DK175581B1 - Modulær samling af antistofgener - Google Patents

Description

DK 175581 B1

Den foreliggende opfindelse angår DNA-rekombineringsmetoder til fremstilling af immun ogl obul iner, genetiske sekvenser, som koder derfor, såvel som metoder til opnåelse af sådanne sekvenser.

5 Anvendelsen af celle-til-celle-fusion til fremstilling af monoklone antistoffer af Kohier og Milstein (Nature (London) 256: 495,1975) har affødt en revolution inden for biologi som i betydning svarer til opfindelsen af rekombinant DNA-kloning. Monoklone antistoffer fremstillet ud fra hybridomaer er allerede anvendt i stor udstrækning inden for kliniske diagnoser og grundlæggende videnskabelige undersøgelser. Anvendelse af 10 humane B-celle-hybridoma-ffemstillede monoklone antistoffer er meget lovende til den kliniske behandling af cancer, virale og mikrobielle infektioner, B-celle-immunodefek-ter med formindsket antistofproduktion og andre sygdomme og forstyrrelser i immunsystemet.

15 Desværre er udbytter af monoklone antistoffer ud fra humane hybridomacellelinier relativt lave (1 gg/ml i human x human sammenlignet med 100 gg/ml i musehybrido-maer) og fremstillingsomkostninger er høje for antistoffer, som er fremstillet i humane vævskulturer i stor målestok. Muse x muse-hybridomaer er på den anden side egnede, da de fremstiller rigelige mængder protein, og disse cellelinier er mere stabile end de 20 humane linier. Gentagne injektioner af "fremmede" antistoffer, såsom et museantistof, hos mennesker kan imidlertid føre til skadelige hypersensivitetsreaktioner.

Der har derfor nyligt været udforskning af muligheden af at fremstille antistoffer, som har de fordele, som monoklone antistoffer fra muse-muse-hybridomaer har og dog de 25 artsspecifikke egenskaber som humane monoklone antistoffer har.

Et andet problem som møder immunologer er, at de fleste humane monoklone antistoffer (dvs. antistoffer, som har humane genkendelsesegenskaber), der opnås i cellekultur, er af IgM-typen. Når det er ønskeligt at opnå humane monoklone antistoffer af 30 IgG-typen har det imidlertid været nødvendigt at anvende sådanne teknikker som cellesortering for at adskille de fa celler, som har skiftet til fremstilling af antistoffer af DK 175581 B1 2

IgG-typen eller anden type fra størstedelen som fremstiller antistoffer af IgM-typen.

Der eksisterer derfor et behov for en mere tilgængelig metode til at skifte antistofklasser for et hvilket som helst givet antistof med en i forvejen bestemt eller ønsket antigenspecificitet.

5

Den foreliggende opfindelse bygger bro mellem hybridomateknologi og monoklon an-tislofteknologi, og anviser en hurtig og effektiv fremgangsmåde såvel som produkter hidrørende derfra til forbedret fremstilling af kimære humane/ikke-humane-antistoffer eller til "klasseskiftede” antistoffer.

10

Tilnærmelser til problemet med fremstilling af kimære antistoffer er blevet beskrevet af forskellige forfattere.

S. L. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6851- 6855 (November 1984), 15 beskriver fremstillingen af et muse/humanantistof-molekyle, som har defineret antigenbindingsspecificitet, og som er fremstillet ved at forene de variable regiongener fra en museantistoffremstillende myelomacellelinie med kendt antigenbindingsspecificitet til humane konstante immunoglobulinregiongener under anvendelse af rekombinant DNA-teknik. Der blev konstrueret kimære gener, hvor den tunge kædes variable regio-20 nexon fra myelomacellelinien S107 forbandt sig godt til humane IgGl- eller IgG2-tun-ge kæders konstante regionexoner, og den lette kædes variable regionexon fra den samme myelomacelle til den humane kappas lette kædeexon. Disse gener blev transficeret ind i musemyelomacellelinier, og transformerede celler, som fremstillede kimære muse-humane antiphosphocholinantistoffer, blev således udviklet.

25 S. L. Morrison et al., EP publikation nr. 173494 (publiceret 5. marts 1986), omhandler kimære "receptorer" (f.eks. antistoffer) med variable regioner hidrørende fra en art og konstante regioner hidrørende fra en anden. Der nævnes anvendelse af cDNA-kloning til konstruktion af generne, selvom der ikke anføres detaljer med hensyn til cDNA-klo-30 ning eller priming (se side 5, 7 og 8).

3 DK 175581 B1 G. L. Boulianne et al., Nature, 312: 643 (13. december 1984) fremstillede også antistoffer bestående af variable museregioner forbundet til konstante humane regioner. De konstruerede immunoglobulingener, hvori DNA-segmenteme, som koder for muse-variable regioner, som er specifikke for haptenet trinitrophenyl (TNP) blev forbundet til 5 segmenter, som koder for humane konstante mu- og kapparegioner. Disse kimære gener blev udtrykt som funktionelt TNP-bindende kimært IgM.

Se Munro, Nature, 312: 597 (13. december 1984), Dickson, Genetic Engineering News, 5, nr. 3 (marts 1985), eller Marx, Science, 229: 455 (august 1985) for en kommentar til 10 arbejdet udført af Boulianne et al. og Morrison et al.

M.S. Neuberger et al., Nature, 314: 268 (25. marts 1986) konstruerede også et kimært tungt kædeimmunoglobulingen, hvori et DNA-segment, som koder for en muse-variabel region, der er specifik for haptenet 4-hydroxy-3-nitrophenacetyl (NP) blev forbun-15 det til et segment, som koder for den humane epsilonregion. Når dette kimære gen blev transficeret ind i J558L-cellelinien, blev der fremstillet et antistof, som bandt til NP-haptenet og havde humane IgE-egenskaber.

M.S. Neuberger et al. har også publiceret arbejde, som viser fremstillingen af cellelini-20 er, der secernerer hapten-specifikke antistoffer, hvori Fc-delen er blevet erstattet enten med en aktiv enzymdel (G. Williams og M.S. Neuberger, Gene 43:319, 1986) og med et polypeptid, som har c-myc-antigene determinanter (Nature, 312:604, 1984).

M. Neuberger et al., PCT publikation WO 86/01533 (publiceret 13. marts 1986) beskri-25 ver også fremstilling af kimære antistoffer (se side 5) og foreslår blandt teknikkens mange anvendelser begrebet "klasseskift" (se side 6).

M. Taniguchi i europæisk patentpublikation nr. 171.496 (publiceret 19. februar 1985) beskriver fremstilling af variable antistoffer med variable regioner med tumorspecifici-30 tet hidrørende fra forsøgsdyr og konstante regioner hidrørende fra mennesker. De til- DK 175581 B1 4 svarende tunge og lette kædegener fremstilles i den genome form og udtrykkes i mam-male celler.

S. Takeda et al., Nature, 314: 452 (4. april 1985) har beskrevet en potentiel metode til 5 konstruktion af kimære immunoglobulingener, som har inkonsekvenser fjernet ved anvendelsen af en retrovirusvektor. Et uventet spl ej sedon orsted forårsagede imidlertid deletionen af V-regionledersekvensen. Dette forsøg gav derfor ikke fuldstændige kimære antistofmolekyler.

10 S. Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 3273-3277 (juni 1984) beskriver plasmider, som dirigerer syntesen i E. coli af tunge kæder og/eller lette kæder af antistof mod carcinoembryonantigen (CEA). Der blev konstrueret et andet plasmid til ekspression af en afkortet form af tung kæde-(Fd’)-ffagment i E. coli. Funktionel CEA-bindingsaktivitet blev opnået ved in vitro-rekonstitution i E. coli-ekstrakter af en 15 del af den tunge kæde med let kæde.

S. Cabilly et al. beskriver i europæisk patentansøgning 125023 (publiceret 14. november 1984) kimære immunoglobulingener og deres formodede produkter såvel som andre modificerede former. På siderne 21, 28 og 33 diskuteres cDNA-kloning og -pri-20 ming.

M. A. Boss, europæisk patentansøgning 120694 (publiceret 3. oktober 1984) viser ekspression i E. coli af ikke-kimære immunoglobulinkæder med 4-nitrophenylspecificitet.

Der er en bred beskrivelse af kimære antistoffer men ingen detaljer (se side 9).

25 C.R. Wood et al., Nature, 314: 446 (april 1985) beskriver plasmider, som dirigerer syntesen af museantistofproteiner mod NP i gær. Tung mu-kædeantistofproteiner viste sig at blive glycosyleret i gærcellerne. Når både tunge og lette kæder blev syntetiseret i den samme celle, blev noget af proteinet samlet til funktionelle antistofmolekyler, som 30 påvist ved anti-NP-bindingsaktivitet i opløseligt protein fremstillet ud fra gær-celler.

5 DK 175581 B1 A. Alexander et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79: 3260-3264 (1982), beskriver fremstillingen af en cDNA-sekvens, som koder for en abnormt kort human Ig-gamma-tung kæde (OMM gamma3 HCD serumprotein) indeholdende en 19-aminosyreleder efterfulgt af de første 15 rester af V-regionen. En omfattende indre deletion fjerner resten af 5 V-regionen og hele CH1-området Dette er cDNA, som koder for et indre deleteret molekyle.

T. W. Dolby et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77: 6027-6031 (1980) beskriver fremstillingen af en cDNA-sekvens og rekombinerede plasmider indeholdende den samme 10 kodning for humane mu- og kappa-immunoglobulinpolypeptider. En af de rekombinerede DNA-molekyler indeholdt codoner for en del af CH3-konstant-regionområdet og hele 3'-ikke-kodningssekvensen.

M. Seno et al., Nucleic Acids Research, 11: 719-726 (1983), beskriver fremstillingen af 15 en cDNA-sekvens og rekombinerede plasmider indeholdende den samme kodning for en del af den variable region og hele den konstante region i den humane tunge IgE-kæ-de (epsilon-kæde).

T. Kurokawa et al., ibid, 11: 3077-3085 (1983), viser konstruktionen under anvendelse 20 af cDNA af tre ekspressionsplasmider, som koder for den konstante del af den humane tunge IgE-kæde.

F. T. Lieu et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 81: 5369-5373 (septemper 1984) beskriver fremstillingen af en cDNA-sekvens og rekombinerede plasmider indeholdende den 25 samme, som koder for ca. 2/3 af CH2- og hele CH3- og CH4-områdeme i human tung IgE-kæde.

Y. Tsujimoto et al., Nucleic Acids Res., 12: 8407-8414 (november 1984) beskriver fremstillingen af en human V-lambda-cDNA-sekvens fra en Ig-lambda-producerende 30 human Burkitt-lymfoma-cellelinie ved at udnytte et klonet konstant regiongen som en primer for cDNA-syntese.

DK 175581 B1 6 J. Murphy, PCT publikation WO 83/03971 (publiceret 24. november 1983) beskriver hybride proteiner, som er fremstillet af fragmenter omfattende et toksin og en cellespecifik ligand (som foreslås muligvis at være et antistof).

5

Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (november, 1985) opnåede ekspression af et human-muse-kimært immunoglobulingenomgen efter transficering ind i musemyelo-maceller.

10 P. T. Jones et al., Nature 321:552 (maj 1986) konstruerede og udtrykte en genomkon-struktion, hvor CDR-områder i variable regioner fra et monoklont museantistof blev anvendt til at erstatte de tilsvarende områder i et humant antistof.

L. K. Sun et al., Hybridoma 5 suppl. 1 SI7 (1986) beskriver et kimært humant/-15 muse-antistof med potentiel tumorspecificitet. De kimære tunge og lette kædegener er genome konstruktioner og udtrykkes i mammale celler.

Sahagan et al., J. Immun. 137:1066-1074 (august 1986) beskriver et kimært antistof med specificitet over for et humant tumorassocieret antigen, for hvilket generne er sam-20 let ud fra genome sekvenser.

For en nyere oversigt over området se også S.L. Morrison, Science 229: 1202-1207 (20. september, 1985) og V. T. Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986).

25 Oi et al.-beskrivelsen er relevant, da den anfører, at fremstillingen af kimære antistoffer ud fra cDNA-konstruktioner i gær og/eller bakterier ikke nødvendigvis er fordelagtig.

Se også kommentaren på side 835 i Biotechnology 4 (1986).

30 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt metode til fremstilling af genmanipulerede antistoffer med ønsket variabel regionspecificitet og konstant re- 7 DK 175581 B1 gion-egenskaber ved hjælp af genkloning og ekspression af lette og tunge kæder. De klonede immunoglobulingenprodukter kan fremstilles ved ekspression i genmanipulerede organismer.

5 Anvendelsen af kemisk gensyntese, rekombineret DNA-kloning og fremstilling af specifikke immunoglobulinkæder i forskellige organismer, giver en effektiv løsning til den effektive produktion af humane monoklone antistoffer i stor målestok.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af 10 et immunoglobulinmolekyle med tunge og lette kæder eller fragmenter deraf, som er forbundet således, at det overordnede molekyle udviser ønskede bindings- og genkendelsesegenskaber, idet fremgangsmåden omfatter (a) dyrkning af en transformeret eller transfekteret prokaryot vært under passende 15 betingelser, sådan at tungt kædeimmunoglobulin og let kædeimmunoglobulin el ler fragmenter deraf udtrykkes som et resultat af transskription af polynucleotid-sekvenser i værten, hvor polynucleotidsekvenseme koder for mindst én funktionelt virkende region af en variabel region af et antistof, og et prokaryot sekretionssignalpeptid, hvor den variable region under ekspression operabelt bindes 20 ved dens N-ende til et prokaryot sekretionssignalpeptid til muliggørelse af sekre tion fra værten; og (b) opnåelse af immunoglobulinkæden eller fragmentet af en immunoglobulin-kæde, som forud for sekretion fra værten oprindeligt var således bundet til signal- 25 peptidet i form af en immunoglobulinmolekyle med tunge og lette kæder eller fragmenter deraf, at det overordnede molekyle udviser de ønskede bindings- og genkendelsesegenskaber.

Opfindelsen kan anvendes til at tilvejebringe individuelle kimære immunoglo-30 bulinkæder såvel som fuldstændigt samlede molekyler og immunoglobulinffagmenter 8 DK 175581 B1 (såsom Fab) med humane konstante regioner og ikke-humane variable regioner, hvor begge variable regioner har den samme bindingsspecificitet

Blandt andre immunoglobulinkæder og/eller molekyler, som kan tilvejebringes ifølge 5 opfindelsen, er: (a) et fuldstændigt funktionelt immunoglobulinmolekyle omfattende: (i) to identiske kimære tunge kæder omfattende en ikke-human variabel region og en human konstant region, og l° (ii) to identiske helt (dvs. ikke-kimære) humane lette kæder, og (b) et fuldstændigt funktionelt immunoglobulinmolekyle omfattende: 15 (i) to identiske kimære tunge kæder omfattende en ikke-human variabel region og en human konstant region, og (ii) to identiske helt (dvs. ikke-kimære) ikke-humane lette kæder, og 20 (c) et monovalent antistof, dvs. et fuldstændigt funktionelt immunoglobulinmolekyle omfattende: (i) to identiske kimære tunge kæder omfattende en ikke-human variabel region og en human konstant region, og 25 (ii) to forskellige lette kæder, hvoraf kun en har den samme specificitet som den variable region i de tunge kæder. Det resulterende antistofmolekyle binder kun til en ende deraf og er derfor ude af stand til divalent binding, og 30 (d) et antistof med to forskellige specificiteter, dvs. et fuldstændigt funktionelt immunoglobulinmolekyle omfattende: 9 DK 175581 B1 (i) to forskellige kimære tunge kæder, hvoraf den første omfatter en ikke-human variabel region og en human konstant region, og den anden omfatter en forskellig ikke-human variabel region og en human konstant region, og 5 (ii) to forskellige kimære lette kæder, hvoraf den første omfatter en ikke-human variabel region med den samme specificitet som den første tunge kædes variable region og en human konstant region, og den anden omfatter en ikke-human variabel region med den samme specificitet som den anden tunge kædes variable 10 region og en human konstant region.

Det opnåede antistofmolekyle binder til to forskellige antigener.

Opfindelsen tilvejebringer også fremstillingen af funktionelt aktive kimære immuno-15 globulinffagmenter, som secerneres af prokaryote værter eller fuldstændigt foldede og gensamlede kimære immunoglobulinkæder.

Genetiske sekvenser, især cDNA-sekvenser, som koder for de førnævnte kombinationer af kimære kæder eller ikke-kimære kæder, tilvejebringes også heri.

20

Anvendelsen af cDNA-sekvenser er særlig fordelagtig sammenlignet med genome sekvenser (som indeholder introner) ved at cDNA-sekvenser kan udtrykkes i bakterier eller andre værter, som mangler RNA-splejsesystemer.

25 Blandt foretrukne specifikke antistoffer er sådanne, som har specificiteter for can-cer-beslægtede antigener.

Fig. 1 viser DNA-omordninger og ekspression af tunge immunoglobulin-my- og -gam-makædegener. Dette er en skematisk repræsentation af det humane tunge kædegenkom-30 pleks, som ikke er vist i målestok. Dannelse af tung kædes variable V-region forekommer ved foreningen af VH-, D- og JH-gensegmenter. Dette frembringer et aktivt mygen.

10 DK 175581 B1

En anden type DNA-omordning kaldet "klasseskiftning" omlokaliserer den forenede VH-, D- og JH-region fra den konstante my-C-region til en anden tung kæde-C-region (skift til gamma er vist her). Skemaet viser, at J-regionen er et fælles træk for alle udtrykte tunge kædegener. J-regionen er også et fælles træk for udtrykte lette 5 kædegener.

Fig. 2 viser den kendte nukleotidsekvens af humane J-regioner og muse-J-regioner. Consensussekvenser for J-regioneme er vist nedenfor, de faktiske sekvenser.

10 Oligonukleotidsekvensen under muse-kappa-J-region-consensussekvensen er et universalt immunoglobulingen (UIG)-oligonukleotid, som anvendes ifølge den foreliggende opfindelse.

Fig. 3 viser et skema, som viser anvendelsen af UIG-oligonukleotidprimeren for synte-15 sen af cDNA, som er komplementær til den variable region i immunoglobulinmessen-ger RNA eller anvendelsen af oligo-dT som en primer for cDNA-syntese efterfulgt af en in vitro-mutagenese.

Fig. 4 viser syntesen og analysen af humane IgGl-gener omfattende tre isolerede klo-20 ner (A.b), hvoraf en (pGMH-6) anvendes som en kloningsvektor (B). En 1,5 kb deletion af pBR322-sekvens mellem BamHI og PvuII er vist. Ikke i målestok.

Fig. 5 viser kloningsvektoren pQ23, en modificeret pBR322, som er egnet til cDNA-kloning ved KpnI-stedet. Denne vektor indeholder også de egnede 25 restriktionsenzymsteder Bglll samt Sall. Ikke i målestok.

Fig. 6 viser i A. syntesen og analysen af humane lette kappakædegener. Figuren viser også i B. (ikke i målestok) konstruktion af en human Ci<-region-kloningsvektor pING2001.

30

II

DK 175581 B1

Fig. 7 viser primere, som er udformet til immunoglobulin-V- regionsyntese. (A) viser de tunge kæde-J-C-regioner og primere. En DNA-version af hver muse-J-tung-region er vist direkte over primere udformet ud fra den sekvens. Muse-J-regioner er 5' til 3', venstre til højre, mens primere er 3' til 5', venstre til højre. Primemavne er vist i paren-5 tes, og antal nukleotider (N) og antallet af ikke matchende med hver JH-region er anført til højre. Primere som introducerer et BstEII-sted er understreget. (B) viser de lette kæde-J-regioner og primere. Det samme som for (A) bortset fra lette kæder. Primere udformet til at introducere et BgLII-sted er understreget som BclI-stedet til stede i pING2016E'er. (C) viser variable museregionconsensus UIG-primere. Den faktiske pri-10 mersekvens er vist under den consensussekvens. Den humane CK-Hindlll-vektor pGML60 er vist nedenfor. (D) viser en muse-gamma-2a-J/C-for- bindelsesprimer.

Fig. 8 viser syntesen af tunge kæde-V-regionmodulgener under anvendelse af oligonu-kleotidprimet cDNA-syntese. Ikke i målestok.

15

Fig. 9 viser konstruktionen af hybride muse/humane immunoglobulingener. Panel A viser konstruktion af et tungt kædegen. Stiplede regioner viser C-regionmoduler, mens skravede eller sorte regioner viser V-regionmoduler. Ikke i målestok.

20 Fig. 10 viser konstruktionen af cDNA-kloningsekspressionspendulvektorer for pattedyrsceller. Vektorerne pING2003 og pING2003E hidrører fra pLl, pUC12, pSV2-neo og M8-otRX12. Stiplede regioner viser muse-tung kæde-fremmer-DNA, skraverede regioner viser SV-40-DNA fra pLl og dobbeltskraverede regioner viser SV40-DNA fra pSV2-neo. I vektorerne pING2003 og pING2003E viser tykke linier pBR322-DNA fra 25 pSV2-neo, mens tynde linier viser pUC12-DNA. Pile viser lokaliseringer og retninger af SV-40-tidlig regionpromotorer og viser en fuldstændig SV-40-intronsekvens. Ikke i målestok.

Fig. 11 viser konstruktionen af det tunge kædeekspressionsplasmid pING2006E. Pile 30 viser SV-40-promotorlokaliseringer og retninger for transkription. Skraverede og sorte 12 DK 175581 B1 områder viser muse-V-regionmoduler, mens stiplede områder viser humane C-region-moduler. Ikke i målestok.

Fig. 12 viser strukturen af de kimære anti-hepatitis tunge kædegener i ekspressionsplas-5 miderne pENG2006E og pING2012E. Panel A viser strukturen af kimære muse/humane anti-hepatitis tunge kædegener. Strukturen af humant IgGl-mRNA og -cDNA er vist i A.a. Den humane tunge konstante kæderegion-cDNA-klon pGMH-6 og de muse-tunge variable kæderegion-cDNA-kloner pBS13-l og pJ3-l 1 blev anvendt til at fremstille det hybride gen anvendt i pING2006E. Skraverede genblokke viser musevariable regionse-10 kvenser, mens åbne genblokke viser humane konstante IgGl-regionsekvenser. Panel B viser nukleotidsekvensen af den anti-hepatitis B-tunge variable kæderegion i pING2006E og pING2012E. pING2012E blev konstrueret ved først at indsætte et Bglll-sted ved Sall-stedet i pING1202 (se fig. 16) til dannelse af pING1202BglII. Det kimære tunge kædegen fra dette plasmid blev indsat i ekspressionsvektoren 15 pING2003E, hvilket resulterede i pING2012E. pING2012E er forskellig fra pING2006E i regionen umiddelbart opstrøms for initiatoren ATG. Understregede nukleotider viser humane J-regionsekvenser fra cDNA-klonen pGMH-6. Med stjerne forsynet aminosyre 117 viser en enkelt ændring i dette sted mellem muse og human sekvens (Ala til Ser) indført i den kimære gen-J-region. Sekvensbestemmelse blev ud-20 ført efter Sangers metode på plas- midskabelon (åben cirkel) og M13-skabelon (lukket cirkel).

Fig. 13 viser i panel A J-C-forbindelsesregionnukleotidsekvensen i lette kædekloner hidrørende fra pING2001 (pMACK-3, pING2013E, pING2007E, pING2010E-gpt og 25 pING2014E-gpt). J-regionsekvensen, som stammer fra pK2-3, er markeret human JK4. G-nukleotidet, som ikke er forudsagt ved genom sekvensbestemmelse, er markeret med en stjerne. Den til modifikation af denne sekvens anvendte oligonukleotidprimer (K2-4BCLI) er vist under den humane JK4-sekvens. Panel B viser stedsrettet mutage-nesemetoden, som blev anvendt til at fremstille pING2016E-gpt. Ikke i målestok.

30 13 DK 175581 B1

Fig. 14. Genkopiantal af de transficerede sekvenser i to transformanter. nDNA fra 2AE9, 2BH10 blev fordøjet med de viste enzymer. Koncentrationen af DNA titreres ned over banerne med den mængde, som er anført over dem. Sonden indeholder humane C-gamma-1-sekvenser (pmvHc24 Apal-BamHI). Referencen er kim-linie eller 5 GM2146-nDNA fordøjet med Apal. 3'- Apal-stedet er 2 bp på den anden side af poly-(A)-addition (3).

Fig. 15 viser nukleotidsekvensen af V-regionen i L6-VH-cDNA- klonen pH3-6a. Sekvensen blev bestemt ved dideoxyafslutningsmetoden under anvendelse af M13-sub-10 kloner af genfragmenter (vist nedenfor). Åbne cirkler viser aminosyrerester bekræftet ved peptidsekvens. En sekvenshomolog med DSP.2 i CDR3-regionen er understreget.

Fig. 16 viser nukleotidsekvensen af V-regionen af L6-VK-cDNA- klonen pL3-12a. Den til stedsrettet mutagenese anvendte oligonukleotidprimer er vist under JK5-segmentet.

15 Åbne cirkler viser aminosyrerester bekræftet ved peptidsekvens.

Fig. 17 viser konstruktionen af kimære L6-VH samt humane C-gamma-1-ekspressi ons-plasmider. Panel (a) viser sekvenserne af BAL-31-deletionskloneme M13mpl9-Cl-del-ta 4 (Cl delta 4) og M13mpl9-Cl-delta 21(Cl-delta 21). S'-enden af cDNA-klonen 20 pH3-6a er vist med en pil. M13-sekvenser er understreget. Den til dette forsøg anvendte oligonukleotidprimer er H3-6a (5'- GACTGCACCAACTGG-3'), som primer i FRI nær den fuldt udviklede N-ende. Panel (b) viser strategien for stedsrettet mutagenese af 1 μg kloner Cl-delta 4 og Cl-delta 21, hver føjet sammen med 20 ng af 31-mer oligonu-kleotidet MJH2-ApaI. Komplementær strengsyntese med Klenow-fragmentet af 25 DNA-polymerase foregik ved stuetemperatur i 30 minutter, derefter 15°C i 72 timer. Transficerede fag-plaquer blev adsorberet på nitrocellulose fikseret med NaOH og hy-bridiseret til 32P-mærket MJH2-ApaI-oligonukleotid ved 65°C, 18 timer, i 4xTBS (0,6 M NaCl, 0,04 M Tris-HCl (pH-værdi 7,4), 0,004 M EDTA) plus 10% dextransulfat. Afsluttende vask af filtrene var ved 65 °C 4xSSPE, 0,1% SDS i 15 minutter (Maniatis, 30 T., et al., Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, 1982). Positive plaquer blev på vist ved udsættelse natten over for Kodak XAR-film og blev direkte udtaget for vækst 14 DK 175581 B1 og restriktionsenzymanalyse af RF DNA. Forkert matchede mellem MJH2-ApaI-oligo-nukleotidet og muse-CHl er vist, hvilket resulterede i kodningsændringeme, som er vist under oligonukleotidet. Panel (c) viser strategien for erstatningen af den residente VH i det kimære ekspressionsplasmid pING2012 med hver af de mutageniserede 5 L6-VH-moduler til dannelse af pING2111 og pING2112.

Fig. 18 viser konstruktionen af det kimære L6-ekspressions-plasmid pING2119. Sall-til -BamHI-ffagmentet fra pING2100 er identisk med Sall- til -BamHI-A-fragmentet fra pING2012E.

10

Fig. 19 viser modificeringen af VK-genet og dets brug ved konstruktion aflet kæde- og tung samt let kædeekspressionsplasmider.

(a) Deletion af oligo-d[GC]-segmentet 5' for VK i L6. Oligo- nukleotidet er en 22-mer 15 og indeholder et Sall-sted. De 3 forkert matchede er vist. VK-genet, efter mutagenese, forbindes som et Sall-Hindlll-fragment til det humane C-K-modul. Det således dannede ekspressionsplasmid er pING2119.

(b) pING2114, et tungt samt let kædeekspressionspiasmid. Ekspressionsplasmidet 20 pfNG2114 indeholder det tunge kimære L6-kædegen fra pING2111 og den kimære lette kæde fra pING2114 (fremhævet linie).

Fig. 20 viser en opsummering af de sekvensændringer, som er lavet i konstruktionen i de kimære L6-antistofekspressionsplasmider. Understregede rester i den 25 5'-ikke-translaterede region hidrører fra de klonede muse-kappa- og tung-kæde-gener.

Rester med cirkel omkring i V/C-grænsen er et resultat af mutageneseoperation til dannelse af restriktionsenzymsteder i denne region. Rester vist med små cirkler over dem i tung kæde L6-kimæren er også et resultat af mutagenese. De er stille ændringer.

15 DK 175581 B1

Fig. 21 viser 2H7 VH-sekvensen. VH-genet indeholder JH1-sekvenser og DSP.2-sekvenselementer. Små cirkler over aminosyrerester er de, som matcher peptidsekvenser.

5 Fig. 22 viser 2H7 VL-sekvensen. VK-genet indeholder JK5-sekvenser. Et 22-mer oligonukleotid blev anvendt til at anbringe et Sall-sted 5' for ATG-initiatorcodonet.

Små cirkler over aminosyreresteme er de, som matcher peptidsekvenser.

Fig. 23 viser de kimære immunoglobulingenekspressionsplasmider med 10 2H7-specificiteten. Et gen-plasmider er pING2l01 (VH,neo), pING2106 (VK,neo) og pING2107 (VK, gpt). De andre er to-genplasmider. Deres konstruktion involverede ligeringen af de større Ndel-ffagmenter af pING2101 og pING2107 til liniariseret pING2106 delvis fordøjet med Ndel. pHL2-l 1 og pHL2-26 blev opnået fra pING2101 og pING2106, pLL2-25 blev opnået frapING2107 og pING2106.

15

Fig. 24 viser en opsummering af nukleotidændringer, som er indført i VH og VK i konstruktionen af de kimære plasmider. De samhørende VH- og VK-nukleotidrester i 5'-enden er under- stregede. Cirkel-rester i J-C-forbindelsesleddene hidrører fra de humane C-moduler.

20

Fig. 25 viser den anvendte strategi til sammenslutning af den fuldt udviklede L6-kimære lette kædesekvens til gærinvertase signalsekvensen og afkortet PGK-promotor. Den åbne dobbeltlinie repræsenterer gærinvertasesignalsekvens-DNA.

Den udfyldte dobbeltlinie repræsenterer gær-PGK-DNA; -> repræsenterer 25 PGK-promotoren; - | repræsenterer PGK-terminatoren; RF = replikativ form.

pING1225 blev udledt ved at sammenslutte human CK-DNA til PGK-promotoren. pING1149 blev udledt ved at sammenslutte gærinvertasesignalsekvensen til gær-PGK-promotoren. (A) viser strategien for introduktion ved in vitro-mutagenese af et Aatll-sted i signalsekvensprocesstedet. (B) viser DNA-sekvensen af den 30 enkeltstrengede mutageneseprimer og den tilsvarende ikke-mutageniserede DNA-sekvens. (C) viser den strategi, som blev anvendt til at konstruere et plasmid 16 DK 175581 B1 indeholdende den fuldt udviklede lette kædesekvens sammensluttet med invertase-signalsekvensen og afkortet PGK-promotor.

Fig. 26 viser den strategi, som blev anvendt til sammenslutte den fuldt udviklede L6 5 kimære tunge kædesekvens med gærinvertasesignalsekvensen og afkortet PGK-promotor. pING1288 indeholder det kimære tunge kædegen sammen med den variable region fra det muse-monoklone 2H7 antistof (se eksempel IV). Alle symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 25. (A) viser strategien for introduktion ved in vitro-mutagenese af et Sstl-sted i signalsekvensprocesstedet. (B) viser DNA-sekvensen 10 af den enkeltstrengede mutageneseprimer og den tilsvarende ikke-mutageniserede DNA-sekvens. (C) viser den anvendte strategi til konstruktion af et plasmid indeholdende den fuldt udviklede tunge kædesekvens sammensluttet med invertasesignalsekvensen og afkortet PGK-promotor.

15 Fig. 27 viser den anvendte strategi til fjernelse af ikke-gær 3'-ikke-translaterede DNA-sekvenser fra det L6-kimære lette kædegen og til konstruktion af et plasmid indeholdende det lette kædegen sammensluttet med invertasesignalsekvensen og afkortet PGK-promotor, hvori alle sekvenser enten er kendt ved DNA-sekvensanalyse eller har vist sig at være funktionelle. pBR322NA hidrører fra pBR322 ved deletion af 20 DNA fra Ndel til Aual. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 25.

Fig. 28 viser den anvendte strategi til fjernelse af ikke-gær 3'-ikke-translateret DNA-sekvens fra det L6-kimære tunge kædegen og konstruktion af et plasmid indeholdende det tunge kædegen sammensluttet med invertasesignalsekvensen og 25 afkortet PGK-promotor, hvori alle sekvenser enten er kendt ved DNA-sekvensanalyse eller har vist sig at være funktionelle. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig.

25.

Fig. 29 viser den anvendte strategi til kloning af det L6-kimære lette kædegen 30 sammensluttet med invertasesignalsekvensen og afkortet PGK-promotor i gær-E, coli-pendulvektorer indeholdende GK-transkriptionsafslutnings-polyadenyleringssig- 17 DK 175581 B1 nal, gærreplikationssekvenser og gener til udvælgelse af transformanter. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 25.

Fig. 30 viser den anvendte strategi til kloning af det L6-kimære tunge kædegen 5 sammensluttet med invertasesignalsekvensen og afkortet PGK-promotor i gær-E. coli-pendulvektorer indeholdende PGK-transkriptionsafslutnings-polyadenyleringssig-nalet, gærreplikeringssekvenser og gener til udvælgelse af transformanter. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 25.

10 Fig. 31 viser et skematisk diagram af strukturen af human IgGl.

Fig. 32(A) viser den anvendte strategi til indførsel af et stopcodon og BclI-sted i "hængselregionen" i human gamma 1. (B) viser DNA-sekvensen af den enkeltstrengede primer, som blev anvendt til in vitro-mutagenese af 15 gamma-1-hængselregionen og den tilsvarende ikke-mutageniserede sekvens. Lodrette pile repræsenterer inter-kædedisulfidbindinger. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 25.

Fig. 33 viser den anvendte strategi til sammenslutning af det L6-kimære tunge kædegen 20 indeholdende et stopcodon i hængselsregionen (Fd-kæde) med gærinvertasesig-nalsekvensen og afkortet PGK-promotor. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 25.

Fig. 34 viser den anvendte strategi til fjernelse af ikke-gær, 3'-ikke-translaterede 25 sekvenser fra den L6-kimære Fd-kæde og konstruktion af et plasmid indeholdende Fd-kæden sammensluttet med invertasesignalsekvensen og afkortet PGK-promotor, hvori alle sekvenser enten er kendt ved DNA-sekvensanalyse eller har vist sig funktionelle. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 25.

30 Fig. 35 viser den anvendte strategi til kloning af det L6-kimære Fd-kædegen sammensluttet med invertasesignalsekvensen og afkortet PGK-promotor i gær-E.

18 DK 175581 B1 coli-pendulvektorer indeholdende PGK-transkriptionsafslutning-polyadenyleringssig-nalet, gærreplikeringssekvens og gener til udvælgelse af transformanter. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 25.

5 Fig. 36(A) viser nukleotidsekvensen, som omgiver N-enden af Erwinia caratovora pelB-genet (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987, under trykning)). Ndel- og Haelll-stedeme, som anvendes ved kloning, er vist. Pilene viser lederpep ti dasekløv-ningsstedet for pectatlyase. (B) viser kloningsstrategien for konstruktion af pelB-lederkassetten. pSS1004 indeholder et 1,9 kb Dral-ffagment klonet ind i 10 Smal-stedet i pUC8. Symboler er som defineret i beskrivelsen af fig. 39.

Fig. 37 viser konstruktionen aflette kædeekspressionsplasmider pRR177-8, pRR180, pRR190 og pRR191. Udover de i teksten beskrevne plasmider blev M13mpl8 og pIT 181 anvendt. pITl 81 indeholder det fuldt udviklede lette kædegen sammensluttet 15 direkte efter ATG-initieringscodonet i araB-genet i pIT2 (se fig. 40).

Fig. 38 viser konstruktionen af Fd-ekspressionsplasmider pRR178-5, pRR.186 og pRR196.

20 Fig. 39 viser restriktionskortene for den lette kæde og Fd-genkassetten i pFKlOO, pFKlOl, pFK102, pFK103 og pFK104. Disse plasmider blev konstrueret som beskrevet i teksten under anvendelse af plasmider vist i fig. 37 og 38. Pilene viser retningen af transkription fra lac-promotoren. E. caratovora- og eukaryote ikke-kodende sekvenser er vist som åbne stænger. pelB-ledersekvensen er dobbeltskraveret, og den 25 udfyldte stang repræsenterer antistofgeneme Fd og lette kæde (K).

Fig. 40(A) viser konstruktionen af en vektor for arabinose inducerbar Fab-ekspressi on.

Plasmid plT2 (Mason and Ray, Nucl. Acids. Res. 14:5696 (1986)) er et 6431 bp plasmid, som koder for araC-genet, araB-promotoren og en del af araB-genet fra 30 pINGl (Johnston, S. et al., Gene 34 34:134 (1985)) i et derivat af pBR322. Et 19 DK 175581 B1

Ncol-sted er blevet dannet ved ATG-initieringscodonet i araB-gene. (B) viser introduktionen af lacigenet i pFK102.

Generelt er antistoffer sammensat af to lette og to tunge kædemolekyler. Lette og tunge 5 kæder er inddelt i områder med strukturel og funktionel homologi. De variable regioner i både lette (VL) og tunge (VH) kæder afgør genkendelse og specificitet. De konstante regionområder i lette (CL) og tunge (CH) kæder giver vigtige biologiske egenskaber, såsom antistofkædeassociering, sekretion, transplacental mobilitet, komplement binding og lignende.

10

En kompleks række af begivenheder fører til immunoglobulingenekspression i B-celler. V-regiongensekvenseme, som bibringer antigenspecificitet og binding, er anbragt i separate kimlinie-gensegmenter (eng: germ line gene segments) benævnt VH, D og JH; eller VL og JL. Disse gensegmenter er forbundet ved hjælp af 15 DNA-omordninger til dannelse af de fuldstændige V-regioner udtrykt i henholdsvis tunge og lette kæder (fig. 1), De omordnede forbundne (VL-JL og VH-D-JH) V-segmenter koder derefter for de fuldstændige variable regioner eller antigenbindingsområder hos henholdsvis lette og tunge kæder.

20 DEFINITIONER

Visse benævnelser og udtryk anvendes gennem hele beskrivelsen og kravene. De følgende definitioner anføres med det formål at skabe klarhed og overensstemmelse.

25 1. Ekspressionsvektor - et plasmid-DNA indeholdende nødvendige regulatoriske signaler for syntesen af mRNA hidrørende fra gensekvenser, som kan indsættes i vektoren.

2. Modulvektor - et plasmid-DNA indeholdende et konstant eller variabelt 30 region-genmodul.

20 DK 175581 B1 3. Ekspressionsplasmid - en ekspressionsvektor, som indeholder et indsat gen, såsom et kimært immunoglobulingen.

4. Genkloning - syntese af et gen, indsættelse i DNA-vektorer og identifikation ved 5 hybridisering eller lignende.

5. Transfektion - overførsel af DNA ind i mammale celler.

6. Promotorregion - en nukleotidsekvens, som giver en celle de nødvendige 10 regulatoriske sekvenser til at udtrykke et operabelt koblet cistron eller operon.

7. Sekretionssignal - et polypeptid, som er til stede ved N-enden af en kimær immunoglobulinkæde, som er egnet til at bidrage til sekretionen af kæden til det, der omgiver værten. Også kaldet "lederpeptid" eller "leder".

15

GENETISKE PROCESSER OG PRODUKTER

Opfindelsen tilvejebringer en hidtil ukendt måde til kloning og produktion af humane antistoffer med ønsket specificitet. Generelt forener fremgangsmåden fem elementer: 20 (1) Isolering af messenger-RNA (mRNA) ffa B-cellehybridomalinier, som fremstiller monoklonale antistoffer mod specifikke antigener, kloning og cDNA-produktion derfra.

25 (2) Fremstilling af universalt immunoglobulingen-(UIG)-oligonukleotider, der er egnede som primere og/eller sonder til kloning af de variable regiongensegmenter i det lette og tunge kæde-mRNA ud ffa specifikke humane eller ikke-humane hybridomacellelinier og cDNA-produktion derffa.

30 (3) Fremstilling af konstant regiongensegmentmoduler ved cDNA-ffemstilling og kloning eller genom genfremstilling og kloning.

21 DK 175581 B1 (4) Konstruktion af fuldstændige tunge eller lette kædekodningssekvenser ved binding af de klonede specifikke variable regionggenimmunoglobulinsegmenter fra del (2) ovenfor til klonede humane konstante regiongensegmentmoduler.

5 (5) Ekspression og produktion af lette og tunge kæder i udvalgte værter omfattende prokaryote og eukaryote værter, enten ved separate fermenteringer efterfulgt af samling af antistofmolekyler in vitro eller ved produktion af begge kæder i den samme celle.

10 Opfindelsen udnytter klonede hybridoma-B-cellelinier, som fremstiller monoklone antistoffer med defineret specificitet til isolering af mRNA til cDNA-kloning. På grund af at mange lymfoide cellelinier indeholder meget aktive nukleaser, som nedbryder mRNA under isolering, anvendes der ifølge opfindelsen mRNA-fremstillingsmetoder, som er specifikt udviklet til isoleringen af intakt mRNA fra celler og væv indeholdende 15 aktive nukleaser. En sådan metode, som giver fuldstændige RNA-præparater ved celleeller vævsødelæggelse, er en ethanolperchlorat-tøris-blanding, som reducerer nuklease-virkning (Lizardi, P. M. et al., Anal. Biochem., 98: 116 (1979)). Denne metode giver intakt transi aterbart mRNA.

20 Andre metoder, som har været anvendt ifølge opfindelsen, omfatter ekstraktion af celler med lithiumchlorid samt urinstof (Aufffay, C. og Rougeon, F., Eur. J. Biochem., 107: 303 (1980)) eller guanidinthiocyanat (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry, 18: 5294 (1979)) til fremstilling af fuldstændigt RNA.

25 Et fælles træk hos alle udtrykte lette og tunge immunoglobulinkædegener og messenger RNA'er er den såkaldte J-region (dvs. forbindelsesregion, se fig. 1). Tunge og lette kæde-J-regioner har forskellige sekvenser, men der forekommer en høj grad af sekvenshomologi (mere end 80%) inden i de tunge JH-regioner eller kappa-let-kæde-regioneme. Opfindelsen tilvejebringer consensussekvenser af lette og 30 tunge kæde-J-regioner, som er egnede ved udformningen af oligonukleotider (betegnet heri som UIG'er) til brug som primere eller sonder til kloning af lette eller tunge 22 DK 175581 B1 immunoglobulinkæde-mRNA’er eller -gener (fig. 2 eller 7). Afhængig af naturen af udformningen af et bestemt UIG kan det være i stand til at hybridisere til alle imrnunoglobulin-mRNA'er eller -gener indeholdende en enkelt specifik J-sekvens, såsom UIG-MJH3, som kun påviser muse-JH3-sekvenser (fig. 7).

5

En anden anvendelse af en bestemt UIG-sonde kan være hybridisering til lette kæde-eller tunge kæde-mRNA'er med en specifik konstant region, såsom UIG-MJK, som påviser alle muse-JK-holdige sekvenser (fig. 7). UIG-udformning kan også omfatte en sekvens til indføring af et restriktionsenzymsted i cDNA-kopien af et immunoglo-10 bulinen (se fig. 7). Opfindelsen kan f.eks. udnytte kemisk gensyntese til frembringelse af UIG-sondeme til kloningen af V-regioner i immunoglobulin-mRNA fra hybridoma-celler fremstillende monoklon antistoffer med ønskede antigenspecificiteter.

En multi-trinsffemgangsmåde anvendes til dannelse af fuldstændige 15 V+C-region-cDNA-kloner ud fra hybridomacelle-lette og -tunge kæde-mRNA'er. I det første trin udnytter opfindelsen UIG-sonder, som "primere” til omvendt transkriptase-kopiering af den fuldstændige V-region- og lederkodningssekvenser af tunge og lette kæde-mRNA'er (fig. 3). Den komplementære streng af det primerforlængede cDNA syntetiseres derefter, og dette dobbeltstrengede cDNA klones 20 i passende cDNA-kloningsvektorer, såsom pBR322 (Gubier og Hoffman, Gene 25: 263 (1983)) eller pQ23 (fig. 5, Maniatis, T., et al,, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, New York, side 224 (1982)).

Kloner screenes for specifik hybridisering med UIG-oligonukleotidsonder. Positive tunge og lette kædekloner, som er identificeret ved denne screeningsprocedure, 25 kortlægges og sekvensbestemmes til udvælgelse af sådanne som indeholder V-region-og lederkodningssekvenser.

En alternativ fremgangsmåde er at anvende cDNA-kloner under anvendelse af oligo-dT som en primer efterfulgt af udvælgelse af lette og tunge kædekloner ved standard-3 0 hybri di seringsmetoder.

23 DK 175581 B1

Et andet trin udnytter kloning af C-regiongensegmenter til dannelse af lette og tunge kædemodulvektorer. Ved en fremgangsmåde fremstilles cDNA-kloner af human tung og let kædeimmunoglobulin-rriRNA. Disse cDNA-kloner omdannes derefter til C-regionmodulvektorer ved stedsrettet mutagenese til anbringelse af et restriktionssted 5 ved en ønsket lokalisering nær en grænse til den konstante region. En alternativ metode udnytter genome C-regionkloner som kilde for C-regionmodulvektorer.

Et tredje cDNA-kloningstrin involverer dannelsen af fuldstændige lette og tunge kædekodningssekvenser med forbundne V- og C-regioner. De klonede V-regionseg-10 menter, som er dannet som beskrevet ovenfor, udskæres og ligeres til lette eller tunge kæde-C-regionmodulvektorer. F.eks. kan man klone den fuldstændige humane kappa-lette kæde-C-region og den fuldstændige humane gamma 1-C-region. Endvidere kan man modificere en human gamma-1-region og indføre et afslutningscodon, hvorved der opnås en gensekvens, som koder for den tunge kædedel af et 15 Fab-molekyle.

Kodningssekvenseme, der har operationelt bundne V- og C-regioner, overføres derefter til passende ekspressionssystemer til ekspression i passende værter, prokaryote eller eukaroyte. Operationelt bundet betyder i-ramme-forening af kodningssekvenser til 20 opnåelse af en kontinuert translationsdygtig gensekvens uden ændringer eller forstyrrelser af triplet-læse-rammen.

En særlig fordel ved anvendelse af genetiske cDNA-sekvenser ifølge opfindelsen er den kendsgerning, at de kontinuert koder for immunoglobulinkæder, enten tunge eller 25 lette. Ved "kontinuert" menes, at sekvenserne ikke indeholder introner (dvs. ikke er genome sekvenser, men snarere, da de hidrører fra mKNA ved omvendt transkription, er sekvenser af tilstødende exoner). Denne egenskab ved cDNA-sekvenseme ifølge opfindelsen muliggør, at de kan udtrykkes i prokaryote værter, såsom bakterier, eller i lavere eukaryote værter, såsom gær.

30 24 DK 175581 B1

En anden fordel ved cDNA-kloningsmetoder er den nemhed og simpelhed, hvorved der opnås V-regiongenmoduler.

Udtrykket "ikke-human" som anvendt ifølge opfindelsen er ment at indbefatte et 5 hvilket som helst dyr forskellig fra et menneske, hvor der kan frembringes en immunreaktion, som derefter fører til anvendelige B-celler, som resulterer i tilsvarende hybridomaer, eller B-cellekloner opnået ved viral transformation og lignende. Sådanne dyr omfatter almindeligvis gnavere, såsom musen eller rotten. På grund af hvor nemt det er at opnå dem og deres store tilgængelighed, er musen for tiden det foretrukne 10 ikke-humane dyr. Muse-muse-hybridomaer udnyttes således som de foretrukne kilder for variable regioner i tunge og lette kæder.

Fortrinsvis tilvejebringer opfindelsen hele V- og/eller C-region-cDNA-sekvenser. Dette betyder, at sekvenserne koder for i alt væsentligt operationsdygtige V- og/eller 15 C-regioner uden, at der mangler nogle væsentlige strukturelle dele deraf.

Udtrykkene "konstant" og "variabel" anvendes til funktionelt at betegne sådanne regioner i immunoglobulinkæden enten tung eller let kæde, som koder for egenskaber og træk, som de variable og konstante regioner i naturligt forekommende ikke-kimære 20 antistoffer har. Som bemærket er det ikke nødvendigt at den fuldstændige kodningsregion for variable eller konstante regioner er til stede, så længe at der er en funktionel operationsdygtig region til stede og tilgængelig.

Der er en lang række kilder for hybridomaer tilgængelig til fremstilling af mRNA. Se 25 f.eks. kataloget ATCC CELL LINES AND HYBRIDOMAS, december 1984,

American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., side 5-9 og ECACC Catalogue, 2. udgave, PHLS CAMR Porton Down, Salisbury, Wills; SP40JG, U.K. side 30-35 og 40-46. Hybridomaer, som secernerer monoklone antistoffer, der er reaktionsdygtige over for en lang række antigener, er 30 anført deri, er tilgængelige fra samlingen og anvendelige ifølge opfindelsen. Af særlig interesse er hybridomaer, som secernerer antistoffer, der er reaktive med virale 25 DK 175581 B1 antigener omfattende Dengue- complex-sped fik (ATCC HB 114), Dengue-type 1-virus (ATCC HB 47), Dengue-type 2-virus (ATCC HB 46), Dengue-type 3-virus (ATCC HB 49), Dengue-type 4-virus (ATCC HB 48), Epstein-Barr-receptor (ATCC HB 135), Flavivirus-gruppe (ATCC HB 112), hepatitis B-overfladeantigen (ATCC CRL 8017 5 og 8018), herpes simplex type I (ATCC HB 8068), herpes simplex type II (ATCC HB 8067), influenzavirus (ATCC CL 189), influenza A-virus, matrixprotein (ATCC HB 64), influenza A-virus, nucleoprotein (ATCC HB 65), influenza A Bangkok/1/79HA (ATCC HB 66), influ- enza AWSN NP (ATCC HB 67), SV40 stort T-antigen (ATCC TIB 115), SV40 stort T-antigen, C-terminalende (ATCC TIB 117), og SV40-ikke-viral 10 T-antigen (ATCC TIB 116). Eksempler på andre hybridomaer omfatter sådanne, som secernerer antistoffer over for tumorassocieret antigener eller over for humane lymfocyt- antigener, såsom sådanne, som er reaktive over for human tumor-associerede CEA, høj mw (ATCC CRL 8019); human tumorassocieret α-føtoprotein, IgGl-K (ATCC HB 134); human B-lymfocyt-HLA-DR, monomorph, IgG2b (ATCC HB 104); 15 human T-lymfocyt-T-celleforstadier, IgGl (ATCC CRL 8022); human T-lymfocyt-T-cellesubset, hjælper, IgG2b (ATCC CRL 8002); T-subset, suppressor/cytotoksisk, human, IgGl (ATCC CRL 8013); T-cellesubset, suppressor/cytotoksisk, human, IgG2a (ATCC CRL 8014); T-celler, periferal, human, IgGl (ATCC CRL 8000); T-celler, periferal, human, IgG2a (ATCC CRL 8001); thymocyter, "fælles", human, IgGl 20 (ATCC CRL 8020).

Disse linier og andre af lignende natur kan udnyttes til at kopiere mRNA-kodningen for variabel region under anvendelse af UIG-sondeme. Af særlig interesse er antistoffer med specificitet over for humane tumorantigener.

25

Ekspressionsvehikler omfatter plasmider eller andre vektorer. Foretrukne blandt disse er vehikler, som bærer en funktionelt fuldstændig human konstant tung eller let kædesekvens med passende restriktionssteder, som er dannet således, at enhver variabel tung eller let kædesekvens med de passende kohæsive ender let kan indsættes 30 deri. Humane konstante tunge eller lette kædesekvens-holdige vehikler er således en vigtig udførelsesform ifølge opfindelsen. Disse vehikler kan anvendes som 26 DK 175581 B1 mellemprodukter ved ekspressionen af enhver ønsket fuldstændig tung eller let kæde i en hvilken som helst passende vært.

En foretrukken vært er gær. Gær giver væsentlige fordele ved fremstillingen aflette og 5 tunge immunoglobulinkæder. Gær udfører post-translationale peptidmodifikationer omfattende glycosylering. En række DNA-rekombineringsstrategier eksisterer nu, som udnytter stærke promotorsekvenser og plasmider med højt kopiantal, som kan anvendes til åben produktion af de ønskede proteiner i gær. Gær genkender ledersekvenser på klonede mammale genprodukter og secernerer peptider, som har ledersekvenser (dvs.

10 præpeptider) (Hitzman et al., 11th International Conference on Yeast, Genetics and Molecular Biology, Montpelier, Frankrig, 13-17 september, 1982).

Gærgenekspressi onssystemer kan rutinemæssigt bedømmes for produktionsniveauet af tung og let kæde, proteinstabilitet og sekretion. Et hvilket som helst af en række 15 gærgenekspressionssystemer omfattende promotor- og afslutningselementer fra de aktivt udtrykte gener, som koder for glycolytiske enzymer, som produceres i store mængder, når gær dyrkes i medier, som er rige på glucose, kan anvendes. Kendte glycolytiske gener kan også give meget effektive transkriptionskontrolsignaler. F.eks. kan promotor- og afslutningssignaler fra iso-l-cyto- chrom C (CYC-l)-genet anvendes.

20

De følgende måder kan anvendes til bedømmelse af optimale ekspressionsplasmider for ekspressionen af klonede immunoglobulin-cDNA'er i gær.

(1) De klonede immunoglobulin-DNA-bindende V- og C-regioner forbindes til 25 forskellige transkriptionspromotorer og afslutnings-DNA-fragmenter.

(2) De kimære gener anbringes på gærplasmider anvendt til proteinoverproduktion (se f.eks. Beggs, J. D., Molecular Genetics and Yeast, Alfred Benzon Symposium, 16, København (1981)).

30 27 DK 175581 B1 (3) Yderligere genetiske enheder, såsom et gærlederpeptid, kan indbefattes på immunoglobulin-DNA-konstruktioner til opnåelse af antistofsekretion.

(4) En del af sekvensen, ofte de første 6 til 20 codoner i gensekvensen, kan modificeres 5 til at repræsentere foretrukken gærcodonanvendelse.

(5) De kimære gener anbringes på plasmider anvendt til integration i gærkromosomer.

De følgende måder kan anvendes til samtidigt at udtrykke både lette og tunge 10 kædegener i gær.

(1) De lette og tunge kædegener forbindes hver til en gærpromotor og en afslutningssekvens og anbringes på det samme plasmid. Dette plasmid kan udformes til enten autonom replikation i gær eller integration på specifikke steder i 15 gærkromosomet.

(2) De lette og tunge kædegener forbindes hver til en gærpromotor, og afslutningssekvens på separate plasmider indeholdende forskellige selekterbare markører. F.eks. kan det lette kædegen anbringes på et plasmid indeholdende trpl- 20 genet som en selekterbar markør, mens det tunge kædegen kan anbringes på et plasmid indeholdende ura3 som en selekterbar markør. Plasmideme kan udformes til enten autonm replikation i gær eller integration på specifikke steder i gærkromosomer. En gærstamme, der er mangelfuld med hensyn til begge selekterbare markører, transformeres enten samtidig eller sekventielt med plasmidet 25 indeholdende let kædegen og med plasmidet indeholdende tung kædegen. 1

De lette og tunge kædegener forbindes hver til en gærpromotor og afslutningssekvens på separate plasmider, som hver indeholder forskellige selekterbare markører som beskrevet i (2) ovenfor. En gærparringstype "a''-stamme, som er 30 mangelfuld med hensyn til de selekterbare markører, som findes på de lette og tunge kædeekspressionsplasmider (trpl og ura3 i det ovenfor nævnte eksempel) 28 DK 175581 B1 transformeres med plasmidet indeholdende det lette kædegen ved udvælgelse af en af de to selekterbare markører (trpl i det ovenfor nævnte eksempel). En gærparringstype "«"-stamme, som er mangelfuld med hensyn til de samme selekterbare markører som "a"-stammen (dvs. trpl og ura3 som eksempler) 5 transformeres med et plasmid indeholdende det tunge kædegen ved udvælgelse af den alternative selekterbare markør (dvs. ura3 i det ovenfor nævnte eksempel). "a"-stammen indeholdende det lette kædeplasmid (fænotype: Trp+ Ura- i det ovenfor nævnte eksempel) og stammen indeholdende det tunge kædeplasmid (fænotype: Trp- Ura+ i det ovenfor nævnte eksempel) parres og diploider udvælges, 10 som er prototrope for begge af de ovenfor nævnte selekterbare markører (Trp+ Ura+ i det ovenfor nævnte eksempel).

Blandt bakterielle værter, som kan anvendes som transformationsværter, er E. coli K12-stamme 294 (ATCC 31446) særlig egnet. Andre mikrobielle stammer, som kan 15 anvendes, omfatter E. coli XI776 (ATCC 31537). De førnævnte stammer såvel som E. coli W3110 (ATCC 27325) og andre enterobakterier, såsom Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og forskellige Pseudomona-arter, kan anvendes.

Generelt anvendes plasmidvektorer indeholdende replikon- og kontrolsekvenser, som 20 hidrører fra arter, der er forligelige med en værtscelle, i forbindelse med disse værter. Vektoren bærer sædvanligvis et replikationssted såvel som specifikke gener, der er i stand til at give fænotyp udvælgelse i transformerede celler. F.eks. transformeres E. coli let under an- vendelse af pBR322, et plasmid hidrørende fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracyklin-25 resistens og giver således en nem måde til identifikation af transformede celler. pBR322-plasmidet eller andre mikrobielle plasmider skal også indeholde eller modificeres til at indeholde promotorer, som kan anvendes af den mikrobielle organisme til ekspression af dens egne proteiner. De promotorer, som mest almindeligt anvendes i DNA-rekombineringskonstruktion, omfatter 6-1 actamasepromotorsystemer 30 (penicilinase) og lactosepromotorsystemer (6-galactosidase) (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056 (1977)); og tryptophanpromotorsystemer 29 DK 175581 B1 (Goeddel et al., Nucleic Acids Research, 8: 4057 (1980); EPO publikation nr. 0036776). Mens disse er de mest almindeligt anvendte, er andre mikrobielle promotorer blevet opdaget og udnyttet.

5 F.eks. kan en genetisk konstruktion for en hvilken som helst tung eller let kimær immunoglobulinkæde bringes under kontrol af den mod venstre rettede promotor af bakteriofag λ (PL). Denne promotor er en af de stærkeste kendte promotorer, som kan reguleres. Kontrol udøves ved hjælp af λ-repressoren og nærliggende restriktionssteder er kendte.

10

Ekspressionen af immunoglobulinkædesekvensen kan også bringes under kontrol af andre regulatoriske sekvenser som kan være "homologe" med organismen i dens ikke-transformerede tilstand. F.eks. omfatter lactoseafhængigt E. coli-kromosomalt DNA et lactose- eller lac-operon, som formidler lactosefordøjelse ved udformning af 15 enzymet β-galactosidase. lac-kontrolelementeme kan opnås fra bakteriofag λ pLAC5, som er inficerende for E. coli. lac-promotor/operator-systemet kan fremkaldes af IPTG.

Andre promotor/operator-systemer eller dele deraf kan ligeledes anvendes. F.eks. kan arabinose, colicin El, galactose, alkalisk phosphatase, trypthophan, xylose, tac og 20 lignende anvendes. Andre bakterielle genekspressionskontrolelementer kan anvendes til opnåelse af ekspressionen af immunoglobulinproteiner. F.eks. kan et gen med en bakteriel sekretionssignalpeptidkodningsregion udtrykkes i bakterier, hvilket resulterer i sekretion af immunoglobulinpeptidet, som oprindelig var forbundet til signalpeptidet.

25 Andre foretrukne værter er mammale celler dyrket in vitro i vævskultur eller in vivo i dyr. Mammale celler giver posttranslationale modifikationer af immunoglo-bulinproteinmolekyler omfattende lederpeptidfjemelse, korrekt foldning og samling af tunge og lette kæder, glycosylering på korrekte steder og sekretion af funktionelt antistofprotein fra cellen som H2L2-molekyler.

30 30 DK 175581 B1

Mammale celler, som kan være egnede som værter ved fremstillingen af antistofproteiner, omfatter celler af fibroblastorigin, såsom Vero (ATCC CRL 81) eller CHO-K1 (ATCC CRL 61), eller celler af lymfoid origin, såsom hybridomaet Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581) eller myelomaet P3X63Ag8 (ATCC TIB 9) og 5 derivater deraf, /

Der er flere mulige vektorsystemer tilgængelige for ekspressionen af klonede tunge kæde- og lette kædegener i mammale celler. En klasse af vektorer udnytter DNA-elementer, som giver et autonomt replikerende ekstrakromosomalt plasmid, 10 hidrørende fra dyreviruser, såsom bovint papillomavirus (Sarver, N. et ak, Proc. Natl.

Acad. Sci., USA, 79: 7147 (1982)), polyomavirus (Deans, R. J. et ak, Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 81: 1292 (1984)), eller SV40-virus (Lusky, M. og Botchan, M., Nature, 293: 79 (1981)). En anden klasse vektorer er afhængig af integrationen af de ønskede gensekvenser ind i værtscellekromosomet. Celler, som stabilt har integreret det indførte 15 DNA i deres kromosomer kan udvælges ved også at indføre lægemiddelresistensgener, såsom E. coli gpt (Mulligan, R. C. og Berg, P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 2072 (1981)) eller Tn5 neo (Southern, P. J. og Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)).

Det selekterbare markørgen kan enten direkte bindes til DNA-gensekvenseme, som skal udtrykkes, eller indføres i den samme celle ved cotransfektion (Wigler, M. et ak, 20 Cell, 16:77(1979)).

Da et immunoglobulin-cDNA kun er sammensat af sekvenser, som repræsenterer det fuldt udviklede mRNA, der koder for et antistofprotein eller dets forstadie, er yderligere gen ekspressi onselementer, som regulerer transkription af genet og opar-25 bejdning af RNA'et nødvendig for optimal syntese af immunoglobulin-mRNA. Disse elementer kan omfatte splejsesignaler såvel som transkriptionspromotorer omfattende inducerbare promotorer, fremmere og afslutningssignaler. cDNA-ekspressions-vektorer, som har inkorporeret sådanne elementer, omfatter sådanne beskrevet af Okayama, H. og Berg, P., Mol. Cell Biol, 3: 280 (1983), Cepko, C. L. et ak, Cell, 37: 30 1053 (1984) og Kaufman, R. J, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82:689 (1985).

31 DK 175581 B1

En måde at bedømme optimale vektorer til ekspressionen af immunoglobulin-cDNA i mammale celler involverer, at man først bringer immunoglobulin-DNA-sekvenseme ind i vektorer, som stabilt er i stand til at integrere ind i cellegenomet eller replikere autonomt som et ekstrakromosomalt plasmid. Vektorerne kan anvendes til at bedømme 5 forskellige genekspressionselementer for optimal immunoglobulinsyntese.

En yderligere fordel ved mammale celler som værter er deres evne til udtrykke kimære immunoglobulingener, som hidrører ffa genome sekvenser. Således kan mammale celler udtrykke kimære immunoglobulingener, som er sammensat af et variabelt 10 region- cDNA-modul samt en konstant region, der er sammensat helt eller delvis af genome sekvenser. Flere genome kloner for human konstant region er blevet beskrevet (Ellison, J. W. et al., Nucl. Acids Res., 10: 4071 (1982) eller Max, E. et al., Cell, 29: 691 (1982)). Anvendelsen af sådanne genome sekvenser kan være hensigtsmæssig for den samtidige indføring af immunoglobulinfremmere, splejsesignaler og transkrip-15 tionsafslutningssignaler sammen med det konstante regiongensegment.

Forskellige fremgangsmåder kan følges til opnåelse af hele H2L2-antistofFer.

For det første kan man separat udtrykke de tunge og lette kæder efterfulgt af in 20 vitro-samling af oprensede lette og tunge kæder til hele H2L2-IgG-antistoffer. Samlingsvejene, som anvendes til dannelse af hele H2L2-IgG-molekyler i celler er blevet undersøgt i vidt omfang (se f.eks. Scharff, M., Harvey Lectures, 69: 125 (1974)).

In vitro-reaktionsparametre for dannelsen af IgG-antistoffer fra reducerede isolerede lette og tunge kæder er blevet defineret af Beychok, S., Cells of immunoglobulin 25 Synthesis, Academic Press, New York, side 69, 1979.

Dernæst er det muligt at sam-udtrykke lette og tunge kæder i de samme celler til opnåelse af intercellulær samling og binding af tunge og lette kæder til hele H2L2-IgG-antistoffer. Sam-ekspressionen kan forekomme ved enten at anvende det 30 samme eller forskellige plasmider i den samme vært.

32 DK 175581 B1 I en foretrukket udførelsesform kan sam-ekspressionen forekomme ved hjælp af sekretionssignaler, som er egnede i gær eller bakterier. Under sådanne betingelser kan der opnås fuldstændigt foldede og samlede H2Lrimmunoglobuliner.

5 Fremstillingen af kimære Fab-ffagmenter kan ligeledes udføres ved hjælp af fremgangsmåderne ifølge opfindelsen.

De heri beskrevne fremgangsmåder kan også anvendes til at skifte klasser af et hvilket som helst antistof med en given specificitet og klasse til et antistof med den samme 10 specificitet, men af en anden klasse, hvadenten human eller ikke-human. F.eks. kan humane IgM-antistoffer transmuteres til humane IgG-antistoffer ved at fremstille konstruktioner indeholdende humane konstante IgG-cDNA- eller genome sekvenser forbundet til variable humane cDNA-sekvenser opnået fra en celle, som fremstiller det oprindelige IgM-antistof. Disse konstruktioner indføres derefter i passende værter og 15 udtrykkes.

POLYPEPTIDPRODUKTER

Opfindelsen tilvejebringer "kimære" immunoglobulinkæder, enten tunge eller lette. En 20 kimær kæde indeholder en konstant region, som i alt væsentligt ligner den, som er til stede i den tunge kæde i et naturligt forekommende humant immunoglobulin og en variabel region med en hvilken som helst ønsket antigen specificitet. Den variable region er enten af human eller ikke-human origin.

25 Opfindelsen tilvejebringer også immunoglobulinmolekyler med tunge og lette kæder forbundet således, at det samlede molekyle udviser ønskede bindings- og genkendelsesegenskaber. Forskellige typer immunoglobulinmolekyler tilvejebringes: monovalente, divalente, dispecifikke (dvs. med forskellige variable regioner), molekyler med kimære tunge kæder og ikke-kimære lette kæder eller molekyler med variable 30 bindingsområder forbundet til peptiddele, som bærer ønskede funktioner.

33 DK 175581 B1

Antistoffer med kimære tunge kæder med den samme eller forskellig variabel regionbindingsspecificitet og ikke-kimære (dvs. helt humane eller helt ikke-humane) lette kæder kan fremstilles ved passende samling af de nødvendige polypeptidkæder.

Disse kæder fremstilles individuelt ved hjælp af de modulære samlingsmetoder ifølge 5 opfindelsen.

Kimære Fab-fragmenter er også en del af opfindelsen.

ANVENDELSER

10

Antistofferne ifølge opfindelsen med human konstant region kan udnyttes til passiv immunisering, især hos mennesker, uden negative immunreaktioner, såsom serumsygdomme eller anafylaktisk shock. Antistofferne kan selvsagt også anvendes i kendte immunodiagnostiske analyser og sæt i mærket form til in vitro- billeddannelse, 15 hvor mærket kan være en radioaktiv emitter, eller et NMR-kontrastmiddel, såsom en carbon- 13-keme, eller et røntgenkontrastmiddel, såsom en tungmetalkeme. Antistofferne kan også anvendes til in vitro-lokalisering af antigener ved passende mærkning.

Antistofferne kan anvendes til terapeutiske formål i sig selv i komplementformidlet 20 lyse eller kan være koblet til toksiner eller andre terapeutiske dele.

Klasseskift af antistoffer er anvendeligt, når det ønskes at ændre associering, aggregering eller andre egenskaber hos antistoffer opnået ved cellefusionsteknik eller hybridomateknik. F.eks. er de fleste humane/humane monoklone antistoffer af 25 IgM-klassen, som er kendt for nemt at blive reduceret og aggregere. Ændring af sådanne antistoffer til andre antistoftyper, såsom IgG, IgA eller IgE er således af stor betydning.

Blandede antistof/enzym-molekyler kan anvendes til immunodiagnosemetoder, såsom 30 ELISA. Blandede antistof-peptideffektorkonjugater kan anvendes til målrettet udlevering af effektordelen med en høj effektivitets- og specificitetsgrad.

34 DK 175581 B1

Efter nu generelt at have beskrevet opfindelsen vil den yderligere blive forstået ved henvisning til visse specifikke eksempler, som er indbefattet heri udelukkende for illustrationsformål og ikke er ment at være begrænsende, med mindre andet er anført.

5 EKSPERIMENTER Materialer og metoder Vævskulturcellelinier 10 De humane cellelinier GM2146 og GM1500 blev leveret fra the Human Mutant Cell Repository (Camden, New Jersey) og dyrket i RPM11640 samt 10% føtalt bovinserum (M. A. Bioproducts). Cellelinierne Sp2/0 og CRL 8017 blev leveret fra the American Type Culture Collection og dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) samt 4,5 g/1 glucose (Μ. A. Bioproducts) samt 10% føtalt bovinserum (Hyclone, Sterile 15 Systems, Logan, Utah). Medier blev suppleret med penicillin/streptomycin (Irvine Scientific, Irvine, Californien).

Rekombineret plasmid og bakteriofag DNA

20 Plasmideme pBR322, pLl og pUC12 blev leveret fra Pharmacia P- L-Biochemicals (Milwaukee, Wisconsin). Plasmideme pSV2-neo og pSV2*gpt blev leveret fra BRL (Gaithersburg, Maryland) og var tilgængelige fra the American Type Culture Collection (Rock- ville, Maryland). pHu-gamma-1 er en subklon af 8,3 kb Hindlll- til BamHI-fragmentet af det humane IgGl-kromosomgen. En separat isolering af det 25 humane IgGl-kromosomgen er beskrevet af Ellison, J. W. et al., Nucl. Acids Res., 10: 4071 (1982). M8oRX12 indeholder 0,7 kb Xbal- til EcoRI-fragmentet indeholdende den tunge musekædeffemmer ffa J-C-intronregionen i M603-kromosomgenet (Davis, M. et al., Nature, 283: 733) indsat i M13mpl0. G-haledannet pUC9 blev leveret fra Pharmacia P-L. DNA-manipulationer, som involverer oprensning af plasmid-DNA ved 30 opdriftsdensitetcentrifugering, restriktionsendonukleasefordøjelse, oprensning af DNA-ffagmenter ved hjælp af agarosegelelektroforese, ligering og transformation af E.

35 DK 175581 B1 coli blev udført som beskrevet af Maniatis, T. et ak, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (1982). Restriktionsendonukleaser og andre DNA/RNA-modificerende enzymer blev leveret fra Boehringer-Mannheim (Indianapolis, Indiana), BRL, New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) og Pharmacia P-L.

5

Oligonukleotidfremstilling

Oligonukleotider blev enten syntetiseret ved hjælp af triestermetoden beskrevet af Ito et al., (Nucl. Acids Res., 10: 1755 (1982)), eller blev leveret fra ELESEN, Los Angeles, 10 Californien, Tritylerede, afblokkede oligonukleotider blev oprenset på Sephadex-G50, efterfulgt af HPLC med omvendt fase med en 0-25% gradient af acetonitril i 10 mM triethylamineddikesyre, pH-værdi 7,2, på en Cl 8 uBondapak-søjle (Waters Associates). Detritylering var i 80% eddikesyre i 30 minutter efterfulgt af afdampning tre gange. Oligonukleotider blev mærket med [gamma-32P]ATP samt T4-polynukleo-15 tidkinase.

RNA-fremstilling og analyse

Totalt cellulært RNA blev fremstillet ud fra vævskulturceller ved hjælp af metoden af 20 Auffray, C. og Rougeon, F. (Eur. J. Biochem., 107: 303 (1980)) eller Chirgwin, J. M. et ak (Biochemistry, 18: 5294 (1979)). Fremstilling af poly(A)+-RNA, methyl-kvik-sølvagarosegelelektroforese og "Northem"-overførseI til nitrocellulose blev udført som beskrevet af Maniatis, T. et ak, supra. Totalt cellulært RNA eller poly(A)+ RNA blev direkte bundet til nitrocellulose ved først at behandle RNA'et med formaldehyd (White, 25 B. A. og Bancroft, F. C., J. Biol. Chem., 257: 8569 (1982)). Hybridisering til filterbundet RNA var med hak-translaterede DNA-fragmenter under anvendelse af betingelser som beskrevet af Margulies, D. H. et ak (Nature, 295: 168 (1982)) eller med 32P-mærket oligonukleotid under anvendelse af 4xSSC, 10X Denhardt's, 100 gg/ml laksesperm-DNA ved 37°C natten over efterfulgt af vask i 4xSSC ved 37°C.

cDNA-fremstilling og kloning 30 36 DK 175581 B1

Oligo-dT-primerbehandlede cDNA-biblioteker blev fremstillet ud fra poly(A)+-RNA fra GM1500- og GM2146-celler ved hjælp af metoderne beskrevet af Land, H. et al.

(Nucl. Acids Res., 9: 2251 (1981)) og Gubier, V. og Hoffman, B. J., Gene, 25: 263 5 81983). cDNA-bibliotekeme blev screenet ved in situ-hybridisering (Maniatis T., supra) med 32P-mærkede oligonukleotider under anvendelse af de ovenfor beskrevne betingelser eller med hak-translaterede DNA-fragmenter under anvendelse af betingelserne beskrevet af de Lange et al. (Cell, 34: 891 (1983)).

10 Oligonukleotidprimerforlængelse og kloning

Poly(A)+ RNA (20 /tg) blev blandet med 1,2 μg primer i 40 /ti 64 mM KC1. Efter denaturering ved 90°C i 5 minutter og derefter afkøling i is blev tre enheder human placentalribonukleaseinhibitor (BRL) tilsat i 3 /ti 1M Tris-HCl, pH-værdi 8,3. Oli-15 gonukleotidet blev føjet sammen med RNA’et ved 42°C i 15 minutter, hvorefter 12 /ti 0,05 M DTT, 0,05 M MgC12 og 1 mM af hver dATP, dTTP, dCTP og dGTP blev tilsat.

2 /ti a-32P-dATP (400 Ci/mmol, New England Nuclear) blev tilsat efterfulgt af 3 μΐ AMV omvendt transkriptase (19 enheder//tl, Life Sciences).

20 Efter inkubation ved 42°C i 105 minutter blev 2 μ\ 0,5 M EDTA og 50 μΐ 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH-værdi 7,6 tilsat. Ikke-inkorporerede nukleotider blev fjernet ved Sephadex G-50 hvirvelsøjlekromatografi, og RNA-DNA-hybridet blev ekstraheret med phenol, derefter med chloroform og præcipiteret med ethanol. Anden streng-syntese, homopolymer-haledannelse med dGTP eller dCTP og indsættelse i vektorer med 25 homopolymer-hale blev udført som beskrevet af Gubier og Hoffman, supra.

Stedsrettet mutagenese

Enkeltstrenget M13-subklon DNA (1 /ig) blev forenet med 20 ng oligonukleotidprimer 30 i 12,5 μΐ Hin-puffer (7 mM Tris-HCl, pH-værdi 7,6, 7 mM MgC12, 50 mM NaCl).

Efter opvarmning til 95°C i et lukket rør, blev primeren føjet sammen med skabelonen 37 DK 175581 B1 ved langsom afkøling fra 70°C til 37°C i 90 minutter. 2 μΐ dNTP'er (1 mM hver), 1 μΐ 32P-dATP (10 μΟ), 1 μ] DTT (0,1 M) og 0,4 μΐ Klenow DNA Poll (2 μ Boehringer Mannheim) blev tilsat og kæder forlænget ved 37°C i 30 minutter. Dertil blev tilsat 1 μ\ (10 ng) M13-omvendt primer (New England Biolabs), og opvarmning/sam-5 menføjnings- og kædeforlængelsestrinnene blev gentaget. Reaktionen blev standset med 2 μΐ 0,5 M EDTA, pH- værdi 8 samt 80 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH-værdi 7,6, 1 mM EDTA. Produkterne blev phenolekstraheret og oprenset ved Sephadex G-50-hvirvel-søjlekromatografi og ethanolpræcipiteteret før restriktionsenzymfordøjelse og ligering til den passende vektor.

10

Transfektion af mveloma-vævskulturceller

En variation af metoden beskrevet af Ochi, A. et al. (Nature, 302: 340 (1983)) blev anvendt til protoplastfusion. 50 ml bakterier ved A60o på 0,7 blev omdannet til 15 protoplaster ved hjælp af den af Sandri-Goldin, R. M. et al., beskrevne metode (Mol.

Cell. Biol., 1: 743 (1981)), derefter fortyndet med 20 ml DMEM plus 10% FBS (slutvolumen er 25 ml). Sp2/0-celler blev indsamlet, pelleteret ved 2.200 x g, vasket, genpelleteret og gensuspenderet i DMEM ved 2-5x106/ml. Bakterieprotoplaster (10 ml) blev blandet med 10x106 Sp2/0-celler og pelleteret ved centrifugering ved 4000 x g ved ! 20 22°C i 20 minutter. Efter afpipettering af supematanten blev pelleten suspenderet i den tilbageværende mediumdråbe ved at knipse til røret. 2 ml 10% DMSO, 37% (vægt/volumen) PEG6000 (Kodak) i DMEM blev dråbevis tilsat under blanding i løbet af 45 sekunder. Efter 15 sekunder blev 2 ml 42% PEG6000 i DMEM tilsat i løbet af 45 sekunder. Fuldstændigt DMEM (45 ml) blev langsomt tilsat under blanding. Celler 25 blev pelleteret ved 2500 x g, derefter vasket og pelleteret tre gange.

Elektroporationsmetoden beskrevet af Potter, H. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 7161 (1984)) blev anvendt. Efter transfektion fik celler lov til at komme sig i fuldstændigt DMEM i 48-72 timer, hvorefter der blev podet ved 10.000 til 50.000 30 celler per brønd i kulturplader med 96 brønde i nærværelse af selektivt medium. G418 (GIBCO) selektion var ved en koncentration på 0,8 mg/ml, mycophenolisk syre 38 DK 175581 B1 (Calbiochem) var ved en koncentration på 6 gg/ml plus 0,25 mg/ml xanthin, og HAT (Sigma) var ved standardkoncentrationen.

Analyser for immunoglobulinsvntese og -sekretion 5

Secerneret immunoglobulin blev målt direkte fra vaevskulturcellesupematanter. Cytoplasmisk proteinekstrakt blev fremstillet ved at hvirvle lxlO6 celler i 160 μΐ 1% NP40, 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH-værdi 7,6 ved 0°C, 15 minutter efterfulgt af centrifugering ved 10.000 x g til fjernelse af uopløseligt materiale.

10

Dobbelt antistof-sandwich ELISA (Voller, A. et al., i Manual of Clinical Immunology, 2. udgave, udgivere Rose, N. og Friedman, H., side 359-371, 1980) under anvendelse af affinitetsoprenset antisera blev anvendt til at påvise specifikke immunoglobuliner.

Til påvisning af human IgG er pladebundet antiserum gede-anti-human IgG (KPL, 15 Gaithersburg, Maryland) i en fortynding på 1/1000, mens det peroxidase-bundne antiserum er gede-anti-human IgG (KPL eller Tago, Burlingame) i en fortynding på 1/4000. Til påvisning af human immunoglobulin kappa er det pladebundne antiserum gede-anti-human kappa (Tago) i en fortynding på 1/500, mens det peroxidase-bundne antiserum er gede-anti-human kappa (Cappel) i en fortynding på 1/1000.

20

Antistoffer, som binder hepatitis B-overfladeantigen blev påvist under anvendelse af en kommerciel analyse (Abbott, AYSAB).

EKSEMPLER

25

De følgende eksempler viser fremstillingen af kimære antistoffer, som hver har en human konstant region og en ikke-human variabel region. Disse eksempler viser trin-efter-trin-fremgangsmåden til fremstilling af de kimære antistoffer.

30 EKSEMPEL I: Humane antistof-konstante regioneenmoduler og cDNA-ekspressi onsvektorer 39 DK 175581 B1 (1) Fremstilling af cDNA-kloner og vehikler indeholdende de samme til human tung kædes konstantregion.

5 Cellelinien GM2146 blev anvendt som kilde ved mRNA-ffemstilling og cDNA-klo-ning. Denne cellelinie secernerer IgGl (Sim- mons, J. G. et al., Scand. J. Immunol., 14: 1-13, 1981). Test af denne cellelinie viste, at den secernerer IgA såvel som IgG.

Cellelinien blev klonet, og resultater viste, at 5. ud af 6 subkloner kun secernerede IgG, 10 mens en ud af 6 subkloner kun secernerede IgA. Poly(A)+ RNA blev fremstillet ud fra cellelinien, og et cDNA-bibliotek blev fremstillet ud fra poly(A)+ RNA'et ved hjælp af metoden beskrevet af Gubier, U. og Hoffman, B. I, Gene, 25: 263-269 (1983). En indledningsvis udpladning af cDNA'et transformeret ind i E. coli-stammer HB10I og RR1 gav i alt 1500 kolonier, som blev screenet ved hybridisering til et Hindlll- til 15 BamHI-ffagment af en genom klon af human IgGl (pHU-gamma-1). Der blev fundet fire positive kloner. Et fragment indeholdende CH3-kodningsregionen af en af disse kloner, pGMH-3 (fig.4) blev anvendt til at genscreene det oprindelige bibliotek samt en ny transformation med ca. 5000 kolonier. To af de største kloner, pGMH-6 og pGMH-15, blev analyseret ved restriktionsenzymfordøjelse (fig. 4). Begge kloner 20 indeholdt hele den konstante region af human IgGl, selvom det viste sig, at pGMH-6 havde deleteret ca. 1500 basepar af pBR322 DNA tilsyneladende uden at påvirke IgGl-cDNA-sekvenseme.

Klon pGMH-6 tilvejebragte IgGl-konstant regionmodulet ved konstruktionen af 25 kloningsvektorer for tung kædes variable regionkloning.

(2) Fremstilling af cDNA-kloner og vehikler indeholdende disse til human let kædes konstante region.

30 En human cellelinie (GM1500), som fremstillede IgG2K blev udvalgt til den indledningsvise kloningsfase. Poly(A)+ RNA fremstillet ud fra GM1500 er aktivt ved in 40 DK 175581 B1 vitro-translation under anvendelse af kanin-reticulocytekstrakter. Der blev fremstillet et cDNA-bibliotek ud fra dette RNA ved hjælp af metoden beskrevet af Land et al., Nucl.

Acids Res., 9: 2251-2266 (1981) under anvendelse af KpnI-fordøjet og dG-hale- dannet pQ23 som kloningsvektoren (fig. 5). Denne vektor indeholder Bglll-, Kpnl- og 5 Sstl-steder indsat mellem BamHI- og Sall-stedeme i pBR322.

For at identificere cDNA-kloneme, som er dannet ud fra GM1500-RNA, som svarer til let kæde mRNA, blev en DNA-sonde, UIG-HuK, syntetiseret og oprenset. UIG-HuK-oligonukleotidet havde sekvensen 5'-AGCCACAGTTCGTTT-3' og er 10 udformet til at hybridisere til alle funktionelle humane kappa-mRNA-arter ved J-C-forbindelsen. Denne sonde blev anvendt til at prime cDNA- syntese på GM1500-RNA i nærværelse af dideoxynukleotider og omvendt transkriptase. Fra 1,2 pg total GM1500 poly(A)+ RNA blev anvendt i dette forsøg, blev hele J-sekvensen og noget af V-regionen aflæst, hvilket viser at (1) GM1500 RNA er intakt, (2) 15 kappa-sonden har den korrekte sekvens, og (3) GM1500 let kæde mRNA indeholder JK4-sekvenser.

cDNA-kloner, som var positive med hensyn til hybridisering til den lette kædesonde, blev udvalgt. Da sonden hybridiserer til J-C-forbindelsen, var det vigtigste punkt at 20 bestemme, om klonerne havde fuldstændig konstant regionsekvens ud over J-regionen.

Indsættelsesstørrelser for de to største kappa-cDNA-kloner var 0,6 og 0,9 kb. Restriktionsenzymkortlægningen viste, at hele den konstante regionkodningssekvens var til stede i begge kloner (fig. 6). Den humane kappa-cDNA-klon pK2-3 blev anvendt 25 til at fremstille den lette kæde-konstante regionsvektor pING2001 ved indsættelse af Sau3A-fragmentet omfattende de humane kappa-konstante og J regioner ind i BclI-stedet i pBR325 (fig. 6B).

En variant af den humane kappa-cDNA-klon blev fremstillet ved at anbringe et 30 Hindlll-sted i J-regionen. Dette blev udført ved in vitro-mutagenese under anvendelse af en JKHINDIII-oligonukleotidprimer (fig. 7C). Det resulterende plasmid er pGML60.

41 DK 175581 B1

En vektor, pING2003, blev konstrueret til overførsel og ekspression af cDNA-sekvenser til mammale celler (fig. 10). Denne vektor blev konstrueret ud fra pUC12 og to plasmider indeholdende SV40-sekvenser. PLI giver en SV40 tidlig 5 regionpromotor og en SV40 sen regionsplejsesekvens. pSV2-neo-sekvenser giver en selekterbar markør for mammal celletransformation og SV40-polyadenylerings-signalsekvenser. pUC12 giver et multipelt kloningssted for cDNA-indsættelse.

pING2003-vektoren havde flere egnede restriktionssteder for modifikationer. Disse 10 omfatter et Hindlll-sted, som er egnet til indsættelse af fremmersekvenser, og et Hindlll- til Xhol- fragment, som er egnet til indsættelsen af vekslende promotorsekvenser. Denne vektor er egnet ved ekspressionen af cDNA- gener i mammale celler.

15 Addition af fremmerelement til pING2003

Immunoglobulinfremmerelementer har vist sig at fremme transskription af gener i deres nærhed i stabilt transformerede musemyelomaceller med flere hundrede gange (Gillies, S. D. et al., Cell, 33: 717, 1983; og Baneiji, J. et al., Cell. 33: 729, 1983). For 20 at lette ekspression af muse/humane immunoglobulingener i musemyelomaceller, blev museimmunoglobulin tung kæde-ffemmerelementet sat til cDNA-ekspressionsvektoren pING- 2003 (fig. 10). Muse-tung kædefremmer region-DNA'et blev isoleret fra en M13-subklon af muse-tung kæde-genom-DNA (M8-a-RX12, Deans, R. J., ikke publiceret). DNA isoleret fra et Sall- samt EcoRI-fordøjelsesmateriale af denne 25 subklon blev modificeret med Hindlll-koblere og indsat i Hindlll-stedet i pING2003, hvilket resulterede i den nye cDNA-ekspressionsvektor pING2003E. Denne vektor er egnet ved den effektive ekspression af cDNA-gener i mammale celler, især musemyeloma- eller hybridomacellelinier.

30 EKSEMPEL II: Human/muse-kimær anti-HBsAG-antistofkæde 42 DK 175581 B1 (l) Fremstilling af cDNA-kloner og vehikler indeholdende disse til muse-tung kædes anti-HBsAg-variable region.

Cellelinien CRL8017 blev leveret fra ATCC og subklonet. Subkloner blev dyrket og 5 undersøgt for muse-IgG-anti-hepatitis B-bindingsaktivitet under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt anti-HBsAg-påvisningssæt. Der blev fundet tre positive subkloner. Poly(A)+-RNA blev fremstillet ud fra en af disse subkloner og blev fraktioneret på en methylkviksølvagarosegel. RNA’et indeholdt intakte let kæde- og tung kæde-mRNA'er som udledt fra specifik hybridisering til kappa-UIG-MJK-primer 10 og til muse-tung kæde-UIG-MJH3-sonde (se fig. 7). Endvidere blev UIG-MJK-prime-ren anvendt til specifik priming af anti-HBsAg-poly(A)+-RNA ved en dideoxysekvens-reaktion. Tilstrækkelig sekvens blev aflæst til at vise, at et væsentligt kappa-RNA af anti-HBsAg-cellelinien indeholder JK2-sekvensen.

15 Betingelserne for variabel region-cDNA-syntese blev optimeret ved anvendelse af tunge og lette kæde-UIG-primere på anti-HBsAg-poly(A)+-RNA. Dideoxykædefor-længelsesforsøg viste, at muse-UIG-MJK-primeren og UIG-JH3-primeren korrekt primede kappa og tung kæde-RNA'er. Når der blev udført omvendt transkription i fravær af dideoxynukleotider, var hovedproduktet under anvendelse af 20 kappa-UIG-MJK-primeren et 410±20 nukleotidffagment, mens hovedproduktet under anvendelse af den tunge kæde UIG-JH3-primer var et 430+30 nukleotidffagment.

Disse svarer til de forventede længder af de variable og 5'-ikke-translaterede regioner af kappa og tung kæde-immunoglobulin- mRNA'er. Betingelserne for den optimale priming af poly(A)+-RNA fra CRL8017-celler skulle virke godt for poly(A)+-RNA iso-25 leret fra en hvilken som helst cellelinie, som producerer et monoklonalt antistof.

Efter bestemmelse af optimale betingelser for priming af hybridoma-mRNA med oligonukleotidprimere, blev to oligonukleotider udformet og anvendt til tung kæde-V-region-cDNA-syntese. Disse to oligonukleotider er UIG-MJHBSTEII(13) og 30 UIG-MJH3 (fig. 7 og 8). Det bør bemærkes, at primersekvensen blev udformet til indførsel af et BstEII-genkendelsessted (GGTGACC) i klonen, således at den kunne 43 DK 175581 B1 forbindes på dette sted til det humane IgG 1 -konstante modul ved den analoge position ved sidstnævntes J-region. I dette tilfælde havde primeren en enkelt forkert match mellem G og U med muse-mRNA-sekvensen, som anvender JH3-kodningssekvensen. UIG-MJHBSTEIl(13)-primeren var 13 baser lang, og den ikke-matchende rest blev 5 flankeret af 7 matcher 5' og 5 matcher 3' for den. Dette var 13-mer BstEII- primeren.

Til bedømmelse af primingseffektiviteten af 13-mer BstEII-oligonukleotidet blev der anvendt en 21-mer primer, som var specifik for muse-JH3 (UIG-MJH3). Denne primer matchede perfekt med hensyn til de 17 nukleotider på dens 3'-ende.

10 Disse to primere og JH3-kodningssekvenseme er vist i fig. 8. De første streng-cDNA-produkter fremstillet via 13-mer BstEII- og 21-mer JH3-primeme inkluderede bånd på ca. 430 nukleotider, som repræsenterede hele VH-regionen. Under standardprimingsbetingelseme, som blev anvendt, var primingseffektiviteten af 13-mer BstEII meget mindre end den af 21-mer JH3. Derfor blev et cDNA-bibliotek dannet ud 15 fra den første strengsyntese fra hver af disse primere under anvendelse af metoden beskrevet af Gubier og Hoffman, supra.

Først blev 21-mer JH3-biblioteket screenet med 21-mer JH3-oligonukleotidet. Filterhybridisering blev udført ved 30°C natten over efter metoden beskrevet af Lange, 20 T. et al., Cell, 34: 891-900 (1983). Filtrene blev derefter vasket ved 51° i 6 x SSC, 0,1% SDS. Der blev udvalgt fem kolonier. Den største havde en indsættelse på ca. 460 bp. Mere signifikant indeholder den tre restriktionssteder forudsagt ud fra den kendte JH3-sekvens, som er til stede opstrøms for primersekvensen. Denne klon pJ3-ll blev sekvensbestemt under anvendelse af JH3-primeren ved kæde-afslutningsmetoden 25 (Wallace, R. B. et al., Gene, 16: 21-26 (1981)). Den opnåede sekvens havde det tilbageværende JH3-kodningssegment. Lige opstrøms matchede et 13-nukleotidsegment med en publiceret D-segmentsekvens (Dsp 2.2) (Kurosawa, Y. et al., J. Exp. Med., 155: 201 (1982) og Tonegawa, S., Nature, 302: 575 (1983)). Et nonapeptid forudsagt ud fra dette område viste karakteristisk homologi med de 30 publicerede muse-tunge kæde-V-undergrupper ved aminosyrerester 86 til 94 omfattende FR3 af tunge kædemolekyler. Plasmid pJ3-ll repræsenterede en omordnet 44 DK 175581 B1 VDJ-sekvens og indeholdt tilsyneladende anti-hepatitis-VH-sekvensen frembragt af denne cellelinie.

Med henblik på at isolere en VH-region-cDNA-klon, som havde et BstEII-sted i 5 J-regionen, blev en 265 nukleotid lang Alul til Sau96I-sonde fra pJ3-11 derefter anvendt til at screene det cDNA-bibliotek, som var dannet ud fra 13-mer BstEII-primeren. Seks positive kloner blev isoleret. Det største, pBsl3-l, blev yderligere analyseret. Indføjelsen var 280 nukleotider lang, og dens restriktionskort stemte overens med det for pJ3-l 1 bortset fra det indførte BstEII-sted. I fig. 9 10 illustreres, hvorledes disse to indføjelser blev genkombineret til dannelse af pMVHCa-13, en VH-klon med det modulsammenføjende BstEII- sted. Tre yderligere VH-cDNA-kloner blev isoleret fra et cDNA- bibliotek, som var dannet ud fra 21-mer oligonukleotid UIG- MJH3BSTEII-primer indeholdende et BstEII-sted. Disse kloner kan tilvejebringe skiftende VH-cDNA-sekvenser til sammenføjning til humane 15 Cn-sekvenser.

(2) Fremstilling af cDNA-kloner og vehikler indeholdende de samme til variabel let kæde-muse-anti-HBsAg-region.

20 Eftersom JK2-sekvensen er til stede i mRNA fremstillet ud fra anti-hepatitis hybridomcellelinie blev oligonukleotidet UIG-JK2BGLII (fig. 7B) udformet til at indføre et Bglll-sted i JK2-regionen. Fordøjelse med BglH ville derefter muliggøre direkte indføjelse af en VK-cDNA-kodningsregion i BclI-stedet hos den tidligere omtalte humane Ck* vektor, pING2001. Denne indføjelse ville resultere i den præcise 25 sammenføjning af et variabelt museregionsegment (indbefattende J-regionen) til et humant, konstant kappa-regionsegment, hver i den korrekte kodningsramme uden nogen ændring i aminosyresekvens for hverken den variable museregion eller konstante humanregion.

30 JK2BGLIl-oligonukleotidet blev anvendt til at prime anti- HBsAg-mRNA til dannelse af et cDNA-bibliotek som for tung kæde, supra, i pUC9. cDNA blev udvalgt i størrelse 45 DK 175581 B1 ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese forud for kloning, og 80% af cDNA-kloneme blev vist at have indføjelsesstørrelser mellem 300 og 750 nukleotider i længde. Kopifiltre af dette bibliotek blev screenet med to oligonukleotider, den oprindelige primer og en anden sonde komplementær til JK2-sekvens 5’ til den op-5 rindelige primer.

Det blev opdaget, at den monoklonale anti-hepatitis B-celle- linie CRL 8017 secernerer immunoglobuliner med mindst to forskellige lette kæder. En af dem hidrører ffa myelom NS-1, der blev anvendt som en fusionspartner ved dannelse af anti-hepatitis 10 B-cellelinien. Eftersom NS-1 hidrører fra myelom MOPC21, undersøgtes den mulighed, at MOPC21 VK-mRNA kan være til stede i VK-cDNA-biblioteket fra den monoklonale antihepatitis-cellelinie. En af de analyserede cDNA-kloner (p6D4B) havde faktisk et identisk restriktionsenzymkort med det for MOPC21 Vk-cDNA bortset fra det indføjede BglH-sted.

15

To konklusioner kan drages af disse resultater. Den første er, at det er muligt effektivt at anvende et oligonukleotid til at indføre et restriktionsenzymsted, imens man kloner en VK-region ffa en hybridomacellelinie. Den anden er, at man omhyggeligt må overvåge hybridomacellelinier for tilstedeværelsen af multiple V-regionsekvenser, 20 hvoraf kun en har den ønskede sekvens.

Med henblik på yderligere at karakterisere kappa-let kæde-J-regioner, som er til stede i cellelinien mRNA, blev poly(A)+-RNA bundet til nitrocellulose ved hjælp af "Dot blot"-formaldehydproceduren ifølge White og Bancroft, J. Biol. Chem., 257: 8569 25 (1982). RNA blev hybridiseret til 32P-mærkede oligonukleotidsonder, som var specifikke for hver funktionel kappa J-region. Disse sonder er vist i fig. 7B som UIG-sondeme 5JK1, MJK, 5JK4 og 5JK5. Resultaterne viste, at mRNA hybridiserede kraftigt til både MJK- og 5JK4-oligonukleotidsondeme, hvilket indikerer, at både JK2-og JK4-sekvenser var til stede. Eftersom JK2-mRNA tidligere var blevet identificeret 30 som den, der var afledt fra parental hybridomapartneren NS-1, blev det konkluderet, at Ji<4-mRNA kodede for anti-hepatitisbindingsspecificitet hos CRL 8017-celleme.

46 DK 175581 B1

To forskellige cDNA-biblioteker blev screenet til isolering af V-regionkloner, som koder for JK4-sekvenser. Den første blev primet af JK2BGLII, supra. Den anden blev fremstillet ved anvendelse af oligonukleotidprimeren JK4BGLII, som er specifik for 5 JK4-mRNA og indfører et Bglll-sted i J-regionen af klonede V-regioner. JK4BGLII-primeren blev anvendt til at prime syntese af første cDNA-streng til opbygning af et cDNA-bibliotek ved hjælp af den samme metode, som blev anvendt til at konstruere et JK2BGLII-primet cDNA-bibliotek, bortset fra at cDNA ikke blev udvalgt efter størrelse forud for kloning.

10 I fig. 7B er opstillet i tabeller de umagetheder, som hver primer har med andre funktionelle kappa J-museregionsekvenser. Det skal bemærkes, at JK4 har fem umagetheder i 21 nukleotider ved sammenligning med JK2BGLII-primeren og tre i 23 ved sammenligning med JK4BGLII-primeren.

15

Begge biblioteker blev screenet for V-regionkloner indeholdende JK4-sekvenser ved hybridisering til en oligonukleotidsonde, som var specifik for JK4-sekvenser (5JK4). Resultaterne af denne screening er vist i tabel 1.

20 Tabel 1 1

Bibliotek Sondespecificitet

Jk.2 Jk4 25 JK2BGLII 2% (30/1500) 0,15% (2/1500) JK4BGLII N/D 3,5% (31/875)

Procentdel af kloner indeholdende JK2- eller JK4-sekvens plus en V-region. De anvendte sonder var oligonukleotidet 5JK4 (JK4-specificitet, fig. 7) og p6D4B, som 30 indeholder NS-1 (MOPC21) V-regionsekvensen. N/D, ikke foretaget.

47 DK 175581 B1

Flere JK4-V-region-cDNA-kloner isoleret fra begge biblioteker blev karakteriseret.

Disse kloner har identiske restriktionsenzymkort, herunder det gensplejsede Bglll-sted resulterende fra den oligonukleotidprimede cDNA-kloningsprocedure. Restriktionskortet og sekvensen for en klon, pV17, viste, at pV17 indeholder 5 V-regiongensekvenser.

Disse resultater viser, at JK2BGLII-primeren kunne prime JK4-mRNA-sekvenser korrekt, skønt ineffektivt. Eftersom JK2BGLII- primeren havde færre umagetheder med en hvilken som helst anden Ji<.-region-mRNA end med JK4-mRNA (fig. 7B), 10 forventes det, at de andre JK-mRNA'er kan primes på det korrekte sted med bedre effektivitet under anvendelse af JK2BGLII-primeren. Således kan effektiv cDNA-kloning af en hvilken som helst funktionel kappa V-museregion opnås ved anvendelse af en blanding af JK2BGLII- og JK4BGLII-primeme.

15 Anbringelse af et Bglll-sted i J-regionen under cDNA-kloning af V-regioneme muliggør sammenføjning af det klonede V-region-musegenmodul til det humane konstante kappa-regiongen-modul (fig. 9B).

Efter de føromtalte eksperimenter var udført, viste det sig, at cDNA-klonen pV17 20 manglede en komplet 5'-kodningsregion. Nukleotidsekventering viste, at A i initiatorcodonet ATG ikke var kopieret i pV17. Dette var ikke en tilfældig cDNA-kloningsartefarkt, fordi to andre cDNA-kloner havde den samme mangel. To fremgangsmåder blev udtænkt til opnåelse af et let kædegen med en komplet 5'-kodningsregion.

25 Først blev et nyt cDNA-bibliotek konstrueret ved først at prime med et oligonukleotid (5'-ATATTTGCTGATGCTCT-3') komplementært til pV17-sekvenser 155 baser fra 5’-enden. Fra dette bibliotek blev kloner, som hybridiserer til en p V17-DNA-fragment-sonde, udvalgt, og nogle af disse nye cDNA-kloner havde initiator-ATG plus ca. 20 30 nukleotider af ikke-translateret 5'-region. En af disse kloner, p2-12, fremskaffer en ikke-translateret 5'-region på 23 nukleotider og et komplet ATG-initiator- codon. Når 48 DK 175581 B1 p2-12 blev kombineret med pV17-afledte sekvenser, blev en variabel region med en komplet 5'-ende dannet (pING2013E).

Dernæst blev en stedsrettet mutagenese på den eksisterende lette kædeklon anvendt til 5 samtidigt at fjerne poly-G-området og anbringe en ribosomgenkendelsessekvens naboliggende til initiator-ATG. Pstl-fragmentet fra pV17 blev subklonet i Ml3-mpl8.

Et oligonukleotid (V17-IVM; 5-GTGTCGACTCAGCATGAGG- TTCCAGGTTC-3') blev derefter anvendt som en primer til at mutere pV17-sekvensen til at indbefatte et Sall-sted og en initiator-ATG i pV 17-sekvensen. Det resulterende plasmid pV17-IVM 10 tilvejebragte en skiftende variabel museregion til sammenføjning til konstante humanregi onmodul er.

Den komplette nukleotidsekvens af den variable region fra pV17 blev derefter bestemt. Sekvensen viser, at pV17 indeholder en VK-JK-foreningsregion, som indeholder 15 adskillige bevarede aminosyrer, og JK2/JK4-hybridregionen, som blev dannet ved at prime J]<4-RNA med UIG-JK2BGLII-oligonukleotidet. VK-regionen i pV17 er imidlertid ikke-fimktionel, fordi VK- og JK-regioneme ikke er i den samme kodningsramme. Translation af pV17-V-regionen ville således resultere i en abnorm immunoglobulin-let kæde, hvor J-regionen er translateret i en ukorrekt ramme. Denne 20 defekt kan være forårsaget af afvigende V-J-forening, hvilket resulterer i et ikke-funktionelt kappa-mRNA, som det er blevet observeret af D. E. Kelley et al., Mol.

Cell. Biol., 5: 1660-1675 (1985).

Eftersom pV17-V-regionen koder for et abnormt immunoglobulin, er det meget 25 usandsynligt, at denne lette kæde er del af et funktionelt anti-hepatitis-anti-stofmolekyle. Disse resultater viser vigtigheden af at overvåge hybridomaceller for tilstedeværelse af multiple RNA-arter, som koder for V-regioner, hvoraf kun en har den ønskede sekvens.

30 Yderligere screening af CRL 8017-cDNA-biblioteker blev foretaget for at søge efter VK-cDNA-kloner, som ikke er fra nogen af de to VK-cDNA-klasser, der er fundet indtil 49 DK 175581 B1 nu (M0PC21 -p6D4B, pV17). Først blev et oligo-dT-primet cDNA-bibliotek fremstillet ud fra CRL 8017-RNA screenet med en DNA-fragmentsonde specifik for denne konstante kapparegion og separat med sonder specifikke for MOPC21- og pV17-VK-regioner. En cDNA-klon (plE9L-81), som indeholder den konstante 5 kappa-region, men har en VK-region, som er forskellig fra den af MOPC21 og pV17, blev opdaget. Denne metode til screening af oligo-dT-primede cDNA-biblioteker er et nyttigt alternativ til oligonukleotidscreening af cDNA-biblioteker, fordi der anvendes haktranslaterede sonder med høj specifik aktivitet. Denne metode muliggør også den samtidige isolation af flere klasser af V-regionkloner, såsom alle VK-kloner, ved 10 passende sondevalg. For det andet blev det UIG-JK2BGLII-primede cDNA-bibliotek fremstillet ud fra CRL 8017-RNA screenet med UIG-5JK2-oligonukleotidsonden (se fig. 7). En ny klasse af VK-cDNA-kloner blev fundet, hvis bestanddele er homologe til plE9L-81 og hybridiserer til UIG-5JK2-sonden, men ikke til en MOPC21 -VK-sonde. Restriktionsendonukleasestedkortene og nukleotidsekvenseme for disse kloner afviger 15 også fra MOPC21-homologe VK-cDNA-kloner fra CRL 8017-celler. Disse kloner har imidlertid en afvigende V-J-forening, hvilket resulterer i et ikke-funktionelt mRNA, og synes at være identiske med den, som er beskrevet af Cabilly og Riggs (Gene, 40:157 (1985)).

20 Det blev derfor konkluderet, at anti-hepatitis B-cellelinien CRL 8017 har mindst tre klasser af VK mRNA svarende til de ovenfor beskrevne cDNA-kloner, p6D4B (MOPC21), plE9L og pV17. pIE9L- og pV17-kloneme hidrører fra mRNA fra på afvigende måde omordnede kappa-gener, mens p6D4B-klonen hidrører fra moderhy-bridomafusionspartneren NS-1. Ingen af disse kloner synes at kode for den ønskede 25 lette anti-hepatitiskæde.

(3) Fremstilling og ekspression af tung kæde indeholdende konstante human-/variable muse-regioner.

30 V-regionsekvenseme i pMVHCa-13 blev forbundet til den humane IgGl-konstante (C)-regionklon pGMH-6. På grund af tilstedeværelsen af et andet BstEII-sted inden i 50 DK 175581 B1

IgGl CH1-regionen af pGMH-6 var en flertrinsligering påkrævet. Først blev det 220 nukleotid lange BstEII-ffagment fra J-CH1-regionen af pGMH-6 ligeret til det li00 nukleotid lange IgG-region-BstEII til BamHI-fragment af pGMH-6. I en separat ligering blev det 420 nukleotid lange BstEII til BamHI-fragment af pMVHCa-13, hvil-5 ket fragment omfatter V-museregionen, forenet til en kalvetarmphosphatase-behandlet BamHI-plasmidvektor. De to ligeringer blev derefter kombineret, ligase blev tilsat, og produkterne blev transformeret i HB101, hvilket resulterede i den kimære muse-V-human-C-klon pMVHCc-24 (fig. 9A).

10 V-regionen af det tunge hybridkædegen i pMVHCc-24 blev yderligere analyseret ved delvis sekvensanalyse. Denne analyse viste, at den klonede V-region indeholdt en D-sekvens, som passer til en kendt D-sekvens, DSP2.2 (Kurosawa og Tonegawa, supra). Sekvensen forudsagde også et 19 aminosyrelederpeptid svarende til kendte tunge V-musekædelederpeptidsekvenser og en ikke-translateret 5'-region på mindst 3 15 nukleotider.

BamHI-ffagmentet indeholdende det tunge muse-human-hybridkædegen af pMVHCc-24 blev klonet i BamHI-fordøjet pING2003E-vektor, hvilket resulterede i ekspressionsplasmid piNG2006E (fig. 11). pING2006E-plasmidet skulle have en 20 forøget sandsynlighed for effektiv ekspression af det kimære muse-human-immu-noglobulinen i B-lymfeceller på grund af tilstedeværelsen af den tunge musekæde-forstærkerregion.

En modifikation af det kimære tunge kædegen til stede i pMVHCc-24 blev foretaget til 25 tilvejebringelse af et vekslende tungt kædegen, som mangler oligo-dC-regionen foranstående initiator-ATG. pING2032E- og pING2006E-vektoreme er identiske bortset fra nukleotideme umiddelbart foranstående ATG, som vist i fig. 12.

Bakterier, som huser pING2006E- og pSV2-neo-plasmideme, blev omdannet til 30 protoplaster ved hjælp af metoden af R. M. San- dri-Goldin et al., Mol. Cell. Biol., 1:743 (1981). Protoplasteme blev derefter separat sammensluttet til SP2/0-Agl4-hy- 51 DK 175581 B1 bridomaceller (ATCC CRL 1581) ved behandling med polyethylenglycol (A. Ochi et al., Nature, 302: 340, 1983). De sammensluttede celler fik lov at restituere sig i 72 timer i komplet medium før udpladning ved 10.000 eller 50.000 celler per brønd i en vævskulturplade med 96 brønde. Cellerne blev udvalgt med G418 ved 0,8 mg/ml i to 5 uger, da vækst i nogle brønde var helt tydelig. Under disse udvælgelsesbetingelser blev SP2/0-celler fuldstændigt dræbt inden for 4-7 dage af G418. Kun celler, som har integreret og udtrykt neo-genet til stede i vektorerne, vil vokse under G418-udvælgelse.

Antallet af brønde positive for vækst ved disse integrative transfektanter er vist i tabel 2.

52 DK 175581 B1

Tabel 2*

Stamme/ 10.000 50.000 5 plasmid celler/brønd celler/brønd MCl061/pING2006E 3(13%) 12(50%) MC1061 /pSV2-neo 7 (29%) 4 (17%) MC1061/ingen 0 0 10 _ * Procentdel af brønde, som udviser positiv vækst ud af 24 brønde.

Celler transficeret med pING2006E og pSV2-neo blev undersøgt for immunoglobulingenekspression på RNA- og proteinniveau. Total celle-RNA blev 15 fremstillet ud fra transficerede celler, blev bundet til nitrocellulose og hybridiseret til hak-translaterede sonder, som var specifikke for det tunge muse-human- hybrid-kædegen. To kloner blev fundet, som havde et stærkt signal, repræsenterende ekspression af genet på RNA-niveau. Mængden af totalt cellulært RNA, som hybridiserede til musehumansonden, forekom at være ca. 1/10 af niveauet af tung 20 RNA-kæde i de oprindelige hybridomaceller. Dette repræsenterede sandsynligvis ca.

1% af det totale mRNA af den transficerede celle.

De transficerede museceller blev også undersøgt for produktion af cytoplasmatisk tungt humankædeprotein ved en ELISA-analyse. Det viste sig, at tre ud af 7 25 pING2006E-transficerede cellelinier producerede påviselige niveauer af tungt humankædeprotein. Musecelletransformanten, som producerede mest tungt muse-humankædeprotein, gav et signal i ELISA-analysen, som var sammenligneligt med det af en 1/100 fortynding af en human B-cellelinie, som producerede intakt human immunoglobulin IgGl. Dette beskedne niveau af påvist tungt 30 muse-humankædeprotein kan skyldes flere faktorer, herunder tunge kæders ustabilitet i 53 DK 175581 B1 fravær af lette kæder i hybridomaceller eller ukorrekt oparbejdning af det kimære gentranskript.

(4) Genopformering af det integrerede kimære gen.

5

Southem-afitryksanalyse viste, at multiple kopier af pING2006E-DNA-sekvenseme blev integreret anbragt efter hinanden i musegenomet. Restriktionsenzymer Apal og Bglll spalter begge pING2006E enkeltvis. I transformanten, 2AE9, viste et bånd fra en Apal- eller Bglll-fordøjelse med den forventede størrelse (8,2 kb) sig at hybridisere til 10 de humane C-gamma 1 -sekvenser (data ikke vist). Et BamHI-bånd med den korrekte størrelse (1,6 kb) viste sig at hybridisere til humane såvel som 1E9 VH-sekvenser. Genkopititreringsforsøg (fig. 14) indikerede, at der er ca. 5 kopier af pING2006E i 2AE9-genomet. Den kendsgerning, at kun et enkelt bånd blev påvist i Apal- eller Bglll-banen, indikerer, at disse individuelle kopier er anbragt efter hinanden i en ordnet 15 opstilling. Et sæt af dobbeltfordøjelser viste, at pING2006E-sekvenser ikke gennemgik nogen omordning ved deres indføring ind i muse-DNA (data ikke vist).

Dernæst blev 2AE9-celleme transficeret med et plasmid, som indeholder en forskellig selekterbar markør, gpt-genet, og udvalgte kloner voksende ud i DMEM-HAT. En 20 klon, 2BH10, har ca. 38 ng opløseligt humant gamma 1-protein per 106 celler. Southem-analyse viste, at 2BH10 har ca. 30 kopier af pING2006E (fig. 14). De blev opformeret fra de 5 kopier i 2AE9 uden omordning af DNA-sekvenseme. (Sammenlign 2AE9-panelet med 2BH10). SI-data (data ikke vist) afslørede, at denne forøgelse i skabelon førte til en højere mængde af IgG-gentranskripter. Det menes, at disse 25 sekvenser blev co-opformeret med tilstødende cellulære sekvenser som et resultat af den anden udvælgelse.

EKSEMPEL III: Et kimært human-museantistof med cancerantigen specificitet.

30 (1) Antistof L6.

54 DK 175581 B1

Monoklonalt L6-antistof (MAb) blev opnået fra en mus, som var blevet immuniseret med celler fra humant lungecarcinom, hvorefter miltceller blev hybridiseret med NS-l-musemyelomaceller. Antistoffet binder til et tidligere ikke-identificeret car-bohydratantigen, som udtrykkes i store mængder ved overfladen af cellerne fra de 5 fleste humane carcinomer, herunder lungecarcinomer (adeno, pladeepitel), brystcarcinomer, tyktarmscarcinomer og carcinomer i æggestokkene, idet antigenet kun er til stede i spormængder i normale celler fra den voksne vært. MAb L6 er et lgG2a og kan formidle antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet, ADCC, i nærværelse af humane perifere blodleukocytter som en kilde til effektorceller til at lysere L6-positive 10 tumorceller, og det kan lysere L6-positive tumorceller i nærværelse af human serum som en komplementkilde; lysen påvises som frigivelse af 51 Cr fra mærkede celler i løbet af et 4 timers inkubationstidsrum. MAb L6 kan lokalisere sig til L6-positive tumorer, som er xenotransplanterede på blottede mus, og det kan inhibere udvæksten af sådanne tumorer. MAb L6 er beskrevet i Cancer Res. 46: 3917-3923, 1986 (på 15 MAb-specificitet) og i Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 7059-7063, 1986 (på MAb-funktion).p3 (2) Identifikation af J-sekvenser i immunoglobulin-mRNA af L6.

Frosne celler blev optøet på is i 10 minutter og derefter ved stuetemperatur. Suspensionen blev fortyndet med 15 ml PBS, og cellerne blev nedcentrifugeret. De 20 blev gensuspenderet, efter vask i PBS, i 16 ml 3M LiCl, 6M urinstof og ødelagt i en polytron forskyder. Fremstillingen af mRNA og udvælgelsen af poly- (A)+-fraktionen blev udført ifølge Auffray, C. og Rougeon, F., Eur. J. Biochem. 107: 303, 1980.

Poly(A)+-RNA fra L6 blev hybridiseret individuelt med mærkede JH1-, JH2-, JH3- og 25 JH4-oligonukleotider under betingelser beskrevet af Nobrega et al. Anal. Biochem. 131: 141, 1983. Produkterne blev derefter underkastet elektroforese i 1,7% agarose-TBE-gel. Gelen blev fikseret i 10% TCA, trykket tør og udsat for autoradiografi. Resultatet viste, at L6 VH indeholder JH2-sekvenser.

30 Til analysen af VK-mRNA blev punktaftryksmetoden ifølge White og Bancroft, J.

Biol. Chem. 257: 8569, (1982) anvendt. Poly(A)+-RNA blev immobiliseret på 55 DK 175581 B1 nitrocellulosefiltre og blev hybridiseret til mærkede sondeoligonukleotider ved 40° i 4xSSC. Disse eksperimenter viser, at L6 indeholder JK5-sekvenser. En svag hybridisering til JK2 blev obsen'eret.

5 (3) V-region-cDNA-kloner

Et bibliotek primet af oligo (dT) på L6-poly(A)+-RNA blev screenet for kappa-kloner med en CK-museregionsonde. Fra L6-biblioteket blev adskillige kloner isoleret. En anden screening med . en JK5-specifik 5'-sonde identificerede de lette 10 L6-(JK5)-kædekloner. Tunge kædekloner af L6 blev isoleret ved screening med JH2-oligonukleotidet.

De tunge og lette kædegener eller genfragmenter ffa cDNA-kloneme, pH3-6a og pL3-12a, blev indsat i M13-bakteriofagvektorer til nukleotidsekvensanalyse. De 15 komplette nukleotidsekvenser af den variable region af disse kloner blev bestemt (fig.

15 og 16) ved dideoxykædeafslutningsmetoden. Disse sekvenser forudsiger V-regionaminosyresammensætninger, som stemmer godt overens med de observerede sammensætninger, og forudsiger peptidsekvenser, som er blevet verificeret ved direkte amino-syresekventering af dele af V-regioneme.

20

Nukleotidsekvenseme af cDNA-kloneme viser, at de er immunoglobulin V-region-kloner, idet de indeholder aminosyrerester diagnostiske for V-områder (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; U.S. Dept of HHS, 1983).

25 L6-Vh hører til undergruppe II. cDNA forudsiger en N-terminal sekvens med 24 aminosyrerester identisk med den af en kendt VH (45-165 CRI; Margolies et al. Mol. Immunol. 18: 1065, 1981). L6-Vh har JH2-sekvensen. L6-Vl er fra VK-KpnI-familien (Nishi et al., Proc. Nat. Acd. USA 82: 6399, 1985) og anvender JK5. Det klonede L6-Vl forudsiger en aminosyresekvens, som blev fastslået ved aminosyresekventering af 30 peptider fra den lette L6-kæde svarende til rester 18-40 og 80-96.

56 DK 175581 B1 (4) In vitro-mutagenese til gensplejsning af restriktionsenzymsteder i J-regionen til forening til et humant C-modul og til fjernelse af oligo (dC)-sekvenser 5' til V-moduleme.

5 Begge kloner dannet ud fra priming med oligo (dT) L6-VK og L6-VH var nødvendige at modificere. Til L6-VK anvendtes J- regionmutageneseprimeren JKHindIII, som vist i fig. 17B. Et humant CK-modul afledt af en cDNA-klon blev mutageniseret til at indeholde Hindlll-sekvensen (se fig. 17A). Mutagenesereaktionen blev udført på Ml3-subkloner af disse gener. Frekvensen af mutante kloner lå i intervallet fra 0,5 til 10 l % af de opnåede plaques.

Det var tidligere blevet observeret, at oligo (dC)-sekvensen opstrøms for AUG-codonet i et kimært VH-gen griber forstyrrende ind i korrekt splejsning i en bestemt genkonstruktion. Det blev vurderet, at måske så meget som 70% af RNA-transkripteme 15 havde undergået missplejsning, hvori en kryptisk 3-splejsningsacceptor i ledersekvensen blev anvendt. Derfor blev oligo (dC)-sekvensen opstrøms for initiator-AUG fjernet i alle klonerne.

Ved en metode blev et oligonukleotid anvendt, hvilket oligonukleotid indeholder et 20 Sall-restriktionssted til at mutagenisere N6-VK-klonen. Primeren anvendt til denne oligonukleotidrettede mutagenese er en 22-mer, som indfører et Sall-sted mellem oligo (dC) og initiatormet-codonet (fig. 19).

Ved en anden metode blev nukleasen BAL-31 anvendt til at borttygge oligo (dC) i 25 L6-VH-klonen pH3-6a. Størrelsen af deletionen i to af de opnåede mutanter blev bestemt ved nukleotidsekventering og er vist i fig. 17. I begge disse mutanter (delta 4 og delta 21) blev alle oligo (dC) 5' til kodnings- regionen deleteret.

Disse kloner blev derefter modificeret ved oligonukleotidrettet mutagenese med 30 MJH2-ApaI-primeren (fig. 17). Denne 31-base primer indfører et Apal-sted i muse-Cn-genet ved en stilling, som er analog til et eksisterende Apalsted i humant 57 DK 175581 B1 C-ganima l-cDNA-genmodul. Primeren indfører de pågældende codoner for det humane C-gamma l-gen. Det kimære tunge kædegen fremstillet ved forening af det mutageniserede muse-VH~genmodul til et humant Cn-modul koder således for et kimært protein, som ikke indeholder humane aminosyrer for hele VH-regionen.

5

Det humane C-gamma 1-genmodul er et cDNA afledt fra GM2146- celler (Human Genetic Mutant Cell Repository, Newark, New Jersey). Dette C-gamma 1-genmodul blev tidligere kombineret med et muse-VH-genmodul til dannelse af det kimære ekspressionspi asmid pING2012E.

10 (5) Kimære L6-ekspressionsplasmider.

Kimære tunge L6-kædeekspressionsplasmider blev afledt fra erstatning af VH-modulet pING2012E med VH-moduleme af mutanter delta 21 og delta 4 til opnåelse af 15 ekspressionsplasmideme pING2111 og pING2112 (fig. 17). Disse plasmider dirigerer syntesen af kimær tung L6-kæde ved transfektion ind i pattedyrs- celler.

For det lette kimære L6-kædegen blev Sall- til Hindlll-ffagmentet af muse-VK-moduIet forenet til det humane CK-modul ved metoden, som er vist i hovedtræk i fig. 18, til 20 dannelse af pING2119. Erstatning af neo-sekvensen med E. coli-gpt-genet afledt fra pSV2-gpt resulterede i pING2120, som udtrykte kimær let L6-kæde og giver mycophenolsyreresistens ved transfektion ind i pattedyrsceller.

Inklusion af både tunge og lette kimære kædegener i det samme plasmid muliggør 25 indføring i transficerede celler i et l:l-genforhold mellem tunge og lette kædegener, hvilket fører til afbalanceret gendosering. Dette kan forbedre ekspression og mindske manipulationer af transficerede celler til optimal kimær antistofekspression. Til dette formål blev DNA-fragmenteme hidrørende fra de kimære tunge og lette kædegener af pING2111 og pING2119 kombineret i ekspressionsplasmidet pING2114 (fig. 19).

30 Dette ekspressionsplasmid indeholder en selekterbar neoR-markør og separate 58 DK 175581 B1 transkriptionsenheder for hvert kimære gen, hver indbefattende en tung mu sekæde forstærker.

Modifikationerne og V-C-foreningsregioneme af de kimaere L6- gener er vist kortfattet 5 i fig. 20.

(6) Stabil transfektion af muselymfeceller til fremstilling af kimært antistof.

Elektroporering blev anvendt (Potter et al., supra; Toneguzzo et al. Mol. Cell. Biol.

10 6:703, 1986) til indføring af kimært L6-ekspressionspIasmid-DNA i Sp2/0-museceller.

Elektroporeringsteknikken gav en transfektionsfrekvens på 1-10 x 10 s for Sp2/0-cel-leme.

Togensekspressionsplasmidet pING2114 blev lineariseret ved fordøjelse med 15 Aatll-restriktionsendonuklease og transficeret ind i Sp2/0-celler til opnåelse af ca. 50 G418-resistente kloner, som blev screenet for human tung og let kædesyntese. Niveauerne af kimær antistofkædesyntese fra de to producenter, D7 og 3E3, er vist i tabel 3. Kimært L6-antistof blev frem- stillet ved dyrkning af D7-transfektantceller i 24 timer ved 2xl06 celler/ml i 5 1 DMEM suppleret med HEPES-puffer og penicillin og 20 streptomycin. Supematanten blev koncentreret over en "Amicon YM30"-membran i 10 mM natriumphosphatpuffer, pH-værdi 8,0. Præparatet blev fyldt på en DEAE-cellulosesøjle, som adskilte immunoglobulinet i ubundne og bundne fraktioner.

Prøver fra de DEAE-ubundne præparater, de DEAE-bundne præparater og præDEAE-præparateme (fra 1,6 fil medium) blev separat oprenset ved 25 affmitetskromatografi på en pr otei η - A-seph arosesøj 1 e ved eluering med 0,1 M natriumcitrat, pH-værdi 3,5. Det eluerede antistof blev neutraliseret og koncentreret ved "Amicon centricon"-filtrering i phosphatpufret salt. Udbytterne for de tre præparater var 12 fig (DEAE-ubundet), 6 fig (DEAE-bundet) og 9 fig (præ-DEAE-søjle). Western-analyse af antistofkædeme indikerede, at de var 30 kombineret i en H2L2-tetramer ligesom naturligt forekommende immunoglobuliner.

59 DK 175581 B1 (7) En anden oprensning for kimært L6-antistof secerneret i vævskultur.

a. Sp2/0.pING2114.D7-celler blev dyrket i kulturmedium [DMEM (Gibco #320-1965), suppleret med 10% føtal bovinserum (Hyclone #A-1111-D), 10 mM

5 HEPES, 1 x Glutamin-Pen-Strap (Irvine Scientific #9316) til 1 x 106 celler/ml.

b. Cellerne blev derefter centrifugeret ved 400 x g og gensuspenderet i serumfrit kulturmedium ved 2 x 106 celler/ml i 18-24 timer.

10 c. Mediet blev centrifugeret ved 4000 o/m i en JS-4,2-rotor (3000 x g) i 15 minutter.

d. 1,6 liter supernatant blev derefter filtreret gennem et 0,45 gm filter og derefter koncentreret over et YM30-filter (Amicon Corp.) til 25 ml.

15 e. Ledningsevnen af denne koncentrerede supernatant blev indstillet til 5,7-5,6 mS/cm, og pH-værdien blev indstillet til 8,0.

f. Supematanten blev centrifugeret ved 2000 x g i 5 minutter og blev derefter fyldt på en 40 ml DEAE-søjle, som forud var ækvilibreret med 10 mM natriumphosphat, 20 pH-værdi 8,0.

g. Gennemstrømningsfraktionen blev opsamlet og fyldt på en 1 ml protein A-sepharose-søjle (Sigma), som var præækvilibreret med 10 mM natriumphosphat, pH-værdi 8,0.

25 h. Søjlen blev vasket først med 6 ml 10 mM natriumphosphatpuffer, pH-værdi 8,0, efterfulgt af 8 ml 0,1 M natriumcitrat, pH-værdi 3,5, og derefter af 6 ml 0,1 M citronsyre (pH-værdi 2,2). Fraktioner på 0,5 ml blev opsamlet i rør indeholdende 50 /il 2 M Trisbase (Sigma).

30 60 DK 175581 B1 i. Det meste af IgG var i elueringsvæsken ved pH 3,5 og blev samlet og koncentreret over Centricon 30 (Amicon Corp.) til ca. 0,06 ml.

j. Pufferen blev ændret til PBS (10 mM natri umphosphat, pH-værdi 7,4, 0,15 M

5 NaCl) i Centricon 30 ved gentagen fortynding med PBS og genkoncentrering.

k. IgG-opløsningen blev derefter indstillet til 0,10 ml, og bovint serumalbumin (Fraction V, U.S. Biochemicals) blev tilsat til en koncentration på 1,0% som et stabiliserende reagens.

10 (8) Fremstilling og oprensning af kimært L6-antistof secerneret i bugvattersotvæske.

a. Bugvattersotvæsken blev først centrifugeret ved 2000 x g i 10 minutter.

15 b. Ledningsevnen af supematanten blev indstillet til 5,7-5,6 mS/cm, og dens pH-værdi blev indstillet på 8,0.

c. Supematanten blev derefter fyldt på en 40 ml DEAE-cellulosesøjle, som var præ-ækvilibreret med 10 mM Na2P04H, pH-værdi 8,0.

20 d. Gennemstrømningsfraktionen ffa DEAE-søjlen blev opsamlet, og dens pH-værdi blev indstillet til 7,4, hvorefter den blev fyldt på en 1,0 ml gede-antihuman-IgG (H+L)-sepharosesøjle.

25 e. Søjlen blev vasket, først med 6 ml 10 mM natriumphosphat, 0,5 M natriumchlorid, efterfulgt af 8 ml 0,5 M NH4OH og 3 M natriumthiocyanat.

f. Natriumthiocyanateluatet blev samlet og dialyseret over for 2 1 PBS natten over.

30 Antistoffet kan yderligere koncentreres ved trinnene j. og k. i den tidligere metode.

61 DK 175581 B1 TABEL 3

Niveauer af secernerede kimære L6-kæder fra Sp2/0-transfektantera 5

Sp2/0.D7 Sp2/0.3E3

Kulturforhold FBS Kappab Gammac Kappab Gammac 1.20 ml, 2d, + 17 77 100 700 podestof @ 2xl05/ml 10 2.200 ml, 2d, + 0,9 6 80 215 podestof @ 2,5x105/ml 3.200 ml, ld, - 1,9 3,8 97 221 15 podestof @2x106/ml

4. Balb/c bugvattersot - 5.160 19.170 ND ND

ascites 20 a - Sp2/0-celler transficeret ved elektroporering med pING2114 (pL6HL) b - p.g/1 målt ved ELISA specifik for human kappa - human Bence-Jones proteinstandard.

c - μg/I målt ved ELISA specifik for human gamma - human IgG-standard.

ND - ikke bestemt.

25 FBS: føtal bovinserum.

(9) Undersøgelser udført på det kimære L6-antistof.

Prøverne blev først undersøgt ved en bindingsanalyse, hvori celler af både en 30 L6~antigen-positiv og L6-antigen-negativ cellelinie blev inkuberet med monoklonalt standardmuseantistof-L6, kimært L6-antistof afledt fra cellekultursupematanteme og 62 DK 175581 B1 kimært L6-antistof afledt ffa bugvattersot (ascites) (som tidligere beskrevet) efterfulgt af et andet reagens, fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugerede gedeantistoffer for humant (eller muse-, for standarden) immunoglobulin.

5 Eftersom bindingsanalysen viste stærk reaktivitet af det kimære L6 på den L6-antigen-positive cellelinie og total mangel på reaktivitet på den negative cellelinie, var det næste trin at undersøge det kimære L6's evne til at inhibere bindingen af muse-L6 til antigen-positive celler; sådanne inhiberingsanalyser anvendes rutinemæssigt til at etablere identiteten af to antistoffers genkendelse af antigen. Disse 10 data er diskuteret nedenfor ("inhibering af binding"). Som del af disse undersøgelser blev en grov vurdering af antistof-iver foretaget.

Til sidst blev to aspekter af antistoffunktion undersøgt, evnen til at formidle ADCC i nærværelse af humane perifere blodleukocytter og evnen til at dræbe L6-positive 15 tumorceller i nærværelse af human serum som en komplementkilde (se "Funktionelle analyser" nedenfor).

Bindingsanalvser. Celler fra en human tyktarmscarcinomlinie, 3347, som tidligere var blevet vist at udtrykke ca. 5 x 105 molekyler af L6-antigenet ved celleoverfladen, blev 20 anvendt som målceller. Celler fra T-cellelinien HSB2 blev anvendt som en negativ kontrol, eftersom de ifølge en tidligere undersøgelse ikke udtrykker påviselige mængder af L6-antigenet. Målcellerne blev først inkuberet i 30 minutter ved 4°C med enten det kimære L6 eller med L6-musestandard, som var blevet oprenset fra musebugvattersot. Dette blev fulgt af inkubering med et andet, FITC-mærket reagens, 25 som for det kimære antistof var gede-antihuman-immunoglobulin, leveret fra TAGO (Burlingame, CA) og anvendt ved en fortynding på 1:50. For musestandarden var det gede-antimuse-immunoglobulin, som også var leveret fra TAGO og blev anvendt ved en fortynding på 1:50. Antistofbinding til celleoverfladen blev bestemt under anvendelse af et "Coulter Model EPIC-C"-cellesorterapparat.

30 63 DK 175581 B1

Som vist i tabel 4 og 4A bandt både det kimære L6 og musestandard-L6 signifikant og ca. i samme grad til den L6-positive 3347-linie. De bandt ikke over baggrund til den L6-negative HSB2-linie.

5 I lyset af den kendsgerning, at de tre forskellige kimære L6-prøver præsenteret i tabel 4 optrådte på samme måde i bindingsanalyseme, blev de samlet til de nedenfor beskrevne inhiberingsundersøgelser. De samme inhiberingsundersøgelser blev udført for kimært L6 afledt fra bugvattersotvæske præsenteret i tabel 4A.

10 Inhibering af binding. Som det næste trin undersøgtes den udstrækning, hvormed graduerede doser af det kimære L6-antistof eller standardmuse-L6 kunne inhibere bindingen af et FITC-mærket muse-L6 til overfladen af antigen-positive 3347 tyktarms-carcinomceller.

15 Både det kimære L6 og musestandard-L6 inhiberede bindingen af det direkte mærkede L6-antistof, idet bindingskurveme var parallelle. Det kimære antistof var en anelse mindre effektivt end standarden, som det indikeres af resultaterne, som viste, at 3,4 gg/ml af det sammenbragte kimære L6-MAb i sammenligning med 2,0 jig/ml af standardmuse-L6 MAb var nødvendigt til 50% inhibering afbindingen, og at 5,5 /ig/ml 20 af det kimære L6 (afledt ffa bugvattersot) i sammenligning med 2,7 /tg/ml af stan-dardmuse-L6 MAb var nødvendigt til 50% inhibering afbinding.

Som del af disse undersøgelser blev der foretaget et groft skøn over antistof-iver.

Iveren hos standardmuse-L6 var tidligere bestemt til at være ca. 4 x 108. Dataene 25 indikerede, at der ikke var nogen signifikante forskelle i iver mellem det kimære L6 og muse-L6.

Funktionelle analyser. En sammenligning blev foretaget mellem evnen hos det kimære L6 og standardmuse-L6 til at lysere L6 antigen-positive celler i nærværelse af humane 30 perifere blodleukocytter som en kilde for effektorceller (formidlende anti- stofafhængig 64 DK 175581 B1 cellulær cytotoksicitet, ADCC) eller human serum som en komplementkilde (formidlende komplementafhængig cytolyse, CDC).

Som vist i tabel 5 og tabel 5A-5D var det kimære L6 overlegent i forhold til den 5 samtidigt undersøgte prøve af muse-L6 til at bevirke ADCC, som målt ved en 4 timers 51 Cr-ffigivelsesprøve.

I tabel 6 og 6A-6B ses dataene ffa undersøgelser af komplement-formidlet målcellelyse. I dette tilfælde blev en høj cytolytisk aktivitet observeret med både 10 muse-L6-antistoffer og kimære L6-antistoffer.

Konklusioner.

De ovenfor anførte resultater viser en række vigtige, uventede kvaliteter hos det 15 kimære monoklonale L6-antistof ifølge opfindelsen. For det første binder det kimære L6-antistof til L6-antigen-positive tumorceller i ca. samme udstrækning som musestandard-L6 og med ca. den samme iver. Dette er signifikant af de følgende grunde. L6-antistoffet definerer (a) et carbohydratoverfladeantigen og (b) et proteinantigen på ca. 20.000 dalton, som begge er karakteristiske for ikke-småcelle-20 lungecarcinom (NSCLC) og visse andre humane carcinomer. Det er værd at lægge mærke til, at L6-antistoffet ikke binder i påviselig grad til normale celler, såsom fibroblaster, endotelceller eller epitelceller i de større organer. Således definerer det kimære monoklonale L6-antistof et antigen, som er specifikt for carcinomceller og ikke normale celler.

25

Udover evnen hos de kimære monoklonale L6-antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse til at binde specifikt til maligne celler og lokalisere tumorer, udviser det kimære L6 dybtgående biologiske virkninger efter binding til dets mål, hvilket gør det kimære antistof til en fortrinlig kandidat til tumorimmunoterapi. De heri præsenterede 30 resultater viser, at kimært L6 er i stand til at binde til tumorceller og efter binding dræber tumorcelleme enten ved ADCC eller CDC. En sådan tumordræbende aktivitet blev 65 DK 175581 B1 påvist under anvendelse af koncentrationer af kimært L6-antistof så lave som 0,01 ptg/ml (10 ng/ ml).

Selvom udsigten ved at forsøge tumorterapi under anvendelse af monoklonale 5 antistoffer er attraktiv, idet nogle delvise tumortilbageslag er blevet rapporteret, er en sådan monoklonal antistofterapi indtil dato blevet mødt med begrænset succes (Houghton, februar 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1242- 1246). Den terapeutiske effektivitet af monoklonale museantistoffer (som er dem, som er blevet prøvet indtil nu) synes at være for lav til de fleste praktiske formål. Opdagelsen af den fortrinlige 10 biologiske aktivitet af kimært L6 forbundet med dets specificitet for et carcinomantigen gør det kimære L6-antistof til et velvalgt terapeutisk middel til behandling af tumorer in vivo. På grund af de "humane" egenskaber, som vil gøre de kimære monoklonale L6-antistoffer mere resistente over for cleareance in vivo, vil de kimære monoklonale L6-antistoffer endvidere med fordel ikke kun kunne anvendes til terapi med 15 umodificerede kimære antistoffer, men også til udvikling af forskellige immunokonjugater med lægemidler, toksiner, imrnunomodulatorer, isotoper, etc., såvel som til diagnostiske formål, såsom in vivo-billeddannelse af tumorer under anvendelse af hensigtsmæssigt mærkede kimære L6-antistoffer. Sådanne immunokonju-geringsteknikker er kendt af fagfolk inden for området og kan anvendes til at 20 modificere de kimære L6-antistofmolekyler ifølge den foreliggende opfindelse.

To illustrative cellelinier, som secernerer kimært L6-antistof, blev deponeret forud for indleveringsdatoen for nærværende ansøgning ved ATCC, Rockville, Maryland. Disse er transficeret hybridoma C255 (svarer til 3E3-celler, supra), ATCC HB 9240 og 25 transficeret hybridoma C256 (C7-celler, supra), ATCC HB 9241.

Den foreliggende opfindelse skal ikke begrænses i omfang af disse deponerede cellelinier, eftersom den deponerede udførelsesform er tilsigtet som en enkelt illustration af et aspekt ved opfindelsen, og alle cellelinier, som er funktionelt ækvi-30 valente, er inden for opfindelsens omfang. Forskellige modifikationer af opfindelsen 66 DK 175581 B1 udover de viste inden for teknikken fra den foregående beskrivelse og ledsagende tegninger er tilsigtet at høre inden for omfanget af de ledsagende krav.

TABEL 4 5 Bindingsanalyser af kimært L6-antistof og monoklonalt L6-museantistof på en L6-antigen-positiv og L6-antigen-negativ cellelinie.

Bindingsforhold for1 H3347-celler (L6 +)

10 Antistof Batch GAM GAH

Standard L6 56,6 4,2

Kimært L6 a 1,3 110,3 b 1,3 110,3 15 c 1,3 110,3

Bindingsforhold for1 HSB-2-celler (L6

20 GAM GAH

Standard L6 1,1 1,1

Kimært L6 a 1,0 1,0 b 1,0 1,1 25 c 1,0 1,1

Alle analyser blev udført under anvendelse af en antistofkoncentration på 10 /xg/ml. Bindingsforholdet er det antal gange en testprøve er mere klar end en kontrolprøve behandlet med GAM (FITC-konjugeret gede-antimus) eller GAH (FITC-konjugeret 30 gede-antihuman) alene. Et forhold på 1 betyder, at testprøven er lige så klar som kontrollen; et forhold på 2 betyder, at testprøven er 2 gange så klar som kontrollen, etc.

67 DK 175581 B1

TABEL 4A

Bindingsanalyser af kimært L6-antistof og monoklonalt muse- antistof på en L6-antigen-positiv og L6-antigen-negativ cellelinie.

5 Antistof- Bindingsforhold for1 koncentration H3347-celler (L6 +)

Antistof (qg/mO GAM GAH

Standard L6 30 38 4 10 49 4 10 3 40 3

Kimært L6 30 2 108 (Bugvattersot) 10 2 108 3 1 42 15 Kimært L6 30 1 105 (Cellekultur) 10 1 86 3 1 44

Bindingsforhold for2 20 HSB-2-celler fL6 -)

GAM GAH

Standard L6 10 1 1

Kimært L6 10 1 1 (Bugvattersot) 25 Kimært L6 10 1 1 (Cellekultur)

Bindingsforholdet er det antal af gange en testprøve er mere klar end en kontrolprøve 2 behandlet med GAM (FITC-konjugeret gede-antihuman) alene. Et forhold på 1 30 betyder, at testprøven er lige så klar som kontrollen; et forhold på 2 betyder, at testprøven er 2 gange så klar som kontrollen, etc.

TABEL 5 ADCC af kimære L6-antistoffer og standard (muse)-L6-antistoffer på tyktarmscar- cinomcellelinie 3347.

68 DK 175581 B1 5 Antistof koncentration PBL per %

Antistof fug/ml) målcelle Cytolvse1

Kimært L6 10 100 64 10 5 100 70 10 0 2

Standard L6 10 100 24 5 100 17 15 10 0 2

Ingen 0 100 1 Målcellerne var blevet mærket med 51Cr og blev påvirket i 4 timer af en kombination af MAb og humane perifere blodleukocytter (PBL), og frigivelsen af 51 Cr blev målt 20 efterfølgende. Frigivelsen af 51Cr (efter korrektioner for værdier af spontan frigivelse fra ubehandlede celler) er et mål for den procentvise cytolyse.

TABEL 5A

ADCC af kimære L6-antistoffer og standard (muse)-L6-antistoffer på tyktarmscarcinomcellelinie 3347.

69 DK 175581 B1 5 Antistof koncentration PBL per %

Antistof (qg/mO målcelle Cvtolvse*

Kimært L6 20 100 80 (Bugvattersot) 10 100 74 10 5 100 71 2,5 100 71 20 0 0

Kimært L6 10 100 84 (cellekultur) 5 100 74 15 2,5 100 67 10 0 3

Standard L6 20 100 32 10 100 26 20 0 0 20 _ * Målcellerne var blevet mærket med 51 Cr og blev påvirket i 4 timer af en kombination af MAb og humane perifere blodleukocytter (PBL), og frigivelsen af 51 Cr blev målt efterfølgende. Frigivelsen af51 Cr (efter korrektioner for værdier af spontan frigivelse fra ubehandlede celler) er et mål for den procentvise cytolyse.

25

TABEL 5B

ADCC af kimære L6-antistoffer og standard (muse)-L6-antistoffer på tyktarmscar- cinomcellelinie 3347.

70 DK 175581 B1 5 Antistof- koncentration PBL per %

Antistof ( qg/ml) målcelle Cvtolvse*

Kimært L6 5 100 84 (Bugvattersot) 2,5 100 78 10 1,25 100 85 0,63 100 81 0,31 100 80 0,16 100 71 0,08 100 65 15 5 0 0

Standard L6 5 100 32 5 0 0

Ingen 0 100 19 20 _ * Målcellerne var blevet mærket med 51Cr og blev påvirket i 4 timer af en kombination af MAb og humane perifere blodleuko cytter (PBL), og frigivelsen af 5,Cr blev målt efterfølgende. Frigivelsen af 51Cr (efter korrektioner for værdier af spontan frigivelse fra ubehandlede celler) er et mål for den procentvise cytolyse.

25

TABEL 5C

ADCC af kimære L6-antistoffer og standard (muse)-L6-antistoffer på lungecarcinom- cellelinie H2669.

71 DK 175581 B1 5 Antistof koncentration PBL per %

Antistof (tcg/ml) målcelle Cvtolvse*

Kimært L6 10 100 35 · (Bugvattersot) 1 100 31 10 0,1 100 27 0,01 100 15 0,001 100 13 0,0001 0 15 15 Standard L6 10 100 9 1 100 15

Ingen 0 100 9 20 Kimært L6 10 10 19 (Bugvattersot) l 10 15 0,1 10 11 0,01 10 13 0,001 10 22 25 0,0001 10 11

Standard L6 10 10 7 1 10 6

Ingen 0 10 S

Kimært L6 10 0 4 30 (Bugvattersot)

Standard L6 10 0 9 72 DK 175581 B1 * Målcellerne var blevet mærket med 51 Cr og blev påvirket i 4 timer af en kombination af MAb og humane perifere blodleuko cytter (PBL), og frigivelsen af 51Cr blev målt efterfølgende. Frigivelsen af 51Cr (efter korrektioner for værdier for spontan frigivelse 5 fra ubehandlede celler) er et mål for den procentvise cytolyse.

TABEL 5D

ADCC af kimære L6-antistoffer og standard (muse)-L6-antistoffer på tyktarmscarci-nomcellelinie H3347.

10 _

Antistofkoncentration PBL per %

Antistof f^g/ml) målcelle Cytolyse1

Kimært L6 10 100 62 15 (Bugvattersot) 1 100 66 0,1 100 69 0,01 100 26 0,001 100 8 0,0001 0 3 20 10 0 0

Standard L6 10 100 19 1 100 24 0 0 25

Ingen 0 100 8 Målcellerne var blevet mærket med 51 Cr og blev påvirket i 4 timer af en kombination MAb og humane perifere blodleukocytter (PBL), frigivelsen af51 Cr (efter korrektioner 30 for værdier for spontan frigivelse fra ubehandlede celler) er et mål for den procentvise cytolyse.

73 DK 175581 B1 TABEL 6

Komplement-afhængig cytotoksisk effekt af kimært L6 og standard-(muse)-L6 på tyktarmscarcinomceller ffa linie 3347 som målt ved en 4-timers 5lCr-ffigivelsesanalyse.

5 Humant serum fra et sundt individ blev anvendt som komplementkilde.

Antistof Human-komplement % cytolyse 10 L6-standard 10 ^g/ml Ja 90 L6-kimært 10 /ig/ml Ja 89 L6-standard 10 /tg/ml Nej 0 L6-kimært 10/ig/ml Nej 1 15 _ 74 DK 175581 B1

TABEL 6A

Komplement-afhængig cytotoksisk virkning af kimære L6-an ti stoffer og $tandard-(mu-se)-L6-antistoffer på tyktarmscarcinom- cellelinie 3347 5 Antistof koncentration PBL per %

Antistof fug/ml) målcelle Cvtolvse*

Kimært L6 20 + 29 10 (Bugvattersot) 10 + 23 5 +18 2.5 + 8 20 Inaktiveret 0 10 0 0 15

Kimært L6 20 + 29 (Cellekultur) 5 +26 2.5 + 18 20 +4 20 10 0 4

Standard L6 20 + 55 10 + 37 20 Inaktiveret 0 25 20 0 1

Ingen 0+0 * Komplement-formidlet cytolyse blev målt ved en 4 timers 51 Cr-frigivelsesanalyse.

30 Humant serum fra et sundt individ blev anvendt som komplementkilde.

75 DK 175581 B1

TABEL 6B

Komplement-afhængig cytotoksisk virkning af kimære L6-antistoffer og stand-ard-(muse)-L6-antistoffer på tyktarmscarcinom-cellelinie 3347 5 Antistof koncentration PBL per %

Antistof (ug/ml) målcelle Cytolvse*

Kimært L6 10 + 209 10 (Bugvattersot) 5 + 155 2.5 + 166 1,25 + 114 0,6 + 63 0,3 +17 15 10 0 0

Standard L6 10 + 96 5 +83 2.5 + 48 20 1,25 + 18 0,6 + 7 0,3 + 4 10 0 2 25 Ingen 0 +0 * Komplement-formidlet cytolyse blev målt ved en 4 timers 51 Cr-frigivelsesanalyse.

Humant serum fra et sundt individ blev anvendt som komplementkilde.

30 EKSEMPEL IV: Et kimært human-muse-antistof med specificitet for humant B-celle-antigen 76 DK 175581 B1

Det monoklonale 2H7-museantistof (gamma 2i>K) genkender et humant B-celleoverfladeantigen, Bp35 (Clark, E. A., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 1766 (1985)). Bp35-molekylet spiller en rolle i B-celleaktivering. mRNA blev fremstillet ud fra 2H7-cellelinien. To cDNA-biblioteker blev dannet under anvendelse 5 af den tunge UIG-H-kædeprimer og den anden, oligo(dT). En VH-klon, pH2-ll, blev isoleret efter screening med det samme UIG-H-oligonukleotid. Til isolering af den lette kædeklon blev et kappa-specifikt DNA-museffagment anvendt til at screene oligo(dT)-biblioteket. Kandidatkloner blev yderligere screenet med JK5-muse-sekvenser. En VK-klon, pL2-12, blev således isoleret. Den lette kæde UIG-K blev 10 derefter anvendt til at gensplejse et restriktionsenzymsted i J-regionen.

De to cDNA-kloner blev også modificeret ved 5'-enden til fjernelse af den kunstige oligo d[C]-sekvens. I pH2-l 1 blev dette udført ved anvendelse af restriktionsenzymet Ncol, som skærer en nukleotidrest 5' for ATG-initiatorcodonet. I pL2-12 blev dette 15 opnået ved hjælp af en oligonukleotid-in vitro-mutagenese under anvendelse af en 22-mer indeholdende et Sall-sted.

DNA-sekvenseme af disse to kloner er vist i fig. 21 og 22. Til konstruktion af det kimære tunge kædeplasmid blev VH-modulet forenet til det humane C-gamma 1-modul 20 (pGMH6) ved JH- BstEII-stedet, og den kimære lette kæde, VK-modulet, blev forenet til det humane Cjc-modul (pGML60) ved JK-HindIII-stedet. Ekspressionsvektor-sekvenseme blev afledt fra pING2012-neo såvel som pING2016-gpt. De konstruerede plasmider er pING2101 (VHC-gamma 1-neo), pING2106 (VKCK-neo) og pING2107 (Vi<.CK-gpt). pING2101 og pING2106 blev også anvendt til at danne plasmider 25 indeholdende begge gener. Disse er pHL2-l 1 og pHL2-26. Endvidere blev pING2106 og pING2014 kombineret til et plasmid indeholdende to lette kæder, pLL2-25, til at kompensere for den dårligere (i sammenligning med tung kæde) "steady-state"-akkumulation af let kædeprotein i transficerede celler (se fig. 23). I fig.

24 ses ændringerne foretaget i de variable regionsekvenser under konstruktionen.

30 77 DK 175581 B1

Plasmidet, pHL2-l 1, blev lineariseret ved hjælp af Aatll; og DNA'et blev anvendt til at transficere Sp2/0-celler ved elek- troporering. Transforman ter blev udvalgt i G418-DMEM. En transformant, 1C9, producerer 9,3 ng/ml kimært kappa-protein og 33-72 ng/ml kimært gamma 1-protein, som bestemt ved ELISA. Southem-analyse af 5 1C9-DNA viste, at der en kopi af plasmidet integreret i Sp2/0-genom.

EKSEMPEL V: Sekretion af et funktionelt kimært antistof fra gær (1) Sammenslutning af fuldt udviklede lette og tunge kimære L6-kædegener til 10 gærinvertasesignalsekvensen og afkortet phosphoglyceratkinase (PGK-promotor).

Gærceller er i stand til at genkende pattedyrssekretionssignalsekvenser og til at dirigere sekretion af pattedyrsproteiner (Hitzman et al., supra). Der er imidlertid vidnesbyrd, som antyder, at visse naturligt forekommende gærsignalsekvenser er mere effektive 15 end pattedyrssignal sekvenser til at dirigere sekretion af nogle pattedyrsproteiner ffa gær (Smith et al, Science 229: 1219 (1985)). Et eksempel er signalsekvensen for gærinvertasegenet. Til forbedring af effektiviteten aflet og tung kædesekretion blev de fuldt udviklede lette og tunge kædesekvenser sammensluttet til gærinvertasesignalsekvensen og anbragt under transkriptionskontrol af den afkortede PGK-promotor (US 20 patentansøgning nr. 797.477) under anvendelse af de strategier, som er skitseret i henholdsvis fig. 25 og 26. Et vigtigt element ved disse konstruktioner er anvendelsen af in vitro-mutagenese til indføring af et restriktionssted ved signalsekvensprocesstedet for både invertasesignalsekvensen (se US patentansøgning nr. 797.477) og de lette og tunge kædegener. Disse restriktionssteder anbringes således, at en stumpendet ligering 25 af restriktionsenzym-fordøjet T-4-DNA-polymerase-behandlet DNA resulterer i i-fase-translationssammenslutninger af 5'-enden af de fuldt udviklede immunoglobulin-kæder med 3'-enden af gærinvertasesignalsekvensen. Sådanne gener kan, når de er udtrykt i en gærcelle, dirigere syntesen, oparbejdningen og sekretionen aflette og tunge kimære kæder med den samme primære peptidsekvens, som kimære lette og tunge 30 kæder secernerede fra transficerede muse-Sp2/0-celler. DNA-sekvenseme for mutageneseprimeme, der anvendes til lette og tunge kædegener, såvel som de 78 DK 175581 B1 tilsvarende ikke-mutageniserede sekvenser, er vist i henholdsvis fig. 25B og 26B. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde blev de lette og tunge kimære L6-kæder sammensluttet til gærinvertasesignalsekvensen og afkortet PGK-promotor, hvilket resulterede i plasmideme pING 1407-7 og pING1415 (fig. 25C og 26C).

5 (2) Fjernelse af ikke-gær 3'-ikke-translateret DNA.

Nylige undersøgelser af ekspression af hepatitis B-overfladeantigen i gær viste, at fjernelse af ikke-gær 3'- og 5'-ikke-translaterede sekvenser kan resultere i forøgede 10 niveauer af heterolog genekspression i gær (Knieskin et al., Gene, 46: 135 (1986)). Den lette kædgensekvens af kimært L6-antistof i pING 1407-7 (fig. 25C) indeholder ca. 200 bp 3'-ikke-translateret DNA efterfulgt af 70 bp poly A-sekvens og 20 bp poly G-sekvens. En indledningsvis behandling af det kimære lette L6-kæde-DNA med dobbeltstrenget exonuklease Bal31 fjernede poly A- og poly G-sckvenseme og alt, 15 bortset fra 90 bp 3'-ikke-translateret DNA, til dannelse af plasmidet pING2121b (fig.

27). Et restriktionsffagment fra pING2121b, som kun indeholdt C^, blev klonet ind i et derivat af pBR322 til dannelse af pING1419 (fig. 27). En anden Bal31-fordøjelse blev derefter anvendt til at fjerne alt, bortset fra 13 bp ikke-gær 3'-ikke-translateret DNA til dannelse af plasmidet pING 1431 (fig. 27). Det kimære tunge L6-kædegen i pING1415 20 (fig. 26) indeholder også omfattende 3'-ikke-translateret sekvens, som indbefatter 80 bp poly A. Alt, bortset fra 11 bp af det 3'-ikke-translateret DNA, blev fjernet under anvendelse af den i fig. 28 viste strategi til dannelse af plasmidet pING1429.

Stedsrettet in vitro-mutagenese kan med en lav frekvens indføre uønskede basepar-25 forandringer i regioner af DNA uden for det område, som mutageniseres. For at sikre, at sådanne mutationer ikke var til stede i de lette og tunge kimære L6-kæde-sekvenser, som var blevet klonet ind i Ml3 og underkastet stedsrettet mutagenese, blev der konstrueret lette og tunge kædegener sammensluttet til invertasesignalsekvensen og den afkortede PGK-promotor, som bestod af kodningssekvenser, som enten var 30 fastslået ved DNA-sekvensanalyse eller havde vist sig at være funktionelle i kraft af deres ekspression i transficerede muse-Sp2/0-celler til produktion af funktionelt ki- 79 DK 175581 B1 mært L6-antistof. Plasmideme pINGl439 (let kæde, fig. 27) og pINGl436 (tung kæde, fig. 28) blev dannet ved disse konstruktioner.

(3) Konstruktion af gærekspressionsplasmider indeholdende lette og tunge kimære 5 L6-kædegener fra henholdsvis pING1439 og pING1436 sammensluttet med PGK-polyadenyleringssignalet.

Med henblik på at gær skal producere et intakt funktionelt antistofmolekyle, foretrækkes en afbalanceret syntese af både let og tungt kædeprotein inden i 10 værtscellen. En fremgangsmåde er at anbringe de lette og tunge kædegener på separate ekspressi onsvektorer, som hver indeholder en forskellig selektiv markør. En gærstamme mangelfuld med hensyn til selektive markører fundet på plasmideme kan derefter enten samtidigt eller sekventielt transformeres med disse plasmider.

15 De lette og tunge kimære L6-kædegener fra pING1439 (fig. 27) og pING1436 (fig. 28) blev klonet som henholdsvis Bglll-Xhol- og BamHI-XhoI-ffagmenter i to forskellige mediumkopiantal (ca. 20 kopier/celle)-ekspressionsvektorer (gær-E. coli-pendul). En af disse, pING804CVS, indeholder den komplette gær 2-μτη ring, PGK-transkriptions-terminerings- og polyadenyleringssignaleme og leu2-genet som den selektive markør.

20 En anden vektor, pING1150, indeholder gærreplikationsorigin, oriY, en cis-virkende sekvens (REP3) fra det endogene 2-μτη gærplasmid, PGK-transkriptionsterminerings-og polyadenyleringssignaleme og ura3-genet som den selektive markør. Begge plasmider indeholder også B-lactamasegenet (bia) for ampicillinresistens og bakteriereplikationsorigin (oriB) fra pBR322 til udvælgelse og opformering i bakterier.

25 Fire plasmider resulterede fra disse konstruktioner: pING 1441 -let kæde, leu2 og pING 1443-let kæde, ura3 (fig. 29); pING1440-tung kæde, leu2 og pING1442-tung kæde, ura3 (fig. 30).

(4) Sekretion af kimært L6-antistof fra transformerede gærceller.

30 DK 175581 B1

SO

To separate transformationseksperimenter blev udført i et forsøg på at opnå både let og tung kædesyntese i gærceller. Fire /xg hver af pINGl440 og pINGl443 og separat af pING1442 og pINGl44l blev cotransformeret ind i Saccharomyces cerevisiae-stammer, BB331C (MATa, ura3, leu2) ved udvælgelse for vækst på SD-agar (2% 5 glucose, 0,67% gæmitrogenbase, 2% agar). Ura+ Leu+-transformanter fremkom ved 2-3 dages inkubation ved 30°C. Ca. 100 transformanter blev opnået for pING1440 plus pING1443; og kun 15 transformanter blev opnået for pING1442 plus pING1441. Ti kolonier blev podet fra hver plade i 5 ml SD-kødafkog suppleret med 50 mM natriumsuccinat, pH-værdi 5,5, og dyrket i 65 timer ved 30 °C. Cellerne blev fjernet 10 ved centrifugering, og kultursupematanteme blev analyseret ved ELISA for niveauer af let kæde og tung kæde og for graden af forening af de secernerede lette og tunge kæder.

Det sidste blev vurderet under anvendelse af gede-antihuman-kappa-antiserum til belægning af mikrotiterbrøndene og et peroxidase-mærket gede-antihuman-gam-maan ti serum til påvisning af niveauet af tung kæde bundet til anti-kappa-belægningen.

15 Resultaterne af disse analyser (tabel 7) afslørede, at alle kultursupematanteme fra cellerne transformeret med pING1440 (tung kæde, leu2) plus pING1443 (let kæde, ura3) indeholdt et uforholdsmæssigt højt niveau af let kædeprotein i forhold til niveauerne af tungt kædeprotein og intet tegn (i det mindste som bestemt ved ELISA) på samlede lette og tunge kæder. På den anden side indeholdt supematanteme fra 20 cellerne transformeret med pING1442 (tung kæde, ura3) + pING1441 (let kæde, leu2) en mere afbalanceret produktion af lette og tunge kæde- proteiner, og otte ud af ti isolater viste sig at indeholde nogle samlede lette og tunge kæder som bestemt ved ELISA. To af disse isolater, nr. 1 og nr. 5, producerede en signifikant andel af samlet let og tung kæde.

81 DK 175581 B1 TABEL 7 NIVEAUER AF SECERNEREDE LETTE OG TUNGE KIMÆRE L6-KÆDER VED HJÆLP AF GÆRTRANSFORMANTER8

Kappa/ 5 Pladmiderb Isolat nr. Kappac Gammad Gamma6 pING1440+ 1 284 39 0 pING1443 2 324 33 0 3 473 52 0 4 387 40 0 10 5 316 34 0 6 188 28 0 7 381 45 0 8 455 45 0 9 380 26 0 15 10 579 32 0 pING1441+ 1 128 79 35 pING1442 2 150 30 1 3 124 29 0 20 4 185 55 5 5 114 52 35 6 139 23 5 7 149 34 5 8 245 57 12 25 9 202 26 11 10 157 19 7 a. S. cerevisiae-stamme BB331C (MATa, leu2, ura3) transformeret til Ura+ Leu+ med plasmider, som bærer ura3 og leu2 med lette eller tunge kæder.

30 b. Plasmider: pING1440 = tung kæde + leu2; 82 DK 175581 B1 pING1443 = let kæde + ura3; pING1442 = tung kæde + ura3; pING 1441 = let kæde + leu2.

5 c. ng/ml målt ved ELISA specifik for humant kappa med humant Bence Jones-protein som standard.

d. ng/ml målt ved ELISA specifikt for humant gamma med human som IgG-standard.

10 e. ng/ml mål ved ELISA under anvendelse af anti-humant kappa som belægningsantistof og anti-humant gamma som andet antistof med human IgG-standard.

Yderligere analyse blev udført, for at bestemme om denne forening var resultatet af syntesen af et H2L2-størrelse-protein. Kultursupematanteme fra isolater nr. 1 og 5 såvel 15 som fra isolat nr. 8, som indeholdt et meget lavere niveau af tilsyneladende forening af let og tung kæde, blev koncentreret ved ultrafiltrering på et "Centricon 30”-filter (Amicon Corp.). De koncentrerede supematanter blev kørt på en 7% polyacrylamidgel under ikke-reducerende betingelser, aftrykt til nitrocellulose og sonderet med gede-antihuman-kappa-antiserum efterfulgt af peroxidase-mærket kanin-anti-20 gede-antiserum. De koncentrerede supematanter fra isolateme nr. 1 og 5, men ikke fra nr. 8, indeholdt et enkelt immunoreaktionsdygtigt bånd, som comigrerede med det oprensede kimære L6-antistof fra transficerede Sp2/0-celler. Disse resultater antyder, at isolateme nr. 1 og 5 syntetiserede og secernerede samlet kimært L6-antistof.

25 (5) Oprensning af kimært L6-antistof fra gærkultursupematant.

Med henblik på yderligere at karakterisere H2L2-størrelse-proteinet secerneret af gæren og bestemme, om dette var samlet kimært L6-antistof, blev en tilstrækkelig mængde af gærproduceret materiale oprenset til at muliggøre udøvelse af forskellige 30 bindingsanalyser og funktionelle analyser. pING1442 + 1441-transformantisolatet nr. 5 blev dyrket i 58 timer ved 30°C i en 1 O-liter fermenter under anvendelse af et syntetisk 83 DK 175581 B1 medium (tabel 8). Cellerne blev til at begynde med dyrket i 9 liter af søjle A-mediet, indtil glucoseniveauet faldt under 1 g/1, på hvilket tidspunkt de blev tilført et totalt volumen på 2,5 liter af medium fra søjle B. Glucoseniveauer blev holdt på 0,5 g/1 under det resterende forløb af fermenteringen. Cellerne blev fjernet ved centrifugering, og 5 kultursupematanteme blev analyseret ved ELISA for tilstedeværelse af lette og tunge kædeproteiner og for forening af de tunge og lette kæder. Supematanten indeholdt ca.

250 μg/l let kæde, 240 μg/l tung kæde og 130 μ g/1 tung kæde forenet med let kæde. Kultursupematanteme blev derefter koncentreret ved ultrafiltrering over en D.C.

1 O-enhed (Amicon Corp.), filtreret gennem et 0,45 μη\ filter og koncentreret over et 10 YM30-filter (Amicon Corp.) til 250 ml. Den koncentrerede supernatant blev indstillet til en pH-værdi på 7,4 med KOH, bragt til 500 ml med PBS (10 mM, pH-værdi 7,4, 150 mM natriumchlorid) og fyldt på en 1 ml protein A Sepharose-søjle (Sigma), som forud var ækvilibreret med PBS. Søjlen blev vasket først med 20 ml PBS efterfulgt af 10 ml 0,1 M natriumcitrat, pH-værdi 3,5 og derefter med 10 ml 0,1 M citronsyre, 15 pH-værdi 2,2. Eluateme ved pH-værdi 3,5 og 2,2 blev hver opsamlet i et rør indeholdende 1 ml 2 M Tris-base (Sigma). Hoveddelen af de lette og tunge immunoreaktionsdygtige kædeproteiner var i eluatet ved pH-værdi 3,5, hvilket eluat derefter blev koncentreret over Centricon 30 (Amicon Corp.) til et slutvolumen på 106 μΐ. Analyse af dette protein på ikke-reducerende polyacrylamidgeler under anvendelse 20 af coomassieblå-farvning og immunoaftrykning med antihumant kappa-antiserum (Sigma) til synliggørelse af proteinerne viste et H2L2-størrelse-proteinbånd på 150 kilodalton. Dette protein blev oprenset væk fra andre proteiner ved hjælp af HPLC under anvendelse af ABX 5-μιη søjle, som var ækvilibreret med puffer A (10 mM KP04, pH-værdi 6,8). Efter påsætning af prøven på søjlen blev søjlen vasket med 25 puffer A i 10 minutter (strømningshastighed = 1 ml/minut) og underkastet en lineær gradient på 0% til 50% puffer B (250 mM KPO4, pH-værdi 6,8) i løbet af 50 minutter ved 1 ml/minut.

84 DK 175581 B1 TABEL 8 MEDIUM ANVENDT TIL GÆRFERMENTERING TIL FREMSTILLING AF SECERNERET KIMÆRT L6-ANTISTOF2 Bestanddele Ab Bc 5 1. Cerelose (Glucose) 119 g/1 538 g/1 2. (NH4)2S04 13,9 g/1 83,3 g/1 3. Thiamin HC1 0,011 g/1 0,05 g/1 4. Biotin 0,00011 g/1 0,005 g/1 5. Pantotensyre 0,002 g/1 0,009 g/1 10 6. Inositol 0,194 g/1 0,875 g/1 7. H3P04 5,67 ml/1 25,5 ml/1 8. KH2P04 5,78 g/1 26,0 g/1 9. MgS04.7H20 3,33 g/1 15,2 g/1 10. CaCl2.2H20 0,33 g/1 1,5 g/1 15 11. FeS04.7H20 0,072 g/1 0,34 g/1 12. ZnS04.7H20 0,022 g/1 0,104 g/1 13. MnCl2.4H20 0,0039 g/1 0,018 g/1 14. CuS04.5H20 0,0067 g/1 0,031 g/1 15. Kone. H2S04 0,0056 ml/1 0,026 ml/1 20 a. Fermentering blev udført som beskrevet i teksten.

b. Bestanddele af 9-liter startbatch.

c. Bestanddele af 2,5-liter fødebatch.

25 Hoveddelen af proteinet opløstes i en enkelt stor bred top mellem 20 og 50 minutter som bestemt ved absorbans ved 280 nm. En anden mindre top blev observeret ved 52-56 minutter, hvilket svarede til den normale elueringsposition for kimært L6-antistof fra transficerede Sp2/0-celler. ELISA-analyse af søjlefraktioneme viste en større tung + let kæde krydsreaktiv top svarende til UV-absorbanstoppen ved 52-56 30 minutter. Analyse af 52-56 minut-fraktionerne på ikke-reducerende SDS-polyacryl-amidgeler under anvendelse af coomassieblå-farvning og immunoaftrykning viste et 85 DK 175581 B1 overvejende rent protein, som comigrerede med kimært L6-antistof oprenset fra transficerede Sp2/0-celler.

(6) Undersøgelser udført på det kimære L6-antistof 5 secerneret af gær.

Det oprensede gærafledte antistof blev vurderet for funktion på flere måder. Først blev det oprensede antistof undersøgt for dets evne til at binde direkte til en L6-anti-gen-positiv cellelinie. For det andet blev antistoffet undersøgt for dets evne til at 10 inhibere binding af muse-L6-antistof til antigen-positive celler. Til slut blev det oprensede antistof testet for to aspekter ved antistoffunktion - evnen til at formidle ADCC i nærværelse af humane perifere blodleukocytter og evnen til at dræbe L6-positive tumorceller i nærværelse af human komplement.

15 Direkte bindinesanalvse. Celler fra en human tyktarmscarcinomlinie, 3347, som udtrykker ca. 5 x 105 molekyler af L6-antigenet per celle på celleoverfladen blev anvendt som målceller. Celler fra T-cellelinien, T51, blev anvendt som en negativ kontrol, eftersom de ifølge tidligere undersøgelse ikke udtrykker påviselige mængder af L6-antigenet. Målcellerne blev først inkuberet i 30 minutter ved 4°C med enten 20 Sp2/0-celle- eller gærafledt kimært L6-antistof eller med muse-L6-antistof-standard oprenset fra musebugvattersot. Dette blev efterfulgt af inkubering med FITC-mærket gede-antihuman-immunoglobulin for de kimære antistoffer eller med FITC-mærket gede-antimuse-immunoglobulin for musestandarden. Begge mærkede antistoffer blev leveret fra TAGO (Burlingame, CA) og anvendt i en fortynding på 1:50.

25 Antistofbinding til celleoverfladen blev bestemt under anvendelse af et Coulter Model EPIC-C-cel)esorterings-apparat.

Som vist i tabel 9 bandt både de pattedyrs- og gærafledte kimære L6-antistoffer signifikant og ca. i samme grad til den L6-positive 3347-linie. De bandt ikke udover 30 baggrund til den L6-negative T51-linie.

86 DK 175581 B1

Inhibering af binding. Som det næste trin blev det kimære L6-gærantistof og det Sp2/0-celleafledte kimære L6-antistof undersøgt for deres evne til at inhibere bindingen af et FITC- mærket muse-L6-antistof til overfladen af antigen-positive 3347 tyktarmscarcinomeel ler.

5 Både de gærafledte og Sp2/0-afledte kimære L6-antistoffer inhiberede bindingen af mærket muse-L6-antistof, og bindingskurveme var parallelle. På basis af resultaterne af disse undersøgelser blev der foretaget et groft skøn over antistofiver. Iveren hos det Sp2/0-celleafledte kimære L6 var tidligere bestemt til at være ca. 4 x 108. Dataene 10 indikerede, at der ikke var nogen signifikante forskelle mellem iveren hos gærafledte kimære L6-antistoffer og Sp2/0-celleafledte kimære L6-antistoffer for L6-antigenet.

Funktionelle analyser. En sammenligning blev foretaget mellem evnen hos de gærafledte kimære L6-antistoffer, de Sp2/0-celle-afledte kimære L6-antistoffer og standard-15 muse-L6-antistoffeme til at lysere L6-antigen-positive celler i nærværelse af humane perifere blodleukocytter som en kilde til effektorceller formidlende antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC). Som vist i tabel 10 var det kimære L6 fra gær lidt bedre end Sp2/0-celleafledt kimært L6, og som tidligere observeret var begge overlegne i forhold til standardmuse-L6 til at forårsage ADCC, som målt ved en 4 20 timers 5!Cr-frigivelsestest.

En sammenligning blev derefter foretaget mellem gærafledte kimære L6-antistoffer, Sp2/0-celleafledte kimære L6-antistoffer og standardmuse-L6-antistoffer for deres evner til at lysere L6-antigen-positive celler ved komplementafhængig cytolyse (CDC), 25 når humant serum blev anvendt som komplementkilde. Resultaterne af denne sammenligning (tabel 11) viste, at mens både de Sp2/0-celleafledte kimære L6-antistoffer og standard-muse-L6-antistoffeme udviste høj cytolytisk aktivitet, kunne det gærafledte L6-antistof ikke bevirke nogen cytolyse selv ved den højeste antistofkoncentration. Disse resultater var uventede og viser, at det gærafledte antistof 30 har nye og enestående egenskaber.

87 DK 175581 B1 (7) Konklusioner

En fremgangsmåde er beskrevet, hvorved gær kan gensplejses til at secernere funktionelle antistoffer. Det gærafledte kimære antistof i dette eksempel binder til det 5 pågældende målantigen med ca. den samme iver som det kimære antistof produceret af lymfe (Sp2/0)-celler. Det gærafledte antistof udviser også tilsvarende ADCC-aktivitet som Sp2/0-afledt antistof. I mod- sætning til det Sp2/0-celleafledte antistof udviste det gær- afledte antistof ikke nogen CDC-aktivitet, hvilket således viser de nye og enestående egenskaber hos dette gærafledte antistof. Fremgangsmåden bør være 10 praktisk anvendelig til fremstilling af en lang række monoklonale antistoffer og kimære antistoffer, som bærer udvalgte antigenbindingsområder bundet til en udvalgt konstant områdeisotype. Gensplejsede antistoffer og derivater deraf fremstillet i gær vil også udvise hidtil ukendte funktionelle egenskaber, f.eks. evnen til selektivt at formidle måldrab ved ADCC uden nogen påviselig CDC-aktivitet. Den heri beskrevne teknologi 15 kan også være egnet til produktion af forskellige andre heterologe multimere secernerede proteiner ved hjælp af gensplejset gær.

TABEL 9

BINDINGSANALYSER AF KIMÆRT L6-ANTISTOF PRODUCERET AF GÆR ELLER 20 MUSE-Sp2/0-CELLER PÅ EN L6-ANTIGEN-POSITIV OG EN

L6-ANTIGEN-NEGATIV CELLELINIE Bindingsforholdb for: H3347-celler T51-celler

Antistof fL6+) (L60 25 Standard muse-L6 95 1,0

Sp2/0-kimært-L6 116 1,0 Gær-kimært-L6 116 1,0 a. Alle antistoffer blev anvendt i en koncentration på 10 /tg/ml.

30 b. Bindingsforholdet er det antal gange en testprøve er mere klar end en kontrolprøve behandlet med FITC-konjugeret andet antistof. Gede-antimuse-antistof blev anvendt 88 DK 175581 B1 som det andet antistof for monoklonalt muse-L6-standardantistof. Gede-antihu-man-antistof blev anvendt som det andet antistof for kimært gær-L6-antistof og kimært Sp2/0-L6-antistof.

5 TABEL 10 ADCC AF KIMÆRT L6-ΑΝΤΙ STOF AFLEDT FRA GÆR ELLER Sp2/0-CELLER OG STANDARD (MUSE)-L6-ANTISTOF PÅ TYKTARMSCARCINOMCELLELINIE 3347 10 Antistof koncentration

Antistof fug/ml) % cvtolvse1

Standard muse-L6 5,0 42 15 1,0 48

Sp2/0-kimært-L6 1,0 96 0,1 71 0,01 54 0,001 37 20 Gær-kimært-L6 1,0 114 0,1 108 0,01 76 0,001 60

Ingen 0 23 25 _ Målcellerne var blevet mærket med 51Cr og blev i fire timer udsat for en kombination af MAb og humane perifere blodleukocytter ved 100 per målcelle, og frigivelsen af 51Cr blev målt efterfølgende. Frigivelsen af 5,Cr (efter korrektioner for værdier af 30 spontan frigivelse fra ikke-behandlede celler) er et mål for den procentvise cytolyse.

89 DK 175581 B1 TABEL 11 HUMAN KOMPLEMENT-AFHÆNGIGE CYTOTOKS1SKE VIRKNINGER AF KIMÆRT L6-ANTISTOF PRODUCERET AF GÆR ELLER MUSE-Sp2/0-CELLER PÅ TYKTARMSCARCINOMCELLELENIE 3347 5

Antistof- koncentration Komplement8 Procent Antistof (tte/mB O eller -3 cvtolvse

Standard muse-L6 5 + 122 10 1 + 53 5 - 1

Sp2/0-kimært-L6 5 + 73 1 + 22 0,1+5 15 5 - 2 Gær-kimært-L6 5 + 3 1 + 2 0,1 + 4 5 - 2 20 _ a Humant serum fra et sundt individ blev anvendt som komple mentkilde. b Komplement-formidlet cytolyse blev målt ved en fire-timers51 Cr-frigivelsesanalyse.

25 EKSEMPEL VI: Sekretion af funktionelt kimært Fab fra gær

Fab-delen af IgG består af et enkelt letkædemolekyle koblet ved hjælp af en disulfidbro til et enkelt afkortet tungkæde-molekyle bestående af den variable region og CH1 (fig.

31). Dette tunge kædeffagment er kendt som Fd. Fab'er er potentielt anvendelige til en 30 række terapeutiske og diagnostiske procedurer. Endvidere er de i stand til at blive produceret ved mikrobiel fermentering.

90 DK 175581 B1

Den almindelige metode til produktion af Fab involverer fordøjelse af intakt IgG med papain (se fig. 31) efterfulgt af oprensning af Fab væk fra Fc-fragmenteme, der dannes i det fordøjede materiale. Skønt denne procedure er relativt ligefrem og kan resultere i 5 høje udbytter af Fab, er den noget tidsforbrugende, idet den først kræver produktion og oprensning af helt antistof efterfulgt af dannelse og til slut oprensning af Fab. Endvidere anvendes en tredjedel af hele antistoftnolekylet - Fc-delen (fig. 31) - ikke.

De nylige fremskridt indenfor genkloningsteknologi og stedspecifik mutagenesetek-10 nologi muliggør en mere direkte og enkel alternativ fremgangsmåde til produktion af Fab-molekyler. Ved denne fremgangsmåde indføres et stopcodon i det tunge kædegen inden i hængselregionen ved ca. codonet for den aminosyre, ved hvilken papainfordøjelse forekommer. Fab produceres derefter direkte ved samtidig ekspression af både den lette kæde og Fd-geneme til produktion af deres respektive proteiner, 15 som samles og secerneres fra cellen.

(1) Indføring af et stopcodon i hængselregionen af kimær tung L6-kæde.

Strategien for indføring af et stopcodon i hængselregionen af kimær tung L6-kæde er 20 skitseret i fig. 32A. Lokaliseringen af stopcodonet inden i hængselregionen og af DNA-sekvensen af mutageneseprimeren er vist i fig. 32B. Stopcodonplaceringen svarer til aminosyre 226 i fig. 31. Ved denne procedure dannedes plasmidet pING1402 indeholdende et Fd-gen, som koder for et protein bestående af 228 aminosyrer og strækker sig seks aminosyrer ud over cystein, hvortil den lette kæde er koblet. Ved 25 mutagenesen indføres også et unikt BclI-sted ved stopcodonet, som let kan anvendes til efterfølgende manipulationer af 3'-enden af Fd. Dette indbefatter, men er ikke nødvendigvis begrænset til, fjernelse af tung kæde-3'-ikke-translateret DNA såvel som splejsning af forskellige typer af modifikationer af Fd indbefattet addition af kodningssekvenser for specifikke aminosyrer og produktion af sammenslutnings-30 proteiner.

91 DK 175581 B1 (2) Fusion af det fuldt udviklede Fd-gen til gærinvertasesignal sekvens og afkortet PGK-promotor.

Strategien for sammenslutning af Fd-genet til gærinvertasesignalsekvensen er skitseret 5 i fig. 33. Ved denne fremgangsmåde blev der gjort brug af den tidligere konstruktion af gærinvertasesignalsekvens - fuldt udviklet tung L6-kæde-fusion (fig. 26), og der blev anvendt et unikt Apal-sted i J-regionen af den kimære tunge L6-kæde til erstatning af den konstante region i pING1415 bestående af CH1, CH2 og CH3 med den konstante region fra pING1412 indeholdende stopcodonet i hængselregionen. Ved denne metode 10 blev plasmidet pINGl418 dannet.

(3) Fjernelse af ikke-gær-3'-ikke-translateret DNA.

Indføring af et unikt BclI-sted ved stopcodonet af Fd-kæden tilvejebragte en 15 hensigtsmæssig metode til ijemelse af alt ikke-gær-3’-ikke-translateret DNA. Dette blev gennemført under anvendelse af den i fig. 34 anførte strategi, og plasmidet pING1428 blev dannet.

Eftersom stopcodonet blev indført i hængselregionen ved stedspecifik mutagenese af et 20 tungt kædefragment klonet ind i Ml3, eksisterede den mulighed, at uønskede mutationer kunne være blevet indført under mutagenesetrinnet. For at sikre at sådanne mutationer ikke var til stede, blev et Fd-gen sammensluttet med invertasesignal-sekvensen og afkortet PGK-promotor og bestående af kendte kodningssekvenser konstrueret under anvendelse af den i fig. 34 skitserede strategi til dannelse af 25 plasmidet pING 1444.

(4) Konstruktion af gærekspressionsplasmider indeholdende det kimære L6-Fd-gen fra pING1444 sammensluttet med PGK-polyadenyleringssignalet.

30 Med henblik på at gær kan producere et intakt, funktionelt Fab-molekyle, må en afbalanceret syntese af både lette kæde- proteiner og Fd-kædeproteiner forekomme 92 DK 175581 B1 samtidigt inden i cellen. Som beskrevet i eksempel V er en fremgangsmåde at anbringe let kæde- og Fd-geneme på separate pendulvektorer indeholdende separate selektive markører og at transformere disse vektorer ind i en gærstamme, som er mangelfuld med hensyn til begge selektive markører.

5

Fd-genet fra pING1444 (fig. 34) blev klonet som et BamHI-XhoI-ffagment ind i to mediumkopinummer gær-E. coli-pendulvektorer indeholdende sekvenser for replika-tion i gær og PGK-polyadenylerings/transkriptionstermineringssignalet: pING804CVS for leu2-udvælgelse og pINGH50 for ura3-udvælgelse (se fig. 29 og 30). De to 10 plasmider resulterende fra disse konstruktioner - pING1445 (ura3) og pINGl446 (leu2) - er visti fig. 35.

(5) Sekretion af kimært L6-Fab fra transformerede gærceller.

15 To separate transformationseksperimenter blev udført i et forsøg på at opnå både letkædesyntese og Fd-kædesyntese i gærceller. Fire μg hver af pINGl445 (fig. 35) og pING1441 (fig. 30) og separat af pINGl446 (fig. 35) og pING1442 (fig. 30) blev cotransformeret ind i S. cerevisiae-stamme BB331c (MATa, ura3, leu2) ved udvælgelse for vækst på SD-agar (2% glucose, 0,67% gæmitrogenbase, 2% agar). Ura+ 20 Leu+-transformanter fremkom efter 2 til 3 dages inkubation ved 30°C.

Fem kolonier blev podet fra hver plade i 6 ml SD-kødafkog suppleret med 50 mM natriumsuccinat, pH-værdi 5,5, og dyrket i 65 timer ved 30°C. Cellerne blev fjernet ved centrifugering og analyseret ved hjælp af ELISA for niveauer af let kæde.

25 Resultaterne af disse analyser afslørede, at niveauerne af let kæde i kultursupematanteme af pING1446 + pING1443-transformanteme var tre til seks gange højere end niveauerne i kultursupematanteme af pING1445 + pING1441-transformanteme. Kultursupematanteme for hver gruppe af transformanter blev derefter koncentreret ved ultrafiltering på et "Centricon 30"-filter (Amicon Corp.) 30 og kørt på en 10% polyacrylamidgel under ikke-reducerende betingelser. Proteinerne blev aftrykt til nitrocellulosepapir og sonderet med gede-antihuman-kappa-anti- serum 93 DK 175581 B1 efterfulgt af peroxidasemærket kanin-an ti gede-antiserum. Den koncentrerede supernatant fra pING1446- og pING1443-transformanteme indeholdt en signifikant anti-kappa-krydsreaktionsdygtig udstrygning over en stor del af aftrykket med kun et svagt kryds-reaktionsdygtigt bånd ved den position, som var ventet for Fab-proteinet.

5 Ved sammenligning indeholdt de koncentrerede supematanter fra pING1445 + pING1441-transformanteme relativt lidt udstrøget antihuman kappa-krydsreaktionsdygtigt protein på aftrykket. Endvidere indeholdt en af de fem prøver (nr. 4) et særligt intenst, distinkt anti-kappa-kryds-reaktionsdygtigt bånd, som migrerede ved den position, som var ventet for et Fab-protein.

10 (6) Oprensning af kimært L6-Fab fra gærkultursupematant.

For at fastslå at Fab-størrelse anti-kappa-krydsreaktionsdygtigt protein secerneret af gær faktisk er kimært L6 Fab-protein krævedes oprensning af tilstrækkelige mængder 15 til udøvelse afbindingsanalyser. pING1441 + pING1445-transformantisolatet nr. 4 blev derfor dyrket i 1 liter SD-kødafkog suppleret med 50 mM natriumsuccinat, pH-værdi 5,5, i 95 timer ved 30°C. Cellerne blev fjernet ved centrifugering, og kultursupematanten blev analyseret med ELISA for niveau af let kædeprotein. Supematanten indeholdt ca. 130 μΐ/ΐ let kædeprotein. Kultursupematanten blev derefter 20 koncentreret ved ultrafiltrering over et "Amicon YM30"-filter til 20 ml. Den koncentrerede supernatant blev vasket med 130 ml 10 mM kaliumphosphat, pH- værdi 7,5 (puffer A) og genkoncentreret over "YM30"-filteret til 12,5 ml. Den koncentrerede supernatant blev herefter bragt til 54 ml med puffer A og sat på en 1,5 ml S-sepharosesøjle ækvilibreret med puffer A. Søjlen blev vasket med 20 ml puffer A og 25 underkastet en lineær gradient på 0 til 200 mM natriumchlorid i puffer A (totalt volumen 40 ml). ELISA-analyse af søjleffaktioneme viste en stor anti-kappa-krydsreaktionsdygtig top mellem fraktion 8 og 21 svarende til en saltkoncentration på ca. 60 mM. Disse fraktioner blev samlet, koncentreret på "Amicon YM10"- og "Centricon-10"-filtre (Amicon Corp.) til 51 μΐ og blev analyseret på 30 ikke-reducerende og reducerende polyacrylamidgeler under anvendelse af coomassie-blå-farvning og Westem-aftrykning med antihumankappa- og antihuman-Fab-anti- 94 DK 175581 B1 serum. Disse analyser viste et overvejende rent protein, som migrerede ved ca. 46 kd på den ikke-reducerende gel og blev opløst i to bånd, som løb ved ca. 23 og 24,5 kd på den reducerende gel, hvilket svarer til de forudsagte (på basis af aminosyresekvens) _ molekylvægte for henholdsvis let kædeprotein og Fd-kædeprotein. Det mindste af de to 5 bånd reagerede stærkt med antihuman-kappa-antiserum på Western-aftrykket. Begge proteinbånd reagerede med antihuman Fab-anti-serum på Western-aftrykket.

(7) Undersøgelser udført på kimært L6-Fab secerneret af gær.

10 Den primære aktivitet af et Fab-molekyle er dets evne til at binde til målantigenet. Det gærafledte kimære Fab blev derfor undersøgt for dets evne til at binde direkte til en L6-anti-gen-positiv cellelinie og for dets evne til at inhibere binding af use-L6-antistof til antigen-positive celler.

15 Direkte bindingsanalyse. Celler fra den humane tyktarmscarcinomcellelinie 3347, som indeholder L6-antigenet på celleover-fladen, blev anvendt som målceller. Celler fra den antigen-negative cellelinie T51 blev anvendt som en negativ kontrol. Målcellerne blev først inkuberet i 30 minutter ved 4°C med enten gærafledt kimært L6-Fab, Sp2/0-celleafledt kimært L6- antistof eller med muse-L6-antistof. Dette blev efterfulgt 20 af inkubation med FITC-mærket gede-antihumant kappa-immunoglobulin for det kimære Fab, FITC-mærket gede-antihumant IgG for kimært antistof eller med FITC-mærket gede-antimuse-immunoglobulin for museantistoffet. Begge mærkede antistoffer blev leveret af TAGO (Burlingame, CA) og blev anvendt i en fortynding på 1:50. Antistofbinding til celleoverfladen blev bestemt under anvendelse af et Coulter 25 Model EPIC-C-cellesorteringsapparat.

Som vist i tabel 12 bandt det gærafledte kimære L6-Fab til den L6-positive 3347-linie.

Det gærafledte kimære L6-Fab bandt ikke over baggrund til den L6-negative T51-linie.

30 Inhibering af binding. Som det næste trin undersøgtes den udstrækning, hvormed graduerede doser af det gærafledte kimære L6-Fab eller det Sp2/0-celleafledte kimære 95 DK 175581 B1 L6-antistof kunne inhibere binding af et FITC-mærket muse-L6-antistof til overfladen af antigen-positive tyktarmscarcinomceller 3347.

Det gærafledte kimære L6-Fab inhiberede bindingen af det direkte mærkede 5 muse-L6-antistof. En højere koncentration af gær-L6-Fab var imidlertid påkrævet til opnåelse af 50% inhibering af muse-L6-antistofbinding til målcellerne, end det var nødvendigt for den samme grad af bindingsinhibering ved hjælp af Sp2/0-celleafledt kimært L6-antistof.

10 (8) Konklusioner

En fremgangsmåde er beskrevet, hvorved gær kan gensplejses til at secernere funktionelle Fab-områder af immunoglobuliner. Det gærafledte kimære Fab i dette eksempel binder til det pågældende målantigen. Sådanne Fab-molekyler tilvejebringer 15 hensigtsmæssige målmidler til en lang række af diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Ved denne fremgangsmåde ses også gennemførligheden af sekretion af heterologe heterodimere molekyler fra gær.

TABEL 12

20 BINDINGSANALYSER AF KIMÆRT L6-FAB PRODUCERET AF GÆR PÅ EN

L6-ANTIGEN-POSITIV OG EN L6-ANTIGEN-NEGATIV CELLELINIE

Bindingsforholdb for: 3347 celler T51-celler 25 Antistof (L6+1 (L6-)

Sp2/0-kimært-L6 103 1 Gær-kimært-L6-Fab 32 1 30 a. Alle antistoffer blev anvendt i en koncentration på 10 /ig/ml.

96 DK 175581 B1 b. Bindingsforholdet er det antal gange en testprøve er mere klar end en kontrolprøve behandlet med FITC-konjugeret andet antistof. Gede-antihuman-antistof blev anvendt som det andet antistof for det kimære Sp2/0-L6-antistof, og gede-antihuman-kap-pa-antistof blev anvendt som det andet antistof for gær-Fab.

5 EKSEMPEL VII: Sekretion af funktionelle kimære Fab-molekvler fra bakterier

Bakterier er egnede til produktion af kimære antistoffer udtrykt fra pattedyrs-cDNA, eftersom hele kodningssekvenser kan udtrykkes fra fint karakteriserede promotorer.

10 Escherichia coli er en af de mange nyttige bakteriearter til produktion af fremmede proteiner (Holland, I.B., et al., BioTechnology, 4: 427 (1986)), eftersom et væld af genetisk information er tilgængelig til at optimere genekspressionen heraf. E. coli kan anvendes til produktion af fremmede proteiner internt eller til sekretion af proteiner ud af cytoplasmaet, hvor de for det meste ophobes i de periplasmatiske rum (Gray et al., 15 Gene 39: 247 (1985); Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7212 (1985)). Sekretion fra E. coli-cytoplasmaet er blevet observeret for mange proteiner og kræver en signalsekvens. Proteiner produceret internt i bakterier foldes ofte ikke korrekt og præcipiteter i subcellulære partikler betegnet inklusionslegemer (Schoner et al., BioTechnology 3: 151 (1985)). Protein secerneret fra bakterier er imidlertid ofte foldet 20 korrekt og antager naturligt forekommende sekundære og tertiære strukturer (Hsiung et al., BioTechnology 4: 991 (1986)). Selvom immunoglobulinpeptider er blevet syntetiseret i gensplejsede E. coli (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273 (1984); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5369 (1984); Boss et al., Nucl. Acids Res. 12: 3791 (1984)), er der ingen rapporter om sekretion af disse peptider fra E. coli i 25 form af funktionelle antistoffer eller antistoffragmenter.

Et Fab-molekyle består af to ikke-identiske proteinkæder bundet ved hjælp af en enkelt disulfidbro. Disse to kæder er den intakte lette antistofkæde og V-, J- og CH1 -delen af den tunge antistofkæde, Fd. De korrekte cDNA-kloner for kimært let L6-gen og Fd-gen 30 er allerede blevet identificeret. I dette eksempel blev disse cDNA-kloner organiseret i et enkelt bakterieoperon (en dicistron besked) i form af gen sammenslutninger til 97 DK 175581 B1 pectatlyase (pelB)-genledersekvensen fra Erwinia carotovora (Lei et al.} J. Bacteriol., under trykning (1987)) og udtrykt fra en af to stærke, regulerede promotorer. Resultatet er et system til samtidig ekspression af to proteinkæder i E. coli og sekretion af immunologisk aktivt, korrekt samlet Fab af kimært L6-antistof i kulturvækstmediet.

5 A. Konstruktion af E. coli-ekspressionssystemer for kimært L6-Fab.

1. Samling af pelB-ledersekvenskassette.

10 Erwinia carotovora EC koder for flere pectatlyaser (polygalac- turonsyretranselimi-nase) (Lei et al., Gene 35: 63 (1985)). Tre pectatlyasegener var blevet klonet, og DNA-sekvensen af disse gener er blevet bestemt. Ved kloning ind i E. coli under styring af en stærk promotor udtrykkes pelB-genet, og store mængder af pectatlyase ophobes i det periplasmatiske rum. pelB-signalsekvensen fungerer effektivt i E. coli og 15 blev anvendt som et sekretionssignal for antistofgener i dette eksempel. Nukleotid-sekvensen omsluttende signalsekvensen af pelB-genet er vist i fig. 36a.

pelB-signalsekvensen indeholder et Haelll-restriktionssted ved aminosyre 22 naboliggende til signalpeptidasekløvningsstedet: ala-ala. Plasmid pSS1004 (Lei et al., 20 J. Bacteriol., under trykning (1987)) indeholdende pelB-genet i plasmidvektor pUC8 (Vieirra og Messing, Gene, 19: 259 (1982)) blev fordøjet med Haelll og EcoRJ. Dette DNA blev ligeret med en 8 basepar lang Sstl-kobler til Sspl, og EcoRl-skåret pBR322.

Det resulterende plasmid indeholdt et 300 bp fragment, som indbefattede 22 ami-nosyreledersekvensen af pelB og ca. 230 bp opstrøms for E. caratovora-DNA. Dette 25 plasmid pING173 indeholder en indføjelse, som efter fordøjelse med Sstl og behandling med T4-DNA-polymerase, kan ligeres direkte til et DNA-fragment flankeret af den første aminosyre af en fuldt udviklet kodningssekvens for et hvilket som helst gen til dannelse af en proteinsammenslutning indeholdende en funktionel bakterieledersekvens i ramme med det indkommende gen. Sstl til EcoRI-restriktions-30 fragmentet i pING173 blev klonet ind i pUC18 (Yanich-Perron et al., Gene 33: 103 (1985)) til dannelse af pRR175, som indeholder pelB-ledersekvensen og naboliggende 98 DK 175581 B1 opstrøms ikke-kodende sekvens (herunder et ribosombindingssted) nedstrøms for lac-promotoren. Konstruktionen af pRRl 75 er skitseret i fig. 36b.

2. Fremstilling af kimær let L6-gen til bakterieekspression.

5

Det intakte kimære lette L6-kædegen indeholdende et Aatll-restriktionssted ved signalsekvensprocesstedet og et unikt Bglll-sted nedstrøms for genet blev udskåret fra gærekspressionsplasmidet pENG1298 (fig. 25a) som et 1200 bp DNA-fragment. Dette fragment blev indsat i plasmid pRR175. Det resulterende plasmid pRR177-8 indeholdt 10 en i-ramme sammenslutning af pelB-lederen, og den lette L6-kæde nedstrøms for lac-promotoren beliggende i moderplasmidet. En række derivater af dette plasmid blev konstrueret til deletion af ikke-kodende sekvenser fra både 5'- og 3-enden af pelBr.let kædegen-sammenslutningen i pRJR.177-8. Opstrøms ikke-kodende sekvenser blev deleteret ved at gøre brug af et Ndel-restriktionssted ved -48 bp fra pelB-ledersekvens-15 initieringscodonet (fig. 36) til dannelse af pRR180-2. De ikke-kodende 3'-sekvenser blev elimineret ved at substituere et fragment fra plasmidet optimeret for let L6-kædeekspression i gær, pING1431 (se fig. 27a) i pRR179 til dannelse af pRR191.

Et andet plasmid, pRR190, ligner pRR191, men indeholder 90 bp af ikke-kodende eukaryot DNA ved 3'-enden af det lette kædegen. Disse konstruktioner er vist i fig. 37.

20 3. Fremstilling af kimært L6-Fd-gen til bakterieekspression.

Det intakte kimære L6-Fd-gen indeholdende et Sstl-restrikti onssted ved signalsekvensprocesstedet, et BclI-sted indført ved stedsrettet mutagenese (fig. 32a, b) og 25 dannende et termineringscodon ved aminosyre 226 og et unikt BamHI-restrik-tionssted nedstrøms for genet blev udskåret fra plasmidet pING1406 (fig. 33) som et 880 bp DNA-fragment. Dette DNA-fragment blev indsat i plasmid pRR175 til dannelse af en i-ramme-sammenslutning af pelB-1 edersekvensen og L6-Fd-genet nedstrøms for lac-promotoren pRR178-5. En række derivater blev konstrueret til deletion af 30 ikke-kodende sekvenser fra både 5’ og 3'-endeme af sekvensen indeholdt i pRR178-5.

De ikke-kodende 3'-sekvenser blev elimineret ved at substituere et restriktionsfragment 99 DK 175581 B1 fra piasmidet optimeret for L6-Fd-ekspression i gær, pINGl428 (fig. 34), som indeholder en Xhol-kobler umiddelbart efter termineringscodonet af Fd-genet til dannelse af plasmid pRR186. Fjernelse af E. caratovora-DNA-sekvenser op- strøms for Ndel-stedet ved -48 fra ledersekvensen dannede plasmid pRR196. Konstruktionen af 5 disse plasmider er vist i fig. 38.

4. Multicistron ekspressionssystem for let kædegen og Fd-gen.

Til produktion af bakterielt afledt Fab var det nødvendigt, at både let kæde og Fd blev 10 produceret samtidigt inden i cellen. Under anvendelse af plasmideme konstrueret med hvert af disse gener separat blev en række ekspressionsvektorer konstrueret, hvilke vektorer indeholdt begge gener stillet på linie, således at transkription fra en enkelt promotor vil specificere begge gener. Dette blev gjort på en måde, som minimerede det ikke-kodende DNA mellem de to gener til 60 bp. Hvert gen har et ribosombindingssted 15 nødvendigt for translationsinitiering og den identiske DNA-sekvens fra -48 til pelB-leder::antistof-gen-foreningen. Flere kloningstrin var nødvendige til at opstille de to gener på række sammen. En del af det lette kæde-gen bundet til pelB-lederen i pRR180-2 blev klonet nedstrøms for Fd-genet i pRR186 til dannelse af pFKlOO. Det resterende af det lette kædegen blev subklonet i pFKlOO fra pRRI77-8 til dannelse af 20 pFKlOl. Tilsvarende blev DNA-fragmenter indeholdende 3'-deletioner af eukaryote sekvenser fra pRR190 og pRR.191 klonet i pFKlOl til dannelse af henholdsvis pFK103 og pFK102. DNA-fragmenter fra pRR192 og pFKlOl blev ligeret til dannelse af pFK104, som indeholder en deletion af sekvenser opstrøms for -48 bp fra Fd-genet.

Kort over Fd-kassetten og den lette kædegenkassette i disse plasmider er vist i fig. 39.

25 5. Anbringelse af den dicistrone besked for let kæde og Fd under regulering af inducerbare promotorer.

Plasmider, pFKlOl, pFK102, pFK103 og pFK104, indeholder Fd- og lette kædegener 30 klonet sekventielt under lac-promotorens kontrol i vektor pUC18 eller pUC19. I E. coli-stammer, såsom JM103 F'laciQ (Messing et al., Nucl. Acids. Res. 9: 309 (1981)), 100 DK 175581 B1 påvirkes mængden af let kæde, som ophobes i periplasmaet, ikke af lac-promotor-induktionsmidlet isopropyl-B-D- thi ogal actopyranosid (IPTG), se tabel 13. Endvidere er bakterievækst langsommere (sammenlignet med celler indeholdende pUCl8), og bakteriekolonier udviser en ændret morfologi, idet de er små, tørre og ru, 5 hvilket antyder, at væsentlig fremmed genekspression er skadelig for cellevækst. To strategier blev anvendt til at anbringe denne genkassette under mere stramt regulerede promotorer.

Først blev et PstI til EcoRI-ffagment ffa pFK104 ligeret til pIT206 til anbringelse af 10 Fd-genkassetten og den lette kæde-genkassette under direkte kontrol af Salmonella typhimurium araB-promotoren, en godt karakteriseret stærk promotor i E. coli. Et restriktionskort over pIT206 og konstruktion af pIT104 er vist i fig. 40. Anvendelse af araB-promotoren og dets regulatoriske protein araC til ekspression af bakterie-gener er beskrevet i US patentansøgningerne nr. 695.309, indleveret 28. januar, 1985 og nr.

15 797.472, indleveret 13. november, 1985. Som det ses i tabel 14 reguleres det resulte rende plasmid, pIT104, nu til syntese af let kæde ved tilsæt- ning af arabinose til kulturvækstmediet. En mindst 10-gange induktion sker ved arabinosetilsætning.

Selvom Fab secerneret i vækstmediet stiger mere end 10 gange, stopper cellevækst efter induktion med arabinose. Dette bekræfter, at ekspression i højt niveau af 20 Fab-geneme er skadeligt for cellevækst. Bakteriekolonier husende pIT104 er fænotypisk ikke til at skelne fra E. coli husende pIT206, når de dyrkes i fravær af arabinose.

Dernæst blev et DNA-fragment indeholdende laci-genet, en repressor af lac-promo-25 toren, klonet i højkopi-ekspressionsvektoren pFK102. Ekspression af laci fra en højkopi-antalvektor er nyttig til at regulere ekspression af lac-promotoren på en højkopi-antalvektor (Russel et al., Plasmid, under trykning (1987); Hsuing et al., Biotechnology 4: 991 (1986)). Et 1,7 kb EcoRIfragment indeholdende laci-genet på pMC9 (Calos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015 (1983)) blev udskåret, udfyldt 30 med T4-polymerase til stumpender, ligeret med PstI- koblere og klonet i det unikke Pstl-sted af pFK102 til dannelse af pFK102 laci. Kortet over pFK1021aci er vist i fig.

DK 175581 B1 ΙΟΙ 40b. Selektionsproceduren, der blev anvendt til at identificere den korrekte klon, sikrede, at det resulterende plasmid, pFK102laci, indeholdt en funktionelt undertrykt lac-promotor. Alle hvide eller svagt pink kolonier på MacConkey-lactose-plader indeholdt plasmider med laci-indføjelser, imens transformanter indeholdende pFK102 5 alene var røde, hvilket indikerer den funktionelle undertrykkelse af lac-promotoren ved højkopi-antal-laci-genet. I tabel 14 ses, at ekspression af bakterie-Fab ffa celler indeholdende pFK1021aci svarer til ekspression fra pFK102. I modsætning til celler indeholdende pFK102, som dannede afvigende kolonier og voksede langsomt i kødafkogskultur, lignede celler indeholdende pFK1021aci sådanne indeholdende 10 PUC18.

B. Ekspression, SDS-PAGE, og oprensning af bakterielt produceret Fab.

1. Vækst af E. coli husende klonede antistofgener.

15

Plasmid-DNA blev transformeret ind i enten E. coli-JM103 eller -MC1061 ved standard E. coli-transformationsprocedurer. Bakteriekulturer blev dyrket i TYE (trypton 1,5%, gærekstrakt 1,0% og NaCl 0,5%) suppleret med de pågældende antibiotika (penicillin 250 /tg/ml, tetracyklin 15 /ig/ml). Bakteriekulturer blev dyrket i 20 volumener på 5 ml til 1 1 ved 37°C til en optisk densitet OD600 = 0,8 (ca. 4 x 108 celler/ml) og prøver blev induceret med IPTG (0,2 mM), lactose (1,0%) eller arabinose (1,0%). Kulturer blev dyrket i et yderligere tidsrum på 4 til 21 timer. Portioner af hver kultur blev analyseret for let kædeproduktion. Protein blev frigivet fra det periplasmatiske rum af E. coli-celler ved osmotisk shock som beskrevet af Yanagida et 25 al., J. Bacteriol. 166: 937 (1986). Alternativt blev kultursupematanter analyseret direkte for tilstedeværelsen af antistofkæder.

Kvantitativ bestemmelse af let L6*kæde skete ved ELISA ved gede-antihu-man-kappa-let kædeantistof (Cappel, Malvern, PA). Fd kunne påvises ved hjælp af 30 ELISA med monoklonalt muse- antihuman-Fd-antistof (Calbiochem, San Diego, CA).

I tabel 13 ses repræsentative data for ekspression af let kædereaktionsdygtigt materiale 102 DK 175581 B1 i periplasmatiske E. coli-ekstrakter. Let kæde secerneres fra det bakterielle cytoplasma ind i periplasmaer. Antistofkæder frigives også fra bakterierne til kultursupematanten.

Dette er en usædvanlig opdagelse og kan være en enestående egenskab hos L6-Fab blandt eukaryote proteiner udtrykt i E. coli. Under visse betingelser vides 5 bakterieproteiner imidlertid at blive frigivet fra E. coli. (Abrahamsen et al., Nucl. Acids Res. 14: 7487 (1986); Pages et al., J. Bacteriol. 169:1386 (1986)). I tabel 14 sammenlignes mængden aflet kæde secerneret i periplasmaet med mængden secerneret i kultursupematanten. Let kædereaktionsdygtigt materiale er til stede i plasmid indeholdende kulturer, som huser klonet let kæde alene eller let kæde plus Fd. De 10 bedste producenter af Fab (pFK102, pFK104 og pFK1021aci) secernerer typisk 300-1000 ng/ml af ELISA-reaktionsdygtig let kæde i kulturmedierne. En separat konstruktion blev foretaget, hvori det lette kædegen efterfølges af Fd-genet (pFK107).

Denne konstruktion dirigerer syntese og sekretion af Fab i omtrent samme niveauer som konstruktionerne med generne i omvendt rækkefølge. Således er genrækkefølgen 15 ikke kritisk for sekretion af Fab.

2. SDS-PAGE af bakterielt produceret kimært let L6-kæde og Fd.

Bakterielt producerede antistofkæder blev analyseret ved poly- acrylamidgelelektro-20 forese under reducerende og ikke-reducerende betingelser. Proteinekstrakter aflyserede hele bakterieceller, protein frigivet fra det periplasmatiske rum ved osmotisk shock og protein secerneret i kultursupematanten blev analyseret elektroforetisk. Overføring af gelsepareret protein under fuldt reducerende betingelser til nitrocellulose og immunologisk aftryk med gede-anti-human-let kædeantistof ved Western-analyse viste, 25 at et protein med den samme molekylvægt som autentisk kimær let L6-kæde var til stede (ca. 23 Kd). Analyse af proteinprøver ved SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser viste, at ekstrakter fra celler husende et plasmid med det lette kædegen alene (pRR191 eller pRR190) indeholdt en stor andel af det lette kædereaktionsdygtige materiale forenet i en form med højere molekylvægt. Meget af dette materiale løb ved 30 ca. 46 Kd, hvilket sandsynligvis er en let kædedimer. Lette kædedimerer er blevet observeret fra myelomceller, som kun producerer let kæde. Der er også andre 103 DK 175581 B1 immunoreaktionsdygtige proteinbånd, som kan repræsentere ikke-specifik disulfiddan-nelse mellem let kæde og E. coli-proteiner. Proteinprøver (periplasmatiske ekstrakter eller kultursupematanter) fra E. coli-celler husende både let kædegen og Fd-gen indeholder et let kædereaktionsdygtigt bånd ved ca. 48 Kd ved separation under 5 ikke-reducerende gelbetingelser, hvilket bånd løber ved en lidt højere molekylvægt end den bakterielle lette kæde-dimer. Dette materiale er bakterielt produceret L6-kimært-Fab. I E. coli husende pFK1021aci, pFKlOl, pFK102, pFK103 eller pFK104 er 48 Kd-båndet, der observeres på en SDS-gel kørt under ikke-reducerende betingelser, den mest iøjnefaldende immunoreaktionsdygtige art. Endvidere er 10 baggrundspletten eller -udstrygningen af immunoreaktionsdygtige proteiner set i ekstrakter kun indeholdende den lette kæde stærkt reduceret i ekstrakter fra celler indeholdende både let kæde og Fd.

3. Oprensning af bakterielt produceret kimært L6-Fab.

15

Immunologisk og funktionelt aktivt (se nedenfor) bakterie-Fab blev oprenset fra enten kultursupematanter eller periplasmatiske proteinekstrakter af E. coli husende pFK1021aci eller pIT104. Til oprensning af periplasmatisk materiale blev den periplasmatiske fraktion fra 1 liter celler induceret i 4 timer frigivet i 50 ml destilleret 20 vand. Dette materiale blev centrifugeret i 20 minutter ved 5000 g og filtreret gennem et 0,45 μτη filter. Den periplasmatiske ekstrakt blev derefter koncentreret over en "ΥΜΙΟ''-membran (Amicon) til ca. 5 ml. Dette materiale blev fortyndet 8 gange i startpuffer (10 mM K2HP04, pH-værdi 7,5) og påsat en 1 ml S-Sepharose-søjle ved en strømningshastighed på 1,0 ml/minut. Søjlen blev vasket med 25 ml startpuffer og 25 elueret med en 0 til 200 mM NaCl-gradient i startpuffer (totalt volumen 200 ml). Den immunoreaktionsdygtige gradienttop blev samlet (eluering skete ved ca. 100 mM) og koncentreret på Centricon 10. Oprenset Fab blev opbevaret i PBS + 2,0% BSA.

Til oprensning af secerneret Fab fra 1 liter bakteriekultursupematant blev cellerne 30 fjernet ved centrifugering efter vækst i 21 timer med induktionsmidler, og supematanten blev filtreret gennem et 0,45 μτη filter. Medierne blev koncentreret over DK 175581 Bl 104 en "ΥΜΙΟ’’-membran (Amicon) til ca. 16 ml og derefter fortyndet med 10 mM K2HP04 til 105 ml. Dette materiale blev på- ført en 1,6 ml S-Sepharose-søjle og elueret med en 0 til 200 mM NaCl-gradient i 40 ml. Fab udvundet fra S-Sepharose-kromatografi var mere end 70% rent som bestemt ved densitometri-5 sporing af en ikke-reducerende, commassiefarvet 10% acrylamidgel. Fab oprenset fra bakteriekultursupematanter opløstes i 2 hovedproteinbånd på ca. 23 Kd og 24,5 Kd på en 15% reducerende gel. Molekylvægten af Fd og let kæde baseret på DNA-sekvensen er 24,5 Kd og 23 Kd, hvilket svarer godt til de observerede proteinstørrelser. Det mindste af de to bånd reagerede stærkt med gede-anti-human-kappa-let kæde-antiserum 10 på et Western-aftryk. Bakterie-Fab oprenset fra enten det periplasmatiske rum eller bakteriekultursupematanteme kan ikke skelnes ved hjælp af alle de her afprøvede analytiske kriterier.

4. Funktionel bindingsaktivitet af bakterielt produceret kimært L6-Fab til L6-anti-15 genet.

Bakterielt produceret Fab oprenset ved S-Sepharose-kromatografi blev undersøgt for binding til L6-antigen-holdige celler. Som vist i tabel 15 binder bakterie-Fab specifikt til den humane tyktarmscarcinomcellelinie 3347. Celler fra T-cellelinien T51 blev 20 anvendt som en negativ kontrol. Målceller blev inkuberet i 30 minutter ved 4°C med bakterielt produceret L6-kimært-Fab, intakt kimært L6-antistof produceret i Sp2/0-celler eller muse-L6-antistof oprenset fra musebugvattersot. Dette blev efterfulgt af en inkubation med FITC-mærket gede- anti-human-let kæde-antistof til Fab-påvisning, FITC-mærket gede-anti-human-immunoglobulin til kimært antistof-påvisning eller 25 med FITC-mærket gede-anti-murin-immunoglobulin til museantistof-påvisning. Antistofbinding til celleoverfladen blev bestemt under anvendelse af et Coulter Model EPlC-C-cellesorteringsapparat.

Bakterielt produceret Fab udviser også karakteristisk bindingsinhibering af 30 FITC-mærket muse-L6-antistof til overfladen af antigen-positive 3347-tyktarmscar-cinomceller. Bakterielt produceret Fab og Sp2/0-afledt kimært L6 har tilsvarende bin- 105 DK 175581 B1 dingsinhibermgsprofiler, hvilket dermed antyder, at iveren hos bakterielt produceret Fab og Sp2/0-afledt kimært L6 er omtrent den samme.

Konklusioner 5

En hidtil ukendt fremgangsmåde er beskrevet, hvorved E. coli er blevet anvendt som en vært til produktion af funktionelt aktive Fab-områder af immunoglobuliner og til at secernere disse i det periplasmatiske rum og også i kulturmediet. Dette molekyle udviser bindingsegenskaber som forventes af et korrekt samlet 10 antistofgenkendelsessted. Denne teknologi kan anvendes til at udtrykke antistofgener med andre bindingsspecificiteter i E. coli.

1. Proteiner, som kodes af modificerede antistof-cDNA-kloner, kan secerneres fra bakterier under anvendelse af en signalsekvens.

15 2. To antistofgener kan udtrykkes fra en enkelt bakteriepromotor som en dicistron besked.

3. To fremmede proteiner (i dette eksempel let kædeantistof og Fd-antistof) kan samles 20 korrekt, dvs. antage korrekt sekundær, tertiær og kvatemær struktur, når de secerneres fra bakterier.

4. Mindst to og sandsynligvis mange bakteriepromotorer kan anvendes til ekspression af antistofgener.

25 5. Dette eksempel er en generel metode, hvorved gener, som koder for andre antistofkæder, kan udtrykkes sammen som en dicistron besked. Disse indbefatter enten lette kædegener og Fd-gener eller lette kædegener og intakte tunge kædegener.

106 DK 175581 B1 6. Genrækkefølgen med hensyn til promotoren er ikke vigtig for evnen hos E. coli til at producere Fab. En konstruktion af Fd-genet efterfulgt af den lette kæde arbejder lige så godt som generne, som er organiseret i den omvendte rækkefølge.

5 7. Fab kan secerneres fra E. coli i kultursupematanten, hvor det er stabilt og kan oprenses. De fleste er Fab-kæder, som passerer cytoplasmamembranen, secerneres i kultursupematanten.

Mikroorganismedeponeringer 10

Saccharomyces cerevisiae BB331C (41/42-5), GI 87 blev deponeret hos ATCC 9. juli 1987 og er tildelt accessionsnummeret 20856. Eschericia coli JM 103 (pFK1021 aci), G186 blev også deponeret der på den samme dato og fik tildelt accessionsnummeret 67457. Begge deponeringer skete under Budapest-traktaten.

15 TABEL 13 KVANTITATIV BESTEMMELSE AF LET KÆDE FRA E. COLI-PERIPLASMA Ng/ml af kultur ng/ml af kultur plasmid - + plasmid - + 20 _______ pRR175 0 0 pFKIOl 36 28 pRR177-8 8,5 11 PFK102 68 55 pRR180 399 412 pFK103 38 45 pRR190 200 241 pFK104 91 68 25 pRRl9l 463 772 E. coli-JM103 eller MCI061 (omtrent samme resultater) blev transformeret med hvert plasmid. Friske transformanter blev dyrket i TYE ved 37°C til en OD600 = 0,8. Kulturer blev delt, og induktionsmidlet (IPTG) blev tilsat til 0,2 mM til en prøve (-30 eller + IPTG). Celler blev dyrket ved 37°C i 4 timer. Periplasmatiske proteinekstrakter blev fremstillet, og prøver blev undersøgt for let kæde ved ELISA med 107 DK 175581 B1 gede-antihuman-kappa-antistof. Hver værdi er af gennemsnittet af mindst to separate forsøg. Fjernelse af ikke-kodende sekvenser både 5' og 3’ til antistofgenet bevirkede en stigning af ophobning aflet kæde i periplasmaet.

5 TABEL 14

OPHOBNING AF LET KÆDE I SUPERNATANTEN OG PERIPLASMAET EFTER

INDUKTION

Induktions- Supernatant Periplasma 10 Plasmid middel 4 timer 21 timer 4 timer 21 timer pRR 190 - 0 nd 200 nd pRR190 + 5 188 241 nd 15 pFK102 - 12 nd 68 nd pFK102 + 57 828 55 40 pFK104 - 13 nd 91 nd pFK104 + 150 290 68 35 20 pFK1021aci - 25 360 50 100 pFK102Iaci + 72 606 37 40 pIT104 - 13 nd 10 nd 25 pIT104 + 150 216 19 35

Plasmid indeholdende E. coli-stammer blev dyrket, fremstillet og undersøgt som beskrevet i tabel 13. For pRR190, pFK102, pFK104 og pFK1021aci blev celler 30 induceret med 0,2 mM IPTG; pIT104 blev induceret med 1% arabinose. Hver værdi er gennem- snittet af mindst to separate forsøg. Til analyse af E. coli- kultursupematanter 108 DK 175581 B1 blev bakterier fjernet ved centrifugering, og kultursupematanter blev ført gennem et 0,45 fim filter. Værdier udtrykkes i ng/ml af kultur.

nd - ikke bestemt 5 TABEL 15 BINDINGSANALYSER AF BAKTERJE-Fab Bindingsforhold* 3347-celler T51-celler 10 Antistof L6+ L6-

Standard muse-L6 95 1

Sp2/0-kimært-L6 116 1

Bakterie-L6-Fab 54 1 15 Standard L6-Fab 16 1 * Bindingsforholdet er antallet af gange en testprøve er mere klar end en kontrolprøve behandlet med FITC-konjugeret an det antistof.

20

Standard L6-Fab blev fremstillet ved enzymatisk fordøjelse af muse-L6-antistof.

Claims (8)

109 DK 175581 B1

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et immunoglobulinmolekyle med tunge og let-5 te kæder eller fragmenter deraf, som er forbundet således, at det overordnede molekyle udviser ønskede bindings- og genkendelsesegenskaber, idet fremgangsmåden omfatter (a) dyrkning af en transformeret eller transfekteret prokaryot vært under passende betingelser, sådan at tungt kædeimmunogl obul in og let kædeimmunoglobulin el- 10 ler fragmenter deraf udtrykkes som et resultat af transskription af polynucleotid- sekvenser i værten, hvor polynucleotidsekvenseme koder for mindst én funktionelt virkende region af en variabel region af et antistof, og et prokaryot sekretionssignalpeptid, hvor den variable region under ekspression operabelt bindes ved dens N-ende til et prokaryot sekretionssignalpeptid til muliggørelse af sekre-15 tion fra værten; og (b) opnåelse af immunoglobulinkæden eller fragmentet af en immunoglobulin-kæde, som forud for sekretion fra værten oprindeligt var således bundet til signal-peptidet i form af en immunoglobulinmolekyle med tunge og lette kæder eller 20 fragmenter deraf, at det overordnede molekyle udviser de ønskede bindings- og genkendelsesegenskaber.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor sekretionssignalpeptidet er et pektatlyase-sekretionssignal. 25

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller krav 2, hvor immunoglobulinmolekylet isoleres fra det periplasmiske rum.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller krav 2, hvor immunoglobulinkæden eller 30 fragmentet af en immunoglobulinkæde isoleres fra dyrkningsvækstmediet. 110 DK 175581 B1

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor immu-noglobulinmolekylet er et Fd-ffagment.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor immu-5 noglobulinmolekylet omfatter en kimær immunoglobulinkæde.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, hvor den variable region af antistof operabelt er bundet til en sekvens, som koder for et polypeptid, som er et andet end en immunoglobulinkæde. 10

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvor polypeptidet er et enzym. 15