BG106998A - АНТИ-EGFRvIII SCFVS С ПОДОБРЕНА ЦИТОТОКСИЧНОСТ И ДОБИВ, ИМУНОТОКСИНИ НА БАЗАТА НА THEREON И МЕТОДИ ЗА ТЯХНОТО ПРИЛОЖЕНИЕ - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до антитела за мутантна форма на рецептор на епидермален растежен фактор, известна като EGFRvIII. Този мутант е открит само или първично по повърхността на глиобластомни клетки и по клетки от карцином на гърдата, на яйчницитеи от белодробен карцином. Антителата съгласно изобретението имат по-висок афинитет към EGFRvIII и образуват имунотоксини с повишени цитотоксичност и добив, в сравнение с известни антитела в тази област, включително scFv, обозначени като MR1. По-специално изобретението се отнася до антитяло, обозначено като MR1-1, което мутира MR1 в CDR3 на VH и VL веригите, за осигуряване на антитяло с особено добра цитотоксичност. Изобретението се отнася и до допълнителни антитела, при които MR1 е мутирало в CDR1 и 2 на VH или VL, или и в двете, с по-добро свързване към EGFRvIII в сравнение с родителското MR1 антитяло.

Description

Настоящата заявка претендира ползата на U.S. Provisional Patent Application 60/185,039, представена на 25 февруари 2000 г., съдържанието, на която е включено чрез цитат.

СТАНОВИЩЕ КАТО ПРАВА ЗА ИЗОБРЕТЕНИЯ , НАПРАВЕНО С ФЕДЕРАЛНО СПОНСОРИРАНО ИЗСЛЕДВАНЕ И РАЗРАБОТКА Не приложимо.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Една мутантна форма на рецептора на епидермалния растежен фактор, означена като “EGFRvlll”, е силно експресирана в 50-60% от глиобластомите и също е показано, че присъствува в 7080% от карциномите на гърдата и яйчниците, и около 16% от недребноклетьчния карцином на белия дроб (Wikstrand et al., Cancer Res. 55:3140-3148 (1995); Moscatello et al., Cancer Res. 55:5536-5539 (1995)). Мутацията се състо от една в рамка делеция на екзони 2-7,

Чйй*» близо до амино края на екстрацелуларния домен, което води до експресията на EGFR мРНК с една 801 базова делеция. Мутантният белтък съдържа един нов глицинов кодон на снадената свързка (Moscatello et al., по-горе). Мутантният рецептор е експресиран по клетъчната повърхност и създава един нов туморен специфичен епитоп (последователност) на клетъчната повърхност при делетираната свръзка. Рецепторът има конститутивна тирозин киназна активност, която повишава туморогенността на глиобластоми in vivo (Nishikawa wt al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7727-7731 (1994)).

Поради тумор-специфичната екстрацелуларна последователност, мутантният рецептор е атрактивно потенциално прицелно място за ракова терапия, по специално с употребата на имунотоксини.

Имунотоксини са получени чрез фузия на прицелната единица, като едно антитяло или част от антитяло, с белтъчен токсин като Pseudomonas екзотоксин.

Показано е, че имунотоксини имат активност срещу солидни тумори при хора, както е демонстрирано от Фаза I на клинично изпитване, при което един имунотоксин, получен с антитяло специфично за Lewis Y-свързан антиген, свръх експресиран при много с тумори, е показал туморна регресия (Pai et al., Nat Med. 2:350-353 (1996)). Имунотоксини като такива в проучването на Pai et al., които са получени с цяло мишо моноклонално антитяло обаче, имат известни недостатъци. Те са относително големи, което ограничава тяхното проникване. Освен това, често има хетерогенност на връзката между антитялото и токсина и е трудно да се получат конюгатите в голямо количество. Подобно на това, различните антитела срещу EGFRvlll, известни в тази област, както е представено от U.S.Patent No. 5,212,290, WO 96/16988 и Reist et al., Cancer Res. 55:4375-4382 (1995), имат ограничения при конструиране на имунотоксини.

Усилията да се преодолеят тези проблеми, като се изготвят изцяло рекомбинантни имунотоксини, при които клонирани Fvs са използувани за прицелване, са били затруднени, тъй като повечето променливи домени на антитялото функционират лошо като Fvs, поради нестабилност дължаща се на слабо V_H-V_L асоцииране или поради слаба свързваща активност.

MR1 е едноверижен антитяло променлив домен (scFv), който се свързва специфично с EGFRvlll. MR1 scFV е изолиран от една антитяло фагов дисплей библиотека (Lorimer et al.,

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:14815-14820 (1996)). scFV библиотеката, съдържаща MR1 е получена от мРНК на слезка от мишка, която е имунизирана с EGFRvlll специфичен пептид, плюс екстрацелуларния домен на EGFRvlll, пречистен с афинитетна хроматография от EGFRvlll-експресиращи туморни xenografts (ксеногенни присадки) (Lorimer et al., Clin.Cancer Res. 1:859-864 (1995)). MR1 е създаден като една перспектива за разработка на терапевтичен агент, който специфично би се се прицелвал към EGFRvlll-положителни ракови клетки. Последователността на MR1 е депозирана в GenBank с ключов номер U76382.

Имунотоксин MR1(Fv)-PE38 е конструиран члез сливане на scFv от MR1 с една скъсена форма на Pseudomonas ендотоксин А, РЕ38, в който целият домен la и аминокиселини 365-380 на домен lb са делетирани (Lorimer et al., Proc.Natl.Acad,Sci.USA 93:14815-14820 (1996). Няколко други рекомбинантни РЕ38 имунотоксини понастоящем са в клинични изпитвания (Kreitman et al., Blood 94(10):3340-48 (1999); Pai-Scherf et al., Clin.Cancer Res. (in press) (1999); Pai et al., Clin.Application Immunotoxins 234:83-96 (1998)). Общо, scFv гените са свързани c PE38 гена чрез къс линкер и клонирани в Т7-базиран експресионен вектор. Рекомбинантните имунотоксини са експресирани в E.coli, където те акумулират във включващи телца. След като включващите телца са добре измити, те са разтворени в гуанидин хидрохлорид и белтъкът е ренатуриран и пречистен с йонообменна хроматография и гел филтрация. Получените молекули са активни и са насочени към клетъчно специфичен антиген чрез scFv. Клетъчна смърт е предизвикана от активността на токсина.

За да бъдат приложими като терапевтични агенти, имунотоксините трябва да имат висок афинитет за антигена, което има за резултат висока цитотоксичност спрямо клетки, експресиращи антигена. За улесняване на процесирането и разноските, благоприятно е ако имунотоксинът може да се произвежда с висок добив. MR1 (scFv)-PE38 е най-високо афинитетният, най-цитотоксичен имунотоксин, който е на разположение, срещу клетки експресиращи EEGFRvlll, но който е далеч от идеалния. Той има Kd 8 пМ и добив по-малък от 3%. Следователно би било полезно, да се създадат антитела, които свързват EGFRvlll с по-голям афинитет и които когато са свързани с РЕ38 или други токсини, образуват имунотоксини с по-голяма цитотоксичност спрямо EGFRvlllекспресиращи клетки. В допълнение, би било полезно да се открият антитела, които образуват имунотоксини с по-високи добиви.

Няколко опита да се разрешат тези проблеми, като се С създадат допълнителни scFv от моноклонални анти-EGFRvll антитела са били неуспешни. MR1 остава единственият scFv, който е на разположение в тази област за прицелно действие на антиEGFRvlll имунотоксини.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

В един аспект, изобретението предоставя антитела с подобрено свързване за мутантната форма на рецептор на епидермален растежен фактор като EGFRvlll. По-специално, изобретението предоставя полипептиди с мутирани антитяло променливи тежковерижни (V_H) области или една мутирана леко верижна (V_L) област, или и двете, които полипептиди имат Kd за EGFRvlll 7пМ, 6пМ, 5пМ, 4пМ, 3.5пМ, ЗпМ или по-ниска, мутираната V_H или V_l притежават последователност, която се различава от родителската антитяло MR1 V_H или V_L, съответно чрез аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина с определяща комплементарност област (CDR), аминокиселината кодирана от кодон, който включва нуклеотид, принадлежащ на един гореща точка мотив от AGY или RGYW, където R е А или G, Y е С или Т и W е А или Т. В някои изпълнения, замяна може да се появи в

CDR3 V_H или CDR3 V_L. В други изпълнения, замествания могат да се появят в CDR1 V_H или CDR2 V_H, или двете, или в CDR1 V_L или CDR2

V_L или и в двете, или във всяка комбинация на CDR1,2 и 3 V_H и V_L.

Например, в едно изпълнение, замените могат да се появят в CDR3

V_L, CDR2 V_L, и CDR1 V_H.

В предпочитано изпълнение, полипептидът има една замяна в CDR3 V_H на най-малко една аминокиселина, подбрана от група състояща се от S98 и Т99. В други предпочитани изпълнения, заместванията са подбрани от P98-Y99, P98-N99, P98-W99, P98-I99, P98-F99 и P98-V99. Полипептидът може по-нататък да има една замяна в CDR3 V_L, където W е заменен с F в позиция 92. В особено предпочитано изпълнение, полипептидът има замествания в тежката верига на S98P-T99Y и в леката верига се включва замяната F92W (определяйки антитялото означено като “MR1-1”).

Полипептидите описани по-горе могат да бъдат едноверижна променлива област на едно антитяло (един “scFv”), един дисулфиден стабилизиран Fv, Fab, F(ab’)₂ или друг фрагмент на антитяло, който запазва способността да разпознава и свързва антиген. Те могат също да съдържат един повърхностен белтък на бакгериофаг.

В предпочитани изпълнения, полипептидите описани по-горе иматКс! за EGFvIll най-малко 1пМ по-ниско отколкото това на MR1. Полипептидите могат да имат Kd 7, 6, 5,4, 3. 5, 3 или по-малко.

Полипептидите описани по-горе, могат също да бъдат свързани, прикачени или свързани по друг начин с ефекторна молекула, терапевтична единица или откриваем белег. Терапевтичната единица може да бъде токсин или цитотоксична част от токсин (една ’’токсична единица”), която свързана с полипептид образува имунотоксин. Токсичната единица може да бъде Diphteria токсин или негов цитотоксичен фрагмент, saporin, pokeweed антивирусен белтък, рицин или негов цитотоксичен фрагмент и bryodin 1. В предпочитани изпълнения, токсинът е Pseudomonas екзотоксин (“РЕ”) или цитотоксичен фрагмент на РЕ. В особено предпочитани изпълнения, РЕ е РЕ38. Имунотоксините образувани от комбинацията на полипептидът и токсичната единица могат да имат IC₅o 7ng/ml или по-малка, 6ng/ml или по-малка, 5ng/ml или по-малка, 4 ng/ml или по-малка или около 3.5ng/ml или по-малка. Имунотоксинът може да има добив, когато е рекомбинантно експресиран най-малко 3% и може да бъде 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% или по-висок.

По-нататък изобретението предоставя молекули нуклеинова киселина, кодиращи полипептиди с една мутантна антитяло С променлива тежковерижна (V_H) област или една мутантна лековерижна (V_L) област, или и двете, който полипептид има Kd за EGFRvlll 7пМ или по-ниско, мутантнтните V_H или V_L, притежаващи последователност, която се различава от родителско антитяло MR1 V_H или V_L, съответно, с една аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина в определящата комплементарността област (CDR), аминокиселината кодирана от кодон, който съдържа нуклеотид принадлежащ на един гореща точка мотив, подбран от AGY или RGYW, където R е А или G, Y е С или Т, и W е А или Т. В някои изпълнения, замяната може да се появи в CDR3 V_H или CDR3 V_L. В други изпълнения, замените могат да се появят в CDR1 V_H или CDR2 V_H, или и двете, или в CDR1 V_L или CDR2 V_L, или двете, или във всяка комбинация на CDR1, 2 и 3 V_H и V_L. Например, в едно изпълнение, замествания могат да се появят в CDR3 V_L, CDR2 V_L и CDR1 V_H.

В предпочитано изпълнение, молекулата нуклеинова киселина кодира полипептид, притежаващ една замяна в CDR3 V_H в сравнение с MR1 на най-малко една аминокиселина, подбрана от групата състояща се от S98 и Т99. В други предпочитани изпълнения, заместванията са подбрани от P98-Y99, P98-N99, Р987

W99, P98-I99, P98-F99 и P98-V99. Молекулата нуклеинова киселина може също да кодира полипептид, притежаващ една замяна в CDR3

V_L в сравнение с MR1, съдържащ W заместващ F в позиция 92.

Молекулите нуклеинова киселина могат да кодират полипептиди, които са едноверижна променлива област на антитяло (един “scFv”), стабилизиран с дисулфид Fv, Fab, F(ab’)₂ или друг фрагмент на антитяло, който запазва способността да разпознава и да се свързва с антиген. Полипептидите могат също да включват повърхностен белтък на бакгериофаг. Молекулите нуклеинова киселина, описани по-горе могат да бъдат оперативно свързани с промотор.

В друг набор от изпълнения, изобретението предоставя методи за убиване на клетка носеща антиген, характеризиращи се с това, че клетката се поставя в контакт с имунотоксин, съдържащ токсична единица и прицелваща единица, прицелващата единица включва полипептид с мутантни антитяло променливи тежковерижни (V_H) области или мутантна лековерижна (V_L) област, или и двете, който полипептид има Kd за EGFRvlll 7пМ или по-ниско, мутантите V_H или V_l притежаващи последователност, която се различава от родителското антитяло MR1 V_H или Vl, съответно с една аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина в определящата комплементарността област (CDR), аминокиселината кодирана от кодон, който съдържа нуклеотид принадлежащ към мотив с една гореща точка от AGY или RGYW, където R е А или G, Y е С или Т и W е А или Т. В някои изпълнения, замените могат да се появят в CDR3 V_H или CDR3 V_L. В други изпълнения, заместванията могат да се появят в CDR1 V_H или CDR2 V_H, или и в двете или в CDR1 V_L или CDR2 V_L, или и в двете, или във всяка комбинация в CDR1,2n3V_H nV_L.

В предпочитано изпълнение, методът се характеризира с това, че прицелна единица в полипептид притежава една замяна в CDR3 V_H от най-малко една аминокиселина, подбрана от група състояща се от S98 и Т99. В други предпочитани изпълнения, прицелващата единица съдържа полипептид, включващ замествания подбрани от P98-Y99, P98-N99, P98-W99, P98-I99, P98-F99 и Р98V99. В особено предпочитано изпълнение, прицелващата единица е MR1-1.

Прицелващата единица може да бъде едноверижна променлива област на антитяло (един “scFv”), дисулфиден G стабилизиран Fv, Fab, F(ab’)2 или друг фрагмент на антитяло, който запазва способността да разпознава или да се свързва с антиген.

Клетката носеща антигена, може да бъде злокачествена клетка, като глиомна клетка, клетка от карцином на гърдата, клетка от белодробен карцином или клетка от карцином на яйчника.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1. Фигура 1 представя стратегията за PCR конструиране на мутанти и библиотеки. А. Използуван е pCANTABSEMR1 като матрица за амплификация, като се използува един праймер срещу посоката на транскрипцията, S1, и един праймер по посока на транскрипцията CDR3H b, d или f, съдържащи дегенерации (NNS) в прицелните области. В. pCANTAB5E-MR1 е използуван като матрица за амплификация, като се използуват продуктите на реакция в етап А като праймери отпред и един AMBN праймер след матрицата. Продуктите от реакция В са хидролизирани и клонирани в PCANTAB5E.

Фигура 2. BIAcore сензограма на MR1, MR1-1 и MR1 с S98P-T99Y мутации в VH CDR3.

Фигура 3. Преживяване на атимични плъхове с вътречерепни тумори от човешки глиобластомни клетки, трансфекгирани с EGFRvlll, третирани с MR 1-1-прицелен имунотоксин. Y-оста показва процента животни, преживели на даден момент от време. Х-оста показва времето на преживяване в дни. Легенда: MR 1-1 означава MR1-1-PE38 имунотоксин. Ромбчета, животни, на които са въведени бцд MR1-1-PE38 имунотоксин в продължение на 7-дневен период с 24-часова инфузия. Празен триъгълник: животни, на които са въведени 2 gg MR1-1-PE38 w имунотоксин по същата схема. Празно кръгче: животни, на които е въведен физиологичен разтвор като контрола по същата схема.

Фигура 4. Преживяване на атимични плъхове с вътречерепни тумори от човешки глиобластомни клетки, трансфекгирани с EGFRvlll и третирани с MR1-1-прицелен имунотоксин или третирани с физиологичен р-р контроли. У-оста показва процента животни преживели на даден момент от време. Xоста показва времето на преживяване в дни. Легенда: MR1-1, означава MR1-1-PE38 имунотоксин. Празни ромбчета, животни на които са въведени 0.2 ng MR1-1-P38 имунотоксин (в 200μΙ PBS с 0.2% HSA) в продължение на 7 дни с 24 часова инфузия. Празен триъгълник: животни, на които са въведени 0.6 μg MR1-1-P38 имунотоксин по същия начин. Празно кръгче: животни, на които са въведени 2.0 μg MR1-1-PE38 имунотоксин по същия начин. “X”, животни на които е въведен физиологичен разтвор като контрола по същия начин.

Фигура 5. Преживяване на атимични плъхове с неопластичен менингит, след интратекално инжектиране на човешки глиобластомни клетки, трансфектирани с EGFRvlll и третирани с MR1-1-прицелен имунотоксин или физиологичен разтвор като контрола. Y-оста показва процента животни преживели на даден момент от време. Х-оста показва времето на преживяване в дни. Легенда: MR1-1 означава MR1-1-PE38 имунотоксин. Триъгълничета: животни, на които са въведени 2pg MR1-1-PE38 имунотоксин в 40 μΙ PBS с 0.2% НА на 3-ия, 5-ия и 7-ия ден след туморната инициация, за обща доза 6 pg. Ромбчета: Животни, на които са въведени 1 pg MR1-

1-Р38 имунотоксин в 40 pl PBS с 0.2% НА на 3-ия, 5-ия и 7-ия дни след туморната инициация, за обща доза 3 pg имунотоксин. ^w Кръгчета: Животни, на които са въведени 40 pl PBS с 0.2% НА на 3ия, 5-ия и 7-ия ден след туморната инициация, като контроли.

Фигура 6. Обем на тумори във времето у атимични плъхове, инжектирани в дясната страна с човешки глиобластомни клетки, трансфектирани с EGFRvlll и третирани с MR1-1-прицелен имунотоксин или физиологичен разтвор като контрола. Y-оста показва туморния обем в mm³. Х-оста показва времето в дни от началото на третиране (животните са инжектирани с туморните клетки 7 дни преди ден “0”). Легенда: MR-1 означава MR1-1-PE38 имунотоксин. Квадратчета: животни, на които са приложени 1 pg болус инжекции с MR1-1-PE38 имунотоксин в 20pl на дни 0, 2 и 4 с обща доза 3 pg. Триъгълничета правилно поставени: Животни, на които са въведени 2рд болус инжекции с MR1-1-PE38 имунотоксин в 20 pl физиологичен р-р на дни 0, 2 и 4, с обща доза 6 pg имунотоксин. Триъгълничета обърнати надолу: животни на които са въведени 3 pg болус инжекции с MR1-1-PE38 имунотоксин в 20 pl физиологичен разтвор на дни 0, 2 и 4, с обща доза 9 pg имунотоксин. Ромбчета: животни, на които са въведени 20 pl болус инжекции с физиологичен разтвор на дни 0, 2 и 4, като контроли.

ПОДБРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

I. Въведение

Настоящето изобретение предоставя scFv антитела и други антитела с по-висок афинитет към EGFRvlll отколкото MR1. Понататък то предоставя имунотоксини с по-висока цитотоксичност за EGFRvlll-експресиращи клетки, отколкото тази на същите имунотоксини, използуващи MR1 като прицелващата част от молекулата. Антителата са създадени от MR1, но са мутирани в области с гореща точка на техните определящи комплементарността области (CDRs). Очудващо, имунотоксини включващи тези мутантни форми на MR1 като прицелваща единица, имат не само висок афинитет за EGFRvlll, но също могат да бъдат произведени в значително по-високи добиви, в сравнение със сходни имунотоксини, използуващи MR1 като прицелваща част на молекулата.

Ограничаващият фактор при конструирането на антитяло библиотеки с рандомизации в CDRs, е големият брой остатъци, които съставляват CDRs. Тъй като не се разполага с рентгенови структурни анализи за повечето антитела, обикновено няма опити да се идентифицират няколкото CDR остатъци, където мутациите е възможно да създават варианти с по-висок афинитет. Следователно, необходимо е да се конструират изключително големи произволни библиотеки, за да се осигури изолирането на варианти с по-висок афинитет.

В примерни проучвания, са правени мутации в CDRs на тежко верижната променлива област (V_H) на MR1. V_H CDRs на MR1 има единадесет аминокиселинни остатъци. Последните два остатъци на V_H областта, D101 и Y102 са изключени от проучванията с мутагенеза, тъй като те са разглеждани като не вероятни да участвуват в свързване на антиген, по две причини. Първо, тези два остатъци обикновено лежат на границата с V_L веригата. В резултат на това, те не са излагани. Второ, тези остатъци участвуват чрез J сегмента и следват 3’-свързващата област на V_HCDR2. В резултат на това, те са относително по-консервирани отколкото остатъка от V_HCDR3.

Другите девет аминокиселини във всяка позиция на CDR3 са заменени с всяка от другите естествени аминокиселини. Тези проучвания показват, че само мутации в области, известни че са горещи точки (области известни, че претърпяват хипермутация по време на афинитетно антитяло зреенето, най-добре характеризирани с мотивите RGYW и AGY, където R е А или G, Y е С или Т, и W е А или Т), което има за резултат антитела с по-висока цитотоксичност отколкото родителското MR1. Намерено е също, че мутациите повишават добива на имунотоксин, когато тези мутантни scFv са включени в имунотоксини, в сравнение с подобен имунотоксин, получен с родителското MR1 scFv. В следващи примерни проучвания са правени мутации само при аминокиселини в рамките на горещата точка. Отново, мутациите водят до антитела с по-висока цитотоксичност и добив, в сравнение с родителското антитяло MR1.

Въз основа на тези резултати, не е необходимо да се рандомизира всеки остатък в CDR за да се идентифицира този, където мутации ще създадат варианти с по-висок афинитет. Очаква се, че мутации в горещите точки на V_H и V_L CDRs 1 и 2 по подобен начин ще имат за резултат антитела с подобрен афинитет за EGFRvlll, подобрена цитотоксичност за EGFRvlll-експресиращи клетки, когато са включени в имунотоксини и подобрен добив за имунотоксини, включващи такива scFvs в сравнение с имунотоксини на базата на MR1. Тъй като подобрените свойства се дължат на замените на аминокиселините, същите положителни ефекти ще бъдат намерени, когато тези мутирани форми на MR1 (включително такива мутирани в V_H и V_L CDR3), са включени в дисулфид стабилизирани Fvs (dsFvs) или във Fab’, F(ab’)₂ или Fab.

Повишена цитотоксична активност не корелира обезателно с повишен афинитет (Таблици 4 и 5, по-долу). Няма видимо обяснение за тази липса на корелация. Освен свързващ афинитет, който обикновено е измерен при 22°С, има много аспекти в токсичния процес, които могат да бъдат повлияни чрез “гореща точка” мутации. Такива аспекти включват стабилност при 37°С, степен на интернализация, протеолитично процесиране и пренос до компартмента изискван за транслокация. Възможно е един или повече от тези аспекти да бъдат повлияни. Антитела с по-висок афинитет за EGFRvlll обаче са полезни за различни цели и поспециално за диагностично приложение и in vitro тестове, за определяне наличието или отсъствието на EGFRvlll-експресиращи клетки в дадена проба. Например, за in vitro приложения, антитела като scFv с по-висок афинитет за EGFRvlll, могат да бъдат свързани с радионуклиди или с всякакъв брой други откриваеми маркери и използувани за откриване наличието на клетки експресиращи EGFRvlll в биопсична проба от пациент, за определяне дали пациентът има рак , характеризиращ се с наличието на такива клетки, или за определяне, че ракът не е все още унищожен у пациента, за който е известно, че има такова раково заболяване. Подобно на това, при in vivo приложения, scFv, dsFv или други антитела на изобретението, могат да бъдат свързани с радионуклиди или други откриваеми маркери и да бъдат използувани за откриване наличието на клетки експресиращи EGFRvlll у пациент, при което отново да се диагностицира, дали пациентът има рак, характеризиращ се с наличието на такива клетки, или ракът не е все още унищожен у пациент, за който е известно, че има такова раково заболяване.

Накрая, една очебийна разлика, наблюдавана измежду CDR мутанти, е била крайният добив на активен мономерен белтък. Рекомбинантни токсини акумулират във включващи телца като неразтворим агрегиран белтък (имунотоксин). Активни мономери са получени чрез разтваряне на включващи телца в 6М гуанидин HCI, последвано от контролирана ренатурация в редокс система и разделяне на мономери от мултимери и агрегати. Проучванията показват, че мутации в 1 или 2 аминокиселини в CDRs, могат силно да повишат добивите (Таблица 6) на имунотоксин, както е определено и обяснено по-долу. Добивът на MR1(Fv)-PE38 е само 2%, но е повишен драматично до 17% в тежко верижни CDR3 S98P-T99S мутации. Вероятно, тези мутации имат дълбок ефект върху пътя за нагъване. Общо, всичките мутации в тежката верига, изолирани в началната мутагенеза на тежката верига, имат по-добър добив отколкото родителското MR1. Така, тежката верига на CDRs е много важна за точно нагъване и фаговата експресионна система може да бъде подбрана по начин за белтъци, които се нагъват по-ефективно. Следователно, фаги съдържащи по-добре нагъващи се Fvs, изглежда присъствуват в по-голям брой и предпочитано са обогатени при задържане върху антиген.

Въз основа на тези резултати, може да се очаква, че фагов дисплей може да бъде използуван за подбор на Fvs мутирани в CDR1 или 2 на Vh и V_l веригите, които подобно проявяват повишен произведен добив, в сравнение с родителските MR1 scFv.

Проведени са in vivo тестове за определяне ефекта на примерни имунотоксини, прицелно насочени от MR1-1 върху животински модели на човешки тумори. За установяване туморите, атимични плъхове и мишки са инжектирани интракраниално, интратекално или подкожно с клетки на човешка глиобластомна клетъчна линия (U87MG), която е трансфекгирана да експресира

EGFRvlll (трансфектираната EGFRvlll-експресираща клетъчна линия е обозначена като U87MG.AEGFRvlll и е описана от Nishikawa et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)91(16);7727-7731 (1994)). След като туморите са установени, плъховете и мшките са третирани с болус инжекции или продължителни инфузии с различни дози на имунотоксин. Както е описано в Примерите, по-долу, и Фигури 3-6, независимо от туморната локализация и метод на въвеждане на имунотоксина, на животните, на които е даван имунотоксин в дози 1 или 2 pg, показват подчертан по-малък растеж на тумора и по-продължително време на преживяване, в сравнение с животните, на които е даван ^w физиологичен разтвор като контрола.

II. Дефиниции

Единици, префикс и символи са отбелязани по приетата форма на Systeme International de Unites (SI). Цифровите обхвати са включващи бройките определящи порядъка. Ако не е указано по друг начин, нуклеинови киселини са написани отляво надясно в 5’ до 3’ ориентация, аминокиселинните последователности са написани отляво надясно в амино към карбокси ориентация. Заглавията, които са дадени тук не са ограничения за различните аспекти или изпълнения на изобретението, които могат да са налице от цитат към спецификацията като цяло. Съответно на това, термините определени непосредствено по-долу, са по-пълно определени чрез цитат към спецификацията в неговата цялост.

Мутирани остатъци от известна последователност са обозначени за удобство чрез изброяване в едно-буквен код, остатъкът, който нормално е намерен на определената позиция в последователността, позицията в последователността на мутирания остатък и остатъкът заменен за оригиналния остатък. Така с оглед на MR1 CDR3 V_H, терминът “598Р”показва, че серинът нормално откриван в позиция 98 на нормалната CDR3 тежка верига на MR1 е мутиран за пролин. Обозначение като “S98”, при което броят не е последван от обозначение на един остатък обяснява, че остатъкът нормално се намира в тази позиция на нормалната последователност на пептида или че този специфичен остатък понастоящем се намира в тази позиция (т.е. че този обозначен остатък е заменен с остатък нормално съществуващ в тази позиция). Каква употреба се предвижда тук, ще бъде ясно от контекста. Обяснения тук за дадени номерирани аминокиселинни остатъци на MR1-1 се отнасят за остатъци номерирани съгласно Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTERST, U.S. Department of Health and Human Services, (1987), както е актуализирано; този цитат след това е обозначен като “Kabat”, съдържанието на който тук е включено чрез цитат) когато последователността на scFv е подредена и номерирана съгласно Kabat системата.

“EGFRvlH” означава мутантна форма на рецептор на епидермален растежен фактор, разпознат от MR1 scFv и характеризиран с една 801 базова двойка в рамкова делеция на екзони 2-7 близо до амино края. Тази форма на рецептора е известна в тази област, както е илюстрирано от Wickstrand et al., Moscatello et „ al., и Lorimer et al. справки цитирани в Предшествуващо състояние на техниката. Поради една промяна в терминологията, EGFRvlll оригинално е наречен Тип II мутация в някои по-ранни работи в тази област, както е илюстрирано с U.S.Patent No. 5,212,290.

Както тук е използувано “антитяло” включва описание за имуноглобулинова молекула, имунологично реактивно със специален антиген и включва съответни поликлонални и моноклонални антитела. Терминът включва също генетично инженерни форми като химерни антитела (например, хуманизирани миши антитела), хетероконюгатни антитела (например, биспецифични антитела).

Терминът специално се отнася тук за рекомбинантни едноверижни Fv фрагменти (scFv), дисулфидно стабилизирани (dsFv) Fv фрагменти (виж, U.S.S.N. 08/077,252 включен тук чрез цитат) или pFv фрагменти (виж, U.S.Provisional Patent Applications 60/042,350 и 60/048,848). Терминът “антитяло” включва също антиген свързващи форми на антитела, включително фрагменти с антиген-свързваща способност (например, Fab’, F(ab’)₂, Fab, Fv и rlgG. Виж също, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Виж също, например, Kuby, J., Immunology, 3^rd Ed., W.H.Freeman & Co., New York (1998). Кой специален смисъл или значения на термина са С предвидени, ще бъде ясно в контекста.

Антитяло имунологично реактивно с даден антиген, може да бъде създадено чрез рекомбинантни методи, като селекция на библиотеки на рекомбинантни антитела във фагови или подобни вектори, виж например, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); и Vaughan et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996) или чрез имунизиране на животно с антигена или с ДНК кодираща антигена.

Обикновено, един имуноглобулин има една тежка и лека верига. Всяка тежка и лека верига съдържа една постоянна област и една променлива област, (областите също са известни като “домени”). Леко- и тежковерижни променливи области съдържат четири “рамкови” области, прекъснати от три свръх променливи области, наречени “определящи комплементарността области” или “CDRs”. Разпростирането на рамковите области и CDRs е определено (виж, Kabat, по-горе). Последователностите на рамковите области на различни леки и тежки вериги са относително консервирани в рамките на даден вид. Рамковата област на едно антитяло, това са комбинираните рамкови области на съставящите леки и тежки вериги, служи да позиционира и подреди CDRs в три димензионално пространство.

CDRs са първично отговорни за свързването с епитоп на антиген. CDRs на всяка верига обикновено са означени като CDR1, CDR2 и CDR3, номерирани последователно, започвайки от N-края и също обикновено са идентифицирани по веригата, в която е локализирана дадената CDR. Така, V_H CDR3 е локализирана в променливия домен на тежката верига на антитялото, в която се намира, докато V_L CDR1 е CDR1 от променливия домен на тежката верига на антитялото, в която тя се намира.

Препратки към “V_H” или “VH” се отнасят за променлива област на имуноглобулинова тежка верига на една антитяло, включително тежката верига на Fv, scFv, dsFv или Fab. Препратки към “V_L” или “VL” се отнасят за променлива област на имуноглобулинова лека верига, включително лека верига на Fv, scFv, dsFv или Fab.

Фразата “едноверижен Fv” или “scFv се отнася за антитяло, в което променливите области на тежката верига и на леката верига на традиционно двуверижно антитяло, са свързани да образуват една верига. Обикновено, един линкерен пептид е вмъкнат между двете вериги, за да позволи точно нагъване и създаване на активно свързващо място.

Терминът “линкерен пептид” включва препратка към пептид, в рамките на един антитяло свързващ фрагмент (например, Fv фрагмент), който служи индиректно да свърже променливия домен на тежката верига с променлив домен на леката верига.

Терминът “родителско антитяло” общо се отнася за антитяло, което представлява интерес, което ще бъде мутирано или променено за получаване антитела или техни фрагменти, които се свързват за същия епитоп както родителското антитяло. Както тук е използувано, терминът “родителско антитяло се отнася за scFv обозначено като “MR1”(GenBank Accession Number U76382) ако друго не е указано или изисквано от контекста.

Терминът “гореща точка” означава част от нуклеотидната последователност на CDR или на рамковата област на променливия домен, която е място на особено висока естествена мутация. Въпреки че CDRs самите са разглеждани като области на свръх променливост, известно е, че мутациите на са равномерно разпределени по протежение на CDRs. Идентифицирани са специални места или горещи точки, като тези локализации, които претърпяват концентрирани мутации. Горещите точки се характеризират с известен брой структурни особености и последователности. Тези “горещи точки мотиви” могат да се използуват за идентифициране на горещи точки. Два мотива с консензус последователности, които са особено добре характеризирани са тетрануклеотидната последователност RGYW и серин последователността AGY, където R е А или G, Y е С или Т и W е А или Т.

“Прицелваща единица” или “прицелваща молекула” е частта на един имуноконюгат, която има способността да насочва прицелно имуноконюгата към клетки, които са от интерес. Обикновено, прицелващата единица е едно антитяло, scFv, dsFv, Fab или F(ab’)₂, която разпознава специфичен антиген на клетките, които са от интерес.

“Токсична единица” е цитотоксин или част от цитотоксин, който когато е включен в имунотоксин, прави имунотоксина цитотоксичен спрямо клетките, които са от интерес.

“Имунотоксин е молекула съдържаща прицелваща молекула, като scFv, и една токсична единица, като Pseudomonas екзотоксин (“РЕ”) или негов цитотоксичен фрагмент.

Имунотоксините обсъждани тук, обикновено са експресирани като включващи телца в E.coli, след което включващите телца са пречиствани, солюбилизирани в 6М гуанидин HCI и белтъкът е ренатуриран. Както тук е използуван, терминът “добив” се отнася за количеството на точно нагънат мономерен имунотоксин, получен с тази процедура. Той е изразен като процент определен като: милиграми белтък след MonoQ йонообменна хроматография/ милиграми ренатуриран белтък на включващи телца.

“Терапевтична единица” е частта на имуноконюгата, предвидена да действува като терапевтичен агент.

Терминът “терапевтичен агент” включва всякакъв брой съединения известни понастоящем или по-късно създадени да действуват като противо-неопластични, противо-възпалителни, цитокини, противо-инфекциозни, ензимни активатори или инхибитори, алостерични модификатори, антибиотици или други агенти, въведени да индуцират желан терапевтичен ефект у пациент. Терапевтичният агент може също да бъде токсин или радиоизотоп, където предвиденият терапевтичен ефект, например е убиването на ракова клетка.

“Откриваем белег” означава, по отношение на един имуноконюгат, част от имуноконюгата, която има свойство да прави своето наличие откриваемо. Например, имуноконюгатът може да бъде белязан с радиоактивен изотоп, което позволява клетки, които притежават имуноконюгат да бъдат откривани в имунохистохимични тестове.

Термините “ефекторна единица” и “ефекторна молекула” означават частта на имуноконюгата, предвидена да има ефект върху клетка, която е прицелна за прицелващата единица или да идентифицира наличието на имуноконюгата. Така, ефекторната единица може да бъде, например, терапевтична единица, токсин, радиоактивен белег или флуоресцентен белег.

Терминът “имуноконюгат” означава химерна молекула, съдържаща прицелваща молекула (като scFv) прикачена директно (например, чрез ковалентна връзка) или индиректно (например, чрез линкерен пептид) за ефекгорна молекула. В подгрупа от имуноконюгати, ефекгорната молекула е токсин и химерната молекула след това по-специфично е наречена “имунотоксин.

Терминът “ефективно количество” или “количество ефективно за” или “терапевтично ефективно количество” включва обяснение за дозировка на терапевтичен агент, достатъчно да произведе желан резултат, като инхибиране на клетъчна белтъчна синтеза най-малко с 50% или убиване на клетката.

Терминът “токсин” включва препратка към abrin, ricin, Pseudomonas екзотоксин (РЕ), дифтеритен токсин (DT), ботулинов токсин или техни модифицирани токсини. Например, РЕ и DT са силно токсични съединения, които обикновено предизвикват смърт чрез чернодробна токсичност. РЕ и DT, обаче могат да бъдат модифицирани във форма за употреба като имунотоксин, чрез отстраняване на нативния прицелващ компонент на токсина (например, домен 1а на РЕ или В веригата на DT) и заместването му с различна прицелваща единица, като едно антитяло.

Терминът “IC50” се отнася за концетрация на токсин или имунотоксин (изразена като ng/ml), необходима да инхибира белтъчна синтеза с 50%.

Терминът “контактуване” включва обяснение за поставяне в пряка физическа връзка.

“Експресионен плазмид” включва нуклеотидна последователност, кодираща молекула, която представлява интерес, която е оперативно свързана с промотор.

Както тук е използувано, “полипептид”, “пептид” и “белтък” са използувани взаимозаменяемо и включват справка за полимер на аминокиселинни остатъци. Термините се прилагат за аминокиселинни полимери, при които един или повече аминокиселинни остатъци са изкуствен химичен аналог на съответна естествено срещаща се аминокиселина, както и естествено срещащащи се аминокиселинни полимери. Термините също са приложими за полимери, съдържащи консервативни аминокиселинни замени, такива при които белтъкът се запазва функционален.

Терминът “остатък” или “аминокиселинен остатък” или “аминокиселина” включва справка за аминокиселина, която е включена в белтък, полипептид или пептид (колективно “пептид). Аминокиселината може да бъде естествено срещаща се аминокиселина и ако не е ограничена в друго отношение, може да обхваща известни аналози на природни аминокиселини, които могат да функционират по сходен начин както естествено срещащи се аминокиселини.

Аминокиселините и аналози цитирани тук са описани чрез съкратени обозначения както следва в Таблица 1:

Таблица 1: Аминокиселинна номенклатура

Наименование	3-буквено	1-буквено
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспаргин	Asn	N
Аспаргинова киселина	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутаминова киселина	Glu	E
Глутамин	Gin	Q
Глицин	Gly	G
Хистидин	His	H
Изолевцин	lie	I

Левцин

Лизин

Leu

Lys

Met

Метионин

Μ

Фенилаланин

Phe

F

Пролин	Pro	P
Серии	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	w
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Vai	V

“Консервативна замяна”, когато се описва един белтък, се

отнася за промяна в аминокиселинния състав на белтъка, която не променя съществено белтъчната активност. Така, “консервативно модифицирани варианти” на дадена аминокиселинна последователност, се отнасят за аминокиселинни замени на такива аминокиселини, които не са критични за белтъчната активност или замени на аминокиселини, с други аминокиселини, притежаващи подобни свойства (например, киселинни, основни, положително или отрицателно натоварени, полярни или не-поларни и т.н.) така, че замените на дори критични аминокиселини не променят съществено активността. Таблици на консервативни замени, осигуряващи функционално сходни аминокиселини, са добре известни в тази област. Следващите шест групи в Таблица 2, всяка съдържа аминокиселини, които са обикновено консервативни замени една за

Друга:

Таблица 2 1) Аланин (А), серин (S), треонин (Т); 2) Аспаргинова киселина (D), глутаминова киселина (Е); 3) Аспаргин (N), глутамин (Q); 4) Аргинин (R), лизин (К); 5) Изолевцин (I), левцин (L), метионин (М), валин (V); и

6) Фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

виж също, Creighton, PROTEINS, W.Н.Freeman and Company, New York (1984). Трябва да се отбележи обаче, че докато фенилаланин и триптофан са общо разглеждани като консервативни замени една за друга, замяната на триптофан с фенилаланин в горещата точка на V_L CDR3 на scFv MR1 създава един имунотоксин, който е по-активен отколкото неговия родителски scFv. Съответно на това, докато тези аминокиселини са разглеждани като консервативни замени за части на едно антитяло извън CDR, в контекста на това изобретение, тези две аминокиселини не са консервативни замени една за друга в рамките на гореща точка. Въз основа на тези резултати, аминокиселинни замени в рамките на гореща точка не могат да бъдат разглеждани като консервативни замени, ако те не са тестирани с например, тестовете представени тук по-долу, за определяне дали или не, те повлияват свързващия афинитет на получената молекула, добива на имунотоксин, получен с тази молекула като прицелваща единица, или и двете.

Термините “съществено сходен” в контекста на един пептид, показва, че пептидът съдържа последователност с най-малко 90%, предпочитано 95% идентичност на последователността, спрямо референтната последователност, върху прозорец за сравнение от 10ΣΟ аминокиселини. Процентът идентичност на последователността е определян чрез сравнение на две оптимално подредени последователности, върху прозорец за сравнение, където частта от полинуклеотидната последователност в прозореца за сравнение, може да съдържа допълнения или делеции (т.е. празнини) в сравнение с референтна последователност (която не съдържа допълнения или делеции) за оптимално подреждане на двете последователности. Процентът е изчислен чрез определяне броя на позициите, при които идентичната база на нуклеинова киселина или аминокиселинен остатък се появява в двете последователности, за получаване броя на сдвоените позиции, разделяйки броя на сдвоените позиции на общия брой позиции в прозореца за сравнение и умножавайки резултата със 100, за получаване процента идентичност на последователността.

Фразата “дисулфидна връзка” или “цистеин-цистеин дисулфидна връзка се отнася за ковалентно взаимодействие между два цистеина, при които серните атоми на цистеините са окислени за образуване на дисулфиден мост. Средната енергия на свързване на w дисулфидната връзка е около 60 kcal/mol, сравнена с 1-2 kcal/mol за водородна връзка. В контекста на това изобретение, цистеините, които образуват дисулфидната връзка са в обсега на рамковите области на едноверижното антитяло и служат да стабилизират конформацията на антитялото.

Термините “ конюгиране”, “присъединяване”, “свързване” или “скачване” се отнасят за получаване на два полипептида в една последователна полипептидна молекула. В контекста на настоящето изобретение, термините включват справка за свързване на антитяло единица с ефекторна молекула (ЕМ). Свързването може да бъде по Q химичен или рекомбинантен начин. Химическите начини се отнасят за реакция между антитяло единицата и ефекторната молекула, така че има една ковалентна връзка образувана между двете молекули за формиране на една молекула.

Както тук е използувано, “рекомбинантен” включва справка за белтък, произведен като са използувани клетки, които не притежават, в тяхното нативно състояние, ендогенно копие на ДНК, способно да експресира белтъка. Клетките произвеждат рекомбинантния белтък, поради това че те са били генетично променени чрез въвеждане на съответна изолирана последователност на нуклеинова киселина.

Терминът включва също справка за клетка, или нуклеинова киселина, или вектор, които са били модифицирани чрез въвеждане на хетероложна нуклеинова киселина или промяната на нативна нуклеинова киселина в не-нативна форма към тази клетка, или че тази клетка е производна от клетка така модифицирана. Така, например, рекомбинантни клетки, експресиращи гени, които не се намират в рамките на нативната (не-рекомбинантна) форма на клетката, експресират мутанти на гени, които не се намират в обсега на нативната форма, или експресират нативни гени, които са по друг начин абнормно експресирани, по-слабо експресирани или съвсем не са експресирани.

Както тук е използувано, “нуклеинова киселина” или “последователност на нуклеинова киселина”, включва справка за дезоксирибонуклеотид или рибонуклеотид полимер в едно- или двуверижна форма, и ако не е ограничена по друг начин, обхваща известни аналози на природни нуклеотиди, които хибридизират с нуклеинови киселини по начин, сходен с природно срещащи се нуклеотиди. Ако друго не е указано, дадена последователност на нуклеинова киселина включва нейната комплементарна последователност, както също консервативни варианти, т.е.

□ нуклеинови киселини, представени в непостоянни позиции на кодони и варианти, така че когато се транслират в белтък, да имат за резултат една консервативна замяна на аминокиселина.

Както тук е използувано, “кодиращ по отношение на специфична нуклеинова киселина, включва справка за нуклеинови киселини, които съдържат информацията за транслация в специфичен белтък. Информацията е специфицирана чрез употребата на кодони. Обикновено, аминокиселинната последователност е кодирана от нуклеинова киселина, използувайки “универсален” генетичен код. Обаче, варианти на универсалния код, такъв какьвто е налице в някои растения, животни и гъбични митохондрии, бактерия Macronucleus capricolum (Proc.Natl.Acad. Sci.USA 82:2306-2309 (1985)), или цилиатите Macronucleus, могат да бъдат използувани когато нуклеиновата киселина е експресирана, при използуване на транслационната машинария на тези организми.

Фразата “сливане в рамка” се отнася за свързване на две или повече последователности на нуклеинова киселина, които кодират полипептиди така, че свързаната последователност на нуклеинова киселина транслира в едноверижен белтък, който съдържа оригиналните полипептидни вериги.

Както тук е използувано, “експресиран” включва справка за транслация на нуклеинова киселина в белтък. Белтъци могат да бъдат експресирани и остават вътреклетъчни, стават компонент на клетъчната повърхностна мембрана или са секретирани в извънклетъчния матрикс или среда.

С “клетка гостоприемник” се означава клетка, която може да подкрепи репликацията или ексресията на експресионния вектор. Клетки гостоприемници могат да бъдат прокариотни клетки като E.coli, или еукариотни клетки като от дрожди, от насекоми, амфибии или клетки от бозайници.

Фразата “фагов дисплей библиотека” се отнася за популация от бактериофаг, всяка от които съдържа чужда кДНК рекомбинантно слята в рамка с един повърхностен белтък. След репликация в бактериален гостоприемник, обикновено E.coli, фагът, който съдържа чуждата кДНК, която е от интерес, са подбрани по експресията на чужд белтък по повърхността на фага.

Термините “идентичен” или процент “идентичност, в контекста на две или повече последователности на нуклеинови киселини или полинуклеотиди, се отнасят за две или повече последователности или подпоследователности, които са същите или имат специфициран процент аминокиселини остатъци или нуклеотиди, които са същите, когато са сравнени и подредени за максимално съответствие, както е измерено използувайки един от следващите алгоритми за сравнение на последователности или чрез визуална преценка.

Фразата “съществено идентичен”, в контекста на две нуклеинови киселини или полипептиди, се отнася до две или повече последователности или подпоследователности, които имат най-малко 60%, предпочитано 80%, най-предпочитано 90-95% идентичност на нуклеотидни или аминокиселинни остатъци, когато се сравняват и Y подреждат за максимално съответствие, както е измерено използувайки един от следващите алгоритми за сравнение на последователност или чрез визуална преценка. Предпочитано, съществената идентичност присъствува върху една област на последователностите, която е най-малко около 50 остатъка по дължина, по-предпочитано върху една област от най-малко около 100 остатъци и най-предпочитано, последователностите са съществено идентични върху най-малко около 150 остатъци. В най-предпочитано изпълнение, последователностите са съществено идентични върху цялата дължина на кодиращите области.

За сравнение на последователности, обикновено една Че»· * последователност действува като референтна последователност, спрямо която се сравняват тестираните последователности. Когато се използува алгоритъм за сравнение на последователности, в компютера се вкарват тестираната и референтната последователности, обозначени са координатите на последователностите, ако е необходимо, и са обозначени параметрите на алгоритъмната програма на последователността. След това алгоритъмът за сравнение на последователности, изчислява процента идентичност на последователности за тестираната последователност(и) спрямо референтната последователност, въз основа на обозначените параметри на програмата. Познати са известен брой програми за такива подреждания в тази област.

Следваща индикация, че две последователности на нуклеинови киселини или полипептиди са съществено идентични е, че полипептидът кодиран от първата нуклеинова киселина е имунологично кръстосано реактивен с полипептида, кодиран от втората нуклеинова киселина, както е описано по-долу. Така, един полипептид е обикновено съществено идентичен с втори полипептид, например, където двата пептида се различават само по консервативни замени. Друга индикация, че две последователности на нуклеинови киселини са съществено идентични е, че двете молекули хибридизират една с друга при строги условия, както е описано по-долу.

Терминът “in vivo включва справка за вътрешността на тялото на организма, от който е получена клетката. “Ex vivo” и “in vitro” означава извън тялото на организма, от който клетката е получена.

Фразата “злокачествена клетка” или “злокачественост” се отнася за тумори или туморни клетки, които са инвазивни и/или _w способни да образуват метастази, т.е. ракова клетка.

Както тук е използувано, “клетки от бозайници” включва справка за клетки произхождащи от бозайници, включително хора, плъхове, мишки, морски свинчета, шимпанзета или макак. Клетките могат да бъдат култивирани in vivo или in vitro.

Терминът “селективно реактивен” означава, по отношение на един антиген, преференциалното свързване на антитяло, изцяло или част, с клетка или тъкан, носеща този антиген и не се отнася за клетки или тъкани, които нямат този антиген. Разбира се, признато е, че известна степен не-специфични взаимодействия могат да се появят между молекула и не прицелна клетка или тъкан. Независимо от това, селективна реактивност, може да бъде определена като медиирана чрез специфично разпознаване на антигена. Въпреки че селективно реактивни антитела се свързват с антиген, те могат да правят това с нисък афинитет. От друга страна, специфично свързване се проявява в по-силно асоцииране между антитялото и клетки носещи антигена, отколкото между свързващото антитяло и клетки, които нямат антигена. Специфично свързване обикновено води до по-голямо от 2 пъти, предпочитано по-голямо от 5 пъти, попредпочитано повече от 10 пъти и най-предпочитано повече от 100 γ,.

Ч' пъти повишение количеството свързано антитяло (за единица време) с клетка или тъкан, носеща EGFRvlll, в сравнение с клетка или тъкан, които нямат EGFRvlll. Специфично свързване с белтък при такива условия изисква антитяло, което е подбрано по неговата специфичност за даден белтък. Различни имунотест формати са подходящи за подбор на антитела, специфично имунореактивни с даден белтък. Например, твърдо-фазни ELISA имунотестове рутинно са използувани за подбор на моноклонални антитела, специфично имунореактивни с даден белтък. Виж, Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York _ (1988), за описание на имунотест формати и условия, които могат да бъдат използувани за определяне специфична имунореактивност.

Терминът “имунологично реактивни условия” включва справка за условия, които позволяват една антитяло, създадено за специален епитоп, да се свързва с този епитоп в откриваемо повисока степен, отколкото и/или до същественото изключване на свързване с всички други епитопи. Имунологично реактивни условия са зависими от формата на антитяло свързващата реакция и обикновено са тези, използувани в протоколи за имунотестове или тези условия срещащи се in vivo. Виж Harlow & Lane, по-горе, за описание на имунотест формати и условия. Предпочитано, имунологично реактивни условия, използувани в методите на настоящето изобретение са “физиологични условия”, които включват справка за условия (например, температура, осмоларитет, pH), които са типични вътре в живия бозайник или клетка от бозайник. Тъй като се признава, че някои органи са предмет на екстремни условия, вътре организмовата и вътреклетъчната околна среда нормално е около pH 7 (т.е. от pH 6.0 до pH 8.0, обикновено pH 6.5 дж 7.5), съдържа вода като преобладаващ разтворител и съществува при температура над 0°С и под 50°С. Осмоларитетът е в обсега, който подкрепя клетъчния виталитет и пролиферация.

III. Създаване антитела с по-висок афинитет за EGFRvlll от този на MR1

Антитела се свързват с антигени чрез остатъци в техните CDRs. Следователно, мутагенеза на CDRs е широко използувана за подобряване афинитета на Fab и Fv фрагменти на антитела. Има известен брой различни подходи за CDR мутагенеза. Повечето от тях, като кодон-базирана мутагенеза (Yelton et al., J.Immunol. 155:1994-2004 (1995)), CDR разходка (Barbas et al., Trends Biotech. 14:230-234 (1996); Yang et al., J.Mol.Biol. 254:392-403 (1996)) и синтетична CDR конструкция (de Kruif et al., J.Mol.Biol. 248:97-105 (1995)), изискват конструкцията на големи библиотеки, което технически е трудно да се направи и е трудно да се манипулира. Насоката при антитяло афинитетно зреене е в посока изолиране на високо афинитетни съединители от относително по-малки по размер библиотеки (Pini et al., J.Biol.Chem. 273:21769-21776 (1998); Wu et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6037-6042 (1998); Chowdhury et al., Nature Biotechnol. 17:568-572 (1999)). Всички тези подходи включват конструиране на експресионни библиотеки на антитела с мутации в CDRs и селекция за по-добри съединители.

Фагов дисплей технологията е станала полезно средство за отбор на големи пептидни или белтъчни библиотеки (Winter et al., Annu.Rev.Immunol. 12:433-455 (1994); McCafferty, J., Nature 348:552554 (1990); Barbas et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982 (1991)). Едноверижни Fvs могат да бъдат експресирани върху фагови частици като фузии с М13 ген 3 протеин в един фагемид вектор. Слетите белтъци са експресирани в E.coli и в присъствието на хелперен фаг, са представени на връхчета на М13 фаг, който може да бъде отделен от среда за култивиране. Фаги, които представят scFv слети белтъци, които се свързват със специфичен антиген, са подбрани чрез разстилане на фагови библиотеки върху клетки експресиращи антигена или по повърхност, с която антигенът е свързан, като магнитни зърна. Фаги, които не се свързват са отмити, свързаните фаги са елюирани и амплифицирани чрез ре-инфектиране на E.coli. Няколко цикъла на разстилане имат за резултат обогатяване на специфични съединители. Чрез правене условията на разстилане построги, по-добрите съединители могат по-ефекгивно да се отделят от по-лошите съединители.

Фагов дисплей технология може да бъде използувана за създаване на антитела, които се свързват с EGFRvlll, с по-висок афинитет отколкото MR1. Както е добре известно в тази област, едно интактно антитяло съдържа две тежки вериги и две леки вериги; всяка верига има три CDRs, обозначени съответно като 1, 2 и 3. Всяка CDR е известно, че допринася за антигенно свързване, но те правят това не еднакво. Виж общо, Kuby, J., Immunology, W.Н.Freeman & Co., New York (3^rd Ed. 1998). Докато аминокиселините на всяка от CDR може да бъде мутирана, за намиране мутации, които повишават афинитета, средно CDR3 на всяка верига има по-голям принос за антигенно свързване, отколкото CDR1 или CDR2 на тази верига. Виж общо, Kuby, по-горе на страница 117. Така, мутации на CDR3 V_H и V_L вериги могат да бъдат особено благоприятни. Освен това, CDR3 V_H на MR1 е относително дълга за миша CDR3, което може да допринася отчасти за относителната стабилност на MR1 scFv в сравнение с други scFvs.

След изключване на последните две аминокиселини на V_H CDR3 като не вероятни да допринасят за антигенно свързване, поради основанията обсъдени във Въведение, останалите девет остатъци в V_H CDR3 са заменени с всяка от другите 19 природни w аминокиселини. Само мутации на серин и треонин в аминокиселинни позиции 98 и 99, съответно, имат за резултат подобрена цитотоксичност на получения имунотоксин (аминокиселинната последователност на V_H и V_L CDR3 са представени с единичен буквен код в Таблица 5, 6 и 7 по-долу. Последователността представяща V_H не показва двата остатъка, D101 и Y102, което се разглежда като вероятно не допринасящо за антигенното свързване). Предпочитаните замени във V_H CDR3 са P98-Y99, което дава IC50 в РЕ38 имунотоксин 3.5 ng/ml, P98-N99, P98-W99 и P98-I99, всички от които имат IC50 4.5 ng, P98-F99, с IC50 6 ng, и Р98-Т99 има IC50 равна на родителския клон. (Условно, термин като “P98-Y99” означава, че аминокиселината пролин се появява в позиция 98 на обозначения пептид, в този случай MR1 V_H CDR3 и че тирозин се появява в позиция 99, но че остатъкът от молекулата е този на нормалния пептид, в този случай, родителското антитяло MR1).

По отношение мутацията на V_L CDR3, само една мутация, F92W, прави един имунотоксин по-активен в сравнение с родителя. Неговата IC50 е 1 -3 ng/ml . В този случай, “родителската” молекула е MR1 със замените P98-Y99 в V_H CDR3, което без добавената замяна в V_L CDR3 има 1С₅о 3-5 ng/ml. Този мутантен MR1, който комбинира мутации в CDR3 на V_H и V_L веригите (V_H S98P-T99Y-V_LF92W), е найцитотоксичната форма тестирана, когато е използуван като прицелваща част на един имунотоксин и понастоящем е обозначена като “MR 1-1”.

Тези резултати показват, че мутации в различни CDRs могат да имат адитивен ефект и могат да повишават цитотоксичността на получения имунотоксин. С оглед на тези резултати, мутации на аминокиселини в горещи точки на CDRs 1 и 2 на V_H и V_L вериги на MR1, е вероятно да имат за резултат антитела с допълнително подобрен афинитет за EGFRvlll и в имунотоксини с допълнително Y подобрена цитотоксичност, когато се сравняват с MR1.

Най-доброто време за анализ на клонове е рано по време на процеса. Задържане върху повърхността след максимумите на обогатяване може да бъде вредно поради риск от загуба на клонове. Възможно е Fvs с нисък афинитет, но висока експресия да бъдат преимуществено обогатени, докато добри съединители могат да се загубят. Данни подкрепящи това, са наблюдавани при задържане на повърхността на леко верижните CDR3 библиотеки: намерено е мугантно F92S с нисък афинитет (Kd 22пМ) в 7 от 10 клона, изследвани след третия кръг, докато най-добрият съединител, F92W е бил налице само веднъж. За разлика от това, във вторият кръг F92S е открит в 2 от 17 клона, докато F92W е бил налице в 6 от 17 клона.

IV. Анти-EGFRvlll антитела

Настоящето изобретение предоставя антитела, които се свързват с EGFRvlll с по-висок афинитет отколкото по-рано създадени антитела и които селективно реагират с EGFRvlll. Поспециално, изобретението предоставя антитела, които имат по-ниско Kd по отношение на EGFRvlll отколкото има MR1, най-доброто известно преди това scFv спрямо този антиген. Освен това, тези антитела образуват имунотоксини, които имат по-висока цитотоксичност за EGFRvlll-експресиращи клетки, отколкото има същия имунотоксин произведен с MR1. По-нататък изобретението предоставя метод за създаване на антитела с по-висок афинитет и по-голяма цитотоксичност срещу EGFRvlll отколкото има MR1. Имуноконюгатите представени по-долу прицелват EGFRvlll, като използуват антитела на настоящето изобретение. Тези антитела са селективно реактивни в имунологични условия спрямо тези детерминанти на EGFRvlll, които са представени по повърхността на ** клетки от бозайници и достъпни за антитялото от извънклетъчната среда.

В предпочитани изпълнения на настоящето изобретение, анти-EGFRvlll антитялото е рекомбинантно антитяло като scFv или дисулфидно стабилизирано Fv антитяло. Fv антитела са обикновено около 25 kDa и съдържат цялото антиген-свързващо място с 3 CDRs върху тежките и леките вериги. Ако V_H и V_L веригите са експресирани непоследователно, веригите на Fv антитялото обикновено са подържани заедно чрез нековалентни взаимодействия. Обаче, тези вериги имат тенденция към дисоциирани при разреждане, поради което са създадени методи за кръстосано свързване на веригите чрез глутаралдехид, вътремолекулни дисулфиди или пептиден линкер. Дисулфидни стабилизирани Fvs са изучени например, в U.S.Patent No. 5,747,654.

В особено предпочитано изпълнение, антитялото е едноверижно Fv (scFv). V_H и V_L областите на scFv включват единична верига, която е нагъната така че да създаде антиген свързващо място, сходно на това открито в двужерижни антитела. След като е нагънато, не-ковалентни взаимодействия стабилизират едноверижното антитяло. В едно по-предпочитано изпълнение, scFv е произведен рекомбинантно. Специалистът в тази област ще разбере, че могат да бъдат получени консервативни варианти на антителата на настоящето изобретение. Такива консервативни варианти използувани при scFv фрагменти, ще запазят критични аминокиселинни остатъци, необходими за точно нагъване и стабилизиране между V_H и V_L областите.

В някои изпълнения на настоящето изобретение, scFv антитялото е директно свързано с ефекгорната молекула (ЕМ) чрез леката верига. Обаче, scFv антитела могат да бъдат свързани с ЕМ чрез нейния амино или карбокси край.

Докато V_H и V_l областите на известни антитяло изпълнения могат да бъдат директно заедно свързани, специалистът в тази област ще оцени, че областите могат да бъдат отделени чрез пептиден линкер, състоящ се от една или повече аминокиселини. Пептидни линкери и тяхната употреба са добре известни в тази област. Виж, например Huston et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:5879 (1988); Bird et al., Science 242:4236 (1988); Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362 (1990); U.S.Patent No. 4,946,778, U..S. Patent No. 5,132,405 и Stemmer et al., Biotechniques 14:256-265 (1993), всички включени тук чрез цитат. Общо пептидният линкер ще има неспецифична биологична активност, различна от тази да свързва областите или да запази минимално разстояние или друго пространствено взаимоотношение между V_H и V_L. Обаче, аминокиселините съставляващи пептидния линкер, могат да бъдат подбрани да повлияват някои свойства на молекулата, като нагъване, заряд или хидрофобност. Едноверижни Fv (scFv) антитела включват по избор пептиден линкер с не повече от 50 аминокиселини, общо не повече от 40 аминокиселини, предпочитано не повече от 30 аминокиселени и още по-предпочитано не повече от 20 аминокиселини дължина. В някои изпълнения, пептидният линкер е конкатамер на последователността Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, предпочитано 2, 3, 4, 5, или 6 такива последователности. Обаче, трябва да се преценява, че могат да бъдат направени някои аминокиселинни замествания в рамките на линкера. Например, валин може да бъде заменен с глицин.

А. Получаване на scFvs

Както е описано по-горе, в предпочитани изпълнения, антитялото (например, прицелващата единица на имунотоксин) е scFv. Описани са методи за изготвяне на scFv антитела. Виж, Huse et al., по-горе; Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); и Vaughan et al., по-горе. Накратко, изолирана е мРНК от В-клетки и изготвена кДНК. кДНК е амплифицирана с добре известни техники, като PCR, с праймери специфични за променливите области на тежки и леки вериги на имуноглобулини. PCR продуктите са пречистени с например, агарозна гел електрофореза и са присъединени последователностите нуклеинова киселина. Ако се желае линкер пептид, последователности нуклеинова киселина, която кодира пептида, са вмъкнати чрез инсерция между последователности на тежките и леките вериги нуклеинови киселини. Последователностите ζ, могат да бъдат присъединени с техники известни в тази област, като лигиране на изравнени краища, инсерция на рестрикционни места при краищата на PCR продуктите или чрез снаждане чрез припокриващо се удължаване (Chowdhury et al., Mol.Immunol. 34:9 (1997)). След амплификация, нуклеиновата киселина, която кодира scFv е вмъкната във вектор, с техники известни в тази област. Предпочитано, векторът е способен да реплицира в прокариоти и да бъде експресиран в еукариоти и прокариоти. В предпочитано изпълнение, scFv гените са свързани с РЕ38 гена чрез къс линкер и клонирани в Т7-базиран експресионен вектор. В особено предпочитани изпълнения, scFv е експресиран под контрола на Т7 промотор в E.coli BL21 (ZDE3).

Както бе отбелязано в предишни раздели, scFv който специфично се свързва с EGFRvlll чрез задържане върху повърхност. Задържане върху повърхност може да бъде проведено с всеки от няколко метода. В предпочитан метод с оглед на настоящето изобретение, задържането може удобно да бъде проведено като се използуват клетки, експресиращи EGFRvlll на тяхната повърхност. Протокол за извършване на задържане като се използуват клетки, е представен в Примерите, по-долу. Задържане може също да бъде И»***·.

w изпълнено върху твърда повърхност, чрез покриване на твърда повърхност с EGFRvlll и инкубиране фага по повърхността за подходящо време при подходящи условия. Удобно, повърхността може да бъдат магнитни зърна. Несвързаните фаги са отмивани от твърдата повърхност и свързаните фаги са елюирани.

Намиране антитялото с най-висок афинитет е продиктувано от ефективността на селекционния процеса и зависи от броя на клоновете, които могат да бъдат подбрани и строгостта при която е направено. Обикновено, по-висока строгост съответствува на поселективно разстилане. Ако условията са твърде строги обаче, фагът няма да се свързва. След един кръг на задържане фагите, които се свързват с покритите с EGFRvlll платки или с клетки експресиращи EGFRvlll по тяхната повърхност, са развивани в E.coli и са подложени на друг кръг задържане. По този начин, се получава многократно обогатяване в 3 кръга на задържане върху повърхност. Така, дори когато обогатяването във всеки кръг е ниско, множество кръгове задържане ще доведат до изолиране на редки фаги и генетичният материал, в рамките на който кодира scFv с най-висок афиинитет или такъв, който е по-добре експресиран по фага.

Независимо от избрания метод за задържане върху повърхност, физикалната връзка между генотип и фенотип осигурена от фагов дисплей, прави възможно да се тестира всеки член на кДНК библиотика за свързване с антиген, дори с големи библиотеки от клонове.

В. Свързващ афинитет на антитела

Антителата на това изобретение се свързват с епитоп на EGFRvlll с Kd най-малко 1пМ по-виско от това на родителското антитяло MR1. Свързващият афинитет за прицелен антиген w обикновено е измерван или определен със стандартни антитялоантиген тестове, като конкурентни тестове, сатурационни тестове или имунотестове като ELISA или RIA.

Такива тестове могат да бъдат използувани за определяне дисоциационната константа на антитялото. Фразата “дисоциационна константа” се отнася за измерване афинитета на антитяло за антиген. Специфичност на свързване между антитяло и антиген съществува ако дисоциационната константа (Kd=1/K, където К е афинитетна константа) на антитялото е в микромоларния обхват, предпочитано <100пМ, най-предпочитано < 0.1 пМ. Молекули на антитяло обикновено ще имат Kd в по-ниските равнища. Kd = [Ab-Ag]/[Ab][Ag] където [АЬ] е концентрацията при равновесие на антитялото, [Ад] е концентрацията при равновесие на антигена и [Ab-Ад] е концентрацията при равновесие на антитяло-антиген комплекса. Обикновено, свързващите взаимодействия между антиген и антитяло включват обратими не-ковалентни асоциации, като електростатично привличане, Van der Waals сили и водородни връзки. Този метод за дефиниране свързваща специфичност, се прилага за единични тежки и/или леки вериги, CDRs, слети белтъци или фрагменти на тежки и/или леки вериги, които са специфични за EGFRvlll.

С. Имунотестове

Антителата могат да бъдат открити и/или количествено определени като се използуват известен брой признати имунологични свързващи тестове (виж, например U.S.Patents 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; и 4,837,168). За обзор на общите имунотестове, виж също METHODS IN CELL BIOLOGY, vol. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7^th Edition, Stites & Terr, eds. (1991). Имунологични свързващи тестове (или имунотестове) обикновено използуват лиганд (например, EGFRvlll) да w се свърже специфично за или често да имобилизира едно антитяло. Антителата използувани в имунотестове на настоящето изобретение са обсъдени по-подробно по-горе.

Имунотестове също често използуват маркиращ агент за да се свързва специфично и да маркира свързващия комплекс, образуван от лиганда и антитялото. Маркиращият агент може самият той да бъде една от единиците включени в антитяло/антиген комплекса, т.е. анти-EGFRvlll антитялото. По избор, маркиращият агент може да бъде трета единица, като друго антитяло, което специфично се свързва с антитяло/EGFRvlll белтъчния комплекс.

В един аспект, е предвиден конкурентен тест, където маркиращият агент е второ анти-EGFRvlll антитяло, носещо белега. След това двете антитела конкурират за свързване с имобилизиран EGFRvlll. В изпълнения където въпросът, на който трябва да бъде отговорено, е да се сравни афинитета на първото антитяло с този на MR1, второто антитяло може да бъде MR1. По избор, в неконкурентен формат, EGFRvlll антитялото е с липсващ белег, но второ антитяло, специфично за антителата на видовете, от които анти-EGFRvlll антитялото е производно, например, миши и което се свързва с анти-EGFRvlll антитялото, е белязано.

Други белтъци способни специфично да свързват имуноглобулинови константни области, като Протеин А или Протеин G могат също да бъдат използувани като маркиращия агент. Тези белтъци са нормални съставки на клетъчната стена на стафилококови бактерии. Те проявяват силна не-имуногенна реактивност с имуноглобулинови константни области от голямо видово разнообразие (виж общо, Kronval et al., J.Immunol. 111:14011406 (1973); и Akerstrom et al., J.Immunol. 135:2589-2542 (1985)).

Измежду тестовете, инкубация и/или измиващи етапи, могат да се изискват след всяка комбинация от реагенти. Етапите на С инкубация могат да варират от около 5 секунди до няколко часа, предпочитано от 5 минути до около 24 часа. Обаче, времето на инкубация може да зависи от формата на теста, антитяло, обем на разтвора, концентрации и подобни. Обикновено, тестовете се провеждат на стайна температура, въпреки че могат да бъдат извършвани в диапазон от температури, като 4°С до 40°С.

Докато детайлите на имунотестовете на настоящето изобретение могат да варират с дадения използуван формат, методът за откриване на анти-EGFRvlll антитела в проба съдържаща антителата, общо се характеризира с това, че включва етапи на контактуване на пробата с едно антитяло, което специфично реагира, при имунологично реактивни условия, с EGFRvIII/антитяло комплекса.

V. Получаване на имуноконюгати

Анти-EGFRvlll антителата създадени в настоящето изобретение могат да бъдат свързани с ефекторни молекули (ЕМ) чрез ЕМ карбоксилния край, ЕМ амино края, чрез вътрешен аминокиселинен остатък на ЕМ като цистеин, или всяка тяхна комбинация. Подобно на това, ЕМ може да бъде свързана директно с тежката, леката Fc (константна област) или рамкови области на антитялото. Връзка може да се появи чрез амино или карбокси краищата на антитялото, или чрез вътрешен аминокиселинен остатък. Ако РЕ или негов цитотоксичен фрагмент е използуван като ЕМ, връзките при или близо до карбоксилния край трябва да бъдат осъществени така, че да подържат, или да добавят (ако връзката е при С-края) една последователност, която функционира като сигнална последователност, да насочва молекулата в цитозола. Подходящи сигнални аминокиселинни последователности като REDLK (последователността на нативен РЕ, в еднобуквен код), KDEL, RDEL и повтори на KDEL, са известни в тази област. Виж например, w WO 91/18099. По-нататък, множествени ЕМ молекули (например, всяка една от 2-10) могат да бъдат свързани с анти-EGFRvlll антитялото и/или множествени антитела (например, всяко едно от 2 до 5) могат да бъдат свързани с една ЕМ. В особено предпочитано изпълнение, KDEL е С-крайната последователност. Молекулата образувана чрез свързването на една ефекторна молекула с едно антитяло е известна като имуноконюгат.

Терапевтичен агент е агент със специална биологична активност, насочена срещу дадена прицелна молекула или клетка, носеща прицелна молекула. Специалистът в тази област ще прецени, че терапевтичният агент може да включва различни лекарства, като vinblastine, daunomycin и подобни, цитотоксини като нативен или модифициран Pseudomonas екзотоксин или Diphteria токсин, инкапсулиращи агенти (например, липозоми), които самите съдържат фармакологични комбинации, радиоактивни агенти като ¹²⁵1, ³²Р, ¹⁴С, ³Н и ³⁵S и други маркери, прицелни единици и лиганди.

Изборът на даден терапевтичен агент зависи от дадената прицелна молекула или клетка и биологичния ефект, който се желае да бъде предизвикан. Така, например, терапевтичният агент може да бъде цитотоксин, който е използуван да предизвика смърт на дадена

Υ'· прицелна клетка. Обратно, където просто се желае да се предизвика не-летален биологичен отговор, терапевтичният агент може да бъде конюгиран с не-летален фармакологичен агент или липозома съдържаща не-летален фармакологичен агент.

С терапевтичните агенти и антитела предоставени тук, специалистът в тази област може да конструира разнообразие от клонове съдържащи функционално еквивалентни нуклеинови киселини, такива като нуклеинови киселини, които се различават с последователност, но които кодират същата ЕМ или антитяло последователност. Така, настоящето изобретение предоставя нуклеинови киселини, кодиращи антитела и конюгати и техни слети белтъци.

А. Рекомбинантни методи

Последователностите на нуклеинови киселини на настоящето изобретение, могат да бъдат изготвени по всеки подходящ метод, включително, например, клониране на подходящи последователности или чрез директна химична синтеза, с методи като фосфотриестерния метод на Narang et al., Meth. Enzymol. 68:9099 (1979); фосфодиестерния метод на Brown et al., Meth.Enzymol. 68:109-151 (1979); диетилфосфорамидитния метод на Beaucage et al., Tetra.Lett. 22:1859-1862 (1981); твърдофазния фосфорамидитен триестерен метод описан от Beaucage & Caruthers, Tetra.Letts. 22(20):1859-1862 (1981), например, използувайки автоматичен синтезатор както е описано, например Needham-VanDevanter et al., Nucl.Acids Res. 12:6159-6168 (1984); и твърдофазен support метод на U.S. Patent No. 4,458,066. Химичната синтеза произвежда едноверижен нуклеотид. Той може да бъде превърнат в двойновержна ДНК чрез хибридизация с комплементарна последователност, или чрез полимеризация с ДНК полимераза, като се използува едноверижна матрица. Специалистът в тази област ще разпознае, че докато химичната синтеза на ДНК е ограничена до последователности от около 100 бази, по-дълги последователности могат да бъдат получени чрез лигиране на по-къси последователности.

В предпочитано изпълнение, последователностите на нуклеинови киселини на това изобретение, се изготвят с техники за клониране. Примери за подходящо клониране и секвениращи техники, и инструкции, които са достатъчни да насочат специалистите чрез много опити за клониране, се намират в Sambrook et al., MOLECULAR C CLONING: A LABORATORY MANUAL (2^nd Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Berger and Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego CA (1987)), или Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Green Publishing and Wiley-lnterscience, NY (1987). Информация за продуктите от производители на биологични реагенти и експериментално оборудване, също предоставя полезна информация. Такива производители включват SIGMA chemical company (Saint Louis, MO), R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem. Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen (San Diego, СА) и PE Applied Biosystems (Foster Cuty, СА), както много други търговски източници известни в тази област.

Нуклеинови киселини кодиращи нативни ефекторни молекули (ЕМ) или анти-EGFRvlll антитела, могат да бъдат модифицирани за образуване на ЕМ, антитела или имуноглобулини на настоящето изобретение. Модификация чрез място-насочена мутагенеза, е добре известна в тази област. Нуклеинови киселини кодиращи ЕМ или анти-EGFRvlll антитела могат да бъдат амплифицирани чрез in vitro методи. Методи за амплификация включват полимеразна верижна реакция (PCR), лигазната верижна реакция (LCR), базирана на транскрипция амплификационна система (TAS) и само-подържаща последователността репликационна система (3SR). Голямо разнообразие от клониращи методи, клетки гостоприемници и in vitro амплификационни методологии са добре известни на специалиста в тази област.

В предпочитано изпълнение, имуноконюгати са изготвяни W чрез вмъкване на кДНК, която кодира едно анти-EGFRvlll scFv антитяло във вектор, който съдържа кДНК кодираща ЕМ. Инсерцията е правена така, че scRv и ЕМ се четат в рамка, която е един непрекъснат полипептид, който съдържа функционална Fv област и функционлана ЕМ област. В особено предпочитано изпълнение кДНК, кодираща фрагменти на Diphteria токсин, е лигирана с scFv така, че токсинът е локализиран при амино края на scFv. В най-предпочитано изпълнение, кДНК кодираща РЕ или негов цитотоксичен фрагмент, е лигирана с scFv така, че токсинът е локализиран при карбоксилния край на scFv. В най-предпочитано изпълнение, цитотоксичният * фрагмент е РЕ38.

След като нуклеиновите киселини кодиращи ЕМ, антиEGFRvlll антитяло или имуноконюгат на настоящето изобретение са изолирани и клонирани, може да се експресира желания белтък в рекомбинантно манипулирана клетка като бактериална, растителна, дрождена, от насекоми или клетки от бозайници. Очаква се, че специалистът в тази област е запознат с многобройните експресионни системи, които са на разположение за експресия на белтъци, включително E.coli, други бактериални гостоприемници, дрожди и различни по-висши еукариотни клетки като COS, СНО, HeLa и миеломни клетъчни линии. Не е направен опит да се опишат подробно различните известни методи за експресия на белтъци в прокариоти и еукариоти. Накратко, експресията на природни или синтетични нуклеинови киселини, кодиращи изолираните белтъци на изобретението, обикновено може да бъде постигната чрез оперативно свързване на ДНК или кДНК с промотор (който е конститутивен или индуцируем), последвано от включване в експресионна касета. Касетата може да бъде подходяща за репликация и интегриране на прокариоти или еукариоти. Типична експресионна касета съдържа транскрипционни и транслационни терминатори, иницииращи последователности и промотори, които са полезни за регулация експресията на ДНК кодираща белтъка. За удобство, касетата може да бъде поставена в плазмиди, които също съдържат един или повече резистентни на антибиотик гени. За получаване високо ниво на експресия на клониран ген, желателно е да се конструира експресионна касета, която съдържа минимум един силен промотор да насочва транскрипцията, едно рибозомно свързващо място за инициация на превеждането и транскрипционно/транслационен терминатор. За E.coli това включва промотор като Т7, trp, lac или ламбда промотори, едно рибозомно свързващо място и предпочитано един завършващ транскрипцията сигнал. За еукариотни клетки, контролната последователност може да включва един промотор и предпочитано един усилвател (enhancer) производен на имуноглобулинови гени, SV40, цитомегаловирус и полиаденилирана последователност и може да включва снаждащ донор и акцепторни последователности. Касетите на изобретението могат да бъдат пренесени в избраната клетка гостоприемник с добре известни методи, като калциев хлорид трансформация или електропорация за E.coli и калциев фосфат третиране, елекгропорация или липофекция на клетки от бозайници. Клетки трансформирани с касетите, могат да бъдат отбрани чрез резистентност към антибиотици, придадена от гени за резистентност, съдържащи се в касетата, като amp, кап, gpt, neo и hyg гени. Резистентност към kanomycin и резистентност към ampicillin са предпочитани изпълнения за работа с фаги.

Специалистът в тази област може да прецени, че могат да бъдат направени модификации на нуклеинова киселина, кодираща полипептид на настоящето изобретение (т.е. анти-EGFRvlll антитяло, РЕ или имуноконюгат, образуван от тяхна комбинация) без да се намалява нейната биологична активност. Някои модификации могат да бъдат направени за улеснение клонирането, експресията или включването на прицелващи молекули в слет белтък. Такива модификации са добре известни на специалиста в тази област и включват, например, метионин прибавен при амино края за осигуряване на място за инициация, или допълнителни аминокиселини (например, поли His) поставени или на края за създаване на удобно локализирани рестрикционни места или завършващи кодони, или пречистващи последователности.

В допълнение на рекомбинантните методи, имуноконюгатите, ЕМ и антитела на настоящето изобретение, могат да бъдат конструирани изцяло или отчасти, като се използува стандартна пептидна синтеза. Твърдофазна синтеза на полипептиди на настоящето изобретение на по-малко от 50 аминокиселини дължина, може да бъде изпълнена чрез прикачване на С-терминална аминокиселинна последователност към неразтворима подложка (support) последвано от последователно добавяне на останалите аминокиселини на последователността. Техники за твърдофазна синтеза са описани от Barany & Merrifield, The PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BI0L0GY.V0L.2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. pp. 3-284; Merrifield et al., J.Am.Chem.Soc.

85:2149-2156 (1963) и Stewart et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2^nd ED. .Pierce Chem.Co., Rockford, III. (1984). Белтъци c по-голяма дължина могат да бъдат синтезирани чрез кондензация на амино и корбоксилни краища на по-къси фрагменти. Методи за образуване на пептидни връзки чрез активиране на карбоксилен терминален край (например, чрез употреба на свързващ реагент Ν,N’дициклохексилкарбодиимид) са известни на специалиста в тази област.

В. Пречистване

След експресиране, рекомбинантните имуноконюгати, антитела и/или ефекгорни молекули на настоящето изобретение, могат да бъдат пречистени съгласно стандартни процедури в тази област, включително утаяване с амониев сулфат, афинитетни колони, йонообменни и гел филтрационни колони и batch хроматография и подобни (виж, общо, R.Scopes,PROTEIN PURIFICATION, SpringerVerlag, N.Y. (1982)). Значително чисти препарати от най-малко около 90-95% хомогенност са предпочитани и 98 до 99% или повече хомогенност са най-предпочитани за фармацевтична употреба. След пречистване, частично или до хомогенност, според желанието, ако ще се употребяват терапевтично полипептидите, трябва да бъдат съществено свободни от ендотоксин.

Методи за експресия на едноверижни антитела и/или ренатуриране до подходяща активна форма, включително едноверижни антитела, от бактерии като E.coli, са описани и добре известни и са приложими за антителата на това изобретение. Виж, Buchner et al., Anal.Biochem. 203:263-270 (1992); Pluckthun,

Biotechnology 9:545 (1991); Huse et al., Science 246:1275 (1989) и Ward et al., Nature 341:544(1989), всички включени тук чрез цитат.

Често, функционално хетероложни белтъци от E.coli или други бактерии, са изолирани от включващи телца и изискват стабилизиране като се използуват силни денатуриращи вещества и последващо ренатуриране. По време на етапа на стабилизиране, както е добре известно в тази област, трябва да присъствува редуциращ агент, за да редуцира дисулфидните мостове. Като примерен буфер с редуциращ агент е: 0.1М Трие pH 8, 6М гуанидин, 2mM EDTA, О.ЗМ DTE (дитиоеритрол). Реоксидиране на дисулфидните мостове може да се появи в присъствието на реагенти с нискомолекулни тегла и редуцирани и окислени форми, както е ** описано в Saxena et al., Biochemistry 9:5015-5021 (1970), включена тук чрез цитат и специално описани от Buchner et al., по-горе.

Ренатурация обикновено е изпълнявана чрез разреждане (например 100-кратно) на денатуриран и редуциран белтък в ренатуриращ буфер. Един примерен буфер е 0.1 М Трие, pH 8.0, 0.5 М L-аргинин, 8тМ оксидиран глутатион (GSSG) и 2mM EDTA.

Като модификация на метода за пречистване на двуверижно антитяло, леко и тежковерижните области са отделно солюбилизирани и редуцирани и след това комбинирани в ренатуриращия разтвор. Получен е предпочитан добив, когато тези два белтъка са смесени в моларно отношение, като 5-кратеният моларен излишък на единия белтък спрямо другия не е превишен. Желателно е да се добави излишък от окислен глутатион или други оксидиращи нискомолекулни съединения към ренатуриращия разтвор след като редокс-преразпределението е завършено.

VI. Pseudomonas екзотоксин и други токсини

Токсини могат да бъдат използувани с антитела на настоящето изобретение за получаване на имунотоксини. Примерни токсини включват ricin, abrin, diphteria токсин и техни субединици, както и ботулинови токсини А до F. Тези токсини са достъпни от търговски източници (например, Sigma Chemical Company, St.Louis, MO). Diphteria токсин е изолиран от Corynebacterium diphteriae. Рицин е пектинът RCA60 от Ricinus communis (Castor bean). Терминът също се отнася за техни токсични варианти. Например, виж, U.S.Patent Nos. 5,079,163 и 4,689,401. Ricinus communis аглутинин (RCA) се проявява в две форми обозначени RCAeo и RCA-I20, според техните молекулни тегла от около 65 и 120 kD, съответно (Nicholson & Blaustein, J.Biochim.Biophys.Acta 266:543 (1972)). А веригата е отговорна за инактивиране на белтъчната синтеза и убиване на клетки. В веригата свързва рицин с галакгозни остатъци на клетъчната повърхност и улеснява транспорта на А веригата в цитозола (Olsnes et al., Nature 249:627-631 (1974) и U.S.Patent No. 3,060,165).

Абрин включва токсични пектини от Abrus precatorius. Токсичните принципи, абрин a, b, с nd имат молекулни тегла от около 63 и 67 kD и са съставени от две дисулфидно-свързани полипептидни вериги А и В. А веригата инхибира белтъчна синтеза; В-веригата (абирн-b) се свързва с D-голактозни остатъци (виж, Funatsu et al., Agr.Biol.Chem. 52:1095 (1988); и Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335 (1978)).

В предпочитани изпълнения на настоящето изобретение, токсинът е един Pseudomonas екзотоксин А (РЕ). Нативен РЕ е изключително активен мономерен белтък (молекулно тегло 66kD), секретиран от Pseudomonas aeruginosa, който инхибира белтъчна синтеза в еукариотни клетки. Нативната РЕ последователност е предоставена от U.S.Patent No. 5,602,095, включен тук чрез цитат. Методът за действие е инактивиране на удължаващ фактор 2 (elongation factor 2, EF-2) с АДФ-рибозилиране. Ендотоксинът съдържа три структурни домена, които действуват съгласувано за предизвикване на цитотоксичност. Домен 1а (аминокиселини 1-252) медиира клетъчно свързване. Домен II (аминокиселини 253-364) е отговорен за преместване в цитозола и домен III (аминокиселини 400613) медиира АДФ рибозилиране на удължаващ фактор 2. Функцията на домен lb (аминокиселини 365-399) остава неопределена, въпреки че част от него, аминокиселини 365-380, може да бъде делетирана без загуба на цитотоксичност.

Терминът “Pseudomonas екзотоксин” както тук е използуван, се отнася за нативна последователност, цитотоксични фрагменти на нативната последователност и консервативно модифицирани варианти на нативен РЕ и негови цитотоксични фрагменти. В предпочитани изпълнения, РЕ молекулата е модифицирана за да отпадне домен la, за редуциране или елиминиране на неспецифично свързване на токсина. Цитотоксични фрагменти на РЕ включват такива, които са цитотоксични със или без последващо протеолитично или друго процесиране в прицелната клетка (например, като един белтък или προ-белтък). Цитотоксични фрагменти на РЕ включват РЕ40, РЕ38 и РЕ35. РЕ40 е скъсено производно на РЕ както е описано по-рано в тази област. Виж, Pai et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3358-62 (1991); и Kando et al., J.Biol.Chem. 263:9470-9475 (1988). PE35 е един 35kD карбоксилтерминален фрагмент на РЕ, съставен от един метионин в позиция 280, последван от аминокиселини 281-364 и 381-613 на нативен РЕ. РЕ38 е скъсен РЕ προ-белтък, съставен от аминокиселини 253-364 и 381-613 на РЕ. РЕ38 е активиран до неговата токсична форма с процесиране вътре в клетката (виж, U.S.Patent No. 5,608,039, включен тук чрез цитата).

В особено предпочитано изпълнение, РЕ38 е токсичната единица на имунотоксина на това изобретение. Цитотоксичните фрагменти РЕ35 и РЕ40, обаче, също могат да бъдат използувани;

тези фрагменти са представени в U.S.Patents 5,602,095 и 4,892,827 всеки, от които е включен тук чрез цитат. Въз основа на работа изпълнена с MR1-базирани имунотоксини, KDEL е предпочитана модификация на С-крайната последователност (виж, Lorimer et al., PrOC.Natl.Acad.Sci.USA 93:14815-14820 (1996).

А. Консервативно модифицирани варианти на РЕ

Консервативно модифицирани варианти на РЕ или негови цитотоксични фрагменти, имат най-малко 80% сходство на последователностите, предпочитано най-малко 85% сходство на последователностите, по-предпочитано най-малко 90% сходство на последователностите и най-предпочитано, най-малко 95% сходство на последователностите на аминокиселинно ниво, с РЕ от интерес, такива като РЕ38.

Терминът “консервативно модифицирани варианти” се прилага за последователности на аминокиселини и нуклеинови киселини. По отношение на дадени последователности на нуклеинови киселини, консервативно модифицирани варианти се отнасят за онези последователности на нуклеинови киселини, които кодират идентични или съществено идентични аминокиселинни последователности, или ако нуклеиновата киселина не кодира аминокиселинна последователност, за съществено идентични последователности на нуклеинови киселини. Поради дегенерацията на генетичния код, голям брой функционално идентични нуклеинови киселини кодират всеки даден полипептид. Например, кодоните GCA, GCC, GCG и GCU всичките кодират аминокиселината аланин. Така, при всяка позиция, където аланин е специфициран от кодон, кодонът може да бъде променен във всеки от съответните кодони, описани без да се променя кодирания пептид. Такива вариации на нуклеинови киселини са “тихи вариации”, които са един вид консервативно модифицирани вариации. Всяка последователност на нуклеинова киселина тук, която кодира един полипептид, също описва всяка възможна тиха вариация на нуклеинова киселина. Специалистът в тази област, ще прецени, че всеки кодон в една нуклеинова киселина (с изключение на AUG, който по правило е единственият кодон за метионин, и UGG, който е единствения кодон за триптофан) може да бъде модифициран, за получаване на функционално идентична молекула. Съответно на това, всяка тиха вариация на нуклеинова киселина, която кодира един полипептид, се съдържа във всяка описана последователност.

Що се отнася до аминокиселинни последователности, специалистът в тази област ще разпознае, че индивидуални замествания, делеции или добавяния към последователност на нуклеинова киселина, пептид, полипептид или белтък, които променят, добавят или делетират една аминокиселина или малък процент от аминокиселини в кодираната последователност, е “консервативно модифициран вариант”, където промяната води до заместването на една аминокиселина с химически сходна аминокиселина.

В. Изпитване за цитотоксичност на РЕ

Pseudomonas екзотоксини, използувани в изобретението, могат да бъдат тестирани за желано ниво на цитотоксичност с тестове, добре известни в тази област. Например, цитотоксичност често е измервана като е използувано инхибиране с Pseudomonas екзотоксин на белтъчна синтеза като заместителна мярка. Виж, например, Lorimer et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14815-14820 (1996) на 14818. Удобно, това може да бъде извършено, чрез измерване поглъщането на радиоактивно белязана аминокиселина (както е указано в Prior et al., Cell 64:1017-1023 (1991)) от клетки, които юрмално не експресират EGFRvlll, но които са трансфектирани с EGFRvlll кДНК. В примерите по-долу, включването на белязан по тритий левцин е измервано в NR6M клетки (Swiss ЗТЗ клетки, подбрани поради липса на експресия на миши EGFR и трансфектирани с човешка RGFRvlll кДНК). Така, цитотоксични фрагменти на РЕ и консервативно модифицирани варианти на такива фрагменти могат да бъдат тестирани за цитотоксичност.

Могат да бъдат тестирани едновременно голям брой кандидати РЕ молекули за цитотоксичност с методи известни в тази област. Например, подгрупи на кандидат молекули могат да бъдат тестирани за цитотоксичност. Положително реагиращи подгрупи на кандидат молекули, могат последователно да бъдат подразделени и тестирани повторно докато се идентифицират желани цитотоксични фрагмент(и). Такива методи позволяват бързо подбиране на голям брой цитотоксични фрагменти или консервативни варианти на РЕ.

С. Други терапевтични единици

Антитела на настоящето изобретение могат също да бъдат използувани за прицелване на всякакъв брой различни диагностични или терапевтични съединения към клетки, експресиращи EGFRvlll по тяхната повърхност. Така антитяло на настоящето изобретение, като едно анти-EGFRvlll scFv, може да бъде прикачено директно или чрез линкер за лекарство, което се доставя директно до клетките носещи EGFRvlll. Терапевтични агенти включват такива съединения като нуклеинови киселини, белтъци, пептиди, аминокиселини или производни, гликопротеини, радиоизотопи, липиди, въглехидрати, или рекомбинантни вируси. Терапевтични и диагностични единици на нуклеинови киселини включват антисенз нуклеинови киселини, дериватизирани олигонуклеотиди за ковалентно кръстосано

Sn*· свързване с единична или двойна ДНК и триплекс образуващи олигонуклеотиди.

По избор, молекулата свързана с едно анти-EGFRvlll антитяло може да бъде инкапсулираща система, като липозома или мицел, които съдържат терапевтичния състав като лекарство, нуклеинова киселина (например, антисенз нуклеинова киселина) или друга терапевтична единица, която е предпочитано защитена от директно излагане на циркулаторната система. Средства за изготвяне на липозоми, прикачени за антитела, са добре известни на специалистите в тази област. Виж, например, U.S.Patent No. 4,957,735; и Connor et al., Pharm.Ther. 28:341-365 (1985).

D. Откриваеми маркирания

Антитела на настоящето изобретение могат по избор да бъдат ковалентно или не-ковалентно свързани с откриваем белег. Откриваеми маркирания, подходящи за такова приложение, включват всеки препарат откриваем със спектроскопски, фотохимически, биохимични, имунохимични, елекгрични, оптични или химични средства. Полезни маркирания в настоящето изобретение включват магнитни зърна (например, DYNABEADS), флуоресцентни багрила (например, флуоресцеин изотиоцианат, Texas red, rhodamin, green fluorescent protein и подобни), радиобелязане( например, ³Н, ¹²⁵l, ³⁵S, ¹⁴С или ³²Р), ензими (например, horse radish peroxidase (пероксидаза от хрян) алкална фосфатаза, луцифераза и други, обикновено използувани при ELISA) и колориметрични белези, като колоидално злато или зърна от цветно стъкло или от пластмаса (например, полистирен, полипропилен, латекс и др.)

Средства за откриване на такива белези са добре известни на специалиста в тази област. Така, например, радиобелязане може да бъде открито като се използува фотографски филм или щинтилационни броячи, флуоресцентни маркери могат да бъдат открити с фотодетектор за откриване емитирана светлина. Ензимни маркери обикновено се откриват, като ензима се снабдява със субстрат и се открива реакционния продукт, получен от действието на ензима върху субстрата и колориметрични белези се откриват с просто визуализиране на цветния белег.

Е. Конюгация с антитялото

В едно не-рекомбинантно изпълнение на изобретението, ефекторни молекули, например, терапевтични, диагностични или ^w детектирани единици, са свързани с анти-EGFRvlll антителата на настоящето изобретение, използувайки всякакъв брой средства, известни на специалиста в тази област. Могат да бъдат използувани средства за ковалентно и не-ковалентно прикрепяне с анти-EGFRvlll антитела на настоящето изобретение.

Процедурата за прикачване на ефекторна молекула за едно антитяло може да варира, в зависимост от химичната структура на ЕМ. Полипептиди обикновено съдържат разнообразие от функционални групи; например, карбоксилова киселина (СООН), свободна амино (-NH2) или сулфхидрилна (-SH) групи, които са на разположение за реакция с подходяща функционална група на антитяло, които да се свържат с ефекгорната молекула.

По избор, антитялото е дериватизирано за да изложи или прикачи допълнителни реактивни функционални групи. Дериватизацията може да включва прикачване на всяка от известен брой линкерни молекули, като тези достъпни от Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.

“Линкер”, както тук е използувано, е молекула, която е използувана да свърже антитялото с ефекгорната молекула. Линкерът е способен да образува ковалентни връзки с антитялото и с зфекгорната молекула. Подходящи линкери са известни на специалистите в тази област и включват, но не се ограничават до линкери с прави или разклонени въглеродни вериги, хетероциклични въглеродни линкери или пептидни линкери. Там където антитялото и ефекторната молекула са полипептиди, линкерите могат да бъдат свързани с аминокиселините, които са съставни части, чрез техни странични групи (например, чрез дисулфидна връзка с цистеин). Обаче, в предпочитано изпълнение, линкерите ще се свързват с алфа въглеродни амино и карбоксилни групи на крайните аминокиселини.

В известни условия, е желателно да се освободи — ефекторната молекула от антитялото, когато имуноконюгатът е достигнал неговото прицелно място. Следователно, при тези условия, имуноконюгати ще съдържат връзки, които са разцепващи се в близост до прицелното място. Разцепване на линкера за освобождаване на ефекторната молекула от антитялото, може да бъде ускорено с ензимна активност или условия, при които имуноконюгатът е изложен или вътре в прицелната клетка или в близостта на прицелното място. Когато прицелното място е тумор, може да бъде използуван линкер, който се разцепва при условия, които са налице в мястото на тумора (например, когато е изложен на туморно-свързани ензими или киселинно pH).

С оглед на големия брой методи, които са съобщени за прикачване на разнообразие от радиодиагностични съединения, радиотерапевтични съединения, лекарства, токсини и други агенти за антитела, специалистът в тази област ще бъде в състояние да определи подходящ метод за прикачване на даден агент за антитяло или друг полипептид.

VII. Фармацевтични препарати и въвеждане

Антитялото и/или имуноконюгатните препарати на това изобретение (т.е. РЕ свързан с едно антитяло с Kd за един епитоп на EGFRvlll най-малко 1пМ по-ниско от това на MR1), са полезни за въвеждане в мозъка. Употреба на имунотоксини за мозъчна туморна терапия, наскоро е обобщена от Oldfield, Е., and Youle, R., Curr.Top.Microbiol.Immunol. 234:97-114 (1998). Малки полипептиди преминават кръвно-мозъчната бариера. За по-дълги полипептиди, които не преминават кръвно-мозъчната бариера, са известни методи за въвеждане на белтъци в мозъка. Например, белтъци, полипептиди и други съединения и клетки могат да бъдат доставени до мозъка на бозайници чрез интрацеребровентрикуларна инжекция (ICV) или с канюла (виж, например, Motta & Martini, Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 168:6264 (1981); Peterson et al., Biochem.Pharmacol. 31:2807-2810 (1982); Rzepczynski et al., Metab.Brain Dis. 3:211-216 (1988); Leibowitz et al., Brain Res.Bull. 21:905-912 (1988); Sramka et al., Stereotect.Funct. Neurosurg. 58:79-83 (1992); Peng et al., Brain Rers. 632-57-67 (1993); Chem et al., Exp.Neurol. 125&72-81 (1994); Nikkhah et al., Neuroscience 63:57-72 (1994); Anderson et al., J.Comp.Neurol. 357:296-37 (1995); и Breckmnell & Fawcett, Exp.Neurol. 138:338-344 (1996)).

Така, например, глиобластома може да бъде третирана чрез локализирано доставяне с канюла или спринцовка до тъканта заобикаляща тумора, или по-общо в компартмента на централната нервна система чрез ICV. В допълнение, имуноконюгатите могат да бъдат въведени системно, където например, глиобластомата на пациента е увредила епителните клетки, достатъчно да позволи пробив на кръвно-мозъчната бариера.

Антитялото или имуноконюгати на изобретението, могат също да бъдат въведени локално или системно за лечение на карциноми на гърдата, яйчниците и белодробен карцином. Например, злокачествени образования могат да бъдат третирани с директно инжектиране в тумора, който не може хирургически да бъде изрязан. Тези карциноми могат също да бъдат третирани с парентерално въвеждане на имуноконюгати например, за локализиране и убиване на метастатични клетки, които още не са образували тумори с достатъчна големина, за да бъдат третирани с олъчване, хирургично лечение или в действителност, пряко да бъдат открити.

Препаратите за въвеждане обикновено съдържат разтвор на антитяло и/или имуноконюгат разтворен във фармацевтично приемлив носител, предпочитано воден носител. Може да бъде ^w използувано разнообразие от водни носители, например, буфериран физиологичен разтвор и подобни. Тези разтвори са стерилни и общо свободни от нежелани примеси. Тези препарати могат да бъдат стерилизирани с конвенционални, добре известни техники за стерилизация. Препаратите могат да съдържат фармацевтично приемливи помощни вещества, както се изисква за приближаване до физиологичните условия като pH нагласяне и буфериращи агенти, нагласящи токсичността агенти и подобни, например, натриев ацетат, натриев хлорид, калиев хлорид, калциев хлорид, натриев лактат и подобни. Концентрацията на слетия белтък в тези комбинации може С да варира широко и ще бъде подбрана първоначално въз основа обеми на течности, вискозитети, телесно тегло и подобни, в съответствие с дадения начин на въвеждане, подбран за нуждите на пациента.

Така, типичен фармацевтичен състав на имунотоксин на настоящето изобретение, за въвеждане в мозъка, ще бъде около 1.2 до 1200 pg дневно. Типичен състав за интравенозно въвеждане за лечение карцином на гърдата, на яйчниците или белодробен карцином, са около 0.1 до 10 mg за пациент дневно. Дозировки от 0.1 до около 100 mg за пациент дневно, могат да бъдат използувани, по60 специално ако лекарството е въвеждано в изолирано място и не в кръвоносната или лимфната система, като в телесна кухина или в лумен на даден орган. Актуални методи за изготвяне препарати, които могат да бъдат въвеждани, биха били известни или очевидни за специалиста в тази област и са описани в повече подробности в такива публикации като REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1995).

Препаратите на настоящето изобретение могат да бъдат въвеждани за терапевтично третиране. При терапевтични приложения, препарати са въвеждани на пациент страдащ от заболяване, като глиобластома, карцином на гърдата, карцином на яйчниците или белодробен карцином, в количество достатъчно наймалко да забави или да спре заболяването или неговите усложнения. Количеството адекватно да изпълни това се определя като “терапевтично ефективна доза”. Количества ефективни за това приложение, ще зависят от тежестта на заболяването и общото здравословно състояние на пациента. Ефективно количество от съединението е това, което осигурява субективно облекчение на симптом(и) или обективно идентифицирано подобрение, отбелязано от клинициста или друг квалифициран наблюдател.

Еднократно или многократни приложения на препаратите са въведени в зависимост от дозировката и честотата, както се изисква и се понася от пациента. При всеки случай, препаратът трябва да осигури достатъчно количество от белтъците на това изобретение, за ефективно лечение на пациента. Предпочитано, дозировката се въвежда еднократно, но може да бъде прилагана периодично докато се постигне терапевтичен резултат или докато странични ефекти ще предизвикат прекъсване на терапията. Общо, дозата е достатъчна да лекува или подобрява симптоми или признаци на заболяване, без да предизвиква неприемлива токсичност у пациента.

Парентерални комбинации c контролирано освобождаване на препарати с имуноконюгати на настоящето изобретение, могат да бъдат изготвени като импланти, маслени инжекции или като партикулни системи. За широк обзор на белтък предоставящи системи виж, Banga, A.J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995) включени тук чрез цитат. Партикулни системи включват микросфери, микрочастици, микрокапсули, нанокапсули, наносфери и наночастици. Микрокапсули съдържат терапевтичен белтък като централна сърцевина. В микросфери лекарството е диспергирано в частица. Частици, микросфери и микрокапсули по-малки от около pm общо са означени като наночастици, наносфери и нанокапсули, съответно. Капиляри имат диаметър от приблизително 5рт, така само наночастици са въвеждани интравенозно. Микрочастици обикновено са около ЮОрт диаметър и са въвеждани подкожно или интрамускулно. Виж, например, Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J.Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994); и Tice & Tabibi, TREATISE ON COTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp.315-339 (1992) и двете включени тук чрез цитат.

Полимери могат да бъдат използувани за йонноконтролирано освобождаване на препарати от имуноконюгати на настоящето изобретение. Различни разграждащи се и неразграждащи се полимерни матрикси за употреба при контролирано предоставяне на лекарство, са известни в тази област (Langer, R., Accounts Chem.Res. 26:537-542 (1993)). Например, блок кополимерът, polaxamer 407 съществува като вискозна все още подвижна течност при ниска температура, но образува полу-твърд гел при телесна температура. Показано е, че е ефективен вехикулум за комбиниране и продължително освобождаване на рекомбинантен интерлевкин-2 и уреаза (Johnston et al., Pharm.Res. 9:425-434 (1992); и Pec et al., J.Parent.Sci.Tech. 44(2):58-65 (1990)). По избор, хидроксиапатит е използуван като микроносител за контролирано освобождаване на белтъци (Ijntema et al., Int.J.Pharm. 112:215-224 (1994)). В друг аспект, липозоми са използувани за контролирано освобождаване както и лекарство прицелващо липид-капсулираното лекарство (Betageri et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Известни са много допълнителни системи за контролирано предоставяне на терапевтични белтъци. Виж, например, U.S.Pat. No. 5,055,303, 5,188,837, 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, 4,957,735 и 5,019,369, 5,055,303; 5,514,670; 5,413,797; 5,268,164; 5,004,697; 4,902,505; 5,506,206; 5,271,961; 5,254,342 и 5,534,496, всеки от които е включен тук чрез цитат.

Измежду различните приложения на имунотоксините на настоящето изобретение, са включени болестни състояния, предизвикани от специфично експресиращ се в човешки клетки EGFRvlll, който може да бъде елиминиран чрез токсично действие на имуноконюгата. Едно предпочитано приложение за имунотоксините на изобретението, е третирането на злокачествени клетки експресиращи EGFRvlll. Примерни злокачествени клетки включват клетки на глиобластома, на карцином на гърдата, на карцином на яйчниците и белодробен карцином.

VIII. Диагностични китове и in vitro приложения

В друго изпълнение, това изобретение предоставя китове за откриване на EGFRvlll в биологична проба. “Биологична проба”, както тук е използувано, е проба от биологична тъкан или течност, която съдържа EGFRvlll. Такива проби включват, но не се ограничават до, тъкан от биопсия, храчки, амниотична течност, кръв и кръвни клетки (например бели кръвни клетки). Проби от течности могат да представляват известен интерес, но общо не са предпочитани тук, тъй като откриваеми концентрации на EGFRvlll рядко се установяват в такива проби. Биологични проби също включват тъканни срези, като замразени срези взети за хистологични цели. Една биологична проба обикновено е получена от многоклетъчен еукариот, предпочитано бозайник, като плъх, мишка, крава, куче, морско свинче или заек и попредпочитано примат, като макак, шимпанзе. Най-предпочитано, биологичната проба е от човек.

Китовете обикновено включват едно анти-EGFRvlll scFv на настоящето изобретение, което има по-висок афинитет за EGFRvlll отколкото MR1 scFv.

В допълнение, китовете обикновено включват материали инструкции, представящи начини за употреба антитяло на настоящето изобретение (например, за откриване на EGFRvlllсъдържащи клетки в една проба). Китовете могат също да включват допълнителни компоненти за улеснение на даденото приложение, за което е предвиден кита. Така, например, може допълнително да съдържа начини за откриване на белег (например, ензимни субстрати за ензимно белязане, набори филтри за откриване флуоресцентно белязане, подходящи вторични белези, като овчи анти-HRP, или подобни). Китовете могат допълнително да съдържат буфери и други реагенти, рутинно използувани за практиката на даден метод. Такива китове и подходящо съдържание, са добре известни на специалистите в тази област.

В едно изпълнение на настоящето изобретение, диагностичен кит съдържа един имунотест. Както е описано по-горе, въпреки че детайлите за имунотестовете на настоящето изобретение могат да варират за дадения използуван формат, методът за откриване на EGFRvlll в биологична проба, общо включва етапите на .онтактуване на биологичната проба с едно антитяло, което специфично реагира, в имунологично реактивни условия, с EGFRvlll с по-висок афинитет за EGFRvlll отколкото MR1 scFv. Антитялото е оставено да се свърже с EGFRvlll в имунологично реактивни условия, и наличието на свързано антитяло е откривано директно или индиректно.

Поради повишения афинитет на антителата създадени с методите указани тук и на scFv обозначено MR1-1, в частност, антителата предоставени тук ще бъдат особено полезни като диагностични агенти и при in vitro тестове за откриване наличието на EGFRvlll в биологични проби. Например, MR1-1 и други антитела изготвени с методите, които тук са указани, могат да бъдат използувани като прицелващи единици на имуноконюгати при имунохистохимични тестове, за определяне дали дадена проба съдържа клетки експресиращи EGFRvlll. Ако пробата е такава, взета от тъкан на пациент, която нормално не трябва да експресира EGFRvlll, откриването на EGFRvlll ще означава или, че пациентът има карцином характеризиращ се с наличието на EGFRvlllекспресиращи клетки, или че лечението за такъв карцином не е било успешно за премахване на рака. Специалистите в тази област ще преценят, че анти-EGFRvlll антителата на изобретението, свързани с подходящ белег, могат подобно да бъдат използувани in vivo за откриване наличието на EGFRvlll експресиращи клетки, при което показвайки, че пациентът има рак характеризиращ се с наличието на EGFRvlll-експресиращи клетки, или че лечението за такова раково заболяване не е било успешно за премахване на рака.

ПРИМЕРИ

Пример 1

Стратегия за създаване антитела с по-добро свързване отколкото това на MR1.

За откриване антитела с по-добро свързване с EGFRvlll от това на MR1, е направена фагов дисплей библиотека с MR1 scFv. Случайни мутации са въведени в тежковерижната определяща комплементарността област 3 (V_HCDR3), един район, който има главна роля при антигенното свързване (MacCallum et al., J.Mol.Biol. 262:732-745 (1996)). Задържане върху повърхност на клетки експресиращи EGFRvlll, произвежда няколко мутанти, които когато се използуват за конструиране имунотоксини, имат подобрен афинитет, цитотоксичност и добив. Анализ на тези варианти разкрива, че те всички имат мутации локализирани в район на V_HCDR3, който се определя като гореща точка за хипермутация (Neuberger et al., Curr.Opin.lmmunol. 7:248-254 (1995); Jolly, C.J., Semin.Immunol. 8:159168 (1996); Neuberger et al., Immunological Rev. 62:107-116 (1998)). Горещи точки са определени чрез консензус последователностите G/A-G-T/C-A/T или A-G-СЯ. Последната съдържа серинови кодони, открити в гените на променливия домен на антитела (Goyenechea et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13979-13984 (1996)). Горещите точки са области, които мутират при висока честота по време на зреенето на антитела. Задържане върху повърхност на V_HCDR3 библиотеката, не произвежда някакви клонове, съдържащи мутации извън горещите точки. Този резултат потвърждава нови данни, че рандомизирането на горещи точки е по-вероятно да продуцира мутанти с подобрен афинитет (Chowdhury et al., Nature Biotechnol. 17:568-572 (1999)). Найдобрият съединител получен от задържане V_HCDR3 библиотеката е използуван за изготмяне на фагов дисплей библиотека, като се рандомизира горещата точка в лековерижната CDR3. Задържане зърху повърхност на тази библиотека произвежда няколко мутантни клонове с дори по-желани характеристики.

Пример 2

Конструиране на VH мутантна библиотека. V_HCDR3 на MR1 се състои от единадесет аминокиселини. Както е отбелязано във Въведение, две от тези аминокиселини са разглеждани като невероятни да участвуват в антигенното свързване. Другите девет аминокиселини в VH са мутирани чрез заместване всички от другите природни аминокиселини, както следва за аминокиселинния остатък 'Чййй#'·· нормално срещащ се при тази позиция. ДНК олигомери са планирани да създадат три библиотеки, във всяка случайно са подбрани девет нуклеотида, (три последователни аминокиселини). MR1 фагемид е използуван като матрица за въвеждане на три аминокиселинни рандомизации в CDR3 тежката верига в 3 отделни дву-етапни полимеразни верижни реакции (PCR) (Фигура 1). Използувани са следните олигонуклеотиди:

CDR3Hb (5’-CTTGGCCCCASNNSNNAGAGGTACTAGAATAGCCTC TTGTGCA-3’),

CDR3Hd (5’-CTTGGCCCCACATAGCATASNNSNNSNNAGAATAGCCTC TTGTGCA-3’),

CDR3Hf (5’-CTTGGCCCCACATAGCATAAGAGGTACTSNNSNNSNNTC TTGTGCA-3’),

S1 (5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’)

AMBN (5’-GCTAAACAACTTTCAACAGTCTATGCGGGCAC-3’)

При първата PCR, 50 pg от фагемид pCANTAB 5 E-MR1 e използуван като матрица в три отделни реакции, използувайки 20 pmol ДНК олигомер S1 заедно с 20 pm от ДНК олигомерните

CDR3Hb, CDR3Hd или CDR3Hf. Матрицата и олигата са смесени с 2

Ready-To-Go PCR beads (Pharmacia) в 50 μΙ обем и след това са циклирани като е използуван следния профил: 1 цикъл при 95°С за 5 минути, последван от 30 цикъла на 94°С за 1 минута, 55°С за 1 минута и 72°С за 1 минута. Тези реакции генерират 407 базови двойки продукти, които съдържат мутациите. Продуктите генерирани в първия етап, след това са използувани като праймери в три отделни реакции с праймер AMBN, използувайки MR1 фагемид като матрица. При тези реакции, 1 μΙ продукт от първата реакция е използуван с 20 pmol ДНК олигомера AMBN с 50 pg фагемид pCANTAB 5 E-MR1 като матрица. Праймерите и матрицата са смесени с 2PCR зърна в 50 μΙ обем и са циклирани използувайки профила описан по-горе. Всяка реакция генерира една 876 базови двойки библиотека. PCR продуктите са хидролизирани с рестрикционни ензими Sfi I и Not I и са пречистени. 150 ng от пречистените PCR продукти са лигирани с 250 ng от фаговия дисплей вектор ДНК pCANTAB5E (прехидролизиран, както е доставен от Pharmacia). Сместа за лигиране е освободена от соли и 40 ng от всяко лигиране са използувани да трансформират E.coli TG1. Всяка трансформация има за резултат приблизително 1.5 х 10⁶ клона. Фаговите библиотеки след това са освободени от трансформирани бактерии. Клетки от всяка трансформация са култивирани в 10 ml 2 х YT (16g bacto-tryptone, 10 д bacto-yeast екстракт, 5 д NaCI за един литър вода) съдържащи 2% глюкоза на 37°С при разбъркване на 250 об.минута. След един час са добавени ампицилин (10цд/т1 крайна концентрация) и 1х1О¹⁰ плака образуващи единици (pfu) от М13КО7 хелперен фаг. Културите са развивани за 1 час, утаявани са, след това са ресуспендирани в 10 ml 2xYT плюс ампицилин (100 цд/т1) и канамицин (50 pg/ml) и са развивани за 16 часа на 37°С при разбъркване на 250 об.минута. Бактериите са утаявани чрез центрофугиране в Sorvall SS34 ротор на 8000 об.мин. за 20 минути. Фаг-съдържащите настоящи течности са филтрувани използувайки 0.45 микрона филтър за спринцовка. След ова фагите са преципитирани чрез добавяне на 2 ml PEG, NaCI (20% PEG8000 в 2.5 М NaCI тегло/обем) след това са инкубирани на лед за 30 минути. Преципитираните фаги са утаени чрез центрофугиране в Sorvall SS34 ротор при 10К об.мин. за 20 минути, след това са ресуспендирани в 1 ml ΝΤΕ (100 mM NaCI, 10mM TRIS pH 7.5, 1 mM EDTA). Освободените фагови библиотеки са титрирани и съхранени при 4°С.

Задържане върху активна повърхност на V_HCDR3 библиотека. NR6M клетки култивирани в DMEM съдържаща 10% фетален говежди серум плюс 750 pg/ml G418 са събрани като е използуван 0.2% EDTA (Sigma # Е-8008). 2 х 10⁷ клетки са утаени и ресуспендирани в 10 ml студен блокиращ буфер (2% BSA, 0.02% NaN₃ в DPBS) и са ротирани бавно за 1 час на 4°С. Клетките са утаени и ресуспендирани в 5 ml студен блокиращ буфер. Добавени са 1х10⁹ фаги от всяка от тежковерижните CDR3 библиотеки, към клетъчната суспензия и сместа е ротирана бавно на 4°С за 2 часа. Клетките са измити двукратно с 10 ml студен блокиращ буфер и са ресуспендирани в 5ml студен блокиращ буфер. Добавено е MR1dsFvPE38 (2μΜ крайна концентрация) като конкурентен инхибитор и суспензията е ротирана бавно на 4°С за 2 часа. Клетките са измити три пъти с 10 ml блокиращ буфер. Свързаните фаги са отдекантирани чрез ресуспендиране на измитите клетки в 1.5 ml ледено студена 50mM HCI и инкубирани на лед за 10 минути. NR6M клетките са утаени и отдекантираните фаги са прехвърлени в нова епруветка съдържаща 200 μΙ 1М Трие pH 8.0. Отдекантираните фаги са титрирани за определяне броя на заловените фаги. След това 0.5 ml от отдекантираните фаги са амплифицирани чрез ^инфектиране E.coli TG1 за употреба в следващия кръг на задържане.

Конструиране на V_L мутантна библиотека. Тежковерижен CDR3 мутант (S98P-T99Y) е използуван като матрица в дву-етапна PCR, която въвежда рандомизации в гореща точка, локализирани в лековерижната CDR3. При първата реакция, 50 pg от фагемид съдържащия тежковерижен мутант (S98P-T99Y) е смесен с 20 pmol от ДНК олигомерите VLMUT (5’-GATTACTACTGTTTGCAANNSNN SAACGTGCCTCTTACA-3’) и AMBN в 50 μΙ обем. Сместа е циклирана, използувайки профила прилаган за генериране ** тежковерижна CDR3 библиотека. Реакциите генерират 150 базови двойки продукти, съдържащи рандомизация на “горещата точка” в лековерижната CDR3. След пречистване, 1μΙ от реакционния продукт, генериран в първата PCR, е използуван с 20 pmol ДНК олигомер S1 във втора PCR с 50 pg от фагемидната ДНК, съдържаща тежковерижния мутант (S98P-T99Y) като матрица. Матрицата и праймери са смесени с 2 PCR Beads в 50 μΙ обем и циклирани, използувайки горния профил. Реакциите генерират 876 базови двойки библиотека, която съдържа V_HCDR3 мутацията (S98PT99Y) и рандомизация на горещата точка в CDR3L. PCR продуктите са хидролиизирани с рестрикционни ензими Sfi I и Not I, пречистени са и са лигирани с pCANTAB5E вектор, както с тежковерижните CDR3 библиотеки. Лигирането е освободено от соли и една десета (40 ng) от реакцията е използувана да трансформира E.coli TG1. Фаговата библиотека, съдържаща 3 х 10⁵ клонове, е освободена както е описано при тежковерижната CDR3 конструкция. Една четвърт от нея е амплифиицирана и използувана за първия кръг на задържане върху активна повърхност.

Задържане върху активна повърхност на V_LCDR3 библиотеката. NR6M клетки са събрани както при V_HCDR3 задържане процедурата. Всички етапи и измивания са направени в студен блокиращ буфер, с изключение където е отбелязано. 5 х 10⁶ клетки са ресуспендирани в 1ml блокиращ буфер и ротирани за 1 час. Клетките са утаени и ресуспендирани, освободената фагова библиотека е добавена и суспензията е ротирана бавно на 4°С за 2 часа. Клетките са измити 3 пъти, след това са ресуспендирани в блокиращ буфер съдържащ 2 рМ MR1 тежковерижен мутант (S98PT99Y) scFv-PE38 и са ротирани на 4°С за 2 часа. Клетките са измити 3 пъти и свързаният фаг е отдекантиран и неутрализиран както с тежковерижната CDR3 библиотека. Отдекантираните фаги са титрирани и освободени за следващия кръг на задържане.

Фагово освобожаване. Фагите, които са захванати след всеки кръг на задържане върху активна повърхност, са амплифицирани за употреба в следващия кръг на задържане. За освобождаване, E.coli TG1 са развивани в 10 ml 2xYT, съдържаща 2% глюкоза, инкубирани са на 37°С, 250 об.мин. Когато се достигнат ODeoo, 0.3, 0.5 ml от захванатите фаги са добавяни към културата и инкубацията е продължена. След един час са добавяни ампицилин (100pg/ml крайно) и 1х1О¹⁰ pfu М13КО7 хелперен фаг и инкубацията е продължена още един час.След това културата е центрофугирана и утаените бактерии са ресуспендирани в 10 ml свежа 2xYT среда, съдържаща ампицилин (100 pg/ml) и канамицин (50цд/т1) и са инкубирани на 37°С, 250 об.мин. за 16 часа. Бактериите са утаявани чрез центрофугиране в Sorvall SS34 ротор на 8К об.мин. за 20 минути. Съдържащите фаги надстоящи течности са филтрувани с 0.45 микрона филтри за спринцовки. След това фагите са преципитирани чрез добавяне на 2ml PEG/NaCI (20% PEG8000 в 2.5

M NaCI тегло/обем) и инкубирани на лед за 30 минути.

Преципитираните фаги са утаени чрез центрофугиране в Sorvall SS34 ротор при 10К об.мин. за 20 минути, след това са ресуспендирани в ml ΝΤΕ (100 mM NaCI, 10 mM Tris, 1mM EDTA pH 7.4). Освободената фагова библиотека е титрирана и съхранявана на 4°С.

Откриване на положителни клонове. След третия кръг на задържане върху активна повърхност, 48 клона от тежковерижната CDR3 библиотека са анализирани за свързване с EGFRvIII пептид (LEEKKGNYWTDHSGGK-биотин) използувайки ELISA. Двадесет и ^w два клона, които дават най-силен сигнал, са подложени на ДНК секвениране и по-нататък анализирани. След четвъртия кръг на задържане, 48 клона са анализирани с ELISA и е определяна ДНК последователността на 10-те клона с най-силен ELISA сигнал. За лековерижната библиотека, след втория кръг на задържане 48 клона са анализирани с ELISA и 17 с най-силен сигнал са секвенирани. След третия кръг, 20 клона са анализирани и 10 клона с най-силни ELISA сигнали са подложени на ДНК секвениране. За освобождаване на фага от индивидуалните клонове, единични колонии са взети от крайната задържаща титрационна платка и са инокулирани в 150 μΙ 2xYT с 2% глюкоза и 100 pg/ml ампицилин в 96-ямкова платка за култивиране. Платката е инкубирана на 37°С, 150 об.мин. След 3 часа, 20 μΙ от културата са прехвърлени в ямките на втора платка съдържащи 100 μΙ 2xYT с 2% глюкоза и 100 μg/ml ампицилин плюс 1 х10⁸ М13КО7 хелперен фаг и са инкубирани за 2 часа. Културите са утаени и ресуспендирани в свежа 2χΥΤ плюс ампицилин и канамицин, след това са развивани за 16 часа. Клетките са утаени и 50 до 100 μΙ от фаг-съдържащите надстоящи течности са тестирани в ELISA. Фагова ELISA е изпълнявана както е описано (Lorimer et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14815-14820(1996) c изключение 100 μΙ з,3’,5,5’-тетраметил бензидин (ВМ blue, Boehringer Mannheim) са използувани като субстрат за детектиране. След развитието на синьо/зелен цвят, са добавяни 100 μΙ 2М H₂SO₄ за прекъсване развитието на оцветяването. Измервана е абсорбцията при 450 пМ.

ДНК секвениране. ДНК секвениране е извършвано като е използувана една РЕ Applied Biosystems (Foster City, СА) Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit. Пробите са правени и анализирани на РЕ Applied Biosystems Model 310 автоматичен секвенатор.

а****· w ScFv имунотоксин плазмидна конструкция, експресия и пречистване. ScFv от подбрани фагемидни клонове са амплифицирани с PCR, използувайки праймери, които въвеждат Ndel и Hindlll рестрикционни места. След това продуктите са хидролизирани и клонирани в Т7 базиран експресинонен вектор, в който scFv е слето с една скъсена версия на Pseudomonas екзотоксин А. Плазмидите са трансформирани в експресионния гостоприемник BL21 (XDE3). MR1 мутантните имунотоксини са експресирани и изготвени както е описано по-рано (Buchner et al., Anal.Biochem. 205:263-270(1992)).

Повърхностен Plasmon резонанс. Измервана е свързващата кинетика, използувайки BIAcore 2000 Biosensor (Biacore, Inc., Piscataway, NJ). Стрептавидин е свързван c CMS reaserch grade сензорен чип, използувайки амин свързващи реагенти, осигурени от BIAcore. Биотинилиран EGFRvlll пептид е свързан със стрептавидина чрез инжектиране на 10 μΙ ЮпМ разтвор на пептида върху чипа. Имунотоксини са разредени до 25 μΙ/ml в буфериран с hepes физиологичен разтвор (HBS). On и off нивата са измервани чрез инжектиране 50 μΙ разреден имунотоксин върху повърхността на чипа

ТЗ ιρπ 10 μΙ/минута, след това оставяне на свързания материал да дисоциира за 5 минути или повече. Останалият свързан материал е отстранен от EGFRvlll пептида чрез инжектиране 5 μΙ ЮОтМ фосфорна киселина. Кинетиката на свързване е анализирана като е използуван BIAevaluation 2.1 Software.

Клетъчно килтивиране и цитотокични тестове. NR6M клетки са култивирани в DMEM плюс 10% фетален говежди серум, допълнена със 750 pg/ml G418. Цитотоксични тестове измерват инхибиране включването на [³Н]-левцин, както преди е описано (Prior С et al., Се//64:1017-1023, 1991).

Бактерии и клетъчни линии. E.coli TG1; К12 Δ (lac-pro), supE, thi, hsd Δ 5/F’[traD36, proAB, lacl^q, lacZ Δ М15]. E.coli BL21(XDE3); F' ompT[lon] hsdS_B (гв’ m_B’; един E.coli В щам) c DE3, един λ профаг, носещ Т7 РНК полимеразен ген. NR6 е един Swiss ЗТЗ миши фибробластен вариант клетъчна линия, с неоткриваем EGFR. NR6M е NR6 клетъчната линия, трансфектирана с кДНК за мутантния EGFRvlll рецептор, под контрола на β-акгин промотор. Източникът на NR6M е описан по-рано (Lorimer et al., Clin.Cancer Res. 1:859-864 (1995)).

Пример 3

Конструиране на V_HCDR3 библиотеката. За повишаване афинитета на MR1(Fv) и активността на съответния имунотоксин MR1 (FV)-PE38, ние мутирахме V_HCDR3 и V_LCDR3, поради това че тези части на антитялото правят значителни контакти с антигена (MacCallum et al., J.Mol.Biol. 262:732-745 (1996)). Първите девет от единадесетте аминокиселини на V_HCDR3 са представени на Таблица (най-малко две, D101 и Y102 са изключени, тъй като те са разглеждани като невероятни да допринасят за антигенното свързване). Поради това, че цяла библиотека, в която девет аминокиселинни остатъци са рандомизирани, би се изисквало повече от 5 х 10¹¹ индивидуални клонове, ние вместо това изготвихме три различни библиотеки, покриващи остатъци 95-97, 98-100 и 101-101С, както е описано в Пример 1. Библиотека H-CDR3 95-97 съдържа 1.6 х 10⁶ клона, библиотека H-CDR3 98-100, съдържа 4 х 10⁵ клона и библиотека H-CDR3, 100А-100С съдържа 1 х 10⁶ клона. За да се осигури, че библиотеките са коректно направени, пет клона от всяка библиотека са секвенирани. Както се очаква, всеки клон има различна w аминокиселинна комбинация в областта, която е прицелна за мутации. Тъй като една напълно различна библиотека, рандомизираща 3 аминокиселини, ще изисква само 8 х 10³ независими клона, големината на библиотеките осигурява, че всички възможни ДНК последователности са добре представени.

Зядържане върху активна повърхност на V_HCDR3 библиотека и анализ на отбрани клонове

Тъй като крайната предвидена употреба за един подобрен MR1 мутант е да прицелва токсин към EGFRvlll- положителни ракови клетки, ние използувахме EGFRvlll положителни NR6M клетки за задържане върху активна повърхност. Задържане е извършено в присъствието на имунотоксин MR1(Fv)-PE38, за който се очакваше, че ще действува като конкурент срещу подбора на див тип MR1 Fv в библиотеката. Фагите от всяка библиотека са освобождавани и равни количества от фага (1 х 10⁹) от всяка библиотека са обединявани за да започне първия кръг на задържане. Отдекантираните фаги са титрирани и освободени за следващия кръг на задържане. Последващите кръгове на задържане върху активна повърхност са извършени без определяне на тигъра на освободения фаг, докато се свършва задържането. Това е правено за да се пести време и да се намали възможността нестабилни съединители да могат да се загубят в 24-те часа, които се изискват да се титрира освободения фаг. Обикновено освобождаванията имат добив 1 χ 10¹² cfu/ml. Таблица 3 обобщава броя на фаги захванати по време на всеки от 4 кръга на задържане. Обогатяването достига максимум на третия кръг и изглежда намалява на четвъртия кръг.

Ние в началото изследвахме фагите отбрани след четири кръга на задържане. Четиридесет и осем клона бяха анализирани за свързване във фагова ELISA и беше определена ДНК последователността на десет от клоновете с най-силен сигнал. Както е показано на Таблица 6, единствените мутации възстановени бяха в позиции 98 и 99. Анализ на ДНК последователност показва, че клоновете принадлежат на пет различни групи: родителска S98-T99; и мутанти P98-N99; P98-Y99; P98-F99 и P98-W99. Ние изследвахме също фаги отбрани след 3-ия кръг за да проверим, дали са загубени добри съединители между 3 и 4 кръг. Ние анализирахме 48 индивидуални клона за свързване с EGFRvlll пептида, с помощта на ELISA и 22 от тях, които дадоха най-висок сигнал, ние подложихме на ДНК секвениране. Отново, единствените възстановени мутации бяха в позиции 98 и 99 (Таблица 6). Разнообразие от аминокиселини беше възстановено при тези позиции. Най-чести бяха S98-T99 (див тип), последвани от P98-S99; P98-Y99; P98-N99 и A98-D99. Четвъртият кръг на задържане има за резултат обогатяване на клонове P98-N99 и P98-Y99 пред дивия тип (S98-T99), известна загуба на някои клонове и също произвежда един нов клон съдържащ P98-F99.

Цитотоксичност и афинитет на V_HCDR3 мутанти. Всеки от 12-те мутанти, които бяха получени чрез задържане върху активна повърхност на MR1 V_HCDR3 библиотеката, бяха използувани за получаване на имунотоксин. Всеки имунотоксин беше конструиран чрез PCR амплифициране на Fvs от фаговия дисплей вектор и те са субклонирани в имунотоксин експресионния вектор. Всички от имунотоксините (с изключение на A98-D99 мутоция в V_HCDR3) могат да бъдат високо пречистени до повече от 90-95% хомогенност. Пречистените имунотоксини са използувани за определяне на тяхната цитотоксичност върху NR6M клетки. Свързващият афинитет е определян с Biacore метода, използувайки пептид имобилизиран върху чип (или една мутантна форма на извънклетъчния домен на EGFR прикрепен за чип). Резултатите от една група експерименти са показани в Таблица 6; сравнени с родителския клон (S98-T99), който има 1С₅о 8.0 ng/ml, имаше шест клона, които бяха по-цитотоксични. Това бяха P98-Y99, които имат 1С₅о 3.5 ng/ml следвани от P98-N99, P98-W99, P98-I99, които имат IC50 4.5 mg, P98-F99 с IC50 6 ng/ml и P98-V99 с IC50 θ·5 ng/ml. Четири клона, P98-S99, W98-F99, S98-W99 и Р98-Т99 имат ICsos идентичнаас родителския клон.

Конструиране на V_LCDR3 библиотеката. Всички от мутантите възстановени след задържане върху активна повърхност на V_HCDR3 библиотеките, бяха локализирани в позиции 98 и 99. ДНК последователността на тези два остатъка съставлява гореща точка, която е област, която претърпява мутации по време на in vivo афинитетното зреене на едно антитяло. Мутантът с най-висока цитотоксична активност от V_H библиотеката, е използуван и подложен на мутагенеза, прицелвайки само горещата точка в V_lCDR3. Последователността на V_LCDR3 е представена в Таблица 3. Библиотеката въвежда рандомизации в горещата точка, която кодира за остатъци 91 и 92. V_LCDR3 фаговата библиотека е конструирана както е описано в Пример 1 и съдържа 3 х 10⁵ клона. Тъй като една библиотека от само 400 клона се изисква да постигне всички възможни аминокиселинни комбинации в двете позиции избрани за зреене, може да се приеме, че всички възможни ДНК последователности са в изобилие в тази библиотека.

Задържане върху активна повърхност на V_LCDR3 библиотека и анализ на отбрани клонове. Проведени са три кръга задържане и фагът захванат на всеки етап е показан в Таблица 3. За тази библиотека ние получихме повече обогатяване във втория кръг на ззадържане отколкото в третия кръг. След втория кръг на задържане, 48 индивидуални клона бяха освободени, беше измерено свързване с пептид с ELISA и беше определена ДНК последователността на седемнадесет клона, които дават най-силен сигнал. Както е показано в Таблица 7, получени са пет различни мутанти. Всички запазват сериновия остатък на дивия тип в позиция 91 и имат мутации при остатък 92. Най-чест беше F92W (6 от 17), следван от F92R (3 от 17), F92S (2 от 17), F92L (1 от 17) и Р92М (1 от 17). От 17 анализирани, 4 са намерени, че са родителски тип.

Анализирани бяха свойствата на клонове, изолирани след третия кръг на задържане (Таблица 7). Двадесет клона са взети случайно, фагите бяха освободени и отчетени за свързване с пептид с помощта на ELISA. Десет клона, които имаха най-силен сигнал бяха избрани за анализ на ДНК последователността. ДНК последователността разкри, че има 3 различни клона присъствуващи, всеки, от които беше представен в кръг 3. Освен един родителски клон, тези клонове бяха F29S (7 от 10), F92W (1 от 10) и F92R (1 от 10). Нямаше намерени нови мутанти и ние не намерихме мутанти F92L и F92M.

Цитотоксичност и свързващи свойства на V_LCDR3 мутантите. Различните получени Fvs бяха използувани за изготвяне ia имунотоксини и бяха определени техните цитотоксични активности и свързващ афинитет, използувайки пречистените рекомбинантни белтъци. Само един мутант, F92W дава един имунотоксин, който е поакгивен от родителския. Неговата 1С₅₀ беше 1.3 ng/ml сравнена с 3.5 ng/ml за неговия родител (Таблица 7). Другите мутанти имат по-ниски активности. Данните в Таблица 7 също показват, че F92W има повисок афинитет (Kd ЗпМ) от родителския клон F92 (Kd 6 пМ). Друг мутант, F92L, има леко повишен афинитет (Kd 4 пМ), но няма повишение на цитотоксичността. Фигура 2 показва BIACore сензограма, сравнявайки свързващите свойства на родителския клон ч» с най-активния имунотоксин, изготвен от Fv, получено от V_HCDR3 библиотеката (V_HS98P-T99Y) и най-активният клон, получен от V_lCDR3 библиотеката (V_HS98P-T99Y-V_LF92W), който сега е наречен MR1-1. Фигурата показва, че двата мутанта имат по-бавно ниво на дисоциация, отколкото родителското Fv. Анализът на имунотоксина (MR1-1-(Dv)-P38) с двете V_H и V_L мутации, показва, че има известно намаление в kotr и леко увеличение в k_on което има за резултат Kd3nM.

Таблица 4 представя два експеримента, при които цитотоксичните активности на MR1(Fv)-P38 са сравнени с два подобрени варианта: MR1(Fv)(VHS98P-T99Y)-P38 и MR1-1(Fv)-P38. В двата експеримента MR1(Fv)-P38 е най-малко активно и MR1-1(Fv)Р38 е най-активно.

Пример 4

Добив на имунотоксин. Наблюдавано е ясно повишение добива на имунотоксини на различни мутанти по време на процеса на пречистване. След ренатурация, белтъците са диализпрани и пречистени с хроматография (Buchner et al., Anal.Biochem. 205:263 270 (1992)). Белтъкът е първа партида пречистен върху Q-сефарозна онообменна смола, което отстранява големите белтъчни агрегати, нуклеинови киселини и други примеси. След това елюираният белтък е нанесен на MonoQ колона и белтъците са елюирани с 0-0.3 М NaCI непрекъснат градиент. Този етап отстранява по-малките агрегати. Точно нагънатият мономерен имунотоксин, е елюиран от MonoQ при определена концентрация на NaCI от 280тМ. Чистотата на събраните MonoQ фракции е потвърдена с наблюдаване на единичен мономерен пик, елюиран от TSK G3000SW размер изключваща колона и SDS-PAGE. Добивът от всеки мугантен имунотоксин MR1(Dv)-PE38 е изчислен въз основа на количеството белтък събрано от пиковите MonoQ фракции и наличието на единичен пик на size exclusion хроматограма (TSK 3000). Таблици 6 и 7 представят добивите когато 100 mg белтък на включващи телца е подложен на пречистване. Очевидно е , че добивът на имунотоксин е силно повлиян от мутациите в CDRs и повишен от 2% с родителското MR1(Fv)-PE38 до 10-17.5 с много от мутантите.

Пример 5

Инициирани са EGFRvlll интракраниални тумори у атимиични плъхове с инжекция на 10⁵ U87MG.AEGFRvlll клетки (човешка глиобластомна линия, създадена чрез трансфекгиране U87MG клетки с EGFRvlll, виж Nishikawa et al. Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 91:7727-7730 (1994), c катетер поставен 1mm предно и 4 mm латерално от bregma. Туморите са третирани с инфузия на MR1-1-PE38 имунотоксин или физиологичен разтвор като контрола, с катетер директно в тумора. Имунотоксинът е въвеждан в дози 2 или 6 цд в 200 μΙ фосфатно буфериран физиологичен разтвор (“PBS) с 0.2% човешки серум албумин (“HAS”) за 7 дневен период, като е използувана Alzet® 2MI осмотична помпа (Durect Corp.Cupertino, СА), на контролните животни са въвеждани 200 μΙ PBS-HAS разтвор. Третирането е >апочвано 3 дни след инокулация на тумора. Както е показано на Фигура 3, всички животни, които са получавали физиологичен разтвор са умрели след 20 дни. Десет процента от животните получаващи брд доза са живи след 160 дни. Повече от 30% от животните третирани с доза 2 pg са живи след 160 дни. Разликата в преживяването между 2 pg и 6 pg дозировките, насочва, че при интракраниално поставяне, концентрацията на имунотоксин от 6 pg доза вероятно е твърде висока и предизвика известна не-специфична токсичност в мозъчната тъкан, която е редуцирана или отсъствува при доза 2 pg, но и при двете дозировки имунотоксинът удължава преживяването.

Пример 6

Инициирани са EGFRvlll интракраниялни тумори у атимични плъхове с инжектиране на 10⁵ U87MG.AEGFRvlll клетки с катетер поставен 1mm пред и 4 mm латерално от bregma. Туморите са третирани с инфузия на MR1-1-PE38 имунотоксин или физиологичен разтвор като контрола, с катетер директно в тумора. Имунотоксинът (0.2, 0.6 и 2.0 pg) е предоставян в 200 pl PBS с HAS за 7 дневен период, използувайки Alzet® осмотична помпа, както е описано в предишния Пример. Третирането е започвано 3 дни след инокулация на тумора.

Както е показано на Фигура 4, само около 10% от животните получаващи 0.2 или 0.6 pg дози имунотоксин преживяват след 25-ия ден, докато около 22% от животните получаващи физиологичен разтвор като контроли, преживяват. За разлика от това, животните получаващи 2 pg доза, преживяват около 55%, повече от два пъти процента на преживяване на животните получаващи физиологичен разтвор като контролни. Резултатите насочват, че дозите 0.2 и 0.6 pg ;а твърде ниски да повлияят на преживяването, докато 2.0рд доза имунотоксин значително удължава преживяването.

Пример 7

Иницииран е EGFRvlll неопластичен менингит у атимични плъхове с инжектиране на 5 х 10⁵ U87MG.AEGFRvlll клетки в 40 μΙ PBS-HAS разтвор, с един интратекален катетер за продължително въвеждане. Третирането на всички носители на тумор животни започва 3 дни след туморната инокулация. MR1-1-PE38 имунотоксинът е даван в 40 μΙ PBS-HAS на 3, 5 и 7 ден след туморната инициация. На контролните животни са въвеждани 40 μΙ PBS-HAS на същите дни.

Както е показано във Фигура 5, всички животни, получавали контролен физиологичен разтвор умират до 10-ия ден. За разлика от това, при всички животни получавали имунотоксин преживяването е удължено най-малко до 14-ия ден, с 30% от животните получавали 1 μg доза и 50% от животните получавали 2 pg дозата са преживели до 60-ия ден.

Пример 8

Инициирани са тумори у атимични мишки чрез инжектиране на 50 μΙ U87MG.AEGFRvlll туморен клетъчен хомогенат седем дни преди началото на третиране (началото на третиране е обозначено като ден “0 за това проучване). Туморите са третирани с 20 μΙ интратуморни болус инжекции с MR1-1-PE38 имунотоксин в дози 1, 2 или 3 pg или контролни с физиологичен разтвор (PBS-HAS разтворът описан в предшествуващите Примери) на 0, 2 и 4 дни. Туморите имат среден обем 600mm³ в началото на третирането на ден 0.

Както е показано на Фигура 6, големината на туморите на животните третирани с всяка от дозите имунотоксин, остава приблизително същата, каквато е измерена на 2-ия ден след първото третиране, ефективно спиране растежа на тумора. За разлика от това, животните третирани само с физиологичен разтвор като контроли, показват бързо нарастване на туморната маса, с обем на тумора нарастващ до 7500 mm³ на 7-ия ден.

Всички публикации и патенти споменати в тази спецификация, са включени тук чрез цитат в спецификацията в същата степен, както ако всяка отделна публикация или патент специфично и индивидуално е указано да бъдат включени тук чрез цитат.

Таблица 3 Фагово обогатяване по време на задържане върху активна

повърхност
Кръг на задържане	Въведен фаг	Елюиран фаг
VHCDR3
1	ЗхЮ9	1.5 х 105
2	ЗхЮ11	1.0 х 106
3	5х1011	1.5 хЮ8
4	5х1011	2.0 х 107
VlCDR3
1	1 х 1О10	2.4 х 105
2	1 х 1О10	5.5 хЮ6
3	1 х1О10	2.0 х 107

Таблица 4
	Експеримент 1	Експеримент 2
Имунотоксин	IC50	Ю50
MR1(Fv)-P38	9.2+2.1	6.6+.2
MR1 (Fv)(VHS98P-T99Y)-PE38	6.0+.39	4.6±.7
MR1-1(Fv)-PE38	2.6+6.2	2.0+1

Сравнение на цитотоксична активност на MR1(Fv)-PE38 с два мутанта с повишен афинитет за EGFRvIII. ICsos са изчислени от тестове, използуващи различни количества имунотоксини. Стойностите са средни + сатнд.откл. Р стойности са <01 когато се сравнява MR1(Fv)РЕ38 С MR1-1(Fv)-P38 и MR1(Fv)(V_HS98P-T99Y)-P38 с MR1-1(Fv)РЕ38 в експеримент 1 и когато се сравнява MR1(Fv)-P38 с MR1(Fv)(V_HS98P-T99Y)-PE38 и MR1(Fv)(V_HS98P-T99Y)-P38 с MR11(Fv)PE38 в експеримент 2.

Таблица 5

ДНК и аминокиселинна последователност на тежковерижна CDR3 и лековерижна CDR3 на MR1 Fv*

MR1CDR3H	GGC	TAT	ТСТ	AGT	ACC	TCT	TAT	GCT	ATG
	G	Y	S	S	T	S	Y	A	M
Position	95	96	97	98	99	100	100A	100B	100C

MR1 CDR3L	TTG	CAA	AGT	TTT	AAC	GTG	CCT	CTT	ACA
	L	Q	S	F	N	V	P	L	T
Position	89	90	91	92	93	94	95	96	97

Торещи точки притежаващи последователността Pu G Ру А/Т са подчертани.

Таблица 6

Последователности и свойства на мутантен фаг, изолиран от тежковерижна CDR3 библиотека и на имунотоксини, изготвени с мутантните scFvs

Position	95	96	97	98	99	100	100A	100B	100C	#out	IC50	KDnM	Yield %
										of 22	ng/ml
Original Amino Acid	G	Y	S	S	T	s	Y	A	M		8.0	8.0	2.0
3rt Round Residues				S	T*					5	8.0	8.0	2.0
				P	S					4	8.0	N.D.	17.5
				P	Y					3	33	6.0	7.0
				P	N					2	43	П.0	10.0
				P	W					2	43	4.0	10.0
- -				A	D**	.				2	N.D.	NJ).	NJ).
				P	I					1	43	5.0	10.0
				W	F					1	8.0	NJ).	10.0
				P	V					1	63	NJ).	7.0
					•-w					1	8.0	NJ).	5.0
				P						1	8.0	8.0	?
										#out
										of 10
44 Round Residues				S	T*					1	8.0	8.0	2.0
				P	N				-	3	43	11.0	10.0
				P	Y					3	33	6.0	7.0
				P	F					2	6.0	20.0	3.0
				P	W					1	4.5	4.0	10.0

* Див тип ** Не може да прави имунотоксин

Таблица 7

Последователности и свойства на мутантен фаг изолиран от лековерижна CDR3 библиотека и на имунотоксини, изготвени с мутантни scFvs

Position	89	90	91	92	93	94	95	96.	97	# out of 17	IC50 ng/ml	KDnM	Yield %
Original Amino Acid	L	Q	S	F	N	V	P	L	T		33	6	7
2nd Round Residues			S	F						4	33	6	7
			S	W						6	13	• 3	7
			S	R						3	6.0	9	8
•			S	S						2	15.0	22	16
			s	L						1	53	4	8
			s	M						1	9.0	6	2
										# out of 10
			s	F							33	6	7
3“ Round Residues										1
			s	- S						7	15.0	22	16
			s	w						1	13	3	7
			s	R						1	6.0	9	8

Claims (40)

1. Полипептид съдържащ мутантна антитяло тежковерижна променлива област (V_H) или мутантна лековерижна променлива област (V_L), полипептид притежаващ Kd за EGFRvlll антиген 7пМ или по-ниско, мутирана V_H или мутирана V_L, притежаваща последователност, която се различава от родителското антитяло MR1 V_H или V_L съответно, с една аминокиселинна замяна на наймалко една аминокиселина в определящата комплементарност област (CDR), аминокиселина кодирана от кодон, който съдържа нуклеотид, принадлежащ на гореща точка мотив, подбран от AGY или RGYW, където R е А или G, Y е С или Т и W е А или Т.

2. Полипептид съгласно претенция 1, където замяната се появява в CDR3 на тежковерижна променлива област.

3. Полипептид съгласно претенция 1, където замяната се появява в CDR3 на лековерижна променлива област.

4. Полипептид съгласно претенция 1, където замяната се появява в CDR1 или CDR2 на лековерижната променлива област.

5. Полипептид съгласно претенция 1, където замяната се появява в CDR1 или CDR2 на тежковерижната променлива област.

6. Полипептид съгласно претенция 1, където двете V_H и V_L веригите са мутирани с аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина в CDR.

1. Полипептид съгласно претенция 2, където мутираната V_H има последователност, която се различава от антитяло MR1 с една аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина, подбрана от група състояща се от S98 и Т99.

8. Полипептид съгласно претенция 7, където заместванията са подбрани от група състояща се от P98-Y99, P98-N99, P98-W99, P98-I99, P98-F99 и P98-V99.

9. Полипептид съгласно полипептид е scFv. претенция 1, където споменатият 10. Полипептид съгласно претенция 7, където споменатият полипептид е scFv. 11. Полипептид съгласно претенция 1, където споменатият полипептид е dsFv, Fab или F(ab’)₂.

12. Полипептид съгласно претенция 1, където заместванията в тежката верига са S98P-T99Y и заместването в леката верига е F92W (MR1-1).

13. Полипептид съгласно претенция 1, съдържащ по-нататък ефекторна молекула, терапевтична единица или откриваем белег.

14. Полепептид съгласно претенция 13, където терапевтичната единица е токсична единица.

15. Полипептид съгласно претенция 14, където токсичната единица е Pseudomonas екзотоксин или негов цитотоксичет фрагмент.

16. Полипептид съгласно претенция 14, където токсичната единица е цитотоксичен фрагмент, който е РЕ38.

17. Полипептид съгласно претенция 15, полипептид има IC50 7ng/ml или по-малко.

18. Полипептид съгласно претенция 15, полипептид има IC50 5 ng/ml или по-малко.

19. Полипептид съгласно претенция 15, където споменатият където споменатият където споменатият полипептид има IC50 около 3.5 ng/ml.

20. Полипептид съгласно претенция 15, където споменатият полипептид има най-малко една аминокиселинна замяна в V_H, където споменатата замяна е подбрана от група състояща се от : P98-S99, W98-V99, S98-W99 и Р98-Т99.

21. Полипептид съгласно претенция 15, където споменатият полипептид има добив най-малко 3%.

22. Полипептид съгласно претенция 15, където споменатият полипептид има добив около 7%.

23. Полипептид съгласно претеция 14, където токсичната единица е подбрана от група състояща се от diphteria токсин или негов цитотоксичен фрагмент, saporin или негов цитотоксичен фрагмент, pokeweed антивирусен токсин или негов токсичен фрагмент, ricin или негов цитотоксичен агент и bryodin 1 или негов цитотоксчен агент.

24. Полипептид съгласно претенция 15, където заместванията в тежката верига са S98P-T99Y и заместването в леката верига е F92W (MR1 -1).

25. Полипептид съгласно претенция 1, по-нататък съдържащ белтък от повърхността на бакгерифаг.

26. Молекула нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, включващ мутантна антитяло тежковерижна променлива област или мутантна лековерижна променлива област, полипептид притежаващ Kd за EGFRvlll 6 или по-ниско, полипептид притежаващ последователност, която се различава от MR1 с една аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина в определяща комплементарност област (CDR), аминокиселина кодирана от кодон, който включва нуклеотид принадлежащ на гореща точка мотив, подбран от AGY или RGYW, където R е А или G, Y е С или Т и W е А или Т.

ggg,,, ·

27. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 26, където полипептидът има последователност, която се различава от MR1 scFv с една аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина в CDR1 или CDR2 на мутираната тежковерижна област или мутирана лековерижна променлива област.

28. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 26, където полипептидът има последователност, която се различава от MR1 scFv c една аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина, подбрана от S98 и Т99 на V_H верижна CDR3 област или една замяна на F92 на V_L CDR3 област.

29. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 28, където заместванията в V_H веригата са подбрани от S98P-T99Y, S98PT99W, S9P-T99I и S98P-T99V.

30. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 28, където заместванията в тежката верига са S98P-T99Y и заместването в леката верига е F92W (MR1-1).

31. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 26, оперативно свързана с един промотор.

32. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция

27, оперативно свързана с един промотор.

33. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция

28, оперативно свързана с един промотор.

34. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция 29, оперативно свързана с един промотор.

35. Молекула нуклеинова киселина съгласно претенция

30, оперативно свързана с един промотор.

36. Метод за убиване на клетка, носеща един антиген, характеризиращ се с това, че клетката се поставя в контакт с имунотоксин, съдържащ токсична единица и прицелваща се единица, прицелващата единица, включва полипептид, притежаващ мутирана антитяло тежковерижна променлива област или мутантна лековерижна променлива област, полипептид притежаващ Kd за EGFRvlll 7 или по-ниско, полипептид притежаващ последователност, която се различава от тази на MR1 с една аминокиселинна замяна на най-малко една аминокиселина в определящата комплементарност област (CDR), аминокиселина кодирана от кодон, който съдържа нуклеотида принадлежащ на гореща точка мотива, подбран от AGY или RGYW, където R е А или G, Y е С или Т и W е А или Т.

37. Метод съгласно претенция 36, където най-малко една аминокиселина е заменена в CDR1 или CDR2 на мутираната антитяло тежковерижна променлива област или в CDR1 или CDR2 на мутираната антитяло лековерижна променлива област.

38. Метод съгласно претенция 36, където CDR3 мутираната тежковерижна променлива област съдържа една аминокиселинна замяна, подбрана от група състояща се от: Ρ98-Υ99, Ρ98-Ν99, P98-W99, Ρ98-Ι99, P98-F99 и P98-V99.

39. Метод съгласно претенция 36, където CDR3 мутираната лековерижна променлива област включва триптофан заместен с фенилаланин в позиция 92.

40. Метод съгласно претенция 36, където прицелващата единица е MR1-1.

41. Метод съгласно претенция 36, където клетката е злокачествена клетка.

42. Метод съгласно претенция 36, където злокачествената клетка е глиомна клетка.

43. Метод съгласно претенция 36, където злокачествената клетка е клетка на карцином на гърдата.

44. Метод съгласно претенция 36, където злокачествената клетка е клетка на карцином на белия дроб.

w 45. Метод съгласно претенция 36, където злокачествената клетка е клетка на карцином на яйчниците.