CN113135995A

CN113135995A - 抗her3单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN113135995A
Application number: CN202010052591.2A
Authority: CN
Inventors: 瞿爱东; 梁红远; 李翱翔; 邱建华; 赵鑫; 宋效飞; 吴丽娜; 祝婧烨; 陆瑾; 董常欣; 罗冲亚
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2040-01-17
Also published as: CN113135995B

Abstract

本发明提供了抗HER3人源化单克隆抗体及其制剂。具体地，本发明提供了一种新的抗HER3人源化抗体。本发明的抗体能够高特异性地结合HER3抗原，具有较高的亲和力和生物活性，可特异性结合抗原分子，尤其是人源化抗体有效降低了鼠抗的免疫原性。本发明的HER3抗体与赫赛汀

爱必妥

Description

抗HER3单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地涉及抗HER3人源化单克隆抗体及其制剂。

背景技术

越来越多的研究发现人表皮生长因子3(human epidermal growth factorreceptor 3，HER3)在肿瘤的发生、进展等方面发生着重要的作用。HER3通常与EGFR或HER2分子形成异二聚体而发挥作用，在癌症病理组织，EGFR、HER2过表达常常伴随着HER3的过表达，并且认为HER3过表达对EGFR、HER2靶向治疗产生耐药性起到重要作用。HER3与配体Heregulin(HRG)结合后构象发生变化，暴露出与EGFR、HER2结合的位点，进而与EGFR、HER2分子形成异二聚体，激活细胞内信号，促进肿瘤细胞增殖。

由于鼠单抗在临床治疗时会引起人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody，HAMA)，因此在临床治疗上受到限制。抗体人源化技术可以很大程度的降低鼠单抗的免疫原性。

因此，本领域仍然需要开发一种高亲和力高生物活性的HER3人源化抗体及其应用。

发明内容

本发明目的是提供了一种高亲和力高生物活性的HER3人源化抗体及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

(1)互补决定区CDR1，所述互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示；

(2)互补决定区CDR2，所述互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:17所示；及

(3)互补决定区CDR3，所述互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.:18所示。

在另一优选例中，所述重链可变区包括以下四个骨架区FR:

(1)骨架区FR1

所述骨架区FR1的氨基酸序列具有选自以下序列：SEQ ID NO.:22、和SEQ ID NO.:30；

(2)骨架区FR2

所述骨架区FR2的氨基酸序列具有选自以下序列：SEQ ID NO.:23、和SEQ ID NO.:31；

(3)骨架区FR3

所述骨架区FR3的氨基酸序列具有选自以下序列：SEQ ID NO.:24、和SEQ ID NO.:32；及

(4)骨架区FR4

所述骨架区FR4的氨基酸序列具有选自以下序列：SEQ ID NO.:25、和SEQ ID NO.:33。

在另一优选例中，所述重链可变区的四个骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:22、SEQ ID NO.:23、SEQ ID NO.:24和SEQ ID NO.:25所示；或者

所述重链可变区的四个骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.:30、SEQ ID NO.:31、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:33所示。

在另一优选例中，所述的重链可变区具有SEQ ID NO.:1或5所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种抗体重链，所述抗体重链具有如本发明第一方面所述的抗体的重链可变区。

在另一优选例中，所述抗体重链具有SEQ ID NO.:2或6所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重链的恒定区是人源的。

在另一优选例中，所述重链的恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区。

在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR’：

(1)互补决定区CDR1’，所述互补决定区CDR1’的氨基酸序列如SEQ ID NO.:19所示；

(2)互补决定区CDR2’，所述互补决定区CDR2’的氨基酸序列如SEQ ID NO.:20所示；及

(3)互补决定区CDR3’，所述互补决定区CDR3’的氨基酸序列如SEQ ID NO.:21所示。

在另一优选例中，所述轻链可变区包括以下四个骨架区FR’:

(1)骨架区FR1’

所述骨架区FR1’的氨基酸序列具有选自以下序列：SEQ ID NO.:26、和SEQ IDNO.:34；

(2)骨架区FR2’

所述骨架区FR2’的氨基酸序列具有选自以下序列：SEQ ID NO.:27、和SEQ IDNO.:35；

(3)骨架区FR3’

所述骨架区FR3’的氨基酸序列具有选自以下序列：SEQ ID NO.:28、和SEQ IDNO.:36；及

(4)骨架区FR4’

所述骨架区FR4’的氨基酸序列具有选自以下序列：SEQ ID NO.:29、和SEQ IDNO.:37。

在另一优选例中，所述轻链可变区的四个骨架区FR1’、FR2’、FR3’、FR4’的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:28和SEQ ID NO.:29所示；或者

所述轻链可变区的四个骨架区FR1’、FR2’、FR3’、FR4’的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.:34、SEQ ID NO.:35、SEQ ID NO.:36和SEQ ID NO.:37所示。

在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.:3或7所示的氨基酸序列。

在本发明的第四方面，提供了一种抗体轻链，所述抗体轻链具有如本发明第三方面所述的抗体的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体轻链具有SEQ ID NO.:4或8所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述轻链的恒定区是人源的。

在另一优选例中，所述轻链的恒定区为人Kappa、Lambda等的轻链恒定区。

在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。

或者，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述抗体还具有重链恒定区和轻链恒定区。

在另一优选例中，所述抗体具有如SEQ ID NO.:1或5所示的重链可变区；和/或如SEQ ID NO.:3或7所示的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体具有如SEQ ID NO.:2或6所示的重链；和/或如SEQ IDNO.:4或8所示的轻链。

在另一优选例中，所述抗体为人源化抗体。

在另一优选例中，所述抗体为特异性结合HER3。

在另一优选例中，所述抗体对人HER3的亲和力的KD值(M)为3.0E-10～1.0E-8。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为双特异性抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。

在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

在本发明的第七方面，提供了一种抗体制剂，所述的抗体制剂包括：

(a)如本发明第五方面所述的抗体；以及

(b)载体，所述的载体包括：缓冲剂、无菌水，任选的表面活性剂。

在另一优选例中，在所述的制剂中，所述抗体的浓度为5-100mg/mL；优选为10-70mg/mL，更优选为20-60mg/mL。

在另一优选例中，所述缓冲剂选自下组：柠檬酸缓冲体系、组氨酸缓冲体系、或其组合。

在另一优选例中，所述的表面活性剂选自下组：吐温80、吐温20、或其组合。

在另一优选例中，在所述的制剂中，所述的表面活性剂含量为0.005-0.2wt％，以所述抗体制剂的总重量计。

在另一优选例中，所述表面活性剂为吐温80，所述浓度为0.02-0.1wt％。

在另一优选例中，所述的制剂pH范围为5.0-7.5，较佳地为5.5-7。

在另一优选例中，所述的制剂为注射制剂。

在本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有如本发明第七方面所述的抗体制剂，以及盛装所述抗体制剂的容器。

在本发明的第九方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv段为特异性结合于HER3的结合区，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的轻链可变区和如本发明第三方面所述的重链可变区。

在本发明的第十方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第九方面所述的CAR构建物。

在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

在本发明的第十一方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

在本发明的第十二方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第十方面所述的免疫细胞、如本发明第十一方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于

(a)制备检测试剂或试剂盒；

(b)制备预防和/或治疗HER3相关疾病的药物或制剂；和/或

(c)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤为高表达HER3的肿瘤。

在另一优选例中，所述药物或制剂用于制备预防和/或治疗与HER3(表达阳性的)相关的疾病的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。

在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于诊断HER3相关疾病。

在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中HER3蛋白。

在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。

在本发明的第十三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第十方面所述的免疫细胞、如本发明第十一方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包含抗肿瘤的第二活性成分。

在另一优选例中，所述的第二活性成分选自下组：细胞毒性药物、毒素、细胞因子、酶、抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的第二活性成分包括：靶向EGFR的抗体、靶向HER2的抗体。

在另一优选例中，所述的第二活性成分选自下组：

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤为高表达HER3的肿瘤。

在本发明的第十四方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白；和/或

(3)如本发明第九方面所述的CAR构建物。

在本发明的第十五方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十四方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

在本发明的第十六方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十五方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十四方面所述的多核苷酸。

在本发明的第十七方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中HER3蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与如本发明第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HER3蛋白。

在本发明的第十八方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第十一方面所述的抗体药物偶联物。

在本发明的第十九方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第五方面所述的抗体；和/或

(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述的抗体的二抗；

或者，所述试剂盒含有如本发明第十八方面所述的检测板。

在本发明的第二十方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。

在本发明的第二十一方面，提供了一种HER3相关疾病的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了hu1044-7Y能有效阻断HER3分子与其配体HRG的结合。

图2显示了hu1044-7Y抗体能与乳腺癌细胞BT-474表面HER3分子结合。

图3显示了hu1044-7Y抗体与乳腺癌细胞BT-474表面HER3分子结合后有诱导内化作用。

图4显示了hu1044-7Y、赫赛汀和爱必妥对肿瘤细胞增殖的影响。

图5显示了hu1044-7Y和赫赛汀对HRG刺激的乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。

图6显示了hu1044-7Y与爱必妥或赫赛汀合用对肿瘤细胞增殖的影响。

图7显示了hu1044-7Y对HRE3介导的信号转导通路的影响。

图8显示了hu1044-7Y与赫赛汀或爱必妥合用对HER3介导的信号转导通路影响。

图9显示了荷瘤(人咽鳞癌Fadu)裸小鼠单次静脉注射2mg/kg hu1044-7Y后对肿瘤组织内HER3及其下游信号AKT磷酸化的影响。

图10显示了hu1044-7Y单用或与爱必妥合用对人非小细胞肺癌A549裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用。

图11显示了hu1044-7Y单用或与赫赛汀合用对人胃癌NCI-N87裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用。

图12显示了hu1044-7Y单用或与爱必妥合用对人咽鳞癌Fadu裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用。

图13显示了hu1044-7Y单用或与赫赛汀合用对人乳腺癌BT-474裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用。

图14显示了hu1044-7Y单用或与赫赛汀合用对人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用。

图15显示了荷瘤(人咽鳞癌Fadu)裸小鼠单次静脉注射2mg/kg hu1044-7Y后，血清及肿瘤组织药物浓度经时变化曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地获得一种具有亲和力优异的和良好的结构稳定性的抗HER3人源化抗体。具体地，本发明在选择人源化骨架区时兼顾相似性及人体使用频率，选择了IGKV3-20*01和IGHV1-69*01两个序列的骨架区进行人源化，并对获得的人源化抗体进行突变筛选。人源化后的抗体，尤其是突变后的人源化抗体达到与嵌合抗体相近的亲和力，通过对该人源化抗体溶解度及内源荧光的初步研究，证实该人源化已具备初步的成药性，未来有进一步开发成靶向治疗的人源化单抗药物。并对人源化后的抗体进行了初步成药性研究，筛选并确定了该抗HER3人源化抗体的制剂配方。优化的人源化抗体能有效抑制配体依赖及非依赖的HER3分子磷酸化，抑制多种肿瘤细胞的增值，抑制裸鼠内体抑制肿瘤的生长，具有优良的抗肿瘤活性，并与

药物有协同作用。在此基础上完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“V_L”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合HER3的抗体，例如具有重链(如SEQ ID NO.:2或6的氨基酸序列)和/或轻链(如SEQ ID NO.:4或8的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

HER3

人表皮生长因子3(human epidermal growth factor receptor 3，HER3)也称为ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受体酪氨酸蛋白质激酶erbB-3，是编码表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶家族的一名成员。在肿瘤的发生、进展等方面发生着重要的作用。HER3通常与EGFR或HER2分子形成异二聚体而发挥作用，在癌症病理组织，EGFR、HER2过表达常常伴随着HER3的过表达，并且认为HER3过表达对EGFR、HER2靶向治疗产生耐药性起到重要作用。HER3与配体Heregulin(HRG)结合后构象发生变化，暴露出与EGFR、HER2结合的位点，进而与EGFR、HER2分子形成异二聚体，激活细胞内信号，促进肿瘤细胞增殖。HER3在本发明的一个优选地实施方式中，人HER3的氨基酸序列如下所示：

MRANDALQVLGLLFSLARGSEVGNSQAVCPGTLNGLSVTGDAENQYQTLYKLYERCEVVMGNLEIVLTGHNADLSFLQWIREVTGYVLVAMNEFSTLPLPNLRVVRGTQVYDGKFAIFVMLNYNTNSSHALRQLRLTQLTEILSGGVYIEKNDKLCHMDTIDWRDIVRDRDAEIVVKDNGRSCPPCHEVCKGRCWGPGSEDCQTLTKTICAPQCNGHCFGPNPNQCCHDECAGGCSGPQDTDCFACRHFNDSGACVPRCPQPLVYNKLTFQLEPNPHTKYQYGGVCVASCPHNFVVDQTSCVRACPPDKMEVDKNGLKMCEPCGGLCPKACEGTGSGSRFQTVDSSNIDGFVNCTKILGNLDFLITGLNGDPWHKIPALDPEKLNVFRTVREITGYLNIQSWPPHMHNFSVFSNLTTIGGRSLYNRGFSLLIMKNLNVTSLGFRSLKEISAGRIYISANRQLCYHHSLNWTKVLRGPTEERLDIKHNRPRRDCVAEGKVCDPLCSSGGCWGPGPGQCLSCRNYSRGGVCVTHCNFLNGEPREFAHEAECFSCHPECQPMEGTATCNGSGSDTCAQCAHFRDGPHCVSSCPHGVLGAKGPIYKYPDVQNECRPCHENCTQGCKGPELQDCLGQTLVLIGKTHLTMALTVIAGLVVIFMMLGGTFLYWRGRRIQNKRAMRRYLERGESIEPLDPSEKANKVLARIFKETELRKLKVLGSGVFGTVHKGVWIPEGESIKIPVCIKVIEDKSGRQSFQAVTDHMLAIGSLDHAHIVRLLGLCPGSSLQLVTQYLPLGSLLDHVRQHRGALGPQLLLNWGVQIAKGMYYLEEHGMVHRNLAARNVLLKSPSQVQVADFGVADLLPPDDKQLLYSEAKTPIKWMALESIHFGKYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAEPYAGLRLAEVPDLLEKGERLAQPQICTIDVYMVMVKCWMIDENIRPTFKELANEFTRMARDPPRYLVIKRESGPGIAPGPEPHGLTNKKLEEVELEPELDLDLDLEAEEDNLATTTLGSALSLPVGTLNRPRGSQSLLSPSSGYMPMNQGNLGESCQESAVSGSSERCPRPVSLHPMPRGCLASESSEGHVTGSEAELQEKVSMCRSRSRSRSPRPRGDSAYHSQRHSLLTPVTPLSPPGLEEEDVNGYVMPDTHLKGTPSSREGTLSSVGLSSVLGTEEEDEDEEYEYMNRRRRHSPPHPPRPSSLEELGYEYMDVGSDLSASLGSTQSCPLHPVPIMPTAGTTPDEDYEYMNRQRDGGGPGGDYAAMGACPASEQGYEEMRAFQGPGHQAPHVHYARLKTLRSLEATDSAFDNPDYWHSRLFPKANAQRT(SEQ ID NO.:15)

在本发明的一个优选地实施方式中，抗HER3鼠单克隆抗体1044(申请号为2014104015453)可阻断HER3分子与其配体HRG的结合，从而抑制其与HER家族其它分子形成异二聚体，该抗体可以和肿瘤表面HER3分子结合，并抑制人表皮鳞状细胞癌A431细胞的增值，具有治疗多种HER3过表达肿瘤的潜力。

抗体

如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。

已有的抗体编号方案包括：

1.Kabat方案(Kabat等，1991)是基于相同结构域类型的序列之间的高序列变异区域的位置，抗体重(VH)和轻(Vλ和Vκ)可变结构域的编号不同。

2.Chothia的方案(Al-Lazikani，1997)与Kabat的方案相同，但校正了在第一个VH互补决定区(CDR)周围插入注释的位置，使其对应于结构环。同样，增强型Chothia计划(Abhinandan和Martin，2008)对插入位置进行了进一步的结构修正。

3.与这些类似Kabat的方案相反，IMGT(Lefranc，2003)和AHo(Honegger和Plückthun，2001)都定义了抗体和T细胞受体(TCR)(Vα和Vβ)可变结构域的独特方案。因此，可以容易地在域类型之间比较等效残基位置。IMGT和AHo在他们注释的位置数量(分别为128和149)以及他们认为indel发生的位置上有所不同。

免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其较链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2、IgG3，IgG4。轻链根据恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到竣基端依次排列的顺序序为:FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。本发明的实施例1中，结合kabat及Chothia方法，对1044抗体的6个CDR进行划分。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的抗HER3的单克隆抗体。制备时用HER3抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源HER3抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。

术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，HER3)的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括

(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；

(ii)F(ab’)₂片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；

(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；

(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。

Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publ ication91-3242)提供。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，HER3分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于1O^-8M、1O^-9M或lO^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

术语“竞争结合”是指与本发明的单克隆抗体识别HER3的胞外区上的相同表位(也称为抗原决定簇)或相同表位的一部分并与所述抗原结合的抗体。与本发明的单克隆抗体结合相同表位的抗体是指识别并结合于本发明的单克隆抗体所识别的HER3的氨基酸序列的抗体。

术语“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约1O^-8M、1O^-9M或lO^-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合HER3。

如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。

抗HER3人源化抗体

本发明提供抗HER3人源化抗体(以下简称HER3抗体)。具体地，本发明提供一种针对HER3的高特异性和高亲和力的人源化抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。

1986年Jones等人首次将鼠单抗重链CDR移植到人抗体重链骨架区，然后与鼠单抗轻链组装成完整抗体并保持了与原鼠单抗相似的亲和力，为抗体人源化技术的发展提供了思路。1989年Queen等人通过CDR移植的方法，成功构建抗CD25人源化抗体，该方法使用的是人抗体Eu骨架区进行人源化，在骨架区部分位点保留了鼠源抗体氨基酸以保持亲和力。1992年Presta等人报道了以人抗体亚群共有序列(consensus sequence)为模板进行CDR移植成功构建人源化的方法。1994年Pedersen等人报道了用表面重塑(resurfacing)的方法对抗体人源化。1994年Hsiao等人报道了以人抗体Germline序列骨架区进行CDR移植的人源化方法。1994年Jespers等人用噬菌体库(shuffling library)的方法成功构建人源化方法。

抗体人源化中人骨架区的选择通常有两种，一种是已知的成熟抗体，一种是人Germline序列。已知的成熟抗体骨架区通常含有体细胞突变位点，可能带来潜在的免疫原性。相比已成熟抗体，人Germline序列骨架区理论上免疫原性更低，而且结构更灵活，可塑性强，容易接受不同的CDR区。人抗体Germline基因在人体中的使用频率具有一定的偏向性，选择使用频率高的Germline骨架区人源化后的抗体具有免疫原性低、表达量高、结构稳定等优点。

在本发明的一个优选地实施方式中，在人源化时并未选择与鼠源抗体相似度最高的Germline序列，而是兼顾相似性及人体使用频率，经过大量实验筛选，选择了IGKV3-20*01和IGHV1-69*01两个序列的骨架区进行人源化。选用人抗体Germline骨架区进行CDR移植，这样构建的人源化抗体结构更加稳定、表达量高、免疫原性低、成药性更高。

在本发明的一个优选地实施方式中，对于上述1044鼠单抗进行人源化后得到人源化单克隆抗体hu1044抗体和另一人源化变体hu1044-7。所述人源化抗体的恒定区同抗HER3人-鼠嵌合单克隆抗体(申请号为2014104015453中所述1044嵌合抗体)的恒定区相同。

所述hu1044重链可变区：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWIDWVKQAPGQGLEWMGEILPGSGGTDYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:11)

所述hu1044轻链可变区：

DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSKSLLHSNGITYLYWYQQKPGQAPRLLIYQMSNLASGIPDRFSSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCAQNLELPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.:12)

所述hu1044-7重链可变区：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWIDWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGGTDYNEKFKGKATITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:13)

所述hu1044-7轻链可变区：

DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSKSLLHSNGITYLYWYQQKPGQAPRLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCAQNLELPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.:14)

在本发明的一个优选地实施方式中，对于上述人源化hu1044抗体和hu1044-7抗体进一步优化，将重链27位Gly突变为Tyr，得到hu1044Y、hu1044-7Y抗体。所述hu1044Y、hu1044-7Y抗体同抗HER3人-鼠嵌合单克隆抗体(申请号为2014104015453中所述1044嵌合抗体)的恒定区相同。

所述hu1044Y抗体重链可变区：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYWIDWVKQAPGQGLEWMGEILPGSGGTDYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:1)

所述hu1044Y抗体轻链可变区：

DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSKSLLHSNGITYLYWYQQKPGQAPRLLIYQMSNLASGIPDRFSSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCAQNLELPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.:3)

所述hu1044-7Y抗体重链可变区：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYWIDWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGGTDYNEKFKGKATITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:5)

所述hu1044-7Y抗体轻链可变区：

DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSKSLLHSNGITYLYWYQQKPGQAPRLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCAQNLELPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.:7)

在另一优选例中，所述的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或人kappa、Lambda轻链恒定区。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以优选为全人源化抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2、或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

本发明抗体可以是靶向HER3的人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。

本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

本发明中设计的抗体片段及其序列信息如下表所示：

抗体的制备

任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的HER3抗体。例如，可以用连接或天然存在的HER3蛋白或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。

任何合适形式的HER3都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对HER3特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、杆状病毒载体、质粒和非病毒载体。

人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。

人源化本发明HER3抗体的示例性方法描述于实施例1。

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

术语“载体”是指能够运输己与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物或动物细胞(如哺乳动物细胞)。

本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。

抗体制剂

抗体在不同的制剂缓冲液中具有不同的稳定性，表现为电荷异质性的变化、抗体分子的降解、聚合等，这些质量性质的变化与抗体本身的理化性质相关，因此，在抗体药物开发过程，需根据不同抗体的理化性质筛选适合其自身的制剂缓冲液。目前常用的抗体制剂缓冲体系有磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、组氨酸缓冲液等，同时根据抗体性质会添加不同浓度的盐离子或山梨醇、海藻糖、蔗糖等赋形剂，以及适量的吐温20或吐温80等表面活性剂，以维持抗体的稳定性。

本发明抗体制剂如本发明第七方面所述。

本发明的抗体药物组合制剂可有效抑制本发明人源化抗体的聚集沉淀、水解、氧化及脱酰胺等副反应，同时能有效提高产品在加压(高温、强光照射及冻融等)、加速及长期冷藏条件下的稳定性。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。

本发明的药物组合物可直接用于结合HER3蛋白分子，因而可用于预防和治疗HER3相关的疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。

检测用途和试剂盒

本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。

本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。

本发明的主要优点包括：

1.本发明人源化抗体为典型的色氨酸、酪氨酸包埋较好的结构，所筛选的人VH、VL骨架区模板结构稳定，且与鼠单抗CDR区适配较好，轻重链可变区能较好的配对在一起，亲和力高、结构稳定。

2.与嵌合抗体相比，本发明人源化抗体具有优异的生物活性、特异性，在保留与HER3相当的亲合力的同时，具有更低的免疫原性和更高的表达量。

3.本发明人源化抗体具有显著的体外生物活性，抑制体外培养肿瘤细胞增殖的活性，与

和

合用有协同增效作用的活性。

4.本发明人源化抗体具有显著的体内生物活性，对人咽鳞癌、人非小细胞肺癌、人胃癌、人乳腺癌细胞具有抑制活性，与

和

合用有协同增效作用的活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

材料与方法

1.菌株、细胞、质粒及试验动物

E.coli DH5α感受态细胞由本研究室制备；FreeStyle 293-F细胞及表达培养基购自Gibco公司；Babl/c裸鼠购自上海灵畅生物科技有限公司。

2.主要试剂及设备

定点突变试剂盒购买自北京赛百盛基因技术有限公司；Mabselect Sure亲和介质购自GE公司；

单抗(批号222330)购自德国默克公司；曲妥珠单抗(批号N3772)购自上海罗氏制药有限公司；HER3胞外区重组蛋白由CHO细胞重组表达；羊抗人抗体购自Jackson ImmunoResearch公司；Polyethylenimine(PEI MW 25000)购自Polysciences公司；OPM-CHO CD07、PFF05、CDF16培养基购自上海奥浦迈生物科技有限公司；1044鼠单抗为2014104015453中的抗体1044。

3.抗体表达制备

将抗体轻链、重链基因转入无血清悬浮培养的CHO-K1细胞，获得稳定表达抗体的CHO-k1细胞株。用稳定细胞株进行无血清悬浮培养表达重组抗体，培养结束后经离心或者过滤去除细胞，获得培养上清。细胞培养上清经过ProteinA亲和层析、低pH处理、阴离子层析、阳离子层析、纳米膜过滤后获得精纯的重组抗体，然后经超滤浓缩后将重组抗体置换到制剂缓冲液，获得最终的重组抗体。

4.ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统测定抗体亲和力

用ProteOn XPR36(Bio-rad)进行亲和力测定。将羊抗人IgG Fc抗体用pH4.5醋酸缓冲液稀释至200nM，然后固化在GLM芯片上(Bio-rad，GLLM4121D01)；待测抗体用PBST稀释至5ug/ml后在GLM芯片上进行捕获，将HER3蛋白用PBST稀释至10、5、2.5、1.25、0.625、0nM进行反应；对结合曲线进行拟合分析，获得亲和力数据。

5.阻断HER3与配体HRG的结合

用HER3配体HRG包被Elisa板并用脱脂牛奶进行封闭；将hGH标签的HER3胞外区蛋白稀释至1ug/ml作为抗体稀释液，将检测抗体用稀释液稀释至2ug/ml，然后按1:3比例梯度稀释，总共制备7个不同抗体浓度；稀释好的抗体加入Elisa板进行反应后洗板；加入HRP标记的抗hGH标签的抗体进行反应后洗板；加入TMB进行显色；在SpectraMax M5设备进行读数，波长450nm。

6.特异性结合细胞表面HER3

用Dylight 488 NHS Ester(Thermo Scientific，46403)标记抗体，hu1044-7Y与Dylight 488 NHS Ester在室温避光孵育1小时，磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中搅拌透析。然后，将不同浓度(0.01-10000ng/mL)的Dylight 488 NHS Ester标记的抗体与人乳腺癌细胞BT-474于4℃避光孵育1小时，离心去上清后以PBS重悬，流式细胞仪BD ACCURI C6 PLUS检测与细胞结合的药物荧光强度。

7.抗体介导的内吞作用

BT-474细胞(4×10⁵/mL)接种于6孔板中。加入1μg/mLDylight 488标记的hu1044-7Y于37℃分别孵育3小时、6小时、18小时、24小时。胰酶消化，离心去上清，Strip buffer(ddH2O,0.05M glycine,pH 2.45+0.1M NaCl)作用7分钟去除未内吞药物，用FACS buffer(PBS+1％BSA)洗三次，然后用流式细胞仪BD ACCURI C6 PLUS检测荧光强度。

8.磺酰罗丹明B蛋白染色法(SRB法)测细胞生长抑制率

接种一定数量(1.5×10⁴/mL)对数生长期细胞于96孔培养板。贴壁生长24小时后，加入不同浓度抗体药物、

或者

抗体浓度分别为(1、3、10、30、100、300、1000、3000、10000、100000ng/mL，单用)或(390.63、781.25、1562.5、3125、6250、12500、25000、50000、100000ng/mL，与

/

合用)；hu1044-7Y与

或

合用时，

所用浓度为39.06、78.125、156.25、312.5、625、1250、2500、5000、10000ng/mL；

所用浓度为0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200ng/mL。细胞经药物处理120小时，药物作用结束后，用三氯乙酸固定细胞。然后SRB(Sigma,S1402-25g)溶液染色；最后加入Tris溶液溶解SRB，Synergy H4酶标仪510nm波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔×100％两药合用时采用的浓度比为1:10(

:hu1044-7Y)和1:500(

:hu1044-7Y)，通过中效原理，以Calcu-Syn program软件计算联合指数(Combinationindex，CI)，判断两药联用时的相互关系(CI<1为协同，CI＝1为相加，CI>1为拮抗)。

9.CCK-8法测半数抑制浓度IC50

药物作用结束后，加入CCK-8工作液(日本同仁化学研究所)，4小时后，酶标仪(Synergy H4)450nm波长下测定OD值。以下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔×100％根据各浓度抑制率，计算半数抑制浓度IC50。

10.HRE3介导的信号转导

细胞接种于六孔板，加入不同浓度(0.01、0.1、1、10、100g/mL)的hu1044-7Y、

或

以及两者合用(0.1g/mL hu1044-7Y加

/

)作用2小时后，加入1×SDS凝胶上样缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT，2％SDS，10％甘油，0.1％溴酚蓝)裂解细胞。细胞裂解物在沸水浴中加热变性，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用湿转系统将蛋白转移至PVDF膜，将PVDF膜置于封闭液(5％脱脂奶粉稀释于TBS/T)中室温封闭1小时，然后I，II抗反应(Anti-pHER3(4561)、anti-AKT(9272S)、anti-GAPDH(5174S)、anti-pAKT(9271S)购自Cel l Signaling Technology)；洗膜后，用ImmobilonWestern HRP Substrate luminal reagent试剂发色，Western Blot成像仪拍照。

11.体内肿瘤组织HER3分子的磷酸化

裸小鼠皮下接种5×10⁶人咽鳞癌Fadu细胞，待平均肿瘤体积生长至300mm³后，小鼠单次静脉注射(IV)2mg/kg抗体,给药体积10mL/kg；溶剂组给予相同体积的“溶剂”(生理盐水)。给药后5分钟、4小时、24小时、48小时、96小时、168小时分别将裸小鼠处死，每个剂量4只小鼠；眼眶取血，室温凝固后离心分离血清进行药物浓度检测；解剖取瘤，肿瘤组织用RIPA裂解后，以Western blot法检测肿瘤组织内HER3信号转导通路的影响。

12.对体内肿瘤组织的疗效

12.1对人非小细胞肺癌A549裸小鼠皮下移植瘤的疗效

裸小鼠皮下接种8×10⁶人非小细胞肺癌A549细胞，待平均肿瘤体积生长至～100mm³后，根据肿瘤体积将动物分组，每组6只。小鼠静脉注射(IV)药物，每周2次；给药体积10mL/kg；溶剂组给予相同体积的“溶剂”(生理盐水)。考察药物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径,肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b²其中a、b分别表示长、宽。T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。当肿瘤出现消退时，抑瘤率(TGI)(％)＝100-(T-T0)/T0×100。如果肿瘤比起始体积缩小，即T<T0或C<C0时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。实验结束(D21)、达到实验终点、或肿瘤体积达到1500mm³，CO2麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。肿瘤体积之间比较采用双尾Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。

12.2对人胃癌NCI-N87裸小鼠皮下移植瘤的疗效

裸小鼠皮下接种6×10⁶人胃癌NCI-N87细胞，待平均肿瘤体积生长至～100mm³后，根据肿瘤体积将动物分组，每组6只。小鼠静脉注射(IV)药物，每周2次；给药体积10mL/kg；溶剂组给予相同体积的“溶剂”(生理盐水)。每周测2次肿瘤体积，称小鼠体重，记录数据。实验指标为考察药物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径,肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b²其中a、b分别表示长、宽。T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。当肿瘤出现消退时，抑瘤率(TGI)(％)＝100-(T-T0)/T0×100。如果肿瘤比起始体积缩小，即T<T0或C<C0时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。实验结束(D21)、达到实验终点、或肿瘤体积达到1500mm³，CO2麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。肿瘤体积之间比较采用双尾Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。

12.3对人乳腺癌BT-474裸小鼠皮下移植瘤的疗效

裸小鼠皮下接种8×10⁶人乳腺癌BT-474细胞，待平均肿瘤体积生长至100-150mm³后，根据肿瘤体积将动物分组(D0)。小鼠静脉注射(IV)药物，每周2次；给药体积10mL/kg；溶剂组给予相同体积的“溶剂”(生理盐水)。每周测2次肿瘤体积，称小鼠体重，记录数据。实验指标为考察药物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径,肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。当肿瘤出现消退时，抑瘤率(TGI)(％)＝100-(T-T0)/T0×100如果肿瘤比起始体积缩小，即T<T0或C<C0时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。实验结束(D21)、达到实验终点、或肿瘤体积达到1500mm³，CO2麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。肿瘤体积之间比较采用双尾Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。

实施例1抗体人源化改造

1.1结合kabat及Chothia方法，对抗HER3鼠单克隆抗体1044的6个CDR进行划分(见下划线部分氨基酸)。所述的抗HER3鼠单克隆抗体1044可以从专利文献CN2014104015453获得，其重链可变区和轻链可变区的序列如下所示：

所述1044重链：

EVQLQQSGTELMKPGASVKISCKATGGTFSNYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGGTDYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.:9)

1044抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：

	SEQ ID NO.:9中位置	序列
			FR1	1-25	EVQLQQSGTELMKPGASVKISCKAT
CDR1	26-35	<u>GGTFSNYWID</u>
			FR2	36-49	WVKQRPGHGLEWIG
CDR2	50-66	<u>EILPGSGGTDYNEKFKG</u>
			FR3	67-98	KATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR
CDR3	99-106	<u>DDYDVFAY</u>
			FR4	107-117	WGQGTLVTVSS

所述1044轻链：

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.:10)

1044抗体轻链可变区中，各FR和CDR如下：

	SEQ ID NO.:10中位置	序列
			FR1'	1-23	DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISC
CDR1'	24-39	<u>RSSKSLLHSNGITYLY</u>
			FR2'	40-54	WYLQKPGQSPQLLIY
CDR2'	55-61	<u>QMSNLAS</u>
			FR3'	62-93	GVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYC
CDR3'	94-102	<u>AQNLELPWT</u>
			FR4'	103-113	FGGGTKLEIKR

1.2抗HER3人源化抗体

选择人IGKV3-20*01氨基酸序列作为轻链人源化模板，选择人IGHV1-69*01氨基酸序列作为重链人源化模板。将鼠单抗1044轻重链CDR区移植到人模板骨架区，人Jκ1序列替换鼠单抗Jκ区，人JH4序列替换鼠单抗JH区。由于CDR移植后的人源化抗体与HER3蛋白亲和力比嵌合抗体约降低32倍，因此又进行回复突变。最终1044鼠单抗进行人源化后，得到如下所示的人源化单克隆抗体hu1044和另一人源化变体hu1044-7。

1.2.1hu1044抗体

所述的hu1044抗体的重链可变区和轻链可变区的序列如下所示：

hu1044重链可变区：

	SEQ ID NO.:11中位置	序列
			FR1	1-25	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS
CDR1	26-35	<u>GGTFSNYWID</u>
			FR2	36-49	WVKQAPGQGLEWMG
CDR2	50-66	<u>EILPGSGGTDYNEKFKG</u>
			FR3	67-98	RVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
CDR3	99-106	<u>DDYDVFAY</u>
			FR4	107-117	WGQGTLVTVSS

hu1044轻链可变区：

	SEQ ID NO.:12中位置	序列
			FR1'	1-23	DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSC
CDR1'	24-39	<u>RSSKSLLHSNGITYLY</u>
			FR2'	40-54	WYQQKPGQAPRLLIY
CDR2'	55-61	<u>QMSNLAS</u>
			FR3'	62-93	GIPDRFSSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC
CDR3'	94-102	<u>AQNLELPWT</u>
			FR4'	103-113	FGQGTKVEIKR

小结：hu1044抗体的骨架区以人IGKV3-20*01氨基酸序列为轻链模板，同时保留了第1、4、69位点1044鼠单抗的氨基酸(VL1保留Asp、VL4保留Met、VL69保留Ser)；以人IGHV1-69*01氨基酸序列为重链模板，同时保留了第38、74位点1044鼠单抗的氨基酸(VH38保留Lys、VH74保留Thr)。

	FR2、FR3	FR1'、FR3'
			1044抗体；hu1044抗体	VH38 Lys、VH74 Thr	VL1 Asp、VL4 Met、VL69 Ser

1.2.2 hu1044-7抗体

所述的hu1044-7抗体的重链可变区和轻链可变区的序列如下所示：

hu1044-7重链可变区：

	SEQ ID NO.:13中位置	序列
			FR1	1-25	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS
CDR1	26-35	<u>GGTFSNYWID</u>
			FR2	36-49	WVRQAPGQGLEWMG
CDR2	50-66	<u>EILPGSGGTDYNEKFKG</u>
			FR3	67-98	KATITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
CDR3	99-106	<u>DDYDVFAY</u>
			FR4	107-117	WGQGTLVTVSS

hu1044-7轻链可变区：

	SEQ ID NO.:14中位置	序列
			FR1'	1-23	DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSC
CDR1'	24-39	<u>RSSKSLLHSNGITYLY</u>
			FR2'	40-54	WYQQKPGQAPRLLIY
CDR2'	55-61	<u>QMSNLAS</u>
			FR3'	62-93	GVPDRFSSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC
CDR3'	94-102	<u>AQNLELPWT</u>
			FR4'	103-113	FGQGTKVEIKR

小结：hu1044-7抗体的骨架区以人IGKV3-20*01氨基酸序列为轻链模板，同时保留了第1、4、63、69位点1044鼠单抗的氨基酸(VL1保留Asp、VL4保留Met、VL63保留Val、VL69保留Ser)；以人IGHV1-69*01氨基酸序列为重链模板，同时保留了第67、68、74位点1044鼠单抗的氨基酸(VH67保留Lys、VH68保留Ala、VH74保留Thr)。

	FR3	FR1'、FR3'
			1044抗体；hu1044-7抗体	VH67Lys、VH68Ala、VH74Thr	VL1 Asp、VL4Met、VL63Val、VL69Ser

比较：

人源化抗体hu1044和hu1044-7抗体区别在于，hu1044和hu1044-7抗体轻链第63位及重链第38、67、68位点氨基酸不同，hu1044抗体为VL63Ile、VH38Lys、VH67Arg、VH68Val，hu1044-7抗体为VL63Val、VH38Arg、VH67Lys、VH68Ala。

	FR2、FR3	FR3'
			hu1044抗体	VH38Lys、VH67Arg、VH68Val	VL63Ile
hu1044-7抗体	VH38Arg、VH67Lys、VH68Ala	VL63Val

1.3抗HER3人源化抗体优化

对人源化抗体hu1044和hu1044-7的经典结构(canonical structure)进行分析，发现上述两种人源化抗体的重链27位氨基酸VH27为Gly，经过大量筛选，发明人意外地发现将重链27位Gly突变为Tyr得到优化的hu1044Y、hu1044-7Y抗体，能够提高抗体的亲和力。

1.3.1hu1044Y抗体

所述的hu1044Y抗体的重链可变区和轻链可变区的序列如下所示：

hu1044Y抗体重链可变区：

hu1044Y抗体重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYWIDWVKQAPGQGLEWMGEILPGSGGTDYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.:2)

hu1044Y抗体轻链可变区：

hu1044Y抗体轻链：

DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSKSLLHSNGITYLYWYQQKPGQAPRLLIYQMSNLASGIPDRFSSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCAQNLELPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.:4)

小结：优化的hu1044Y抗体相对于hu1044，hu1044Y抗体重链27位氨基酸回复突变VH27由Gly变为Tyr。

优化	CDR1
		hu1044抗体	VH27Gly
hu1044Y抗体	VH27Tyr

1.3.2 hu1044-7Y抗体

所述的hu1044-7Y抗体的轻链可变区和重链可变区的序列如下所示：

hu1044-7Y抗体重链可变区：

hu1044-7Y抗体重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYWIDWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGGTDYNEKFKGKATITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYDVFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.:6)

hu1044-7Y抗体轻链可变区：

hu1044-7Y抗体轻链：

DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSKSLLHSNGITYLYWYQQKPGQAPRLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCAQNLELPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.:8)

小结：优化的hu1044-7Y抗体相对于hu1044-7，hu1044-7Y抗体重链27位氨基酸回复突变VH27由Gly变为Tyr。

优化	CDR1
		hu1044-7抗体	VH27Gly
hu1044-7Y抗体	VH27Tyr

比较：

优化的人源化抗体hu1044Y和hu1044-7Y抗体区别在于，hu1044Y和hu1044-7Y抗体轻链第63位及重链第38、67、68位点氨基酸不同，hu1044Y抗体为VL63Ile、VH38Lys、VH67Arg、VH68Val，hu1044-7Y抗体为VL63Val、VH38Arg、VH67Lys、VH68Ala。

	FR2、FR3	FR3'
			hu1044Y抗体	VH38Lys、VH67Arg、VH68Val	VL63Ile
hu1044-7Y抗体	VH38Arg、VH67Lys、VH68Ala	VL63Val

1.5抗体与HER3蛋白亲和力(KD)比较

抗体	亲和力常数(M)
		hu1044	4.42E-10
hu1044Y	2.32E-10
		hu1044-7	3.75E-10
hu1044-7Y	1.17E-10

结果：如上表所示，hu1044抗体与HER3蛋白亲和力(KD)为4.42E-10(M)，hu1044Y与HER3蛋白亲和力(KD)为2.32E-10(M)，故hu1044Y抗体比hu1044抗体亲和力提高约2倍。hu1044-7抗体与HER3蛋白亲和力(KD)为3.75E-10(M)，hu1044-7Y与HER3蛋白亲和力(KD)为1.17E-10(M)，故hu1044-7Y抗体比hu1044-7抗体亲和力提高约3倍。因此，优化的人源化抗体hu1044Y和hu1044-7Y抗体具有优越的抗体亲和力。

实施例检测4

0.107

结果：如上表所示，hu1044-7Y抗体可以阻断HER3与配体HRG的结合，IC₅₀约0.1ug/ml。

2.2 hu1044-7Y特异性结合细胞表面HER3的活性

结果如图2所示，在对照组(hIgG1)未见明显的荧光，100ng/mL hu1044-7Y与BT-474有明显的结合作用，结合能力具有明显的剂量依赖性。

2.3抗体介导的内吞作用的活性

BT-474细胞(4×10⁵/mL)接种于6孔板中。加入1ug/ml Dylight 488标记的hu1044-7Y于37℃分别孵育3小时、6小时、18小时、24小时。胰酶消化，离心去上清，Stripbuffer(ddH2O,0.05M glycine,pH 2.45+0.1M NaCl)作用7分钟去除未内吞药物，用FACSbuffer(PBS+1％BSA)洗三次，然后用流式细胞仪BD ACCURI C6 PLUS检测荧光强度。

结果如图3所示，在对照组(hIgG1)未见明显的荧光，而hu1044-7Y与细胞表面结合后，发生内吞，3小时内吞作用显著，抗体的内吞具有明显的时间依赖性。

2.4抑制体外培养肿瘤细胞增殖的活性

2.4.1接种一定数量(1.5×10⁴/mL)对数生长期细胞于96孔培养板。贴壁生长24小时后，加入不同浓度抗体药物、

或者

抗体浓度分别为(1、3、10、30、100、300、1000、3000、10000、100000ng/mL，单用)，细胞经药物处理120小时，药物作用结束后，用三氯乙酸固定细胞。然后SRB(Sigma,S1402-25g)溶液染色；最后加入Tris溶液溶解SRB，Synergy H4酶标仪510nm波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔×100％两药合用时采用的浓度比为1:10(

:hu1044-7Y)和1:500(

:hu1044-7Y)。

结果：如图4所示，hu1044-7Y、

和

对肿瘤细胞的增殖抑制作用。hu1044-7Y及参比药物

对不同组织来源HER2受体阳性的肿瘤细胞增殖具有一定的抑制作用，100μg/mL hu1044-7Y对人乳腺癌细胞SK-BR-3、BT-474、KPL-4和人胃癌细胞NCI-N87增殖抑制率分别为17.1％、27.6％、34.7％和15.7％；参比抗体

(100μg/mL)对上述肿瘤细胞增殖抑制分别为33.4％、52.6％、51.8％和10.4％。hu1044-7Y及参比药物

对EGFR受体阳性肺癌细胞A549和人咽鳞癌细胞Fadu的增殖也具有一定的抑制作用，100μg/mL hu1044-7Y对上述肿瘤细胞增殖抑制率分别为17.8％、21.6％；参比抗体

(100μg/mL)对上述细胞增殖抑制分别为43.9％、49.1％。

2.4.2药物作用结束后，加入CCK-8工作液(日本同仁化学研究所)，4小时后，酶标仪(Synergy H4)450nm波长下测定OD值。以下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔×100％根据各浓度抑制率，计算半数抑制浓度IC50。

结果：如图5所示，hu1044-7Y及参比药物

对HRG刺激的乳腺癌MCF-7细胞增殖具有很强的抑制作用，IC₅₀分别为13.3ng/mL和10.8ng/mL。

2.5 hu1044-7Y对

或

有协同增效作用的活性

2.5.1磺酰罗丹明B蛋白染色法(SRB法)：接种一定数量(1.5×10⁴/mL)对数生长期细胞于96孔培养板。贴壁生长24小时后，加入不同浓度抗体药物、

或者

抗体浓度分别为(390.63、781.25、1562.5、3125、6250、12500、25000、50000、100000ng/mL，与

/

合用)；hu1044-7Y与

或

合用时，

所用浓度为0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200ng/mL。

2.5.2细胞经药物处理120小时，药物作用结束后，用三氯乙酸固定细胞。然后SRB(Sigma,S1402-25g)溶液染色；最后加入Tris溶液溶解SRB，Synergy H4酶标仪510nm波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔×100％两药合用时采用的浓度比分别为1:10(

:hu1044-7Y)和1:500(

:hu1044-7Y)，通过中效原理，以Calcu-Syn program软件计算联合指数(Combination index，CI)，判断两药联用时的相互关系(CI<1为协同，CI＝1为相加，CI>1为拮抗)。

HER2-HER3异二聚体被认为是HER家族中信号转导能力最强的二聚体。

是人源化单克隆抗体，特异性地作用于人HER2的细胞外部位；抗HER3抗体hu1044-7Y能够与HRE3特异性结合，抑制HRE3的活化。在HER2高表达乳腺癌BT-474细胞中，我们检测了

与hu1044-7Y合用的抗肿瘤活性。此外，在EGFR高表达咽鳞癌Fadu细胞中，我们检测了

与hu1044-7Y合用的抗肿瘤活性。

结果：如图6所示，hu1044-7Y与

合用后对肿瘤细胞增殖抑制活性显著增强，CI为0.04，表明两药合用具有协同效应。hu1044-7Y与

合用后对肿瘤细胞增殖抑制活性显著增强，CI为0.12，表明两药合用具有协同效应。

小结：上述结果表明hu1044-7Y与

或

合用后共同抑制HER3/HER2或HRE3/EGFR二聚体的形成，从而产生协同的抗肿瘤作用。

2.6hu1044-7Y抑制HRE3介导的信号转导

或

以及两者合用(0.1g/mL hu1044-7Y加

/

)作用2小时后，加入1×SDS凝胶上样缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT，2％SDS，10％甘油，0.1％溴酚蓝)裂解细胞。细胞裂解物在沸水浴中加热变性，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用湿转系统将蛋白转移至PVDF膜，将PVDF膜置于封闭液(5％脱脂奶粉稀释于TBS/T)中室温封闭1小时，然后I，II抗反应(Anti-pHER3(4561)、anti-AKT(9272S)、anti-GAPDH(5174S)、anti-pAKT(9271S)购自Cell Signaling Technology)；洗膜后，用ImmobilonWestern HRP Substrate luminal reagent试剂发色，Western Blot成像仪拍照。

结果：

如图7所示，hu1044-7Y抑制BT-474和Fadu细胞内HER3及下游信号分子AKT的磷酸化，抑制活性具有浓度依赖性，hu1044-7Y在0.1μg/mL时对HER3以及下游信号通路具有显著抑制作用；在乳腺癌细胞MCF-7细胞中，hu1044-7Y抑制HRG刺激的HER3及下游信号分子AKT磷酸化，hu1044-7Y在0.01μg/mL时即具有显著抑制作用。

此外，如图8所示，hu1044-7Y增强

对BT-474细胞内HER3及下游信号分子AKT磷酸化抑制活性；增强

对A549细胞内HER3及下游信号分子AKT磷酸化抑制活性。

小结：上述结果表明，hu1044-7Y能够同时阻断配体依赖和非配体依赖的HER3活化，与EGFR或HER2抗体联用，增效对PI3K/AKT信号通路的抑制活性。

实施例3优化人源化抗体的体内生物活性

3.1 hu1044-7Y抑制体内肿瘤组织HER3分子的磷酸化

裸小鼠皮下接种5×10⁶人咽鳞癌Fadu细胞，待平均肿瘤体积生长至～300mm³后，小鼠单次静脉注射(IV)2mg/kg抗体,给药体积10mL/kg；溶剂组给予相同体积的“溶剂”(生理盐水)。给药后5分钟、4小时、24小时、48小时、96小时、168小时分别将裸小鼠处死，每个剂量4只小鼠；眼眶取血，室温凝固后离心分离血清进行药物浓度检测；解剖取瘤，肿瘤组织用RIPA裂解后，以Western blot法检测肿瘤组织内HER3信号转导通路的影响。

结果：

如图9所示，荷瘤(人咽鳞癌Fadu)裸小鼠单次静脉注射hu1044-7Y 2mg/kg后4小时，皮下肿瘤组织内HER3磷酸化即被明显抑制，抑制作用至少持续168小时；HER3下游信号分子AKT磷酸化同样被明显抑制，抑制作用持续168小时；说明hu1044-7Y单次静脉注射即明显抑制人咽鳞癌Fadu裸小鼠皮下移植瘤组织内HER3/AKT信号转导通路。

如图15所示，荷瘤(人咽鳞癌Fadu)裸小鼠单次静脉注射hu1044-7Y 2mg/kg后，血清t_1/2为178.8小时，Cmax为18.5μg/mL,AUC_0-t为1356.2hr*μg/mL,MRT257.8小时；肿瘤组织内Cmax为561.2ng/g,AUC_0-t为73281.4hr*ng/g。

3.2 hu1044-7Y单用或与

合用对人非小细胞肺癌A549裸小鼠皮下移植瘤的疗效

裸小鼠皮下接种8×10⁶人非小细胞肺癌A549细胞，待平均肿瘤体积生长至～100mm³后，根据肿瘤体积将动物分组，每组6只。小鼠静脉注射(IV)药物，每周2次；给药体积10mL/kg；溶剂组给予相同体积的“溶剂”(生理盐水)。考察药物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径,肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b²其中a、b分别表示长、宽。T/C(％)＝(T-T₀)/(C-C₀)×100，其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T₀、C₀为实验开始时的肿瘤体积。抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。当肿瘤出现消退时，抑瘤率(TGI)(％)＝100-(T-T₀)/T₀×100。如果肿瘤比起始体积缩小，即T<T₀或C<C₀时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。实验结束(D21)、达到实验终点、或肿瘤体积达到1500mm³，CO₂麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。肿瘤体积之间比较采用双尾Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。

结果：

如图10所示，hu1044-7Y(2、6、20mg/kg,IV,每周2次，共6次)剂量依赖性地抑制人非小细胞肺癌A549裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为35％、57％和63％；

(1.5mg/kg,IV,每周2次，共6次)对A549皮下移植瘤的抑瘤率为50％；hu1044-7Y(6mg/kg,IV,每周2次，共6次)与

(1.5mg/kg,IV,每周2次，共6次)合用对A549的抑瘤率从单用hu1044-7Y时的57％提高到63％(P>0.05,与单药比较)。荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有体重减轻等症状发生。

*给药方式：静脉注射IV,每周2次，共6次

3.3 hu1044-7Y单用或与

合用对人胃癌NCI-N87裸小鼠皮下移植瘤的疗效

结果：

如图11所示，hu1044-7Y(2、6、20mg/kg,IV,每周2次，共6次)剂量依赖性地抑制人胃癌NCI-N87裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为27％、34％和51％；

(7.5mg/kg,IV,每周2次，共6次)对NCI-N87皮下移植瘤的抑瘤率为61％；hu1044-7Y(6mg/kg,IV,每周2次，共6次)与

(7.5mg/kg,IV,每周2次，共6次)合用对NCI-N87的抑瘤率从单用

时的61％提高到85％(P>0.06,与

比较)。荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有体重减轻等症状发生。

*给药方式：静脉注射IV,每周2次，共6次

3.4 hu1044-7Y单用或与

合用对人咽鳞癌Fadu裸小鼠皮下移植瘤的疗效

裸小鼠皮下接种5×10⁶人咽鳞癌Fadu细胞，待平均肿瘤体积生长至～100mm³后，根据肿瘤体积将动物分组，每组6只。小鼠静脉注射(IV)药物，每周2次；给药体积10mL/kg；溶剂组给予相同体积的“溶剂”(生理盐水)。每周测2次肿瘤体积，称小鼠体重，记录数据。实验指标为考察药物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径,肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。当肿瘤出现消退时，抑瘤率(TGI)(％)＝100-(T-T0)/T0×100。如果肿瘤比起始体积缩小，即T<T0或C<C0时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。实验结束(D21)、达到实验终点、或肿瘤体积达到1500mm³，CO2麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。肿瘤体积之间比较采用双尾Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。

结果：

如图12所示，hu1044-7Y(2、6、20mg/kg,IV,每周2次，共3次)剂量依赖性地显著抑制人咽鳞癌Fadu裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为98％、100％和126％，分别有2/6、3/6、6/6肿瘤部分消退；

(0.5mg/kg,IV,每周2次，共3次)对Fadu皮下移植瘤的抑瘤率为28％；hu1044-7Y(6mg/kg,IV,每周2次，共3次)与

(0.5mg/kg,IV,每周2次，共3次)合用对Fadu的抑瘤率从单用hu1044-7Y时的100％提高到165％,有4/6肿瘤部分消退和2/6肿瘤完全消退。荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有体重减轻等症状发生。结果提示hu1044-7Y对

治疗人咽鳞癌Fadu裸小鼠皮下移植瘤有显著增效作用(P<0.01,与单药比较),而毒性没有增加。

*给药方式：静脉注射IV,每周2次，共3次

3.5 hu1044-7Y单用或与

合用对人乳腺癌BT-474裸小鼠皮下移植瘤的疗效

结果：

hu1044-7Y(2、6、20mg/kg,IV,每周2次，共6次)抑制人乳腺癌BT-474裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为12％、11％和24％；

(7.5mg/kg,IV,每周2次，共6次)对BT-474皮下移植瘤的抑瘤率为52％；hu1044-7Y(6mg/kg,IV,每周2次，共6次)与

(7.5mg/kg,IV,每周2次，共6次)合用对BT-474的抑瘤率从单用

时的52％提高到93％(P<0.01,与

比较)，有1/6肿瘤部分消退。荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有体重减轻等症状发生。结果说明hu1044-7Y对

治疗人乳腺癌BT-474裸小鼠皮下移植瘤有显著增效作用(P<0.01,与单药比较),而毒性没有增加。

*给药方式：静脉注射IV,每周2次，共6次

3.6 hu1044-7Y单用或与

合用对

耐药人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠皮下移植瘤的疗效

裸小鼠皮下接种1.2×10⁷人乳腺癌BT-474/T721细胞，待平均肿瘤体积生长至～100mm³后，根据肿瘤体积将动物分组(D0)。小鼠静脉注射(IV)药物，每周2次；给药体积10mL/kg；溶剂组给予相同体积的“溶剂”(生理盐水)。每周测2次肿瘤体积，称小鼠体重，记录数据。实验指标为考察药物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径,肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、宽。T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。当肿瘤出现消退时，抑瘤率(TGI)(％)＝100-(T-T0)/T0×100。如果肿瘤比起始体积缩小，即T<T0或C<C0时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。实验结束(D21)、达到实验终点、或肿瘤体积达到1500mm³，CO2麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。肿瘤体积之间比较采用双尾Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。

结果：hu1044-7Y(6、20mg/kg,IV,每周2次，共6次)对人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠皮下移植瘤生长有较弱抑制作用，抑瘤率分别为26％和7％；

(7.5mg/kg,IV,每周2次，共6次)对BT-474/T721皮下移植瘤的抑瘤率为28％，说明BT-474/T721对

耐药；hu1044-7Y(6mg/kg,IV,每周2次，共6次)与

(7.5mg/kg,IV,每周2次，共6次)合用对BT-474/T721的抑瘤率从单用

时的28％提高到44％。荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有体重减轻等症状发生。结果说明hu1044-7Y联合

治疗

耐药人乳腺癌BT-474/T721裸小鼠皮下移植瘤有增效作用，但没有统计学显著性差异(P>0.05,与单药比较),而毒性没有增加。

*给药方式：静脉注射IV,每周2次，共6次

小结：上述结果表明hu1044-7Y抗体能特异性结合肿瘤细胞HER3分子，抑制EGFR、HER2阳性肿瘤细胞增殖、抑制HER3及其介导的下游信号转导，抑制多种EGFR、HER2阳性人肿瘤裸小鼠皮下移植瘤的生长，与

合用有协同增效抗肿瘤作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明涉及的序列信息如下:

其中,人源化抗体hu1044和hu1044-7与鼠单抗1044区别在于：

hu1044和hu1044-7抗体轻链第63位及重链第38、67、68位点氨基酸不同，

		FR2、FR3	FR3'
				hu1044抗体	hu1044Y抗体	VH38Lys、VH67Arg、VH68Val	VL63Ile
hu1044-7抗体	hu1044-7Y抗体	VH38Arg、VH67Lys、VH68Ala	VL63Val

优化的hu1044-7Y抗体相对于hu1044-7：仅重链27位氨基酸回复突变VH27由Gly变为Tyr。

		CDR1
			hu1044抗体	hu1044-7抗体	VH27Gly
hu1044Y抗体	hu1044-7Y抗体	VH27Tyr

将轻链骨架区第1、4、69位点、重链骨架区第38、74位点保留了1044鼠单抗的氨基酸，VL1保留Asp、VL4保留Met、VL69保留Ser及VH38保留Lys、VH74保留Thr，最终获得hu1044抗体。

序列表

<110> 上海生物制品研究所有限责任公司

<120> 抗HER3单克隆抗体及其应用

<130> P2019-2096

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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100 105 110

Arg

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<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 10

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 15

<211> 1342

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu

1 5 10 15

Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr

35 40 45

Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu

50 55 60

Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile

65 70 75 80

Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr

85 90 95

Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp

100 105 110

Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser

115 120 125

His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser

130 135 140

Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr

145 150 155 160

Ile Asp Trp Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val

165 170 175

Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly

180 185 190

Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr

195 200 205

Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn

210 215 220

Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp

225 230 235 240

Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val

245 250 255

Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu

260 265 270

Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala

275 280 285

Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala

290 295 300

Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys

305 310 315 320

Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser

325 330 335

Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val

340 345 350

Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu

355 360 365

Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu

370 375 380

Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln

385 390 395 400

Ser Trp Pro Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr

405 410 415

Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile

420 425 430

Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu

435 440 445

Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr

450 455 460

His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu

465 470 475 480

Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu

485 490 495

Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro

500 505 510

Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val

515 520 525

Cys Val Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala

530 535 540

His Glu Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu

545 550 555 560

Gly Thr Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys

565 570 575

Ala His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly

580 585 590

Val Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn

595 600 605

Glu Cys Arg Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro

610 615 620

Glu Leu Gln Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr

625 630 635 640

His Leu Thr Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe

645 650 655

Met Met Leu Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln

660 665 670

Asn Lys Arg Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu

675 680 685

Pro Leu Asp Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe

690 695 700

Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe

705 710 715 720

Gly Thr Val His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys

725 730 735

Ile Pro Val Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser

740 745 750

Phe Gln Ala Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His

755 760 765

Ala His Ile Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln

770 775 780

Leu Val Thr Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg

785 790 795 800

Gln His Arg Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val

805 810 815

Gln Ile Ala Lys Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu His Gly Met Val His

820 825 830

Arg Asn Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val

835 840 845

Gln Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys

850 855 860

Gln Leu Leu Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu

865 870 875 880

Glu Ser Ile His Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser

885 890 895

Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr

900 905 910

Ala Gly Leu Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu

915 920 925

Arg Leu Ala Gln Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met

930 935 940

Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu

945 950 955 960

Leu Ala Asn Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu

965 970 975

Val Ile Lys Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro

980 985 990

His Gly Leu Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu

995 1000 1005

Leu Asp Leu Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala Thr

1010 1015 1020

Thr Thr Leu Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Gly Thr Leu Asn Arg

1025 1030 1035 1040

Pro Arg Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Met Pro

1045 1050 1055

Met Asn Gln Gly Asn Leu Gly Glu Ser Cys Gln Glu Ser Ala Val Ser

1060 1065 1070

Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser Leu His Pro Met Pro

1075 1080 1085

Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser Glu Gly His Val Thr Gly Ser

1090 1095 1100

Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val Ser Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg

1105 1110 1115 1120

Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly Asp Ser Ala Tyr His Ser Gln Arg

1125 1130 1135

His Ser Leu Leu Thr Pro Val Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly Leu Glu

1140 1145 1150

Glu Glu Asp Val Asn Gly Tyr Val Met Pro Asp Thr His Leu Lys Gly

1155 1160 1165

Thr Pro Ser Ser Arg Glu Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser

1170 1175 1180

Val Leu Gly Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met

1185 1190 1195 1200

Asn Arg Arg Arg Arg His Ser Pro Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser

1205 1210 1215

Leu Glu Glu Leu Gly Tyr Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser

1220 1225 1230

Ala Ser Leu Gly Ser Thr Gln Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro Ile

1235 1240 1245

Met Pro Thr Ala Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met Asn

1250 1255 1260

Arg Gln Arg Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Met Gly

1265 1270 1275 1280

Ala Cys Pro Ala Ser Glu Gln Gly Tyr Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln

1285 1290 1295

Gly Pro Gly His Gln Ala Pro His Val His Tyr Ala Arg Leu Lys Thr

1300 1305 1310

Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala Phe Asp Asn Pro Asp Tyr

1315 1320 1325

Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn Ala Gln Arg Thr

1330 1335 1340

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Asp

1 5 10

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Asp Tyr Asp Val Phe Ala Tyr

1 5

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 22

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 23

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 28

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 30

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 31

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 32

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 34

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 36

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1 5 10

Claims

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

2.一种抗体重链，其特征在于，所述抗体重链具有如权利要求1所述的抗体的重链可变区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR’：

4.一种抗体轻链，其特征在于，所述抗体轻链具有如权利要求3所述的抗体的轻链可变区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。

6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有如SEQ ID NO.:1或5所示的重链可变区；和/或如SEQ ID NO.:3或7所示的轻链可变区。

7.一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

8.一种抗体制剂，其特征在于，所述的抗体制剂包括：

(a)如权利要求5所述的抗体；以及

9.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或其组合；和

10.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求7所述的重组蛋白、如权利要求9所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于

(a)制备检测试剂或试剂盒；

(b)制备预防和/或治疗HER3相关疾病的药物或制剂；和/或

(c)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。