고, 이는 최적 범위 0.5-1 내에 있다 (문헌 [Zhang et al., 1999]). 전체 46,464 화합물을 스크리닝하였다.
화합물 라이브러리를 뉴욕주 알바니 소재의 알바니 몰레큘러 리서치, 인크.(Albany Molecular Research, Inc.; AMRI)로부터 수득하였다.
MI-2에 대해, AMRI로부터의 ID 번호는 ALB-H03200218;
MI-2A1: CGX-01216062
MI-2A2: CGX-01216044
MI-2A3: CGX-01207032
MI-2A4: ALB-H09612295
MI-2A5: ALB-H01205459이다.
역치로서 40% 억제율을 사용하여, 324개 후보 화합물을 농축 반응 검정에서의 확인을 위해 선택하였다 (도 1b). 이들 중, 그의 생화학적 활성에 근거하여 추가 확인을 위해 19개 화합물을 선택하였다 (IC50 < 20 μM, 도 1c).
후보 억제제는 ABC-DLBCL 세포주 및 MALT1 촉매 활성을 선택적으로 억제함
MALT1 활성은 ABC-DLBCL 세포주의 증식을 선택적으로 유지하는데 중요한 역할을 한다 (Ngo et al., 2006). 따라서, ABC 및 GCB-DLBCL 세포주는 펩티드 Z-VRPR-FMK에 의한 MALT1 절단 억제에 차등 감수성을 나타낸다 (문헌 [Ferch et al., 2009; Hailfinger et al., 2009; Rebeaud et al., 2008]). 후보 소분자가 유사한 프로파일을 나타내는지를 측정하기 위해, 2개의 ABC-DLBCL 세포주, HBL-1 및 TMD8, 및 1개의 GCB-DLBCL 세포주, OCI-Ly1을 증가하는 농도의 19개의 선택된 분자에 노출시켰다. 세포 증식을 ATP-기재 대사 발광 검정을 사용하여 단일 용량의 화합물에 노출시킨지 48시간 후에 측정하였다 (도 1c에 요약됨). 3개의 화합물이 ABC-DLBCL 세포의 유의한 선택적 용량-의존성 억제를 지속적으로 유도하였다 (MI-2, p<0.0001; MI-4, p=0.006 및 MI-11, p<0.0001 - 회귀 여분의 제곱합 F 시험). 따라서, 이들 화합물은 세포에서 활성이고, ABC-DLBL에 대해 선택적이고, 비-특이적 세포 독성이 없다. MI-6 및 MI-15는 또한 ABC-DLBCL 세포의 차등 억제를 나타내고 있으나, 통계적 유의성에는 이르지 못하였다.
화합물 MI-2는 세포-기반 검정에서 가장 유능하였고 GI25 농도는 높은 나노몰 범위였다. 따라서, MI-2 (도 1d)는 다음으로 림프종 세포에서의 MALT1-매개 기질 절단의 억제에 대해 검정하였다. HBL-1 세포를 24시간 동안 MI-2를 증가하는 농도로 처리하고, MALT1 표적 단백질 CYLD의 절단을 웨스턴 블롯팅 및 밀도측정법에 의해 측정하였다. MI-2는, 미절단 CYLD 단백질의 증가 및 절단된 형태의 단백질의 감소에 의해 주목되면서, MALT1-매개 절단에서 용량-의존성 감소를 야기시켰다 (도 1e). MI-2는, 이것이 구조적으로 연관된 카스파제 패밀리 구성원 카스파제-3, -8 및 -9에 대하여 적은 활성을 나타내기 때문에, MALT1 파라카스파제 억제제로서 선택적이었다. 더욱이, MI-2는, MALT1을 억제하는 농도에서의 세포-기반 검정에서 카스파제-3/7 활성 또는 아폽토시스를 억제하지 않았다. 따라서, MI-2는 치료적 MALT1 억제제로서 잠재적 선도 화합물이다.
MI-2 유사체는 MALT1 억제 활성을 나타냄
화합물 MI-2가 MALT1 억제제의 개발을 위해 잠재적 스캐폴드를 나타내는지를 규명하기 위하여, 본 발명자들은 MI-2를 인 실리코(in silico)에서 다른 화학적 화합물과 비교하여 잠재적 유사체를 확인하였다. 유사성 점수≥70% (타니모토(Tanimoto) 유사성 함수)를 갖는 입수가능한 라이브러리로부터 전체 704개의 유사체 화합물을 LZ-MALT1 형광 검정에 의해 스크리닝하였다. MI-2와 동일하거나 그보다 더 높은 활성을 나타내는 19개의 유사체를 선택하였다 (도 2a). MI-2와 유사한 범위 내에서 생화학적 IC50을 갖는 5개의 유사체를 세포 증식 검정에서 추가의 특징규명을 위해 선택하였다 (도 2b 및 2c). 모든 5개의 유사체 (MI-2A1-5)는, 마이크로몰 범위의 GI25 농도를 가지고 ABC-DLBCL 세포주의 선택적 억제에 대해 동일한 경향을 나타내었다 (도 2c). 화학적 대조군으로서 사용되는, 시험관내에서 LZ-MALT1 억제 활성을 갖지 않는 2개의 유사체 화합물 (MI-2A6-7)은 동일한 용량 범위에 대해 세포 증식에 어떠한 영향도 끼치지 않았다. 상기 5개의 활성 MI-2 유사체는 CYLD의 MALT1 절단의 억제에 대해 검정하였다. MI-2는 그 자체가 가장 유능한 화합물이지만, 8시간 동안 5 μM로 투여된 모든 5개의 화합물은 양성 대조군으로서 사용되는 Z-VRPR-FMK MALT1 블록킹 펩티드 (50 μM)와 유사한 절단 억제를 나타내었다 (도 2d). 집합적으로, 화학적으로 연관된 화합물 중에서 시험관내 및 세포-기반 검정에서 MALT1 억제제 활성의 보존은 MALT1의 선도 화합물 억제제로서 MI-2 및 그의 유사체의 적합성을 가리킨다.
MI-2는 직접 결합하고 비가역적으로 MALT1을 억제함
본 발명자들은, 다음으로, MI-2가, 예를 들어 융합 단백질의 LZ 영역과의 결합을 통해 MALT1 활성에 간접적으로 영향을 미치는지 또는 MALT1에 직접적으로 결합되어 있는지를 조사하였다. 이핵성 단일 양자 간섭성 (HSQC) 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법을 이용하여 MI-2가 MALT1의 파라카스파제 도메인 (잔기 329-728)에 결합한다는 것을 특징규명하였다. MI-2를 적정하여, MALT1의 미결합 상태에 상응하는 공명은 강도에 있어서 감소된 반면, MALT1-MI-2 복합체에 상응하는 공명의 또 다른 세트가 점차적으로 나타났다 (도 3a). 화학적 이동 변화의 이러한 패턴은 NMR 시간 척도상 느린 교환을 특징으로 하고, MALT1과 MI-2 간의 강건한 상호작용을 시사한다. 반대로, NMR 분광분석법 연구는 불활성 유사체 MI-2A6 및 MI-2A7에 의한 결합의 증거는 없음을 보여준다 (도 3b).
MI-2가 반응성 클로로메틸 아미드를 함유하기 때문에, 본 발명자들은 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS)를 이용하여 MI-2가 MALT1을 공유결합적으로 개질할 수 있는지를 조사하였다. 도 3c에서 보여주는 바와 같이, MALT1 파라카스파제 도메인 (329-728)은 55,988.4 Da에서 주요 피크를 나타내었다. 화합물 MI-2와 함께 인큐베이션하면, MALT1의 주요 피크는 419.1 Da이 증가한 56,407.5 Da으로 이동하였다. 이는 클로라이드 기를 뺀 MI-2를 첨가한 것에 상응하며, 이는 MI-2가 MALT1에 공유결합적으로 결합하고 비가역적 억제제로서 잠재적으로 기능할 수 있다는 것을 나타낸다. 클로로메틸 아미드 기가 활성 MI-2 유사체에서 보존되지 않았기 때문에 (도 2b), 이는 MALT1에 특이성을 부여하는 MI-2 시리즈에서 가장 유력한 통상적인 화학적 스캐폴드일 것이다. 특히, LC-MS는 MI-2와 함께 수행하였고, MALT1 활성 부위 돌연변이체 C464A는 현저하게 감소된 공유 결합을 나타냈으며, 이는 활성 부위 C464 잔기가 MI-2에 의한 변형의 주요 표적임을 시사한다 (도 3c). MI-2의 MALT1 파라카스파제 도메인과의 결합의 잠재적 모드를 추가로 탐색하기 위하여, 본 발명자들은 오토도크 4.2 (문헌 [Morris et al., 2009])를 이용하여 분자 도킹을 채용하였다. MALT1의 결정 구조 (문헌 [Wiesmann et al., 2012; Yu et al., 2011])는 강체로서 유지되는 반면 MI-2의 입체형태적 유연성은 허용된다. 각 도킹 입체형태에 대한 예상 결합 자유 에너지 및 클러스터 크기에 대하여 최종 결과를 순위 매김하였다. 상위 5개의 포즈를 선택하였으며, 이들 모두는 그들의 배향에 있어서 약간의 변화만 있으며 유사한 도킹 점수를 갖는다. 제1의 탑 히트에 대하여 보여주는 바와 같이, MI-2는, 활성 부위 틈이 파라카스파제 도메인의 활성 부위 C464에 가까운 그의 클로로메틸 기와 결합한다는 것을 보여주며, 이는 이들 2개의 기 사이에 공유 결합 형성과 일치한다 (도 3d). 집합적으로, 상기 데이터는 MI-2가 관계하여 MALT1 활성 부위와 비가역적으로 결합한다는 것을 시사한다.
MALT1의 MI-2 억제가 비가역적 결합 동역학과 일치하는지를 조사하기 위해서는, LZ-MALT1은 상이한 농도의 MI-2로 5 내지 80분 동안 예비-인큐베이션하고, 이어서 기질 Ac-LRSR-AMC를 첨가하여 효소 활성을 측정하였다 (도 3e). 특히, 백분율 MALT1 불활성화는 시간이 지남에 따라 증가하였으며, 공유결합적 및 비가역적 억제와 일치하면서 테스트의 말미에 가까워질수록 플래토에 이르렀다. 억제는, 농도가 높아지면 높아질수록 불활성화가 더 많아지고 포화율이 더 빨라짐을 보이면서 농도-의존성이었다. 반대로, 클로로메틸 아미드 기를 갖지 않은 활성 MI-2 유사체 MI-2A2는, 가역적 억제와 일치하면서, MALT1의 누적 억제의 증거가 나타나지 않았다. MI-2는 100% 억제에 가까이 이르렀지만, IC50이 더 낮은 MI-2A2는 단지 약 50% 억제에 이르렀다 (도 3e)는 것을 주목해야 한다. 비가역적 동역학은, 펩티딜 할로메틸 케톤 프로테아제 억제제의 경우에 있어서 주목되는 바와 같이(문헌 [Powers et al., 2002]), 세포-기반 검정에서의 MI-2 대 그의 유사체 (이는 클로로메틸 아미드 기가 결여되어 있으며 오로지 가역적으로 결합되어 있음)의 보다 유능한 효과에 기여할 수 있다.
MI-2는 ABC- DLBCL 세포주에서 MALT1 기능을 억제함
선도 화합물로서 MI-2를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 다음으로 ABC-DLBCL 세포에서의 MALT1 신호전달에 대한 그의 효과를 탐색하였다. 본 발명자들은 추가의 MALT1 기질, 예컨대 A20, BCL10 및 RELB의 절단에 대한 MI-2의 영향을 조사하였다. 이들 단백질이 절단 후에 프로테아솜 분해를 하도록 할 때 (문헌 [Coornaert et al., 2008; Hailfinger et al., 2011; Rebeaud et al., 2008]), 본 발명자들은 절단 생성물 중 가시화를 촉진시키는 프로테아솜 억제제 MG-132를 사용하였다 (도 4a). HBL-1 및 TMD8 세포주는 MI-2 (2 μM) 또는 비히클 중 하나에 30분 동안 노출되고, MALT1 기질의 절단 형태가 MI-2에 대한 노출 동안 축적되도록 하기 위하여, 이어서 5 μM MG-132에 추가 1시간 (레인 2, 3) 또는 2시간 (레인 4, 5) 동안 노출되었다. 예상한 바와 같이, MG-132 노출은 이들 DLBCL 세포에서의 MALT1의 구성적 활성으로 인하여 A20, BCL10 및 RELB 절단 생성물의 축적을 드러냈다. 그러나, MI-2에 대한 노출은 절단 형태의 풍부화를 감소시키고/거나 MALT1 효소적 활성의 손실과 일치하는 전장 단백질의 풍부화를 증가시켰다 (도 4a).
MALT1은 핵으로의 c-REL 전위를 매개하고, 이어서 BCR 자극을 매개한다 (문헌 [Ferch et al., 2007]). 따라서, HBL-1 세포를 200 nM MI-2, 50 μM Z-VRPR-FMK (양성 대조군) 또는 비히클에 24시간 동안 노출시키고, 이어서 전세포 또는 단리된 핵의 c-REL 유동 세포측정을 행하였다. MI-2 및 Z-VRPR-FMK 둘다는 유사한 정도로 핵 c-REL을 감소시켰으며, 이는 이 단백질의 전세포 수준에는 영향을 끼지치 않았다 (도 4b). 이 결과를 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 또한 MI-2 (HBL-1의 경우 200 nM 및 TMD8의 경우 500 nM)의 GI50 농도로 24시간 동안 처리한 HBL-1 및 TMD8 세포의 핵 추출물에서 c-REL 및 p65에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 세포주 둘다에서, MI-2에 대한 노출은 핵 c-REL의 확실한 감소를 야기시킨 한편, 이는 p65 수준에는 영향을 끼치지 않았다 (도 4c). c-REL에 대한 이러한 선택성은, MALT1 녹아웃 마우스에서, MALT1 블록킹 펩티드 Z-VRPR-FMK에 의한 MALT1 절단 억제 후에 이전에도 나타나 있었다 (문헌 [Ferch et al., 2009; Ferch et al., 2007; Hailfinger et al., 2011]).
항원 수용체-매개 NF-κB 신호전달은 MALT1 활성에 부분적으로 의존한다 (문헌 [Ruefli-Brasse et al., 2003; Ruland et al., 2003]). 따라서, 본 발명자들은, MI-2가, BCR 활성화를 모방하고 MALT1-의존성 절단을 활성화시키는 PMA/이노마이신에 의해 유도되는 NF-κB 활성화를 약화시키는 것에 대한 효과를 테스트하였다 (문헌 [Coornaert et al., 2008; Rebeaud et al., 2008]). 먼저, 293T 세포를, NF-κB 리포터 벡터 (NF-κB)5-luc2CP-pGL4 (NF-κB 컨센서스 반응 요소 및 불안정화시킨 반딧불이 루시페라제의 5 카피를 보유함) 및 TK-pRL 대조군을 사용하여 BCL10 및 MALT1WT 또는 MALT1C464A (불활성 돌연변이체) 중 하나를 발현하는 플라스미드와 함께 형질감염시켰다. MALT1WT가 형질감염되었을 때(p<0.001; ANOVA 및 Bonferroni 후-시험) PMA/이노마이신에 대한 노출은 293T 세포에서 루시페라제 활성을 유의적으로 증가시켰으나, 돌연변이체 MALT1C464A로는 그렇지 않았다. MI-2로의 예비-처리는 Z-VRPR-FMK (p<0.05)와 유사하게 PMA/이노마이신 자극에 의한 NF-κB 유도가 유의적으로 억제되는 한편 (p<0.01; ANOVA 및 Bonferroni 후-시험), MALT1C464A에의 것에는 유의적으로 영향을 끼치지 않았다 (도 4d). HBL-1 세포는, 결과로 일어나는 NF-κB 활성화와 함께 만성 활성 B-세포 수용체 신호전달을 나타낸다고 보고되어 있다 (Davis et al., 2010). HBL-1을 리포터 구축물 (NF-κB)5-luc2CP-pGL4 및 TK-pRL 대조군과 함께 형질감염시켰다. MI-2로의 처리는 각각 8시간째 및 24시간째에 NF-κB 리포터 활성의 20% 및 50% 감소를 촉진시켰다. 유사한 결과가 Z-VRPR-FMK 50 μM에 대해서 관찰되었다 (도 4e). NF-κB 리포터 활성에서의 이러한 감소는 MI-2 (p<0.001, ANOVA 및 Bonferroni 후-시험) 및 블록킹 펩티드 Z-VRPR-FMK (p<0.05)에 대해 24시간째에 유의하였다.
NF-κB 신호전달에 대한 MI-2의 영향은 유전자 발현 프로파일링에 의해 추가로 특징규명되었다. 이들 실험의 경우, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용하는 유전자 발현 연구를 위하여, HBL-1 및 TMD8 세포주는 MI-2 (HBL-1, 200 nM; TMD8, 500 nM)의 GI50 농도 또는 50 μM Z-VRPR-FMK로 8시간 동안 처리하고, RNA를 추출하였다. Z-VRPR-FMK는 ABC-DLBCL 세포주에서 NF-κB 시그너처를 약화시키는 것으로 이전에 나타나 있었다 (문헌 [Hailfinger et al., 2009]). MI-2는 유사한 프로파일을 나타내는 것으로 예상될 수 있다. 이 연구에 대하여, 본 발명자들은 각각의 세포주에 대해 비히클과 비교하여 Z-VRPR-FMK 처리에 의해 하향조절되는 유전자 선두 200개를 포획함으로써 Z-VRPR-FMK 시그너처를 부여하였다. 본 발명자들은 다음으로 각각의 세포주에 대해 MI-2와 비히클 처리 세포 사이에서 배수 변화로 사전에 순위 매겨진 모든 유전자의 차등 발현에 대하여 상기 Z-VRPR-FMK 시그너처의 유전자 세트 농축 분석(GSEA)을 수행하였다. Z-VRPR-FMK 시그너처는 세포주 둘다에 대해 MI-2 처리 후에 하향조절된 유전자 중에서 유의하게 풍부해졌다 (HBL-1: FDR<0.0001; 및 TMD8: FDR<0.0001, 도 4f). GSEA는 다음으로 OCI-Ly3 및 OCI-Ly10, 또는 HBL-1 세포주로부터 유도된 2개의 독립적 ABC-DLBCL NF-κB 유전자 발현 시그너처를 이용하여 수행하였다. 본 발명자들은 양 세포주 (NF-κB OCI-Ly3/OCI-Ly10, HBL-1: FDR=0.015 및 TMD8: FDR<0.0001) 및 (NF-κB HBL-1, HBL-1: FDR=0.051 및 TMD8: FDR<0.0001)에서 MI-2-처리 후에 하향조절된 유전자 중에서 이들 NF-κB 유전자 세트의 유의미한 풍부화를 관찰하였다. 집합적으로, 이들 데이터는, Z-VRPR-FMK로 관찰한 효과와 유사하게, MI-2가 MALT1에 의해 유도된 NF-κB 활성을 억제한다는 것을 시사한다.
MI-2는 MALT1 -의존성 DLBCL 세포주를 선택적으로 억제함
MI-2-매개 MALT1 억제 효과의 스펙트럼을 추가로 탐색하기 위하여, 본 발명자들은 더 큰 패널의 6개의 ABC-DLBCL 및 2개의 GCB-DLBCL 세포주로 돌아섰다. 이들 세포주에서 B 세포 수용체 및 NF-κB 경로에 영향을 끼치는 유전자적 특징을 표 1에 정리하였다.
표 1: 상기 연구에서 사용된 세포주에 존재하는 ABC- DLBCL NF - κB 활성화 돌연변이
Figure pct00015
내인성 MALT1 활성은 A20, BCL10 및 CYLD에 대한 웨스턴 블롯팅으로 평가하였고; NF-κB 활성화는 포스포-IκB-α 및 총 IκB-α로 평가하였다. 증식에 있어서의 MALT1 단백질분해 활성에 대한 의존성은 48시간 동안의 50□μM Z-VRPR-FMK 처리로 시험하였다. 예상된 바와 같이, 2개의 GCB-DLBCL 세포주 (OCI-Ly7 및 OCI-Ly1)는 MALT1 또는 NF-κB 신호전달의 증거를 나타내지 않았고, Z-VRPR-FMK에 반응하지 않았다. U2932 및 HLY1 ABC-DLBCL 세포주는 TAK1 및 A20에서의 돌연변이를 보유하며, 이들은 MALT1 하류의 NF-κB 신호전달을 활성화한다. 따라서 이들 2개 세포주는 Z-VRPR-FMK에 대해 상대적으로 거의 반응을 나타내지 않았다. 이와 대조적으로 ABC-DLBCL 세포 HBL-1, TMD8, OCI-Ly3 및 OCI-Ly10은 MALT1 활성 및 Z-VRPR-FMK에 의한 증식 억제의 증거를 나타내었는데, 이는 이들 4개 세포주가 MALT1 의존성임을 시사한다.
8개 세포주 모두를 증가하는 농도의 MI-2 (단일 용량)에 노출시키고, 48시간 경과시에 ATP-기반 대사 발광 검정을 사용하여 세포 증식을 측정하였다 (도 5a). MALT1 의존성 세포주의 경우 MI-2에 의한 성장 억제가 선택적이었지만, ABC-DLBCL MALT1 비의존성 세포주인 U2932 및 HLY-1, 및 2개의 GCB-DLBCL 세포주는 내성을 나타냈다. HBL-1, TMD8, OCI-Ly3 및 OCI-Ly10 세포에서 MI-2에 대한 GI50은 각각 0.2, 0.5, 0.4, 및 0.4 μM이었고, 이는 시험관내에서의 그의 IC50보다 더 낮다 (도 1). 이는 도 3에 제시된 바 MALT1에 대한 MI-2의 비가역적 결합에 의해 설명될 수 있을 것 같지만, 또한 상기 화합물의 세포내 축적으로 인한 것일 수도 있다. 실제로 본 발명자들은 HBL-1 세포를 2시간 동안 0.02, 0.2 또는 2 μM MI-2에 노출시키고, 3회 세척하고, MI-2를 LC-MS로 측정한 실험에서 MI-2 세포내 농도의 18배 내지 30배 증가를 관찰하였다 (도 5b). 0.2 μM MI-2 처리된 세포에서 세포내 농도는, 계산된 시험관내 IC50과 유사한 5 μM이었다 (도 5b). 유리 약물의 축적에 대한 동역학을 결정하기 위해 본 발명자들은 0.2 μM의 GI50 농도에서 30분, 2, 6, 12, 24 및 48시간 경과시에 MI-2의 세포내 농도를 측정하였다. 12시간 경과시에 세포 내에서 검출가능한 유리 MI-2는 실질적으로 존재하지 않았다. 그러나, HBL-1 세포를 증가하는 농도의 단일 용량의 MI-2에 노출한 후, 세포 회복은 단지 (0.2 μM 용량 수준의) 48시간 후에 분명해지기 시작했다. 이들 데이터는 MI-2의 강력한 생물학적 효과가 적어도 부분적으로는, 세포 내에서 농축되는 그의 경향에 의해 촉진되는 MALT1에 대한 그의 비가역적 결합에 기인한다는 것을 시사한다.
MALT1 억제의 생물학적 효과를 보다 자세히 탐색하기 위해, HBL-1, TMD8, OCI-Ly10 및 GCB-DLBCL 세포주 OCI-Ly1을 증가하는 농도의 MI-2로 처리하였다. 48, 72 및 96시간 경과시에 생존 세포에 대해 유동 세포측정법에 의한 CFSE 희석 검정을 이용하여 세포 증식을 조사하였다. MI-2는 HBL-1, TMD8 및 OCI-Ly10의 증식은 실질적으로 억제한 반면, OCI-Ly1에는 영향을 미치지 않았다 (도 5c, 5cc, 5ccc). 세포 주기를 평가하기 위해 BrdU 혼입 - DAPI 염색 및 유동 세포측정법을 사용한 경우, MI-2가 S기의 용량-의존성 감소 및 G1-0 및 Sub-G0의 세포 비율의 상반된 증가를 유도한 것이 명백하였다 (도 5d). MALT1 억제제가 아폽토시스를 유도하였는지 결정하기 위해 ABC-DLBCL 세포주 HBL1 및 TMD8를 매일 그의 각각의 GI25 및 GI50의 MI-2로 처리하고, 대조군 OCI-Ly1 세포주를 TMD8에 대해서 사용된 것보다 더 높은 용량으로 처리하였다. 아넥신 V+ DAPI- 유동 세포측정법에 의해 평가한 트리판 블루 배제 및 아폽토시스를 14일의 기간 동안 48시간 경과시마다 측정하였다. MI-2가 OCI-Ly1 세포에 대해 아무런 영향이 없었던 반면, 이는 HBL-1 및 TMD8 세포 둘 다를 크게 억제하였으며, 이 때 전자는 아폽토시스 세포 풍부성을 보다 이르게 및 보다 더 크게 나타냈다 (도 5e). 본 발명자들은 보다 민감한 카스파제-3/7 절단 검정을 사용하여 두 ABC-DLBCL 세포주 모두에서 48시간 이내에 용량 의존성 아폽토시스의 증거를 관찰하였다. 따라서 MI-2는 ABC-DLBLC 세포주의 성장 및 생존을 강력하게 억제한다.
화합물 MI-2는 동물에 대해 비-독성임
생체내 연구를 위한 MALT1 선도 화합물로서의 그의 적합성을 결정하기 위해 본 발명자들은 MI-2가 마우스에서 독성 효과를 유도했는지를 조사하였다. 5마리의 C57BL/6 마우스를 10일의 기간에 걸쳐 누적 용량이 51.1 mg/kg이 되도록 하는 0.05에서 25 mg/kg까지의 범위의 증가하는 용량의 MI-2의 매일의 복강내 (IP) 투여에 노출시키고, 또 다른 5마리 마우스를 비히클 (5% DMSO, n=5)에만 노출시켰다 (도 6a, 독성 1). 기면, 체중 감소 (도 6b, 독성 1) 또는 병을 암시하는 기타 신체적 징후의 증거는 없었다. 최대 투여된 25 mg/kg의 용량이 14-일 스케줄에서 안전한지 확인하기 위해, 본 발명자들은 10마리 마우스를 14일에 걸쳐 누적 용량이 350 mg/kg이 되도록 하는 25 mg/kg의 MI-2의 매일의 IP 투여에 노출시키고, 대조군으로서 비히클만이 주사된 5마리 마우스를 사용하였다 (도 6a, 독성 2). 14일 기간의 MI-2 투여 후에 5마리 마우스를 (5마리 대조군과 함께) 희생시키고, 다른 5마리 마우스를 10일 휴약 기간 후에 희생시켜 지연 독성을 평가하였다. 체중 감소 (도 6b, 독성 2) 또는 조직 손상 (육안 또는 현미경에 의한)을 비롯한 독성 효과 또는 다른 병의 징후는 전혀 눈에 띄지 않았다 (도 6c, 6cc). 뇌, 심장, 폐, 간, 신장, 장, 비장, 흉선 및 골수 조직을 검사하였다. 골수는 정세포성이었고, 3개열 성숙 조혈을 가졌다. 골수 대 적혈구 비는 4 내지 5:1이었다. 거핵구는 수 및 분포에 있어 정상이었다. 섬유증이나 모구 또는 림프구 수의 증가는 전혀 없었다. 완전한 말초 혈액 카운트, 생화학 및 간 기능 검사는 정상이었다 (표 2).
<표 2>
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이들 연구는 항-림프종 효능 연구에서의 사용에 있어서 MI-2의 안전성을 확립하였다.
MI-2는 인간 ABC-DLBCL 이종이식편 및 생체외 원발성 인간 DLBCL을 억제함.
MI-2가 생체내에서 DLBCL을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해 본 발명자들은 HBL-1 및 TMD8 (MALT1-의존성) 및 OCI-Ly1 (MALT1-비의존성) DLBCL 세포를 NOD-SCID 마우스의 우측 측복부 영역 내로 이식하였다. 종양의 부피가 평균 120 mm3에 도달했을 때, 마우스를 무작위화하여 25 mg/kg/일의 MI-2의 IP 주사 (TMD8의 경우 n=10, HBL1의 경우 n=5 및 OCI-Ly1의 경우 n=10) 또는 비히클 (5% DMSO, TMD8의 경우 n=10, HBL1의 경우 n=4 및 OCI-Ly1의 경우 n=10)을 투여하였다. 14회차 주사 후 24시간에 동물을 희생시켰다. 주목할 만한 것은, MI-2는 비히클에 비해 TMD8 (p=0.015, t-시험) 및 HBL1 (p=0.014, t-시험) ABC-DLBCL 이종이식편 둘 다의 성장을 매우 억제한 반면, OCI-Ly1 종양 (p=0.47, t-시험)의 성장에 대해서는 영향을 주지 않았다 (도 7a). OCI-Ly1 종양이 영향받지 않았다는 사실은 MI-2 활성이 숙주 미세환경보다는 림프종 세포에 대한 그의 영향에 기인한다는 것을 시사한다. 아폽토시스 세포를 검출하는 튜넬 검정을 이용한 조직학적 검사는 비히클에 비해 MI-2-처리된 HBL-1 (p=0.0008, t-시험) 및 TMD8 (p<0.0001, t-시험) 이종이식편에서 아폽토시스 세포의 상당한 증가를 나타내었으나, OCI-Ly1 이종이식편 (p=0.5580, t-시험)에서는 그렇지 않았다 (도 7b). 본 발명자들은 또한 비히클과 비교하여 HBL-1 (p<0.0001, t-시험) 및 TMD8 이종이식편 (p=0.0006, t-시험)에서 Ki-67 염색으로 측정한 바 상당한 증식의 감소를 관찰하였으나, OCI-Ly1 이종이식편 (p=1.0, t-시험; 도 7c)에서는 아무런 차이를 관찰하지 못했다. 이종이식편에서 NF-κB 신호전달에 대한 MI-2 처리의 효과를 평가하기 위해, 파라핀 처리된 종양 절편에서 c-REL 면역형광을 수행하였다. 도 4b 및 4c에 제시된 데이터와 일치하는 것으로서, MI-2 처리된 종양은 감소된 c-REL 핵 단백질을 나타내었다 (도 7d). 따라서 MI-2 소분자 MALT1 억제제는 생체내에서 림프종 세포 자율 방식으로 ABC-DLBCL의 증식, 생존 및 NF-κB 활성을 특이적으로 억제한다.
마지막으로, MI-2가 또한 원발성 인간 DLBCL을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해 본 발명자들은 5명의 DLBCL 환자의 림프절 생검으로부터 단세포 현탁액을 수득하였는데, GCB 대 ABC 분류에 대한 대용물로서 이들에 있어서의 GCB 대 비-GCB 상태를 한스 기준 (문헌 [Hans et al., 2004])을 사용하여 면역조직화학으로 확인할 수 있었다. 림프종 세포를 단리하여, 4벌로 0.8 μM MI-2 또는 비히클에 노출시켰다. 48시간 노출 후, 트리판 블루를 사용하여 세포 수 및 생존율을 측정하였다. 주목할 만한 것은, 비-GCB 사례 중 2개가 MI-2에 반응한 반면 (각각 비히클 대비 p=0.04 및 0.003), GCB 중에서는 어느 것도 반응하지 않았다 (도 7e). 비-GCB 중 1개는 MI-2에 반응하지 않았는데, 이 사례는 아마도 한스 기준에 의해 정확히 분류된 것이 아니었을 것이다. 전체적인 이들 연구는 MI-2 소분자 억제제를 사용한 MALT1에 대한 치료 표적화가 인간 ABC-DLBCL 세포에 대해 강력한 억제 효과를 가지며, 임상 시험에서 사용을 위한 적용을 보증한다는 것을 시사한다.
CARMA1-BCL10-MALT1 (CBM) 복합체는 항원 수용체 활성화 후에 조립되어 MALT1 이량체화 및 그의 파라카스파제 활성의 유도를 초래한다. MALT1에 의한 기질 단백질 A20, BCL10, CYLD 및 RELB의 절단은 상이한 메카니즘을 통해 NF-κB 신호전달을 강화한다 (문헌 [Coornaert et al., 2008; Hailfinger et al., 2011; Rebeaud et al., 2008; Staal et al., 2011]). BCR 신호전달은 다양한 유전자의 체세포 돌연변이로 인해 ABC-DLBCL의 하위집합에서 만성적으로 활성이며, 이는 구성적 MALT1 신호전달 및 NF-κB 활성화를 초래한다 (문헌 [Davis et al., 2010]). 더욱이 마우스에서 MALT1의 구성적 발현은 MALT 림프종 및 ABC-DLBCL을 모방한다 (문헌 [Vicente-Duenas et al., 2012]). MALT1 단백질분해 활성에 대한 소분자 억제제는 따라서 ABC-DLBCL 또는 MALT-림프종, 및 다양한 염증성 및 자가면역 장애의 치료를 위한 매우 유용한 치료제를 나타내는 것일 수 있다.
MALT1의 촉매 활성은 잘 정의되어 있으며, 기질 특징, 예컨대 펩티드 길이 및 아미노산 조성 및 위치와 관련되어 있다 (문헌 [Hachmann et al., 2012]). 전장 단백질 또는 파라카스파제 도메인 중 하나인 정제된 MALT1은 용액 중에서 매우 활성이지는 않은데, 이는 그의 활성 이량체 형태 대신 단량체로서 존재하기 때문이다. 이량체화는 높은 염 농도인 1 M 시트르산나트륨에 의해 유도될 수 있다 (문헌 [Boatright et al., 2003]). 그러나, 이들 높은 염 조건은 비-생리학적이며, 이에 따라 생리학적으로 관련된 소분자 억제제에 대한 생화학적 스크리닝을 방해한다. 이를 피하기 위하여, 본 발명자들은 류신 지퍼 도메인에 융합된 재조합 MALT1 단백질을 조작하여, MALT1 (340-789)의 파라카스파제 도메인이 그의 이량체 활성 입체형태가 되도록 하여 (도 1a), 보다 생리학적 조건을 사용하여 스크리닝 가능하도록 하였다. 이 방법을 사용하여, 본 발명자들은 마이크로몰 범위의 IC50으로 시험관내에서 MALT1을 억제할 수 있는 19개 화합물을 확인하였다. 본 발명자들은 MI-2에 집중하였는데, 이는 가장 강력한 억제제였다. 본 발명자들은 MI-2가 C형 간염 바이러스의 NS3/4A 프로테아제에 대한 프로테아제 억제제 약물, 예컨대 텔라프레비르 (문헌 [Klibanov et al., 2011]), 프로테아솜 억제제 카르필조밉 (문헌 [Genin et al., 2010]) 및 기타 약물 (문헌 [Powers et al., 2002])과 유사하게 MALT-1의 공유 비가역적이며 선택적 억제제임을 밝혀냈다. 비록 펩티드 억제제 Z-VRPR-FMK가 연구 도구로서 유용하지만, 상대적으로 큰 크기, 전하 및 이에 따른 낮은 세포 투과성으로 인해 MALT1 치료제로서 적합하지 않다. 따라서, MI-2는 탁월한 세포 침투로 세포 기반 검정에서 우수한 활성을 표시하였으며, 실제로 세포 내에서 높은 농도를 특징으로 하며, 또한 여전히 MALT1 대 다른 카스파제에 대하여 고도로 선택적이었다. 주목할만한 것은, 티로신 키나제 BTK의 선택적 및 비가역적 소분자 억제제인 PCI-32765 (이브루티닙)가 현재 B-세포 비-호지킨 림프종을 갖는 환자에서 임상 개발 중에 있다 (문헌 [Honigberg et al., 2010]). MI-2의 비가역성은 약동학 이점을 제공할 수 있다. ABC-DLBCL이 만성 활성 BCR 신호전달을 갖기 때문에, MALT1-절단의 장기화된 억제가 최대 항-림프종 활성을 위해 필요할 것이다. 비가역적 억제제를 사용하여, 신규한 효소를 합성하는 경우에만 활성이 되돌아올 것이다. 이는 약물이 낮은 혈장 농도에서 효과적이도록 할 수 있으며, 이에 따라 투여 수준 및 주기의 감소, 효능의 악화 없이 긴 혈장 반감기를 위한 요건의 제한, 및 순환하는 약물에 대한 연장된 노출과 관련된 잠재적 독성 작용의 최소화를 가능하게 할 수 있다. 실제로, 본 발명자들의 상세한 연구는 MI-2가 동물에서 비-독성이었음을 나타내었다. 이 결과는 MALT1이 인간에서만 파라카스파제이며 MALT1-결핍 마우스가 상대적으로 건강하다는 사실과 부합한다 (문헌 [Ruefli-Brasse et al., 2003; Ruland et al., 2003]).
ABC-DLBCL에서의 BCR 경로의 만성 활성화는 여러 상이한 메카니즘에 의해 매개되며, 이들 중 다수는 MALT1의 상류이다. ABC-DLBCL이 이 경로에 의존하며, 종종 MALT1 절단 활성에 특이적으로 의존한다 (문헌 [Ferch et al., 2009; Hailfinger et al., 2009; Ngo et al., 2006]). 주목할만한 것은, MI-2는 CD79A/B, CARMA1 및/또는 MYD88 돌연변이를 갖는 ABC-DLBCL 세포주를 선택적으로 사멸시켰지만, A20 동형접합 결실 또는 TAK1 돌연변이를 갖는 것들을 비롯하여 MALT1의 단백질 하류에서 일어나는 것들은 사멸시키지 않았다 (도 5a 및 표 1). 이러한 발견은 표적화 치료제의 합리적인 활용을 위한 림프종에서의 주기적 돌연변이화 대립유전자의 표적화된 재서열분석의 중요성을 강조한다. 비록 MALT1 억제제로 표적화될 수 있는 림프종의 완전한 스펙트럼이 아직 완전히 명확해진 것은 아니지만, 생체외 시스템을 사용하여 본 발명자들은 원발성 인간 비 GCB-DLBCL 시편 또한 MALT1에 의존하며 MI-2에 의해 억제된다는 것을 최초로 밝혀낼 수 있었다.
단일 작용제는 일반적으로 치유적이지 않으며 급속하게 내성을 생성하기 때문에 (문헌 [Misale et al., 2012]), 조합-표적화 요법의 관심이 증가하고 있다. MALT1 절단 억제의 합리적인 조합은 Src 패밀리를 표적화하는 티로신 키나제 억제제 (다사티닙, 사라카티닙, 보수티닙 및 KX01), Syk를 표적화하는 티로신 키나제 억제제 (포스타마티닙 이나트륨) 또는 Btk를 표적화하는 티로신 키나제 억제제 (PCI-32765)와의 조합을 포함할 수 있다. 미토겐-활성화 단백질 (MAP) 키나제 및 포스파티딜이노시톨 (PI) 3-키나제를 비롯한 이들 약물은 BCR 신호전달의 추가의 억제에 의해 NF-κB의 MALT1 절단 억제와 상승작용할 것이다 (문헌 [Lim et al., 2012]). NF-κB 경로를 추가로 억제할 수 있기 때문에, MALT1에 의존적이지만 그의 단백질분해 활성과는 무관한 활성을 비롯한 PKC 억제 활성 또한 잠재적으로 유익한 조합일 것이다. 이식 거부의 방지 및 건선의 치료에 대한 임상 시험에서 (문헌 [Manicassamy, 2009; Matz et al., 2011]), PKC 억제제 소트라스타우린은 ABC-DLBCL 이종이식 종양의 성장을 억제하는 것으로 최근 나타나 (문헌 [Naylor et al., 2011]), 이러한 림프종 하위유형에 대한 항-림프종 요법으로서의 그의 잠재적 사용을 가리킨다. 또한, ABC-DLBCL은 BCL6 전위, SPI-B 증폭 또는 PRDM1 결실 또는 돌연변이를 특징으로 한다 (문헌 [Lenz and Staudt, 2010]). BCL6 억제제는 중요한 검사점 유전자(checkpoint gene)의 방출을 통해 아폽토시스 및 세포 주기 정지를 촉진한다 (문헌 [Cerchietti et al., 2010; Cerchietti et al., 2009; Polo et al., 2004]). 이에 따라, MI-2 및 BCL6 억제제의 조합은 ABC-DLBCL에서의 2개의 중요한 경로 (BCL6 및 NF-κB)를 억제하여 잠재적으로 치료 상승작용을 유발할 것이다. 종합하면, 본원에서 보고된 결과는 MALT1을 표적화하는 선도 화합물로서 MI-2를 밝혀내었으며, NF-κB 신호에 의존적이며 통상적인 화학치료 요법에 내성인 공격성 NHL의 치료에 대한 치료 표적으로서의 MALT1 및 치료제로서의 MI-2의 중요성, 안정성 및 효능을 입증한다.
실시예
MALT1 단백질분해 활성 억제제에 대한 고처리량 스크리닝
Ac-LRSR-AMC를 기질로서 사용하였으며, 360/465 nm의 여기/방출 파장으로 반응을 측정하였다. 대조 값의 평균을 퍼센트 억제의 계산에서 사용하였다. 최종 퍼센트 억제를 다음 식으로 계산하였다. {[형광시험 화합물(T2-T1) - 형광음성 대조군(T2-T1)] / [형광양성 대조군(T2-T1) - 형광음성 대조군(T2-T1)]} × 100. Z-VRPR-FMK (300 nM)를 양성 대조군으로서 사용하였으며, 완충제 단독을 음성 대조군으로서 사용하였다.
성장-억제 결정
발광 방법 (셀타이터-글로(CellTiter-Glo; 위스콘신주 매디슨 프로메가 소재)) 및 트리판 블루 염료-배제 (시그마(Sigma; 미주리주 세인트 루이스 소재))를 사용하여 ATP 정량화에 의해 세포 증식을 결정하였다. 약물-치료된 세포에서의 세포 생존율을 그의 각각의 대조군에 대하여 표준화시켰으며 (생존 분율(fractional viability)), 결과를 1-생존 분율로서 나타내었다. 컴퓨신(CompuSyn) 소프트웨어 (바이오소프트(Biosoft; 영국 캠브리지 소재))를 사용하여 대조군과 비교하여 성장 분율을 억제하는 약물 농도를 결정하였다.
마우스 이종이식편 실험
8주령 수컷 SCID NOD.CB17-Prkdcscid/J 마우스에 저-계대배양 107 인간 HBL-1, TMD8 또는 OCI-Ly1 세포를 피하 주사하였다. 치료제를 복막내 주사에 의해 투여하였다. 디지털 캘리퍼스로 3주간 종양 부피를 모니터링하였다. 모든 절차는 US NIH 프로토콜을 따랐으며, 바일 코넬 의과 대학(Weill Cornell Medical College)의 동물 기관 위원회(Animal Institute Committee)에 의해 승인되었다.
수탁 번호
마이크로어레이 데이터: GSE40003.
MALT1 단백질분해 활성 억제제에 대한 고처리량 스크리닝
스크리닝은 완충제 A (20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% 트리톤 X-100) 중 100 nM LZ-MALT1, 200 μM Ac-LRSR-AMC 및 12.5 μM 시험 화합물과 함께 384-웰 흑색 플레이트 (그라이너 바이오 원(Greiner Bio One; 벨기에 벰멜 소재), 카탈로그 # 784076)에서의 20 μl 반응물로 이루어졌다. 엔비전 멀티라벨 리더(Envision Multilabel Reader; 퍼킨 엘머(Perkin-Elmer); 메사추세츠주 왈탐 소재)를 사용하여 360/465 nm의 여기/방출 파장으로 반응을 측정하였다. 각 반응에 대하여 2개 시점을 측정하였으며; 시점 (T2-T1) 사이의 형광 차이를 MALT1 활성으로서 간주하여 화합물 자가형광으로 인한 가양성을 삭제하였다. 대조군 값의 평균을 퍼센트 억제의 계산에서 사용하였다. 최종 퍼센트 억제를 다음 식으로 계산하였다. {[형광시험 화합물(T2-T1) - 형광음성 대조군(T2-T1)] / [형광양성 대조군(T2-T1) - 형광음성 대조군(T2-T1)]} × 100. Z-VRPR-FMK (300 nM)를 양성 대조군으로서 사용하였으며, 완충제 단독을 음성 대조군으로서 사용하였다. 역치로서 40% 억제를 사용하여, 324개 화합물을 잠재 MALT1 억제제로서 확인하였다. 0.122 μM 내지 62.5 μM의 용량 범위 내의 농축-반응 시험에서 양성 히트를 입증하여, 화합물의 IC50 (50% 억제)을 결정하였다. 또한, 스크리닝에 사용되는 LZ-MALT1 이외에 재조합 전장 야생형 MALT1을 사용하여 활성을 입증하였다.
단백질 발현 및 정제
MALT1 (340-789)을 N-말단에서의 GCN4 (251-281)로부터의 류신-지퍼 서열과 융합하였다 (LZ-MALT1). N-말단 히스-태그부착된 LZ-MALT1을 이. 콜라이에서 발현시키고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 (퀴아젠(Qiagen; 캘리포니아주 발렌시아 소재)), 이어서 20 mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM NaCl 및 5 mM DTT를 함유하는 완충제 중 슈퍼덱스 200 HR 10/300 (지이 헬스케어(GE Healthcare; 영국 소재))으로의 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
세포 배양
DLBCL 세포주 OCI-Ly1, OCI-Ly7 및 OCI-Ly10을 80% 이스코브 배지, 20% FBS 및 페니실린 G/스트렙토마이신에서 성장시켰다. DLBCL 세포주 HBL-1, TMD8, U2932를 90% RPMI 배지, 10% FBS, 2 mM 글루타민, 10 mM Hepes 및 페니실린 G/스트렙토마이신에서 배양하였다. DLBCL 세포주 OCI-Ly3 및 HLY1을 80% RPMI 배지, 20% FBS, 2 mM 글루타민, 10 mM Hepes 및 페니실린 G/스트렙토마이신에서 배양하였다. 293T 세포를 90% D-MEM, 10% FBS 및 페니실린 G/스트렙토마이신에서 배양하였다. 모든 세포주를 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기 하에 배양하였다. 단일 뉴클레오티드 다형성 프로파일링 (핑거프린팅(fingerprinting))에 의해 세포주를 검증하였다.
성장-억제 결정
DLBCL 세포주를 치료 48시간 동안 기하급수적 성장 조건에서 성장시켰다. 발광 방법 (셀타이터-글로 (위스콘신주 매디슨 프로메가 소재)) 및 트리판 블루 염료-배제 (시그마 (미주리주 세인트 루이스 소재))를 사용하여 ATP 정량화에 의해 세포 증식을 결정하였다. 시너지4(Synergy4) 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍 인스트루먼츠(BioTek Instruments; 버몬트주 위누스키 소재))를 사용하여 발광을 측정하였다. 그의 발광 값에 대해 세포 수 (트리판 블루 방법에 의해 결정됨)를 플로팅하여 각 세포주에 대한 표준 곡선을 계산하였으며, 이에 따라 세포의 수를 계산하였다. 약물-치료된 세포에서의 세포 생존율을 그의 각각의 대조군에 대하여 표준화하였으며 (생존 분율), 결과는 1-생존 분율로서 주어진다. 컴퓨신 소프트웨어 (바이오소프트 (영국 캠브리지 소재))를 사용하여 세포주의 성장을 대조군에 비해 25% 억제하는 약물 농도 (GI25)를 결정하였다. 실험은 삼중으로 수행하였다.
선도 화합물 MI-2를 기초로 한 유사체 스크리닝
유사도 조사를 0.7 컷오프로 설정하였으며, 의약품 개발 협력기구(Collaborative Drug Discovery; CDD; 캘리포니아주 벌링게임 소재) 데이터베이스 (www.collaborativedrug.com)의 유사도 조사 기능을 사용하여 수행하였다. CDD 조사 기능은 (http://www.chemaxon.com/jchem/doc/dev/search/index.html#simil)에 기재된 것과 같은 켐액손 (www.chemaxon.com; 헝가리 부다페스트 소재)의 해쉬 핑거프린트의 표준 타니모토 유사도 기능을 기초로 한다. 요약하자면, 모든 질의 구조(query structure)의 해시 핑거프린트를 계산하고, 이어서 1-(NA&B/NA+NB-NA&B)의 비유사도 식을 적용하며, 여기서 NA 및 NB는 각각 분자 A 및 B의 핑거프린트에서 설정된 비트 수이고, NA&B는 양 핑거프린트에서 설정된 비트 수이다. 비유사도 한계값은 0 내지 1 사이의 수이며, 이는 유사도 계산에서 컷오프 한도를 특정한다. 비유사도 값이 한계값 미만인 경우에는, 질의 구조 및 소정의 데이터 베이스 구조가 유사한 것으로 고려한다. 제1 스크리닝에서와 동일한 방법을 사용하여 유사체 스크리닝을 수행하였지만, 단 이는 삼중으로 수행하였다. MI-2에 비해 보다 높은 활성을 갖는 19개 화합물을 추가의 유효성 검정을 위해 선택하였다.
NMR
균일하게, 15N 및 13C 표지된 MALT1 (329-728)을 1 g/l [15N] 염화암모늄 및 3 g/l [13C] 글루코스 (캠브리지 아이소토프 랩스(Cambridge Isotope Labs, 미국 매사추세츠주 앤도버 소재))를 함유한 M9 배지에서 성장한 BL21 (DE3) 이. 콜라이에서 발현시키고, 문헌 [Wiesmann et al., 2012]에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 세포 용해물로부터 정제하였다.
MALT1 (329-728)의 표준 2D 1H 13C NMR 스펙트럼을 50 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM NaCl 및 10% D2O 중 10.0 mg/ml의 단백질을 함유한 샘플에서 기록하였다. 310K의 브루커(Bruker) AV 500 MHz 분광계 (브루커, 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재) 상에서 NMR 분광분석법 실험을 기록하였다.
MALT1 (329-728)의 표준 2D 1H 15N HSQC 스펙트럼을 25 mM 트리스 pH 7.5, 250 mM NaCl, 5 mM DTT, 10% D2O, 0.02% NaN3, 2% DMSO 중 70 μM 단백질을 함유한 샘플에서 기록하였다. 37℃의 600 MHz 배리안(Varian) (배리안, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재) 상에서 HSQC를 실행하였다.
HPLC/ESI-MS
HPLC/ESI-MS 실험을 1 mg/ml 단백질 농도의 5 μl 샘플에서 수행하였다. 단백질의 분리를 포로스(POROS) R1/H (퍼셉티브 바이오시스템즈(Perseptive Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재))가 패킹된 1 mm x 150 mm LC 패킹스 칼럼을 사용하는 HP1100 시스템 (휴렛 팩커드(Hewlett Packard, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)) 상에서 수행하였다. 상기 칼럼을 80℃에서 유지시켰다. 발코(Valco) 모델 C6UW HPLC 밸브 (발코, 미국 택사스주 휴스톤 소재) 및 10 μl 주사 루프가 장착된 CTC PAL 오토샘플러 (CTC, 스위스 즈빙겐 소재)를 이용하여 칼럼에 샘플을 주입하였다. HPLC를 매스링스 소프트웨어 (마이크로매스(Micromass, 영국 맨체스터 소재))로 제어하였다. 214 nm에서 UV 검출을 수행하였다. 용리액 A는 0.05% TFA를 함유한 물이었다. 용리액 B는 0.045% TFA를 함유한 물:아세토니트릴의 1:9 혼합물이었다. 20% B에서 90% B까지의 구배를 20분 동안 실행하였다. 유속은 통상 60 μl/분이었다. LC 시스템으로부터 전체 유량을 UV 검출 세포로 도입한 후, ESI 공급원에 도입하였다. HPLC 시스템을 제어하고, UV 검출기로부터의 신호를 매스링스 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 마이크로매스 Z-유형 전기분무 이온화 공급원이 구비된 Q-tof (마이크로매스, 영국 맨체스터 소재) 사중극자 비행 시간 하이브리드 이중 질량 분광계를 사용하여 질량 분광분석법을 수행하였다. 획득 질량 범위는 통상 m/z 500-2000이었다. 데이터를 기록하고, 매스링스 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 말 심장 미오글로빈 (MW 16,951.5 Da)의 다중-하전된 이온 피크를 사용하여 500-2000 m/z 규모의 보정을 달성하였다.
MALT1 억제의 용량-효과 및 시간-경과
384 웰 흑색 플레이트 (그라이너 바이오 원(Greiner Bio One, 벨기에 베멜 소재), 카탈로그 # 784076)에서, 8 pmol의 정제된 LZ-MALT1을 5% DMSO, 20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% 트리톤(Triton)X-100을 함유한 완충액 내 실온에서 명시된 시간 (5분 내지 80분) 동안 다양한 농도 (125, 62.5, 31.25, 15.625, 7.8125 또는 0 μM)의 화합물 MI-2와 함께 인큐베이션하고, 이어서 4 μMol의 Ac-LRSR-AMC를 각각의 혼합물에 첨가하여 반응을 개시하였다. 360/465 nm에서의 여기/방출 파장 및 20초 간격을 갖는 스펙트라맥스(SpectraMax) M5 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재))에서 반응을 모니터링하였다. 표준화 억제 백분율을 다음 화학식으로 계산하였다: (M(T2-T1)-N(T2-T1))/(P(T2-T1)-N(T2-T1))*100, 여기서 M(T2-T1)은 200초 및 0초에서의 화합물의 신호 차이이고, N(T2-T1)은 음성 대조군 완충액만의 신호 차이이고, P(T2-T1)은 양성 대조군 Z-VRPR-FMK의 신호 차이이다.
MALT1로의 MI-2 도킹
MI-2의 구조물을 생성하고, 그의 기하학적 구조를 최적화하였다. Z-VRPR-FMK 펩티드 억제제 (PDB ID: 3UOA)와의 복합체에서 그의 파라카스파제 및 Ig3 도메인을 함유한 MALT1의 원자 좌표 (문헌 [Wiesmann et al., 2012; Yu et al., 2011])를 억제제 도킹을 위해 선택하였다. 펩티드 억제제 및 용매 분자를 제거한 후, 수소 원자를 MALT1 구조에 첨가하였다. MI-2에 대비한 MALT1에 대한 3D 전위 격자를 규정하면서 도킹 시뮬레이션을 시작하였다. 계산된 격자 지도는 0.375 Å/포인트 간격을 갖는 치수 60 × 40 × 40 포인트였다. 오토도크 4.2의 제네릭 알고리즘 (문헌 [Morris et al., 2009])을 이용하였고, MI-2 억제제에서의 가요성을 허용하면서 견고한 분자로서 MALT1을 사용하여 도킹을 수행하였다. 예상된 결합 자유 에너지에 기초하여 최종 결과를 순위 매김하였다.
웨스턴 블롯
동량의 전체 단백질 (20-75 μg)을 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 상에서 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 전기이동시켰다. 막을 일차 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지스(Santa Cruz Biotechnologies, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터의 MALT1, BCL-10, CYLD; 이바이오사이언스(eBioscience, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터의 A20; 셀 시그날링(Cell Signaling, 미국 매사추세츠주 댄버스 소재)으로부터의 포스포-IκB-α, IκB-α, c-REL, RELB; 및 시그마(Sigma)로부터의 α-튜불린), 및 이어서 화학발광으로 검출되는 양고추냉이 퍼옥시다제와 컨쥬게이트된 이차 항체 (피어스, 써모 사이언티픽(Pierce, Thermo Scientific, 미국 일리노이주 락포드 소재))와 함께 인큐베이션하였다.
유동 세포측정법
세포 증식에서의 MI-2의 효과를 연구하기 위하여, 세포를 0.5 μM 및 37℃에서 10분 동안 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, 인비트로젠, 라이프 테크놀로지스(Invitrogen, Life Technologies, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재))로 표지하였다. CFSE가 장기 생존한 세포내 분자를 카르복시플루오레세인으로 공유결합하여 표지하였다. 각각의 세포 분열 후, 형광 분자를 딸세포에서 희석시켜 세포 분열의 동역학적 비교 연구를 가능하게 하였다. 세포를 DAPI (시그마)로 염색한 후, 유동 세포측정법을 수행하였다. DAPIneg 세포를 분석을 위해 게이팅하였다.
세포-주기 분포를 측정하기 위해, APC BrdU 유량 키트 (BD 파밍겐(BD Pharmingen, 미국 캘리포니아주 산호세 소재))를 사용한 펄스-BrdU (브로모데옥시우리딘) 혼입을 이용하여 유동 세포측정법으로 세포를 분석하였다.
아넥신V-APC/DAPI (BD 파밍겐) 염색 및 이어서 유동 세포측정법으로 아폽토시스를 평가하였다.
c-REL의 핵 유출을 유동 세포측정법으로 연구하였다. 명시된 바와 같이 세포를 처리하고, 전체 세포 또는 단리된 핵을 제조하고, c-REL에 대해 염색하였다. 전체 세포를 고정시키고, 다코(Dako, 덴마크 글로스트룹 소재)로부터의 인트라스테인(Intrastain) 키트를 사용하여 세포가 투과성이 되게 하였다. 핵 추출을 위해, 세포를 차가운 핵 추출 완충액 (320 mM 수크로스, 5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1% 트리톤 X-100 (pH 7.4))에 재현탁시키고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하고, 핵 세척 완충액 (320 mM 수크로스, 5 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.4), 트리톤 X-100 무함유)으로 2회 세척하였다. 핵 수율 및 완전성(integrity)을 트리판 블루 염색을 이용하여 현미경 조사로 확인하였다. 표지를 위해, 핵 세척 완충액을 1% BSA, 0.1% 아지드화나트륨 및 1:100 c-REL 항체 (셀 시그날링)로 보충하였다. 세포를 세척한 후, 인비트로젠으로부터의 이차 항체와 컨쥬게이트된 알렉사 플루오르-488과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 다시 세척하고, DAPI로 염색한 후, 유동 세포측정법을 수행하였다.
루시페라제 검정
12-웰 디쉬의 웰 당 2 × 105개 세포 밀도로 시딩된 293T 세포에서 리포터 검정을 수행하였다. 100 ng의 (NF-κB)5-Luc2CP-pGL4 및 10 ng의 TK-레닐라 내부 대조군 플라스미드를 리포펙타민 2000 (인비트로젠)을 사용하여 25 ng의 명시된 플라스미드 (MIGR1-MALT1WT 또는 MIGR1-MALT1C464A 및 pcDNA4-Flag-Bcl10)와 함께 공동 형질감염시켰다. 용해물을 제조업체의 프로토콜 (프로메가)에 따라 이중 루시페라제 검정으로 이동시켰다. HBL-1에서, 5 × 106개 세포 당 5 μg의 (NF-κB)5-Luc2CP-pGL4 및 50 ng의 TK-레닐라 내부 대조군 플라스미드를 뉴클레오펙션 (아막사, 론자(Amaxa, Lonza, 스위스 바젤 소재))을 이용하여 공동 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 24-웰 플레이트의 웰 당 5 × 104개의 세포 밀도로 플레이팅하고, 명시된 바와 같이 처리하였다. 용해물을 제조업체의 프로토콜 (프로메가)에 따라 이중 루시페라제 검정으로 이동시켰다.
마이크로어레이 데이터 분석
HBL-1 및 TMD8 세포로부터의 RNA를 명시된 농도의 화합물 MI-2 또는 비히클로 8시간 동안 처리하고, 알엔이지 플러스(RNeasy Plus) 키트 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 mRNA를 단리한 후, RNase-프리 DNase 시약 (퀴아젠)을 사용하여 DNase 처리를 하였다. 애질런트 2100 바이오애널라이저 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies, 미국 캘리포리나주 산타 클라라 소재)) 상에서 RNA 6000 나노 랩칩(Nano LabChip) 키트를 사용하여 RNA 완전성을 측정하였다. 샘플을 일루미나(Illumina)의 권고사항에 따라 처리하고, cRNA를 휴먼HT-12 v4 익스프레션 비드칩(HumanHT-12 v4 Expression BeadChip) (일루미나, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)과 혼성화하였다. 어레이를 아이스캔(iScan) 시스템 상에서 스캐닝하였다. 게놈스튜디오(GenomeStudio)를 이용하여 데이터 사전-처리 및 품질 관리를 수행하였다. 데이터를 분위 정규화와 조합하여 로그2-전환시켰다 (문헌 [Du et al., 2008]). GEO 수탁 번호 GSE40003.
결과의 생물학적 중요성을 결정하기 위해, 관련 유전자 세트에 관한 풍부화 시험을 수행하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 GSEA (유전자 세트 농축 분석) 소프트웨어를 이용하였고, 데이터세트를 배수 변화 값으로 미리 순위 매김하였다 (문헌 [Subramanian et al., 2005]). 각 유전자 세트의 p-값을 1,000회 반복값 및 FDR 계산에 대한 여러 가설 시험 수정에 기초하여 계산하였다 (문헌 [Storey and Tibshirani, 2003])
마우스 이종이식편 실험
8주령의 수컷 SCID NOD.CB17-Prkdcscid/J 마우스를 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories, 미국 미네소타주 바 하버 소재))로부터 구입하고, 깨끗한 환경에서 보관하였다. 상기 마우스에 50% 매트리겔 중의 낮은-계대 107 인간 TMD8 또는 OCI-Ly1 세포 (BD 바이오사이언시스, #354234)를 피하 주사하였다. 종양이 120 mm3의 평균 크기에 도달했을 때 (이식 17일 후), 처리를 개시하였다. 약물을 DMSO에서 재구성하고, 사용시까지 -80℃에서 보관하고, 복강내 주사로 투여하였다. 종양 부피를 3주간 디지털 캘리퍼링 (피셔 사이언티픽, 써모 사이언티픽(Fisher Scientific, Thermo Scientific, 미국 일리노이주 락포드 소재))으로 모티터링하고, 화학식 (최소 직경2 × 최대 직경)/2를 이용하여 계산하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로 나타내고, 차이는 대응표본 스튜던츠 t-시험에 의해 p<0.05에서 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다. 동물을 수반한 모든 절차는 US NIH 프로토콜에 따랐고, 코넬 대학의 바일 코넬 의과 대학의 동물 기관 위원회에 의해 승인받았다.
파라핀 (IF-P) 및 면역조직화학 (IHC) 내 면역형광
파라핀-포매된 종양 이종이식편을 절편화하고, 탈랍시키고, 항원 복구시켰다. IF-P의 경우, 인비트로젠으로부터의 이차 항체와 컨쥬게이트된 알렉사 플루오르-488을 사용하고 세포 핵을 DAPI로 대비염색시켰다. 악시오버트(Axiovert) 200M 형광 현미경 (칼 자이스 인크.(Carl Zeiss Inc., 미국 뉴욕주 쏜우드 및 독일 오버코헨 소재))을 사용하여 형광 영상을 수득하였다. IHC의 경우, 비오틴-컨쥬게이트된 이차 항체를 사용하였다. 이어서, 아비딘/비오틴 퍼옥시다제를 슬라이드 (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))에 도포하였다. 디아미노벤조에이트 발색체 퍼옥시다제 기질 (벡터)로 발색시키고, 헤마코실린-에오신으로 대비염색시켰다. 악시오스콥(AxioSkop) II 광학 현미경 (칼 자이스 인크.)에 부착된 악시오캠(AxioCam) (칼 자이스 인크.) 카메라를 사용하여 사진을 수득하였다. 병리학자가 샘플을 검토하였다.
튜넬
말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 말단 표지, 튜넬 검정 (아팝태그, 케미콘(ApopTag, Chemicon, 미국 캘리포니아주 테메큘라 소재))을 이용하여 세포사멸 DNA 단편화를 검출하였다 (문헌 [Gavrieli et al., 1992]). 요약하면, 포르말린-고정 파라핀-포매된 이종이식편 종양을 탈파라핀화하고, 트립신 (자이메드(Zymed, 미국 캘리포니아주 샌 프란시스코 소재))으로 사전 처리하여 DNA를 노출시켰다. 내인성 퍼옥시다제를 3% 과산화수소 (시그마)를 사용하여 켄칭한 후, TdT 효소와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 항-디곡시게닌-퍼옥시다제를 슬라이드에 도포하였다. 디아미노벤조에이트 발색체 퍼옥시다제 기질 (벡터 래보러토리즈, 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)을 사용하여 발색시키고, 메틸 그린 (피셔 사이언티픽, 써모 사이언티픽, 미국 일리노이주 락포드 소재)으로 대비염색시켰다. 악시오스콥 II 광학 현미경 (칼 자이스 인크.)에 부착된 악시오캠 (칼 자이스 인크.) 카메라를 사용하여 사진을 수득하였다. 병리학자가 샘플을 검토하였다.
원발성 세포
바일 코넬 의과 대학 검토 위원회의 가이드라인 및 승인에 따라 환자의 확인되지 않은 조직을 수득하였다. 환자 샘플을 상기 기재된 바와 같이 (문헌 [Cerchietti et al., 2010]) 처리하였다. 요약하면, 림프절 생검으로부터의 단세포 현탁액을 조직의 물리적 파괴, 및 이어서 세포 밀도 구배 분리 (피코/라이트 림포에이치(Fico/Lite LymphoH), 아틀란타 바이올로지칼스(Atlanta Biologicals, 미국 조지아주 로렌스빌 소재))로 수득하였다. 세포 수 및 생존력을 트리판 블루 배제로 측정하였다. 원발성 DLBCL 세포를 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 항생제가 보충된 20% FBS를 갖는 후기 RPMI 배지에서 세포를 48시간 동안 성장시켰다. 세포를 0.8 μM의 MI-2 (Pt.2의 경우 1 μM) 또는 대조군 (DMSO)에 4회 노출시켰다. 노출 48시간 후, 트리판 블루 (시그마)를 사용하여 생존력을 측정하였다. 모든 샘플을 그 자체 반복 대조군에 대해 표준화하였다. 대응표본 T-시험을 이용하여 통계적 유의성을 계산하였다.
인용 문헌
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
본원에 인용된 모든 특허 및 공개물은 각각의 개별 공개물이 구체적으로 및 개별적으로 그의 전문이 본원에 참조로서 포함되는 것으로 명시된 것과 같은 동일한 정도로 본원에 참조로서 포함된다.
사용된 용어 및 표현은 용어의 제한이 아닌 설명으로서 사용된 것이고, 이러한 용어 및 표현의 사용은 나타내고 기재된 특징의 임의의 등가물 또는 그의 일부를 배제하고자 하는 의도가 아니며, 다양한 변형이 청구된 본 발명의 범주 내에서 가능하다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태 및 임의적인 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있을지라도, 본원에 개시된 개념의 변형 및 변화가 통상의 기술자에 의해 행해질 수 있으며, 그러한 변형 및 변화가 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범주 내로 여겨짐을 이해해야 할 것이다.

Claims (13)

  1. MALT1을 유효한 양 또는 농축도의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체와 접촉시키는 것을 포함하는, MALT1을 조절하는 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00025

    상기 식에서,
    파선 결합은 결합이 존재할 수 있거나 부재할 수 있음을 나타내고;
    Y1 및 Y2 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, Y1은 N 또는 CR이고, Y2는 C이고, Ar1은 존재하며; Y1 및 Y2 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, Y1은 CR2이고, Y2는 O 또는 S이고, Ar1은 부재하고, 각각 독립적으로 선택되는 R은 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    R1은 알킬, 알콕시알킬, 또는 아릴알킬이며, 여기서 임의의 알킬, 알콕시알킬, 또는 아릴알킬은 할로 또는 (C1-C6)알콕시로 단일-치환 또는 독립적으로 다중-치환될 수 있되, 단 산소 원자, 및 Y3을 포함하는 고리 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R1은 부재하고, Ar3은 존재하며, 산소 원자 및 고리 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, R1은 존재하고, Y3, 및 산소 원자를 보유한 탄소 원자 사이에 이중 결합이 존재하고, Ar3은 부재하고;
    Ar1은 1-3개의 J1 기로 치환된 페닐이고; J1은 할로 또는 (C1-C6)알콕시이고;
    Ar2는 1-3개의 J2 기로 치환된 페닐이고; J2는 화학식 -N(R)C(O)-R2의 기이고, R2는 알킬, 아릴, 또는 아릴아미노이며, 여기서 임의의 알킬, 아릴, 또는 아릴아미노는 0-2개의 할로, 니트로, 또는 (C1-C6)알콕시 기로 치환되고;
    Ar3은 1-3개의 J3 기로 치환된 페닐이고; J3은 할로 또는 (C1-C6)알콕시이다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체인 방법.
    <화학식 IA>
    Figure pct00026

    상기 식에서, R1, Ar1, 및 Ar2는 화학식 I에 대해 정의된 바와 같다.
  3. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 IB의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체인 방법.
    <화학식 IB>
    Figure pct00027

    상기 식에서, Ar2 및 Ar3은 화학식 I에 대해 정의된 바와 같다.
  4. 제1항에 있어서, 화합물이 하기 화합물 중 임의의 것 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체인 방법.
    Figure pct00028

    Figure pct00029

    Figure pct00030
  5. 제1항에 있어서, MALT1이 살아있는 동물 내에 배치된 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 살아있는 동물이 암을 앓는 인간인 방법.
  7. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체의 유효 용량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00031

    상기 식에서,
    파선 결합은 결합이 존재할 수 있거나 부재할 수 있음을 나타내고;
    Y1 및 Y2 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, Y1은 N 또는 CR이고, Y2는 C이고, Ar1은 존재하며; Y1 및 Y2 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, Y1은 CR2이고, Y2는 O 또는 S이고, Ar1은 부재하고, 각각 독립적으로 선택되는 R은 H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    R1은 알킬, 알콕시알킬, 또는 아릴알킬이며, 여기서 임의의 알킬, 알콕시알킬, 또는 아릴알킬은 할로 또는 (C1-C6)알콕시로 단일-치환 또는 독립적으로 다중-치환될 수 있되, 단 산소 원자, 및 Y3을 포함하는 고리 사이에 이중 결합이 존재하는 경우, R1은 부재하고, Ar3은 존재하며, 산소 원자 및 고리 사이에 단일 결합이 존재하는 경우, R1은 존재하고, Y3, 및 산소 원자를 보유한 탄소 원자 사이에 이중 결합이 존재하고, Ar3은 부재하고;
    Ar1은 1-3개의 J1 기로 치환된 페닐이고; J1은 할로 또는 (C1-C6)알콕시이고;
    Ar2는 1-3개의 J2 기로 치환된 페닐이고; J2는 화학식 -N(R)C(O)-R2의 기이고, R2는 알킬, 아릴, 또는 아릴아미노이며, 여기서 임의의 알킬, 아릴, 또는 아릴아미노는 0-2개의 할로, 니트로, 또는 (C1-C6)알콕시 기로 치환되고;
    Ar3은 1-3개의 J3 기로 치환된 페닐이고; J3은 할로 또는 (C1-C6)알콕시이다.
  8. 제7항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 IA의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체인 방법.
    <화학식 IA>
    Figure pct00032

    상기 식에서, R1, Ar1, 및 Ar2는 화학식 I에 대해 정의된 바와 같다.
  9. 제7항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 IB의 화합물 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체인 방법.
    <화학식 IB>
    Figure pct00033

    상기 식에서, Ar2 및 Ar3은 화학식 I에 대해 정의된 바와 같다.
  10. 제7항에 있어서, 화합물이 하기 화합물 중 임의의 것 또는 그의 임의의 염, 수화물, 호변이성질체, 또는 입체이성질체인 방법.
    Figure pct00034

    Figure pct00035
  11. 제7항에 있어서, 암이 림프종인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 림프종이 미만성 거대 B-세포 림프종인 방법.
  13. 형광원 AMC (7-아미노-4-메틸쿠마린)에 연결된 MALT1 기질 펩티드 LRSR을 사용하여, 류신 지퍼 이량체화 모티프와 융합된 MALT1 (340-789)의 재조합 형태 (LZ-MALT1) 및 후보 조절제 화합물을 접촉시키는 것을 포함하며, MALT1에 의한 Ac-LRSR-AMC 기질의 절단이 AMC 및 형광 신호의 방출을 초래하고, 여기서 후보 조절제의 존재 하에 MALT1의 재조합 형태에 의한 Ac-LRSR-AMC 기질의 절단의 감소는 후보 조절제가 MALT1의 소분자 조절제임을 나타내는 것인, MALT1의 소분자 조절제를 확인하는 방법.
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