CN109562154A - 带有修饰hsp70域的抗原结合融合蛋白 - Google Patents

带有修饰hsp70域的抗原结合融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN109562154A
CN109562154A CN201780029242.5A CN201780029242A CN109562154A CN 109562154 A CN109562154 A CN 109562154A CN 201780029242 A CN201780029242 A CN 201780029242A CN 109562154 A CN109562154 A CN 109562154A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
fusion protein
amino acid
cell
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780029242.5A
Other languages
English (en)
Inventor
T·布劳恩斯
M·C·波南斯基
J·A·盖尔芬德
陈华标
S·J·麦考马克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
April Heath Ltd
General Hospital Corp
Aperisys Inc
Original Assignee
April Heath Ltd
General Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by April Heath Ltd, General Hospital Corp filed Critical April Heath Ltd
Publication of CN109562154A publication Critical patent/CN109562154A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及包含与修饰热休克蛋白70融合的抗原结合域的融合蛋白。本发明进一步涉及采用所述融合蛋白诱导抗原免疫反应及治疗抗原相关疾病的方法。

Description

带有修饰HSP70域的抗原结合融合蛋白
联邦资助声明
本发明得到国防部授予的批准号W81XWH-14-1-0206的政府支持。政府享有本发明的某些权利。
优先权声明
本申请要求2016年3月10日提交的序列号为62/306,168的美国临时申请的权益，其全部内容通过引用纳入本申请中。
技术领域
本发明涉及包含与修饰热休克蛋白70融合的抗原结合域的融合蛋白。本发明进一步涉及采用所述融合蛋白诱导抗原免疫反应及治疗抗原相关疾病的方法。
背景技术
间皮素是一种分化抗原，它在正常人体组织内的表达限于胸膜、心包和腹膜的间皮细胞。但是，间皮素在几种人类癌症中高度表达，包含间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和肺腺癌。间皮素是间皮素疾病预防或治疗方法及间皮素特异性抗体的合适靶，并且含间皮素的疫苗可用于预防和治疗方法。
目前，人们在哺乳动物细胞中制备典型的单克隆抗体。这种制备方法的缺点包含很难产生和选择合适的克隆，而且培养哺乳动物细胞的费用较高。在大肠杆菌中制备了“新一代”的单克隆抗体。最近，通过连接肽连接在一起的VH和VL域的微生物表达能够产生工程“微抗体”。这些微抗体在大肠杆菌中以实质上的组合方式产生。这些人工制备的Fab或单链Fv(scFv)可以连接在一起，形成多聚体，例如，二聚体、三聚体和四聚体。虽然它们与抗原结合的效率与抗体差不多，但是，这些缺少Fc的工程微抗体无法与抗原提呈细胞相互作用，免疫原性较差。工程抗体缺乏免疫原性的现有解决方案包含引导其中一个抗原结合位点直接与免疫细胞结合。这种方案能够使抗原结合位点与免疫细胞结合，但无法实现与单克隆抗体一样的MHC I类提呈。
采用疫苗开展免疫仍然是预防疾病和感染威胁的基础。疫苗研发的主要困难是针对特定的威胁快速匹配一种疫苗，或抗毒素。目前的疫苗研发策略依赖于对于可以成功消除感染或治愈疾病的靶向抗原的鉴定和表征。目前的疫苗研发策略费时费力，只能在威胁出现后开始启动。这种策略在产生个性化疫苗以治疗靶抗原因人而异的疾病方面不具备可行性。因此，目前的疫苗研发策略无法满足需要，因为如果出现严重的新威胁，在新威胁可以被容忍之前并没有足够的时间来鉴定和表征抗原。目前的疫苗研发策略在针对普通人群产生个性化疫苗方面也无法满足要求。
美国专利7,749,501和7,943,133描述了包含增强对抗原的免疫反应、与应激蛋白融合的工程抗体的融合蛋白。
本发明公开了免疫刺激性和治疗性增强的修饰融合蛋白，解决了前面提到的各种缺点。
发明内容
本发明部分基于几种修饰结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)的研发，这些修饰结核分枝杆菌热休克蛋白单独或组合使用，可以提高包含所述修饰HSP70的抗原结合融合蛋白激发针对抗原的免疫反应以及治疗与抗原有关的疾病的有效性。
因此，本发明的一个方面涉及一种融合蛋白，包含与200个以下氨基酸的结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断在读框内融合的抗原结合域，其中所述HSP70片段包含最小HSP70序列。
本发明的另一个方面涉及一种融合蛋白，包含与至少100个氨基酸的结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断在读框内融合的抗原结合域，并包含不超过SEQ ID NO:1的氨基酸1-495。
本发明的另一个方面涉及一种融合蛋白，包含与结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断在读框内融合的抗原结合域，所述热休克蛋白70包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列(临时序列)。
本发明的另一个方面涉及一种融合蛋白，包含与嵌合结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)在读框内融合的抗原结合域，其中所述嵌合HSP70包含人HSP70氨基酸序列骨架，其中大约氨基酸残基367至479(根据SEQ ID NO:29编号)的β-折叠域被结核分枝杆菌热休克蛋白70的大约氨基酸残基395至541(根据SEQ ID NO:1编号)的β-折叠域替换。
本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，包含有效量的本发明所述融合蛋白及药学上可接受的载体。
本发明的另一个方面涉及一种包含本发明所述融合蛋白的免疫原性组合物或疫苗。
本发明的又一个方面涉及一种包含本发明所述融合蛋白及其包装装置的试剂盒。
本发明的另一个方面涉及一种编码本发明所述融合蛋白的分离核酸及包含所述核酸的表达载体和细胞。
本发明的另一个方面涉及一种在受试者体内诱导针对抗原的免疫反应的方法，包括向受试者施用与所述抗原特异性结合的本发明融合蛋白，从而诱导免疫反应。
本发明的又一个方面涉及一种治疗有需要的受试者的抗原相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的与所述抗原特异性结合的本发明融合蛋白，从而治疗疾病。
本发明的这些方面和其它方面将在下面进行更详细的说明。
附图说明
图1示出了VIC-007(SEQ ID NO:28)和VIC-008(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列。通过删除VIC-007以粗斜体表示的冗余氨基酸GSS、SGILEQQG和AAAMRS，并在MtbHsp70位置410引入单氨基酸突变，以苯丙氨酸(F)替换缬氨酸(V)重构得到VIC-008。
图2A-2B示出了肿瘤生长情况。采用IVIS Spectrum，对Luc-ID8肿瘤接种小鼠(n＝8或9)在肿瘤接种后一周及之后每周开展生物发光信号定量分析。(A)提供每个治疗组代表性小鼠肿瘤接种后一周治疗前(W0)及之后5周(W1–W5)的纵向图像。(B)箭头表示从肿瘤接种一周后开始的4次治疗，每次间隔7天。采用IVIS Lumina Series III计算总光子数。统计差异采用两因素方差检验(Two-Way ANOVA)，然后采用图基多重比较试验分析。****，p<0.0001。数据以平均值±标准误差表示。
图3示出了治疗后小鼠的生存情况。治疗1周后每天对小鼠进行观察。在终点，对小鼠实施安乐死，生存时间与寿命一样从肿瘤接种时间开始计算。采用时序检验(log-ranktest)确定生存时间中值和p值。
图4示出了治疗开始(0周)后第一个五周内卵巢癌肿瘤生长的情况。经腹膜内向C57BL/6小鼠注射5x 106个荧光素酶表达ID8小鼠卵巢癌细胞。盐水治疗对照组10只小鼠；VIC-008治疗组11只小鼠。肿瘤接种一周后，小鼠每周接受一次治疗，共接受4次治疗。VIC-008的治疗剂量是每只小鼠20μg。采用IVIS监测荧光素酶信号。采用两因素方差检验(Two-Way ANOVA test)，确定统计显著性。
图5示出了注射卵巢癌细胞后小鼠的生存情况。经腹膜内向C57BL/6小鼠注射5x106个荧光素酶表达ID8小鼠卵巢癌细胞。生理盐水治疗对照组10只小鼠；VIC-008治疗组11只小鼠。肿瘤接种一周后，小鼠每周接受一次治疗，共接受4次治疗。VIC-008的治疗剂量是每只小鼠20μg。采用时序检验(Mantel-Cox)确定统计显著性。
图6示出了瘤内CD8+T细胞浸润。生理盐水或VIC-008第4次治疗和最后一次治疗2周后，采集肿瘤标本。采集肿瘤组织，并采用流式细胞术测得免疫表型以检测CD3+CD8+T细胞。T细胞以其占门内活细胞的百分数计数。
图7示出了瘤内Treg T细胞浸润。生理盐水或VIC-008第4次治疗和最后一次治疗2周后，采集肿瘤标本。采集肿瘤组织，并采用流式细胞术测得免疫表型以检测CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞。T调节细胞以其占所有CD3+CD4+细胞的百分数计数。
图8示出了肿瘤内CD8+T细胞和T调节细胞的比例。生理盐水或VIC-008第4次治疗和最后一次治疗2周后，采集肿瘤标本。采集肿瘤组织，并采用流式细胞术测得免疫表型以检测CD3+CD8+T细胞和CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞。比例按其占观察细胞群的百分数计算。
图9示出了瘤内中央记忆性CD8+T细胞浸润。生理盐水或VIC-008第4次治疗和最后一次治疗2周后，采集肿瘤标本。采集肿瘤组织，并采用流式细胞术测得免疫表型以检测CD8+CD44+CD27+中央记忆性T细胞。CD8+中央记忆性T细胞以其占所有CD3+CD8+细胞的百分数计数。
具体实施方式
下面将参考示出本发明优选实施例的附图对本发明进行说明。但是，本发明可以采用各种不同形式实施，并且不应认为本发明限于本文提出的实施例。相反，提供这些实施例是为了充分完整地公开本发明，并向本领域技术人员全面传达本发明的范围。
除非特别规定，本发明使用的所有技术名词和科学术语的意义与本发明所属领域技术人员通常理解的相同。本发明说明中使用的术语仅仅是为了描述特定实施例，并不是用于限制本发明。通过引用，本文引用的所有出版物、专利申请、专利公开和其它参考文献有关其引用句子和/或段落有关的教导整体都纳入本申请中。
除非上下文另外声明，应该特别指出的是，本文描述的本发明的各种特征可以以任何组合形式使用。
此外，本发明还设想在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文提出的任何特征或特征组合。
举例来说，如果说明书声明一种复合物包含组分A、B和C，应该特别指出的是，A、B或C组分中的任一种组分，或它们的组合，都可以单独或在任何组合中省略和放弃。
本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用而整体纳入本申请中。
本文氨基酸按照IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的方式表示，或(氨基酸)按照37CFR§1.822和惯用法以单字母代码或三字母代码表示。
如在本发明的说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文中清楚表明，否则，单数形式“一”、“所述”也包含复数形式。
又如本文使用的，本文所述“和/或”指的是和包含一个或多个相关列出项目的任何和所有可能组合，及缺少替代(“或”)中阐明的组合。
当提到可以量度的数值，如多肽量、剂量、时间、温度、酶活性或其它生物活性等时，本文使用的词语“大约”指的是包含规定数量±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
在此公开中，“包括”、“包含”、“含有”及“具有”等具有美国专利法赋予它们的开放式含义，指的是“包含”等。
如本文使用的，连接词“基本上由……组成”(consisting essentially of)(及语法变化形式)解释为包含列出的材料或步骤及那些并不显著影响本发明基本新特点的材料或步骤。因此，本文词语“基本上由……组成”不应解释为相当于“包含”。
正如应用于本发明多肽或多核苷酸序列时，词语“基本上由……组成”(consistsessentially of)(和语法变化形式)指的是多肽或多核苷酸由所提出序列(例如SEQ IDNO)及在所提出序列N-端和/或C-端有共10个或更少个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)其它氨基酸或在5’端和/或3’端上有其它核苷酸组成，从而多肽或多核苷酸的功能并未显著改变。共10个或更少个其它氨基酸或核苷酸包含两端加在一起的其它氨基酸或核苷酸的总数量。应用于本发明的多肽时，词语“显著改变”指的是与所提出序列组成的多肽的活性相比，(例如，对含间皮素的肿瘤的)免疫刺激活性提高或降低至少大约50％或更多。应用于本发明多核苷酸时，词语“显著改变”指的是与所提出序列组成的多核苷酸的活性相比，表达编码多肽的能力提高或降低至少大约50％或更多。
词语“调节”指的是增强(例如，提高)或抑制(例如，降低)规定水平或活性。
词语“增强”或“提高”指的是规定参数提高至少大约1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍或甚至15倍。
词语“抑制”或“降低”或其它语法变化形式指的是规定水平或活性降低或减少至少大约15％、25％、35％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％或更多。在特定实施例中，抑制或降低导致几乎没有或基本上没有任何可以检测到的活性(至多是没有意义的数量，例如，小于大约10％或甚至5％)。
谈到多肽和钙通道时使用的词语“接触”或其语法变化形式指的是使多肽和钙通道彼此距离足够近，使它们中的一种能够向另一种施加生物影响。在一些实施例中，词语接触指的是多肽与钙通道结合。
词语“治疗”指的是受试者疾病的严重程度降低或至少部分改善或改进，至少一种临床症状实现某种减轻、缓解或减少。
词语“预防”(及其语法变化形式)指的是与不采用本发明方法相比，阻止和/或延迟受试者疾病、病症和/或临床症状的发生和/或减轻疾病、病症和/或临床症状发生的严重程度。预防可以是全面的，例如，完全不出现疾病、病症和/或临床症状。预防还可以是部分的，从而受试者疾病、病症和/或临床症状的发生和/或疾病、病症和/或临床症状发生的严重程度低于不采用本发明方法时的情况。
本文使用的“治疗有效”量是为受试者提供某些改善或好处的量。或者，“治疗有效”量是减轻、缓解或减少受试者至少一种临床症状的量。本领域技术人员将了解的是，治疗效果并不需要全面或治愈，只要为受试者提供某些好处即可。
本文使用的“预防有效”量是与不采用本发明方法相比，足够阻止和/或延迟受试者疾病、病症和/或临床症状的发生和/或减轻疾病、病症和/或临床症状发生的严重程度的量。本领域技术人员将了解的是，预防水平并不需要全面，只要为受试者提供某些好处即可。
本文使用的所述“间皮素”指的是一种分化抗原，它在正常人体组织内的表达限于胸膜、心包和腹膜的间皮细胞。但是，间皮素在几种人类癌症中高度表达，包含间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和肺腺癌。间皮素基因编码71kDa前体蛋白，71kDa前体蛋白经处理形成称为巨核细胞强化因子(MPF)的31kDa脱落蛋白及通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的40kDa片段-间皮素。
间皮素有三(3)种变体：可溶间皮素-1、独特的间皮素-2转录本及拥有伸长C-端的间皮素-3变体。间皮素-1被发现存在于胸膜、心包和腹膜中及卵巢、扁桃腺和输卵管表面上皮中(Ordonez，2003)。间皮素还在间皮瘤、胰腺癌及头、颈、肺、食道、子宫颈和外阴鳞状细胞癌中过表达(Chang和Pastan 1992,1996；Frierson等2003)。
词语“施用”包含输送本发明化合物的任何方法，包含但不限于将药物组合物或治疗剂输送到受试者系统内或受试者体内或身上的特定区域，包含全身或局部施用。本文使用的词语“全身施用”、“外周施用”指的是化合物、药物或其它材料的施用并非直接输入到中枢神经系统，因此，进入患者系统内，从而，经历新陈代谢和其它类似过程，例如，皮下施用。“胃肠外施用”指的是不同于肠内施用和局部施用的施用模式，通常是注射施用，包含但不限于，静脉内、肌内、病灶内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射，经口、硬脑膜外、鼻内和输液施用。
词语“氨基酸”包含具有氨基功能和酸功能并且能够纳入天然氨基酸聚合物内的所有分子，不管是天然分子或合成分子。示例氨基酸包含天然氨基酸；其类似物、衍生物和同类物；具有不同侧链的氨基酸类似物；前述任一种氨基酸的所有立体异构体。
词语“抗体”指的是免疫球蛋白、保持特异性结合能力的免疫球蛋白衍生物，及结合域与免疫球蛋白结合域同源或大致同源的蛋白质。这些蛋白质可以来源于天然来源，或部分或整体合成制备。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是任何类型免疫球蛋白的成员，包含任何人类免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和IgY。在示例性实施例中，本文所述方法和组合物使用的抗体是IgG类衍生物。词语“抗体”还包含本文定义的抗体片段。
词语“抗体片段”指的是小于全长的任何抗体衍生物。在示例性实施例中，抗体片段保留了全长抗体很大一部分特异性结合能力。抗体片段的实例包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv双链体和Fd片段。抗体片段可以采用任何方法产生。例如，抗体片段可以通过酶法或化学法使完好抗体断裂产生，可以采用编码部分抗体序列的基因重组产生，或可以全部或部分合成产生。抗体片段可以任选是单链抗体片段。或者，所述片段可以包含(例如，通过二硫键)连接在一起的多条链。所述片段还任选是多分子复合物。功能抗体片段通常包含至少大约50个氨基酸，更通常包含至少大约200个氨基酸。
词语“Fab片段”指的是木瓜蛋白酶切割抗体产生的包含抗原-结合位点的抗体片段，木瓜蛋白酶切割铰链区H-链链间二硫键近N-端，从一个抗体分子产生两个Fab片段。
词语“F(ab’)2片段”指的是胃蛋白酶切割抗体分子产生的包含两个抗原结合位点的抗体片段，胃蛋白酶切割铰链区H-链链间二硫键近C-端。
词语“Fc片段”指的是包含其重链恒定区的抗体片段。
词语“Fv片段”指的是包含其重链和轻链可变区的抗体片段。
词语“工程抗体”指的是一种重组分子，包含至少一种包含来自抗体重链和/或轻链可变区的抗原结合位点的抗体片段，及任选包含任何Ig类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)抗体的全部或部分可变区和/或恒定区。工程抗体的实例包含增强单链单克隆抗体和增强单克隆抗体。工程抗体的实例在PCT/US2007/061554中进行了进一步描述，该专利的全部内容通过引用纳入本申请中。“工程抗体”包含根据本发明方法所述，及本文所定义的工程抗体片段。
词语“单链可变片段或scFv”指的是其中重链区和轻链区连接的Fv片段。一个或多个scFv片段可以与其它抗体片段连接(例如，重链或轻链的恒定区)，形成具有一个或多个抗原识别位点的抗体构建体。
词语“多价抗体”指的是包含一个以上抗原识别位点的抗体或工程抗体。例如，“二价”抗体具有两个抗原识别位点，而“四价”抗体具有四个抗原识别位点。词语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等指的是多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(与抗原识别位点数量相对)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点全部与同一表位结合。“双特异性”抗体拥有至少一个与第一表位结合的抗原识别位点及与至少一个与不同于第一表位的第二表位结合的抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有全部与同一表位结合的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其中一些位点与第一表位结合，另一些位点与不同于第一表位的第二表位结合。
词语“表位”指的是抗体优先且特异性与其结合的抗原区域。单克隆抗体优先与可以从分子上定义的分子的单特异性表位结合。在本发明中，多特异性抗体可以识别多个表位。
“抗原”指的是本文所述组合物诱导的免疫反应目标。抗原可以是蛋白抗原，理解为包含病毒或受试者被感染的、外源的或肿瘤细胞表面蛋白质的整个蛋白质、蛋白质片段，以及由于蛋白质加工和展示，例如，通过典型MHC 1类或II类路径，由被感染的、外源的或肿瘤细胞展示的肽。所述外源细胞的实例包含细菌、霉菌和原生动物。细菌抗原的实例包含蛋白质A(PrA)、蛋白质G(PrG)和蛋白质L(PrL)。
词语“抗原结合位点”指的是与抗原表位特异性结合的抗体区或其片段区。
词语“共刺激分子”包含能够增强抗原-特异性原发性T细胞刺激剂刺激作用或将其活性提高到超出细胞活化所需阈值水平，使初始T细胞活化的任何分子。所述共刺激分子可以是膜-驻留受体蛋白。
词语“有效剂”指的是化合物、材料或组合物足够实现预期结果的用量。化合物的有效量可以是一次或多次施用量。
“融合蛋白”或“融合多肽”指的是混合多肽，包含来自至少两种不同多肽的多肽部分。本文定义的“融合蛋白”是包含，例如，本发明应激蛋白的第一氨基酸序列(蛋白)与包含和间皮素或生物素-结合蛋白特异性结合的抗体或抗体片段的第二氨基酸序列连接形成的融合。融合蛋白还包含第一氨基酸序列包含应激蛋白和第二氨基酸序列包含生物素结合蛋白的融合蛋白。融合蛋白还包括下述融合蛋白，其包含包含应激蛋白的第一氨基酸序列和包含抗体结合蛋白的第二氨基酸序列。融合蛋白还包括下述融合蛋白，其包含包含与间皮素特异性结合的抗体或抗体片段的第一氨基酸序列及包含生物素结合蛋白或抗体结合蛋白的第二氨基酸序列。
这些部分可以来自同一生物体的蛋白，此时，融合蛋白称为“种间”、“基因间”等。在不同的实施例中，所述融合多肽可以包含与第一多肽连接的一个或多个氨基酸序列。在不止一个氨基酸序列与第一多肽融合的情况下，融合序列可以是同一序列的多个拷贝，或者可以是不同的氨基酸序列。第一多肽可以与第二多肽的N-端、C-端或N-端和C-端融合。此外，第一多肽可以插入到第二多肽的序列内。
词语“接头”是本领域认可的，指的是连接两种化合物(例如两个多肽)的分子(包括但不限于未修饰或修饰核酸或氨基酸)或分子组(例如，2个或多个分子，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个分子)。接头可以由单个连接分子组成，或可以包含连接分子和至少一个间隔分子，间隔分子用于将连接分子和化合物分开一段特定的距离。
“间隔分子”包括与其分开的两个蛋白段无关的任何氨基酸段。例如，在由应激蛋白和生物素蛋白组成的融合蛋白中，间隔分子将由与含融合蛋白的蛋白无关的氨基酸延伸组成。本发明的“间隔分子”包括中性氨基酸，如甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸，不包括酸性或碱性氨基酸，分别如天冬氨酸或精氨酸。
“基因构建体”指的是包含多肽“编码序列”或可转录形成生物活性RNA(例如，反义、诱骗、核酶等)的核酸(如载体)、质粒、病毒基因组等，可以转染到细胞内，例如，某些实施例中，哺乳细胞内，并可以导致编码序列在所述构建体转染的细胞内表达。所述基因构建体可以包含一个或多个可与编码序列，以及基因内序列、聚腺苷酸化位点、复制源、标记基因等操作连接的调控元件。
“宿主细胞”指的是可采用规定转移载体转导的细胞。所述细胞任选选自试管内细胞(如来自细胞培养的细胞)、体外细胞(如来自生物体的细胞)及体内细胞(如生物体内的细胞)。所述词语理解为不仅指特定受试者的细胞，而且指的是所述细胞的子代或可能子代。由于突变或环境影响，子代可能出现某些变化，实际上，这样的子代可能与亲代细胞并不相同，但仍然包含在本文使用的该词语的范围之内。
词语“包括”指的是“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
词语“免疫原性”指的是物质引发免疫反应的能力。“免疫原性组合物”或“免疫原性物质”是引发免疫反应的组合物或物质。“免疫反应”指的是受试者对抗原的反应，可能包括以下至少一种反应：产生抗体、发炎、发展免疫性、发展对抗原的超敏反应、抗原特异性淋巴细胞对抗原反应、耐受性及植入或移植排斥。
本文使用的“抗原免疫反应”指的是，例如，针对抗原出现的体液或细胞反应。
如果患者对抗原出现体液免疫反应，测定抗-抗原抗体的滴度。典型的免疫分析由以下步骤组成：采用抗原涂布免疫分析平板的各孔(例如，加入重组抗原或使用捕捉抗-抗原抗体)，然后向孔内加入患者血清的系列稀释物。将血清洗掉后，采用结合抗人免疫球蛋白检测人免疫球蛋白。
细胞免疫反应采用细胞杀伤分析测定。分离患者外周血淋巴细胞(PBL)，按不同比例将其加入到表达抗原的CHO细胞系中(采用非转染CHO细胞或以非-抗原构建体转染的CHO细胞作为阴性对照)。抗原表达CHO细胞采用抗原构建体转染，并经选择用于表达其表面抗原。采用放射性或释放出特定染料测定杀伤情况。
本文使用的“治疗疾病”指的是减少患者血浆中可溶抗原的数量。治疗疾病还指的是临床方法(例如，采用回波描记术或本领域已知的其它方法)测定的肿瘤负荷减少。治疗疾病还指的是缩小肿瘤尺寸/减轻质量和/或防止转移。
本文描述的增强间皮素抗体将减少(消除)患有，例如，卵巢癌、脑膜瘤、神经胶质瘤和柔脑膜转移瘤、间皮瘤、子宫腺癌、恶性间皮瘤、胰腺癌和肺腺癌患者的肿瘤负荷。
词语“分离多肽”或“分离蛋白质”指的是可由重组DNA或RNA制备，或合成来源的，或它们的组合制备的多肽，或可以是天然多肽，其(1)与其通常天然结合的蛋白质不发生结合，(2)与其通常出现在其内的细胞分离，(3)基本上不含来自同一细胞源的其它蛋白质，(4)由不同物种的细胞表达，或(5)不会天然出现。
“分离”一种多肽或蛋白质指的是从组织、细胞或不感兴趣的多肽或蛋白质的任何多肽混合物中清除多肽的过程。分离多肽或蛋白质通常未被其它多肽或蛋白质污染。分离多肽或蛋白质中可以存在少量不干扰目标多肽或蛋白质使用的其它多肽或蛋白质。分离多肽或蛋白质的纯度通常至少是30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一个实施例中，本发明所述分离多肽或蛋白质的纯度至少是98％或99％。
词语“分离核酸”指的是合成或天然来源或它们某种组合的基因组、cDNA多核苷酸，其(1)不与其内自然发现“分离核酸”的细胞结合，或(2)与自然不连接的多核苷酸操作连接。
“分离”一种核酸指的是从组织、细胞或非感兴趣核酸的任何核酸混合物中清除核酸的过程。分离核酸通常未被其它核酸污染。分离核酸可以存在少量不干扰感兴趣核酸使用的其它核酸。分离核酸的纯度通常至少是30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一个实施例中，本发明所述分离核酸的纯度至少是98％或99％。
本领域技术人员应该理解的是，由于遗传密码的简并性，编码本发明多肽(及其片段)的多核苷酸会发生变化。遗传密码的简并性，允许不同的核酸序列编码同一多肽，这种简并性是在文献中公知的(参见，例如表1)。
正如本领域熟知的那样，可以采用多种不同程序来鉴定多核苷酸或多肽与已知序列是否具有序列一致性或类似性。序列一致性或类似性可以采用本领域熟知的标准方法测定，包括但不限于Smith&Waterman局部序列一致性算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))、Needleman&Wunsch序列一致性比对算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))、Pearson&Lipman相似性检索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988))，这些算法的计算机实施(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，该软件包由威斯康星州麦迪逊市科学大道575号的Genetics Computer Group提供)，及Devereux等,Nucl.Acid Res.12:387(1984)描述的最佳拟合序列程序，最好是采用默认设置，或检查确定。
有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP利用渐进、双序列比对，根据一组相关序列建立了多序列比对法。它还绘制了表明聚类关系的树图，用于建立比对。PILEUP采用Feng&Doolittle(J.Mol.Evol.35:351(1987))渐进比对法的简化方法；这种方法与Higgins&Sharp,CABIOS 5:151(1989)描述的方法类似。
另一个有用算法的实例是Altschul等,J.Mol.Biol.215:403(1990)和Karlin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873(1993)描述的BLAST算法。特别有用的BLAST程序是来自Altschul等,Meth.Enzymol.,266:460(1996)；blast.wustl/edu/blast/README.html的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2采用几个搜索参数，这些参数优选设定为默认值。这些参数是动态值，是由程序本身建立的，取决于具体序列的组成和正在搜索的目标序列的具体数据库的组成；但是，可以调节这些值以提高灵敏性。
另一种有用的算法是Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389(1997)报告的间隔BLAST。
氨基酸序列一致性百分数通过匹配相同残基的数量除以比对区“长序列”残基的总数量确定。“长”序列是比对区中实际残基数最多的序列(为了最大程度地提高比对分数而通过WU-Blast-2引入的间隙被忽略)。
按照类似方式，相对本文公开的多肽编码序列的核酸序列一致性百分数定义为候选序列中与本文具体公开的多核苷酸中核苷酸相同的核苷酸残基百分数。
比对可能包含在比对序列中引入间隙。此外，对于氨基酸比本文具体公开的多核苷酸多或少的序列来说，应该了解的是，在一个实施例中，序列一致性百分数将根据相同氨基酸的数量相对氨基酸总数量确定。因此，例如，在一个实施例中，比本文特别公开序列短的序列的序列一致性将采用短序列中的氨基酸数确定。在一致性百分数计算中，相对权重并未分配给各种不同的序列变化表示，如插入、删除、替换等。
在一个实施例中，仅一致性评为正分(+1)，包含间隙的所有序列变化形式都分配数值“0”，这样序列相似性计算不需要下述加权比例或参数。序列一致性百分数可以，例如，将匹配相同残基数除以比对区“短”序列残基总数，然后乘以100计算得出。“长”序列是比对区实际残基数最多的序列。
当本文提到“多肽”时，熟悉本领域的技术人员将理解的是，除非上下文清楚表明，否则可以使用蛋白质代替。“蛋白质”可能还指一种或多种多肽组合。
词语“核酸”指的是聚合物形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组合)，或任一种类型核苷酸的修饰形式。该词语还应理解为包括核苷酸类似物制备的RNA或DNA的相当物、类似物，并且正如适用于本文描述的实施例，还包括单链(如正义或反义)和双链多核苷酸。
除非上下文清楚表明，当提到基因表达产物，例如，编码序列编码的氨基酸序列时，本文“蛋白质”、“多肽”和“肽”互换使用。“蛋白质”还可以指一种或多种蛋白质(如抗体)组合。“蛋白质”还可能指蛋白质片段。蛋白质可能是后翻译修饰蛋白质，如糖基化蛋白质。
本发明所述“蛋白质”包括其中一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个)氨基酸与相应野生型蛋白质的氨基酸不同的蛋白质。本发明“所述”蛋白质包括与相应野生型蛋白质相比，其中一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个)氨基酸被删除的蛋白质。本发明所述“蛋白质”包括与相应野生型蛋白质相比，其中增加和/或替换一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸的蛋白质。
应该理解的是，本文特别公开的多肽通常容许氨基酸序列替换(例如，保守替换)，并且大体上保留生物活性。为了鉴定不同于本文特别公开的本发明的多肽，氨基酸替换可以基于本领域已知的任何特点，包括氨基酸侧链取代基的相对类似性或差异性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。
除本文公开以外的氨基酸替换可以按照下述密码子表，改变DNA序列(或RNA序列)的密码子实现：
表1
为了鉴定除本文特别公开以外的编码多肽的氨基酸序列，可以考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质交互生物功能中的重要性是本领域通常所了解的(参见，Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.157:105(1982)；通过引用，该文献全文纳入本申请中)。人们认为，氨基酸的相对亲水性特征对所得蛋白质的二级结构有影响，二级结构反过来定义蛋白质与其它分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)之间的相互作用。
每个氨基酸根据其疏水性和电荷特点，分配了一个亲水指数(Kyte和Doolittle,id.)，这些指数如下：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
因此，当修饰本文特别公开的多肽时，可以考虑氨基酸(或氨基酸序列)的亲水指数。
本领域还理解的是，氨基酸替换可以根据亲水性实施。美国专利第4,554,101号(通过引用，该专利全文纳入本申请中)称，蛋白质的最大局部平均亲水性由其附近氨基酸的亲水性决定，并与蛋白质的生物性质有关。
正如美国专利第4,554,101号详细说明的那样，氨基酸残基分配的亲水性数值如下：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(±3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±I)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
因此，当鉴定除本文特别公开以外的其它多肽时，可以考虑氨基酸(或氨基酸序列)的亲水性指数。
本文使用的词语“同系物”用于指通过对天然多肽进行微小修饰而使其与天然多肽不同，但明显保留了天然多肽生物活性的分子。微小修饰包括但不限于改变一个或几个氨基酸侧链、改变一个或几个氨基酸(包括删除、插入和/或替换)、改变一个或几个原子的立体化学，及轻微衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、异戊烯化、棕榈酰化、酰胺化和加入糖基磷脂酰肌醇。词语“大体上保留”指的是多肽的片段、同系物或其它变体保留天然多肽至少大约50％活性(例如，与钙通道结合或抑制钙通道)，例如，保留大约70％、80％、90％或更多活性。其它生物活性(取决于多肽)可能包括pH敏感性、酶活性、受体结合、配体结合、生长因子诱导、细胞信号转导事件等。
在一些实施例中，本发明的多肽包含至少一个修饰末端，例如，用于防止多肽降解。在一些实施例中，N-端被乙酰化和/或C-端被酰胺化。在一些实施例中，多肽在氨基-和/或羧基-端包含一个或两个D-丙氨酸。
在一些实施例中，本发明的多肽包含至少一个非天然氨基酸(例如，1、2、3或更多个)或至少一个末端修饰(例如，1或2个)。在一些实施例中，多肽包含至少一个非天然氨基酸和至少一个末端修饰。
“基因表达产物”指的是整个基因或部分基因转录产生的分子。基因产物包括基因转录的RNA分子，以及从所述转录翻译的蛋白质。蛋白质可以是天然分离蛋白质或可以是重组或化学合成产物。词语“蛋白质片段”指的是与参考蛋白质本身相比，其中氨基酸残基被删除，但剩余氨基酸序列通常与参考蛋白质相同或大体上相同(例如，100％、99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％相同)的蛋白质。所述删除可以发生在参考蛋白质的氨基-末端或羧基-末端，或者发生在这两个末端。删除还可以内部发生。
片段长度通常是至少大约5、6、8或10个氨基酸，至少大约14个氨基酸，至少大约20、30、40或50个氨基酸，至少大约75个氨基酸，或至少大约100、150、200、300、500或更多个氨基酸。片段可以采用蛋白酶使更大蛋白质断裂得到，或采用重组方法得到，例如，仅表达部分蛋白质-编码核苷酸序列(独立或与另一种蛋白质-编码核酸序列融合)。在不同实施例中，片段可以包含酶活性和/或参考蛋白质与，例如，细胞受体的相互作用位点。在另一个实施例中，片段可以具有免疫原性。蛋白质可以采用各种公知的方法在特定位点引入突变，这些突变不会产生不良影响，但能够增强蛋白质在本文方法中的使用。片段可以保留参考蛋白质的一种或多种生物活性。
本文使用的“功能”肽或“功能片段”大体上保留通常与所述多肽有关的至少一种生物活性(例如，与钙通道结合或抑制钙通道)。在具体实施例中，“功能”肽或“功能片段”大体上保留未修饰肽的全部活性。“大体上保留”生物活性指的是所述肽保留天然肽至少大约50％、60％、75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多生物活性(而且甚至可以比天然肽具有更高活性)。“非功能”肽是几乎没有或基本上没有可检出的与所述肽通常有关的生物活性(例如，至多仅具有少量活性，例如，小于大约10％或甚至5％)。生物活性，例如，蛋白质结合和钙通道抑制活性可以采用本领域公知的方法和本文描述的方法测定。
“患者”或“受试者”或“宿主”指的是人类或非人类动物。
“受试者”包括鸟类和哺乳动物，优选是哺乳动物。本文使用的词语“鸟类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡。本文使用的词语“哺乳动物”包括但不限于人类、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬、兔等。人类受试者包括婴儿、胎儿、少年和成人。
本文使用的词语“药学上可接受的”指的是那些在合理的医学判断范围之内，适合与人类和动物组织接触使用而不会带来过大毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症且具有合理的益处/风险比的化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文使用的“药学上可接受的载体”指的是涉及将主题化合物从一个器官或身体部位携带或输送到另一个器官或身体部位的药学上可接受的材料、组合物或溶媒，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料。每种载体在与制剂其它成分相容方面及不会伤害病人方面必须是“可接受的”。可作为药学上可接受的载体的一些材料实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无致热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酐；及(22)药物制剂中使用的其它无毒相容物质。
“药学上可接受的盐”指的是相对无毒的化合物的无机和有机酸加成盐。
本文使用的“应激蛋白”，亦称为“热休克蛋白”或“Hsp”，是一种由应激基因编码的蛋白质，因此，通常在接触或暴露于生物体应激物时大量产生。词语“应激蛋白”包括应激蛋白的所述部分和多肽。“应激基因”，亦称为“热休克基因”，指的是(含所述基因)生物体由于接触或暴露于应激物，例如，热休克、氧不足、葡萄糖缺乏、重金属盐、能量代谢和电子输送抑制剂，及蛋白质变性剂，或某些苯醌安沙霉素而被活化或出现可检出上调的基因。Nover,L.,Heat Shock Response,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.(1991)。“应激基因”还包括人们已知的应激基因家族的同源基因，如Hsp70和Hsp90应激基因家族中的某些基因，即使所述同源基因本身并不被应激物诱导。除非上下文另外说明，本说明书中使用的词语“应激基因”和“应激蛋白”包括对方。
词语“疫苗”指的是引发免疫反应且在受试者体内引发保护性免疫的物质。
“载体”指的是能够输送与其连接的另一种核酸的核酸分子。优选的载体类型是附加体，即能够染色体外复制的核酸。优选的载体是那些能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的载体。能够引导表达其操作连接基因的载体在本文被称为“表达载体”。通常，重组DNA技术中使用的表达载体通常是“质粒”形式，通常指的是环状双链DNA环，这些环在其载体形式时并不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，正如熟悉本领域的技术人员将理解的那样，本发明包括具有相当功能并在后来被本领域所知悉的表达载体的其它形式，例如，病毒载体。
本文使用的“特异性结合”指的是通过共价键或氢键或静电吸引结合。
本文使用的词语“免疫反应”或“可检测反应”包括受试者接触本文描述的本发明融合蛋白时出现的可以检测的反应水平，但并非受试者未接触本发明融合蛋白时的反应水平。检测的“反应”包括但不限于免疫反应增加或免疫原性增加。
“可以检测的反应”指的是反应至少比未接触本发明融合蛋白的受试者的反应高0.01％、0.5％、1％或更高。“可以检测的反应”还指的是反应至少是未接触本发明融合蛋白的受试者的反应的0.5、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000-倍或更多倍。
本文使用的“免疫原性”指的是，例如，本发明融合蛋白诱导体液和/或细胞介导免疫反应的能力。
本文使用的“免疫反应”指的是生物体免疫系统对物质，包括但不限于外源蛋白质或自身蛋白质的反应。共有三种普通类型的“免疫反应”，包括但不限于粘膜、体液和细胞“免疫反应”。“粘膜免疫反应”是润湿呼吸道、胃肠道和生殖泌尿道所有粘膜表面的分泌物及所有分泌腺的分泌物中分泌型IgA(sIgA)抗体产生引发的(McGhee,J.R.等,1983,AnnalsNY Acad.Sci.409)。这些sIgA抗体防止粘膜表面病原体定殖(Williams,R.C.等,Science177,697(1972)；McNabb,P.C.等,Ann.Rev.Microbiol.35,477(1981))，从而作为第一道防线，防止通过粘膜表面定殖或侵入。sIgA可以通过分泌腺或组织局部免疫刺激产生或通过将抗原向肠-相关淋巴组织(GALT或派尔集合淋巴结)或支气管-相关淋巴组织递呈刺激产生(BALT；Cebra,J.J.等,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.41,210(1976)；Bienenstock,J.M.,Adv.Exp.Med.Biol.107,53(1978)；Weisz-Carrington,P.等,J.Immunol.123,1705(1979)；McCaughan,G.等,Internal Rev.Physiol 28,131(1983))。膜微皱褶细胞，也称为M细胞，覆盖GALT和BALT的表面，可能与其它分泌型粘膜表面有关。M细胞作用于粘膜表面附近腔空间样品抗原，将所述抗原输送到抗原-递呈细胞(树突细胞和巨噬细胞)，这些细胞反过来将所述抗原递呈到T淋巴细胞(在T-细胞依赖性抗原的情况下)，后者加工抗原，递呈给定向B细胞。然后，B细胞被刺激增殖、迁移和最终转化到抗体-分泌浆细胞中，产生对抗递呈抗原的IgA。当抗原被覆盖在GALT和BALT上的M细胞吸收时，实现广义粘膜免疫性，sIgA对抗体内所有分泌型组织产生的抗原(Cebra等,supra；Bienenstock等,supra；Weinz-Carrington等,supra；McCaughan等,supra)。因此，口服免疫是刺激广义粘膜免疫反应的重要路径，此外，在口腔和胃肠道内引发分泌型免疫反应局部刺激。
“免疫反应”可以采用本领域已知的方法测定。例如，可以从怀疑存在“免疫反应”的生物体获取血清、血液或其它分泌物，采用酶联免疫吸附法(ELISA；美国专利5,951,988；Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology 3.sup.rd Ed.John Wiley&Sons,Inc.1995)测定上述免疫球蛋白的存在情况。可以采用本领域已知的统计检验，包含但不限于方差分析(ANOVA)、学生T-检验等确定所测免疫球蛋白水平的差异，其中P值至少<0.1、<0.05、<0.01、<0.005、<0.001，和甚至<0.0001。
“免疫反应”可以采用其它方法测定，如免疫组织化学法，该方法采用对“免疫反应”期间升高的免疫球蛋白部分具有特异性的标记抗体。免疫组织化学得到的微观数据可以这样定量：扫描免疫组织化学染色组织样品和采用本领域技术人员已知的计算机软件程序，包括但不限于NIH Image(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)对染色水平进行定量。根据本发明，如果采用融合蛋白治疗的受试者体内免疫组织化学染色的数量与未采用融合蛋白治疗的受试者体内免疫组织化学染色的数量在统计学上存在不同，可以称本发明的融合蛋白刺激“免疫反应”。可以采用本领域已知的统计检验，包含但不限于方差分析(ANOVA)、学生T-检验等确定所测免疫组织化学染色水平的差异，，其中P值至少<0.1、<0.05、<0.01、<0.005、<0.001，和甚至<0.0001。
1.工程融合蛋白
本发明提供融合蛋白，所述融合蛋白包含与修饰结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)在读框内融合的抗原结合域。
抗原结合域可以是工程抗体或拟抗体，可以包含，例如，至少一个scFv，至少一个Fab片段，至少一个Fv片段等。可以是单价或多价。在其中工程抗体是多价的实施例中，工程抗体可以是双价、三价、四价等。多价抗体可以是单特异性或多特异性，例如，双特异性、三特异性、四特异性等。多价抗体可以是任何形式，如双链抗体、三链抗体、四链抗体等。在一些实施例中，工程抗体是串联双链抗体(Tandab)。修饰HSP70可以是，例如，天然序列的片段、修饰的天然氨基酸序列(例如，删除、增加和/或替换)或它们的任何组合。结核分枝杆菌HSP70的全长多肽序列如SEQ ID NO:1所示。
下面提供有关可以纳入到主题融合多肽中的抗原结合域和修饰HSP70序列的其它详细情况。
A.抗原结合域
抗原结合域是与抗原特异性结合并且充当融合蛋白一部分的任何多肽序列。抗原结合域可以是天然序列，例如，抗体或其片段，纤维胶凝蛋白、胶原凝素等。抗原结合域可以是合成序列，例如，工程抗体、类抗体肽、拟抗体、适配子等。
抗原结合域可以与目标抗原特异性结合。抗原结合域可以，例如，与本发明方法治疗或预防癌症的肿瘤细胞抗原特异性结合。所述抗原包括但不限于，例如，人肉瘤细胞或癌细胞抗原，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、间胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤；白血病，例如，急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病(成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)；慢性白血病(慢性粒细胞(慢粒)白血病和慢性淋巴细胞白血病；及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症或重链疾病细胞。
抗原结合域可以与其它抗原特异性结合，包括疾病相关和/或病毒抗原。抗原结合域可以特异性结合表达其表面抗原的疾病和/或病毒感染细胞。
本发明方法可以治疗或预防的传染病是由传染源引发的。可以被本发明抗原结合域靶向的所述传染源或从传染源衍生的抗原，包括但不限于病毒、细菌、霉菌和原生动物。本发明并不限于治疗或预防细胞内病原体引发的传染病，而是还包括细胞外病原体引发的传染病。许多医学相关微生物在文献中进行了广泛深入的描述，例如，参见C.G.A Thomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall,Great Britain 1983，通过引用，该文献的全部内容纳入本申请中。
人类和非人类脊椎动物的传染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒表达抗原。病毒抗原的实例包括但不限于以下病毒的抗原：逆转录病毒科(例如，人类免疫缺陷病毒，如HIV-1(亦称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；及其它分离株，如HIV-LP；小RNA病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如，引发肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉热病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠病毒科(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；肝脱氧核糖核酸病毒科(乙肝病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒；痘病毒科(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；及未归类的病毒(例如，海绵状脑病病毒、丁型肝炎病毒(被认为是乙肝病毒的缺陷性卫星病毒)、非甲肝、非乙肝病毒(1类＝内部传输；2类＝非肠道传输(即丙肝)；诺沃克病毒和相关病毒，及星状病毒。
能够靶向的逆转录病毒抗原包括简单的逆转录病毒抗原和复杂的逆转录病毒抗原。简单的逆转录病毒包括B-型逆转录病毒、C-型逆转录病毒和D-型逆转录病毒亚群。B-型逆转录病毒的实例有小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C-型逆转录病毒包括亚群C-型A组(包括劳氏肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)和禽成髓细胞瘤病毒(AMV))及C-型B组(包括鼠白血病病毒(MLV)、猫白血病毒(FeLV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、脾坏死病毒(SNV)、网状内皮增生症病毒(RV)和猿猴肉瘤病毒(SSV))。D-型逆转录病毒包括梅森-菲舍猴病毒(MPMV)和猴逆转录病毒(SRV-1)。复杂逆转录病毒包括慢病毒、T-细胞白血病病毒和泡沫病毒亚群。慢病毒包括HIV-1，还包括HIV-2、SIV、绵羊髓鞘脱落病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)。T-细胞白血病病毒包括HTLV-1、HTLV-II、猴T-细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猴泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
抗原结合域可以结合的RNA病毒抗原的实例包括下述病毒的抗原，但不限于这些：呼肠病毒科成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽类逆转录病毒的几种血清型)、环状病毒属(蓝舌病病毒、Eugenangee病毒、克麦罗沃病毒、非洲马瘟病毒和科罗拉多蜱传热病毒)、轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、鼠轮状病毒、猴轮状病毒、牛或绵羊轮状病毒、禽类轮状病毒)；小RNA病毒科(picornaviridae)，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A和B、埃可病毒(ECHO)、甲肝病毒、猴肠道病毒、鼠脑脊髓炎(ME)病毒、鼠脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒、猪肠道病毒)、心病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)、门戈病毒)、鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113种亚型；其它鼻病毒)、口蹄疫病毒属(口蹄疫(FMDV)；杯状病毒科，包括猪水疱疹病毒、圣米格尔海狮病毒、猫细小核糖核酸病毒和诺瓦克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东部马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、基孔肯亚病毒、阿尼昂尼昂病毒(O'Nyong-Nyong virus)、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西部马脑炎病毒)、黄病毒属(蚊媒黄热病病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累溪谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、昆津病毒、中欧蜱传病毒、远东蜱传病毒、科萨努尔森林病毒、跳跃病病毒、玻瓦桑病毒、鄂木斯克出血热病毒)、风疹病毒属(风疹病毒)、瘟病毒属(粘膜病病毒、猪瘟病毒、边界病病毒)；布尼亚病毒科，包括布尼亚病毒属(布尼奥罗病毒和相关病毒、加利福尼亚脑炎病毒群)、白蛉病毒属(西西里白蛉热病毒、裂谷热病毒)、内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病病毒)，和吴孔病毒属(吴孔尼米病毒和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，许多人类亚型)；猪流感病毒及禽流感病毒和马流感病毒；乙型流感病毒(许多人类亚型)，及丙型流感病毒(可能是单独的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(副流感病毒1型、仙台病毒、血球吸附病毒、副流感病毒2型和5型、新城疫病毒、腮腺炎病毒)、麻疹病毒属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎、犬瘟热病毒、牛瘟病毒)、肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)、牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒、辛德毕斯病毒、基孔肯亚病毒、阿尼昂尼昂病毒(O'Nyong-Nyong virus)、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西部马脑炎病毒)、黄病毒属(蚊媒黄热病病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累溪谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、昆津病毒、中欧蜱传病毒、远东蜱传病毒、科萨努尔森林病毒、跳跃病病毒、玻瓦桑病毒、鄂木斯克出血热病毒)、风疹病毒属(风疹病毒)、瘟病毒属(粘膜病病毒、猪瘟病毒、边界病病毒)；布尼亚病毒科，包括布尼亚病毒属(布尼奥罗病毒和相关病毒、加利福尼亚脑炎病毒群)、白蛉病毒属(西西里白蛉热病毒、裂谷热病毒)、内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病病毒)，和吴孔病毒属(吴孔尼米病毒和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，许多人类亚型)；猪流感病毒及禽流感病毒和马流感病毒；乙型流感病毒(许多人类亚型)，及丙型流感病毒(可能是单独的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(副流感病毒1型、仙台病毒、血球吸附病毒、副流感病毒2型和5型、新城疫病毒、腮腺炎病毒)、麻疹病毒属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎、犬瘟热病毒、牛瘟病毒)、肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)、牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡病毒属(VSV)(、金迪普拉病毒、佛朗德-哈特公园水泡性病毒)，狂犬病毒属(狂犬病病毒)，鱼棒状病毒，和两种可能的棒状病毒(马尔堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)、塔卡里伯病毒复合物，及拉沙病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒、人肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒(猫冠状病毒)。
示例性DNA病毒抗原包括但不限于下述病毒的抗原：痘病毒科，包括正痘病毒属(重型天花、轻型天花、猴痘牛痘、牛痘、水牛痘、兔痘、鼠痘)、野兔痘病毒属(粘液瘤、纤维瘤)、禽痘病毒属(禽痘、其它禽类痘病毒)、羊痘病毒属(绵羊痘、山羊痘)、猪痘病毒属(猪痘)、副痘病毒属(传染性脓疱皮炎病毒、伪牛痘、牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒、蛙病毒2和3、鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(单纯性疱疹1型和2型)、水痘-带状疱疹、马流产病毒、马疱疹病毒2和3型、伪狂犬病病毒、牛传染性角膜结膜炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猫鼻气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒)、β-疱疹病毒(人巨细胞病毒及猪、猴和啮齿动物巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、马立克氏病病毒、松鼠猴疱疹病毒、蛛猴疱疹病毒、棉尾兔疱疹病毒、豚鼠疱疹病毒、卢克肿瘤病毒)；腺病毒科，包括哺乳动物腺病毒属(人A、B、C、D、E亚群和未分类群；猴腺病毒(至少23种血清型)、犬传染性肝炎病毒及牛、猪、绵羊、蛙和许多其它物种腺病毒)，禽腺病毒属(禽腺病毒)；和不可培养腺病毒；乳多泡病毒科，包括乳头瘤病毒属(人乳头瘤病毒、牛乳头瘤病毒、兔乳头瘤病毒及其它物种各种病原性乳头瘤病毒)、多瘤病毒属(多瘤病毒、猴空泡病毒(SV-40)、兔空泡病毒(RKV)、K病毒、BK病毒、JC病毒及其它灵长类动物多瘤病毒，如嗜淋巴细胞乳头瘤病毒)；细小病毒科，包括腺相关病毒属、细小病毒属(猫白细胞减少症病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、阿留申水貂病病毒等)。最后，DNA病毒抗原可能包括未纳入上述病毒科的病毒抗原，如库鲁病病毒和克-雅二氏病病毒及慢性传染性神经病毒。
B.工程抗体
天然抗体本身是二聚体，因此是二价。如果将产生不同抗体的两个杂交瘤细胞人工融合，混合杂交瘤产生的一些抗体由具有不同特异性的两个单体组成。这种双特异性抗体也可以通过化学结合两个抗体产生。天然抗体及其双特异性衍生物相对较大，制备费用高昂。小鼠抗体的恒定区也是人抗鼠抗体(HAMA)反应的主要原因，这一点妨碍它们作为治疗剂广泛使用。由于它们的Fc-受体结合，它们还带来了不期望的影响。由于这些原因，分子免疫学家重点关注在微生物中制备小很多的Fab-和Fv-片段。这些更小的片段不仅更容易制备，而且免疫原性更低，不具有效应子功能，而且，由于它们的尺寸相对较小，它们能够更好地渗透组织和肿瘤。在Fab-片段的情况下，可变区附近的恒定区在稳定重链和轻链二聚体方面起着十分重要的作用。因此，虽然全长或接近全长工程抗体可能包括主题融合多肽，但是，融合多肽应用中优先使用更小的单域工程抗体(可能具有多价和多特异性)。
Fv-片段稳定性差很多，因此，可以在重链和轻链可变区之间引入连接肽来提高稳定性。这种构建体被称为单链Fv(scFv)-片段。有时候在这两个区之间引入二硫键进一步提高稳定性。到目前为止，通过融合到额外聚合区(例如，形成四聚体的链霉亲和素单体)，及两性α-螺旋，已经制备了四价scFv-抗体。但是，这些额外区会提高四价分子的免疫原性。
可以仅利用抗体可变区构建二价双特异性抗体。一种相对高效且相对简单的方法是缩短VH和VL区之间的接头序列，从而它们无法折叠和彼此结合。将接头长度缩短到3-12个残基，防止scFv分子形成单体配置，有利于分子间VH-VL配对，形成60kDa非共价scFv二聚体“双链抗体”(Holliger等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,6444-6448)。双链抗体格式还可用于产生重组双特异性抗体，这种重组双特异性抗体是通过两种单链融合产物非共价缔合得到的，所述两种单链融合产物由一种抗体的VH区通过短接头与另一种抗体的VL区连接。将接头长度进一步缩短为少于三个残基，形成三聚体(“三链抗体”，大约90kDa)或四聚体(“四链抗体”，大约120kDa)(Le Gall等,1999,FEBS Letters 453,164-168)。关于工程抗体，特别是单区片段的综述，参见Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology,23:1126-1136。所有这些工程抗体都可以在本文提供的融合多肽中使用。
可能包含所述主题融合多肽的其它多价工程抗体在Lu,等,2003,J.Immunol.Meth.279:219-232(双-双链抗体或四价双特异性抗体)；美国公开申请20050079170(多聚体Fv分子或“柔性抗体(flexibodies)”)，及WO99/57150和Kipriyanov,等,1999,J.Mol.Biol.293:41-56(串联双链抗体，即“Tandabs”)中进行了描述。
上述多价工程抗体中的任一种抗体可以由熟悉本领域的技术人员采用常规重组DNA技术研制，例如，如PCT国际申请No.PCT/US86/02269；欧洲专利申请No.184,187；欧洲专利申请No.171,496；欧洲专利申请No.173,494；PCT国际公开No.WO 86/01533；美国专利No.4,816,567；欧洲专利申请No.125,023；Better等(1988)Science 240:1041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等(1987)Cancer Res.47:999-1005；Wood等(1985)Nature 314:446-449；Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4:214；美国专利No.5,225,539；Jones等(1986)Nature 321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science239:1534；Beidler等(1988)J.Immunol.141:4053-4060；及Winter和Milstein,Nature,349,pp.293-99(1991))中所述。非人抗体优选通过将非人抗原结合区与人恒定区连接进行“人源化”(例如，Cabilly等,美国专利4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,pp.6851-55(1984))。
工程抗体的抗原识别位点或整个可变区可以源自针对间皮素的一个或多个亲代抗体。亲代抗体可以包含天然抗体或抗体片段、天然抗体改造得到的抗体或抗体片段、采用已知对目标抗原具有特异性的抗体或抗体片段序列重新构建的抗体。可以由亲代抗体衍生的序列包含重链和/或轻链可变区和/或CDR、框架区或它们的其它部分。
多价多特异性抗体可以包含含两个或多个可变区的重链和/或含一个或多个可变区的轻链，其中至少两个可变区识别同一抗原上的不同表位。
可以采用人们已知的各种检验方法，根据活性筛选融合多肽中包含的候选工程抗体，或融合多肽本身。例如，测定结合特异性的筛选方法是公知的，并且是本领域经常实践的。对于这些方法的全面讨论，参见Harlow等,(Eds.),ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor,N.Y.,1988,Chapter 6。
C.应激蛋白
本发明的融合多肽中可以使用任何合适的应激蛋白(热休克蛋白(hsp))。应激蛋白优选是HSP70，例如，来源于结核分枝杆菌。
“热休克蛋白”由“热休克基因”或应激基因编码，指的是(含所述基因)生物体由于接触或暴露于应激物，例如，热休克、氧不足、葡萄糖缺乏、重金属盐、能量代谢和电子输送抑制剂，及蛋白质变性剂，或某些苯醌安沙霉素而被活化或出现可检出上调的基因蛋白质产物。Nover,L.,Heat Shock Response,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.(1991)。“热休克蛋白”还包含已知的应激基因家族基因编码的同源蛋白质，即使所述同源基因本身并不被应激物诱导。“热休克蛋白融合”指的是热休克蛋白或其一部分与抗原结合区连接。
细胞通过增加通常称为应激的一组基因或热休克基因的表达，对应激物(通常是热休克处理)做出响应。热休克处理包括将细胞或生物体暴露于比细胞适应温度高1摄氏度至几摄氏度的温度。在所述基因诱导协同作用下，应激细胞内相应应激蛋白的含量增加。
例如，热休克蛋白可以是C-端或N-端与抗原特异性抗原结合区连接，产生热休克蛋白融合。包含热休克蛋白和抗原结合区的热休克蛋白融合能够针对抗原而刺激体液和/或细胞免疫反应，包括CD8细胞毒性T细胞(CTL)反应。
例如，本发明可以使用的热休克蛋白包括BiP(亦称为grp78)、Hsp10、Hsp20-30、Hsp60、hsp70、hsc70、gp96(grp94)、hsp60、hsp40、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90及它们家族的成员，但不限于这些。如下面所示，特别优选的热休克蛋白有BiP、gp96和hsp70。具体的热休克蛋白组包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp20-30，进一步优选的是Hsp70和Hsp60。最优选的是hsp70家族成员。
在细菌中，主要的应激蛋白是分子量分别是大约70和60kDa的蛋白质，通常分别称为Hsp70和Hsp60。这些和其它特异性应激蛋白及编码它们的基因在下面进一步讨论。在细菌中，根据十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳法和考马斯蓝染色得到的染色模式，Hsp70和Hsp60通常占细胞蛋白质的大约1-3％，但在应激条件下累积到高达25％。应激蛋白似乎参与重要的细胞过程，例如，蛋白质合成、细胞内运输及蛋白复合物组装和拆卸。应激期间合成的应激蛋白数量增加，似乎主要是最大限度地减少诱导蛋白质展开。实际上，将细胞预先暴露于诱导应激蛋白合成的温和应激条件下，可以防止细胞在后面更极端应激条件下出现不利影响。
主要的应激蛋白在目前考察的每种生物体和组织类型中似乎都有表达。此外，应激蛋白似乎是目前鉴定的最保守的蛋白质组。例如，当比较不同生物体的应激蛋白时，Hsp90和Hsp70氨基酸水平具有50％或以上的一致性，并且在非-相同位置拥有许多类似性。值得指出的是，物种中特定应激蛋白家族不同成员之间存在类似的或更高的同源性水平。
应激蛋白，特别是Hsp70、Hsp60、Hsp20-30和Hsp 10，是宿主免疫系统对结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌感染做出免疫反应时识别的主要决定因素。Young,R.A.和Elliott.T.J.,Stress Proteins,Infection,And Immune Surveillance,Cell 50:5-8(1989)。此外，某些大鼠关节炎T细胞识别Hsp60表位。Van Eden,W.等,Nature 331:171-173(1988)。但是，没有分枝杆菌感染史或自身免疫性疾病史的个人，包括健康个人，也携带识别细菌和人Hsp60表位的T细胞；健康个人中以表达γ-δT细胞受体为特征的相当一部分T细胞识别自身的和外来的应激蛋白。O'Brien,R.等,Cell 57:664-674(1989)。因此，个人，甚至是健康个人，拥有识别外来和自身应激蛋白表位的T－细胞群。
这种识别应激蛋白表位的系统估计构成侵入生物体的“早期防御系统”。Murray,P.J.and Young,R.A.,J.Bacteriol 174:4193-6(1992)。这种系统可以通过细菌和病毒经常刺激得到维持。如前面所讨论的那样，健康个人拥有识别自身应激蛋白的T细胞群。因此，自身反应性T细胞的存在与正常健康相容，并不会导致自身免疫性疾病；这一点表明了个人体内应激蛋白的安全性。应激蛋白的安全性另外还通过BCG(卡介苗，牛型结核分枝杆菌菌株)成功接种和相对安全性得到了证明，BCG接种诱导针对应激蛋白的免疫反应，防止遭受结核分枝杆菌的攻击。
Hsp70实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73，来自细菌(特别是分枝杆菌(如麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌和牛型结核分枝杆菌(如卡介苗：本文称为Hsp71))的DnaK、来自大肠杆菌、酵母和其它原核生物的DnaK，及BiP和Grp78。Hsp70能够特异性结合ATP以及未折叠多肽和肽，从而参与蛋白质折叠和展开及蛋白质复合物组装和拆卸。
在特定实施例中，本发明的应激蛋白来自肠杆菌、分枝杆菌(特别是麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、母牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和牛结核分枝杆菌)、大肠杆菌、酵母、果蝇、脊椎动物、禽类、鸡、哺乳动物、大鼠、小鼠、灵长类动物或人类。
本发明可以采用热休克蛋白的天然或重组突变体，包括片段及修饰序列。例如，本发明使用突变热休克蛋白，从而促进细胞对其的分泌(例如，一个元件突变或删除，促进内质网重新捕获，如KDEL(SEQ ID NO:14)或其同系物)；所述突变体在PCT申请No.PCT/US96/13233(WO 97/06685)中进行了描述，通过引用，该申请并入此申请中。
在特定实施例中，例如，在涉及应激蛋白和工程抗体之间化学结合物的情况下，采用的应激蛋白是分离的应激蛋白，这指的是从产生应激蛋白的宿主细胞选择和分离所述应激蛋白。所述分离可以按照本文所述和采用本领域已知的常规蛋白质分离方法进行。应激蛋白可以是酸性盐或碱性盐，或其中性形式。此外，可以通过氧化或还原对单个氨基酸残基进行修饰。此外，可以对氨基酸或核酸序列开展各种替换、删除或加成，其净效果是保持或进一步增强应激蛋白提高的生物活性。由于密码简并，例如，编码同一氨基酸序列的核苷酸序列可能发生相当大的变化。融合多肽中可以使用从应激蛋白得到的部分应激蛋白或肽，只要所述部分或肽包括参与增强免疫反应的表位即可。部分应激蛋白可以采用蛋白酶断裂得到，或采用重组方法得到，例如，仅表达部分应激蛋白-编码核苷酸序列(独立或与另一种蛋白-编码核酸序列融合)。肽也可以采用这些方法，或化学合成法制备。应激蛋白可以采用人们已知的各种方法在特定位点引入突变。参见，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual.2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Drinkwaterand Klinedinst Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:3402-3406(1986)；Liao and Wise,Gene88:107-111(1990):Horwitz等,Genome 3:112-117(1989)。
本文提供的药物组合物可以具有氧化或还原修饰的单个氨基酸残基。此外，可以对氨基酸或核酸序列进行各种替换、删除或加成，其净效果是保持或进一步增强热休克蛋白提高的生物活性。由于密码简并，例如，编码同一氨基酸序列的核苷酸序列可能发生相当大的变化。
词语“热休克蛋白”包括来自热休克蛋白的热休克蛋白片段，只要所述片段包括参与增强间皮素免疫反应的表位即可。热休克蛋白片段可以采用蛋白酶得到，或采用重组方法得到，例如，仅表达部分应激蛋白-编码核苷酸序列(独立或与另一种蛋白-编码核酸序列融合)。热休克蛋白可以采用人们已知的各种方法在特定位点引入突变，从而增强其对免疫系统的影响。参见，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Drinkwater and KlinedinstProc.Natl.Acad.Sci.USA 83:3402-3406(1986)；Liao and Wise,Gene 88:107-111(1990)；Horwitz等,Genome 3:112-117(1989)。
在特定实施例中，本发明采用的热休克蛋白是分离的热休克蛋白，这指的是从产生应激蛋白的宿主细胞选择和分离所述应激蛋白。所述分离可以按照本文所述和采用本领域已知的常规蛋白质分离方法进行。Maniatis等,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982)；Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Deutscher,M.,Guide to Protein Purification Methods Enzymology,vol.182,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(1990)。
C.融合蛋白实施例
因此，本发明的一个方面涉及一种融合蛋白，包含与200个以下氨基酸的结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断在读框内融合的抗原结合域，其中所述HSP70片段包含最小HSP70序列。所述HSP70片段包含所述最小HSP序列、基本上由或由所述最小HSP序列组成。
最小HSP70序列指的是提供本发明所述融合蛋白所有生物功能的HSP70片段。在一些实施例中，最小HSP70序列长度是至少40个氨基酸，例如，长度是至少大约40、50、60、70、80、90、100、110或120个氨基酸。在一些实施例中，最小HSP70序列长度小于400个氨基酸，例如，长度小于大约400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140或130个氨基酸。在一些实施例中，最小HSP70序列包含结核分枝杆菌HSP70(SEQ ID NO:1)的大约氨基酸残基368(例如，加或减20、15、10或5个残基)至大约氨基酸残基495(例如，加或减20、15、10或5个残基)的片段，基本上由或由所述片段组成。在一些实施例中，所述最小HSP70区是SEQ ID NO:1的大约氨基酸残基368-495或大约368-479。
在一个实施例中，包含所述最小HSP序列的融合蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由或由该序列组成。下划线表示scFv的VH区和VL区之间的接头，斜体表示scFv和HSP70之间的接头，粗体表示CD94区。
在一些实施例中，所述最小HSP序列包含修饰CD94区，即CD94区的氨基酸序列是修饰的。本文使用的词语“CD94区”指的是拥有序列AAHNKLLGSFELTG(SEQ ID NO:15)或其它HSP70蛋白相当序列的Mbt HSP70(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基422-435。
在一些实施例中，修饰CD94区由选自下述序列的氨基酸序列组成：
在一些实施例中，所述修饰CD94区由氨基酸序列TKENNLLGRFELSG(SEQ ID NO:19)组成。在一个实施例中，包含最小HSP序列与CD94区序列TKENNLLGRFELSG(SEQ ID NO:19)的融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，基本上由或由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述修饰CD94区由氨基酸序列TKDNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:20)组成。在一个实施例中，包含最小HSP序列与CD94区序列TKDNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:20)的融合蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，基本上由或由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述最小HSP70序列可能包含一个或多个氨基酸加成、删除或替换，提高了本发明融合蛋白的效果。在一个实施例中，所述最小HSP70序列包含降低HSP70肽结合活性的V410F替换(根据SEQ ID NO:1编号)，从而减少非-特异性抗原输送。
在一些实施例中，融合蛋白进一步包含抗体结合区和HSP70片段之间的接头。在一些实施例中，接头包含选自下述序列的氨基酸序列，基本上由或由选自下述序列的氨基酸序列组成：GGSSRSS(SEQ ID NO:21)、(GGGSGGG)4(SEQ ID NO:22)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:23)、GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:24)和GGSSESSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:25)。
在一些实施例中，接头是GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:24)。在一个实施例中，包含最小HSP70序列和接头GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:24)的融合蛋白包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列，基本上由或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，接头是GGSSESSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:25)。在一个实施例中，包含最小HSP70序列和接头GGSSESSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:25)的融合蛋白包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列，基本上由或由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
本发明的另一个方面涉及一种融合蛋白，包含与至少100个氨基酸的结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片段在读框内融合的抗原结合区，和包含不超过SEQ ID NO:1的氨基酸1-495。所述片段不包含C-端帽子序列，所述删除增强了本发明融合蛋白的生物活性。本发明这方面的HSP70帽子删除片段的最大长度是495个氨基酸残基，从天然结核分枝杆菌氨基酸序列的氨基酸1开始。HSP帽子删除片段的长度小于大约495、490、480、470、460、450、425、400、375、350、325或300个氨基酸残基。HSP片段的长度是至少大约100、125、150、175、200、225、250、275或300个氨基酸残基。
在某些实施例中，HSP70帽子删除片段可能包含一个或多个氨基酸加成、删除或替换，提高了本发明融合蛋白的效果。在一个实施例中，HSP70帽子删除片段包含任意组合(根据SEQ ID NO:1编号)的修饰(a)F176A或b)R318A(子区II中LPS结合位点内，用于改变LPS结合)或c)V410F(肽结合区内，用于改变肽结合)中的一个或多个。在一个实施例中，包含HSP70帽子删除片段和其它修饰的融合蛋白包含SEQ ID NOS:12、13或31的氨基酸序列，基本上由或由SEQ ID NOS:12、13或31的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，在任何包含序列SEQ ID NO:31的修饰HSP70中，Treg区(氨基酸残基141-155)可以被修饰成，例如，VLRIVNEPMAAALAY(SEQ ID NO:32)、VLRIVNEPTAAALAF(SEQ ID NO:33)或VLRIVNEPMAAALAF(SEQ ID NO:34)中的一个。
在一些实施例中，HSP70帽子删除片段进一步包含上述修饰CD94区。
在一些实施例中，包含HSP70帽子删除片段的融合蛋白进一步包含上文所述接头。
在一些实施例中，HSP70帽子删除片段进一步包含Treg区修饰。HSP70的Treg区是公知的，与SEQ ID NO:1的氨基酸残基141-155对应，或与其它HSP70蛋白的相当区对应。Treg区可以被修饰，例如，将结核分枝杆菌序列区用其它HSP70(例如，人HSP70蛋白)的Treg区替换，或删除和/或替换一个或多个氨基酸残基，例如，HSP70家族成员中一个或多个保守残基。
本发明的另一个方面涉及一种融合蛋白，包含与结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断在读框内融合的抗原结合域，所述结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列(临时VIC-008序列)，基本上由或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列(临时VIC-008序列)组成。
SEQ ID NO:26的修饰HSP70序列可以是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含SEQID NO:27，基本上由或由SEQ ID NO:27组成。
SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的修饰HSP70可能包含上文所述的一个或多个其它修饰，例如，上文所述的CD94区和/或Treg区和/或LPS区和/或肽结合区修饰和/或接头序列。
本发明的另一个方面涉及一种融合蛋白，包含与嵌合结核分枝杆菌HSP70在读框内融合的抗原结合区，其中所述嵌合HSP70包含人HSP70氨基酸序列骨架，其中所述β-折叠结构(例如，大约残基367至大约残基479(例如，加或减20、15、10或5个残基))(按照SEQ IDNO:29编号))被结核分枝杆菌HSP70的β-折叠结构替换(例如，大约残基395至大约残基541(例如，加或减20、15、10或5个残基))(按照SEQ ID NO:1编号))。
人HSP70骨架可以来自已知的任何人HSP家族成员，例如，HSP70-1a、HSP70-1b、HSP70-1t、HSP70-2、HSP70-5、HSP70-6、HSC70和HSP70-9。
上文所述的所有修饰HSP70蛋白可以与抗原结合区融合，所述抗原结合区可以是工程抗体或其片段。在一些实施例中，所述抗原结合区是scFv。
抗原结合区可以与任何目标抗原结合。在一些实施例中，所述抗原是癌抗原。在一些实施例中，所述抗原结合区与间皮素特异性结合，例如，与间皮素特异性结合的scFv。间皮素抗体的实例包括WO 2009/068204中公开的实例，通过引用，该专利全文纳入本申请中。在一个实施例中，与间皮素特异性结合的scFv包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列、基本上由或由该序列组成。
本发明的融合蛋白可以在N-端进一步包含前导序列，例如，从而融合蛋白从其被表达的宿主细胞分泌。前导序列可以是任何合适的前导序列，例如，来自宿主固有的分泌蛋白。在一些实施例中，所述前导序列是植物蛋白前导序列，例如，来自拟南芥伸展蛋白、烟草伸展蛋白、大麦α淀粉酶或PR1A。
本发明的融合蛋白包含上文任一公开序列的变体，例如，与上文任一公开序列至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
本发明的另一个方面涉及一种包含本发明一种或多种融合蛋白的组合物。在一些实施例中，所述组合物是包含有效量的本发明融合蛋白及药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中，所述组合物是免疫原性组合物或包含本发明所述融合蛋白的疫苗。
2.融合蛋白的制备方法
本发明还提供组合物及本发明融合蛋白的制备方法。本文所述的任何融合蛋白可以采用重组方法制备。例如，可以将编码HSP70蛋白的核酸与编码抗原结合区的核酸序列的任一端连接，从而所述蛋白编码序列共用同一个翻译阅读框，并表达为包括例如抗原结合区和HSP70蛋白的融合蛋白。
将该组合序列插入到合适的载体内，根据期望的表达特征及宿主细胞性质选择合适的载体。在下文提供的实例中，所述核酸序列在适合蛋白质在CHO细胞中表达的载体中组装。在选择的宿主细胞中表达后，可以采用常规生化分离技术或免疫亲和性方法，采用所述融合蛋白其中一种组分的抗体，对所述融合蛋白进行提纯。或者，选择的载体可以向融合蛋白序列添加标记，例如，寡聚组氨酸标记，允许表达标记的融合蛋白，标记的融合蛋白采用对所述标记具有适当高亲和性的抗体或其它材料，采用亲和性方法提纯。Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Deutscher,M.Guide to Protein Purification Methods Enzymology,vol.182.Academic Press,Inc.San Diego,Calif.(1990)。如果采用适合在哺乳动物细胞中表达的载体，例如，下面讨论的其中一种载体，所述融合蛋白可以从哺乳动物细胞表达和提纯。或者，所述哺乳动物表达载体(包括融合蛋白-编码序列)可以向受试者施用，在受试者细胞中直接表达本发明方法所述融合蛋白。如果采用适合细菌、酵母、昆虫细胞等表达的载体，所述融合蛋白可以从细胞培养物表达和提纯。如果采用适合植物中表达的载体，所述融合蛋白可以从表达蛋白质的转基因植物表达和提纯。还可以化学法制备编码本发明融合蛋白的核酸，然后，将其插入到合适的载体内，用于融合蛋白制备和提纯或向受试者施用。最后，融合蛋白还可以化学制备。
制备融合基因的方法是本领域已知的。实际上，按照传统方法连接编码不同多肽序列的不同DNA片段，采用平端或交错端进行连接，限制酶消化以提供适当的末端，合适的话，填充粘性末端，进行碱性磷酸酶处理，避免不期望的连接和酶连接。在另一个实施例中，融合基因可以采用包括自动DNA合成仪的传统方法合成。或者，可以采用锚定引物开展基因片段的PCR扩增，锚定引物使两个连续基因片段之间互补突出，这两个基因片段之后可以退火，产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubel等,John Wiley&Sons:1992)。因此，提供一种分离核酸，其包含编码至少一种工程抗体的基因及编码至少一种应激蛋白的基因的融合基因。所述分离核酸可以经密码子-优化，提高宿主细胞中的表达。
所述核酸可以在载体中提供，载体包含编码本发明工程融合蛋白的核苷酸序列，并与至少一种调控序列操作连接。应该了解的是，表达载体的设计可能取决于需转化宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白质类型等因素。应考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力及载体编码的任何其它蛋白质(如抗生素标记)的表达。所述载体可以在任何生物有效载体中施用，例如，能够采用编码嵌合多肽的遗传物质体外或体内有效转染细胞的任何制剂或组合物。方法包括将核酸插入到包含重组逆转录病毒、腺病毒、腺病毒-相关病毒、人类免疫缺陷病毒和单纯性疱疹病毒-1或重组细菌或真核质粒的病毒载体内。病毒载体可用于直接转染细胞；质粒DNA可以在，例如，阳离子脂质体(脂质体)或衍生物(例如，结合抗体)、聚赖氨酸结合物、短杆菌肽S、人造病毒包膜或其它细胞内载体的帮助下单独输送。核酸还可以直接注入。或者，可以采用磷酸钙沉淀，促进核酸进入到细胞内。
所述主题核酸可用于使培养繁殖细胞中本发明融合蛋白表达和过表达，例如，产生融合蛋白或多肽。
还提供一种重组基因转染的宿主细胞，从而表达工程融合蛋白。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，HSP70融合可以在细菌细胞中表达，例如，大肠杆菌、昆虫细胞(杆状病毒)、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。在宿主细胞是人类时，可以是或不是在活的受试者体内。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。此外，宿主细胞可以采用宿主中不常见的tRNA分子补充，从而优化多肽表达。适合提高融合多肽表达的其它方法是本领域技术人员已知的。
细胞培养包括宿主细胞、培养基和其它副产品。细胞培养合适的培养基是本领域已知的。可以从细胞与含多肽培养基的混合物中分泌和分离融合多肽。或者，融合多肽可以保留细胞质，收获、溶解细胞并分离出蛋白质。采用本领域已知悉的蛋白质提纯方法，包括离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、超滤法、电泳法，及采用对融合特定表位具有特异性的抗体进行免疫亲和性提纯，可以将融合多肽从细胞培养基、宿主细胞或它们两者中分离出来。
因此，编码本发明全部或部分融合蛋白的核苷酸序列可用于经微生物或真核细胞过程产生重组形式的蛋白质。标准步骤是将所述序列连接到多核苷酸构建体(例如，表达载体)内，并转化或转染到宿主(真核(酵母、禽类、昆虫、植物或哺乳动物)或原核(细菌细胞)宿主)体内。可以采用类似步骤或其修改步骤，通过微生物方法或组织培养技术，制备本主题发明的重组融合多肽。
制备重组蛋白的表达载体包括质粒和其它载体。例如，表达融合多肽的合适载体包括以下类型的质粒：pBR322-衍生质粒、pEMBL-衍生质粒、pEX-衍生质粒、pBTac-衍生质粒和pUC-衍生质粒，用于在原核细胞(如大肠杆菌)中表达。
在另一个实施例中，所述核酸是与细菌启动子操作连接的融合蛋白，所述细菌启动子为，例如，厌氧大肠杆菌NirB启动子或大肠杆菌脂蛋白脂肪酶启动子，例如，在Inouye等(1985)Nucl.Acids Res.13:3101、Salmonella pagc promoter(Miller等,supra)、Shigella ent promoter(Schmitt and Payne,J.Bacteriol.173:816(1991))、the tetpromoter on Tn10(Miller等,supra)或the ctx promoter of Vibrio cholera中所描述的。可以采用其它任何启动子。细菌启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。示例性诱导型启动子是铁或铁-受限条件下可诱导的启动子。实际上，人们认为，某些细菌(例如，细胞内生物体)会在宿主细胞质内遇到铁受限的条件。铁-调节启动子FepA和TonB的实例是本领域已知的，并且在以下参考文献中进行了描述：Headley,V.等(1997)Infection&Immunity 65:818；Ochsner,U.A.等(1995)Journal of Bacteriology 177:7194；Hunt,M.D.等(1994)Journal of Bacteriology 176:3944；Svinarich,D.M.andS.Palchaudhuri.(1992)Journal of Diarrhoeal Diseases Research 10:139；Prince,R.W.等(1991)Molecular Microbiology 5:2823；Goldberg,M.B.等(1990)Journal ofBacteriology 172:6863；de Lorenzo,V.等(1987)Journal of Bacteriology 169:2624以及Hantke,K.(1981)Molecular&General Genetics 182:288。
质粒优选包含在细菌中适当转录核酸所需的序列，例如，转录终止信号。所述载体进一步包含编码因子的序列，这些因子允许选择含目标核酸的细菌，例如，编码抗抗生素蛋白质的基因，核酸扩增所需序列，例如，细菌复制源。
在一个实施例中，被大肠杆菌RNA聚合酶识别的强大噬菌体T5启动子与乳糖操纵基因阻遏模块一起使用，在大肠杆菌内提供严格调控的高水平表达或重组蛋白质。在这种系统中，在高水平乳糖阻遏物存在下，蛋白质表达被阻断。在一个实施例中，DNA与第一启动子操作连接，细菌进一步包含编码第一聚合酶的第二DNA，第一聚合酶能够介导第一启动子的转录，其中编码第一聚合酶的DNA与第二启动子操作连接。在优选实施例中，第二启动子是细菌启动子，如上文描述的那些启动子。在甚至更优选的实施例中，聚合酶是噬菌体聚合酶，例如，SP6、T3或T7聚合酶，第一启动子是噬菌体启动子，例如，分别是SP6、T3或T7启动子。包含噬菌体启动子的质粒和编码噬菌体聚合酶的质粒可以商业购买，例如，自PromegaCorp.(威斯康星州麦迪逊市)和InVitrogen(加利福尼亚州圣地亚哥市)购买，或可以采用标准重组DNA方法从噬菌体直接得到(J.Sambrook,E.Fritsch,T.Maniatis,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,1989)。噬菌体聚合酶和启动子在，例如，下述参考文献中进一步描述：Sagawa,H.等(1996)Gene 168:37；Cheng,X.等(1994)PNAS USA 91:4034；Dubendorff,J.W.and F.W.Studier(1991)Journal ofMolecular Biology 219:45；Bujarski,J.J.and P.Kaesberg(1987)Nucleic AcidsResearch 15:1337以及Studier,F.W.等(1990)Methods in Enzymology 185:60)。所述质粒可以根据需表达的融合多肽的具体实施例进一步修饰。
在另一个实施例中，细菌进一步包含编码第二聚合酶的DNA，第二聚合酶能够介导第二启动子的转录，其中编码第二聚合酶的DNA与第三启动子操作连接。第三启动子可以是细菌启动子。但是，细菌中可以引入两个以上不同的聚合酶和启动子，从而获得高水平的转录。与DNA由细菌启动子直接控制的细菌相比，采用一种或多种聚合酶介导细菌转录可以使细菌中多肽的数量显著增加。系统选择将依具体用途而异，例如，依需要产生的蛋白质的数量而异。
通常，将编码本发明融合蛋白的核酸引入到宿主细胞内，例如，通过转染，并将宿主细胞在允许融合多肽表达的条件下进行培养。将核酸引入到原核细胞和真核细胞内的方法是本领域已知的。哺乳动物和原核宿主细胞培养的合适培养基是本领域已知的。通常，编码主题融合多肽的核酸由诱导启动子控制，一旦包含核酸的宿主细胞分裂一定次数，诱导启动子被诱导。例如，在核酸由β-半乳糖操纵基因和阻遏物控制时，当细菌宿主细胞密度达到大约OD6000.45-0.60时，向培养物中加入异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。然后，让培养物生长更长时间，使宿主细胞有时间合成多肽。然后，通常将培养物冷冻，在分离和提纯多肽之前，可以冷冻储存一段时间。
当采用原核宿主细胞时，宿主细胞可以包括表达内部T7溶菌酶的质粒，例如，从质粒pLysSL表达。所述宿主细胞溶解释放出溶菌酶，然后，溶菌酶将细菌膜降解。
可包含在载体中用于在细菌或其它原核细胞中表达的其它序列包括合成核糖体结合位点；强转录终止子，例如，来自λ噬菌体的t0和来自大肠杆菌rrnB操纵子的t4，防止通过转录阅读，确保表达多肽的稳定性；复制来源，例如，ColE1；及赋予氨苄西林耐药性的β-内酰胺酶基因。
其它宿主细胞包括原核宿主细胞。甚至更优选的宿主细胞是细菌，例如，大肠杆菌。可以使用的其它细菌包括志贺氏杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、立克次氏体、耶尔森氏菌、埃希氏杆菌、克雷伯氏菌、博德特杆菌、奈瑟氏球菌、气单胞菌、弗朗西斯杆菌、棒状杆菌、柠檬菌、衣原体、嗜血杆菌、布鲁氏菌、分枝杆菌、军团病杆菌、红球菌、假单胞菌、螺杆菌、弧菌、杆状菌和丹毒丝菌。这些细菌中的大多数细菌可从美国菌种保藏中心(ATCC；美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学街10801号，201、10-2209)获取。
许多载体用于表达酵母的重组蛋白质。例如，YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2和YRP17是克隆和表达载体，用于将遗传构建体引入到啤酒酵母中(参见，例如，Broach等,(1983)in Experimental Manipulation of Gene Expression,ed.M.Inouye AcademicPress,p.83)。由于pBR322ori的存在，这些载体可以在大肠杆菌中复制，由于酵母2微米质粒的复制决定子，这些载体可以在啤酒酵母中复制。此外，可以采用耐药标记，如氨苄西林。
在某些实施例中，哺乳动物表达载体包含原核序列以促进细菌中载体增殖，并且包含一个或多个真核细胞中表达的真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、PMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生载体是适合真核细胞转染的哺乳动物表达载体实例。这些载体中的一些载体采用细菌质粒的序列修饰，例如，pBR322，从而促进原核细胞和真核细胞复制和耐药选择。或者，病毒衍生物，如牛乳头瘤病毒(BPV-1)，或爱泼斯坦-巴尔病毒(pHEBo、pREP-衍生和p205)可用于真核细胞内蛋白质的瞬时表达。制备质粒和宿主生物体转化采用的各种方法是本领域已知的。原核细胞和真核细胞其它合适的表达系统，以及通用重组程序，参见Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑的Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)的第16章和第17章。在一些情况下，可以采用杆状病毒表达系统来表达重组蛋白质。所述杆状病毒表达系统的实例包含pVL-衍生载体(如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW-衍生载体(如pAcUW1)，及pBlueBac-衍生载体(如含pBlueBacIII的β-gal)。
在另一种变化中，蛋白质产生可以采用体外翻译系统实现。体外翻译系统通常是无细胞提取物翻译系统，至少包含将RNA分子翻译为蛋白质所需的最少元件。体外翻译系统通常至少包含核糖体、tRNA、起始子甲硫氨酰基-tRNAMet、参与翻译的蛋白质或复合物(例如，eIF2、eIF3)、帽-结合(CB)复合物，包含帽-结合蛋白质(CBP)和真核起始因子4F(eIF4F)。各种体外翻译系统是本领域公知的，包括商业购买试剂盒。体外翻译系统的实例包括真核裂解物，如兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物、人细胞裂解物、昆虫细胞裂解物及小麦胚芽萃取物。裂解物可从生产商，如威斯康星州麦迪逊市的Promega Corp.；加利福尼亚州拉荷亚市的Stratagene；伊里诺斯州阿灵顿高地市的Amersham；和纽约格兰德岛的GIBCO/BRL公司购买。体外翻译系统通常包含大分子(如酶)、翻译、起始和延伸因子、化学试剂和核糖体。此外，也可以采用体外转录系统。所述系统通常包含至少一种RNA聚合酶全酶、核糖核苷酸和任何必要的转录起始因子、延伸因子和终止因子。体外翻译用RNA核苷酸可以采用本领域已知的方法制备。体外转录和翻译可以在一锅反应中同时进行，从而从一种或多种分离DNA制备蛋白质。
当需要表达多肽羧基末端片段，即截短突变体时，可能必须向包含所需表达序列的寡核苷酸中加入起始密码子(ATG)。N-端位置的甲硫氨酸可以采用甲硫氨酰氨肽酶(MAP)酶切割，这是本领域已知的。已经从大肠杆菌(Ben-Bassat等,(1987)J.Bacteriol.169:751-757)和鼠伤寒沙门氏菌克隆了MAP，并在重组蛋白质上证明了它的体外活性(Miller等,(1987)PNASUSA 84:2718-1722)。因此，如果需要的话，N-端甲硫氨酸删除可以通过在产生MAP的宿主(例如，大肠杆菌或CM89或啤酒酵母)中表达所述重组多肽体内实现，或采用提纯MAP体外实现(例如，Miller等的方法)。
在采用植物表达载体时，融合蛋白的表达可能采用多种启动子中的任何启动子推动，例如，适合烟草表达的启动子。例如，可以采用病毒启动子，如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等,1984,Nature,310:511-514)，或TMV外壳蛋白启动子(Takamatsu等,1987,EMBO J.,6:307-311)；或者，可以采用植物启动子，如RUBISCO小亚单位(Coruzzi等,1994,EMBO J.,3:1671-1680；Broglie等,1984,Science,224:838-843)；或热休克启动子，如大豆hsp 17.5-E或hsp 17.3-B(Gurley等,1986,Mol.Cell.Biol.,6:559-565)。这些构建体可以采用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体；直接DNA转化；微注射、电穿孔等引入到植物细胞内。关于这些方法的综述，参见，例如，Weissbach&Weissbach,1988,Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,New York,Section VIII,pp.421-463以及Grierson&Corey,1988,Plant Molecular Biology,2d Ed.,Blackie,London,Ch.7-9。
可用于表达多肽标记或包含多肽标记的融合蛋白的替代表达系统有昆虫系统。在一个此类系统中，采用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。这种病毒生长在草地贪夜蛾细胞中。PGHS-2序列可以克隆到病毒的非必需区内(例如，多角体蛋白基因)，并由AcNPV启动子控制(例如，多角体蛋白启动子)。成功插入编码序列将导致多角体蛋白基因失活，产生非封闭型重组病毒(即缺少蛋白质外壳的病毒，其由多角体蛋白基因编码)。然后，这些重组病毒用于感染插入基因在其中表达的草地贪夜蛾细胞(例如，参见Smith等,1983,J.Virol.,46:584,Smith,美国专利No.4,215,051)。
在昆虫系统的特定实施例中，编码融合蛋白的DNA被克隆到多角体蛋白启动子下游pBlueBaclll重组转移载体中(加利福尼亚州圣地亚哥市英杰公司(Invitrogen))，并转染到Sf9昆虫细胞内(源自草地贪夜蛾卵巢细胞，由加利福尼亚州圣地亚哥市英杰公司(Invitrogen)提供)，从而产生重组病毒。重组病毒蚀斑纯化后，制备高滴度病毒储备液，这种储备液反过来用于感染Sf9或High FiveTM(BTI-TN-5B1-4细胞，源自粉纹夜蛾卵细胞匀浆；由加利福尼亚州圣地亚哥市Invitrogen提供)昆虫细胞，产生大量适当翻译后修饰的主题多肽。
在其它实施例中，本发明任何融合蛋白的组分可以独立产生，然后，彼此连接，例如，共价连接。
例如，在体外独立产生抗原结合区和修饰HSP70蛋白，提纯，并在标记(例如，生物素或抗体结合蛋白)能够连接目标多肽的条件下将它们混合。例如，HSP70蛋白和/或抗原结合区可以从人们知道其会发生的来源得到(分离)，可以从细胞培养物产生和收获，可以通过克隆和表达编码期望HSP70蛋白或抗原结合区的基因产生，或可以化学合成。此外，编码期望HSP70蛋白或抗原结合区的核酸序列，或本发明融合蛋白的任何组分，都可以化学合成。结合蛋白所述混合物的性质可能与单一融合蛋白的性质不同。
接头(亦称为“接头分子”或“交联剂”)可用于连接本发明融合蛋白的各种组分。接头包括能够与几种，通常是两种分子的规定化学基团反应，从而将它们连接的化学物质。已知的大多数交联剂与胺基、羧基和巯基反应。目标化学基团的选择非常重要，如果所述基团可能参与需连接多肽的生物活性的话。例如，与巯基反应的马来酰亚胺可以使含Cys-的多肽或蛋白质失活，这些多肽或蛋白质需要采用Cys与靶结合。接头可以是同官能(包含同一类型的反应基团)、杂官能(包含不同反应基团)，或光反应性(包含照射后具有反应性的基团)接头。
接头分子控制连接组合物的不同性质。应根据连接步骤期间分子柔性及其靶(细胞表面分子等)连接分子的获得性考虑接头的长度。因此，更长的接头可以改善本发明组合物的生物活性，而且更容易制备。可以利用接头的几何形状对分子定向，使其与靶的反应最佳。几何形状灵活的接头使交联肽与其它肽结合时能够在构象上适应。可以改变接头的性质用于其它用途。例如，人们发现，MbuS芳基结构的免疫原性低于MBS的芳族间隔物。此外，接头分子的疏水性和功能性可以通过组成分子的物理性质控制。例如，聚合物接头的疏水性可以通过聚合物单体单元的顺序控制，例如，其中疏水单体嵌段中穿插亲水单体嵌段的嵌段共聚物。
本发明使用的接头或交联剂可以促进融合蛋白的适当折叠，改善本发明融合蛋白的生物活性，并且能够使本发明融合蛋白易于制备等。
接头还提供使scFv重链段和轻链段适当折叠的功能。本发明的“接头”还有助于靶识别。
本发明可以采用不干扰蛋白质适当折叠和功能的任何合适的氨基酸接头。
在一个实施例中，接头是产生一系列中性或低极性氨基酸，促进融合蛋白适当折叠的核酸组合。
如果氨基酸侧链无法被离子化，则其被视为极性的，但是呈中性。例如，由于羧基侧链可以被离子化，因此，天冬氨酸是极性的和酸性的。酪氨酸是极性的。苯环上的羟基不容易被离子化，因此，它被视为极性的，但是呈中性。
在一个实施例中，接头由编码下述氨基酸序列的核酸组成：GGSSRSS(SEQ ID NO:21)。在另一个实施例中，接头由编码下述氨基酸序列的核酸组成：(GGGSGGG)X4(SEQ IDNO:22)。
在另一个实施例中，接头序列包含序列GGGGSGGGGSGGGGS((Gly4Ser)3)SEQ ID NO:23)。在另一个实施例中，接头序列包含序列GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:24)或GGSSESSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:25)。接头序列中优选包含甘氨酸，因为甘氨酸具有H-侧链，而其它所有氨基酸都具有更大的侧链。
制备和使用各种分子接头的化学反应是本领域已知的，许多预先-制备好的分子连接接头可从供应商，例如Pierce Chemical Co.、Roche Molecular Biochemicals、United States Biological等公司购买。
A.融合蛋白制备实施例
本发明的一个方面涉及一种编码本发明融合蛋白的分离核酸。在一些实施例中，所述核酸编码前面公开的任何融合蛋白序列。
在某些实施例中，所述分离核酸包含选自以下的核酸，基本上由或由选自以下的核酸组成：
a)SEQ ID NOS:2、4、6、8或10中任一项的核苷酸序列；
b)与a)中核苷酸序列至少大约80％相同的核苷酸序列；
c)与(a)或(b)互补的核苷酸序列；
d)与(a)或(b)反向互补的核苷酸序列；或
e)(a)至(d)的任何组合。
在一些实施例中，所述分离核酸与SEQ ID NOS:2、4、6、8或10任一项的核苷酸序列至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一些实施例中，所述分离核酸经密码子优化用于宿主细胞表达，例如，细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些实施例中，所述分离核酸经密码子优化用于植物细胞表达，例如，其中所述植物是本氏烟或普通烟。
所述分离核酸可与启动子(例如，适合在目标宿主细胞内表达的启动子)操作连接。在一些实施例中，所述启动子是植物启动子。
本发明的另一个方面涉及一种包含本发明核酸的表达载体。
本发明进一步涉及一种包含本发明分离核酸或表达载体的细胞。所述细胞可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞，例如，选自本氏烟(N.benthamiana)和烟草(N.tabanum)的植物细胞。
本发明的另一个方面涉及一种包含本发明所述分离核酸的转基因植物细胞、植物部分，或植物。
3.融合蛋白的使用方法
本文所述融合蛋白可以向受试者施用，从而增强受试者对表达抗原结合区识别抗原的细胞的免疫反应，特别是细胞-介导的溶细胞反应。融合蛋白可以仅增强免疫反应(从而作为免疫原性组合物)，或引发保护性免疫(从而作为疫苗)。
因此，按照上文所述制备的蛋白质融合多肽可以提纯到合适的纯度作为药物组合物使用。通常，提纯组合物的一种组分占组合物中全部组分的大约85％以上，大约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上。目标组分可以提纯到基本上同质(污染组分采用传统检测方法无法检出)，其中所述组合物基本上由单一组分组成。熟悉本领域的技术人员可以采用蛋白质标准提纯方法提纯融合蛋白，例如，根据本文的教导，采用免疫亲和性色谱法、体积排阻色谱法等。多肽纯度可以采用本领域技术人员已知的许多方法测定，包括，例如，氨基-末端氨基酸序列分析、凝胶电泳法和质谱分析。
因此，本发明提供包含上述融合蛋白的药物组合物。一方面，本发明公开提供药学上可接受的组合物，包括治疗有效量的上文和下文所述的一种或多种化合物，所述化合物与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。另一方面，在一些实施例中，所述化合物可以直接施用或与药学上可接受的载体混合施用，还可以与其它制剂一起施用。因此，联合(组合)治疗包括顺序、同时和分别或共同施用活性化合物，施用方式为当后续施用时，第一次施用的治疗效果尚未完全消失。
本文所述融合蛋白可以采用各种方式向受试者施用。施用途径包括皮内、经皮(例如，缓释聚合物)、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经口、硬脑膜外和鼻内。可以采用其它任何常规施用途径，例如，输液或弹丸注射，或通过上皮层或粘膜皮肤层吸收。此外，本文所述组合物可以包含其它药理学上可接受的组分，如生物活性成分(例如，明矾等佐剂)、表面活性剂(例如甘油酯)、赋形剂(如乳糖)、载体、稀释剂、溶媒，及与这些组分一起施用。此外，所述组合物可以作为刺激受试者白细胞的手段体外使用，在体外引发、扩大和增殖抗原-特异性免疫细胞，然后，将这些细胞重新引入到受试者体内。
此外，融合蛋白可以通过体内表达编码所述蛋白序列的核酸向人类受试者施用。所述核酸的表达可以作为刺激受试者白细胞的手段体外实现，在体外引发、扩大和增殖抗原-特异性免疫细胞，然后，将这些细胞重新引入到受试者体内。适合引导目标融合蛋白表达的表达载体可以选自本领域目前使用的大量载体。优选能够产生高水平表达且在转导目标基因方面有效的载体。例如，可以采用重组腺病毒载体pJM17(All等,Gene Therapy 1:367-84(1994)；Berkner K.L.,Biotechniques 6:616-24 1988)、第二代腺病毒载体DEl/DE4(Wang and Finer,Nature Medicine 2:714-6(1996))，或腺相关病毒载体AAV/Neo(Muro-Cacho等,J.Immunotherapy 11:231-7(1992))。此外，可以采用重组逆转录病毒载体MFG(Jaffee等,Cancer Res.53:2221-6(1993))或LN、LNSX、LNCX、LXSN(Miller和Rosman,Biotechniques 7:980-9(1989))。单纯疱疹病毒载体，如pHSV1(Geller等,Proc.Nat'lAcad.Sci.87:8950-4(1990)或牛痘病毒载体，如MVA(Sutter和Moss.Proc.Nat'lAcad.Sci.89:10847-51(1992))可以作为替代方案。
经常使用的包含启动子和3’序列的特异性表达单位是质粒cDNA3(Invitrogen)、质粒AH5、pRC/CMV(Invitrogen)、pCMU II(Paabo等,EMBO J.5:1921-1927(1986))、pZip-Neo SV(Cepko等,Cell 37:1053-1062(1984))和pSRa(DNAX,Palo Alto,Calif.)中发现的那些表达单位。将基因引入到表达单位和/或载体中可以采用基因工程技术实现，如Molecular Cloning and Current Protocols in Molecular Biology(Sambrook,J.,等,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Press(1989)；Ausubel,F.M.等,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989))等所述。得到的表达核酸可以采用能够将核酸以表达形式放到细胞内的任何方法引入到人类受试者细胞内，例如，如上文所述作为病毒载体的一部分，作为裸质粒或其它DNA，或包裹在靶向脂质体中或红细胞血影中(Friedman,T.,Science,244:1275-1281(1989)；Rabinovich,N.R.等,Science.265:1401-1404(1994))。转导方法包括直接注射到组织和肿瘤内、脂质体转染(Fraley等,Nature 370:111-117(1980))、受体-介导内吞作用(Zatloukal等,Ann.N.Y.Acad.Sci.660:136-153(1992))，及粒子轰击-介导基因转移(Eisenbraun等,DNA&Cell.Biol.12:791-797(1993))。
本发明组合物中融合多肽的量(如前面所述，融合、结合或非共价连接)是按照本文所述方法测定的在受试者体内产生有效免疫刺激性反应的量。有效量是施用时诱导免疫反应的量。此外，受试者融合蛋白施用量将随各种因素变化，包括采用的工程抗体和应激蛋白、受试者身高、年龄、体重、健康状况、性别及饮食，以及受试者的一般免疫反应。调节和控制确定的剂量范围是本领域技术人员的能力范围。例如，本发明工程融合蛋白，例如，间皮素抗体-修饰HSP70融合蛋白的剂量，可以是大约1微克至大约1克，优选大约100微克至大约1克，及大约1毫克至大约1克。包含表达载体的组合物的有效量是施用时诱导针对抗原结合区导向抗原的免疫反应的量。此外，受试者的表达载体施用量将随各种因素变化，包括抗原结合区和表达的HSP70蛋白、受试者身高、年龄、体重、健康状况、性别及饮食，以及受试者的一般免疫反应。需要考虑的其它因素有施用途径和所用载体类型。例如，当采用包含编码本发明工程融合蛋白的核酸的病毒载体开展预防或治疗时，有效量范围是104-1012个无辅助复制缺陷病毒/每公斤体重，优选范围是105-1011个病毒/每公斤体重，最优选范围是106-1010个病毒/每公斤体重。
有效剂量一开始采用体外检验估计。例如，可以采用本领域已知的方法，利用动物模型诱导免疫反应确定剂量。本领域技术人员能够根据动物数据，轻松优化人类施用剂量。可以根据个人情况，调节剂量和时间间隔。例如，当作为疫苗使用时，本发明蛋白质和/或菌株可以1-36周施用大约1至3剂。优选施用3剂，时间间隔是大约3-4个月，然后，定期给予加强疫苗接种。替代方案可能适合单个患者。合适剂量是按照上文所述施用时能够使免疫患者产生免疫反应，至少1-2年足够阻止生病或感染的蛋白质或菌株的量。
所述组合物还包括增强免疫反应的佐剂。此外，所述蛋白质可以进一步悬浮在油状乳液中，使蛋白质注射后在体内更缓慢地释放。配方中每种组分的最佳比例可以采用本领域技术人员已知的方法确定。
本发明疫苗可以采用任何佐剂来提高免疫反应。大多数佐剂包含设计用于防止抗原快速分解代谢的物质，例如，氢氧化铝或矿物油，及免疫反应的特异性或非特异性刺激剂，如脂质A，或百日咳杆菌。合适的佐剂可以购买，包括，例如，弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories)及默克佐剂65(纽约拉威市默克公司)。其它合适的佐剂包括明矾、生物降解性微球、单磷酰脂质A、quil A、SBAS1c、SBAS2(Ling等,1997,Vaccine 15:1562-1567)、SBAS7、Al(OH)3和CpG寡核苷酸(WO96/02555)。
在本发明疫苗中，佐剂可以诱导Th1型免疫反应。合适的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂质A，优选3-脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)与铝盐的组合。增强系统包括单磷酰脂质A和皂角苷衍生物组合，特别是WO 94/00153中公开的3D-MLP和皂角苷QS21的组合，或WO 96/33739中公开的其中QS21采用胆固醇淬火的反应原性更低的组合物。以前的实验已经证明了3D-MLP和QS21组合在诱导体液和Th1型细胞免疫反应方面明显的协同效应。一种在水包油乳液中包含QS21、3D-MLP和生育酚的特别有效的佐剂在WO 95/17210中进行了描述，并且可以包含制剂。
在本发明的某些实施例中，按不同时间间隔(例如，每小时、每天、每周、每月等)，施用不止一次(例如，两次、三次、四次或更多次)来达到治疗效果。
A.使用方法实施例
本发明的一个方面涉及一种在受试者体内诱导针对抗原的免疫反应的方法，包括向受试者施用与所述抗原特异性结合的本发明融合蛋白，从而诱导免疫反应。
本发明的另一个方面涉及一种治疗受试者抗原相关疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的与所述抗原特异性结合的权利要求1-31任一项所述的融合蛋白，从而治疗疾病。
在某些实施例中，所述抗原是疾病抗原。所述抗原可以是上文所述病毒抗原、细菌抗原、病原体抗原或癌抗原。在某些实施例中，所述抗原是癌抗原，例如，间皮素。。
在一些实施例中，所述抗原相关疾病是病原体感染，例如，病毒感染。在一些实施例中，所述抗原相关疾病是表达抗原，例如，间皮素的癌症。在一些实施例中，所述间皮素表达癌症是卵巢癌、脑膜瘤、神经胶质瘤、柔脑膜转移瘤、间皮瘤、子宫腺癌、恶性间皮瘤、胰腺癌或肺腺癌。
在一些实施例中，本发明所述方法进一步包括向受试者施用其它活性剂。其它活性剂可以是治疗剂，例如，抗-病原体剂或抗癌剂。
抗癌剂包括但不限于，1)长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱)；2)表鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)；3)抗生素(例如，更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)、阿霉素、博来霉素、普卡霉素(光辉霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C))；4)酶(例如，L-天冬酰胺酶)；5)生物反应调节剂(例如，α-干扰素)；6)铂配位复合物(例如，顺铂和卡铂)；7)蒽二酮(例如，米托蒽醌)；8)取代脲(例如，羟基脲)；9)甲肼衍生物(例如，丙卡巴肼(N-甲基肼；MIH))；10)肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦(o,p'-DDD)和氨鲁米特)；11)肾上腺皮质类固醇(例如，强的松)；12)孕酮(例如，己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)；13)雌激素(例如，己烯雌酚和乙炔雌二醇)；14)抗雌激素药(例如，它莫西芬)；15)雄激素(例如，丙酸睾酮和氟甲睾酮)；16)抗雄激素(例如，氟他胺)：及17)促性腺激素-释放激素类似物(例如，亮丙瑞林)。在另一个实施例中，本发明化合物与抗血管生成剂一起施用，例如，与VEGF抗体(例如，贝伐单抗(AVASTIN)、兰尼单抗(LUCENTIS))和其它血管生成促进剂(例如，bFGF、血管生成素-1)、α-v/β-3血管整合素抗体(例如，VITAXIN)、血管抑素、内皮抑素、达肝素、ABT-510、CNGRC肽TNFα结合物、环磷酰胺、康普瑞汀A4磷酸酯、二甲基呫吨酮乙酸、多烯紫杉醇、来那度胺、恩扎妥林(enzastaurin)、紫杉酚、紫杉酚白蛋白-稳定纳粒颗粒剂(Abraxane)、大豆异黄酮(Genistein)、枸橼酸它莫西芬、萨立多胺、ADH-1(EXHERIN)、AG-013736、AMG-706、AZD2171、甲苯磺酸索拉非尼、BMS-582664、CHIR-265、帕唑帕尼、PI-88、瓦他拉尼、依维莫司、苏拉明、苹果酸舒尼替尼、XL184、ZD6474、ATN-161、赛伦尼太(cilenigtide)和塞来昔布一起施用。
合适的抗病毒剂包含，例如，病毒失活剂，如非离子、阴离子和阳离子表面活性剂，及C31G(氧化胺和烷基甜菜碱)、聚双胍、二十二烷醇、酰肉碱类似物、辛基甘油和抗菌肽，如蛙皮素、短杆菌肽、蜂毒素和retrocyclins。温和的表面活性剂，例如，去水山梨糖醇月桂酸酯，可以有利地作为本文所述组合物的抗病毒剂。本文所述组合物可以有利地利用的其它抗病毒剂包含核苷酸或核苷类似物，如替诺福韦、阿昔洛韦、金刚胺、地达诺新、膦甲酸、更昔洛韦、利巴韦林、阿糖腺苷、扎西他滨和齐多夫定。其它可以使用的抗病毒剂包含非-核苷逆转录酶抑制剂，例如UC-781(硫代羧酰苯胺)、吡啶酮、TIBO、奈韦拉平、地拉夫定、胡桐内酯A、卡普韦林和依法韦仑。可以使用的其它抗病毒剂是HIV进入阻断剂类别中的那些抗病毒剂，例如，蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin-N)、环糊精、角叉菜胶、硫酸化或磺化聚合物、扁桃酸缩聚物、单克隆抗体、趋化因子受体拮抗剂，如TAK-779、SCH-C/D和AMD-3100，及融合抑制剂，如T-20和1249。
合适的抗菌剂包括抗生素，如氨基糖甙类、头孢菌素类，包括第一代、第二代和第三代头孢菌素；大环内酯，包括红霉素、青霉素，包括天然青霉素、抗青霉素酶青霉素、氨基青霉素、广谱青霉素；磺胺、四环素、氟喹诺酮、甲硝达唑和尿路防腐剂。
合适的抗真菌剂包括两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素、氟胞嘧啶、氟康唑、碘化钾、伊曲康唑、克霉唑、咪康唑、酮康唑和托萘酯。
合适的抗原虫剂包括抗疟疾剂，如氯喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、奎宁、治疟宁和甲氟喹；抗阿米巴药，如二醇草酰胺、吐根碱、双碘喹啉、甲硝达唑、巴龙霉素和奎纳克林；羟乙基磺酸戊双脒、阿托伐醌和依氟鸟氨酸。
其它活性剂可能是针对疾病或治疗症状或副作用提供治疗或增强治疗效果的制剂。在一个实施例中，其它活性剂是消炎剂。实例包括但不限于H1-抗组胺剂(如西替利嗪)、H2-抗组胺剂(如雷尼替丁、法莫替丁)、抗白三烯(例如，孟鲁司特、齐留通)，及非甾体类抗炎药。
其它活性剂可以是增强本发明融合蛋白免疫刺激性效果的免疫刺激剂与/或免疫检查点抑制剂。免疫刺激剂包括但不限于白介素、干扰素、细胞因子、toll-样受体(TLR)激动剂、细胞因子受体激动剂、CD40激动剂、Fc受体激动剂、含CpG的免疫刺激性核酸、补体受体激动剂、佐剂，或CXCL12/CXCR4轴抑制剂(如AMD3100、KRH-1636、T-20、T-22、T-140、TE-14011、T-14012或TN14003)，或干扰CXCR4二聚的抗体。免疫检查点抑制剂包括但不限于PD-1、PD-L1、CTLA4、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、A2AR、TIM-3的VISTA抑制剂，如纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、度伐鲁单抗或阿特朱单抗。
在一些实施例中，本发明所述方法进一步包括向受试者施用其它治疗。其它治疗可以是已知对疾病治疗有效的任何治疗，例如，对癌症治疗有效的治疗，例如，手术、放射治疗、质子束治疗、光治疗等。
4.试剂盒
本发明提供表达本发明工程融合蛋白的试剂盒。所述试剂盒由编码本发明工程融合蛋白的核酸组成。所述核酸可以包含在质粒或载体内，例如，细菌质粒或病毒载体内。其它试剂盒包括工程融合多肽。此外，本发明提供制备和/或提纯本发明融合多肽的试剂盒。
本发明提供预防或治疗患者感染性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病或恶性病的试剂盒。例如，试剂盒可以包括上述一种或多种药物组合物及任选地其使用说明书。在其它实施例中，本发明提供包括一种以上药物组合物及一种或多种施用所述组合物的装置。
试剂盒各组分可以包装用于前述方法的手动操作或部分或全部自动操作。在其它包含试剂盒的实施例中，可以提供其使用说明书。
本发明在以下实例中更具体地进行说明，但这些说明只是示例性的，对熟悉本领域的技术人员来说，本发明的许多变动和改变是显而易见的。
实例1
VIC-008的制备和治疗活性
一种新型融合蛋白VIC-007(SEQ ID NO:28)由广泛免疫活化的结核分枝杆菌-衍生热休克蛋白70(MtbHsp70)和经过验证的免疫治疗靶-单链可变片段(scFv)结合间皮素(MSLN)的肿瘤抗原靶向活性组成(4-6)。MSLN在常见上皮癌表面过表达，包括上皮恶性间皮瘤和卵巢癌，而在健康个人胸膜、心包膜和腹膜间皮细胞中的表达水平相对较低(7-10)。MtbHsp70很好地得到表征，并作为有效的免疫-活化佐剂。它刺激单核细胞和树突细胞(DC)，产生CC-趋化因子(11，12)，后者吸引抗原加工和递呈巨噬细胞、DC和效应子T细胞和B细胞(13)。理论上，抗-MSLN scFv和MtbHsp70的融合利用MtbHsp70的免疫活化作用及scFv的肿瘤-靶向活性，将产生针对最广泛肿瘤抗原的抗-瘤反应。
虽然我们以前的研究表明，通过增强肿瘤-特异性细胞-介导免疫反应，VIC-007显著提高了卵巢肿瘤或恶性间皮瘤免疫活性小鼠的生存情况(14)，但是，所述融合蛋白并不能提供长期缓解效果。在此研究中，利用VIC-007，删除其冗余氨基酸，并降低MtbHsp70天然肽结合位点的活性，重新构建了新的融合蛋白VIC-008(SEQ ID NO:27)。采用同一组小鼠对VIC-007和VIC-008的作用进行比较，我们发现，VIC-008在同系、原位免疫活性卵巢癌鼠模型中实现了显著改善的抗瘤效果。
材料和方法
细胞：将ID8卵巢癌细胞(Kathy Roby(美国堪萨斯州堪萨斯市堪萨斯大学医学中心)慷慨赠送的礼物)(15)采用荧光素酶慢病毒载体转染，并稳定表达荧光素酶，本文称为Luc-ID8。将细胞保持在37℃，置于含2mmol/L L-谷氨酰胺、10单位/ml青霉素、10μg/ml链霉素和10％胎牛血清的DMEM中，并置于含5％CO2的加湿气氛中。培养细胞，直到80％融合，并采用胰蛋白酶EDTA(Mediatech)收获，用于动物注射。
动物模型和治疗：腹膜内(i.p.)注射同系癌细胞Luc-ID8(5x106个细胞/每只小鼠)到6周大的雌性C57BL/6小鼠体内引发卵巢癌。所有小鼠都购自杰克逊实验室。在卵巢癌小鼠接种肿瘤细胞7天后，腹膜内注射VIC-007(4μg/每只小鼠)、VIC-008(4μg/每只小鼠)，或生理盐水对其进行治疗。在这之后，按7天时间间隔进行另外3次治疗。所有研究都按照马萨诸塞州总医院研究动物护理小组委员会(SRAC)批准的协议，以观察者不知情的方式开展。
肿瘤生长活体成像：采用IVIS Spectrum(珀金埃尔默)活体成像，在肿瘤接种后，每周对腹膜内肿瘤生长情况进行监测。提前10分钟向小鼠腹膜内注射150mg D-荧光素/公斤体重，然后，采用IVIS Spectrum进行成像分析。
小鼠生存情况：为了进行生存研究，我们在肿瘤细胞接种1周后，每天观察小鼠。肿瘤发生始终非常明显，首先出现腹胀，然后是恶性腹水，正如以前文献所述(16)，当出现痛苦的症状，包含皮毛变皱、呼吸加快、缩成一团、活动减少及腹水逐步形成，即达到终点，此时，对患肿瘤的小鼠执行安乐死。
统计分析：将每组的平均值与其它每组进行比较，采用两因素方差检验(two-wayANOVA test)，然后采用图基多重比较试验，进行三个或更多个实验组的统计差异分析。采用时序检验，分析生存情况。采用6.0软件(GraphPad Software)进行所有统计分析。
结果与讨论
融合蛋白scFv-MtbHsp70的重构：如我们以前的研究所示(14)，融合蛋白scFv-MtbHsp70采用抗-MSLN p4scFv(17)的VH和VL与全长MtbHsp70融合，两者之间连接一个接头(G4S)3构建。以前的融合蛋白VIC-007明显控制了肿瘤生长，延长了肿瘤小鼠的生存时间，但是，这种治疗方案的抗肿瘤效果需要改善。通过非共价结合和基因融合与MtbHsp70连接的抗原肽可以引发MHC I类-限制CD8+和MHC II类-限制CD4+T-细胞反应(18-22)。在此研究中，研发了新的scFv-MtbHsp70融合蛋白VIC-008，该融合蛋白是通过删除VIC-007的冗余氨基酸，并引入单个氨基酸突变，在MtbHsp70的位置410以缬氨酸(V)替换苯丙氨酸(F)而修饰得到的(图1)。这种改变设计用于防止肽结合(23)，同时保留蛋白质的免疫刺激性，从而减少MtbHsp70偶然结合和输送其它导致脱靶效应或诱导耐受性或自身免疫性的抗原的可能性。
这种融合蛋白由药明康德(中国上海)在CHO细胞中构建和表达，HPLC测定的纯度超过95％，内毒素含量低于1.0EU/mg。
VIC-008增强肿瘤生长控制：如材料和方法一节所述的，在腹膜内(i.p.)注射同系癌细胞Luc-ID8到免疫活性C57BL/6小鼠体内引发鼠卵巢癌，并采用VIC-007和VIC-008对其进行治疗。如图2所示，正如与生理盐水相比的生物发光信号记录所示(p<0.0001和p<0.0001)，VIC-007和VIC-008都明显减慢了肿瘤生长，而与VIC-007(p<0.0001)相比，VIC-008进一步显著延迟了肿瘤生长。
VIC-008延长了小鼠生存时间：对VIC-007和VIC-008延长肿瘤小鼠生存时间的效果进一步进行了评估。如图3所示，与生理盐水相比，VIC-007和VIC-008都显著延长了肿瘤小鼠的生存时间(p＝0.0253和p＝0.0002)，采用生理盐水时的中值生存时间是55天，采用VIC-007时延长到60天，采用VIC-008时延长到65天。与VIC-007相比，VIC-008进一步显著延长了肿瘤小鼠的生存时间(p＝0.0301)。
总之，这些数据表明，新的融合蛋白VIC-008显著延迟了卵巢癌同系鼠模型的肿瘤生长，延长了生存时间。与VIC-007相比，采用VIC-008时小鼠的生存时间得到改善，这可能与蛋白质序列改变有关。该研究为间皮素靶向免疫活化融合蛋白作为卵巢癌治疗剂使用提供了明确的临床前验证。
参考文献
1.Siegel R，DeSantis C，Virgo K，Stein K，Mariotto A，Smith T，et al.Cancertreatment and survivorship statistics，2012.CA：a cancer journal forclinicians.2012；62(4)：220-41.Epub 2012/06/16.
2.Bast RC，Jr.，Hennessy B，Mills GB.The biology of ovarian cancer：newopporumities for translation.Nature reviews Cancer.2009；9(6)：415-28.Epub2009/05/23.
3.Mantia-Smaldone GM，Corr B，Chu CS.Immunotherapy in ovarian cancer.Humanvaccines&immunotherapeutics.2012；8(9)：1179-91.Epub 2012/08/22.
4.Hassan R，Cohen SJ，Phillips M，Pastan I，Sharon E，Kelly RJ，et al.Phase Iclinical trial of the chimeric anti-mesothelin monoclonal antibody MORAb-009in parients with mesothelin-expressing cancers.Clinical cancer research：anofficial journal of the American Association for Cancer Research.2010；16(24)：6132-8.Epub 2010/11/03.
5.Hassan R，Ho M.Mesothelin targeted cancer immunotherapy.Eur JCancer.2008；44(1)：46-53.Epub 2007/10/20.
6.Kreitman RJ，Hassan R，Fitzgerald DJ，Pastan I.Phase I trial of continuousinfusion anti-mesothelin recombinant immunotoxin SS1P.Clinical cancerresearch：an official journal of the American Association for CancerResearch.2009；15(16)：5274-9.Epub 2009/08/13.
7.Chang K，Pastan I.Molecular cloning of mesothelin，a differentiationantigen present on mesothelium，mesotheliomas，and ovarian cancers.Proceedingsof the National Academy of Scieuces of the United States of America.1996；93(1)：136-40.Eoub 1996/01/09.
8.Argani P，Iacobuzio-Donahue C，Ryu B，Rosty C，Goggins M，Wilentz RE，etal.Mesothelin is overexpressed in the vast majority of ductal adenocarcinomasof the pancreas：identification of a new pancreatic cancer marker by serialanalysis of gene expression(SAGE).Clinical cancer research：an officialjournal of the American Association for Cancer Research.2001；7(12)：3862-8.Epub 2001/12/26.
9.Ho M，Bera TK，Willingham MC，Onda M，Hassan R，FitzGerald D，etal.Mesothelin expression in human lung cancer.Clinical cancer research：anofficial journal of the American Association for Cancer Research.2007；13(5)：1571-5.Epub2007/03/03.
10.Tang Z，Qian M，Ho M.The role of mesothelin in tumor progression andtargeted therapy.Anti-cancer agents in medicinal chemistry.2013；13(2)：276-80.Epub2012/06/23.
11.Floto RA，MacAry PA，Boname JM，Mien TS，Kampmann B，Hair JR，etal.Dendritic cell stimulation by mycobacterial Hsp70is mediated throughCCR5.Science.2006；314(5798)：454-8.Epub 2006/10/21.
12.Wang Y，Kelly CG，Karttunen JT，Whittall T，Lehner PJ，Duncan L，etal.CD40is a cellular receptor mediating mycobacterial heat shock protein 70stimulation of CC-chemokines.Immunity.2001；15(6)：971-83.Epub 2002/01/05.
13.Baggiolini M.Chemokines and leukocyte traffic.Nature.1998；392(6676)：565-8.Epub 1998/04/29.
14.Yuan J，Kashiwagi S，Reeves P，Nezivar J，Yang Y，Arrifin NH，et al.A novelmycobacterial Hsp70-containing fusion protein targeting mesothelin augmentsantitumor immunity and prolongs survival in murine models of ovarian cancerand mesothelioma.Journal of hematology&oncology.2014；7：15.Epub 2014/02/26.
15.Roby KF，Taylor CC，Sweetwood JP，Cheng Y，Pace JL，Tawfik O，etal.Development of a syngeneic mouse model for events related to ovariancancer.Carcinogenesis.2000；21(4)：585-91.Epub 2000/04/07.
16.RighiE，Kashiwagi S，Yuan J，Santosuosso M，Leblanc P，Ingraham R，etal.CXCL12/CXCR4 blockade induces multimodal antitumor effects that prolongsurvival in an immunocompetent mouse model of ovarian cancer.Cancerresearch.2011；71(16)：5522-34.Epub 2011/07/12.
17.Bergan L，Gross JA，Nevin B，Urban N，Scholler N.Development and in vitrovalidation of anti-mesothelin biobodies that prevent CA125/Mesothelin-dependent cell attachment.Cancer letters.2007；255(2)：263-74.Epub 2007/06/15.
18.Udono H，Srivastava PK.Heat shock protein 70-associated peptides elicitspecific cancer immunity.The Journal of experimental medicine.1993；178(4)：1391-6.Epub 1993/10/01.
19.Suto R，Srivastava PK.A mechanism for the specific immunogenicity ofheat shock protein-chaperoned peptides.Science.1995；269(5230)：1585-8.Epub1995/09/15.
20.Suzue K，Young RA.Adjuvant-free hsp70 fusion protein system elicitshumoral and cellular immune responses to HIV-1p24.J Immunol.1996；156(2)：873-9.EPub 1996/01/15.
21.Huang Q，Richmond JF，Suzue K，Eisen HN，Young RA.In vivo cytotoxicTlymphocyte elicitation by mycobacterial heat shock protein 70fusion proteinsmaps to a discrete domain and is CD4(+)T cell independent.The Journal ofexperimental medicine.2000；191(2)：403-8.Epub 2000/01/19.
22.Ciupitu A-MT，Petersson M，O′Donnell CL，Williams K，Jindal S，Kiessling R，et al.Immunization with a Lymphocytic Choriomeningitis Virus Peptide Mixedwith Heat Shock Protein 70Results in Protective Antiviral Immunity andSpecific Cytotoxic T Lymphocytes.The Journal of experimental medicine.1998；187(5)：685-91.
23.MacAry PA，Javid B，Floto RA，Smith KG，Oehlmann W，Singh M，etal.HSP70peptide binding mutants separate antigen delivery from dendritic cellstimulation.Immunity.2004；20(1)：95-106.Epub 2004/01/24.
实例2VIC-008的其它研究
经腹膜内向C57BL/6小鼠注射5x 106个荧光素酶表达ID8小鼠卵巢癌细胞。肿瘤接种一周后，小鼠接受每周一次VIC-008(20μg)治疗，共接受4次治疗。结果如图4所示。生存曲线如图5所示。
生理盐水或VIC-008第4次治疗和最后一次治疗2周后，采集肿瘤标本。采集肿瘤组织，并采用流式细胞术测得免疫表型以检测CD3+CD8+T细胞。结果如图6所示。
CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞采用流式细胞术检测。T调节细胞以其占所有CD3+CD4+细胞的百分数计数。结果如图7所示。
图8示出了肿瘤内CD8+T细胞和T调节细胞之比。CD3+CD8+T细胞和CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞采用流式细胞术检测。按其占观察数的百分数计算比例。
图9示出了瘤内中央记忆性CD8+T细胞浸润。采用流式细胞术检测CD8+CD44+CD27+中央记忆性T细胞。CD8+中央记忆性T细胞以其占所有CD3+CD8+细胞的百分数计数。
上述说明是为了阐明本发明，不应视为限制本发明。本发明由下述权利要求定义，与所述权利要求相当的内容也包括在本发明中。

Claims (57)

1.一种融合蛋白，包含与200个以下氨基酸的结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断在读框内融合的抗原结合域，其中所述HSP70片段包含最小HSP70序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述HSP70片段由最小HSP70序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述最小HSP70序列是结核分枝杆菌HSP70的氨基酸残基368-495(SEQ ID NO:1)。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列(克隆#1)。
5.根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其中所述HSP70片段包含修饰CD94区。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述修饰CD94区由选自下述序列的氨基酸序列组成：
AAHNNLLGSFELTG(SEQ ID NO:16)；
AAHNNLLGRFELTG(SEQ ID NO:17)；
AAHNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:18)；
TKENNLLGRFELSG(SEQ ID NO:19)；或
TRDNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:20)。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述修饰CD94区由氨基酸序列TKENNLLGRFELSG(SEQ ID NO:19)组成。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(克隆#2)。
9.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述修饰CD94区由氨基酸序列TKDNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:20)组成。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，包含与SEQ ID NO:7(克隆#5)至少90％相同的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10任一项所述的融合蛋白，进一步包含修饰V410F(根据SEQ IDNO:1编号)。
12.根据权利要求1-11任一项所述的融合蛋白，进一步包含在抗原结合区和HSP70片段之间的接头。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述接头包含选自下述组的氨基酸序列：GGSSRSS(SEQ ID NO:21)、(GGGSGGG)4(SEQ ID NO:22)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)、GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:24)和GGSSESSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:25)。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述接头是GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ IDNO:24)。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(克隆#3)。
16.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述接头是GGSSESSSSGGGGSGGGG(SEQ IDNO:25)。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(克隆#4)。
18.一种融合蛋白，包含与至少100个氨基酸的结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断在读框内融合的抗原结合域，并包含不超过SEQ ID NO:1的氨基酸1-495。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，进一步包含一个或多个修饰(根据SEQ ID NO:1编号)：
a)R318A；
b)F176A；和
c)F410V。
20.根据权利要求18或19所述的融合蛋白，进一步包含修饰CD94区。
21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其中所述修饰CD94区由选自下述序列的氨基酸序列组成：
AAHNNLLGSFELTG(SEQ ID NO:16)；
AAHNNLLGRFELTG(SEQ ID NO:17)；
AAHNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:18)；
TKENNLLGRFELSG(SEQ ID NO:19)；或
TRDNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:20)。
22.根据权利要求18-21任一项所述的融合蛋白，进一步包含Treg区修饰，其中所述Treg区包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基141-155。
23.根据权利要求18-22任一项所述的融合蛋白，进一步包含接头。
24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述接头包含选自下述群组的氨基酸序列：GGSSRSS(SEQ ID NO:21)、(GGGSGGG)4(SEQ ID NO:22)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)、GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:24)和GGSSESSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:25)。
25.根据权利要求19所述的融合蛋白，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(克隆#6)。
26.根据权利要求19所述的融合蛋白，包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列(克隆#7)。
27.一种融合蛋白，包含与结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)片断在读框内融合的抗原结合域，所述结核分枝杆菌热休克蛋白70包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列(暂定序列)。
28.一种融合蛋白，包含与嵌合结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)在读框内融合的抗原结合域，其中所述嵌合HSP70包含人HSP70氨基酸序列骨架，其中大约氨基酸残基367至479(根据SEQ ID NO:29编号)的β-折叠域被结核分枝杆菌热休克蛋白70的大约氨基酸残基395至541(根据SEQ ID NO:1编号)的β-折叠域替换。
29.根据权利要求1-28任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合域是工程抗体或其片段。
30.根据权利要求1-29任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合域是scFv。
31.根据权利要求1-30任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合域与间皮素特异性结合。
32.根据权利要求1-31任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合域是与间皮素特异性结合的scFv。
33.根据权利要求32所述的融合蛋白，其中所述scFv包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
34.根据权利要求1-33任一项所述的融合蛋白，进一步在N-端包含前导序列。
35.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述前导序列是植物前导序列。
36.一种药物组合物，包含有效量的权利要求1-35任一项所述的融合蛋白及药学上可接受的载体。
37.一种免疫原性组合物或疫苗，包含权利要求1-35任一项所述的融合蛋白。
38.一种试剂盒，包含权利要求1-35任一项所述的融合蛋白及其包装装置。
39.一种编码权利要求1-35任一项所述融合蛋白的分离核酸。
40.根据权利要求39所述的分离核酸，选自：
a)SEQ ID NOS:2、4、6、8或10中任一项的核苷酸序列；
b)与a)的核苷酸序列至少大约80％相同的核苷酸序列；
c)与(a)或(b)互补的核苷酸序列；
d)与(a)或(b)反向互补的核苷酸序列；或
e)(a)至(d)的任何组合。
41.根据权利要求39或40所述的分离核酸，所述分离核酸经密码子优化用于在宿主细胞中表达。
42.根据权利要求41所述的分离核酸，所述分离核酸经密码子优化用于在植物细胞中表达。
43.根据权利要求42所述的分离核酸，其中所述植物是本氏烟或烟草。
44.根据权利要求39-43任一项所述的分离核酸，所述分离核酸与启动子操作连接。
45.根据权利要求44所述的分离核酸，其中所述启动子是植物启动子。
46.一种表达载体，包含权利要求39-45任一项所述的分离核酸。
47.一种细胞，包含权利要求39-45任一项所述的分离核酸或权利要求46所述的表达载体。
48.根据权利要求47所述的细胞，所述细胞是植物细胞或细菌细胞。
49.根据权利要求48所述的细胞，所述细胞是选自本氏烟和烟草的植物细胞。
50.一种在受试者体内诱导针对抗原的免疫反应的方法，包括向受试者施用与抗原特异性结合的权利要求1-35任一项所述的融合蛋白，从而诱导免疫反应。
51.一种治疗有需要的受试者抗原相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的与抗原特异性结合的权利要求1-35任一项所述的融合蛋白，从而治疗疾病。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述抗原是疾病抗原。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗原是癌抗原。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述癌抗原是间皮素。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述疾病相关抗原是表达间皮素的癌症。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、脑膜瘤、神经胶质瘤、柔脑膜转移瘤、间皮瘤、子宫腺癌、恶性间皮瘤、胰腺癌或肺腺癌。
57.根据权利要求50-56任一项所述的方法，进一步包括向受试者施用其它活性剂。
CN201780029242.5A 2016-03-10 2017-03-10 带有修饰hsp70域的抗原结合融合蛋白 Pending CN109562154A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662306168P 2016-03-10 2016-03-10
US62/306,168 2016-03-10
PCT/US2017/021911 WO2017156461A2 (en) 2016-03-10 2017-03-10 Antigen-binding fusion proteins with modified hsp70 domains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109562154A true CN109562154A (zh) 2019-04-02

Family

ID=59787756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780029242.5A Pending CN109562154A (zh) 2016-03-10 2017-03-10 带有修饰hsp70域的抗原结合融合蛋白

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20170260286A1 (zh)
EP (1) EP3426289A4 (zh)
JP (1) JP2019511246A (zh)
CN (1) CN109562154A (zh)
AU (1) AU2017229991A1 (zh)
CA (1) CA3017356A1 (zh)
IL (1) IL261681A (zh)
MX (1) MX2018010961A (zh)
WO (1) WO2017156461A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111848819A (zh) * 2020-07-31 2020-10-30 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向msln的嵌合抗原受体及其应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019534249A (ja) * 2016-09-09 2019-11-28 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 癌の治療のための抗化学忌避剤とのｈｓｐ融合タンパク質
US11364264B2 (en) 2016-09-09 2022-06-21 The General Hospital Corporation Ex vivo antigen-presenting cells or activated CD-positive T cells for treatment of cancer
MX2019011324A (es) 2017-03-23 2020-01-21 Massachusetts Gen Hospital Bloqueo de cxcr4/cxcr7 y tratamiento de enfermedad asociada con el virus del papiloma humano.
CN109504698B (zh) * 2017-09-15 2023-10-03 上海恒润达生生物科技股份有限公司 一种靶向全人源化mesothelin的嵌合抗原受体的方法和用途
US20210348194A1 (en) * 2018-10-05 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040063173A1 (en) * 2000-09-13 2004-04-01 Gabriele Multhoff Hsp70 peptide stimulating natural killer (nk) cell activity and uses thereof
US20060264609A1 (en) * 2001-10-03 2006-11-23 Thomas Lehner Use of heat shock proteins
US20090068184A1 (en) * 2006-02-02 2009-03-12 The General Hospital Corporation Engineered Antibody-Stress Protein Fusions
US20090155269A1 (en) * 2006-02-02 2009-06-18 Boston Biocom Llc Mesothelin antibody protein fusions and methods of use

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK0671948T3 (da) 1992-06-25 1997-09-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparat indeholdende adjuvanser
US5951988A (en) 1993-03-30 1999-09-14 University Of Saskatchewan Adjuvant formulation with enhanced immunogenic activity, and related compositions and methods
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1996002555A1 (en) 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
IL123219A0 (en) 1995-08-18 1998-09-24 Sloan Kettering Inst Cancer Method for treatment of cancer and infectious diseases and compositions useful in same
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US7084256B2 (en) * 1999-09-24 2006-08-01 Large Scale Biology Corporation Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers
US6734173B1 (en) * 1999-10-20 2004-05-11 Johns Hopkins University HSP DNA vaccines
CA2396384A1 (en) * 2000-01-14 2001-07-19 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo ctl elicitation by heat shock protein fusion proteins maps to a discrete atp binding domain and is cd4+ t cell-independent
ES2276735T3 (es) 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
US20090162405A1 (en) * 2006-12-14 2009-06-25 Yong Qian Proteinase-engineered cancer vaccine induces immune responses to prevent cancer and to systemically kill cancer cells
WO2007054658A1 (en) * 2005-11-14 2007-05-18 King's College London Control of immune responses
US7932055B2 (en) * 2006-06-22 2011-04-26 Novo Nordisk A/S Soluble heterodimeric CD94/NKG2 receptors fusion proteins
US7795411B2 (en) * 2006-10-05 2010-09-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Vectors for expressing in vivo biotinylated recombinant proteins
US9272002B2 (en) * 2011-10-28 2016-03-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
CN105481985A (zh) * 2016-01-11 2016-04-13 王小平 一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040063173A1 (en) * 2000-09-13 2004-04-01 Gabriele Multhoff Hsp70 peptide stimulating natural killer (nk) cell activity and uses thereof
US20060264609A1 (en) * 2001-10-03 2006-11-23 Thomas Lehner Use of heat shock proteins
US20090068184A1 (en) * 2006-02-02 2009-03-12 The General Hospital Corporation Engineered Antibody-Stress Protein Fusions
US20090155269A1 (en) * 2006-02-02 2009-06-18 Boston Biocom Llc Mesothelin antibody protein fusions and methods of use
US20120134992A1 (en) * 2007-02-02 2012-05-31 Boston Biocom Llc Mesothelin antibody protein fusions and methods of use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANPING YUAN ET AL.: ""A novel mycobacterial Hsp70-containing fusion protein targeting mesothelin augments antitumor immunity and prolongs survival in murine models of ovarian cancer and mesothelioma"", 《JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY》 *
PAUL A. MACARY ET AL.: ""HSP70 Peptide Binding Mutants Separate Antigen Delivery from Dendritic Cell Stimulation"", 《IMMUNITY》 *
YUFEI WANG ET AL.: ""Identification of Stimulating and Inhibitory Epitopes within the Heat Shock Protein 70 Molecule That Modulate Cytokine Production and Maturation of Dendritic Cells"", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111848819A (zh) * 2020-07-31 2020-10-30 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向msln的嵌合抗原受体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017156461A3 (en) 2017-10-05
US20200095332A1 (en) 2020-03-26
EP3426289A4 (en) 2019-08-07
CA3017356A1 (en) 2017-09-14
EP3426289A2 (en) 2019-01-16
US11718683B2 (en) 2023-08-08
MX2018010961A (es) 2019-03-28
US20170260286A1 (en) 2017-09-14
WO2017156461A2 (en) 2017-09-14
IL261681A (en) 2018-10-31
AU2017229991A1 (en) 2018-10-04
JP2019511246A (ja) 2019-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109562154A (zh) 带有修饰hsp70域的抗原结合融合蛋白
ES2949342T3 (es) Receptores de células T y usos de los mismos
EP1379552B2 (en) Toll-like receptor 5 ligands and methods of use
CN102065880B (zh) 使用自我装配疫苗的免疫治疗
US8703146B2 (en) Toll-like receptor 5 ligands and methods of use
US8968720B2 (en) Heat shock protein GP96 vaccination and methods of using same
CN108137673A (zh) 抗原受体及其用途
JP2011518186A5 (zh)
AU2018383708A1 (en) Peptide immunogens of IL-31 and formulations thereof for the treatment and/or prevention of atopic dermatitis
EP3833387A1 (en) Compositions and methods for preventing and treating virus infection
CN112203681A (zh) 疫苗组合物及其用途
US20220273780A1 (en) Self-assembled vaccines and combination therapies for treating cancer
Donayre-Torres et al. Production and purification of immunologically active core protein p24 from HIV-1 fused to ricin toxin B subunit in E. coli
WO2022100585A1 (zh) 抗Her-2抗体-趋化因子融合蛋白及其制法和应用
US20240082387A1 (en) Fusion protein comprising coronavirus-derived receptor-binding domain and nucleocapsid protein, and use thereof
CN109504697A (zh) 一种靶向人源化mesothelin的嵌合抗原受体的方法和用途
WO2023241391A1 (zh) 一种结合ssx2抗原的tcr分子及其应用
WO2024018062A1 (en) Immunoconjugate
CN109069574A (zh) 用于治疗黑色素瘤的方法和组合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190402