CN116769639A - 一种长双歧杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，公开了一种分离自PD‑1治疗有效肿瘤患者体内的长双歧杆菌及其应用。本发明通过使用长双歧杆菌SYSU10联合免疫检查点抑制剂对植瘤小鼠进行抗肿瘤治疗，长双歧杆菌SYSU10可以刺激产生抗肿瘤免疫保护反应，重塑肿瘤微环境，使“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。并且，长双歧杆菌SYSU10显著增强免疫检查点抑制剂对结直肠癌的治疗效果，不仅能够抑制肿瘤原位生长同时能够抑制肿瘤细胞的转移且安全性良好。本发明还提供了长双歧杆菌SYSU10与抗肿瘤活性小分子L‑岩藻糖联用构成的纳米载药系统，利用长双歧杆菌SYSU10厌氧趋向的特点将与功能性纳米颗粒结合，提供了高特异性的肿瘤靶向治疗方案。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种长双歧杆菌及其应用，具体涉及一种长双歧杆菌及其在制备纳米载药系统中的应用。
背景技术
在过去的半个世纪里，由于对癌症生物学的深入了解、手术效果的改善以及越来越有效的多模式化疗和放疗方案，癌症患者的生存期显著提高。细胞毒性药物仍然是大多数晚期疾病患者的主要治疗手段，但它们的治疗反应不可预测，且与治疗相关的发病率和死亡率相当高。
下一代个性化、安全性好、副作用小的癌症治疗方法正在出现，免疫检查点(ICI)治疗就是其中的代表。ICI疗法改变了传统的癌症治疗策略，打破了肿瘤放化疗治疗格局，使实体转移性恶性肿瘤的治疗取得了突破。目前已经发现的免疫检查点有程序性细胞死亡1(PD-1)及其配体(PD-L1)、淋巴细胞激活基因-3(LAG3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)等，这些免疫检查点的阻断能够释放免疫制动反应并有效抑制肿瘤免疫逃逸。
然而，ICI治疗的反应是异质性的，相关报道显示ICI治疗患者客观缓解率仅为10％-30％，也就说明有相当大的一部分患者人群对ICI的治疗存在不响应的情况，这严重降低了ICI的临床使用价值。决定患者是否应答ICI治疗的因素究竟是什么，这一难题长期以来困扰着研究人员。随着肠道微生物组学与生信分析技术的发展，肠道菌群与ICI治疗异质性开始被联系起来，为改善抗肿瘤免疫反应和扩大ICI功效提供了新的见解。但是复杂肠道微生物组的每个组成部分的具体功能和分子机制在很大程度上仍然未知。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种长双歧杆菌及其在制备纳米载药系统中的应用。本发明通过筛选出一株新的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)SYSU10可以与免疫检查点抑制剂联用发挥协同抗肿瘤效应，通过体外细胞实验及小鼠实验验证其抗肿瘤功效，并通过多种实验方法揭示其中的分子机制，提供抗肿瘤治疗新疗法，助力临床ICI治疗价值最大化。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10，所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10于2022年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25777，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的16S rDNA与已知长双歧杆菌菌株对比(National Center for Biotechnology数据库)至少存在三个碱基突变位点，其亲缘关系最近的菌株为Bifidobacterium longum subsp.suillum strainSu 851。
本发明收集了对PD-1抑制剂治疗有响应的肿瘤患者的粪便样本，通过在不同条件下培养成功分离并鉴定出一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10。
通过溶血试验、耐药性试验等证明分离出的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)SYSU10具有较好的安全性及益生菌特性。
通过肠道定植能力检测、耐酸耐胆盐测试与肠粘附性实验证明长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10具有良好的产业化潜力。
第二目的，本发明提供了一种制剂，所述制剂包括含有上述的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的菌悬液。
优选地，所述制剂通过口服、尾静脉注射、瘤内注射或癌旁注射等方式给药。本发明含有的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的制剂能够在肿瘤部位富集，发挥抗肿瘤疗效(抑制肿瘤生长与转移)，改善患者的生活质量。
优选地，所述制剂还包括药学上可接受的载体和辅料，所述制剂的剂型包括冻干粉，片剂、胶囊剂、颗粒剂或针剂中的至少一种。所述制剂可以制备成食品、饮料、食品补充剂、益生菌或保健食品。
优选地，所述制剂包括含有上述的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10活菌、细菌衍生物或者细菌代谢物中的至少一种组合的菌悬液。
第三目的，本发明提供了上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10在制备抗肿瘤制剂或药物中的应用。
第四目的，本发明提供了上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10、或其衍生物、或其代谢物联合免疫检查点抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明将长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10联合免疫检查点抑制剂可以更好地抑制肿瘤的生长。本发明通过抑制肿瘤的生长或减少肿瘤的转移灶来测量增强的治疗效果。
将长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10、或其衍生物、或其代谢物联合免疫检查点抑制剂构成组合物，其中长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10、或其衍生物、或其代谢物可以促进免疫检查点抑制剂的抗肿瘤疗效，抑制肿瘤生长与转移。
优选地，所述肿瘤肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、结直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多形成性胶质细胞瘤、胶质瘤、头颈癌、肾嫌色细胞癌、混合肾癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、前列腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃癌、食管癌、睾丸癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤和软组织肉瘤中的一种或几种。上述肿瘤的种类不仅仅为上述内容，还包括了恶性肿瘤、转移性肿瘤或非转移性肿瘤等本领域常规的肿瘤种类。
在本发明的一个具体的实施例中，肿瘤为结直肠癌。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述免疫检查点抑制剂为作用于T细胞负性共刺激/共抑制分子和/或其配体的阻断剂的一种或多种的组合；所述配体选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、A2AR、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、LAG-3、CD40、KIR、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR、DcR3中的一种。优选地，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1单克隆抗体。
第五目的，本发明提供了上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10在制备纳米载药系统中的应用。
第六目的，本发明提供了一种纳米递药系统，将上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10负载纳米颗粒形成纳米递药系统。
本发明利用长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10厌氧趋向的特点将其与功能性纳米颗粒结合构成纳米递药系统，提供了高特异性的肿瘤治疗方案。
作为本发明所述纳米递药系统的优选实施方式，所述纳米颗粒包括L-岩藻糖白蛋白。
作为本发明所述纳米递药系统的优选实施方式，所述纳米递药系统通过尾静脉进行注射。通过尾静脉注射上述纳米递药系统可以提高抗肿瘤的治疗效果。
本发明提供的纳米递药系统，可以明显改善毒副作用大、易转移复发、持续时间短、生存期短、和生活质量差等常规疗法的缺点；针对免疫检查点单药疗法的缺点：作用瘤种范围有限和药物响应人群少，有明显的改善；针对免疫检查点联合放化疗疗法的缺点：毒副作用大和药物响应人群少，有明显的改善。
本发明给出的治疗方法针对以下患者都有很好的治疗效果：治疗不可手术，无可用靶向药物，放疗，化疗等无效的肿瘤患者；治疗单药免疫检查点抑制剂无效或耐药(原发性、适应性和获得性耐药)的肿瘤患者；治疗免疫检查点抑制剂联合放疗、化疗、靶向治疗无效或耐药(原发性、适应性和获得性耐药)的肿瘤患者。
第七目的，本发明提供了一种上述纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：
S1、将上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的菌液接种于培养基，12h后达到对数生长期，取长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10使用；
S2、通过单轴静电喷雾工艺制备包裹有L-岩藻糖白蛋白的纳米颗粒；
S3、将S1所收集的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10与步骤S2所制得的纳米颗粒混合，再加入EDC和NHS，然后在37℃的厌氧环境中震荡孵育；洗涤离心，收集下层沉淀，即得纳米递药系统。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过使用长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10联合免疫检查点抑制剂(PD-1单克隆抗体)对植瘤小鼠进行抗肿瘤治疗，本发明筛选的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10可以刺激产生的抗肿瘤免疫保护反应，重塑肿瘤微环境，使“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。并且，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10显著增强免疫检查点抑制剂对结直肠癌的治疗效果，不仅能够抑制肿瘤原位生长同时能够抑制肿瘤细胞的转移且安全性良好。同时本发明还提供了一种长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)SYSU10与抗肿瘤活性小分子的L-岩藻糖联用构成纳米载药系统的形式，利用长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10厌氧趋向的特点将与功能性纳米颗粒结合，提供了高特异性的肿瘤靶向治疗方案。
附图说明
图1为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10基本形态图；
图2为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10进化树；
图3为溶血试验及耐药性试验图；
图4为实施例4的结果图；
图5为尾静脉长双歧杆菌组各组织匀浆涂板图；
图6实施例5的流程图；
图7实施例5的肿瘤体积变化曲线；
图8实施例5的小鼠体重图；
图9实施例5的肿瘤重量统计图；
图10实施例5的肿瘤转移灶图；
图11实施例5的瘤子流式结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在图1-11中所出现的“B.longum”、“长双歧”、“长双歧杆菌SYSU10”、“Bifidobacterium longum”均指代的是长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10。
实施例1、粪菌筛选与鉴定
本实施例收集了对PD-1抑制剂治疗有响应患者的粪便样本。
一、实验方法：
(1)粪便收集：细胞培养瓶中加入20mL细菌冻存液，使用灭菌棉签收集刚排泄出来的粪便于细胞培养瓶中，将培养瓶封入厌氧袋里，置于冰盒中保存、运输。
(2)稀释涂布：震荡后吸取100μL粪便悬液至900μL PBS缓冲液中，使用移液枪吹打混匀后再吸取100μL悬液至900μL PBS缓冲液中，以此类推，依次梯度稀释10次。各取20μL每个梯度的稀释液，分别涂布于MRS、MRS+MUP(1:1000，v/v)、BHI、BHI+PB(1:500，v/v)、CBA平板上，37℃有氧或厌氧条件下培养48-72h。
(3)单菌落增菌培养：选择菌落数量在5-100个的平板，使用一次性接种环随机挑取单菌落于20μL PBS中，吹打混匀后取15μL菌液涂布于同种平板上，37℃有氧或厌氧条件下培养48-72h，另外5μL菌液留待革兰氏染色鉴定。
(4)细菌传代：使用一次性接种环尽量刮取平板上生长的细菌，重悬于200μL的PBS缓冲液中，然后将200μL菌液重新涂布到同种平板上，相同条件下培养48-72h。
(5)细菌冻存：细菌增菌培养到足够量后，将平板上的细菌用接种环收集于由胎牛血清、BHI培养基、甘油混合而成的无菌冻存液中，吹打混匀，-80℃保存菌种。同时留取适量细菌待提取细菌基因组DNA。
(6)革兰氏染色鉴定：于载玻片中央滴加挑取单菌落时制备的5μL菌液，使用酒精灯间歇烘烤固定，滴加结晶紫染色液覆盖1min，流水洗涤，然后滴加卢戈碘液碘染1min，流水洗涤，再用脱色酒精覆盖载玻片表面20-30s，期间轻轻摇晃载玻片，流水洗去酒精后使用番红染液复染1min，流水洗涤，待载玻片干燥后使用光学显微镜镜检观察细菌形态。若菌落不纯，存在一种以上的细菌形态，则对样本进行平板划线接种，培养后重新挑取单菌落。
(7)细菌基因组DNA提取：使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按照天根生化科技公司的说明书进行细菌基因组DNA提取，并用NanoDrop2000测定DNA浓度。
(8)16S片段扩增：
1)采用27F/1492R引物对，27F序列：3’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-5’1492R序列：3’-GGTTACCTTGTTACGACTT-5’。
反应体系如下：
| 试剂 | 体积 |
| LA Taq酶 | 15μL |
| PCR Forward Primer(10μM) | 1.2μL |
| PCR Reverse Primer(10μM) | 1.2μL |
| 细菌基因组DNA | 3μL |
| ddH2O | up to 30μL |
2)PCR扩增程序如下：95℃预变性60s；：95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，循环数为31；72℃再延伸7min，结束温度设为4℃。
(9)琼脂糖凝胶电泳：配置25mL含有1％(w/v)琼脂糖的1×TAE缓冲液，使用微波炉加热融化，加入2.5μL核酸染料GoldView，混匀后倒入制胶槽，插入梳子，待其冷却。琼脂糖凝胶冷却后拔掉梳子，将其放入水平电泳槽中，每孔加入5μL扩增后的DNA样本及3μLDL2000 DNA marker，接通电源，110V恒压电泳20min，然后在紫外灯下观察扩增条带是否单一，大小是否在1500bp左右。
(10)16S rRNA测序与结果比对：将扩增后并经琼脂糖凝胶电泳确认无误的DNA16S片段样本送上海生工公司进行测序，得到测序结果后，使用ChromasPro软件进行序列拼接，并在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行16S rRNA序列blast，初步鉴定细菌的类型。
二、实验结果
将分裂鉴定的菌株命名为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10于2022年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25777，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的16S rDNA的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的基本形态图如图1所示。长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10进化树如图2所示。
实施例2、安全性验证
一、实验方法：
(1)溶血性：取10μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10对数生长期的菌液，使用稀释划线法接种于哥伦比亚血平板上，37℃培养36h，观察有无溶血环。
(2)药敏性：①用接种环刮取1环对数生长期的待测菌种，重悬至2mL无菌PBS缓冲液中；②用灭菌后的棉棒反复蘸取上述菌液，均匀涂布于MRS平板上；③待平板上的菌液吸收后，用镊子将药敏纸片放置在平板上，37℃正置培养36h后用直尺测量药敏纸片附近的抑菌圈大小，以mm形式记录结果。
二、实验结果：
筛选出来的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10具有不溶血且对常见抗生素敏感具有较好的安全性，结果如图3所示。
实施例3、制备长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10负载L-岩藻糖白蛋 白纳米药物递送系统
(1)白蛋白水溶液制备：称取明胶，置于纯水中加热搅拌至完全溶解，后温度降至室温后再加入牛血清白蛋白，得到白蛋白聚合物水溶液。
(2)L-岩藻糖白蛋白纳米粒的制备：将L-岩藻糖加入到白蛋白聚合物水溶液，继续搅拌溶解成均匀的溶液，得到L-岩藻糖白蛋白水溶液；采用单轴静电喷雾技术制备得到L-岩藻糖白蛋白纳米粒。
(3)将长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10置于37℃的MRS培养基中进行厌氧培养，待长至对数生长期，离心法用PBS重悬获得细菌悬浮液；
(4)将细菌悬浮液与L-岩藻糖白蛋白纳米颗粒溶液按1:1的体积比混合，再加入EDC和NHS，然后在37℃下厌氧培养8小时；随后将混合物在2000rpm下离心5分钟，取出上清液用PBS洗涤，即得长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10负载L-岩藻糖白蛋白纳米药物递送系统。
二、实验结果：
制得的L-岩藻糖白蛋白纳米粒粒径大小分布均匀，粒径大小约为200-600nm，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10负载L-岩藻糖白蛋白纳米粒递药系统仍具有长双歧杆菌活性；结果如图5所示。
实施例4、尾静脉注射长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10混悬液或长
双歧杆菌负载L-岩藻糖白蛋白纳米药物检验其抗黑色素瘤的治疗效果
一、实验方法：
1、实验分组：共20只C57小鼠(5周龄)，雌性。
2、给C57小鼠连续喝7天地ABX溶液(甲硝唑、万古霉素、氨苄青霉素、硫酸新霉素各100mg/kg)。
3、每只鼠皮下注射5*105个B16-F10细胞/100μL。
4、当肿瘤体积达到50mm3(肿瘤体积＝长*宽2*0.5)作为实验第0天开始测量肿瘤大小。
5、从植瘤开始每3天每只鼠尾静脉注射100μL的PBS/长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10/长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10负载L-岩藻糖白蛋白纳米药物/L-岩藻糖白蛋白纳米药物。
6、待肿瘤最大长至1200mm3时处死小鼠，在生物安全柜中进行解剖，把各组织匀浆之后在BHI板上涂板，放进培养中37℃培养，观察是否有生长出双歧杆菌。
二、实验结果：
尾静脉注射长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10具有较好的肿瘤靶向性能在肿瘤部位富集，将其与L-岩藻糖白蛋白纳米粒制成纳米给药系统后其抗肿瘤效果得到显著提高，结果如图4所示。
实施例5、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10与PD-1抑制剂协同抗结
直肠癌
一、实验方法(流程图如图6所示)：
1、实验分组：共32只C57小鼠(5周龄)，雌雄各半。
| 1. | 对照组(4雌+4雄) |
| 2. | αPD-1(4雌+4雄) |
| 3. | 长双歧杆菌(4雌+4雄) |
| 4. | 长双歧杆菌+αPD-1(4雌+4雄) |
2、给C57小鼠连续喝7天地ABX溶液(甲硝唑、万古霉素、氨苄青霉素、硫酸新霉素各100mg/kg)，之后每天给每只小鼠灌服108CFU/mL的长双歧杆菌混悬液100μL。
3、每只鼠皮下注射5*105个MC38细胞/100μL
4、当肿瘤体积达到50mm3(肿瘤体积＝长*宽2*0.5)作为实验第0天开始测量肿瘤大小。
5、从植瘤后第12天起每3天腹腔注射αPD-1(BioXcell，RMP1-14)，剂量为2mg/kg，共打4次。
6、在第0、4、8、12、16、20、24天记录体重与收集新鲜粪便，-80保存，后续测序。
7、在第0、3、6、9、12、15、18、21、24天记录肿瘤体积。
解剖当天：
1、瘤子称重记录+拍照。
2、取血，收集血清(4℃静置30min之后3000rpm离心10min)，取上清-80保存用于后续实验。
3、每组瘤子按从大到小的顺序在板子上摆好，然后把瘤子用滤纸吸干净，称重。
4、每组瘤子(部分)、脾脏(部分)、肝、肺、淋巴结保存于多聚甲醛，用于后续包埋IHC。
5、每组取部分瘤子和脾脏进行流式实验。肿瘤染CD3-FITC，CD8a-PE。
6、将肿瘤用眼科剪在6孔板中轻轻剪碎后，置于200目的细胞筛网上，用10mL注射器针芯轻轻研压肿瘤，挤压完成后，吸取少量DMEM培养基(或PBS)冲洗细胞筛网，将细胞悬液冲洗至50mL离心管，之后分装到1.5mL离心管中。
7、用PBS洗两遍(第二遍用含4％ FBS的PBS溶液)，4℃3200rpm 3min，第二次洗完之后倒去上清之后用配置好的含4％ FBS的PBS溶液+抗体进行重悬(每个样100μL)。
8、肿瘤染CD3+CD8a：
(1)用黑色的EP管放避光盒子里孵育抗体，将细胞在暗室与抗体孵育，抗体用量看说明书，100μL加1uLCD3、1.5μLCD8a，30-40min；(2)染色结束之后，加入1mL 4％FBS的PBS，离心去上清，再加1mL 4％FBS的PBS重悬上机。
二、实验结果：
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10刺激产生的抗肿瘤免疫保护反应，增加CD8+T细胞浸润肿瘤部位，重塑肿瘤微环境，使“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。将长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10联合免疫检查点抑制剂可以显著增强免疫检查点抑制剂对结直肠的抑制效果。各分组对肿瘤的体积变化影响如图7所示，小鼠体重如图8所示，肿瘤重量统计如图9所示。各分组对肿瘤转移灶的影响如图10所示。各分组的瘤子流式结果如图11所示。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10，其特征在于，所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10于2022年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25777，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种制剂，其特征在于，所述制剂包括含有如权利要求1所述的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的菌悬液。
3.如权利要求1所述的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10在制备抗肿瘤制剂或药物中的应用。
4.如权利要求1所述的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10、或其衍生物、或其代谢物联合免疫检查点抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂为作用于T细胞负性共刺激/共抑制分子和/或其配体的阻断剂的一种或多种的组合；优选地，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1单克隆抗体。
6.如权利要求1所述的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10在制备纳米载药系统中的应用。
7.一种纳米递药系统，其特征在于，如权利要求1所述的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)SYSU10负载纳米颗粒形成纳米递药系统。
8.如权利要求7所述的纳米递药系统，其特征在于，所述纳米颗粒包括L-岩藻糖白蛋白。
9.如权利要求7所述的纳米递药系统，其特征在于，所述纳米递药系统通过尾静脉进行注射。
10.一种如权利要求6～8任一项所述的纳米递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将如权利要求1所述的的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10的菌液接种于培养基，12h后达到对数生长期，取长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10使用；
S2、通过单轴静电喷雾工艺制备包裹有L-岩藻糖白蛋白的纳米颗粒；
S3、将S1所收集的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYSU10与步骤S2所制得的纳米颗粒混合，再加入EDC和NHS，然后在37℃的厌氧环境中震荡孵育；洗涤离心，收集下层沉淀，即得纳米递药系统。
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|---|---|---|---|---|
| CN114657086A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-06-24 | 苏州善佰生物技术有限公司 | 一种双歧杆菌的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用 |
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2023
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