DK175680B1 - Modulsamling af antistofgener, antistoffer fremstillet derved samt anvendelse deraf - Google Patents

Description

i .

i DK 175680 B1

Den foreliggende opfindelse angår rekombinant-DNA-metoder til fremstilling af immunoglobuli ner, genetiske sekvenser, der koder derfor, såvel som fremgangsmåder til opnåelse af sådanne sekvenser.

-.V 5

Anvendelse af ce11e-ti 1-cel 1e-fus i on til fremstilling af monoklone antistoffer ifølge Kobler og Milstein {Nature (London), 256: 495, 1975) har affødt en revolution inden for biologi som med hensyn til betydning svarer til opfindelsen af rekombinant-DNA-kloning. Hybridoma-fremsti Ilede monoklone antistoffer er allerede anvendt i stor udstrækning i klinske diagnoser og ved grundlæggende videnskablige studier. Anvendelse af human B-cellehybridomafremstillet monoklone antistoffer er meget lovende for den kliniske behandling af cancer, virale og mikro- _ bielle infektioner, B-cel 1 e-immunoforstyrre 1 ser med formind-

Id sket anti stofprodukt i on og andre sygdomme og forstyrrelser af immunsystemet.

Desværre er udbytter af monoklone antistoffer fra humane hy-bridomacellelinier forholdsvis lave {1 pg/ml i human x human sammenlignet med 100 pg/ml i musehybridomaer), og produktionsomkostninger er høje for antistoffer fremstillet ved hjælp af human vævskultur i stor målestok. Mus x mus-hybridomaer er på den anden side anvendelige, forbi de fremstiller rigelige mængder af protein, og disse cellelinier er mere stabile end 25 de humane linier. Gentagne injektioner af "fremmede"-antistof-fer, såsom museantistof, i mennesker kan imidlertid føre til skadelige hypersensitivitetsreaktioner.

“ x

Der er derfor foretaget nyere undersøgelser af muligheden for 30 at fremstille antistoffer, der har fordelene ved de monoklone antistoffer fra mus-mus-hybridomaer, men de humane monklone antistoffers artsspecifikke egenskaber.

Et andet problem, som immunologer møder, er, at de fleste hu-35 mane monoklone antistoffer (dvs. antistoffer med humane genkendelsesegenskaber) opnået i cellekultur er af IgM-typen. Når det er .ønskeligt at opnå humane monokloner af IgG-typen, har det imidlertid været nødvendigt at anvende sådan teknik, som

I DK 175680 B1 I

i

I I

H cellesortering, for at skille de få celler, som har skiftet I

til fremstilling af antistoffer af IgG-typen eller anden type, I

fra størstedelen, der producerer antistoffer af IgM-typen. Der I

består derfor et behov for en mere bekvem metode til skift af I

5 anti stofkl asser for et hvilket som helst givet antistof med en forudbestemt eller ønsket antigenspecificitet.

Den foreliggende forbindelse forener både hybridomateknik og I

monoklon antistof teknik og tilvejebringer en hurtig og effek- I

10 tiv metode, såvel som produkter hidrørende derfra, til forbed- I

ret produktion af kimære humane/ikke-humane antistoffer eller I

af "klasseskiftede" antistoffer. I

I

I Forsøg på at løse problemet med at frembringe kimære antistof- I

fer har været beskrevet af forskellige forfattere. I

I F.eks. beskriver Cabilly et al. i EP-A-125023 konstruktionen af en ekspressionsvektor I

I for en kimær immunoglobulinkæde, der omfatter gentagne trin af fordøjelse med I

I 1

I . restriktionsendonuklease, oprensning af fragmenter eller udfyldning med Klenow- H

I 20 polymerase og dNTP'er samt ligering. Det resulterende plasmid bærer et menne- I

I , ske/muse-hybridgen omfattende en variabel museregion og en konstant human region.

I 1 GB-A-2137631 beskrives cDNA-kloner, der koder for lette immunoglobulin-lambda- H

I 25 kæder og tunge i mmunoglobulin-p-kæder. I

I Sharon et al., Nature 309: 364 til 367 (24. maj 1984) beskriver ekspression af kimære H

antistoffer omfattende V-regionen af en tung musekæde og C-regionen af en let muse- H

I 30 κ-kæde. Konstruktion af genet blev udført under anvendelse af genomiske DNA- H

I , fragmenter. H

Hi

I Kudo et al. beskriver i EP-A-184187 (kendt teknik under artikel 54 (3) EPC) konstruk- I

I tionen af muse-menneske-kimær tung immunoglobulinkæde-DNA, hvilket DNA er iso- H

3 5

leret fra genomiske DNA'er fra henholdsvis mus og menneske. H

I Weissman et al. beskriver i W086/05513 (dokument under artikel 54 (3) EPC) en I

I plasmidvektor til anvendelse til fremstilling af muse/menneske-κ-kæde-gener. H

3 DK 175680 B1 S.L. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851-6855 (november 1984) beskriver fremstillingen af et muse-human-anti stofmolekyle med defineret antigenbindingsspecificitet, fremstillet ved at gener for de variable regioner fra ® en muse-antistof-fremsti 1lende myelomacellelinie med kendt antigenbindingsspecificitet forenes med gener for humant immunoglobulins konstante regioner under anvendelse af rekombinant-ONA-teknik. Kimære gener blev konstrueret, hvor den tunge kædes variable regionexon fra myelomacelle 1 ini en S107 knyttedes 1° godt til konstante regionexoner i humant IgGl's eller IgG2's tunge kæde, og hvor den lette kædes variable regionexon fra den samme myeloma til human kappa lette kædeexon. Disse gener blev transficeret i musemyelomacellelinier og transformerede celler, der fremstillede kimære muse-human-antistof fer mod 15 phosphocholin var således udviklet.

S.L. Morrison et al., europæisk patentpublikation nr. 173494 (publiseret 5. marts 1986) beskriver kimsre "receptorer" (f.eks. antistoffer) med variable regioner hidrerende fra én 2o art og konstante regioner hirørende fra en anden. Der nævnes anvendelse af cDNA-kloning til konstruktion af generne, selv om der ikke er anført detaljer med hensyn til cDNA-kloning eller priming. (Se side 5, 7 og 8).

25 G.L. Boulianne et al., Nature, 312:643 (13. december 1984) fremstiller også antistoffer, der består af muse variable regioner forenet med humane, konstante regioner. De opbyggede immunoglobulingener, hvori DNA-segmenterne, der koder for muse variable regioner, spec i f i kke for haptentrin i tropheny1 30 (TNP), blev forenet med segmenter, der koder for humane mu og kappa konstante regioner. Disse kimære gener blev udtrykt som funktionel TNP-bindende kimær IgM.

Se hos Munro, Nature, 312:597 (13. december 1984), Dickson,

Genetic Engineering News, 5, nr. 3 (marts 1985) eller Marx, 3 3

Science, 299:455 (august 1985) for en kommentar på arbejdet udført af Boulianne et al. og Morrison et al..

_______

I DK 175680 B1 I

I I

M. S. Neuberger et al,, Nature, 314 :268 {25. marts 1985} kort- I

struerer også en kimær, tung kæde af immunoglobul i ngen, hvori I

et ONA-segment, der koder for en muse variabel region specifik I

for hapten-4-hydroxy-3-nitrophenacetyl (NP) blev forenet med I

et segment, der koder for den humane e-region. Når dette ki- I

H mære gen blev transficeret ind i J558L-cellelinien, blev et I

H antistof fremstillet, som bandt til NP-haptenen og havde hu- I

H mane igE-egenskaber. I

10 M. S. Neuberger et al. har også publiceret arbejde, der viser I

fremstillingen af cellelinier, som secernerer haptenspecifik- I

ke antistoffer, hvori Fc-delen er blevet erstattet enten med I

en aktiv enzymdel (6. Williams og M.S. Neuberger, Gene 43-.319, I

1986) eller med et polypeptid, der udviser c-myc-antigendeter- I

15 minanter (Nature, 312:604, 1984). I

I M. Neuberger et al, PCT-publikation W086/01533 (publiceret 13. I

marts 1986) beskriver også fremstillingen af kimære antistof- I

fer (se side 5) og foreslår blandt teknikkens mange anvendel- I

I 2q ser begrebet "klasseskift" (se side 6). ^ I

M. Taniguchi, i europæisk patentpublikation nr. 171.496 (pub- I

H liceret 19. februar 1985) beskriver fremstillingen af kimære I

antistoffer, der har variable regioner med tumorspecificitet

og hidrører fra forsøgsdyr og konstante regioner, der hidrører I

I 125 I

ffa mennesker. De tilsvarende tunge og lette kædegener frem- I

I stilles i den genome form og udtrykkes i mammale celler. I

I S. Takeda et al.. Nature, 314:452 (4. april 1985) har beskrev- I

I et en mulig metode til konstruktionen af kimære immunoglobu- I

30 lingener, som har intronsekvenser fjernet ved anvendelsen af I

en retrovirusvektor. Et uventet splejsedonorsted forårsagede - I

I imidlertid fjernelsen af V-regionledersekvensen. Dette forsøg Æ I frembragte således ikke-fuldstændige kimære antistofmolekyler. I 1

S. Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci . , USA, 81: 3273-3277 I

35 (juni 1984) beskriver plasmider, som dirigerer syntesen i E.

I coli af tunge kæder og/eller lette kæder af antistof imod I

I carcinoembryon-antigen (CEA). Et andet plasmid blev konstrue- I

5 DK 175680 B1 ret til ekspression af en afkortet form af tung kæde (Fd1)- fragment i E. coli. Funktionel CEA-bindingsakti vitet blev op- ! nået ved in vitro rekonsti tut i on i E. col i-ekstrakter af en del af den tunge kæde med let kæde.

5 S. Cabilly et al, europæisk patentpublikation 125023 (publiceret 14. november 1984) beskriver kimære immunoglobulingener og deres formodede produkter såvel som andre modificerede former. På siderne 21, 28 og 33 diskuteres cDNA-kloning og pri- 10 m i ng.

M. A. Boss, europæisk patentansøgning 120694 (publiceret 3. oktober 1984) beskriver ekspression i E. coli af ikke-kimære immunog1 obul i nkæder med 4-nitrophenylspecificitet. Der er en almen beskrivelse af kimære antistoffer, men ingen detaljer (se side 9).

C. R. Wood et al.. Nature, 314: 446 (april 1985) beskriver pi asniider, som dirigerer syntesen af muse-anti stofproteiher mod NP i gær. Tung kæde af mu-antistofproteiner viste sig at 2 0 være glycosyleret i gærcellerne. Når både tunge og lette kæder blev syntetiseret i den samme celle, blev noget af proteinet samlet til funktionelle antistofmolekyler som påvist ved anti-NP-bindingsaktivitet i opløseligt protein fremstillet fra gærceller.

25 A. Alexander et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79: 3260-3264 (1982) beskriver fremstillingen af en cDNA-sekvens, der koder for en abnorm kort human Ig y tung kæde (OHM y^ HCD-serumpro-- tein), der indeholder en 19-aminosyreleder efterfulgt af de 30 første 15 led i V-regionen. En omfattende indre deletion fjerner den tilbageværende del af V og hele C^l-området. Dette er cONA, der koder for et molekyle med en indre deletion.

T. w. Dolby et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77: 6027-6031 (I960) beskriver fremstillingen af en cDNA-sekvens og rekombi-35 nantplasmi der, der indeholder den samme kodning for mu og kappa humane immunoglobulinpolypeptider. En af de DNA-rekombine-rede molekyler indeholdt codoner for en del af CH3~konstant-regionområdet og den hele 3'-ikke-kodende sekvens.

I DK 175680 B1 I

I I

Η H. Seno et al.. Nucleic Acids Research, 11: 719-726 (1983) be- I

H skriver fremstillingen af en cONA-sekvens og rekombinantplas- I

mider, der indeholder den samme kodning for en del af den va- I

H 5 riable region og hele den konstante region af den humane IgE I

H tunge kæde (e-kæde). I

T. Kurokawa et al., ibid, 11: 3077-3085, ( 1983) viser kon- I

struktionen under anvendelse af cDNA af tre ekspressionsplas- I

mider, der koder for den konstante del af den humane IgE tunge I

kæde. I

F. T. Liu et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 81: 5369-5373 I

(september 1984) beskriver fremstillingen af en cDNA-sekvens I

og rekombinantplasmi der, der indeholder den samme kodning af I

ca. 2/3 af CH2~, og hele Ch3- og Cn4-omrSderne af human IgE's I

tunge kæde. I

Y. Tsu.jimoto et al., Nucleic Acids Res., 12: 8407-8414 (novem- I

ber 1984) beskriver fremstillingen af en human V λ cONA-se- I

I 20 kvens fra en Ig λ-fremstillende human Burkitt-lymphoma-celle- I

linie ved at benytte sig af et klonet konstant region-gen, som I

en primer for cDNA-syntese. I

J. Murphy., PCT-publikation WO 83/03971 (publiceret 24. no- I

I vember 1983) beskriver hybridproteiner fremstillet af frag- I

25 I

menter, der indeholder et toxin og en cellespecifik ligand

(som formodes muligvis værende et antistof). I

I Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (november 1985) opnåede eks- I

pression af et kimært genomt gen for human-muse-immunoglobu- I

I 30 lin efter transfektion ind i musemyelomaceller. I 1

P. T. Jones et al.. Nature 321:552 (maj 1986) konstruerede og I

I udtrykte en genom konstruktion, hvor CDR-områder af variable I

regioner fra et monoklont museantistof blev anvendt til at I

I 35 erstatte de tilsvarende områder i et humant antistof. I

I DK 175680 B1 I

L. K. Sun et al., Hybridoma 5 suppl. 1 S17 (1986) beskriver et I

kimært humant/muse-antistof med potentiel tumorspecificitet. I

De kimære tunge og lette kædegener er genome konstruktioner og I

i 5 udtrykkes i mamma le celler. I

I Sahagan et al., J. Immun. 137:1066-1074 (august 1986) beskriv- I

er et kimært antistof med specificitet over for et humant tu- I

morassocieret antigen, for hvilket generne er sammensatte ud I

j fra genome sekvenser. I

^ I

For en nyere oversigt over området, se også S. L. Morrison, I

Science 229: 1202-1207 (20. september 1985) og V.T. Oi et al., I

BioTechniques 4:214 (1986). I

Oi et al.-beskrivelsen er relevant, da den anfører, at frem- I

stillingen af kimære antistoffer fra cDNA-konstruktioner i gær I

og/eller bakterier ikke nødvendigvis er fordelagtig. I

Se også kommentaren på side 835 i Biotechnology 4 (1986). I

20 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt I

fremgangsmåde til at fremstille genteknologifremstillede anti- I

stoffer med ønsket variabel regionspecificitet og konstant re- I

gionegenskaber gennem genkloning og ekspression af lette og I

tunge kæder. De klonede immunoglobulingenprodukter kan frem- I

25 stilles ved ekspression i genteknologi fremstillede organismer.

Anvendelsen af kemisk gensyntese, rekombinant-DNA-kloning og fremstilling af specifikke immunoglobuli nkæder i forskellige organismer tilvejebringer en effektiv løsning for den effek-30 tive produktion af humane monoklone antistoffer i stor målestok med antigenspecificiteter af enten humane eller ikke-humane, især gnavere, monoklone antistoffer. Opfindelsen tilvejebringer også en løsning til problemet med klasseskiftende antistofmolekyler, således at det er bekvemt at fremstille im-35 munoglobuliner med en hvilken som helst given klasses bestemte bindingsspecificitet.

DK 175680 B1

Opfindelsen tilvejebringer vektorer omfattende cDNA-sekvenser, der koder for immu-5 noglobulinkæder, som omfatter en konstant human region og en variabel, enten human eller ikke-human, region. Immunoglobulinkædeme kan enten være tunge eller lette.

Opfindelsen tilvejebringer også gensekvenser, der koder for immunoglobulinkæder, der 10 omfatter en variabel cDNA-region af ikke-human origin og en konstant genomregion af

H human origin. I

Opfindelsen tilvejebringer også sekvenser, som ovenfor, der er I

H 15 til stede i rekombinant-DNA molekyler, især i bærere, såsom I

plasmidvektorer, der er i stand til ekspression i ønskede pro- I

karyote eller eukaryote værter. I

Opfindelsen ti 1 vejebri nger også konsensussekvenser og speci- I

2Q fikke oligonucleotidsekvenser, der er anvendelige som sonder I

for hybridisering og priming af cONA-syntese af en hvilken I

som helst hybridoma-mRNA, der koder for variable regioner med I

en hvilken som helst ønsket specificitet. I

I Opfindelsen tilvejebringer værter, der er i stand til ved I

H 2 5 I

dyrkning at fremstille kimære antistoffer og fremgangsmåder I

til anvendelse af disse værter. I

Opfindelsen tilvejebringer også kimære individuelle immunoglo- I

I bulinkæder og hele samlede molekyler, der har humane konstante I

I 30 regioner og ikke-humane variable regioner, hvor begge variable I

I regioner har den samme bindingsspecificitet. I

I Blandt andre immunoglobulinkæder og/eller -molekyler, der til- I

vejebringes ved opfindelsen, er: I

1 35 I

9 DK 175680 B1 (a) et fuldstændigt, funktionelt immunoglobulinmolekyle, der omfatter (i) to identiske kimære tunge kæder, der omfatter en ikke-human variabel region og en human konstant region, og (ii) to identiske helt {dvs. ikke-kimære) humane lette kæder.

(b) et fuldstændigt, funktionelt immunoglobulinmolekyle, der 10 omfatter I (i) to identiske kimære tunge kæder, der omfatter en ikke- human variabel region og en human konstant region, og (i i) to identiske helt (dvs. ikke-kimære) ikke-humane lette 15 kæder.

(c) et monovalent antistof, dvs. et fuldstændigt funktionelt immunoglobulinmolekyle, der omfatter: (i) to identiske kimære tunge kæder, der omfatter en ikke- human variabel region og en human konstant region, og (ii) to forskellige lette kæder, hvoraf kun en har den samme specificitet som den variable region hos de tunge kæder.

Det resulterende anti stofmolekyle binder kun til én ende deraf 25 og er derfor ude af stand til divalent binding, (d) et antistof med to forskellige specificiteter, dvs. et fuldstændigt, funktionelt immunoglobulinmolekyle, der omfatter: (i) to forskellige kimære tunge kæder, hvoraf den forste

Ow er én, der omfatter en ikke-human variabel region og en human konstant region og den anden omfatter en forskellig ikke-human variabel region og en human konstant region, og (ii) to forskellige kimære lette kæder, hvoraf den forste 3 5 omfatter en ikke-human variabel region, der har den samme specificitet, som den første tunge kædes variable region og en human konstant region, og den anden omfatter en ikke-human

I DK 175680 B1 I

variabel region, der har den samme specificitet, som den anden I

tunge kædes variable region, og en human konstant region. I

Det resulterende antistofmolekyle binder til to forskellige I

„ antigener. I

Genetiske sekvenser, især cDNA-sekvenser, der koder for de I

førnævnte kombinationer af kimære kæder eller af ikke-kimære I

kæder tilvejebringes også heri. I

10 Opfindelsen tilvejebringer også en genetisk sekvens, især en I

cDNA-sekvens, der koder for den variable region af et anti- I

stofmolekyles tunge og/eller lette kæde, operabelt koblet til I

en sekvens, der koder for et polypeptid, der er forskelligt I

fra en immunoglobuli nkæde (f.eks. et enzym). Oisse sekvenser I

15 kan samles ved hjælp af metoder ifølge opfindelsen og udtryk- I

kes til opnåelse af molekyler med blandet funktion. I

Anvendelsen af cDNA-sekvenser er særligt fordelagtigt sammen- I

lignet med genome sekvenser (som indeholder introner) ved at I

I 20 cDNA-sekvenser kan udtrykkes i bakterier eller andre værter, I

som mangler RNA-splejsningssystemer. I

Blandt foretrukne spec i fikke ant i stoffer er sådanne, der har I

specificiteter til cancer-beslægtede antigener. I

25 Figur 1 viser DNA-omordninger og ekspressionen af immunoglobu- I

lins mu og γ tunge kædegener. Dette er en skematisk repræsen- I

tation af det humane tunge kædegenkompleks, ikke vist i de I

rigtige forhold. Variabel-V-regiondannelse hos tung kæde fore- I

kommer gennem foreningen af Vh~, 0- og Jn-gensegmenter. Dette I

30 frembringer et aktivt mu-gen. En anden type DNA-omordning I

i kaldet "klasseskift" omlokaliserer den bundne Vh, D og Jh re' I

j gion fra den mu konstante C-region til en anden tung kædes C- I

region {skiftning til γ er anført her). Der fremhæves skema- I

tisk at J-regionen er et almindeligt træk hos alle udtrykte I

35 tunge kædegener. J-regionen er også et almindeligt træk hos I

udtrykte lette kædegener. I

Figur 2 viser de kendte nucleotidsekvenser hos humane J-regi- I

oner og muse-J-regioner. Consensussekvenser for J-regionerne I

11 DK 175680 B1 er vist nedenfor de faktiske sekvenser. 01igonucleotidsekven-sen under muse-kappa J-regionconsensussekvensen er et "universalt immunoglobulingen"-oligonucleotid (UIG), som anvendes i den foreliggende opfindelse.

5

Figur 3 fremhæver skematisk anvendelsen af UIG-oligonucleotid-primeren for syntesen af cDNA komplementær til immunoglobulin-messenger-RNA's variable regi on, eller anvendelsen af oligo-dT som en primer for cDNA-syntese efterfulgt af in vitro mutage- 10 nese*

Figur 4 viser syntesen og analysen af humane IgGl-gener, omfattende tre isolerede kloner (A.b), hvoraf en (pGNH-6) anvendes som en kloningsvektor (B). En 1,5 kb deletion af pBR322-sekvens mellem Barn HI og PvuII er markeret. Ikke i 15 målestoksforhold.

Figur 5 viser kloningsvektoren pQ23, en modificeret pBR322, egnet til cONA-kloning ved KpnI-stedet. Denne vektor indeholder også de anvendelige restriktionsenzymsteder Bglll og Sall.

20 Ikke i målestoksforhold.

Figur 6 viser i A. syntesen og analysen af humane lette kæde-kappagener. Figuren viser også i B. (ikke i- målestoksforhold) konstruktion af en human C|<-region-kloningsvektor pING2001.

2 5

Figur 7 viser primerer konstrueret til syntese af immunoglobulins V-region. (A) viser J-C-regioner af tung kæde og primerer. En DNA-version af hver muse-J-region af tung kæde er vist direkte over primerer konstrueret fra den sekvens. Huse-J-regioner er 5' til 3', fra venstre til højre, mens primerer 30 er 3' til 5’, venstre til højre. Primernavne er omfattet af klammer, og antal nucleotider (N) og antal af forkert matchede med hver *)Η-Γβ9·>οη ®r anført til højre. Primerer, som indfører et BstEII-sted, er understreget. (B) viser J-regionerne af lette kæder og primerer. Det samme som for (A) bortset fra 3 5 lette kæder. Primerer konstrueret til at indføre et Bglll-sted er understreget, som BclI-stedet, der er til stede i pING2016E. (C) viser UlG-primerer til muse-variable regioncon-

I DK 175680 B1 I

I I

H sensus. Oen faktiske primersekvens er vist nedenfor den kon- I

sensussekvens. Den humane Cr-Hindlll-vektor pGML60 er vist ne- I

H denfor. (D) viser en muse γ 2a J/C-forbindelsesprimer. I

I ^ Figur 8 viser syntesen af V-regionmodulgener af tung kæde under I

anvendelse af oligonucleotid primet cDNA-syntese. Ikke i måle- I

stoksforhold. 'I

Figur 9 viser konstruktionen af hybride muse-humane-immunoglo- I

10 bulingener. Del A viser konstruktionen af et gen for tung I

H kæde. Stiplede regioner viser C-regionmoduler, mens skraverede I

H eller sorte regioner viser V-regionmoduler. Ikke i målestoks- I

forhold. I

Figur 10 viser konstruktionen af cDNA-kloningsekspressions- I

H is i

"pendul"-vektorer for mammale celler. Vektorerne pIN62003 og I

I piNG2003E hidrører fra pLl, pUC12, pSV2-neo og M8-a-RX12. Stip- I

lede regioner indikerer DNA-fremmer til muse tung kæde. skrå- I

I verede regioner indikerer SV-40-DNA fra pLl, og dobbeltskrave- I

I rede regioner indikerer SV-40-DNA fra pSV2-neo. I vektorerne I

I pING2003 og pING2003E repræsenterer tykke linier pBR322-DNA I

I fra pSV2-neo, mens tynde linier betegner pUC12-DNA. Pile in- I

I dikerer SV-40 tidlige regionpromotorers lokaliseringer og I

I retninger, og indikerer en fuldstændig SV-40-intronsekvens. I

„ _ Ikke i målestoksforhold. I

I Figur 11 viser konstruktionen af det tunge kædeekspressions- I

plasmid pING2006E. Pilene viser SV-40-promotor1 oka 1 i ser i nger I

og retninger for transcription. Skraverede og sorte områder I

I viser muse-V-regionmoduler, mens stiplede områder viser humane I

H 3 0 I

C-regionmoduler. Ikke i målestoksforhold.

I Figur 12 viser strukturen af de kimære anti-hepatitis tunge I

I kædegener i ekspressionspiasmiderne pING2006E og pING2012E. I

I Oel A viser strukturen af kimære muse-human anti-hepatitis I

I 35 tunge kædegener. Strukturen af humant IgGl-mRNA- og -cDNA er I

I vist i A.a.. Den humane tunge kædes konstante regions cDNA- I

I klon pGMH-6 og cDNA-kloner for muse tung kædes variable region I

I pBS13-l og pJ3-l1 blev anvendt til at fremstille hybridgenet I

13 DK 175680 B1 j anvendt i pING2006E. Skraverede genblokke indikerer muse variable regionsekvenser, mens åbne genblokke viser humane IgGl konstante regionsekvenser. Oel 8 viser den nucleotide j sekvens af anti-hepatitis B tung kædes variable region i j. 5 pING2006E og pING20l2E. pING2012E blev konstrueret ved først at indsætte et BglH-sted ved Sall-stedet i pING1202 {se fig.

16) til dannelse af pING1202BglII. Oet kimære tunge kædegen fra dette plasmid blev indsat i ekspressionsvektoren pING2003E, hvilket resulterer i pING2012E. pING2012E er for-10 skelligt fra pING2006E i regionen øjeblikkeligt opstrøms for initiatoren ATG. Understregede nucleotider betegner humane J-regionsekvenser fra cDNA-klonen pGMH-6. Aminosyre 117 med stjerne indikerer en enkelt ændring ved dette sted fra muse til human sekvens (Ala til Ser) indført i den kimære gen-J-15 region. Rækkefølgebestemmelse var ved hjælp af Sanger-metoden på plasmidskabeloner (åben cirkel) og M13-skabeloner (lukket cirkel).

Figur 13 viser i del A J-C-forbindelsesregionnucleotidsekven-sen i lette kædekloner hidrørende fra pING2001 (pHACK-3, pING2013E, PING2007E, pING2010E-gpt og pING2014E-gpt). J- regionsekvensen begyndende fra pK2-3 er markeret human-JK4. G-nucleotidet, ikke forudsagt ved genom rækkefølgebestemmelse, er markeret med en stjerne. 01igonucleotidprimeren (K2-4BCLI), som anvendes til at modificere denne sekvens, er vist under den humane JK4-sekvens. Oel B viser fremgangsmåden til sted-rettet mutagenese, der anvendes til at fremstille pING2016E-gpt. Ikke i målestoksforhold.

Figur 14 genkopi nummer af de transf icerede sekvenser i to 3 0 transformanter. nONA fra 2AE9, 2BH10 blev fordøjet med de anførte enzymer. Koncentrationen af DNA er titreret ned tværs over banerne med den mængde, der er anført over dem. Sonden indeholder humane C-y-l-sekvenser (pmvHc24 Apal-BamHI). Referencen er kønscelle (eng.: germ-line) eller GM2146 nONA for- 3 5 døjet med Apal. 3' Apal-stedet er 2 bp for stedet for poly(A)-add i t i on (3).

Figur 15 viser nucleotidsekvensen af V-regionen af L6-Vh-cDNA-klon pH3-6a. Sekvensen blev bestemt ved dideoxyterminer ingsme-

I DK 175680 B1 I

I I

H tode under anvendelse af M13-subk1 oner af genfragmenter (vist I

nedenfor). Åbne cirkler betegner aminosyrerester bekræftet ved I

peptidsekvens. En sekvenshomolog til Dsp,2 “· CDR3-regionen er I

understreget. I

I 5 I

H Figur 16 viser nuc 1 eot idsekvensen af V-regionen af L6-V«- I

cDNA-k1 on pL3-12a. 01igonucleotidprimeren anvendt for sted- I

H rettet mutagenese er vist nedenfor Jj(5-segmentet. Åbne cir- I

kier betegner aminosyrerester, der er bekræftet ved peptidse- I

I : 10 I

Figur 17 viser konstruktionen af kimære L6-Vh“ samt humane I

C-y-l-ekspressionsplasmider. Del (a) viser sekvenserne af I

BAL-31 deletionklonerne M13mpl9-CL-6-4 (Cl-6-4) og M13mpl9-Cl- I

I 6-21(01-6-21).· 5'-enden af cDNA-klonen, pH3-6a, er betegnet I

H 1 15 med en pil. M13-sekvenser er understreget. Den oligonucleotid- I

primer, der anvendes til dette eksperiment, er H3-6a I

I {5’-GACT6CACCAACTGG-3' ) , som primer i FRI, nær den fuldt ud- I

viklede N-ende. Del (b) viser strategien for sted-rettet nu- I

tagenese af 1 ug kloner Cl-6-4 og Cl-6-21, hver fejet til 20 I

I 20 I

ng af 31-mer-oligonucleotidet MJH2-ApaI. Komplementær streng-

syntese med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase foregik ved I

H stuetemperatur i 30 minutter, derefter 15eC i 72 timer. Trans- I

ficerede fag-plaquer blev adsorberet til nitrocellulose, I

I fæstnet med NaOH og hybridiseret til 32p-mærket MJH2-ApaI- I

I 25 oligonucleotid ved 6S°C, 18 timer, i 4 x TBS (0,6M NaCl, 0,04M I

I tris-HCl (pH-værdi 7,4), 0,004M EDTA) og 10¾ dextransulfat. I

Afsluttende vask af filtrene foregik ved 65°C, 4 x SSPE, 0,1¾ I

H SDS i 15 minutter (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A I

Laboratory Manual, 1982). Positive plaquer blev påvist ved ud- I

I 30 I

sættelse for "Kodak" XAR-film natten over og blev direkte ud- I

I valgt for vækst og restriktionenzymanalyse af RF-DNA. Forkert I

matchede mellem MJH2-ApaI-o1igonucleotidet og muse-Cnl er an- I

I ført, hvilket resulterer i de kodningsændringer, som er vist I

I nedenfor oligonucleotidet. Del (c) viser strategien for sub- I

35 I

stitutionen af hver af de mutageniserede L6-Vn-moduler for den

residente Vh af det kimære ekspressionspiasmid pING2012 til I

I dannelse af pING2111 og pING21l2. I

15 DK 175680 B1

Figur 18 viser konstruktionen af det kimære L6-ekspressions-plasmid pING2119. Sall til BamHI fragmentet fra pING2100 er identisk med Sall til 8amHI-A fragmentet fra pING2012E.

g Figur 19 viser modificering af Vigenet og dets anvendelse ved konstruktion af let kæde og tung samt lette kædeekspressions-plasmider.

(a) Deletion af oligo-d[GC]-segment 5' af V* af L6. Oligonu-cleotidet er en 22-mer og indeholder et Sall-sted. De tre for-kert matchede er vist. V«-genet bindes efter mutagenese som et SalI-Hindi I I-fragment til human-C-K-rnodul. Det således dannede ekspressionsplasmid er pING2119.

(b) pING2114, et tungt samt let kædeekspressionsplasmid. Eks- 15 pressionspiasmidet pING2114 indeholder det kimære L6 tunge kædegen fra pING21.ll og den kimære lette kæde fra pING2119 (tykke linie).

Figur 20 viser en opsummering af de sekvensændringer, der er ; ,0 foretaget ved konstruktionen af de kimære L6 antistof-ekspres- sionsplasmider. Understregede rester i den 5' ikke-translate-rede region hidrører fra de klonede miise kappa og tunge kæde-gener. Rester med en cirkel omkring i V/C-grænsen resulterer fra rautageneseoperationer til fremstilling af restriktionsen-2g zymsteder i denne region. Rester betegnet med små cirkler over dem i L6 tunge kædekimær resulterer også fra mutagenese. De er i kke udtrykte (eng.· silent) ændr i nger.

Figur 21 viser 2H7 Vn-sekvensen. Vigenet indeholder kvenser og DSP.2-sekvenselementer. Små cirkler over aminosyre-30 resterne er sådanne, som matcher peptidsekvenser.

Figur 22 viser 2H7 Vi.-sekvensen. Vigenet indeholder JK5-se-kvenser. Et 22-mer-o1igonucleotid blev anvendt til at placere et Sall-sted 5' ATG-initi atorcodonet. Små cirkler oven over 35 aminosyreresterne er de, som matcher peptidsekvenser.

Figur 23 viser de kimære immunoglobulingenekspressionspi asmider med 2H7-specificiteten. pING2101 (Vn,neo), pING2106

I DK 175680 B1 I

I I

(V|(fneo) og pING2107 (V|(,gpt) er et-gen-p 1 asmider. De andre er I

to-gen-plasmi der. Deres konstruktion involverer ligeringen af I

H de større Ndel-fragmenter af plNG2lbl og pING2107 til linea- I

riseret pING2106 delvis fordøjet med Ndel. pHL2-ll og pHL2-26 I

5 blev opnået ud fra pING2101 og pING2106; pLL2-25 blev opnået I

I fra PING2107 og pING2106. I

H Figur 24 viser en opsummering af de nucleotidændringer, der er' I

introduceret i Vh og V* ved konstruktionen af de kimære plas- I

I mider. De beslægtede Vh- og V|(-nucleotidrester i 5'-enden er I

H understreget. Rester med cirkler i J-C-forbindel sesstederne I

hidrører fra de humane C-moduler. I

Generelt er antistoffer sammensat af to lette og to tunge I

kædemolekyler. Lette og tunge kæder er fordelt i områder med I

strukturel og funktionel homologi. De variable regioner i både

lette (Vl) og tunge (Vh) kæder bestemmer genkendelse og speci- I

I ficitet. Lette (Cj_) og tunge (Ch) kæders konstante regionsom- I

råder giver vigtige biologiske egenskaber, såsom antistof- I

kæde forening, udskillelse, transplacental mobilitet, komple- I

20 I

mentbinding og lignende.

I En kompleks række af begivenheder fører til immunoglobulin- I

genekspression i B-celler. V-region gensekvenser givende anti- I

genspecificitet og -binding er lokaliseret i separate køns- I

I 25 1 inie-gensegme.nter, der benævnes Vh» D og Jh; eller V^ og J|_. I

Disse gensegmenter er forbundne ved hjælp af DNA-omordn i nger I

I til dannelse af de fuldstændige V-regioner udtrykt i henholds- I

I vis tunge og lette kæder (fig. 1). De omordnede forbundne I

I (Vl-Jl °9 Vh-O-Jh) V-segmenter koder derefter for de fuldstæn- I

I 30 dige, variable regioner eller antigenbindingsområder hos hen- I

holdsvis lette og tunge kæder.

I Visse benævnelser og udtryk anvendes gennem hele beskrivelsen I

H og kravene. Defølgendedefini t ioner anføres med det formål at I

I 35 skabe klarhed og overensstemmelse. I

I 1. Ekspressionsvektor - et plasmid DNA, der indeholder nød-

I vendige regulatoriske signaler for syntesen af mRNA, der hid- I

I rører fra gensekvenser, som kan indsættes i vektoren. I

17 DK 175680 B1 2. Modulvektor - et plasmid DNA, der indeholder et konstant el ler variabelt regiongenmodul.

3. Ekspressionspi asmid - en ekspressionsvektor, som indehol-.. der et indsat gen, såsom et kimært immunoglobul i ngen.

’ 5 4. Genkloning - syntese af et gen, indsættelse i ONA-vektor-er, og identifikation ved hybridisering og lignende.

5. Transfektion - overførslen af DNA ind i mammale celler.

10

Opfindelsen tilvejebringer en hidtil ukendt fremgangsmåde til kloning og produktion af humane antistoffer med ønsket specificitet. Generelt forener fremgangsmåden fem elementer: (1) Isolering af messenger-RNA (mRNA) fra B-cellehybridoma- ' 15 liner, der producerer monoklone antistoffer mod specifikke antigener, kloning og cDNA-fremsti 11 ing derfra.

(2) Fremstilling af universelle immunoglobulingen-oligonucle-otider (UIG), der er anvendelige som primerer og/eller sonder 20 for kloning af de variable regiongensegmenter i det lette og tunge kæde mRNA fra specifikke humane eller ikke-humane hybri-domacelleli ni er, og cDNA-produktion derfra.

(3) Fremstilling af konstant regiongensegmentmoduler ved __ cDNA-fremsti 11 ing og kloning, eller genom genfremstilling og Z 5 kloning.

i j (4) Konstruktion af fuldstændige, tunge eller lette kæde kodende sekvenser ved kobling af de klonede specifikke immunoglobulin variable regiongensegmenter fra del (2) ovenfor til 30 klonede humane konstante regiongensegmentmoduler.

(5) Ekspression og produktion af lette og tunge kæder i udvalgte værter, omfattende prokaryote og eukaryote værter, enten i separate fermentationer efterfulgt af samling af anti-35 stofmolekyler in vitro, eller gennem produktion af begge kæder i den samme celle.

Opfindelsen anvender klonede hybridoma-B-cellelinier, der fremstiller monoklone antistoffer med defineret specificitet

DK 175680 B1 I

for isolering af mRNA for cDNA-kloning. På grund af at ‘mange H

lymfoide cellelinier indeholder meget aktive nucleaser, som H

nedbryder mRNA under isolering, anvendes der ifølge opfindel- H

sen metoder til fremstilling af mRNA specifikt udviklet for H

5 isolering af intakt mRNA fra celler og væv, der indeholder ak- I

tive nucleaser. En sådan fremgangsmåde giver fremstillinger af I

totalt RNA ved celle- eller vævsødelæggelse i en ethanol-per- H

chlorat-tørisblanding, som reducerer nucleasevirkning (P.M. I

Lizardi et al., Anal. Biochem., 98: 116 (1979)). Denne frem- I

10 gangsmåde giver intakt translationsdygtigt mRNA. I

Andre fremgangsmåder, som er blevet anvendt ifølge opfindel- H

sen, omfatter ekstraktion af cellerne med 1 i thiumchlorid samt H

urinstof (C. Auffray og F. Rougeon, Eur. J. 8iochem., 107: 303 H

.. (1980)) eller quanidinthiocyanat (J. M. Chirgwin et al., Bio- H

i O

chemistry, 18: 5294 (1979)) til fremstilling af RNA. H

Et universelt træk ved alle lette og tunge immunoglobulinkæ- H

degener og messenger-RNA'er er den såkaldte J-region (dvs.

forbindelsesregion, se fig. 1). J-regioner hos tunge og lette H

o o kæder har forskellige sekvenser, men en høj grad af sekvensho-

mol og i forekommer (større end 80%) inden i de tunge kæders Jh- I

regioner eller J-regionerne i kappa lette kæde. Opfindelsen H

tilvejebringer consensussekvenser for J-regioner hos lette og H

tunge kæder, der er anvendelige ved udformning af oligonucleo- H

25 tider (betegnet heri som UIG’er) til anvendelse som primerer

eller sonder til kloning af lette eller tunge immunoglobulin- H

kæder-mRNA'er eller -gener (fig. 2 eller 7). Afhængig af na- I

turen af udformningen af en bestemt UIG kan den være i stand I

til hybrid i sering til alle immunoglobuli n-mRNA'er eller -gen- I

30 er, der indeholder en enkelt specifik J-sekvens, såsom UIG- MJH3, som kun detekterer muse-JH3~sekvenser (ficj· 7).

En anden anvendelse af en bestemt UIG-sonde kan være hybridi- H

sering til lette kæde- eller tunge kæde-mRNA'er med en speci- H

35 fik konstant region, såsom UIG-MJK, som detekterer alle muse- I

J|(-holdige sekvenser (fig. 7). UIG-udformningen kan også om- H

fatte en sekvens til indføring af et restriktionsenzymsted i I

et immunoglobulingens cDNA-kopi (se fig. 7). Opfindelsen kan I

! 19 DK 175680 B1 f.eks. benytte kemisk gensyntese til frembringelse af UIG-sonder til kloningen af V-regioner i immunoglobulin-mRNA fra hybridomaceller, der laver monoklone antistoffer med ønskede antigen-specificiteter.

5

En multi tri nsprocedure anvendes til dannelse af fuldstændige V+C-region-cDNA-kloner fra lette og tunge kæde-mRNA'er fra hy-bridomacelle. I det første trin anvendes der ifølge opfindelsen UIG-sonder soo "primerer" for omvendt transcriptase-kopie-1Q ring af den fuldstændige V-region og tunge og lette kæde- mRNA'ers lederkodende sekvenser {f i g. 3). Den komplementære streng af den primerudstrakte cDNA syntetiseres derefter og denne dobbeltstrengede cDNA klones i passende cDNA-klonings-vektorer, såsom p8R322 (Gubier og Hoffman, Gene, 25: 263 15 (1983)) eller pQ23 (fig. 5, T. Maniatis et al., Molecular i Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory I Publications, New York, side 224 (1982)). Kloner screenes for specifik hybridisering med UIG-oligonucleotidsonder. Positive tunge og lette kæde-kloner identificeret ved denne screenings-2o procedure kortlægges og rækkefølgebestemmes til udvælgelse af de, der indeholder V-region og lederkodende sekvenser.

En alternativ metode er at fremstille cDNA-kloner under anvendelse af oligo-dT som en primer, efterfulgt af udvælgelse af lette og tunge kæde-kloner ved hjælp af standardhybridise- 25 rmgsmetoder.

I et andet trin anvendes kloning af C-regiongensegmenter til i. dannelse af tunge og lette kædemodul vektorer. I én fremgangs måde fremstilles cDNA-kloner af human tung og let immunoglo-30 bul inkæde-mRNA. Disse cDNA-kloner omdannes derefter i C-regionmodulvektorer ved sted-rettet mutagenese til placering af et restriktionssted ved en ønsket lokalisering nær en grænse til den konstante region. En alternativ metode anvender genome C-regionkloner som kilden for C-regionmodulvektorer.

Et tredje trin i cDNA-kloning i nvolverer frembringelsen af fuldstændige, lette og tunge kæde-kodningssekvenser med koblede V- og C-regioner. De klonede V-regionsegmenter, frembragt 35

DK 175680 B1 I

som ovenfor, udskæres og ligeres til lette eller tunge kædes

C-region-raodulvektorer. For eksempel kan man klone den fuld- I

stændige, humane, kappa lette kædes C-region og den fuldstæn- I

dige humane y-j-C-region. Derudover kan man modificere en hu- H

5 man y-l-region og indføre et termineringscodon, hvorved der I

opnås en gensekvens, som koder for den tunge kædedel af et H

Fab-molekyle. I

Kodningssekvenserne, der operationelt har koblede V- og C- I

regioner, overføres derefter til passende ekspressionssystemer I

for ekspression i passende værter, prokaryote eller eukaryote. I

Operationelt koblet betyder forening i-ramme af kodningsse- I

kvenser til afledning af en kontinuert translationsdygtig gen- H

sekvens uden ændringer eller forstyrrelser af triplet-læseram- H

men. H

En særlig fordel ved at anvende genetiske cDNA-sekvenser

ifølge den foreliggende opfindelsen er den kendsgerning, at de H

koder kontinuert for immunoglobuli nkæder, hvad enten tunge H

eller lette. Ved "kontinuert" menes, at sekvenserne ikke inde- H

9 o H

holder introner {dvs. ikke er genome sekvenser, men nærmere,

da de hidrører fra mRNA ved omvendt transcription, er sekven- H

ser med nærliggende exoner). Dette karakteristika af cDNA- H

sekvenserne tilvejebragt ifølge opfindelsen gør det muligt for I

dem at kunne udtrykkes i prokaryote værter, såsom bakterier, H

2 5 eller i lavere eukaryotiske værter, såsom gær.

En anden fordel ved cDNA-kloningsmetoder er den nemhed og sim- H

pelhed, hvorved der opnås V-regiongenmoduler. I

30 Udtrykket "ikke-human" som anvendt ifølge opfindelsen er ment H

som omfattende et hvilket som helst dyr forskelligt fra et H

menneske, hvori en immunreaktion kan frembringes som derefter H

fører til anvendelige B-celler resulterende i tilsvarende hy- H

bridomaer eller B-celle-kloner opnået ved viral transformation og lignende. Sådanne dyr omfatter almindeligvis gnavere, såsom

J D

musen eller rotten. På grund af at det er nemt at behandle og H

opnå mus, er musen på nuværende tidspunkt det foretrukne ikke- H

humane dyr. Mus-mus-hybridomaer anvendes således som de fore- H

trukne kilder for tunge og lette kæders variable regioner. H

21 DK 175680 B1 j j Fortrinsvis ti 1 vejebri nger opfindelsen hele V- og/eller C-re- gion-cDNA-sekvenser. Dette betyder, at sekvenserne koder for i alt væsentligt operable V- og/eller C-regioner, uden mangel på nogen som helst større strukturelle dele deraf.

5

Udtrykkene "konstante" og "variable" anvendes funktionelt til at betegne sådanne regioner i immunoglobulinkæden, hvad enten hos tunge eller lette kæder, som koder for egenskaber og træk, der besiddes af de variable og konstante regioner i naturlige ikke-kimære antistoffer. Som bemærket er det ikke nødvendigt 10 for den fuldstændige kodende region for variable eller konstante regioner at være til stede, så længe som en funktionel virkende region er til stede og tilgængelig.

En lang række ki Idehybridomaer er tilgængelige til fremstil- 15 ling af mRNA. Se f.eks. kataloget ATCC Cel! Lines and Hybrido- mas, december 1984, American Type Culture Collection, 12301

Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., side 5-9 og ECACC Catalogue, 2. udgave; PHLS CAMR Porton Down, Salisbury,

Wills; SP40JG, U.K., side 30-35 og 40-46. Hybridomaer, der se-oo cernerer monoklone antistoffer, der er reaktive over for en lang række antigener, er anført deri og tilgængelige fr.a samlingen og anvendelige ifølge opfindelsen. Af særlig interesse af hybridomaer, der secernerer antistoffer, som er reaktive over for virale antigener omfattende Denque kompleks-specifik 25 {ATCC HB 114), Denque type 1 virus (ATCC HB 47), Denque type 2 virus {ATCC HB 46), Denque type 3 virus (ATCC H8 49), Denque type 4 virus (ATCC HB 48), Epstein-Barr receptor (ATCC HB 135), flavivirus-gruppe (ATCC HB 112), hepatitis B overfladeantigen (ATCC CRL 8017 og 8018), herpes simplex type I (ATCC 30 HB 8068), herpes simplex type II (ATCC HB 8067), influenzavirus (ATCC CL 189), influenza A-virus, matrixprotein (ATCC HB 64), influenza A-virus, nucleoprotein (ATCC HB 65), influenza A Bangkok/l/79HA (ATCC HB 66), influenza AWSN NP (ATCC HB 67), SV40 stor T-antigen (ATCC TIB 115), SV40 stor T-antigen, C-35 terminalende (ATCC TIB 117) og SV40 ikke-viral T-antigen (ATCC TIB 116). Eksempler på andre hybridomaer omfatter sådanne, der secernerer antistoffer til tumorassoc ierede antigener eller

DK 175680 B1 I

til humane lymfocytantigener, såsom sådanne, der er reaktive I

med human tumor-associeret CEA, høj mw (ATCC CRl 8019), human I

tumor-associeret α-fetoprotein, IgGjK (ATCC HB 134), human B- I

lymfocyt HLA-DR, monomorph, IgG2b (ATCC HB 104), human T-lym- I

5 focyt T-cel 1 eforstadier, IgG^ (ATCC CRL 8022), human T-lymfo- I

cyt T-celle-delmængde, hjælper, IgG2b (ATCC CRL 8002), T- I

delmængde, suppresser/cytotoksisk, human, IgGj (ATCC CRL I

8013), T-cel1edelmængde,suppressor/cytotoksi sk, human, IgG2a I

(ATCC CRL 8014), T-celler, periferal, human, IgGj (ATCC CRL I

10 8000), T-celler, periferal, human IgG2a (ATCC CRL 8001), thy-

mocytter, "almindelige", humane, IgGi (ATCC CRL 8020). I

Oisse linier og andre af lignende natur kan anvendes til at I

kopiere mRNA, der koder for variabel region, under anvendelse I

af UIG-sonder. Af særlig interesse har antistoffer med speci- I

ficitet over for humane tumoranti gener. I

Ekspressionsbærere omfatter plasmider eller andre vektorer. I

Foretrukne blandt disse er bærere, der bærer en funktionel I

fuldstændig human konstant, tung eller let kædesekvens, der I

20 I

har passende restriktionssteder fremstillet således, at en hvilken som helst variabel tung eller let kædesekvens med de

passende cohæsive ender let kan indsættes deri. Humane kon- I

stante, tung eller let kædesekvens-holdige bærere er således H

en vigtig udførelsesform for opfindelsen. Disse bærere kan an- H

2 5 vendes som mellemprodukter til ekspression af en hvilken som

helst ønsket komplet, tung eller let kæde i en hvilken som H

helst passende vært. I

En foretrukken vært er gær. Gær tilvejebringer i alt væsent- I

30 ligt fordele for fremstillingen af lette og tunge immunog1 obu- I

linkæder. Gær udfører post-translationale peptidmodifikationer I

omfattende g lycosy 1 er ing. Et antal af DNA-rekombineringsstra- I

tegier eksisterer nu, hvori der anvendes stærke promotorse- I

kvenser og plasmider med højt kopiantal, som kan anvendes til I

35 åbenlys fremstilling af de ønskede proteiner i gær. Gær gen- I

kender ledersekvenser på klonede mammale genprodukter og se- I

cernerer peptider, der bærer ledersekvenser (dvs. præpeptider) I

(Hitzman et al., llth International Conference on Yeast, Gene- I

23 DK 175680 B1 tics and Molecular Biology, Montpelier, France, September 13-17, 1982).

Gærgenekspressionssystemer kan rutinemæssigt evalueres for ni-5 veauet af tung og let kædeproduktion, proteinstabilitet og secenering. En hvilken som helst af en række gærgenekspressionssystemer, som inkorporerer promotor- og termineringsele-menter fra de aktivt udtrykte gener, der koder for glycoly-! tiske enzymer frembragt i store mængder, når gær dyrkes i me- 10 diumer som er rig på glucose, kan anvendes. Kendte glycoly-tiske gener kan også tilvejebringe meget effektive transcrip-tionskontrolsignaler. For eksempel kan promotor- og termina-torsignaler fra iso-l-cytochrom-C-(CYC-l)-gen anvendes.

Den følgende fremgangsmåde kan anvendes til evaluering af op-15 timale ekspressionsplasmider til ekspressionen af klonede im-munoglobulin-cDNA'er i gær.

(1) Det klonede DNA-immunoglobulin koblende V- Og C-regioner er bundet til forskellige transcriptionspromotorer og DNA- | 20 terminatorfragmenter.

(2) De kimære gener placeres på gærpi asmider, der anvendes til protein-overfremsti 11ing (se f.eks. J.D. Beggs, Molecular Genetics and Yeast, Alfred Benzon Symposium, 16, København 25 (lsein.

(3) Supplerende genetiske enheder, såsom et gærlederpeptid kan indbefattes i immunoglobulin-DNA-konstruktioner til opnåelse af anti stofsecernering.

30 (4) En del af sekvensen, ofte de første 6-20 codoner af ge nsekvensen, kan modificeres til at repræsentere foretrukne gærcodonanvendelse. 1 3 5

De følgende fremgangsmåder kan anvendes til simultant at ud trykke både lette og tunge kædegener i gær.

De kimære gener placeres på plasmider, der anvendes til integration i gærkromosomer .

DK 175680 B1 I

i

' (1) Oe lette og tunge kædegener er hver knyttet til en gær- H

promotor- og en -terminatorsekvens og placeret på det samme H

plasmid. Dette plasmid kan udformes til enten autonom replika- I

1 tion i gær eller integration ved specifikke steder i gærkromo- H

I 5 somet.

(2) De lette og tunge kædegener er hver knyttet til en gær- H

promotor- og -termi natorsekvens på separate plasmi der, der in- H

deholder forskellige selektive markerer. For eksempel kan det H

lette kædegen placeres på et plasmid, der indeholder trpl- H

genet som en selektiv markør, mens det tunge kædegen kan pla- I

ceres på et plasmid, der indeholder ura3 som en selektiv mar- H

kør. Plasmiderne kan udformes til enten autonom replikation i I

gær eller integration ved specifikke steder i gærkromosomerne. H

jg En gærstreng, der er mangelfuld for begge selektive markører H

er enten simultant eller sekventielt transformeret med det H

plasmid, der indeholder let kædegen og med det plasmid, der H

indeholder tungt kædegen. H

(3) De lette og tunge kædegener knyttes hver til en gærpro- H

20 Η motor- og -terminatorsekvens på separate plasmider, der hver

indeholder forskellige selektive markører som beskrevet i (2) H

ovenfor. En gærparringstype '^"-streng, der er mangelfuld i de H

selektive markører, der findes på de lette og tunge kædeeks- I

pressionspi asmider (trpl og ura3 i det ovenfor nævnte eksem- H

25 pel) transformeres med det plasmid, der indeholder det lette

kædegen ved selektion for en af de to selektive markører (trpl I

i det ovenfor nævnte eksempel). En gærparringstype "<x”-streng, H

der er mangelfuld i de samme selektive markerer som "V-stren- H

gen (dvs. trpl og ura3 som eksempler) transformeres med et H

30 H

plasmid, der indeholder det tunge kædegen ved selektion for

den alternative selektive markør (dvs. ura3 i det ovenfor H

nævnte eksempel). ’'a"-strengen, der indeholder det lette kæde- H

plasmid (phenotype: Trp+ Ura- i det ovenfor nævnte eksempel) H

og strengen, der indeholder det tunge kædeplasmid (phenotype: H

3 5 H

Trp- Ura+ i det ovenfor nævnte eksempel) parres og diploider

udvælges som er prototrofe for begge de ovenfor nævnte selek- H

tive markører (Trp+ Ura+ i det ovenfor nævnte eksempel). H

25 DK 175680 B1

Blandt bakterielle værter, soro kan anvendes soro transformeringsværter, er E. coli K12-streng 294 (ATCC 31446) særlig anvendelig. Andre mikrobielle strenge, som kan anvendes, omfatter E. coli XI776 (ATCC .31537). De førnævnte strenge såvel 5 soro E. coli W3110 (ATCC 27325) og andre enterobakterier, såsom Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og forskellige Pseudoroonus arter kan anvendes.

Generelt anvendes pi asmidvektorer, som indeholder replikonsek-venser og kontrolsekvenser, som hidrører fra arter, der er forligelige med en værtscelle i forbindelse med disse værter. Vektoren bærer almindeligvis et replikationssted, såvel som specifikke gener, som er i stand til at tilvejebringe phenoty-pisk selektion i transformerede celler. For eksempel trans-formeres E. coli nemt under anvendelse af pBR322, et plasmid, der hidrører fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracyklin-r es istens og tilvejebringer således lette metoder til at identificere transformerede celler. pBR322-plasmid eller andre mikro-20 bielle plasmider må også indeholde eller være modificeret til at indeholde, promotorer, som kan anvendes af den mikrobielle organ i sme til ekspression af dens egne proteiner. De promotorer, der almindeligvis mest anvendes ved rekombinant-DNA-konstruktion, omfatter p-lactamasepromotorsystemer (penicilli-25 nase) og 1actosepromotorsystemer (β-ga1actosidase) promotorsystemer (Chang et al.. Nature, 275: 615 (1978), Itakura et al.. Science, 198: 1056 (1977)) og tryptophanpromotorsystemer

(Goeddel et al., Nucleic Acids Research, 8: 4057 (1980), EPO

publikations nummer 0036776). Selvom disse er de mest alminde-30 ligt anvendte er andre mikrobielle promotorer blevet fundet og brugt.

En genetisk konstruktion for en hvilken som helst tung eller let kimær immunog1 obu 1 i nkæde kan f.eks. placeres under kontrol af den mod venstre rettede promotor (P|_) af bakteriefag λ. Denne promotor er en af de stærkeste kendte promotorer, som kan kontrolleres. Kontrol udøves af λ-repressoren og nærliggende restriktionssteder kendes.

DK 175680 B1 I

I Ekspressionen af immunoglobulinksdesekvensen kan også placeres H

under andre regulatoriske sekvensers kontrol, soro kan være H

"homologe" til organismen i dens ikke-transformerede tilstand. I

For eksempel omfatter 1actose-afhængigt E. coli-kromosomalt H

5 DMA I

et lactose- eller lac-operon, soro formidler lactosefordøjelse H

ved opbygning af enzymet β-ga1actosi dase. lac-kontrolelemen- H

terne kan opnås ud fra bakteriofag λ pLAC5, som er inficerende I

for E. coli. 1ac-promotor/operatorsystemet kan fremkaldes af I

10 IPTG. I

Et andet promotor/operator-system eller dele deraf kan lige- I

ledes anvendes. For eksempel arabinose, colicin El, galactose, H

alkalinphosphatase, tryptophan, xylose, tac og lignende kan H

, anvendes. I

15

Andre foretrukne værter er mammale celler, der er dyrket in I

vitro i vævskultur eller in vivo i dyr. Mammale celler tilve- H

jebringer post-translationale modifikationer til immunoglobu- H

1 inproteinmolekyler, der omfatter lederpeptidfjernelse, kor- H

rekt foldning og samling af tunge og lette kæder, glycosyler-

ing på korrekte steder og. secernering af funktionelt antistof- H

protein fra cellen som f^t^-molekyler. H

Mammale celler, som kan anvendes som værter for produktionen H

25 af anti stofproteiner, omfatter celler af fi bropi astorigin, så- I

som Vero (ATCC CRL 81) eller CH0-K1 (ATCC CRL 61), eller cel- I

ler af lymfoidorigin, såsom hybridoma Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL I

1581) eller myleoma P3X63Ag8 (ATCC TIB 9) og dets derivater. I

3Q Flere mulige vektorsystemer er tilgængelige for ekspressionen H

af klonede tunge kæde-gener og lette kæde-gener i mammale cel- H

ler. En klasse af vektorer anvender DNA-elementer, som tilve-

jebringer et autonomt replikerende ekstrakromosoma1t plasmid, H

der hidrører fra dyrevira, såsom bovin-papi1lomavirus (N. H

Sarver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 7147 (1982)), I

polyomavirus (R. J. Deans et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, H

81: 1292 (1984)) eller SV40-virus (M. Lusky og M. Botchan, Na- I

ture, 293: 79 (1981)). En anden klasse af vektorer afhænger af I

1 27 DK 175680 B1 integrationen af den ønskede gensekvens i værtscellekromoso-met. Celler, som stabilt har integreret det introducerede DNA i deres kromosomer, kan udvælges ved også at introducere lægemiddel resistensgener , såsom E. coli gpt (R. C. Mulligan og P.

5 Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 2072 (1981)) eller Tn5 neo (P. J. Southern og P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)). Oet udvælgelige markørgen kan enten være direkte koblet til ONA-gensekvenserne for at blive udtrykt eller indført i den samme celle ved cotransfektion (M. Wigler et al.. Cell, 10 16: 77 (1979)).

Da et immunoglobulin-cDNA kun er sammensat af sekvenser, der repræsenterer det fuldt udviklede mRNA, der koder for et antistofprotein eller dets forstadier, kræves der supplerende ge-,, nekspressionselementer, der regulerer transcription af genet og fremstilling af RNA'et, for optimal syntese af immunoglobul in-mRNA. Disse elementer kan omfatte splejsesignaler, såvel som transcriptionspromotorer omfattende inducerbare promotorer, fremmere og termineringssignaler. cONA-ekspressions-vektorer, der har inkorporeret sådanne elementer, omfatter sådanne, der er beskrevet af H. Okayama og P. Berg, Mol. Cell Biol., 3: 280 (1983), C.L. Cepko et al.. Cell, 37: 1053 (1984) , og R. J. Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 689 (1985) .

2 5

En fremgangsmåde til at evaluere optimale vektorer for ekspressionen af immunoglobulin-cDNA i mammale celler involverer at man først placerer immunoglobulin-DNA-sekvensen i vektorer, der er i stand til stabilt at integrere ind i ce 1 1 egenom.en eller replikerer autonomt som et ekstrakromosoma1t plasmid.

30 :· Vektorerne kan anvendes til at evaluere forskellige genek spressionselementer for optimal immunoglobuli nsyntese.

En yderligere fordel ved mammale celler, som værter, er deres evne til at udtrykke kimære immunoglobul i ngener, som hidrører 35 fra genome sekvenser. Mammale celler kan således udtrykke kimære immunoglobulingener, som er sammensat af et variabelt re-gion-cDNA-modul samt en konstant region, som er sammensat helt eller delvis af genome sekvenser. Flere genome kloner for hu-

I DK 175680 B1 I

I I

man konstant region har varet beskrevet (J. W. Ellison et al.,

I Nucl. Acids Res., 10: 4071 (1982) eller E. Max et al., Cell, I

I 29: 691 (1982)). Anvendelsen af sådanne genome sekvenser kan I

vare hensigtsmæssige til den simultane indføring af immunoglo- I

5 bulinfremmere, splejsesignaler og transcriptionsterminerings- I

signaler sammen med det konstante regiongensegment. I

I Forskellige fremgangsmåder kan følges til opnåelse af fuld- I

I stændige H2L2~antistoffer. I

H

I ^ 10 Først kan man separat udtrykke de lette og tunge kæder efter- I

fulgt af in vitro-assembly af oprensede lette og tunge kæder I

ind i fuldstændige H2L2~IgG-antistof fer. Samlingsmetoderne, I

I der anvendes til frembringelsen af fuldstændige H2L2-IgG-mo- I

I lekyler i celler, er blevet undersøgt i stort omfang (se I

I 15 f.eks. M. Scharff, Harvey Lectures, 69: 125 (1974)). In vitro- I

I reaktionsparametre for dannelsen af Ig6-anti stoffer fra redu- I

ceret, isoleret lette og tunge kæder har være defineret af S. I

Η I Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, I

I New York, side 69, 1979. I

I 20 I

I Dernæst er det muligt at co-udtrykke lette og tunge kæder i de I

I samme celler til opnåelse af intracel1ulær associering og kob- I

ling af tunge og lette kæder til fuldstændige H2L2“IgG-anti- I

I stoffer. Co-ekspressionen kan forekomme ved at anvende enten I

I 25 de samme eller forskellige plasmider i den samme vært. I

I Fremgangsmåden, der er beskrevet heri, kan også anvendes til I

at skifte et hvilket som helst antistofs klasse med en given I

I specificitet og klasse til et antistof med den samme speci- - I

I 30 ficitet, men med en anden klasse, hvad enten human eller I

I ikke-human. For eksempel kan humane IgM-antistoffer transmu- I

teres til humane IgG-anti stoffer ved at fremstille konstruk- I

I tioner, der indeholder human konstant IgG-cONA eller genome I

I sekvenser, der er koblet til human variable cDNA-sekvenser, I

I 35 der er opnået fra en celle, der producerer det originale IgM- I

I antistof. Disse konstruktioner indføres derefter i passende I

I værter og udtrykkes. I

Η i 29 DK 175680 B1

Opfindelsen tilvejebringer "kimære" immunog1 obu 1 i nkæder, enten tunge eller lette. En kimær kæde indeholder en konstant re-I gion, der i alt væsentligt ligner den, som er til stede i den tunge kæde hos et naturligt humant immunoglobulin, og en va-5 riabel region, der har en hvilken som helst ønsket antigenspecificitet. Den variable region er enten af human !. eller ikke-human origin.

Opfindelsen tilvejebringer også immunoglobulinmolekyler, der I har tunge og lette kæder forenet således, at det samlede mole kyle udviser ønsket bindings- og genkendelsesegenskaber. Forskellige typer immunoglobuli nmolekyler tilvejebringes: monovalente, divalente, dispecifikke (dvs. med forskellige variable regioner), molekyler med kimære tunge kæder og ikke-kimære lette kæder eller molekyler med variable bindingsområder 15 knyttet til peptiddele, der bærer ønskede funktioner.

Antistoffer, der har kimære tunge kæder med den samme eller forskellig variabel regionbindingsspecificitet og ikke-kimære (dvs. helt humant eller helt ikke-humant) lette kæder, kan 2 0 fremstilles ved passende forening af de nødvendige polypeptid-kæder. Disse kæder fremstilles individuelt ved hjælp af de modulære samlingsfremgangsmåder ifølge opfindelsen.

Antistofferne ifølge opfindelsen med human konstant region kan 25 anvendes til passiv immunisering, især hos mennesker, uden negative immunreaktioner, såsom serumsygdomme eller anafylaktisk chock. Antistofferne kan selvfølgelig også anvendes ved kendte immunodiagnostiske bestemmelser og i analysesæt i mærket form til in vivo afbildning, hvor mærket kan være en radioaktiv 30 kilde eller, et NMR-kontrastmiddel, såsom en carbon-13-kerne eller et røntgenkontrastmidde1, såsom en tungmeta1 kerne. Antistofferne kan også anvendes til in vitro-lokalisering af antigener ved passende mærkning.

i

Antistofferne kan anvendes til terapeutiske formål i sig selv 3 5 i komplementformidlet lyse eller kan kobles til toxiner eller andre terapeutiske dele.

DK 175680 B1 I

Antistoffers klasseskift er anvendelig, når det ønskes at æn- H

dre sammensætningen, aggregeringen eller andre egenskaber hos H

antistoffer, der er opnået ved cellefusion eller hybridomatek- I

nik. For eksempel er de fleste human-human monoklone ant i - H

5 stoffer af IgH-klassen og er kendt for at de har nemt ved re- I

duktion og aggregering. Andring af sådanne antistoffer til

andre anti stoftyper, såsom IgG, IgA eller IgE, er således en I

stor fordel. I

Blandede antistof-enzym-molekyler kan anvendes til immunodia- H

gnostiske metoder, såsom ELISA. Blandede antistof-pept id- H

effektorkonjugater kan anvendes til målrettet aflevering af H

effektordelen med en høj grad af effektivitet og specificitet. H

Efter nu generelt at have beskrevet opfindelsen vil den yder- H

15 I

ligere forstås ved henvisning til bestemte specifikke eksemp-

ler, som er indbefattet heri kun for illustrationsformål og H

ikke er ment at være begrænsende, medmindre andet er anført. H

Eksperi menter. H

Materialer og metoder. H

Vævskulturcellelinier. H

De humane cellelinier GM2146 og GM1500 blev opnået fra the I

Human Mutant Cell Repository (Camden, New Jersey) og dyrket i H

2 5 I

RPMI1640 samt 10% føtal bovinserum (M. A. Bioproducts). Celle- linierne Sp2/0 og CRL 80X7 blev leveret fra the American Type

Culture Collection og dyrket i Dulbecco’s Modified Eagle Medi- I

um (DMEM) samt 4,5 g/1 glucose (Μ. A. Bioproducts) samt 10% I

føtal bovinserum (Hyclone, Sterile Systems, Logan, Utah). Me- I

30 dier blev suppleret med pen ici11 in/streptomycin (Irvine Scien-

tific, Irvine, California). H

Rekombineret plasmid- og bakteriofag-DNA. H

35 Plasmiderne pBR322, pLl og pUC12 blev leveret fra Pharmacia P- I

L Biochemicals (Milwaukee, Wisconsin). Plasmiderne pSV2-neo og H

pSV2-gpt blev leveret fra BRL (Gaithersburg, Maryland) og er H

tilgængelige fra the American Type Culture Collection Η 31 DK 175680 B1 (Rockville, Maryland). pHu-γ-Ι er en subklon af 8,3 Kb fragmentet Kb Hindlll til BamHI fra det humane IgGl kromosomale gen. En separat isolering af det humane IgGl kromosomale gen er beskrevet af J. W. Ellison et al., Nucl. Acids Res., 10: 5 4071 (1982). M8-o-RX12 indeholder 0,7 Kb fragmentet Xbal til

EcoRI, der indeholder muse tung-kæde-fremmer fra J-C-intron-regionen i M603 kromosomgenet ( M. Oavis et al., Nature, 283: 733) indsat i Mi3mpl0. G-haledannet pUC9 blev leveret fra Pharmacia P-L. DNA-manipulationer, der involverede oprensning 10 af plasmid DMA ved grænsedensitetcentrifugering, restriktions-endonuc1easefordøje1 se, oprensning af ONA-fragmenter ved aga-rosegelelektroforese, ligering og transformering af E. coli blev udført som beskrevet af T. Maniatis et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982). Restriktionsendonuclea-15 ser og andre DNA/RNA-modificerende enzymer blev leveret fra Boehringer-Mannheim (Indianapolis, Indiana), BRL, New England Bi o 1abs (Bever 1y, Massachusetts) og Pharmacia P-L.

Oligonucleotidfremstilling.

2 0 01 igonucleoti der blev enten syntetiseret ved triestermetoden beskrevet af Ito et al. (Nucl. Acids Res., 10: 1755 (1982)) eller blev leveret fra ELESEN, Los Angeles, California. Tr i - tyleret, afblokerede oligonuc1eoti der blev oprenset på

Sephadex-G50, efterfulgt af omvendt-fase HPLC med en 0-25% 2 5 gradient af acetonitril i lOmM triethylamineddikesyre, pH-værdi 7,2, på en C18 uBondapak-søjle (Waters Associates). Af-tritylering blev udført i 80% eddikesyre i 30 minutter, efterfulgt af afdampning tre gange. 01 igonucleoti der blev mærket med [y-32p] ATP samt T4-polynucleotidki nase.

30 RNA-fremst i 11 ing og analyse.

Totalt, cellulært RNA blev fremstillet ud fra vævskulturceller ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet af C. Auffray og F. Rou-25 geon (Eur. J. Biochem., 107: 303 (1980)) eller J. M. Chirgwin et al. (Biochemistry, 18: 5294 (1979)). Fremstilling af poly(A) + -RNA, met hyl kviksølvagarosegele 1ektroforese og "Nor-thern"-overførsel til nitrocellulose blev udført som beskrevet

32 I

DK 175680 B1 I

| af T. Maniatis et al., supra. Totalt cellulært RNA eller I

poly(A)+-RNA blev direkte bundet til nitrocellulose ved først I

at behandle RNA * en med formaldehyd <B. A. White og F. C. Ban- I

croft, J. Biol. Chem., 257: 8569 (1982)). Hybridi sering til

5 filterbundet RNA var med hak-translaterede ONA-fragmenter un- . I

der anvendelse af betingelser beskrevet af D. H. Margulies et I

al. (Nature, 295: 168 (1982)) eller med 32P-mærket oligonuele-

otid under anvendelse af 4xSSC, 10X Oenhardt’s, 100 pg/ml I

1akssperma-DNA ved 37eC natten over, efterfulgt af vask i I

10 4xSSC ved 37°C.

cDNA-fremsti 11ing og kloning. I

Oligo-dT primede cDNA-biblioteker blev fremstillet ud fra I

poly(A)+-RNA fra GM1500- og GM2146-celler ved hjælp af frem- I

15 I

gangsmåden beskrevet af henholdsvis H. Land et al. (Nucl.

Acids Res., 9: 2251 (1981)) og V. Gubier og B. J. Hoffman, I

Gene, 25: 263 (1983). cDNA-bibliotekerne blev screenet ved in I

situ hybridisering (T. Maniatis, supra) med 32P-mærket oligo- I

nucleotider under anvendelse af betingelserne anført ovenfor, I

20 H

eller med hak-translaterede DNA-fragmenter under anvendelse af

betingelserne beskrevet af Lange et al. (Cell, 34: 891 H

(1983)).

01igonucleotid-primerforlængelse og kloning. I

Poly(A)+-RNA (20 pg) blev blandet med 1,2 pg primer i 40 pi I

64mM KC1. Efter denaturering ved 90°C i 5 minutter og derefter I

afkøling i is blev 3 enheder human placental ribonucleaseinhi- I

bitor (BRL) sat til 3 pi 1M tris-HCl, pH-værdi 8,3. Oligonu- I

2Q cleotidet blev føjet til RNA ved 42eC i 15 minutter, derefter I

blev 12 pi 0,05M DTT, 0,05H MgCl2 og ImM af hver dATP, dTTP, I

dCTP og dGTP tilsat. 2 pi a-32P-dATP (400 Ci/mmol, New England I

Nuclear) blev tilsat efterfulgt af 3 pi AMV-omvendt-transcrip- I

tase (19 enheder/pl, Life Sciences). I

3 5 I

Efter inkubering ved 42°C i 105 minutter blev 2 pi 0,5M Ε0ΤΑ

og 50 pi lOmM tris, ImM EDTA, pH-værdi 7,6, tilsat. Ikke- I

inkorporerede nucleotider blev fjernet ved "Sephadex” G-50 I

33 · DK 175680 B1 hvirvelkolonnekromatografi, og RNA-DNA-hybridet blev ekstraheret med phenol, derefter med chloroform og præcipiteret med ethanol. Syntese af den anden streng, homopolymerha ledannelse med dGTP eller dCTP og indsættelse ind i homopolymerhaledan-5 nende vektorer blev udført som beskrevet af Gubier og Hoffman, supra.

Sted-rettet mutagenese.

Enkeltstrenget M13 subklon DNA (1 Mgx b1ev forenet med 20 ng 10

oligonucleotidprimer i 12,5 μΐ Hin-puffer (7mM tris-HCl, pH-værdi 7,6 7mM MgCl2» 50 mM NaCl). Efter opvarmning til 95°C i et lukket rør blev primeren føjet til skabelonen ved langsomt at afkøle fra 70eC t.il 37eC i 90 minutter. 2 μΐ dNTP (ImM

hver), 1 μΐ 32P-dATP (10 uCi), 1 μΐ DTT (0,1M) og 0,4 μΊ Kle- 15 now-DNA-PolI (2u, Boehringer Mannheim) blev tilsat og kæderne forlænget ved 37eC i 30 minutter. Til dette blev sat 1 μΐ (10 ng) Μ13 omvendt primer (New England Biolabs) og opvarmnings/ sammenføjnings- og kædefor 1ængelsestrinnene blev gentaget. Reaktionen blev stoppet med 2 μΐ 0,5M EDTA, pH-værdi 8 samt 80 ! 20 μΐ lOmM tris-HCl, pH-værdi 7,6, ImM EDTA. Produkterne blev phenolekstraheret og oprenset ved "Sephadex” G-50 hvirvelko-lonnekromatograf i og ethanol-præcipiteret før restriktionsenzymfordøjelse og ligering til den passende vektor.

25 Transficering af myelomavævskulturceller.

En variation af metoden beskrevet af A. Ochi et al. (Nature, 302: 340 (1983)) blev anvendt til protoplastfusion. 50 ml bakterier ved A600 0*7 blev omdannet til protoplaster ved 30 hjælp af metoden beskrevet af R. M. Sandri-Go 1din et al. (Mol.

Cell. Biol., 1: 743 (1981)), derefter fortyndet med 20 ml DMEM og 10% FBS (endelig volumen er 25 ml). Sp2/0-celler blev høstet, pelleteret ved 2.200 x g, vasket, genpel1eteret og gensuspenderet i DMEM ved 2-5xl06/ml. Bakterielle protoplaster 35 (10 ml) blev blandet med 10xl06 Sp2/0-celler og pelleteret ved centrifugering ved 4.000 x g ved 22°C i 20 minutter. Efter af-pipettering af supernatanten blev pelleten suspenderet i den tilbageværende dråbe af medium ved at ryste røret. 2 ml 10%

I DK 175680 B1 I

I 34 I

I OMSO, 37% (vægt/vol.) PEG6000 (Kodak) i DMEM blev tilsat drå- I

I bevis under blanding i løbet af 45 sekunder. Efter 15 sekunder I

I blev 2 ml 42% PEG6000 i OMEM tilsat i løbet af 45 sekunder. I

Fuldstændigt DMEM (45 ml) blev langsomt tilsat under blanding. I

I 5 Cellerne blev pelleteret ved 2500 x g, derefter vasket og H

pelleteret tre gange. I

I Elektroporationsmetoden beskrevet af H. Potter et al. (Proc. I

I Natl. Acad. Sci., USA, 81: 7161 (1984) blev anvendt. Efter I

^ transficering fik cellerne lov til at komme sig i fuldstændig H

DMEM i 48-72 timer, hvorefter de blev podet ved 10.000 til fl

H 50.000 celler pr. brønd i dyrkningsplader med 96 brønde i nær- H

I værelse af selektivt medium. G418 (GIBCO)-selektion var ved fl

I 0,8 mg/ml, mycophenolisk syre (Calbiochem) ved 6 pg/ml samt H

I 0,25 mg/ml xanthin og HAT (sigma) var ved standardkoncentra- fl fl fl fl

fl Bestemmelse af immunoglobulinsyntese og -secernering. H

I Secerneret immunoglobulin blev målt direkte fra vævskultur- H

I 20 cel lesupernatanter. Cytoplasmisk proteinekstrakt blev frem- H

I Stillet ved hvirvling af lxlO^-celler i 160 μΐ 1% NP40, 0,15M fl I NaCl , lOmM tris og ImM EDTA, pH-værdi 7,6 ved 0®C, i 15 mi- fl

fl nutter, efterfulgt af centrifugering ved 10.000 x g til fjer- H

fl nelse af uopløseligt materiale. H

fl 25 fl I Oobbe 1 tant i stof-sandwich ELISA (A. Voller et al., i Manual of fl fl Clinical Immunology, 2. udgave, udgivere N. Rose og H. Friedm- fl I an, side 359-371, 1980) under anvendelse af affinitetoprenset fl

I antisera blev anvendt til at påvise specifikke immunoglobuli- H

I 30 ner. Til påvisning af human IgG var det pladebundne antiserum H

I gede-ant i-human-IgG (KPL, Gaithersburg, Maryland) i en H

I 1/1000-fortynding, mens det peroxidasebundne antiserum var H

I gede-anti-human-IgG (KPL eller Tago, Burlingame) i en 1/4000- H

fl fortynding. Til påvisning af human immunoglobulin kappa var H

fl det pladebundne antiserum gede-anti-human-kappa (Tago) i en H

3 5 ^fl

fl 1/500 fortynding, mens det peroxidasebundne antiserum er gede- H

fl ant i-human-kappa (Cappel) i en 1/1000-fortynding. H

35 DK 175680 B1

Antistoffer, der binder hepatitis B-overf1adeanti gen, blev påvist under anvendelse af en kommerciel bestemmelse (Abbott, AUSAB).

Eksempler.

5

De følgende eksempler viser fremstillingen af kimære antistoffer, der hver har en human konstant region og en ikke-human variabel region. Disse eksempler anviser den trinvise fremgangsmåde til fremstilling af de kimære antistoffer.

10

Eksempel 1: Humant antistofs konstante region-gen-moduler og cDNA-ekspressionsvektorer.

(1) Fremstilling af cDNA-kloner og bærere, der indeholder disse, for tung kædes humane konstante region.

i O

Cellelinien GM2146 blev anvendt som kilde ved mRNA-fremsti 1 -ling og cDNA-kloning. Denne cellelinie secernerer IgGl (J. G. Simmons et al., Scand. J. Immunol., 14: 1-13, 1981). Undersøgelser af denne cellelinie viste at den secenerer IgA såvel 20 T „ som IgG.

Cellelinien blev klonet og resultater viste at fem af seks subkloner kun secernerede IgG, mens en af seks subkloner kun secernerede IgA. Poly(A)+-RNA blev fremstillet ud fra celleli-25 nien og et cDNA-bibliotek belv fremstillet ud fra poly(A)+-RNA ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet af U. Gubier og B. J. Hoffman, Gene, 25: 263-269 (1983). En indledende spredning af cDNA transformeret i E. coli-stammer HB101 og RR1 gav et samlet antal kolonier på 1500, som blev screenet ved hybridise-30 ring til fragment af Hindlll til BamHI af en genom klon af human IgGl (pHu-y-1). Der blev fundet fire positive kloner. Et fragment, der indeholder den CH3-kodende region af en af disse kloner, pGMH-3 (fig. 4), blev anvendt til at genscreene det oprindelige bibliotek samt en ny transformation af ca. 5000 35 kolonier. To af de største kloner, pGMH-6 og pGMH-15, blev analyseret ved hjælp af restriktionsenzymfordøjelse (fig. 4). Begge kloner indeholdt hele den konstante region af human IgGl, selvom det viste sig, at pGMH-6 havde deleteret ca. 1500 —^___

DK 175680 B1 I

basepar af pBR322-ONA, tilsyneladende uden at påvirke IgGl H

cDNA-sekvenserne. H

Klon pGMH-6 tilvejebragte IgGl's konstante regionsmodul i kon- I

struktionen af kloningsvektorer til kloning af tung kædes va- H

riable region. H

(2) Fremstilling af cDNA-kloner og bærere, der indeholder H

disse, for human let kædes konstante region. H

10 En human cellelinie (GM1500), der producerer IgG2K, blev ud- H

valgt til indledningskloningsfasen. Poly{A)+-RNA fremstillet H

ud fra GM1500 er aktivt i in vitro translation under anven- H

delse af kanin-reticulocytekstrakter. Et cONA-bibliotek blev H

fremstillet ud fra dette RNA ved hjælp af fremgangsmåden bes- H

15 krevet af Land et al., Nucl. Acids Res., 9: 2251-2266 (1981) I

under anvendelse af fordøjet Kpnl og dG-haledannet pQ23 som H

kloningsvektoren (fig. 5). Denne vektor indeholder Bglll-, H

Kpnl- og Sstl-steder indsat mellem 8amHI- og SalI-stederne hos H

p8R322. I

For at identificere cDNA-klonerne frembragt ud fra GM1500 RNA, H

som svarer til let kæde-mRNA, blev en ONA-sonde, UIG-HuK, syn- H

tetiseret og oprenset. UIG-HuK-oligonucleotid har sekvensen H

5'-AGCCACAGTTCGTTT-3’ og er udformet til at hybridisere til I

oc alle funktionelle humane kappa-mRNA-arter ved J-C-forbin- I

IO

delsen. Denne sonde blev anvendt til at prime cDNA-syntese på I

i GH1500 RNA i nærværelse af dideoxynucleotider og omvendt H

transcriptase. Poly(A)+-RNA anvendtes fra 1,2 pg totalt GM1500 I

i dette eksperiment, hele J-sekvensen og noget af V-regionen H

3Q blev aflæst, hvilket viser at (1) GM1500 RNA er intakt, (2) at H

kappa-sonden har den korrekte sekvens, og (3) GH1500 let kæde H

mRNA indeholder Jj(A-sekvenser. H

cDNA-kloner, der er positive for hybrid i sering til sonden for H

: let kæde, blev udvalgt. Da sonden hybridiserer til J-C- I

35 forbindelsen, var det vigtigste punkt at bestemme, om klonerne

havde fuldstændig konstant region-sekvens ud over J-regionen. I

Indsættelsesstørrelser for de to største kappa-cDNA-kloner var I

0,6 og 0,9 kb, restriktionsenzym-kortlægning viste at hele den I

37 DK 175680 B1 konstante region-kodningssekvens var til stede i begge kloner (fig. 6) Den humane kappa-cDNA-klon pK2-3 blev anvendt til at fremstille let kæde konstant regionvektoren pING2001 ved at indsætte Sau3A-ffagmentet, der omfatter human kappa konstant 5 regionen og J-regionen i BclI-stedet hos pBR325 (fig. 6B).

En variant af human kappa cDNA-klonen blev fremstillet ved at placere et Hindlll-sted i J-regionen. Oette blev udført ved in vitro mutagenese under anvendelse af JkHINDIII-oligonucleotidprimer (fig. 7c). Det resulterende plasmid er pGML60.

En vektor, pING2003, blev konstrueret for at overføre og udtrykke cDNA-sekvenser i mammale celler (fig. 10). Denne vektor blev konstrueret ud fra pUC12 og to pi asmi der, der indeholdt 15 SV40-sekvenser. pLl tilvejebringer en SV40 tidlig-regions-promotor og en SV40 sen-region-splejsesekvens. pSV2-neo-sek-venser tilvejebringer en udvælgelig markør for mammal celletransformation og SV40 polyadenyleringssignalsekvenser. pUC12 tilvejebringer et multipelt kloningssted for cONA-indsættelse.

20 pING2003-vektoren har flere anvendelige restriktionssteder for modifikationer. Disse omfatter et Hindlll-sted, der er anvendelig for indsættelsen af fremmer-sekvenser, og et Hindlll til Xhol-fragment, der er anvendelig for indsættelsen af skiftende 25 prorootorsekvenser. Denne vektor er anvendelig ved ekspression en af cONA-gener i mammale celler.

Tilsætning af fremmerelement til pING2003.

Immunoglobulin-fremmerelementer har vist sig at fremme trans-30 cription af gener i deres nærhed i stabilt transformerede muse- myelomaceller med flere hundrede gange (S. D. Gillies et al.,

Cell, 33: 717, 1983 og J. Banerji et al., Cell, 729, 1983).

For at lette ekspression af muse-human-immunoglobulin-gener i muse-myelomacel ler blev muse-immunoglobul in tung kædefremmer-35 elementet sat til cONA-ekspressionsvektoren pING2003 (fig. 10). DNA for muse-tung kæde fremmerregionen blev isoleret ud fra en H13-subklon af genomt 0ΝΑ for muse-tung kæde (M8-a-

DK 175680 B1 I

RX12, R. J. Deans, ikke publiceret). DNA isoleret fra en Sall H

samt EcoRI fordøjelse af denne subklon blev modificeret med

Hindlll-koblere og indsat i Hindi Il-stedet hos pING2003, I

hvilket resulterede i den nye cDNA-ekspressionsvektor H

5 pING2003E. Denne vektor er anvendelig ved effektiv ekspression H

af cDNA-gener i mammale celler, især muse-myeloma- eller hy- H

bridoma-cellelinier. H

Eksempel 2; Kimært human-muse-antianti stofkæde mod HBsAG. H

10 (1) Fremstilling af cONA-kloner og bærere, der indeholder I

disse, for tung museksdes variable region. H

Cellelinien CRL8017 blev opnået ud fra ATCC og subklonet. Sub- H

kloner blev dyrket og undersøgt for muse IgG anti-hepatitis B- H

15 bindingsaktivitet under anvendelse af et kommercielt tilgænge- H

ligt anti-HBsAg-påvisningssst. Der blev fundet tre positive H

subkloner. Poly(A)+-RNA blev fremstillet ud fra en af disse H

subkloner og blev fraktioneret på en methy1kviksølvagarosege 1 . H

RNA'et indeholdt intakte lette kæde- og tunge kæde- roRNA’er H

20 hvilket kan sluttes ud fra specifik hybridisering til kappa H

UIG-MJK-primer og til muse tung kæde UIGMJH3-sonden (se fig. H

7). Derudover blev UIG-MJK-primeren anvendt til specifik pri- H

ming af anti-HBsAg-poly(A)+-RNA i en dideoxyrækkefølgereak- H

tion. Tilstrækkelig rækkefølge blev aflæst til at vise at et H

25 større kappa-RNA af anti-HBsAg-cellelinien indeholder J«2-sek- H

vensen. H

Betingelserne for variabel region cDNA-syntese blev gjort op- H

timale under anvendelse af tung og let kæde-UIG-primerer på H

30 anti-HBsAg-poly(A)+-RNA. Dideoxykædeforlsngelseseksperimenter H

viste at muse UIG-HOK-primer og UIG-JH3-primer korrekt primede H

kappa og tunge kæde RNA'er. Når omvendt transcription blev ud- H

ført under fravær af dideoxynucleotider, blev hovedproduktet H

under anvendelse af kappa UIG-MJK-pr imeren et 410+.20 nucleo- H

35 tidfragment, mens hovedproduktet under anvendelse af tung kæde H

UIG-JH3-pr i meren blev et 430+^30 nuc 1 eot idf ragment. Dette sva- H

rer til de forventede længder af de variable og 5'-ikke- H

trans!aterede regioner hos kappa og tunge kæde immunoglobulin- H

39 DK 175680 B1 mRNA'er. Betingelserne for optimal priming af poly(AS)+ RNA fra CRL8017-celler burde virke godt for poly(A)+ RNA, der er isoleret fra en hvilken som helst cellelinie, der fremstiller et monoklont antistof.

5

Efter bestemmelse af optimale betingelser for priming af hy-bridoma mRNA med ol igonucleotid-primere, blev to oligonucleo-tider udformet og anvendt til tung kæde V-region cDNA-syntese.

Oisse to oligonucleotider er UIG-MJHBSTEII{13) og UIG-MJH3 j0 (-f i g. 7 og 8). Det bor bemærkes, at primersekvensen blev ud formet til at indføre et BstEII-genkendelsessted (GGT6ACC) i klonen, således at det ved dette sted kunne forenes med human IgGl konstant modulet ved den analoge position hos sidstnævntes J-region. I dette tilfælde havde primenen en enkelt forkert matching mellem G og U med muse-mRNA-sekvensen som anven-15 der JH3-kodningssekvensen. UIG-MJHBSTEII(13)-primeren var 13 baser lang og den forkert matchede rest blev flankeret af 7 matchede 5' og 5 matchede 3' af den. Dette var 13-mer-BstEII- primeren. For at fastsætte primingseffektiviteten af 13-mer-

BstElI-oligonuc1eoti det blev der anvendt en 21-mer-primer, der var specifik for muse-Jn3 (UIG-MJH3). Denne primer havde en * perfekt match for 17-nucleotiderne på dens 3'-ende.

Disse to primerer og JH3-kodningssekvenserne er vist i fig. 8.

Første streng cDNA-produkterne fremstillet via 13-mer-BstEII- 2 5 og 21-mer-JH3-primerne omfatter bånd på ca. 430.nuc1eotider, som repræsenterer hele Vn-regionen. Under de anvendte standard primingsbetingelser var primingseffektiviteten af 13-mer-Bst-E11 meget mindre end den af 21-mer-JH3· I overensstemmelse hermed blev et cDNA-bibliotek fremstillet ud fra første streng 30 syntesen fra hver af disse primerer under anvendelse af metoder beskrevet af Gubier og Hoffman, supra.

Først blev 21-mer-Jn3-biblioteket screenet med 21-mer-JH3-oligonuc1eotidet. FiIterhybridisering blev udført ved 30® 35 natten over som beskrevet af T. de Lange et al., Cell, 34: 891-900 (1983). Filterne blev derefter vasket ved 51° i 6 x SSC, 0,1% SDS. Der blev udvalgt fem kolonier. Den største havde en indsættelse på ca. 460 bp. Mere signifikant indeholdt

I DK 175680 B1 I

I 40 I

den tre restriktionssteder forudsagt fra den kendte J^-sek- I

H vens, som er til stede opstrøms for primersekvensen. Denne I

klon, pJ 3-11, blev rækkefølgebestemt under anvendelse af I

Jn3-primeren ved kæde-afslutningsmetoden (R. B. Wallace et I

5 al., Gene, 16: 21-26 (1981)). Den opnåede sekvens havde det I

tilbageværende Jn3-kodningssegment. Lige opstrøms matchede et I

13-nucleotidsegment til en D-segmentsekvens (Dsp 2,2), der er . I

publiceret (Y. Kurosawa et al., J. Exp. Med, 155: 201 (1982), I

og S. Tonegawa, Nature, 302: 575 (1983)). Et nonapeptid forud- I

H 10 sagt fra dette område viste karakteristisk homologi til de pu- I

blicerede V-subgrupper af tung musekæde ved aminosyreresterne I

86 til 94 omfattende FR3 af de tunge kæde-molekyler. Plasmid H

pJ3-ll repræsenterede en omarrangeret VDJ-sekvens og indeholdt H

H tilsyneladende anti-hepatitis-V^-sekvensen produceret af cel- I

I 15 lelinien. I

For at isolere en Vn-region-cDNA-klon, som havde et BstEII- I

H sted i J-regionen, blev en Alul til Sau96I, 265 nucleotid H

I lang, sonde fra pJ3-ll dernæst anvendt til at screene cDNA- . I

biblioteket fremstillet ud fra 13-mer-BestEII-primeren. Der H

blev isoleret seks positive kloner. Den største, pBsl3-l, blev

yderligere analyseret. Indsættelsen var 280 nucleotider lang H

og dens restriktionskort var i overensstemmelse med pJ3-ll's I

på nær det introducerede BstEII-sted. Figur 9 illustrerer H

I 2 5 hvorledes disse to indsætninger blev genkombineret til frem- H

I stilling af pMVHCa-13, en Vn-klon med det modul forbindende I

BstEII-sted. Tre yderligere Vn-cONA-kloner blev isoleret fra H

et cONA-bibliotek fremstillet ud fra 21-mer oligonucleotid- H

I UIG-MJH3BSTEII-primeren, der indeholdt et BstEII-sted. Disse I

I 30 kloner kan ti 1 vejebringe, at skiftende Vn-cDNA-sekvenser for- I

I enes med humane Cn-sekvenser. H

I (2) Fremstilling af cDNA-kloner og bærere, der indeholder I

I disse, for lette musekædes variable region mod HBsAg.

I 35 Da J|(2-sekvenser er til stede i mRNA, fremstillet ud fra anti- I

I hepatitis-hybridomacellelinien, blev oligonuc1eotid-UIG-JK2- I

I BGLII (fig. 7B) udformet til at indføre et Bglll-sted ind i I

J^2-regionen. Fordøjelse medBglll ville derefter tillade di- H

41 DK 175680 B1 rekte indsættelse af en VK~cDNA-kodningsregion i BclI-stedet hos den tidligere nævnte humane C«-vektor, pING2001. Denne indsættelse ville resultere i den præcise forening af et muse variabelt region-segment {omfattende J-regionen) med et humant 5 kappa konstante region-segment, hver i den rigtige kodnings-ramme og uden nogen ændring i aminosyresekvens for hverken muse variabel region eller human konstant region.

JK2BGLII-oligonucleotid blev anvendt til at prime anti-HBsAg- roRNA til at danne et cDNA-bibliotek som for tung kæde, supra, i pUC9. cDNA blev størrelsesudvalgt ved polyacry1amidgelelek- troforese før kloning og 80% af cDNA-k1 onerne blev vist at have indsætningsstørrelser mellem 300 og 750 nucleotider i længden. Replikafiltre af dette bibliotek blev screenet med to oligonucleotider, den originale primer og en anden sonde kom-1 5 plementær t i 1 Jk2-sekvens 5' til den originale primer.

Det blev opdaget, at anti-hepatitis-B-monoklon cellelinien CRL 8017 secernerer immunoglobuliner med mindst to forskellige lette kæder, et af dem hidrører fra myeloma-NS-1, som blev an- 20 vendt som en fusionspartner til at frembringe anti-hepatitis-B-cellelinen. Da NS-1 hidrører, fra myeloma-M0PC21, blev muligheden af, at H0PC2l-V((-mRNA kan være til stede i V«-cDNA-biblioteket fra anti-hepatitis-monok1 once 11e1 ini en undersøgt.

Faktisk har en undersøgt cDNA-klon (p6D4B) et restriktionsen-25 zymkort der er identisk til det af M0PC21-V|<-e0NA, bortset fra det indsatte Bglll-sted.

Der kan drages to konklusioner fra disse resultater. Den første er, at det er muligt effektivt at anvende et oligonucleo-30 tid til at indføre et restriktionsenzymsted, mens en V|(-region klones fra en hybr idomacel lel inie. Den anden er, at man forsigtigt må undersøge hybridomacelleliner for tilstedeværelsen af flere V-region-sekvenser, hvoraf kun én er den ønskede sekvens.

For yderligere at karakterisere J-regionerne i kappa lette kæder, der er til stede i cellelinie-mRNA, blev poly(A)+-RNA bundet til nitrocellulose ved hjælp af formaldehyd-'Oot j 35

I DK 175680 B1 I

Η I

I ! blot"-fremgangsmåden, beskrevet af White og Bancroft, J. Biol. I

Chem., 257: 8569 (1982). RNA blev hybridiseret til 32p-mærket I

oligonucleotidsonder specifikke for hver funktionel kappa J- I

H region. Disse sonder er vist i fig. 7B som UIG-sonderne 5JK1, I

5 HJK, 5JK4 og 5JK5. Resultaterne viste at mRNA hybridiserede I

kraftigt til både MJK- og 5JK4-o1igonucleotidsonder, hvilket I

viste at både J|(2- og J«4-sekvenser var til stede. Da J«2-mRNA I

tidligere var blevet identificeret som det, der hidrørte fra I

rooderhybridomapartner NS-1, blev det konkluderet, at Jj(4-mRNA I

10 koder for anti-hepatitisbindingsspecificitet hos CRL 8017-cel- I

lerne. I

To forskellige cDNA-biblioteker blev screenet for at isolere I

V-region-kloner, der koder for Jj(4-sekvenser. Oen første blev I

j primed af JK2BGLII, supra. Oen anden blev fremstillet under I

15 I

anvendelse af ol igonucleotidprimeren, JK4BGLII, som er speci- I

Η H

fik for J((4-mRNA og indfører et Bglll-sted i J-regionen af I

klonede V-regioner. JK4BGLII-primeren blev anvendt til at I

prime syntese af den første streng cDNA til konstruktion af et I

I 20 cDNA-bibliotek ved hjælp af den samme metode der blev anvendt I

til at konstruere et JK2BGLII-pri met cDNA-bibliotek, bortset I

fra at cONA ikke blev størrelsesudvalgt før kloning. I

Η I fig. 7B vises de forkert matchede, som hver primer har med I

andre funktionelle muse-kappa-J-region-sekvenser. Bemærk, at I

I 25 I

Jk4 har fem forkert matchede i 21-nucleotider, når sammenlignet

med JK2BGLII-primeren, og 3 i 23 med JK4BGLII-primeren. I

Begge biblioteker blev screenet for V-region-kloner, der inde- I

I holdt Jk4-sekvenser ved hybridisering til en oligonucleotid- I

I 30 sonde specifik for J|(4-sekvenser (5JK4). Resultaterne af sere- I

I eningen er vist i tabel 1. I

I Tabel 1 *. I

Bibliotek Sondespecificitet. I

I 35 3k2 Ίκ4 I

I JK2BGLII 2% (30/1500) 0,15% (2/1500) I

I JK4BGLII N/D 3,5% (31/875) I

43 DK 175680 B1 * Procentandel af kloner, der indeholder Jj(2- eller J|(4-sekvenser og en V-region. De anvendte sonder var oligonu-cleotidet 5 JK4 (J|(4-specificitet, fig. 7) og p6D4B, soro indeholder NS-1 (M0PC21) V-region-sekvensen. N/D, ikke udført.

5

Flere JK4-V-region-cDNA-kloner isoleret fra begge biblioteker blev karakteriseret. Disse kloner har identiske restriktionsenzymkort omfattende det frembragte Bglll-sted resulterende fra den oligonucleotidprimede cONA-k1 on ingsfremgangsmåde. Re-strikt i onskortet og sekvensen af en klon, pV17, viser at pV17 indeholder V-region-gensekvenser.

Disse resultater viser, at JK2BGLII-primer korrekt kunne, selv om ueffektivt, prime J|<4-mRNA-sekvenser. Da JK2BGLII-primeren har færre forkert matchede med en hvilken som helst anden J«-*5 -region-mRNA end med J|(4-niRNA (fig. 7B) forventes det, at de andre Jx-mRNA'er kan primes på den korrekte lokalisering med bedre effektivitet under anvendelse af JK2BGL11-primeren. Således kan effektiv cDNA-kloning af en hvilken som helst funktionel muse-kappa-V-region opnås ved anvendelse af en blanding 20 af JK2BGLII- og JK4BGLII-primeren.

Placeringen af et Bglll-sted i J-regionen under cDNA-kloningen af V-regionerne tillader forening af det klonede muse-V-region-gen-modu1 til det humane kappa-konstant-region-gen-25 modul (fig. 9B).

Efter at de fornævnte eksperimenter var udført viste det sig at cDNA-k1 on pVl7 manglede en fuldstændig 5'-kodningsregion.

Nucleotid-rækkefølgebestemmelse viste at A af initiator- codon'et ATG ikke var kopieret i pVl7. Dette var ikke en ti 1 — 30 fældi g cONA-kloningsartifakt, da to andre cDNA-kloner havde den samme fejl. To fremgangsmåder blev udformet til opnåelse af et let kædegen med en fuldstændig 5'-kodningsregion.

Først blev et nyt cDNA-bibl iotek konstrueret ved først at 35 prime med et oligonucleotid (5’-ATATTTGCTGATGCTCT-3') komple mentær til pVl7-sekvenser 155 baser fra 5*-enden. Fra dette bibliotek blev kloner, der hybridiserede til en pV17-DNA-

I DK 175680 B1 I

i I

I 1 I

I fragment-sonde, udvalgt og nogle af disse nye cDNA-kloner har H

I initiatoren AT G samt ca. 20 nucleotider af 5’ ikke- I

translateret region. Én af disse kloner, p2-12, leverer en 5’ I

I ikke-translateret region på 23 nueleotider og et fuldstændigt I

5 ATG-initiatorcodon. Når p2-12 blev kombineret med sekvenser I

hidrørende fra pV17, blev en variabel region med en fuldstæn- I

I dig 5'-ende dannet (pING2013E). I

Dernæst blev sted-rettet mutagenese på den eksisterende lette I

I kæde-klon anvendt til simultant at fjerne poly-G-området og I

placere en ri bosom-genkende 1 sessekvens i nærheden af initia- I

I toren ATG. Pstl-fragmentet fra pV17 blev subklonet ind i I

I H13mpl8. Et o 1 i gonue1eoti d (V17-IVM; 5'-GTGTCGACTCAGCATGAGGT- I

TCCAGGTTC-3 * ) blev derefter anvendt som en primer til at mu- I

I tere pV17-sekvensen til at omfatte et Sall-sted og en initia- I

tor ATG ind i pV17-sekvensen. Det resulterende plasmid

I pV17-IVM tilvejebragte en alternativ muse variabel region til I

forening til humane konstante regionmoduler. I

Den fuldstændige nue1eotidsekvens hos den variable region fra

20 I

pV17 blev derefter bestemt. Sekvensen viser at pV17 indeholder

I en VK-JK’forbindelsesregion, der indeholder flere bevarede I

I aminosyrer og den hybride J«2/J|<4-region, der er dannet ved I priming af Jk^-RNA med UIG-JK2BGLII-o1 igonue1eotidet. V*-

I regionen i pV17 er imidlertid ikke-funktionel, forbi V«- og I

I J«"regionen ikke er i den samme kodningsramme. Translation af I

I pV17-V-regionen ville således resultere i en abnorm immunoglo- I

I bulin-let-kæde, hvor J-regionen er translateret i en ukorrekt I

ramme. Denne mangel kan forårsages af aberrerende V-J- I

forening, resulterende i en ikke-funktionel kappa-mRNA, som er I

30 blevet observeret af D.E. Kelley et al., Mol, Cell. Biol., Η

I 5:1660-1675 (1985). I

Da pV17-V-regionen koder for et abnormt immunoglobulin, er det I

I meget usandsynligt at denne lette kæde er del af et funktio- I

I 35 nelt antistofmolekyle mod hepatitis. Disse resultater viser I

vigtigheden af, at undersøge hybridomaceller for tilstedevæ-

I reisen af flere RNA-arter, der koder for V-regioner, hvoraf I

kun én er den ønskede sekvens. I

45 DK 175680 B1

Yderligere screening af CRL 8017-cDNA-biblioteker blev udført for at lede efter V|(-cDNA-kloner, som ikke er fra nogen af de to νκ-cDNA-klasser, der er fundet indtil nu (M0PC21-p6D4B, pV17). Først blev et oligo-dT-primet cDNA-bibliotek, der var 5 fremstillet ud fra CRL8017-RNA, screenet med en DNA-fragment-sonde specifik for kappa konstant regionen, og separat med sonder specifik for M0PC21- og pV17-V((-regioner. En cDNA-klon (P1E9L-81), som indeholder kappa konstant regionen, men har en anden V«region end den hos M0PC21 eller pV17, blev opdaget. Denne metode, at screene oligo-dT-primede cDNA-biblioteker, er et anvendeligt alternativ til oligonucleotid-screening af cDNA-biblioteker, forbi hak-translaterede sonder med høj specifik aktivitet anvendes. Denne metode muliggør også den simultane isolering af flere klasser af V-regi on-kl oner, såsom 15 alle V^-kloner, ved hjælp af passende sondevalg. Dernæst blev det UIG-JK2BGLII-pr i mede cDNA-bibliotek, der var fremstillet ud fra CRL 8017-RNA, screenet med UIG-5JK2-oligonucleotid-sonden (se fig. 7). Der blev fundet en ny klasse af Vj(-cDNA-kloner, hvis medlemmer er homologe til plE9L-81 og hybridise-20 rer til UIG-5JK2-sonden, men ikke til en MOPC21-VK-1sonde.

Restriktionsendonucleasested-kortene og nuc1eotidsekvenserne hos disse kloner er også forskellig fra MOPC21-homologe Vk_ -cDNA-kloner fra CRL80i7-celler. Disse kloner har imidlertid en aberrerende V-J-forbindelse, som resulterer i et ikke-25 funktionelt mRNA, og er tilsyneladende identisk til ét beskrevet af Cabilly og Riggs (Gene, 40:157 (1985)).

Det blev derfor konkluderet, at anti-hepatitis-B-cellelinien CRL8017 har mindst tre klasser af νχ-mRNA, der svarer til de 30 ovenfor beskrevne cDNA-kloner p604B (M0PC21), plE9l og pV17.

pIE9L- og pV17-klonerne hidrører fra mRNA fra aberrerende omdannede kappa-gener, mens p6D4B-klonen hidrører fra moderhy-bridoma fusionspartneren NS-1. Ingen af disse kloner ser ud til at kode for den ønskede lette kæde mod hepatitis.

3 5 (3) Fremstilling og ekspression af tung kæde, der indeholder human konstan/muse-vari able regioner.

V-regionsekvenserne i pMVHCa-13 blev knyttet til den humane IgGl-konstant-(C)-region-klon pGMH6. På grund af tilstedevæ-

I DK 175680 B1 I

I I

reisen af et andet BstEII-sted inden i IgGl CHl-regionen hos I

pGMH-6 var en flertrinsligering nødvendig. Først blev 220 nu- I

cleotid BstEII-fragmentet fra J-CHl-regionen hos pGMH-6 liger- I

et til 1100 nucleotid-IgG-regionen BstEII til BamHI fragmen- I

H 5 tet hos pGMH-6, I en separat ligering blev 420 nudeotid I

I BstEII til BamHI fragmentet hos pMVHCa-13, som omfatter muse- I

V-regionen, knyttet til en kalvetarmphosphatase-behandlet I

BamHI-plasmi dvektor. De to ligeringer blev derefter forenet, I

ligase blev tilsat og produkterne blev transformeret ind i I

I 10 HB101, hvilket resulterede i den kimære muse-V-human-C-klon I

I pMVHCc-2 4 (fig. 9A). I

V-regionen af det hybride tunge kæde-gen i pMVHCc-24 blev yder- I

ligere analyseret ved partiel sekvensanalyse. Denne analyse I

H viste at den klonede V-region indeholdt en D-sekvens, som mat- I

I chede en kendt D-sekvensr DSP2,2 {Kurosawa og Tonegawa, supra). I

Sekvensen forudsagde også et lederpeptid med 19 aminosyrer,

der ligner de kendte muse-V-tung-kæde-lederpeptidsekvenser, og I

en 5' ikke-1rans1 ateret region på mindst 3 nucleotider. I

I 2 0 I

BamHI-fragmentet, der indeholder de muse-humane hybride tunge

I kæde-gen af pMVHCc-24 blev klonet i BamHI-fordøjet pING2003E- I

H vektor, resulterende i ekspressionsplasmid pING2006E (fig. I

11)· pING2006E-plasmidet bør have en forøget sandsynlighed for I

effektiv ekspression af det kimsre muse-human-immunog1 obu 1 in- I

I 2 5 gen i B-lymfoideel ler på grund af tilstedeværelsen af muse-

H tung-kæde-fremmer-regionen. I

I En modificering af det kimære tunge kædé-gen til stede i I

I pHVHCc-24 blev udført for at tilvejebringe et alternativt I

I 30 tungt kæde-gen som mangler oligo-dC-regionen forudgående for M

I initiatoren ATG. pING2012E- og pING2006E-vektorerne er iden- I

I tiske på nær nucleotiderne umiddelbart før ATG, som vist i ι I

I fig. 12. I 1

35 Bakterier, der gemmer pING 2006E- og pSV2-neo-plasmiderne, I

I blev omdannet til protoplaster ved hjælp af fremgangsmåden be- I

I skrevet af R.M. Sandri-Goldin et al., Mol. Cell. Biol, 1 -.743 I

I (1981). Protop1 asterne blev derefter separat sammensmeltet til I

47 DK 175680 B1 SP2/0-Agl4-hybridomaceller (ATCC CRL 1581) ved behandling med polyethylenglycol (A. Ochi et al.. Nature, 302: 340, 1963). De sammensmeltede celler fik lov til at komme sig i 72 timer i fuldstændigt medium, før udspredning med 10.000 eller 50.000 5 celler pr. brønd i en vævskulturplade med 96 brønde. Cellerne blev udvalgt med G418 ved 0,8 mg/ml i to uger, hvorefter vækst j i i nogen brønde var ganske tydelig. Under disse udvælgelsesbe- ! tingelser blev Sp2/0-celler fuldstændigt dræbt i løbet af 4-7 dage af G418. Kun celler som havde integreret og udtrykt det i 10 vektorerne tilstedeværende neo-gen vil vokse under G418-udvæl-gelse. Antallet af brønde, der var positive for vækst ved . i disse integrative transfektanter, er vist i tabel 2. ! ! Tabel 2 *.

15 Stamme/ 10.000 50.000 plasmid celler/brønd celler/brønd MC1061/pING2006E 3 (13%) 12 (50%) MC1061/pSV2-neo 7 (29%) 4 (17%) 20 MC1061/ingen 0 0 * Procentandel af brønde, der viser positiv vækst ud af 24 brønde .

Celler transficeret med pING2006E og pSV2-neo blev undersøgt 2 5 for immunoglobulin-gen-ekspression ved RNA- og proteinni^ veauet. Samlet celle-RNA blev fremstillet ud fra transficerede celler, der var bundet til nitrocellulose og hybridiseret til hak-t rans 1aterede sonder, specifikke for det muse-humane hybride tunge kæde-gen. To kloner blev fundet som havde et 3 0 ! stærkt signal, hvilket repræsenterer ekspression af genet ved RNA-niveauet. Mængden af samlet cellulær-RNA hybridiseret til muse-human-sonden viste sig at være ca. 1/10 af niveauet af tung kæde-RNA i de oprindelige hybridomace11 er. Dette repræ- i senterer sandsynligvis ca. 1% af det samlede mRNA af den 3 5 transficerede celle.

De transficerede muse-celler blev også undersøgt for produktion af cytoplasmisk humant tung-kæde-protein ved hjælp af en

DK 175680 B1 I

ELISA-bestemmel se. Det viste sig at 3 ud af 7 pING2006E- H

transficerede cellelinier frembragte påviselige mængder af hu- H

mant tung-kæde-protein. Muse-celle-transformanten, der produ- H

cerede det meste muse-human-tung-kæde-protein, gav et signal i H

5 ELISA-bestemmelsen sammenlignelig til den af en 1/100-for- H

tynding af et humant B-cellelinieproducerende intakt humant I

immunoglobulin-lgGl. Denne beskedne mængde af påvist muse- H

human tung-kæde-protein kan skyldes flere faktorer, omfattende H

ustabilitet af tunge kæder i nærværelse af lette kæder i hy- H

10 bridomacller, eller ukorrekt fremstilling af det kimære gen- H

transcript. H

(4) Gen-forstærkning af det integrerede kimære gen. H

Southern-plet-analyse viste at flere kopier af pING2006E-DNA- H

15 H

sekvenserne var integreret dobbelt i muse-genoroet. Restrik-

tionsenzymer Apal og Bglll kløver begge pING2006E enkeltvis. I

transformanten, 2AE9, blev et bånd fra en Apal- eller Bglll- H

fordøjelse af den forventede størrelse (8,2 kb) fundet at hy- H

bridisere til de humane Ο-γ-1-sekvenser (resultater ikke H

?o vist). Et BamHI-bånd med den korrekte størrelse (1,6 kb) viste

sig at hybridisere til det humane såvel som til lE9-Vn-sek- H

venserne. Gen-kopititreringseksperiment (fig. 14) viste at der H

er ca. 5 kopier af pIHG20Q6E i 2AE9-genomet. Oen kendsgerning, H

at kun et enkelt bånd blev påvist i Apal- eller Bglll-banen I

2 5 H

viser, at disse individuelle kopier er i en dobbe1t-arrangeret

opstilling. Et sæt af dobbelt fordøjelser viser at pING2006E- H

sekvenser ikke undergik nogen omarrangering ved deres indfø- H

ring i muse-DNA (resultater ikke vist). H

3 0 Dernæst blev 2AE9-celler transf iceret med et plasmid, som in- H

deholder en anden udvælgelig markør, gpt-genet, og udvalgte H

kloner, der vokser ud i DMEM-HAT. Én klon, 2BH10, har ca. 38 I

ng opløseligt humant γ-1-protein pr. 106-celler. Southern- H

analyse viste at 2BH10 har ca. 30 kopier af pING2006E (fig. H

35 14). De blev forstærket fra de 5 kopier i 2AE9 uden omdannelse H

af DNA-sekvenserne. (Sammenlign 2AE9-feltet til 2BH10). SI- H

resultater (resultater ikke vist) viste at denne forøgelse i I

skabelon førte til en højere mængde IgG-gen-transcripter. Det H

49 DK 175680 B1 antages, at disse sekvenser blev co-forstærket med nærliggende cellulære sekvenser som et resultat af den anden udvælgelse.

Eksempel 3; Et kimært human-muse-anti stof med canceranti-genspecificitet.

(1) Antistof L6.

Monoklont L6-antistof (MAb) blev opnået ud fra en mus, som var blevet immuniseret med celler fra et human 1ungecarcinom, hvo-10 refter vildtceller blev hybridiseret med NS-l-myse-myeloma-celler. Antistoffet binder til et tidligere ikke identificeret carbohydratantigen, som udtrykkes i store mængder ved overfladen af celler fra de fleste humane carcinomaer, omfattende 1ungecarci nom (adeno, squamosus), brystcarcinorner, coloncarci-j 15 norner og ovariecarcinomer, mens antigenet kun er til stede i spormængder i normale celler fra den voksne vært. MAb L6 er en lgG2a og kan formidle antistofafhængig cellulær cytotoksici-tet, ADCC, i nærværelse af humane periferale blodleukocytter som en kilde for effektorce11 er, for at lyse L6-positive tu-20 morceller, og det kan lyse L6-positive tumorceller i nærværelse af human serum som en kilde for komplement, idet lysen påvises som frigivelsen af SlCr fra mærkede celler i løbet af en 4 timers inkubationsperiode. MAb L6 kan lokalisere L6-posi-tive tumorer, xenotransplanteret på nøgne mus, og det kan in-25 hibere udvæksten af sådanne tumorer. Mab L6 er beskrevet i

Cancer Res. 46:3917-3923, 1986 (angående MAb-specifi c itet) og i Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7059-7063, 1986 (angående MAb- funktion).

30 (2) Identifikation af J-sekvenser i immunoglobulin-mRNA af 16.

Frosne celler blev optøet på is i 10 minutter og derefter ved stuetemperatur. Suspensionen blev fortyndet med 15 ml PBS og cellerne blev centrifugeret ned. De blev gensuspenderet, efter 35 vask i PBS, i 16 ml 3M Lid, 6M urinstof og blev revet fra hinanden i en polytronklipper. Fremstillingen af mRNA og udvælgelsen af po1y(A+)-frakt ionen blev udført som beskrevet af C. Auffray og F. Rougeon, Eur. J. Biochem. 107:303, 1980.

I DK 175680 B1 I

50 I

Poly(A+)-RNA fra L6 blev hybridiseret -individuelt roed mærket I

jh1-' jH2-' jH3“ og JH4-oligonucleotider under betingelser be- I

skrevet af Nobrega et al., Anal. Biochem 131:141, 1983). Pro- I

dukterne blev derefter underkastet elektroforese i en 1,7% I

5 agarose-TBE-ge1. Gelen blev bundet i 10% TCA, suget tør og ud- I

sat for autoradiografi. Resultaterne viste at L6 Vh indeholder I

Jn2-sekvenser. I

For analysen af Vk-ibRNA blev "Dot-Blot*'-f rerogangsmåden bes- I

I 1Q krevet af White og Bancroft, J. Biol. Chem. 257:8569, (1982) I

anvendt. Poly(A+)-RNA blev immobi1 i seret på nitrocellulosefi 1- I

B tre og blev hybridiseret til mærket sonde-oligonucleotider ved I

B 40* i 4xSSC. Oisse eksperimenter viser at L6 indeholder I

B JK5-sekvenser. En svag hybridisering til Jk2 blev iagttaget. I

I (3) V-region-cONA-kloner, I

B Et bibliotek primet af oligo-(dT) på L6-poly(A+)-RNA blev I

B screenet for kappa-kloner med en muse-C«-regi on-sonde. Fra I

B L6-biblioteket blev flere kloner isoleret. En anden screening I

B 20 med en 5' J|(5-specifik sonde identificerede L6 (J|(5) lette I

B kæde-kloner. Tunge kæde-kloner af L6 blev isoleret ved screen- I

B ing med Jh2-o1igonucleotid. I

B Oe tunge og lette kæde-gener eller genfragmenter fra cDNA- I

B 25 klonerne, pH3-6a og pL3-12a, blev indsat i H13-bakterio- I

B fagvektorer for nucleotidsekvensanalyse. De fuldstændige nu- I

B cleotidsekvenser af den variable region hos disse kloner blev I

B bestemt (fig. 15 og 16) ved hjælp af dideoxykædeafslutningsme- I

B toden. Disse sekvenser forudsiger V-region-aminosyresammensæt- I

B 30 ninger, som stemmer godt overens med de observerede sammen- I

B sætninger, og forudsiger peptidsekvenser, som er blevet be- I

B kræftet af direkte aminosyrerækkefølgebestemmelse af dele af I

B V-regionerne. I

cDNA-klonernes nucleotidsekvenser viser at de er immunoglo- I

35.. I

bulin-V-region-kloner, da de indeholder aminosyrerester, der I

I viser V-områder (Kabat et al.. Sequences of Proteins of Immu- I

I nological Interest; U.S. Dept of HHS, 1983). I

51 DK 175680 B1 16 Vh hører til subgruppe II. cDNA forudsiger en N-endesekvens på 24 aminosyrerester, der er identisk til den hos en kendt Vh (45-165 CRI; Margolies et al., Mol. Immunol. 18:1065, 1981).

L6 Vtø har Jn2-sekvensen. L6 Vj_ er fra Vj(-KpnI-f ami 1 ien (Nishi 5 et al., Proc. Nat. Acd. Sci . USA 82:6399, 1985) og anvender J«5. Det klonede L6 V|_ forudsiger en aminosyresekvens, som blev bekræftet ved aminosyrerækkefølgebestemmel se af peptider fra L6's lette kæde, svarende til rester 18-40 og 80-96.

10 (4) Γη vitro mutagenese til at frembringe restriktionsenzym- steder i J-regionen til forening med et humant C-modul og til fjernelse af oli go(dC)sekvenser 5' til V-modulerne.

Begge kloner frembragt fra priming med oligo(dT) L6-Vk og L6-Vu behøver at blive modificeret. For L6 V*· blev J-region-mutagenese-primeren J)(HindIlI, som vist i fig. 17B, anvendt. Et humant C|<-roodul hidrørende fra en cONA-klon blev mutageniseret til at indeholde HindlII-sekvensen (se fig. 17A)

Mutagenesereakt i onen blev udført på M13-subkloner af disse gener. Frekvensen af rautante kloner lå i området fra 0,5 til 20 1% af de opnåede plaquer.

Det er tidligere blevet iagttaget at oli go(dT)-sekvensen opstrøms for AUG-codonet i et Vh kimært gen virker forstyrrende på den korrekte splejsning i en særlig genkonstruktion. Det 25 blev estimeret at ca. så mange som 70¾ af RNA-transcripterne havde undergået forkert splejsning, hvori en ukendt 3‘-splejseacceptor i ledersekvensen var anvendt. Derfor blev oligo(dC)-sekvensen opstrøms for initiatoren AUG fjernet i i alle klonerne.

30 I en fremgangsmåde blev et oligonucleotid anvendt som indeholder et Sall-restriktionssted for at mutagenisere 16 V|(-klonen.

Den anvendte primer for denne oligonucleotid-rettede mutagenese er en 22-mer, som introducerer et Sall-sted mellem 35 oligo(dC) og initiatoren met-codon (fig. 19).

I en anden fremgangsmåde blev nucleasen BAL-31 anvendt til at tygge oligo(dC) i L6 Vn-klonen pH3-6a væk. Størrelsen af dele-

I DK 175680 B1 I

I I

H tionen i de to mutanter, der blev opnået, blev bestemt ved I

H nucleotidrækkefølgebestemmelse og er vist i fig. 17. I begge I

af disse mutanter (04 og 621) blev hele oligo(dC) 5' for kod- I

ningsregionen deleteret. I

I 5 i

Disse kloner blev derefter modificeret ved hjælp af oligo- I

nucleotid-rettet mutagenese med MJH2-ApaI-primer (fig. 17). I

Denne primer med 31 baser introducerer et Apal-sted i muse-C^- I

genet ved en stilling, der er analog til et eksisterende I

Apal-sted i human-C-y-l-cDNA-gen-modul. Primeren indfører de I

passende codoner for human-C-y-l-genet, Det kimære tunge kæ- I

degen, fremstillet ved forening af det mutageniserede muse-Vn- I

gen-modul med et humant Cn-modul, koder således for et kimært I

protein, som ikke indeholder nogle humane aminosyrer for hele I

I 15 V^-regionen. I

Det humane C-y-l-gen-modul er et cDNA hidrørende fra GM2146 I

I celler (Human Genetic Mutant Cell Repository, Newark, New I

I Jersey). Dette C-y-1-gen-modul blev tidligere forenet med et I

I 20 muse-Vh-gen-modul til dannelse af det kimære ekspress ionspi as- I

mid pING2012E. I

(5) L6 kimære ekspressionsplasmider. I

L6 kimsre tunge kæde-ekspressionsplasmider blev afledt fra om- I

25 placeringen af Vn-modulet pING2012E med V^-moduler af mutanter I

I 621 og 64 til opnåelse af ekspressionspi asmiderne pING2111 og I

I PING2112 (fig. 17). Disse plasmider dirigerer syntesen af ki- I

I mære U6 tunge kæde, når transficeret ind i mammale celler. I

I 30 For det kimære L6 lette kæde-gen blev fragmentet Sall til I

Hindlll af muse-Vx-modulet forenet med det humane Οκ-modul ved I

I hjælp af fremgangsmåden beskrevet i fig. 18 til dannelse af I

pING2119. Erstatning af neo-sekvensen med E. coli-gpt-gen hid- I

I rørende fra pSV2-gpt resulterede i pING2120, som udtrykte ki- I

I 35 mære L6 lette kæde og giver mycophenolisk syremodstand, når I

I transficeret ind i mammale celler. I

I Inklusionen af både kimære tunge kædegener og kimære lette kæ- I

degener i det samme plasmid muliggør indføringen ind i trans- I

53 DK 175680 B1 ficerede celler i et 1:1-genforho1d mellem tunge og lette kædegener, hvilket fører til en balanceret gendosering. Dette kan forbedre ekspression og formindske manipulationer af transficerede celler til optimal kimær antistofekspression.

5 Til dette formål blev ONA-fragmenterne hidrørende fra de kimære tunge og lette kædegener af pING2111 og pING2119 forenet i ekspressionsplasmidet pING2114 (fig. 19). Dette ekspres-sionsplasmid indeholdt en udvælgelig neoR-markør og separate transcriptionsenheder for hvert kimært gen, hver indeholdende 10 en muse-tung-kædefremmer.

Modifikationerne og V-C-forbindelsesregionerne hos de kimære L6-gener er opsummeret i fig. 20.

(6) Stabil transfektion af muse lymfoide celler til produk- 15 tionen af kiraært antistof.

Elektroporation blev anvendt (Potter et al., supra; Toneguzzo et al., Mol. Cell Biol., 6: 703, 1986) for inføringen af L6 kimært ekspressionsp1 asmid-DNA i muse-Sp2/0-celler. Elek-20 troporationsteknikken gav en trasfektionsfrekvens på 1-10 x 10“5 for Sp2/0-cellerne.

To-gen ekspressionsplasmidet pING2114 blev lineariseret ved fordøjelse med Aat 11-restriktionsendonuc 1 ease og transficeret 25 ind i Sp2/0-celler til opnåelse af ca. 50 G418-modstands- dygtige kloner, som blev screenet for syntese af human tung og let kæde.

Niveauerne for syntese af kimær antistof kæde fra de to fremstillere, D7 og 3E3, er vist i tabel 3. Kimær-L6-antistof blev 30 fremstillet ved at dyrke D7-transfektantcellerne i 24 timer ved 2x10® celler pr. ml i 5 liter DMEM, suppleret med HEPES-puffer og penicillin og streptomycin. Supernatanten blev koncentreret over en Amicon YM30-membran i 10mM natriumphosphat- puffer, pH-værdi 8,0. Det fremstillede blev hældt på en DEAE-35 cellulosesøjle, som adskilte immunoglobu1 i net i ubundne og bundne fraktioner. Prøver fra OEAE-ubundet, DEAE-bundet og præ-DEAE præparat (fremstillet fra 1,6 μΐ medium) blev separat

I DK 175680 B1 I

I I

oprenset ved affinitetskromatografi på en I

protein-A "Sepharose"-søj1e, idet der blev elueret med Ο,ΙΜ I

natriumcitrat, pH-værdi 3,5. Det eluerede antistof blev neu- I

traliseret og koncentreret ved Amicon-centricon-filtrering i I

5 phosphatpufret saltopløsning. Udbytterne for de tre præparater I

var 12 ug {DEAE-ubundet), 6 pg (DEAE-bundet) og 9 ug I

I (præ-OEAE-søjle). Western-analyse af anti stofkæderne viste at I

de var forenet i H2l2“tetramer^ igne'nde naturlige I

immunoglobuli ner.

I 10 I

H (7) En anden oprensning for kimært L6-antistof secerneret i I

vævskultur. I

I a. Sp2/0.pING2114.D7-cel ler blev dyrket i kulturmedium (DMEM I

(Gibco nr. 320-1955)), suppleret med 10% føtal bovinserum I

I 15 (Hyclone nr. A-llll-D), lOmM HEPES, lxglutamin-Pen-Strep I

I (Irvine Scientific nr. 9316) til 1 x 106 celle/ml. I

b. Cellerne blev derefter centrifugeret ved 400 x g og gensu- I

I j spenderet i serumfri kulturmedium ved 2 x 106 celle/ml i 18-24

Hi 20 timer. I

H c. Mediet blev centrifugeret ved 4000 o/min. i en JS-4,2 ro- I

H tor (3000 x g) i 15 minutter. I

H d. 1,6 liter supernatant blev derefter filtreret gennem et I

H 25 I

0,45 mikron filter og derefter koncentreret over et YM30

H (Amicon Corp.) filter til 25 ml. I

H e. Ledeevnen af den koncentrerede supernatant blev indstillet I

I til 5,7-5,6 mS/cm og pH-værdien indstillet til 8,0. I

I I

I f. Supernatanten blev centrifugeret ved 2000 x g, 5 minutter,

og derefter hældt på en 40 ml DEAE-søjle, der var ækvilibreret I

I i forvejen med lOmM natriumphosphat, pH-værdi 8,0. I

I g. Den gennemstrømmede fraktion blev opsamlet og hældt på en I

35 I

Α-''Sepharose" (Sigma) søjle med 1 ml protein, der var ækvili- I breret i forvejen med 10 mM natriumphosphat, pH-værdi 8,0.

I h. Søjlen blev først vasket med 6 ml lOmM natriumphosphat- I

I puffer, pH-værdi 8,0, efterfulgt af 8 ml 0,1M natriumcitrat, I

55 DK 175680 B1 pH-værdi 3,S, derefter med 6 ml 0,lM citronsyre (pH-værdi 2,2). Fraktioner på 0,5 ml blev opsamlet i ror, der indeholdt 50 μΐ 2M tris base (Sigma).

5 i. Størstedelen af IgG var i elueringen med pH-værdi 3,5 og blev forenet og koncentreret over Centricon 30 (Amicon Corp.) til ca. 0,06 ml.

j. Pufferen blev ændret til PBS (lOmM natriumphosphat, pH-værdi 7,4, 0,15M NaCl) i Centricon 30 ved gentagen fortynding 10 med PBS og genkoncentrering.

k. IgG-op1øsni ngen blev derefter indstillet til 0,10 ml og bovint serum albumin (fraktion V, U.S. Biochemicals) blev sat til 1,0% som et stabiliseringsreagens.

15 (8) Produktion og oprensning af kimært L6-antistof secerneret i ascitesvæske.

a. Ascitesvæske blev først centrifugeret ved 2.000 x g i 10 minutter.

20 b. Ledeevnen af supernatanten blev indstillet til 5,7-5,6 mS/cm og dens pH-værdi indstillet til 8,0.

c. Supernatanten blev derefter hældt på en 40 ml DEAE-25 cellulosesøjle, der var ækvilibreret i forvejen" med lOmM

Na2P04H, pH-værdi 8,0.

d. Det gennemstrømmede fra DEAE-søjlen blev opsamlet og dets pH-værdi blev indstillet til 7,4 og derefter hældt på en ,,Sepharose,,-søj le med 1,0 ml gede-anti-human-IgG (H + L).

30 e. Søjlen blev først vasket med 6 ml lOmM nat r i umphosphat, 0,5M natri umchlor id, efterfulgt af 8 ml 0,5M NH4OH og 3M natriumthiocyanat.

35 f. Natriumthiocyanateluatet blev forenet og dialyseret mod 2 1 PBS natten over.

Antistoffet kan yderligere koncentreres ved trinnene j. og k. i den forudgående fremgangsmåde.

I DK 175680 B1 I

I I

Tabel 3. I

Niveauer af secerneret kimære-L6-kæder fra Sp2/0-transfektan- I

I

5 Sp2/O.D7 Sp2/0.3E3 I

Dyrkningsbetingelser FBS kappab yc kappab yC I

1. 20 ml, 2d, I

podet® 2xl05/ml + 17 77 100 700 I

102. 200 ml, 2d, I

I podetø 2,5xl05/ml + 0,9 6 80 215 I

3. 200 ml , Id, I

I podete 2x10®/ml - 1,9 3,6 97 221 I

4. Balb/c ascites - 5.160 19.170 NO NO I

i I

a - Sp2/0-celler transficeret ved elektroporation med I

I pING2114(pL6HL) . I

I b - pg/l målt ved ELISA specifikt for human-kappa-human I

Bence-Jones-proteinstandard. I

I

H c - pg/l målt ved ELISA specifikt for human-y-human-IgG- I

standard. I

I NO - Ikke bestemt. I

I FBS: Føtal bovinserum. I

I (9) Undersøgelser foretaget af det kimære L6-antistof. I

I Først blev prøverne undersøgt med et bindingsforsøg, hvori I

30 celler fra både en L6 antigenpositiv og en L6 antigennegativ I

I cellelinie blev inkuberet med standard-muse-monoklonantistof I

I L6, kimært L6-antistof hidrørende fra cel 1ekultur-superna- I

tanterne og kimært L6-antistof hidrørende fra ascites (som I

tidligere beskrevet) efterfulgt af et andet reagens, fluor-

I 25 escein-isothiocyanat-konjugeret gede-antistoffer (FITC) over I

I for humant (eller mus for standarden) immunoglobulin. I

I Da bindingsforsøget viste stærkt reaktivitet hos det kimære L6 I

I med den L6 antigenpositive cellelinie og total mangel på reak- I

i DK 175680 B1 tivitet med den negative cellelinie var det næste trin at undersøge for det kimære L6*s evne til at inhibere bindingen mellem muse-16 og antigenpositive celler, sådanne inhiberings-undersøgelser, anvendes rutinemæssigt til at etablere identi-5 teten af to antistoffers genkendelse af antigen. Oisse resultater er diskuteret nedenfor (inhibering af binding). Som del af disse undersøgelser blev der foretaget et groft estimat af antistof ivrighed (aviditet).

jg Endelig blev to aspekter af antistoffunktion undersøgt, nemlig evnen til at formidle ADCC i nærværelse af humane periferale blodleukocytter og evnen til at dræbe U6-positive tumorceller i nærværelse af human serum som en kilde for komplement (se "funktionelle forsøg" nedenfor).

15

Bindingsforsøg. Celler fra en human coloncarcinomalinie, 3347, som tidligere er blevet vist at udtrykke ca. 5 x 105 molekyler L6-antigen ved celleoverfladen, blev anvendt som mål. Celler fra T-cellelinien HSB2 blev anvendt som en negativ kontrol, da de i overensstemmelse med tidligere undersøgelser ikke ud- o o trykker påviselige mængder af L6-antigenet. Målcellerne blev først inkuberet i 30 minutter ved 4eC med enten det kimære L6 eller med muse-L6-standard, som var blevet oprenset fra muse-ase i tes. Dette blev efterfulgt af inkubering med et andet FITC-mærket reagens, som for det kimære antistof var gede-25 anti-human-immunoglobulin, opnået fra TAGO (Burlingame, CA) og anvendt i en fortynding på 1:50. For muse-standarden var det gede-anti-mus-immunoglobu1 in, også opnået fra TAGO og anvendt i en fortynding på 1:50. Anti stofbi nding til celleoverfladen blev bestemt under anvendelse af en Coulter Model EPIC-C- 30 cellesorterer.

Som vist i tabel 4 og 4A bandt både det kimære L6 og musestandard 16 signifikant og ca. i den samme udstrækning til den L6-positive 3347-linie. De bandt ikke over baggrundsstøj til 35 den L6-negative HSB2-linie.

På baggrund af den kendsgerning, at de tre forskellige kimære L6-prøver anført i tabel 4 opførte sig ensartet i bindingsfor-

I DK 175680 B1 I

I I

søgene, blev de forenet til inhiberingsundersøgelserne anført I

nedenfor. De samme inhiberingsundersøgelser blev udført for I

kimær L6 hidrørende fra ascitesvæske anført i tabel 4A. I

c Bindingsinhibering. I

Η H

I Som det næste trin blev den udstrækning, til hvilken trindelte I

doser af det kimære L6-antistof eller standard-muse-L6 kunne I

inhibere binding af en FITC-mærket muse-L6 til overfladen af I

antigenpositive 3347-coloncarcinomceller. I

I 10 I

Både det kimære L6- og muse-standard-L6 inhiberer bindingen af I

det direkte mærkede L6-antistof, idet bindingskurverne er I

parallelle. Det kimære antistof var en smule mindre effektivt I

I end standarden, som indikeret af resultaterne, som viste at 3,4 I

15 pg/ml af det forenede kimære L6 MAb, sammenlignet med 2,0 I

pg/ml af standard-muse-L6 MAb, var nødvendigt for 50% bin- I

dingsinhibering, og at 5,5 pg/ml af det kimære L6 (hidrørende I

fra ascites) sammenlignet med 2,7 pg/ml af standard-muse-6 MAb I

var nødvendigt for 50% bindingsinhibering.

I 20 I

Som en del af disse undersøgelser blev et groft estimat fore- I

I taget af antistof ivrighed. Standard-muse-16-ivrighed var tid- I

ligere blevet bestemt til ca. 4 x 10®. Resultaterne viste at I

der ikke var nogen signifikante forskelle i ivrighed mellem I

H 25 det kimære L6 og muse-L6. I

Funktionsforsøg. I

I Der blev foretaget en sammenligning mellem de kimære L6's og I

I standard-muse-L6's evner til at lyse L6-antigenpositive celler I

I 30 i nærværelse af humane periferale blodleukocytter som en kilde I

I for effektorceller (formidlende antistofafhængig cellulær cy- I

I totoksicitet, ADCC) eller humanserum som kilde for komplement I

I (formidlende komplementafhængig cytolyse, CDC). I

Som vist i tabel 5 og tabellerne 5A-5D var det kimære L6 over- I

I legent over for den samtidige undersøgte prøve af muse-16

I m.h.t. at forårsage ADCC, som målt ved et 4 timers 51cr-frigi- I

velsesforsøg.

59 DK 175680 B1 1 tabellerne 6 og 6A-6B anføres resultaterne fra undersøgelser på komplementformidlet må 1ce11 elysis. I dette tilfælde blev en høj cytolytisk virkning observeret både med muse-L6-antistof-ferne og de kimære L6-antistoffer.

5

Konklusioner.

De ovenfor anførte resultater viser et antal vigtige, uventede kvaliteter ved det kimære monoklone L6-antistof ifølge opfindelsen. For det første binder det kimære L6-antistof til L6-antigenpositive tumorceller i ca. den samme udstrækning som muse-LB-standarden og med ca. den samme aviditet. Dette er signifikant af de følgende grunde: L6-antistoffet fastlægger (a) et overf 1adecarbohydratantigen, og (b) et proteinantigen med ca. 20.000 dalton, hvoraf hver er karakteristisk for ingen-lille 1 5 cell elungecarcinorner (NSCLC) og visse andre humane carcinomer. L6-antistof fet binder ikke signifikant påviseligt til normale celler, såsom fi brobi aster, endotheliale celler eller epithe-liale celler i de større organer. Således bestemmer det kimære monoklone L6-antistof et antigen, som er specifikt for carci- 20 nomceller og ikke normale celler.

Ud over evnen hos de kimære monoklone L6-anti stoffer ifølge opfindelsen til at binde specifikt til ondartede celler og lokalisere tumorer, udviser det kimære-L6 indgående biologiske 25 virkninger med hensyn til at binde til dets mål, hvilket gør det kimære antistof til en hovedkandidat for tumorimmunotera-pi. Resultaterne anført heri viser, at kimært L6 er i stand til at binde til tumorceller og ved binding dræbe tumorcellerne, enten ved ADCC eller CDC. Sådan tumor-drabs-virkning 30 blev vist under anvendelse af koncentrationer af kimært 16-antistof så lave som 0,01 pg/ml (10 ng/ml).

i

Selv om udsigten til at forsøge tumorterapi under anvendelse af monoklone antistoffer er attraktivt, idet nogle delvise tu-35 mortilbageslag er blevet rapporteret, har sådan monoklon- antistofterapi til dato været mødt med begrænset succes (Houghton, februar 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1242-1246).

Oen terapeutiske effektivitet af monoklone museantistoffer

I DK 175680 B1 I

I I

H {som er de, som er blevet forsøgt indtil nu) ser ud til at I

være for lav for de fleste praktiske formål. Opdagelsen af den I

indgående biologiske aktivitet af kimært L6 koblet med dets I

spcificitet for et carcinomantigen gør det kimære L6-antistof I

H 5 til et terapeutisk middel, der kan vælges til behandling af I

tumorer in vivo. På grund af de "humane” egenskaber som vil I

gøre de kimære monoklone L6-antistoffer mere resistente over I

H for clearance in vivo vil de kimære monoklone L6-antistoffer I

desuden fordelagtigt anvendes ikke kun til terapi med umodifi- I

10 cerede kimære antistoffer, men også til udvikling af forskel- I

H lige immunokonjugater sammen med lægemidler, toxiner, immuno- I

modulatorer, isotoper osv., såvel som for diagnostiske formål, I

såsom in vivo afbildning af tumorer under anvendelse af pas- I

sende mærkede kimære L6-antistoffer. Sådan immunokonjugations- I

H 15 teknik er kendt for fagmanden indenfor området og kan anvendes I

til at modificere de kimære L6-antistofmolekyler ifølge den I

foreliggende opfindelse. I

To illustrerende cellelinier der udskiller kimært L6-antistof I

20 blev deponeret før denne ansøgnings indleveringsdag hos ATCC, I

I Rockville Maryland. Disse er transficeret hybridoma-C255 I

(svarende til 3E3-celler, supra), ATCC HB 9240 og transfice- I

I ret hybridoma C256 (C7-celler, supra), ATCC HB 9241. Se bilag I

I 1 og 2. I

25 I

(10) Ekspression i gær af L6-kæder. I

I Genetiske sekvenskodninger for kimært L6-antisofts tunge og I

lette kæder blev fremstillet og indført i vektorer. Gærceller I

blev transformeret dermed, og ekspression af separate tunge og I

I 30 lette antistofkæder for 16-antistof blev påvist. I

Den foreliggende opfindelse er ikke ment som værende begrænset I

I i omfang med de deponerede cellelinier, da den deponerede ud- I

I førelsesform er ment som en enkelt illustration af et aspekt I

I 3 5 a* opfindelsen og alle cellelinier som er funktionelt ækviva- I

I lente er inden for opfindelsens omfang. I virkeligheden ads- I

I killige modifikationer af opfindelsen ud over de, som er vist I

inden for området fra den foregående beskrivelse og tilhørende I

^1 I

I 1 I

61 DK 175680 B1 tegninger. Sådanne modifikationer er ment at falde inden for de vedføjede kravs omfang.

Tabel 4.

Bindingsforsøg med kimært LB-antistof og . monoklont L6-rause-antistof til en L6-antigenpositiv cellelinie og L6-antigen-negativ cellelinie.

Bindingsforhold for1 10 H3347-celler (L6+).

Antistof Portion GAH GAH

Standard L6 56,6 4,2

Kimært L6 a 1,3 110,3 15 b 1,3 110,3 c 1,3 110,3

Bindingsforhold for1 HSB-2-celler (L6-) 20

I GAM GAH

Standard L6 1,1 1,1

Kimært L6 a 1,0 1,0 b 1,0 1,1 25 c 1,0 1,1

Alle forsøg blev udført under anvendelse af en antistofkoncentration på 10 pg/ml. Bindingsforholdet er det antal af gange klarere end prøve er end en kontrolprøve behandlet med 30 GAM (FITC-konjugeret gede-anti-mus) eller GAH (FITC konjugeret gede-anti-human) alene. Et forhold på 1 betyder at prøven er lige så klar som kontrollen, et forhold på 2 mener at prøven er to gange så klar som kontrollen osv..

35 Tabel 4A.

B i ndi ngsforsøg med kimært L6-antistof og monoklont museanti- stof til en L6-antigenpositiv cellelinie og en L6-antigen-negativ cellelinie.

I DK 175680 B1 I

I, I

I

i

Antistofkon- Bindingsforhold for* I

Antistof centration H3347-celler (L6+) I

(Mg(ml) GAM GAH I

. Standard L6 30 38 4 I

'I

10 49 4 I

I 340 3 I I

Kimært L6 30 2 108 ( I

(ascites) 10 2 108 I

i 1 42 I

Kimært L6 30 1 105 I

I (cellekultur) 10 1 86 I

I 3 1 44 I

Bindingsforhold for** I

15 HSB-2-celler (L6-) I

I GAH GAH I

I Standard L6 10 11 I

I Kimært L6 10 1 1 I

H 20 (ascites) I

I Kimært L6 10 l 1 I

(cellekultur) I

H

* Bindinsforholdet er det antal gange klarere en prøve er end I

en kontrolprøve behandlet med GAM (FITC-konjugeret gede-anti- I

human) alene. Et forhold på 1 betyder at prøven er lige så I

klar som kontrollen, et forhold mener at prøven er to gange så : I

I klar som kontrollen osv.. I

Tabel 5. I

so I

ADCC af kimære L6 (mus) og standard L6-antistoffer på colon- I

carcinomcellelinie 3347. I

Antistofkon- PBL pr. % I

35 Antistof centraktion målcelle cytolysis* I

(pg/ml) I

I Kimært L6 10 100 64 I

I 5 100 70 I

63 DK 175680 B1 10 0 2

Standard L6 10 100 24 5 100 17 10 0 2 5 Ingen 0 100 1 * Målcellerne er blevet mærket med 51cr og blev i 4 timer udsat for en kombination af MAb og humane periferale blodleuko-cytter (PBL), og frigivelsen af 51ςΡ blev derefter målt. Fri- 10 giveisen af 51Cr (efter korrektion for værdier for spontan frigivelse fra ubehandlede celler) er et mål for procentandelen af cytolyse.

Tabel 5A.

15 ADCC af kimære L6 og standard (muse) L6-antistoffer på colon-carcinomcellelinie 3347.

Antistofkon- PBL pr. %

Antistof centration målcelle cytolysis1 20 (pg/ml)

Kimært L6 20 100 80 (ascites) 10 100 74 5 100 71 2.5 100 71 2 5 20 0 0

Kimært L6 10 100 84 (cellekultur) 5 100 74 2.5 100 67 10 0 3 i' Standard L6 20 100 32 10 100 26 20 0 0 Målcellerne var blevet mærket med Slør og blev i 4 timer 35 udsat for en kombination af MAb og humane periferale blodleu- kocytter (PBL), og frigivelsen af 51Cr blev derefter målt. Frigivelsen af SlCr (efter korrektioner for værdier for spontan frigivelse fra ubehandlede celler) er et mål for andelen af cytolyse.

I DK 175680 B1 I

Tabel 5B. I

ADCC af kimære L6 og standard (muse) L6-anti stof fer på colon- I

carcinomcellelinie 3347. I

5 Antistofkon- PBL pr. % I

Antistof centration målcelle cytolysis* I

(ug/mi) I

Kimært L6 5 100 84 I

10 (ascites) 2,5 100 78 I

1,25 100 85 I

0,63 100 81 I

0,31 100 80 I

0,16 100 71 I

15 0,08 100 65 I

5 0 0 I

Standard L6 5 100 32 I

5 0 0 I

Ingen 0 100 19 I

* Målcellerne var blevet mærket med 51Cr og blev i 4 timer I

udsat for en kombination af MAb og humane periferale blodleu- I

kocytter (PBL), og frigivelsen af 5lcr blev derefter målt. I

Frigivelsen af 5iCr (efter korrektioner for værdier for spont- I

2g an frigivelse fra ubehandlede celler) er et mål for andelen af I

cytolyse. I

Tabel 5C. I

ADCC af kimære L6 og standard (muse) L6-antistoffer på lunge- I

30 carcinomcelleiinie H2669. I

Antistofkon- PBL pr. % I

Antistof centration målcelle cytolysis* I

(ug/ml) I

35 Kimært L6 10 100 35 I

(ascites) 1 100 31 I

0,1 100 27 I

0,01 100 15 I

65 DK 175680 B1 0,001 100 13 0,0001 0 15

Standard L6 10 100 9 1 100 15 5 Ingen 0 100 9

Kimært 16 10 10 19 (ascites) 1 10 15 0,1 10 11 0,01 10 13 10 0,001 10 22 0,0001 10 11

Standard L6 10 10 7 1 10 6

Ingen 0 10 8 15 Kimært L6 10 04 | (asci tes)

Standard L6 10 09 * Målcellerne var blevet mærket med 51cr og blev i 4 timer udsat for en kombination af MAb og humane periferale blodleu-kocytter (PBL), og frigivelsen af 51Cr blev derefter målt. Frigivelsen af SlCr (efter korrektioner for værdier for spontan frigivelse fra ubehandlede celler) er et mål for andelen af cytolyse.

25 Tabel 5D.

ADCC af kimært L6 og standard (muse) L6-antistoffer på colon-carcinomcellelinie H3347.

Antistofkon- PBL pr. %

Antistof centration målcelle cytolysis* (pg/ml)

Kimært L6 10 100 62 (ascites) 1 100 06 0,1 100 69 0,01 100 26 0,001 100 8 0,0001 0 3

I DK 175680 B1 ; I

I I

10 o o I

Standard L6 10 100 19 I

Η 1 100 24 I

I o o I

5 Ingen 0 100 8 I

* Målcellerne var blevet mærket med 5*Cr og blev i 4 timer I

udsat for en kombination af MAb og humane periferale blodleu- I

kocytter (PBL), og frigivelsen af 51Cr (efter korrektioner for I

^1 10 værdier for spontan frigivelse fra ubehandlede celler) er et I

mål for andelen af cytolyse. I

Tabel 6. I

Komplementafhængig cytotoksisk effekt af kimært og standard I

15 (muse) L6 på coloncarcinomceller fra linie 3347, som målt ved I

et 4 timers ®1C*—frigivelsesforsøg. Humanserum fra en sund I

frivillig forsøgsperson blev anvendt soro komplementkilde. I

Antistof Human-komplement % cytolysis I

20 L6-standard 10 pg/ml ja 90 I

L6-kimært 10 pg/ml ja 89 I

I L6-standard 10 pg/ml nej 0 I

L6-kimært 10 pg/ml nej 1 I

25 Tabel 6A. I

Komplementafhængig cytotoksisk effekt af kimært L6 og standard I

I (muse) L6-antistoffer på coloncarcinomcellelinie 3347. I

I Antistofkon- PBL pr. % I

I 30 Antistof centration målcelle cytolysis* I

I (pg/ml) I

I Kimært L6 20 +29 I

I (ascites) 10 + 23 I

I 35 5 + 18 I

I 2,5 I

I 20 inaktiveret 0 I

I 10 o o I

67 DK 175680 B1

Kimært L6 20 + 29 (cellekultur) 5 + 26 2, S + 18 20 + 4 5 10 0 4

Standard L6 20 + 55 10 + 37 20 inaktiveret 0 20 0 1 10 Ingen 0 + 0 * Komplementformidlet cytolyse blev målt ved et 4 timers 5*Cr-frigivelsesforsøg. Humanserum fra en sund forsøgsperson blev anvendt som koroplementkilde.

15 Tabel 6B.

Komplementafhængig cytotoksisk effekt af kimært L6 og standard (muse) L6-antistoffer på coloncarcinomcellelinie 3347.

Antistofkon- PBl pr. % 20

Antistof centration målcelle cytolysis* (wg/mi)

Kimært L6 10 + 209 (ascites) 5 ♦ 155 25 2,5 ♦ 166 1.25 + 114 i 0,6 + 63 0,3 + 17 10 0 0

Standard L6 10 + 96 5 ♦ 83 2,5 + 48 1.25 + 18 0,6 + 7 35 0,3 + 4 10 ' 0 2 I ngen . 0 + 0

I DK 175680 B1 I

* Komplementformidlet cytolyse blev målt ved et 4 timers ^ I

51Cr-frigivelsesforsøg. Humanserum fra en sund forsøgsperson I

blev anvendt som komp1ementkiIde. I

5 Eksempel 4: Et humant kimært museantistof med specificitet I

for humant B-celleanti gen . I

Monoklont 2H7-muse-antistof (γ 2bK) genkender et humant B- I

celleoverfladeantigen, Bp35 (E.A. Clark et al., Proc. Nat. : I

Acad. Sci. USA, 82:1766 (1985)). Bp35-mo1eky1et spiller en il

ίο I

rolle i B-cel leaktivering. mRNA blev fremstillet ud fra 1 I

2H7-cellelinien. To cDNA-bib1 ioteker blev fremstillet - én un- , | der anvendelse af UIG-H-primeren med tung kede og den anden | oligo(dT). En Vn-klon, pH2-ll, blev isoleret efter screening |

med det samme UIG-H-oligonucleotid. For at isolere klonen med I

15 : I

let kæde, blev et muse-kappa-specifikt DNA-fragment anvendt I

til at screene oligo(dT)-biblioteket. Kandidatkloner blev I

yderligere screenet roed en muse-J«5-sekvens. En Vj(-klon, I

pL2-12, blev således isoleret. Den lette kæde UIG-K blev an- I

vendt til at fremstille et restriktionsenzymsted i J-regionen. I

20 I

Oe to cDNA-kloner blev også modificeret ved 5'-enden til fjer- I

nelse af den kunstige oligod[C]-sekvens. I pH2-ll blev dette I

udført under anvendelse af restriktionsenzymet Ncol, som skær- I

er en nucleotidrest 5' af ATG-initiatorcodonet. I pL2-12 blev I

25 dette opnået ved hjælp af et oligonucleotid in vitro mutagen- I

ese under anvendelse af en 22-mer der indeholder et Sall-sted. I

DNA-sekvenserne af disse to kloner er vist i fig. 21, 22. For I

at konstruere det kimære tunge kæde-plasmid blev Vn-modulet I

30 knyttet til det humane C-y-l-modul (pGMH6) ved Jh BstEII- I

stedet, og det kimsre lette kæde νκ-modul blev knyttet til det I

humane Οκ-modul (pGML60) ved Jk Hi ndiII-stedet. Ekspressions- I

vektorsekvenserne blev afledt fra pING2012-neo såvel som I

pING2016-gpt. De konstruerede plasmider er pING2101 (VnC-γ-Ι- I

35 neo), plNG2106 (νκθκ-neo), pING2107 (νκθκ-gpt). pING2101 og I

PING2106 blev også anvendt til at fremstille plasmider, der I

indeholdt begge gener. De er pHL2-ll og pHL2-26. Derudover I

blev pING2106 og pING2014 forenet til et plasmid med to lette I

DK 175680 B1 I

kæder, pLL2-25, for at kompensere for den ringere (sammenlig- H

net til tung kæde) ligevægtsakkumulering af let kæde-protein i H

transf icerede celler. {Se fig. 23). Fig. 24 viser ændringerne, I

der er foretaget med de variable regionsekvenser under opbyg- I

5 ningen. I

Plasmidet, pHL2-ll, blev lineariseret med Aatll, og DNA * et I

blev anvendt til at transficere Sp2/0-celler ved H

elektroporation. Transformanter blev udvalgt i G418-0MEM. £n I

10 transformant, 1C9, frembragte 9,3 ng/ml kimært kappa og 33-72 I

ng/ml kimært γ-1-protein som bestemt ved ELISA. Southern- analyse af 1C9-DNA viste at der kun er én kopi af plasmidet integreret i Sp2/0-genom.

15

Claims (24)

1. Vektor omfattende en cDNA-sekvens, der koder for den fuldstændige, variable I 5 region af en immunoglobulinkæde, hvilken kæde omfatter en fuldstændig V-J- I forbindelse i tilfælde af en let kæde, og en fuldstændig V-D-J-forbindelse i tilfælde af I H en tung kæde, hvilken vektor mangler enhver konstant region eller hvilke som helst in* I tron-sekvenser. I H 10

2. DNA-ffagment omfattende en cDNA-sekvens, der koder for den fuldstændige I H konstante IgGl-region for en human tung kædes immunoglobulinkæde, hvilket frag- I H ment mangler en hvilken som helst variabel region og den konstante region mangler I H hvilke som helst in tron-sekvenser. I

3. Vektor omfattende en kontinuert kodningssekvens, uafbrudt af introns, omfatten- I I de: I i) en DNA-sekvens, der koder for den variable region af en ikke-human immunoglobu- I lin-kæde omfattende en V-J-forbindelse i tilfælde af en let kæde og en V-D-J- I forbindelse i tilfælde af en tung kæde; I 20 ii) en DNA-sekvens, der koder for den konstante region af en human immunoglobulin- I kæde. I

4. Vektor ifølge krav 1 eller 3, som er et plasmid. I I 25

5. Bakterie, der er transformeret med vektoren eller fragmentet ifølge kravene 1, 2, I I 3 eller 4. I

6. Pattedyrscelle eller gær, der er transficeret med vektoren eller fragmentet ifølge I I kravene 1,2,3 eller 4. I I 30 I DK 175680 B1

7. Polynukleotidmolekyle, der omfatter en konsensussekvens for J-regionen af den tunge kæde af et immunoglobulin-rnolekyle, hvori konsensus-sekvensen udviser mindst 80% sekvens-homologi til kendte J-region-sekvenser uden at være identiske.

8. Molekyle ifølge krav 7, hvori sekvensen er for en human tung kædes J-region.

9. Molekyle ifølge krav 7, hvori sekvensen er for en tung musekædes J-region.

110. Polynukleotidmolekyle omfattende en konsensussekvens for J-regionen af en let 10 kæde af et immunoglobulinmolekyle, hvori konsensussekvensen udviser mindst 80% sekvenshomologi til kendte J-regionsekvenser uden at være identiske.

10 JK2BGLI1- CCCTGGTTCGACCTCTAGATT 5JK2- GTGCAAGCCTCCCCCCTGG SJK4- GCAAGCCGAGCCCCTGT 15 JKABGLIt 6CCCCTGTTTCAACCTCT AGATT 5JK5 GCAAGCCACGACCCTGG WJK T6GTTCGACCTTT ATTTTG 20

11. Molekyle ifølge krav 10, hvori sekvensen er for et human Kappa-J-region.

12. Molekyle ifølge krav 10, hvori sekvensen er for en muse-Kappa-J-region.

13. Molekyle ifølge krav 10, hvori sekvensen er for en muse-Lambda-J-region.

14. Fremgangsmåde til direkte fremstilling af en gensekvens, der koder for en kimær 20 immunoglobulinkæde med en konstant human region og en variabel ikke-human region af enhver ønsket specificitet, hvilken fremgangsmåde omfatter: a) tilvejebringelse af en cDNA-sekvens, der koder for en fuldstændig ikke-human variabel region omfattende en fuldstændig V-J-forbindelse i tilfælde af en let kæde og en fuldstændig V-D-J-forbindelse i tilfælde af en tung kæde, og som mangler hvilke som 25 helst konstante regionsekvenser; b) tilvejebringelse af en vektor indeholdende en gensekvens, der koder for den konstante region; c) operativ binding af sekvensen a) til vektoren b).

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, hvori trin (c) omfatter operativ binding af cDNA- sekvensen til sekvensen af trin (c) i et plasmid. DK 175680 B1 I I 72 I

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, som yderligere omfatter transformation af I H plasmidet i en vært, der er i stand til at udtrykke plasmidet. I

17. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 14-16, hvori kæden er en tung kæde. I

18. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 14-16, hvori kæden er en let kæde. I

19. Fremgangsmåde ifølge krav 14, hvori trin a) omfatter: I 10 a') tilvejebringelse af mRNA, der koder for den variable region ffa en celle, der secer- I nerer monoklonale antistoffer af den ønskede specificitet og I a") priming af dannelsen, ved revers transkription under anvendelse af dette mRNA I som en skabelon, af cDNA hidrørende derfra med ét polynukleotidmolekyle omfatten- I de en konsensusgensekvens for J-regionen af immunoglobulinkæden, hvori konsensus- I 15 sekvensen udviser mindst 80% sekvenshomologi til de kendte J-regionsekvenser. I

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvori konsensusgensekvensen er valgt fra grup- I pen bestående af: I I (i) tung human kædes J-region; I H 20 (ii) tung musekædes J-region; I (iii) human Kappa-J-region; I (iv) muse-Kappa-J-region; og I I (v) muse-Lambda-J-region. I

21. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvori konsensusgensekvensen er valgt fra grup- I I i pen bestående af dem, der betegnes som MJH1, MJH2, MJH3, MJH3-BSTEII, MJH- I I ! BSTEII(13), MJH4, 5JK1, 5JK2, JK2BGLII, 5JK4, JK4BGLII, 5JK5, og MJK: I I WJH1- GCCAGTGGCAGAGGAGT CG GT I I 30 I MJH2- GAGAGTGT CAGACGA6TCGGT DK 175680 B1 «JH3- ACCAGTGACAGAGACGTCGGT HJH3-BSTEI7- TCCCTGAGACCAGTGGCAGAG HJH-BSTEIIM3)- ACC AGTGGC AG AG 5 HJH4- GTCAGTGGCAGAGGAGTCGGT 5JK1- 6CAAGCCACCTCCGTGG

22. Fremgagnsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at nævnte konsensusse-kvens yderligere omfatter den sekvens, der koder for genkendelsesstedet for et restrik- 25 tionsendonukleaseenzym.

23. cDNA-ekspressionsvektorer, der har restriktionsendonukleasestedkort som vist i fig. 10, indeholdende en SV40-tidlig region-promotor, en SV40-sen region- 3Q splejsningssekvens, den selekterbare markør neo, SV40-polyA-signa)sekvenser, et multipelt kloningssted (pING2003) og eventuelt endvidere en tung musekædes forstærkerelement (pING2003 E).

24. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvori konsensusgensekvensen er valgt ffa grup-3 5 pen bestående af dem, der betegnes som UIGH, UIGK og MJH2-Apal: I DK 175680 B1 I I I I u:g-h agggaccacggtcaccgtctc I UIG-K GGGACCAAGCTTGAG I Id I I MJ„2-Apal TGTCAGAGGAGTCGGTCGTGTTTCCCGGGTA I I i° I