CN114344342B - 副干酪乳杆菌Lp. R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

副干酪乳杆菌Lp. R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了副干酪乳杆菌Lp.R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的副干酪乳杆菌Lp.R3，保藏编号为CGMCCNo.22008；副干酪乳杆菌Lp.R3的菌悬液在小鼠体内显著促进肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化，和显著抑制肿瘤生长以及显著增强免疫检查点抑制剂PD‑1抑制肿瘤生长，具备应用于体内抗肿瘤或增强免疫检查点抑制剂抗肿瘤效应的潜能。本发明公开的一株副干酪乳杆菌Lp.R3在预防或治疗肿瘤方面有巨大的潜在应用前景。

Description

副干酪乳杆菌Lp.R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及副干酪乳杆菌Lp.R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是近年肿瘤治疗领域的研究热点，尤其是免疫检查点抑制剂的成功开发与应用，更是将肿瘤免疫治疗带入了一个新时代。与化疗、放疗、靶向治疗等常规治疗方法直接作用于肿瘤细胞不同，免疫检查点抑制剂是通过阻断肿瘤微环境中免疫检查点通路，激发肿瘤特异性T细胞功能，从而改善内源性抗肿瘤免疫，达到抗肿瘤效果。现在已有多种程序性死亡受体1(PD-1)、程序性死亡受体配体1(PD-L1)单抗获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床抗肿瘤治疗。然而，仍有相当一部分癌症无法通过免疫治疗成功治疗或控制肿瘤。事实上，只有少数非选择性实体瘤患者可以从此类免疫疗法中获益，但仍有复发风险。在这种情况下，制定策略来提高当前癌症免疫疗法的临床反应和治疗效果是紧迫和必要的。
越来越多的证据已经表明，肠道菌群可用于增强癌症免疫疗法的抗肿瘤功效。已发现共生菌通过影响局部和全身免疫系统来影响恶性肿瘤的发生和发展。肠道微生物群的失调被证明会影响PD-1阻断剂对荷瘤小鼠和癌症患者的治疗效果，而口服补充特定菌株可以提高抗肿瘤免疫反应。此外，研究人员还发现，CTLA-4阻断剂的抗肿瘤作用取决于肠道微生物群，尤其是拟杆菌物种，因此，表明肠道微生物群的操纵可能是改善癌症免疫治疗临床结果的有效方法。同时，国际益生菌专利申请集中于美、日、俄传统研发强国，而我国缺乏拥有自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民口腔、胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。
因此，提供副干酪乳杆菌Lp.R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了副干酪乳杆菌Lp.R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
副干酪乳杆菌Lp.R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lp.R3的保藏编号为CGMCC No.22008，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年3月15日，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei。
进一步，所述副干酪乳杆菌Lp.R3为菌悬液。
进一步，所述肿瘤包括如下实体肿瘤中的至少一种：结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、黑色素瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、纤维肉瘤、胆管癌。
进一步，所述肿瘤为结肠癌或肺癌。
进一步，所述副干酪乳杆菌Lp.R3在制备显著促进肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化药物中的应用。
进一步，副干酪乳杆菌Lp.R3在制备增强免疫检查点抑制剂治疗肿瘤效应的药物中的应用。
进一步，所述副干酪乳杆菌Lp.R3为菌悬液。
进一步，所述免疫检查点抑制剂为如下至少一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4单抗药物。
进一步，所述肿瘤包括如下实体肿瘤中的至少一种：结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、黑色素瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、纤维肉瘤、胆管癌。
进一步，所述肿瘤为结肠癌或肺癌。
进一步，所述副干酪乳杆菌Lp.R3在制备显著促进PD-1治疗肿瘤中的CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化药物中的应用。
本发明所述副干酪乳杆菌Lp.R3显著促进肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化，表现出良好的抑制肿瘤生长的作用，以及增强免疫检查点抑制剂PD-1抑制肿瘤生长的效应。
本发明所述在小鼠体内显著提高肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞占总细胞的比例，和显著抑制肿瘤生长以及显著增强免疫检查点抑制剂PD-1抑制肿瘤生长的菌株，为副干酪乳杆菌Lp.R3菌悬液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了副干酪乳杆菌Lp.R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用，副干酪乳杆菌Lp.R3是从健康婴幼儿粪便中分离筛选得到的，在小鼠体内具有显著促进肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化，和显著抑制肿瘤生长以及显著增强免疫检查点抑制剂PD-1抑制肿瘤生长的潜能，此为利用副干酪乳杆菌Lp.R3开发抗肿瘤或增强免疫抑制抗肿瘤效应的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3与相关种的16S rDNA序列系统发育树；
图2附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3在MRS固体培养基上形成的菌落形态图；
图3附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3在血液琼脂平板上的菌落形态；
其中，1，阴性对照菌：CICC 10417英诺克李斯特氏菌；2，阳性对照菌：CICC 10473金黄色葡萄球菌；3，样品：副干酪乳杆菌Lp.R3；
图4附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3革兰氏染色后的显微形态观察；
图5附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3药敏检测图；
其中，A：青霉素；B：氨苄西林；C：美罗培南；D：万古霉素；E：红霉素；F：克林霉素；G：利奈唑胺；
图6附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3和PD-1抗体联用对结肠癌细胞(MC38)生长体积的影响；
图7附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3和PD-1抗体联用对CD4+T细胞浸润结肠癌(MC38)组织的影响；
图8附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3和PD-1抗体联用对CD8+T细胞浸润结肠癌(MC38)组织的影响；
图9附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3和PD-1抗体联用对对肺癌细胞(LLC)生长体积的影响；
图10附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3和PD-1抗体联用对CD4+T细胞浸润肺癌(LLC)组织的影响；
图11附图为本发明副干酪乳杆菌Lp.R3和PD-1抗体联用对CD8+T细胞浸润肺癌(LLC)组织的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1副干酪乳杆菌Lp.R3分离、鉴定及保藏
(1)分离：将健康婴幼儿粪便经梯度稀释后，分别接种于MRS固体培养基、BHI固体培养基、BS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的单菌落划线分离得到纯菌落。将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。其中通用引物27F和1492R的序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
菌株的生理生化鉴定：挑取菌落制成菌悬液，用VITEKANC鉴定卡进行鉴定。具体生理生化结果见表1。
表1 Lp.R3生理生化反应结果
Figure BDA0003443903580000051
符号说明：“+”，阳性；“-”，阴性。
系统发育学分析：采用MEGA软件，邻位连接法显示“副干酪乳杆菌Lp.R3(Lactobacillus paracasei Lp.R3)”与相关种的16S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。
实验结果：从广东省东莞市健康婴幼儿新鲜粪便中筛选出的菌株，以16SrDNA同源性为基础，选取11个典型菌株的16S rDNA用MEGA软件进行系统进化分析，结果见图1。Lp.R3与副干酪乳杆菌模式菌株JCM 1171T(D16550)单独构成一个分支，反映出两者的亲缘关系最近。因此，经生理生化鉴定、16S rDNA鉴定、以及由系统发育树显示，菌株Lp.R3被鉴定为副干酪乳杆菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
CTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTA；SEQ ID NO.3。
(3)菌株的培养特性
用接种环挑取Lp.R3菌落，分区划线接种于MRS琼脂平板，37℃厌氧条件培养48h；另外，挑取Lp.R3菌落接种在血液琼脂平板上，以CICC 10417英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)为阴性对照菌，CICC 10473金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为阳性对照菌，37℃厌氧条件培养48h；观察MRS平板中菌落生长情况以及血液琼脂平板上有无溶血环形成。
实验结果：Lp.R3单菌落接种到MRS固体培养基上，37℃厌氧培养48h，菌落白色、圆形、表面湿润、不透明、边缘整齐(图2)；阴性对照菌CICC 10417英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)在血液琼脂平板上不出现溶血环，而阳性对照菌CICC 10473金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在血液琼脂平板上出现溶血环，副干酪乳杆菌Lp.R3在血液琼脂平板上不出现溶血环(图3)。
(4)菌株形态学鉴定：对筛选出的Lp.R3菌株革兰氏染色后于显微镜下观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
实验结果：Lp.R3菌体呈杆状，单个或成对排列，革兰氏阳性(图4)。
(5)药敏性试验：取上述培养Lp.R3菌株，采用E-test试验法进行对常用抗菌类药物的敏感性测定。
实验结果：由表2和图5可知，Lp.R3对青霉素、氨苄西林、红霉素、克林霉素、利奈唑胺敏感，对美罗培南中介，而对万古霉素不敏感。
表2 Lp.R3药敏性试验结果
抗菌药物 MIC值(μg/mL) 药敏性
青霉素(PEN) 0.25 敏感
氨苄西林(AM) 0.25 敏感
美罗培南(MP) 2 中介
万古霉素(VA) ≥256 耐药
红霉素(EM) 0.094 敏感
克林霉素(CM) 0.064 敏感
利奈唑胺(LZ) 0.50 敏感
实施例2副干酪乳杆菌Lp.R3菌悬液(菌体)的制备
将副干酪乳杆菌Lp.R3活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养15h后，6000r/min离心10min，收集菌体沉淀，经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×109CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例3肿瘤细胞悬液的制备
小鼠结肠癌细胞MC38和肺癌细胞LLC均购自ATCC；基底胶Matrigel购自Corning。
分别将对数生长期的结肠癌细胞MC38、肺癌细胞LLC，经胰酶消化，100×g离心5min，收集细胞，PBS洗涤细胞一次后，分别用PBS重悬为2×107个/mL的细胞悬液，再与预冷的Matrigel按1：1混合均匀制备成1×107个/mL的细胞悬液。
实施例4副干酪乳杆菌Lp.R3对结肠癌细胞(MC38)生长的影响
本实验通过了中国科学院广州生物医药与健康院实验动物伦理委员会伦理审查。C57B/6小鼠购自广东药康生物科技有限公司；InVivoMab anti-mouse PD-1购自BioXcel。
健康C57B/6小鼠40只，适应性喂养1周，小鼠随机分为4组，每组10只。对照组和PD-1组每天均灌胃100μL PBS；Lp.R3组和Lp.R3+PD-1组每天均灌胃100μL副干酪乳杆菌Lp.R3菌悬液(1×109CFU/mL)；灌胃一周后，每只小鼠皮下接种100μL结肠癌细胞MC38悬液(1×107个/mL)，同时继续灌胃28天。另外，在接种肿瘤细胞后第7，10，14，17天，PD-1组和Lp.R3+PD-1组的小鼠均腹腔注射PD-1抗体，注射剂量为每次每只小鼠100μg；同时对照组和Lp.R3组的小鼠均腹腔注射100μL 0.9％生理盐水。于接种肿瘤细胞后7天开始，每3天记录肿瘤体积。肿瘤体积计算如下：
肿瘤体积＝0.5×肿瘤长径×肿瘤宽径2
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用
Figure BDA0003443903580000091
数据表示，用单因素方差分析：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.001。
结果见图6；由图6可知，与对照组(2121.45±252.99mm3)相比，PD-1组的肿瘤体积(1446.46±373.19mm3)显著减少(P<0.01)，因此，PD-1具有抑制结肠癌生长的作用，与临床结果一致。
Lp.R3组的肿瘤体积为640.63±128.92mm3，与对照组(2121.45±252.99mm3)相比较差异性显著(P<0.001)。另外，Lp.R3+PD-1组的肿瘤体积为306.16±59.86mm3，与对照组(2121.45±252.99mm3)相比较差异性显著(P<0.001)，以及与PD-1组(1446.46±373.19mm3)相比较也差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌Lp.R3具有抑制结肠癌生长的作用，以及也具有增强免疫检查点抑制剂PD-1抑制结肠癌生长的效应。
实施例5副干酪乳杆菌Lp.R3对CD8+T和CD4+T细胞浸润结肠癌(MC38)组织的影响
取实施例4中每组每只小鼠的肿瘤组织约200mg，分别充分剪碎研磨，100μm尼龙细胞筛过滤，制成单细胞悬液，100×g离心5min，收集细胞沉淀，用PBS重悬为1×107个/mL的细胞悬液。按抗体说明书要求进行染色。染色完成后1h内上机检测。所用流式抗体FITC RatAnti-Mouse CD4和PE anti-mouse CD8a均购自Biolegend公司。
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用
Figure BDA0003443903580000101
数据表示，用单因素方差分析：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。
结果见图7、8；由图7和图8可知，与对照组(CD4+T细胞：4.21±1.42％；CD8+T细胞：4.03±0.91％)相比，PD-1组的肿瘤组织中CD4+T细胞(5.94±1.56％)和CD8+T细胞(5.90±1.12％)占总细胞的比例均显著升高(P<0.05)，因此，PD-1通过增加肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化，从而抑制结肠癌的生长，与临床结果一致。
Lp.R3组的肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞占总细胞的比例分别为7.57±1.22％和6.40±1.53％，与对照组(CD4+T细胞：4.21±1.42％；CD8+T细胞：4.03±0.91％)相比较均差异性显著(P<0.01)。另外，Lp.R3+PD-1组的肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞占总细胞的比例分别为9.32±1.13％和8.06±1.78％，与对照组(CD4+T细胞：4.21±1.42％；CD8+T细胞：4.03±0.91％)相比较均差异性显著(P<0.005)，以及与PD-1组(CD4+T细胞：5.94±1.56％；CD8+T细胞：5.90±1.12％)相比较也均差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌Lp.R3通过增加肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化，从而抑制结肠癌的生长或增强免疫检查点抑制剂PD-1抑制结肠癌生长的效应。
实施例6副干酪乳杆菌Lp.R3对肺癌细胞(LLC)生长的影响
本实验通过了中国科学院广州生物医药与健康院实验动物伦理委员会伦理审查。C57B/6小鼠购自广东药康生物科技有限公司；InVivoMab anti-mouse PD-1购自BioXcel。
健康C57B/6小鼠40只，适应性喂养1周，小鼠随机分为4组，每组10只。对照组和PD-1组每天均灌胃100μL PBS；Lp.R3组和Lp.R3+PD-1组每天均灌胃100μL副干酪乳杆菌Lp.R3菌悬液(1×109CFU/mL)；灌胃一周后，每只小鼠皮下接种100μL肺癌细胞LLC悬液(1×107个/mL)，同时继续灌胃28天。另外，在接种肿瘤细胞后第7，10，14，17天，PD-1组和Lp.R3+PD-1组的小鼠均腹腔注射PD-1抗体，注射剂量为每次每只小鼠100μg；同时对照组和Lp.R3组的小鼠均腹腔注射100μL 0.9％生理盐水。于接种肿瘤细胞后7天开始，每3天记录肿瘤体积。肿瘤体积计算如下：
肿瘤体积＝0.5×肿瘤长径×肿瘤宽径2
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用
Figure BDA0003443903580000111
数据表示，用单因素方差分析：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.001。
结果见图9；由图9可知，与对照组(2219.76±319.90mm3)相比，PD-1组的肿瘤体积(1412.77±384.86mm3)显著减少(P<0.01)，因此，PD-1具有抑制肺癌生长的作用，与临床结果一致。
Lp.R3组的肿瘤体积为794.91±136.18mm3，与对照组(2219.76±319.90mm3)相比较差异性显著(P<0.001)。另外，Lp.R3+PD-1组的肿瘤体积为399.87±123.86mm3，与对照组(2219.76±319.90mm3)相比较差异性显著(P<0.001)，以及与PD-1组(1412.77±384.86mm3)相比较也差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌Lp.R3具有抑制肺癌生长的作用，以及也具有增强免疫检查点抑制剂PD-1抑制肺癌生长的效应。
实施例7副干酪乳杆菌Lp.R3对CD8+T和CD4+T细胞浸润肺癌细胞(LLC)组织的影响
取实施例6中每组每只小鼠的肿瘤组织约200mg，分别充分剪碎研磨，100μm尼龙细胞筛过滤，制成单细胞悬液，100×g离心5min，收集细胞沉淀，用PBS重悬为1×107个/mL的细胞悬液。按抗体说明书要求进行染色。染色完成后1h内上机检测。所用流式抗体FITC RatAnti-Mouse CD4和PE anti-mouse CD8a均购自Biolegend公司。
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用
Figure BDA0003443903580000112
数据表示，用单因素方差分析：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。
结果见图10、11；由图10和图11可知，与对照组(CD4+T细胞：3.96±0.86％；CD8+T细胞：4.46±0.88％)相比，PD-1组的肿瘤组织中CD4+T细胞(5.80±1.13％)和CD8+T细胞(5.95±1.29％)占总细胞的比例均显著升高(P<0.05)，因此，PD-1通过增加肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化，从而抑制肺癌的生长，与临床结果一致。
Lp.R3组的肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞占总细胞的比例分别为7.01±1.29％和6.60±1.13％，与对照组(CD4+T细胞：3.96±0.86％；CD8+T细胞：4.46±0.88％)相比较均差异性显著(P<0.01)。另外，Lp.R3+PD-1组的肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞占总细胞的比例分别为8.62±1.72％和8.20±1.35％，与对照组(CD4+T细胞：3.96±0.86％；CD8+T细胞：4.46±0.88％)相比较均差异性显著(P<0.005)，以及与PD-1组(CD4+T细胞：5.80±1.13％；CD8+T细胞：5.95±1.29％)相比较也均差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌Lp.R3通过增加肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润和活化，从而抑制肺癌的生长或增强免疫检查点抑制剂PD-1抑制肺癌生长的效应。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 广东南芯医疗科技有限公司 佛山市朗芯生物科技有限公司
<120> 副干酪乳杆菌Lp. R3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga acgagttctc gttgatgatc ggtgcttgca 60
ccgagattca acatggaacg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgccctt 120
aagtggggga taacatttgg aaacagatgc taataccgca tagatccaag aaccgcatgg 180
ttcttggctg aaagatggcg taagctatcg cttttggatg gacccgcggc gtattagcta 240
gttggtgagg taatggctca ccaaggcgat gatacgtagc cgaactgaga ggttgatcgg 300
ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360
acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt tcgggtcgta 420
aaactctgtt gttggagaag aatggtcggc agagtaactg ttgtcggcgt gacggtatcc 480
aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540
ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag 600
ccctcggctt aaccgaggaa gcgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca 660
gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag 720
gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta 780
gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttggaggg tttccgccct 840
tcagtgccgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa 900
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 960
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tttgatcacc tgagagatca ggtttcccct 1020
tcgggggcaa aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatg actagttgcc agcatttagt tgggcactct 1140
agtaagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200
ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg agaccgcgag 1260
gtcaagctaa tctcttaaag ccattctcag ttcggactgt aggctgcaac tcgcctacac 1320
gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc cgaagccggt ggcgtaaccc 1440
tttta 1445

Claims (2)

1.副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）Lp.R3在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述副干酪乳杆菌Lp.R3的保藏编号为CGMCC No.22008；所述肿瘤为结肠癌或肺癌。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌Lp.R3在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述副干酪乳杆菌Lp.R3为菌悬液。
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