CN113227362A - 用于制造基因治疗载体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于从哺乳动物宿主细胞培养物产生和/或纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法。

Description

用于制造基因治疗载体的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月21日提交的美国临时申请号62/734,505的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交并以引用的方式整体并入本文的序列表。所述ASCII拷贝创建于2019年9月23日，被命名为NIGH-015/001WO_SL.txt，并且大小为308千字节。
技术领域
本公开涉及人治疗剂、生物制剂药物产品、人DNA序列的病毒递送及其制造方法的领域。
背景技术
对基于AAV的递送载体和制造这些基于AAV的递送载体的改善的方法有长期存在且未被满足的需要。
发明内容
本公开提供一种从哺乳动物宿主细胞培养物纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法，其包括以下步骤：(a)通过疏水作用色谱法(HIC)纯化多个rAAV粒子，以产生包含所述多个rAAV粒子的HIC洗脱液；(b)通过阳离子交换色谱法(CEX)纯化(a)的HIC洗脱液，以产生包含多个rAAV粒子的CEX洗脱液；(c)通过阴离子交换(AEX)色谱法从(b)的CEX洗脱液中分离多个完整rAAV粒子，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的AEX洗脱液；和(d)通过切向流过滤(TFF)渗滤并浓缩来自(c)的AEX洗脱液到制剂缓冲液中，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子和最终制剂缓冲液的最终组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：在适用于将所述多个rAAV粒子释放到收获培养基中的条件下，使多个转染的哺乳动物宿主细胞与病毒释放溶液接触，以产生包含多个rAAV粒子、病毒释放溶液和收获培养基的组合物；和通过疏水作用色谱法(HIC)从所述组合物纯化所述多个rAAV粒子，以产生包含所述多个rAAV粒子的HIC洗脱液。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：在适用于形成多个rAAV粒子的条件下在收获培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞，其中在所述接触步骤之前，所述多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染，以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，AAV为AAV8或其衍生物。在一些实施方案中，AAV包含AAV8衣壳蛋白或其衍生物。
在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基包含杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s medium；DMEM)、稳定的谷氨酰胺、稳定的谷氨酰胺二肽和Benzonase中的一种或多种。
在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基包含甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐脱水物、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、i-肌醇、氯化钙(CaCl2)(无水)、硝酸铁(Fe(NO3)3″9H2O)、硫酸镁(MgSO4)(无水)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)和D-葡萄糖(右旋糖)。
在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基包含4mM稳定的谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺二肽。
在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基包含无血清培养基。在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基由无血清培养基组成。
在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基包含无蛋白培养基。在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基由无蛋白培养基组成。
在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基包含澄清培养基。在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基由澄清培养基组成。
在本公开的方法的一些实施方案中，外源性序列包含：(a)编码视紫红质激酶启动子的序列；(b)编码色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)的序列；和(c)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列。
在本公开的方法的一些实施方案中，视紫红质激酶启动子为GRK1启动子。在一些实施方案中，其中编码GRK1启动子的序列包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000031
在本公开的方法的一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列为密码子优化的人RPGRORF15序列。在一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000032
在一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000041
在本公开的方法的一些实施方案中，编码polyA信号的序列包含牛生长激素(BGH)polyA序列。在一些实施方案中，编码BGH polyA信号的序列包含以下核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000051
在本公开的方法的一些实施方案中，外源性序列包含编码ATP结合盒亚家族成员4(ABCA4)蛋白或其一部分的序列。在一些实施方案中，外源性序列包含编码ABCA4蛋白或其一部分的5′序列。在一些实施方案中，外源性序列包含编码ABCA4蛋白或其一部分的3′序列。
在本公开的方法的一些实施方案中，外源性序列还包含编码启动子的序列。在一些实施方案中，外源性序列还包含编码视紫红质激酶(RK)启动子的序列。在一些实施方案中，RK启动子为GRK1启动子。
在本公开的方法的一些实施方案中，编码GRK1启动子的序列包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000052
在本公开的方法的一些实施方案中，外源性序列还包含编码鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的序列。在一些实施方案中，编码CBA启动子的序列包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000053
或
Figure BPA0000305202160000054
在本公开的方法的一些实施方案中，编码ABCA4的序列为人ABCA4序列。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-4500或其任一者的3′截短变体。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701或1-4326。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3000-6822或其任一者的5′截短变体。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3154-6822、3196-6822、3494-6822、3603-6822、3653-6822、3678-6822、3702-6822或3494-6822。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-4326，并且编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3154-6822。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701，并且编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3196-6822。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701，并且编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3494-6822。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701，并且编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3603-6822。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701，并且编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3653-6822。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701，并且编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3678-6822。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701，并且编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3702-6822。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701，并且编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3494-6822。
SEQ ID NO：1为对应于NCBI参考序列NM_000350.2的人ABCA4核酸序列。SEQ IDNO：1与NCBI参考序列NM_000350.2相同。ABCA4编码序列跨越SEQ ID NO：1的核苷酸105至6926。
除以下突变之外，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1相同：核苷酸1640G＞T、核苷酸5279G＞A、核苷酸6173T＞C。这些突变不改变编码的氨基酸序列，并且因此由SEQ ID NO：2编码的ABCA4蛋白与由SEQ ID NO：1编码的ABCA4蛋白相同。
在本公开的方法的一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体还包含编码5′反向末端重复(ITR)的序列和编码3′ITR的序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列衍生自AAV血清型2(AAV2)的5′ITR序列和3′ITR序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含与AAV2的5′ITR序列和3′ITR序列相同的序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO：34)。在一些实施方案中，编码3′ITR的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000071
在本公开的组合物的一些实施方案中，多核苷酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含核苷酸序列GGCCACCATG(SEQ ID NO：73)或由其组成。
在本公开的组合物的一些实施方案中，多核苷酸包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000072
Figure BPA0000305202160000081
在本公开的方法的一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体或包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体还包含编码选择标记的序列。
在本公开的方法的一些实施方案中，编码病毒Rep蛋白的序列和编码病毒Cap蛋白的序列包含从AAV血清型8(AAV8)病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白序列分离或衍生的序列。
在本公开的方法的一些实施方案中，收获培养基包含DMEM、4mM稳定的谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺二肽以及Benzonase。
在本公开的方法的一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞已用包含聚合物(例如聚乙烯亚胺(PEI)组合物)、磷酸钙、脂质、能够穿过细胞膜的载体(例如脂质体、胶束、纳米粒子(例如碳、硅、聚合物和金)中的一种或多种的组合物转染。在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞已经用包含聚乙烯亚胺(PEI)的组合物(即PEI组合物)转染。
在本公开的方法的一些实施方案中，病毒释放溶液包含盐和高pH。在一些实施方案中，所述盐包括NaCl。在一些实施方案中，所述高pH为碱性pH。在一些实施方案中，高pH大于7.0。在一些实施方案中，高pH包括大于或等于7.0、7.1、7.2、7.3.、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0的pH。
在本公开的方法的一些实施方案中，适用于形成多个rAAV粒子的条件包括在重演体内生理学的条件下将哺乳动物宿主细胞孵育至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在一些实施方案中，重演体内生理学的条件包括在最低人内部体温的温度下的5％CO2。在一些实施方案中，适用于形成多个rAAV粒子的条件包括在等于或小于10％CO2的CO2水平下孵育哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，人内部体温为至少36℃。
在本公开的方法的一些实施方案中，(a)的HIC步骤还包括以下步骤：(i)生成HIC色谱图；和(ii)在所述HIC色谱图上选择含有rAAV粒子的级分，以产生包含多个rAAV病毒粒子的HIC洗脱液。在一些实施方案中，HIC步骤还包括在生成HIC色谱图之前将收获培养基稀释到高盐缓冲液中。在一些实施方案中，多个rAAV粒子使用分步梯度洗脱。在一些实施方案中，所述分步梯度包含在每个分步梯度下盐浓度的降低。
在本公开的方法的一些实施方案中，(b)的CEX步骤还包括以下步骤：(i)生成CEX色谱图；和(ii)从所述CEX色谱图中选择含有rAAV粒子的级分，以产生包含多个rAAV病毒粒子的CEX洗脱液。在一些实施方案中，CEX色谱法包括SO3-阳离子交换基质。在一些实施方案中，CEX色谱步骤还包括在生成CEX色谱图之前将HIC洗脱液调节到低盐缓冲液中。在一些实施方案中，所述调节包括稀释步骤。在一些实施方案中，调节步骤包括TFF步骤。在一些实施方案中，TFF步骤使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。在一些实施方案中，TFF步骤使用至少70kDa HFF执行。在一些实施方案中，TFF步骤使用至少50kDa HFF执行。在一些实施方案中，TFF步骤使用至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100kDa或在其之间的任何数目的kDa HFF执行。在一些实施方案中，将HIC洗脱液的pH调节到pH 3.0至pH 4.0(包括端点在内)。在一些实施方案中，将HIC洗脱液的pH调节到pH 3.5至pH 3.7(包括端点在内)。在一些实施方案中，CEX步骤还包括过滤HIC洗脱液。在一些实施方案中，过滤HIC洗脱液包括0.8/0.45μm聚醚砜(PES)过滤器。在一些实施方案中，多个rAAV粒子使用分步梯度洗脱。在一些实施方案中，所述分步梯度包括pH梯度、盐梯度或其组合。在一些实施方案中，多个rAAV粒子使用线性梯度洗脱。在一些实施方案中，所述线性梯度包含pH梯度、盐梯度或其组合。在一些实施方案中，CEX步骤还包括中和CEX洗脱液的pH。在一些实施方案中，中和的CEX洗脱液的pH为pH 9.0。
在本公开的方法的一些实施方案中，(c)的AEX色谱步骤还包括以下步骤：(i)生成AEX色谱图；和(ii)从所述AEX色谱图中选择含有完整rAAV粒子的级分，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的AEX洗脱液。在一些实施方案中，AEX色谱法包括阴离子交换(QA)基质。在一些实施方案中，AEX色谱步骤还包括在生成AEX色谱图之前将CEX洗脱液稀释到低盐缓冲液中。在一些实施方案中，所述调节包括稀释步骤。在一些实施方案中，调节步骤包括TFF步骤。在一些实施方案中，调节步骤包括第一TFF步骤和第二TFF步骤。在一些实施方案中，TFF步骤使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。在一些实施方案中，稀释的CEX洗脱液的pH为9.0。在一些实施方案中，纯化且富集的多个完整rAAV粒子使用线性梯度洗脱。在一些实施方案中，纯化且富集的多个完整rAAV粒子使用分步梯度洗脱。在一些实施方案中，CEX步骤还包括中和包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的洗脱液的pH。
在本公开的方法的一些实施方案中，(d)的TFF步骤使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(f)还包括第二TFF步骤，并且其中第一TFF步骤和第二TFF步骤两者均使用100kDa HFF执行。在一些实施方案中，最终制剂缓冲液包含Tris、MgCl2和NaCl。在一些实施方案中，最终制剂缓冲液在pH 8下包含20mM Tris、1mMMgCl2和200mM NaCl。在一些实施方案中，最终制剂缓冲液还包含0.001％的泊洛沙姆188。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述方法还包括将泊洛沙姆188添加到最终组合物中。
在本公开的方法的一些实施方案中，将包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子和最终制剂缓冲液的最终组合物在-80℃下冷冻。
本公开提供一种组合物，其包含通过本公开的方法产生的多个rAAV粒子。
在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物包含(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)，和(b)小于50％的空衣壳。在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物包含(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间或1x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)，和(b)小于30％的空衣壳。在一些实施方案中，组合物包含(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间或1x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)，和(b)小于25％的空衣壳。在一些实施方案中，组合物包含(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间或1x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)，和(b)小于99％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％或在其之间的任何百分比的空衣壳。在一些实施方案中，组合物包含约5x1012vg/mL。
在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间或1x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)，和(b)至少70％的完整衣壳。在一些实施方案中，组合物包含(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间或1x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)，和(b)至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在其之间的任何百分比的完整衣壳。在一些实施方案中，组合物包含5x1012vg/mL。
在本公开的组合物的一些实施方案中，多个rAAV的一部分包含功能性载体基因组，其中每个功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达外源性序列。在一些实施方案中，当与未转导细胞中相应内源性序列的表达水平相比时，包含功能性载体基因组的多个rAAV的一部分以2倍增加表达外源性序列。在一些实施方案中，当与未转导细胞中相应内源性序列的表达水平相比时，包含功能性载体基因组的多个rAAV的一部分以3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或其之间任何其他增量倍数增加来表达外源性序列。
在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物包括其中多个rAAV的一部分包含功能性载体基因组的那些组合物，其中每个功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达外源性序列，外源性序列和相应内源性序列是不同的。在一些实施方案中，外源性序列和相应内源性序列是不同的，但由外源性序列编码的蛋白质和由内源性序列编码的蛋白质是相同的。在一些实施方案中，外源性序列和相应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或在其之间的任何百分比的同一性。在一些实施方案中，当与内源性序列相比时，外源性序列是密码子优化的。在一些实施方案中，外源性序列和相应内源性序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或在其之间的任何百分比的同一性。
在本公开的组合物的一些实施方案中，在用本公开的组合物转导细胞后，外源性序列编码蛋白质。在一些实施方案中，由外源性序列编码的蛋白质的活性水平等于或大于由未转导细胞的相应序列编码的蛋白质的活性水平。在一些实施方案中，外源性序列和相应内源性序列是相同的。在一些实施方案中，外源性序列和相应内源性序列是不同的。在一些实施方案中，外源性序列和相应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或在其之间的任何百分比的同一性。在一些实施方案中，在用本公开的组合物转导细胞后，外源性序列编码蛋白质。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述方法包括其中所述方法包括在适用于形成多个rAAV粒子的条件下在收获培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞的步骤的那些方法，其中在接触步骤之前，多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染，以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约0.5∶1∶1至约10∶1∶1、约1∶1∶1至约10∶1∶1、约2∶1∶1至约10∶1∶1或约3∶1∶1至约10∶1∶1，任选地约0.5∶1∶1、约1∶1∶1、约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1、约9∶1∶1或约10∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约1∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约3∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约10∶1∶1的摩尔比提供。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述方法包括其中所述方法包括在适用于形成多个rAAV粒子的条件下在收获培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞的步骤的那些方法，其中在接触步骤之前，多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染，以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞，包含外源性序列的质粒载体(pITR)和辅助质粒载体(pHELP)以在1∶1与20∶19之间、或在1∶20与20∶1之间、或在1∶20与1∶1之间的摩尔比(例如，下表A中所示的任何比率)提供。在一些实施方案中，pITR与包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体(pREPCAP)的摩尔比为在1∶1与20∶19之间、或在1∶20与20∶1之间、或在1∶20与1∶1之间(例如，下表A中所示的任何比率)。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约3∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约10∶1∶1的摩尔比提供。在某些实施方案中，转染使用CaPO4或PEI进行。在具体实施方案中，转染使用PEI以分别为约1∶1至约5∶1，任选地约2∶1至约4∶1、约4∶1、约3∶1或约2∶1的PEI∶DNA比率(mL∶mg)进行。在某些实施方案中，转染使用PEI进行，其中包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约1∶1∶1的摩尔比提供。在某些实施方案中，转染使用PEI以分别为约0.5∶1至5∶1或约1∶1至约5∶1，任选地约2∶1至约4∶1、约4∶1、约3∶1或约2∶1的PEI∶DNA比率(mL∶mg)进行，其中包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体以约0.5∶1∶1至约10∶1∶1、约1∶1∶1至约10∶1∶1、约2∶1∶1至约10∶1∶1，任选地约0.5∶1∶1、约1∶1∶1、约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1、约9∶1∶1或约10∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约1∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约3∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约10∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1或约9∶1∶1的摩尔比提供。
Figure BPA0000305202160000141
Figure BPA0000305202160000151
在本公开的方法的一些实施方案中，所述方法包括其中所述方法包括在适用于形成多个rAAV粒子的条件下在收获培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞的步骤的那些方法，其中在接触步骤之前，多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染，以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞，并且其中质粒载体与辅助质粒载体或RepCap载体的摩尔比包括质粒载体与辅助质粒载体或RepCap载体相比的更大值，在适用于形成多个rAAV粒子的条件下在收获培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞包括转染剂。在一些实施方案中，转染剂包括聚乙烯亚胺。在一些实施方案中，转染剂包括磷酸钙(CaPO4)。
在某些相关实施方案中，本公开提供一种产生重组AAV载体的方法，其包括用以下转染哺乳动物宿主细胞：(i)包含外源性序列的质粒载体；(ii)包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体；和(iii)辅助质粒载体，其中使哺乳动物宿主细胞与转染培养基接触，所述转染培养基包含以分别地约0.5∶1∶1至约10∶1∶1、或约1∶1∶1至约10∶1∶1，任选地约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1、约9∶1∶1或约10∶1∶1的摩尔比的包含外源性序列的质粒载体、包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体和辅助质粒。在一些实施方案中，转染培养基包含选自聚乙烯亚胺(PEI)和CaPO4的转染剂。在某些实施方案中，转染剂为PEI，并且其中转染培养基包含约5∶1至约1∶1、约2∶1至约4∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1或约1∶1的比率的PEI和DNA。
在本文公开的产生重组AAV载体的方法的具体实施方案中，外源性序列包含：(a)编码视紫红质激酶启动子的序列；(b)编码色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)的序列；和(c)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列。在一些实施方案中，视紫红质激酶启动子为GRK1启动子，例如包含以下序列或由其组成的GRK1启动子：
Figure BPA0000305202160000161
在一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列为密码子优化的人RPGRORF15序列，其包括但不限于本文公开的那些序列中的任一种。
在本文公开的产生重组AAV载体的方法的具体实施方案中，编码polyA信号的序列包括牛生长激素(BGH)polyA序列，其包括但不限于本文公开的那些序列中的任一种。
在本文公开的产生重组AAV载体的方法的具体实施方案中，包含外源性序列的质粒载体还包含编码5′反向末端重复(ITR)的序列和编码3′ITR的序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列衍生自AAV血清型2(AAV2)的5′ITR序列和3′ITR序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含与AAV2的5′ITR序列和3′ITR序列相同的序列。在其他实施方案中，与野生型AAV2相比，ITR包含一个或多个修饰，例如一个或多个核苷酸缺失、插入或取代。在某些实施方案中，ITR以正向和反向取向衍生自3′AAV2ITR，随后缺失，以产生稳定的ITR。在某些实施方案中，编码5′ITR的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO：34)。在某些实施方案中，编码3′ITR的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000171
在本文公开的产生重组AAV载体的方法的具体实施方案中，外源性序列还包含编码Kozak序列的序列。在某些实施方案中，Kozak序列包含核苷酸序列GGCCACCATG(SEQ IDNO：73)。
在本文公开的产生重组AAV载体的方法的具体实施方案中，外源性序列包含以下序列：
Figure BPA0000305202160000181
Figure BPA0000305202160000191
Figure BPA0000305202160000201
在本文公开的产生重组AAV载体的方法的具体实施方案中，外源性序列包含编码ATP结合盒亚家族成员4(ABCA4)蛋白或其一部分的序列。在一些实施方案中，外源性序列包含编码ABCA4蛋白或其一部分的5′序列。在一些实施方案中，外源性序列包含编码ABCA4蛋白或其一部分的3′序列。在一些实施方案中，外源性序列还包含编码启动子的序列。在一些实施方案中，外源性序列包含编码视紫红质激酶(RK)启动子的序列。在某些实施方案中，RK启动子为GRK1启动子。在一些实施方案中，编码GRK1启动子的序列包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000202
在某些实施方案中，外源性序列包含编码鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的序列。在一些实施方案中，编码CBA启动子的序列包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000203
或
Figure BPA0000305202160000204
在一些实施方案中，编码ABCA4的序列为人ABCA4序列或其变体。在某些实施方案中，编码ABCA4的序列包含5′核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701或1-4326。在某些实施方案中，编码ABCA4的序列包含3′核苷酸序列，其包含SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3154-6822、3196-6822、3494-6822、3603-6822、3653-6822、3678-6822、3702-6822或3494-6822。在具体实施方案中，本文公开的方法用于产生上游和/或下游ABCA4载体，其可以根据本文公开的双载体系统使用。在具体实施方案中，ABCA4载体包括但不限于图307-335中任一者所公开的那些载体或包含所述图中任一者所公开的序列的那些载体。
在本文公开的产生重组AAV载体的方法的具体实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体或包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体还包含编码选择标记的序列。
在本文公开的产生重组AAV载体的方法的具体实施方案中，编码病毒Rep蛋白的序列和编码病毒Cap蛋白的序列包含从AAV血清型8(AAV8)病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白序列(包括其变体)分离或衍生的序列。
附图说明
本专利的文件含有至少一张彩色绘制的附图/照片。具有一张或多张彩色附图/照片的本专利的副本在请求和支付必要费用后将由主管局提供。
有几张附图是色谱图。通常，绿色线表示荧光，红色线表示吸光度(260nm)，蓝色线表示吸光度(280nm)，并且黑色线表示电导率。在以黑白观察时，电导率线通常以低值开始并随时间而增加，并且吸光度(260nm)线和吸光度(280nm)线在很大程度上彼此跟踪。
图1是概述制造过程的示例性细胞培养和扩增步骤的图。含有粘附细胞培养物的血清中的细胞通过所示步骤传代并扩增以繁殖二十个HYPERstack(36-层培养容器)。
图2是包括过程中限制和QC测试的AAV8-RPGR上游制造过程的示意性概述。
图3是细胞解冻步骤的示意性流程图。
图4是示出用于细胞解冻过程的参数和操作范围/设定点的表。
图5是示出在细胞解冻过程中使用的关键性材料/消耗品的表。
图6是一般传代程序的示意性流程图。
图7是示出细胞传代方案的一般指导的表。
图8是示出用于细胞传代的推荐的试剂体积(HBSS、细胞解离溶液和生长培养基)和细胞接种密度的表。
图9是示出在细胞解冻和传代方案中使用的关键性材料/消耗品的表。
图10是概述制造过程的转染和收获步骤的图。使用基于聚乙烯亚胺(PEI)的转染方案转染细胞。(1)将DNA和
Figure BPA0000305202160000221
在转染溶液中单独稀释。(2)将PEI溶液逐滴添加到DNA溶液中，并且在室温下孵育10分钟。(3)将DNA/PEI溶液添加到先前制备的转染培养基(DMEM+4mM稳定的谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺二肽+10％FBS)中。(4)从HYPERstack中去除生长培养基(DMEM+4mM稳定的谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺二肽+10％FBS)，添加含有DNA/PEI的转染培养基，并且将细胞在37℃、5％CO2下孵育24小时。(5)从HYPERstack中去除转染培养基，添加收获培养基(DMEM+4mM稳定的谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺二肽+0％FBS+Benzonase)，并且将细胞在37℃、5％CO2下孵育72小时。(6)将病毒释放溶液添加到HYPERstack中，并且将细胞在5％CO2中孵育18小时以释放AAV粒子。
图11是示出每5x36-层
Figure BPA0000305202160000222
产生磷酸钙介导的转染溶液的指导的表。
图12是示出每5x36-层
Figure BPA0000305202160000223
产生
Figure BPA0000305202160000224
介导的转染溶液的指导的表。
图13是瞬时转染和培养基收获步骤的示意性流程图。
图14是示出初始培养基更换所需的氯喹和培养基的作为生产规模的函数的体积的表。
图15是示出用于转染和收获步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图16是示出在磷酸钙细胞转染过程中使用的关键性材料/消耗品的表。
图17是示出在PEI细胞转染过程中使用的关键性材料/消耗品的表。
图18是过滤澄清步骤的示意性流程图。
图19是示出用于澄清过滤步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图20是示出在澄清过滤步骤中使用的关键性材料/消耗品的表。
图21是概述制造过程的下游加工步骤(DSP)的图。(1)从HYPERstack收集含有AAV粒子的收获培养基。(2)通过疏水作用色谱法(HIC)纯化稀释的收获培养基，选择含有AAV粒子的峰，并且收集洗脱液。(3)通过阳离子交换色谱法(CEX)进一步纯化稀释的HIC洗脱液，选择含有rAAV粒子的峰并收集洗脱液。(5)通过阴离子交换色谱法(AEX)用梯度洗脱富集稀释的CEX洗脱液中的完整rAAV粒子，选择含有完整rAAV粒子的峰并收集洗脱液。(6)经由两个切向流过滤(TFF)步骤使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)将AEX洗脱液浓缩并渗滤到最终制剂缓冲液(FFB)(不含Pluronic F-68)中。(7)添加Pluronic F-68(也称为泊洛沙姆188)，并且将原料药在-80℃下冷冻。
图22是包括QC测试和过程中控制的AAV8-RPGR下游和填充和整理(fill andfinish)制造过程的示意性概述。
图23A是示出大孔色谱技术的优点的表。
图23B是从左到右示出膜、整料和常规珠粒的色谱介质的一系列3张图像。
图24A和图24B是描绘对初始材料(收获物)的HPLC分析(指纹、总粒子、空粒子/完整粒子)的一对图表(左图描绘部分分离法分析并且右图描绘总分析)。
图25是rAAV-RPGR收获材料的SDS-PAGE分析的照片
图26是来自收获的培养基和澄清后收获的培养基的样品的总宿主DNA和蛋白质的示例性结果。
图27是概述疏水作用色谱法(HIC)AAV捕获过程的表。
图28是描绘疏水条件的稳定性测试程序的示意图。
图29是描绘来自图89中概述的HIC程序的色谱图的图表。
图30是描绘在收获时、过滤前(BF)和过滤后(AF)通过测量OD600得到的HIC结果的表，条件如图89中所描绘。
图31是描绘在没有过滤负载的情况下HIC的运行条件的表。
图32是对应于图31的HIC运行条件的一对色谱图。
图33是描绘图31和图32中描绘的HIC的SDS-PAGE分析的一对照片。
图34是描绘在磷酸钾(KP)沉淀的情况下的HIC的示意图。导致蛋白质变性较少和蛋白质稳定性(天然)较高。
图35是对应于图34的HIC实验(使用C4 A柱)的一对色谱图。
图36是对应于图34的HIC实验(使用OH柱)的一对色谱图。
图37是描绘图95至图97中所描绘的HIC的SDS-PAGE分析的一系列照片。
图38是描绘使用C4 A柱和OH柱的(NH4)2SO4和PK的结果的一系列表。
图39是描绘HIC条件的示意图，此图中的装载量是图40至图96和图102的装载量。
图40是对应于图39的HIC实验的一对色谱图。
图41是描绘在1mL柱上HIC的装载容量的示意图，例如，如图39和图40中所示。
图42是描绘初始材料的HPLC总分析的FLD反应的一对色谱图。
图43是两个HIC实验的一对ddPCR分析(每个实验有一个表和一张色谱图)。在不使用山梨糖醇的情况下执行HIC-9。使用山梨糖醇执行HIC-10。
图44是描绘两个HIC实验的ddPCR分析的一对表。在OH柱上执行HIC-10。在C4 A柱上执行HIC-10。
图45是示出HIC纯化步骤的线性梯度洗脱与优化分步洗脱的比较的一对图表
图46是描绘通过比较HIC稀释缓冲液的摩尔浓度得到的HIC实验的稳健性的一系列色谱图。
图47是描绘HIC实验在2mL柱(HIC-16和HIC-17)上的容量的一系列色谱图。
图48是描绘HIC-18的色谱条件的表。
图49是对应于图48的一对色谱图。
图50是描绘来自HIC-18(在OH 80-mL容量柱上运行)的ddPCR结果的一对表和一张色谱图。
图51是描绘HIC-19的色谱条件的表。
图52是对应于图51的一对色谱图。
图53是描绘来自HIC-19(用分步洗脱运行)的ddPCR结果的一对表和一张色谱图。
图54是分别提供HIC-18和HIC-19的电导率测量结果的一对表，以及对应于图49、图50和图51的HIC实验的色谱图。
图55是描绘HIC-20的色谱条件的表。
图56是对应于图55的一对色谱图。
图57是描绘来自HIC-20(在OH 80-mL容量柱上运行)的ddPCR结果的一对表和一张色谱图。
图58是对应于图57的HIC-20的SDS-PAGE分析的照片。
图59是概述20个HIC实验中每一个的柱类型、所用缓冲液和目的的表。
图60A至图60B分别是示出示例性HIC AAV捕获步骤的色谱图和SDS-PAGE凝胶。图60A示出来自80mL柱的色谱图。HIC捕获步骤已成功地从1mL柱按比例放大到80mL柱。图60B示出HIC收获培养基、流过液、负载和洗脱级分的SDS-PAGE凝胶分析。泳道从左到右示出：标记、输入收获培养基、负载、流过液(FT)、W、级分E1、级分E2、稀释两倍的级分E2(E2.2X)、级分E3、稀释两倍(E3.2X)、原位清洁液(CIP)和稀释两倍的原位清洁液(CEP.2X)。含有AAV粒子的E2级分用绿色加框，将收获培养基泳道用红色加框。
图61A至图61B是示出用于HIC步骤的梯度洗脱(图61A)和等度洗脱(图61B)方案的一对色谱图。E1级分、E2级分和E3级分被加框。
图62A至图62B是示出2步过程相对3步过程的基本原理的一对SDS-PAGE凝胶。图62A示出示例性HIC洗脱。图62B示出AEX完整粒子与空粒子分离的概念验证运行。含有衣壳的级分用红色加框(图62A，同时AEX步骤后含有空衣壳和完整衣壳的级分用红色(左)和绿色(右)加框(图62B)。经由HIC步骤得到的纯度和随后HIC和AEX QA纯化产物的纯度是不够的。需要中间精制步骤(CEX阳离子交换，SO3-)。
图63是示出HIC捕获步骤之后的过滤步骤的优化的图表。X轴上示出不同类型的过滤器：PES＝聚醚砜，CA＝乙酸纤维素，GF＝玻璃纤维，PVDF＝聚氟二乙烯，PTFE＝聚四氟乙烯，MV＝混合酯，RC＝再生纤维素。y轴上示出每种过滤器类型的AAV粒子的平均回收率(％)。橙色条表示具有有限放大选项的过滤器(PVDF和PTFE)。
图64A至图64B分别是示出使用疏水作用色谱法(HIC)实现的rAAV粒子的捕获的色谱图和SDS-PAGE凝胶。在图16A中，以mAU为单位的吸光度在y轴上以50的增量从0至300表示。含有rAAV粒子的级分E2和级分E3分别以深绿色和浅绿色加框。洗涤液、洗脱液和CIP级分在X轴上表示。图64B是示出来自图64A的洗脱级分的纯度的SDS-PAGE凝胶。示出含有rAAV粒子的级分E2的泳道加框。2x表示两倍稀释。
图65A至图65B分别是示出示例性HIC步骤的分步回收率的色谱图和表。
图66A至图66B分别是示出使用HIC纯化的AAV粒子的色谱图和三张透射电子显微镜法(TEM)显微照片的图像。图66A是示出示例性HIC步骤中纯化的AAV粒子的洗脱的色谱图。含有AAV粒子的级分E3、级分E4和级分E5在x轴上用括号表示。图66B示出在E3级分、E4级分和E5级分中洗脱的AAV粒子的TEM显微照片。比例尺表示200nm。
图67是E3 HIC级分、E4 HIC级分和E5 HIC级分在两种不同放大倍数下的一系列六张TEM显微照片。在顶行中，比例尺从左到右表示0.5μM、0.5μM和500nM。在底行中，比例尺表示200nm。
图68是概述用于AAV中间纯化的阳离子交换色谱法(CEX)过程的表。
图69是描绘在pH 4.0(SO3-1)或pH 3.5(SO3-2)下执行的开发中间纯化步骤SO3的一对色谱图。
图70是在pH 3.5下执行的中间纯化SO3步骤(SO3-2)的SDS-PAGE分析的照片。
图71是描绘SO3-2的ddPCR结果的一对表和一张色谱图。
图72是描绘SO3-3的色谱条件的表。
图73是对应于图72的一对色谱图。
图74是描绘SO3-3的ddPCR结果的一对表和一张色谱图。
图75是描绘SO3-4的色谱条件的表。
图76是对应于图75的一对色谱图。
图77是SO3-4的SDS-PAGE分析的照片。
图78是描绘在pH 3.8(SO3-5)或pH 3.6(SO3-7)下执行的中间纯化步骤SO3的一对色谱图。
图79是SDS-PAGE分析的照片，其显示pH 3.6±0.1是使用图69至图78的条件进行HIC实验的优选或最佳的pH。
图80是在SO3上的柱容量测定的分析。
图81是描绘在不过滤负载材料的情况下的容量运行SO3-9的色谱条件的表。
图82是对应于图135的一对色谱图。
图83是描绘在过滤负载材料的情况下的容量运行SO3-10的色谱条件的表。
图84是对应于图135的一对色谱图。
图85是比较SO3-7、SO3-9和SO3-10的一系列色谱图。
图86是描绘SO3-9和SO3-10的HPLC分析的一对表。
图87是描绘SO3-11的色谱条件的表。
图88是对应于图141的色谱图。
图89是不含泊洛沙姆(SO3-7，左图和色谱图)或含泊洛沙姆(SO3-11，右图和色谱图)的一对ddPCR分析。
图90是描绘SO3-12的色谱条件的表。
图91是示出SO3-12负载样品和SO3-12FT样品的照片。
图92是对应于图90的一对色谱图。
图93是HIC-20(左图和色谱图)或SO3-12(右图和色谱图)的一对ddPCR分析。
图94是SO3-12的SDS-PAGE分析的照片。
图95是概述12个SO3实验中每一个的柱类型、所用缓冲液和目的的表。
图96是测定在中间纯化SO3-12之后材料的完整粒子∶空粒子比率的HPLC色谱图。
图97A至图97B分别是示出通过CEX使用SO3-柱基质进行的中间精制步骤的色谱图和SDS-PAGE凝胶。图97A示出pH 3.6 SO3-放大色谱图，其中含有rAAV粒子的级分被加框。图97B示出pH 3.5(E2)、pH 3.6(SO3 7 E2)、pH 3.8(SO3-5 E2)和pH 4.0(E2)样品的SDS-PAGE凝胶。所有凝胶都稍微过度展开以便暴露本样品中的所有蛋白质条带。与在pH较高的样品中相比，在pH较低的样品中存在的污染物稍少。最佳pH为3.6+/-0.1。
图98A至图98D是示出CEX步骤的pH优化的一对色谱图(图98A、图98C)和对应于所述色谱图的一对SDS-PAGE凝胶(图98B、图98D)。图98A、图98B是在pH 4.0下，图98C、图98D是在pH 3.5下。
图99A至图99C是示出SO3 CEX洗脱液的透射电子显微镜(TEM)分析的一系列2张透射电子显微照片(图99A至图99B)和表(图99C)。在样品中，21.8％的AAV既不完整也不空。蓝色箭头表示完整衣壳AAV，红色箭头表示空衣壳AAV，并且绿色箭头表示不确定的(既不完整也不空)AAV。
图100A至图100B分别是示出在AAV中间(精制)纯化步骤中AAV粒子CEX的洗脱的色谱图和SDS page凝胶。在图100A中，y轴示出以mAU为单位的吸光度，以500的增量从0至2500表示。洗涤液、洗脱液和CIP级分在x轴上表示。含有AAV粒子的级分E2和级分E3分别以深绿色和浅绿色加框。图100B是示出来自图100A的洗脱级分的纯度的SDS-PAGE凝胶。示出含有AAV粒子的级分E2的泳道被加框。2X和10X分别表示两倍稀释和十倍稀释。
图101是概述用于富集rAAV完整粒子的阴离子交换色谱法(AEX)过程的表。
图102是描绘使用不同pH的不含MgCl2的缓冲液得到的在中间纯化(SO3-12)之后材料的QA洗脱曲线的HPLC色谱图。
图103A至图103B分别是示出完整粒子峰和空粒子峰的作为pH和MgCl2浓度的函数的解析率的色谱图和热图。图103A示出在pH 9.5下用不同浓度的MgCl2得到的叠加AEX QA基质色谱图(A260信号)。黑色箭头表示0mM MgCl2，橙色箭头表示2mM MgCl2，蓝色箭头表示1mM MgCl2。图103A是示出分离完整粒子和空粒子的能力的热图，其中pH在一个轴上，并且MgCl2在另一个轴上。分离由颜色从最小程度(紫色)至最大程度(白色)表示。在pH 9.0和0mM MgCl2下观察到最佳分离。
图104A至图104B分别是示出使用AEX富集完整AAV粒子的色谱图和SDS-PAGE凝胶。在图104A中，y轴示出以mAU为单位的吸光度，其以50的增量从0至100表示。级分E2、级分E3、级分E4、级分E5和级分E6在X轴上表示。含有完整AAV粒子的级分E3被加框。图104B是示出来自图104A的洗脱级分的纯度的SDS-PAGE凝胶。含有完整rAAV粒子的级分QA2 E3被加框。
图105A至图105F是概述完整粒子富集步骤的两张色谱图(图105A、图105D)、三张表(图105B、图105C、图105F)和一张SDS-PAGE凝胶(图105E)。图105A是示例性AEX QA-2色谱图，而图105D是图105A中的色谱图的缩放图。图105B是概述通过分光光度法估计的完整粒子纯度的表。如在E3级分中所见的约1.3的A260∶A280比率表示完整粒子的高百分比。图105C是概述通过HPLC估计的QA2 E2 AEX级分和E3AEX级分的完整粒子含量的表。图105E是示出QA2 AEX负载、洗脱液和CIP级分的SDS-PAGE凝胶。含有完整AAV粒子的级分E3被加框。图105F是概述通过HPLC确定的每个级分中的完整粒子回收率的表。
图106A至图106C分别是示出通过阴离子交换色谱法(AEX)富集完整AAV粒子的一张TEM显微照片和两张表。图106A是示出rAAV粒子的QA2 E3级分的TEM显微照片。比例尺表示200nm。图106B示出通过微滴式数字PCR(ddPCR)得到的AAV粒子的滴度。E3级分用绿色框表示。图106C示出级分AQ2E3(也称为QA2 E3)的计数病毒的数目、按百分比计的完整粒子和部分粒子的百分比和按百分比计的空粒子/受损粒子的估计数目。
图107是示出制造过程的每个步骤的预期收率的表。
图108A至图108D是示出样品S03-14 E1的ddPCR结果的一系列图表：QA-3(A)、QA-4(B)、QA-5(C)和QA-6(D)。
图109是提供QA-3至QA-8的TEM结果的图表。所有样品都是透明的，没有杂质，在样品SO3-14、QA-3 E3、QA-6 E3和QA-8 E3中很少注意到粒子的聚集体。在所有QA样品中，完整病毒与空病毒/受损病毒之间的比率相似(71-77％)，但在SO3-14样品中较低(46％)。一些粒子没有被分类为完整粒子或空粒子。引入第三组病毒(未分类)。来自此组的病毒在整个表面上不是电子透明的，而在表面上仅展示电子致密点。此类病毒可能是完整的、不完全完整的、未正确形成的或受损的。
图110是示出在QA-7(容量)和QA-8(常规条件)下空粒子和完整粒子的纯化比较的色谱图和相应表。
图111是示出QA-8纯化的一对色谱图。下部色谱图是更高放大倍数的上部色谱图。
图112A至图112C是提供ddPCR结果和HPLC E/F结果的一系列表。使用分析柱(QA-0.1mL，具有2μm孔)执行从QA-7向前的制备性运行。
图113是示出在QA-7和QA-8各自的每个纯化步骤中发现的蛋白质的存在的一对SDS-page分析。
图114是示出来自运行QA-8的完整级分(E3)的一对TEM显微照片和相应表。
图115是提供S0315的色谱条件的表。
图116是示出S0315的纯化的一对色谱图。底部色谱图是更高放大倍数的顶部色谱图。
图117A至图117B是提供SO3 15的HPLC结果(A)和ddPCR结果(B)的一对表。
图118是提供QA-9的色谱条件的表。
图119是示出使用QA-9进行的纯化的一对色谱图。底部色谱图是更高放大倍数的顶部色谱图。
图120是提供QA-10的色谱条件的表。
图121是示出使用QA-10进行的纯化的一对色谱图。底部色谱图是更高放大倍数的顶部色谱图。
图122是提供QA-11的色谱条件的表。
图123是示出使用QA-11进行的纯化的一对色谱图。底部色谱图是更高放大倍数的顶部色谱图。
图124是提供QA-12的色谱条件的表。
图125是示出使用QA-12进行的纯化的色谱图。
图126是示出使用QA-9得到的空粒子/完整粒子比率的一对色谱图。底部色谱图是更高放大倍数的顶部色谱图。
图127是示出使用QA-9得到的空粒子/完整粒子比率的色谱图。
图128是示出使用QA-10得到的空粒子/完整粒子比率的一对色谱图。底部色谱图是更高放大倍数的顶部色谱图。
图129是示出使用QA-10得到的空粒子/完整粒子比率的色谱图。
图130是示出使用QA-11得到的空粒子/完整粒子比率的一对色谱图。底部色谱图是更高放大倍数的顶部色谱图。
图131是示出使用QA-11得到的空粒子/完整粒子比率的色谱图。
图132A至图132C是提供来自QA-9、QA-10和QA-11的ddPCR结果和HPLC结果的一系列表。
图132D是提供来自QA-9、QA-10和QA-11的空粒子/完整粒子比率、纯度和回收率的表。
图133是提供来自制备性运行QA-9、QA-10和QA-11的洗脱性质的表。
图134是示出使用制备性运行QA-9、QA-10和QA-11进行的蛋白质纯化的一系列SDS-page分析。
图135是提供来自S03-15 E1、QA-9、QA-10和QA-11的纯化病毒的纯化和TEM分析之后的病毒计数、完整病毒百分比、空病毒百分比和未分类病毒百分比的表。所有样品都含有小聚集体，其主要由受损病毒或不完全形成的病毒组成。在QA-10样品和QA-11样品中，完整病毒与空病毒/受损病毒之间的比率相似(74％)，但在SO3-14样品中较低(45％)，而在样品QA-9 E3中较高。一些粒子没有被分类为完整粒子或空粒子。引入第三组病毒(未分类)。来自此组的病毒在整个表面上不是电子透明的，而在表面上仅展示电子致密点。此类病毒可能是完整的、不完全完整的、未正确形成的或受损的。
图136是提供QA-13的色谱条件的表。
图137是阐明分级分离方法的QA-13的一对色谱图。底部色谱图是更高放大倍数的顶部色谱图。
图138是提供用于TFF交换到制剂缓冲液中的条件的表。
图139是示出与MALS检测器分析偶联的HPLC E/F的一系列色谱图。
图140是示出与MALS检测器分析偶联的HPLC E/F的一系列色谱图。
图141是概述使用QA-13进行的病毒纯化的每个步骤的空粒子/完整粒子比率、纯度和回收率百分比的表。
图142是概述样品S03-14、QA-3、QA-4、QA-5、QA-6和QA-8中每一种的组成的表(与图142至图156相关)。分析五个腺相关病毒(AAV)样品和一个额外用于透射电子显微镜(TEM)分析的样品，以确定病毒完整性并评价完整粒子/空粒子之间的关系。
图143是显示在低放大倍数下观察时病毒均匀地散布在整个栅格(S03-14)中的TEM显微照片。对于图143至图170，制备样品以使用负染色法使用TEM进行检查。将解冻的样品轻轻混合并施用在新鲜辉光放电的铜栅格(400目，碳涂覆的弗姆瓦(Formvar))上5分钟，洗涤并用1微滴乙酸双氧铀的1％(w/v)水溶液染色。为每个样品准备两个栅格。用在80kV下操作的透射电子显微镜Philips CM 100(FEI，The Netherlands)观察栅格。彻底检查至少10个栅格，并拍摄许多显微照片(照相机ORIUS SC 200，Gatan，Inc.)以评价完整粒子与空粒子之间的关系。在栅格上的不同位置一致地拍摄显微照片。
图144是样品SO3-14的一对代表性显微照片；存在小聚集体(黑色箭头)。没有检测到杂质，并且仅能注意到少量的小聚集体。
图145是示出不能被分类为完整粒子或空粒子/受损粒子(白色箭头)的粒子的显微照片。
图146是显示样品QA3-E3与样品SO3-14相比存在更多聚集体且聚集体可能稍大的一对显微照片。没有发现其他杂质。
图147是示出用黑色箭头标记的空粒子/受损粒子和用白色箭头标记的未分类粒子的一对显微照片。未分类粒子可以代表完整病毒，但是它们看起来并不完美。
图148是显示病毒(QA-4 E3)均匀散布在整个栅格上的显微照片。没有发现杂质或聚集体。
图149是示出完整粒子、空粒子和未分类粒子的QA-4 E3的一对代表性显微照片。
图150是示出完整粒子、空粒子和未分类粒子的QA-5 E3的一对代表性显微照片。没有发现杂质或聚集体。用黑色箭头标记空粒子/受损粒子并用白色箭头标记未分类粒子。未分类粒子可以代表完整病毒，但是它们看起来并不完美。
图151在低放大倍数下示出完整粒子、空粒子和未分类粒子的QA-5 E3的代表性显微照片。
图152是示出完整粒子、空粒子和未分类粒子的QA-6 E3的一对代表性显微照片。没有发现杂质或聚集体。病毒均匀地散布(左显微照片)；存在少量聚集体(右显微照片)。
图153是选择用于评价完整粒子/空粒子比率的样品QA-6 E3的一对代表性显微照片；空粒子/受损粒子用黑色箭头标记，未分类粒子用白色箭头标记。
图154是在低放大倍数下观察的QA-8 E3病毒的显微照片。样品没有杂质，但含有一些小聚集体。
图155是样品QA-8 E3的一对代表性显微照片；小聚集体(黑色箭头)含有受损病毒。
图156是提供完整粒子与空粒子/受损粒子之间的比率的表。通过计数在相同放大倍数下拍摄的所选显微照片中的粒子来确定完整病毒与空病毒/受损病毒之间的比率。样品SO3-14含有46％的完整病毒，所有其他样品均含有更高且更相似％的完整病毒(71-77％)。所有样品都是透明的，没有杂质，在样品SO3-14、QA-3 E3、QA-6 E3和QA-8 E3中很少注意到粒子的聚集体。在所有QA样品中，完整病毒与空病毒/受损病毒之间的比率相似(71-77％)，但在SO3-14样品中较低(46％)。
图157是提供在图157至图169的分析中使用的每个样品的组成的表。
图158是示出在低放大倍数下观察到的未稀释样品的S03-15 E1病毒的代表性TEM显微照片。病毒到处均匀地散布。制备样品以使用负染色法使用TEM进行检查。将解冻的样品轻轻混合并施用在新鲜辉光放电的铜栅格(400目，碳涂覆的弗姆瓦)上5分钟，洗涤并用1微滴乙酸双氧铀的1％(w/v)水溶液染色。为每个样品准备三个栅格，一个用于未稀释样品，并且两个用于稀释样品。用0.1M PB稀释样品。用在80kV下操作的透射电子显微镜PhilipsCM 100(FEI，The Netherlands)观察栅格。彻底检查至少10个栅格，并拍摄若干显微照片(照相机ORIUS SC 200，Gatan，Inc.)以评价完整粒子与空粒子之间的比率。在栅格上的不同位置一致地拍摄显微照片。
图159是样品SO3-15的一对代表性显微照片；左：未稀释样品；右：稀释样品。病毒均匀地散布在整个栅格中。
图160是样品SO3-15的一对代表性显微照片；左：未稀释样品；右：稀释样品。病毒均匀地散布在整个栅格中，在未稀释样品和稀释样品中存在很少的小聚集体(白色箭头)。
图161是在低放大倍数下观察的未稀释样品(左)和稀释样品(右)的QA-9 E3病毒的一对代表性显微照片。病毒均匀地散布，并且仅能发现少量的聚集体。不存在其他杂质。
图162是选择用于计数的未稀释样品(左)和稀释样品(右)的QA-9 E3病毒的一对代表性显微照片。病毒均匀地散布，并且仅能发现少量的聚集体。不存在其他杂质。
图163是QA-9 E3病毒的一对代表性显微照片。大多数病毒是完整的，具有特征性形状(左)；小聚集体含有受损粒子(右)。
图164是在低放大倍数下观察的未稀释样品(左)和稀释样品(右)的QA-10 E3病毒的一对代表性显微照片。所有具有样品QA-10 E3的栅格都表现出适当的质量。除一些小聚集体之外，发现可能代表完全崩解的病毒的其他结构(图165，右显微照片)；此类结构存在于样品的所有三个栅格上，但仅结合在栅格的一小部分上。与样品QA-9 E3相比，样品QA-10E3含有更多的受损粒子。
图165是稀释样品QA-10 E3的QA-10 E3病毒的一对代表性显微照片，其中指示几乎完全受损的病毒(左)；右显微照片：最可能的其余的被破坏的病毒。
图166是选择用于病毒计数的未稀释样品QA-10 E3的代表性显微照片。使用21张显微照片计数粒子并计算完整病毒与空病毒/受损病毒之间的比率。
图167是在低放大倍数下观察的未稀释样品的QA-11 E3病毒的代表性显微照片。样品QA-11 E3含有小聚集体。通过计数在相同放大倍数下拍摄的33张显微照片上的粒子来确定完整病毒与空病毒/受损病毒之间的比率。
图168是选择用于计数的未稀释样品(左)和稀释样品(右)的QA-11 E3病毒的一对代表性显微照片。
图169是提供每个样品的完整粒子与空粒子/受损粒子之间的比率的表。通过计数在相同放大倍数下拍摄的所选显微照片中的粒子得到完整病毒与空病毒/受损病毒之间的比率。粒子一起被分类为3组：完整粒子、未分类粒子、空粒子和受损粒子。样品SO3-15 E1含有45％的完整病毒，样品QA-9 E3含有80％的完整病毒，样品QA-10 E3和QA-11 E3关于完整粒子/空粒子比率是相似的(74％的完整病毒)。所有样品都含有小聚集体，其主要由受损病毒或不完全形成的病毒组成。在QA-10样品和QA-11样品中，完整病毒与空病毒/受损病毒之间的比率相似(74％)，但在SO3-14样品中较低(45％)，而在样品QA-9 E3中较高。一些粒子不能被分类为完整粒子或空粒子，因此它们被作为“未分类粒子”归于第三组中。来自此组的病毒在整个表面上不是电子透明的，而在表面上仅展示电子致密点。此类病毒可能是完整的、不完全完整的、未正确形成的或受损的。
图170A至图170B是提供QA-13和TFF1步骤的ddPCR结果和HPLC结果的一对表。
图171是提供TFF1的与MALS检测器分析偶联的HPLC E/F的一系列图表和概要表。
图172是纯化的QA-13病毒的SDS分析。
图173是比较QA和TFF之后病毒纯化的一对SDS分析。
图174是包括过程中限制和QC测试的AAV8-RPGR上游制造过程的示意性概述
图175是细胞解冻步骤的示意性流程图。
图176是示出用于培养基加温的推荐的最低加温持续时间的表。
图177是示出用于细胞解冻过程的参数和操作范围/设定点的表。
图178是示出在细胞解冻过程中使用的材料/消耗品的表。
图176是示出初始培养基更换所需的氯喹和培养基的作为生产规模的函数的体积的表。
图177是示出用于转染和收获步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图178是示例性传代程序的示意性流程图。
图179是示出细胞传代方案的一般指导的表。
图180是示出用于细胞传代的推荐的试剂体积(HBSS、细胞解离溶液和生长培养基)和细胞接种密度的表。
图181是示出在解冻和传代方案中使用的材料/消耗品的表。
图182是瞬时转染和培养基收获步骤的示意性流程图。
图183是示出初始培养基更换所需的氯喹和培养基的作为生产规模的函数的体积的表。
图184是示出用于转染和收获步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图185是示出每5x36-层
Figure BPA0000305202160000331
产生磷酸钙介导的转染溶液的指导的表。
图186是示出过滤澄清步骤的示意性流程图的表。
图187是示出用于澄清过滤步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图188是示出在澄清过滤步骤中使用的材料/消耗品的表。
图189是大规模切向流过滤单元操作的示意性流程图。
图190是示出用于大规模切向流过滤步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图191是示出在大规模切向流过滤步骤中使用的材料/消耗品的表。
图192是碘克沙醇浓缩单元操作的示意性流程图。
图193是示出用于初始碘克沙醇浓缩步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图194是示出在离心浓缩步骤中使用的材料/消耗品的表。
图195是完成碘克沙醇梯度纯化步骤所需的步骤的示意性流程图。
图196是示出用于碘克沙醇梯度纯化步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图197是示出在碘克沙醇梯度纯化步骤中使用的关键性材料/消耗品的表。
图198是阳离子交换色谱单元操作的示意性流程图。
图199是示出用于阳离子交换色谱步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图200是示出阳离子交换色谱操作条件的表。
图201是示出在阳离子交换色谱步骤中使用的材料/消耗品的表。
图202是完成小规模切向流过滤步骤所需的步骤的示意性流程图。
图203是示出用于小规模切向流过滤步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图204是示出在小规模切向流过滤步骤中使用的关键性材料/消耗品的表。
图205是无菌过滤和填充单元操作的示意性流程图。
图206是示出用于无菌过滤和填充步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图207是示出在无菌过滤和填充步骤中使用的材料/消耗品的表。
图208是示出过程中保持点和储存条件的表。
图209是示出用于溶液制备的优选化学品的列表的表。
图210是示出用于实验A的在澄清DMEM培养基中配制的样品的表。
图211是示出用于实验A的制备性运行和分析性运行的缓冲液的表。
图212是示出实验A中用于HIC纯化的使用专用缓冲液的SOP分步梯度的表。
图213是示出实验A中用于CEX纯化的使用专用缓冲液的SOP分步梯度的表。
图214是示出用于实验A的60个柱体积(CV)的0至100％流动相B以及然后步进到10CV的100％MPC的SOP线性梯度的表。
图215是示出用于实验A的制备性运行条件的表。
图216是来自用于实验A的运行HIC-25的代表性色谱图。整个运行-装载阶段(上图)，放大的洗脱部分(下图)。图例：蓝色线是在280nm下的UV检测，红色线是在260nm下的UV检测，棕色线是电导率，深绿色线是压力。在装载期间的压力升高是0.6巴。用棕色标记记录级分。主要洗脱液是E1。装载阶段的UV尖峰(spike)对应于通过柱的气泡，这在停止装载以将样品转移到较小容器后发生。
图217是实验A的基于HPLC分析的代表性色谱图。HIC-25的总方法。A-空白(缓冲液)运行；B-收获物；C-负载；D-流过液(FT)；E-洗涤液1(W1)；F-洗涤液2(W2)，G-洗脱液(E1)；H-洗涤液3(W3)；I-CIP；J-荧光信号叠加。图例：图例：荧光(Ex 280nm，EM 348nm)：绿色曲线，在260nm下的吸光度：红色曲线，在280nm下的吸光度：蓝色曲线，电导率(mS/cm)：黑色曲线。与其他级分相比，主要洗脱液(E1)是10倍稀释的。所有色谱图都是呈相同标度。
图218是用于实验A的基于ddPCR和HPLC总分析的HIC-25运行的回收率的表。
图219是用于实验A的HIC-25运行的代表性SDS-PAGE结果。M-阶梯。级分E1、级分W3和级分CIP分别是5倍稀释的、5倍稀释的和2倍稀释的。主要级分是E1。VP1-VP3蛋白由红色矩形标记。
图220是示出用于实验A的制备成匹配结合条件并装载到CEX-SO3柱的E1 HIC-OH的制备性运行条件的表。
图221是来自实验A的运行SO3-16的代表性色谱图。整个运行-装载阶段(上图)，放大的洗脱部分(下图)。图例：蓝色线是在280nm下的UV检测，红色线是在260nm下的UV检测，棕色线是电导率，深绿色线是压力。在装载期间没有压力升高。用棕色标记记录级分。主要洗脱液是E1。
图222是来自实验A的基于HPLC分析的代表性色谱图。SO3-16的总方法。A-空白(缓冲液)运行；B-负载BF；C-负载；D-流过液+洗涤液1(W1)(FT)；E-洗涤液2(W1)；F-洗脱液(E1)；G-洗涤液3(W3)；H-CIP。图例：图例：荧光(Ex 280nm，EM 348nm)：绿色曲线，在260nm下的吸光度：红色曲线，在280nm下的吸光度：蓝色曲线，电导率(mS/cm)：黑色曲线。主要洗脱液(E1)是100倍稀释的，其中其他级分是2.5倍稀释的或5倍稀释的(W3和CIP)。所有色谱图都是呈相同标度。
图223是示出用于实验A的制备性运行SO3-16的基于ddPCR和HPLC总分析的回收率的表。
图224是来自实验A的SO3-16运行的代表性SDS-PAGE。M-阶梯。级分E1是5倍稀释的和10倍稀释的，级分W3和级分CIP是2倍稀释的。主要级分是E1。VP1-VP3蛋白由红色矩形标记。
图225是示出实验A中用于将来自SO3-16的全部洗脱液(E1)装载到AEX-QA(QA-14)柱的制备性运行条件的表。
图226是来自实验A的运行QA-14的代表性色谱图。整个运行-装载阶段(上图)，放大的洗脱部分(下图)。图例：蓝色线是在280nm下的UV检测，红色线是在260nm下的UV检测，棕色线是电导率，深绿色线是压力。在装载期间没有压力升高。用棕色标记记录级分。主要洗脱液(完整衣壳AAV)是E3。
图227是用于实验A的QA-14的基于HPLC分析空粒子-完整粒子方法的代表性色谱图。A-SO3-16 E1；B-FT+W；C-E1；D-E2(空AAV衣壳)；E-E3(完整AAV衣壳)；F-E4(完整主峰的尾部)；G-E5；H-E6；I-CIP。图例：图例：荧光(Ex 280nm，EM 348nm)：绿色曲线，在260nm下的吸光度：红色曲线，在280nm下的吸光度：蓝色曲线，电导率(mS/cm)：黑色曲线。图片A、B、C、F、G、H和I都是呈相同标度，D呈2倍大的标度，并且E呈4倍大的标度。各级分是20倍稀释的(图片A)或10倍稀释的(图片H)，其他级分是5倍稀释的。对于相应级分呈现比率A260/A280。
图228是示出通过对用于实验A的QA-14 E3样品实施TFF的浓缩和缓冲液交换条件的表。
图229示出来自实验A的制备性运行QA-14TFF和总DSP收率的基于ddPCR和HPLC E/F分析的回收率的表。
图230示出用于实验A的基于HPLC E/F分析的空AAV衣壳和完整AAV衣壳两者的纯度的表。
图231示出用于实验A的通过TEM评价的完整AAV和空AAV的比率的表。
图232示出用于实验A的通过TEM评价的在TFF之后来自QA-14的代表性级分。E3级分(上图)，E2级分(下图)。
图233示出用于实验A的QA-14运行的代表性SDS-PAGE结果。M-阶梯。级分E3是纯的并且是5倍稀释的，其他级分是纯的。主要级分是E3。AAV8 FULLS是TFF后的E3级分。VP1-VP3蛋白由红色矩形标记。
图234是示出用于实验B的在澄清DMEM培养基中配制的样品的表。
图235是示出用于实验B的制备性运行和分析性运行的缓冲液的表。
图236是示出实验B中用于HIC纯化的使用专用缓冲液的SOP分步梯度的表。
图237是示出实验B中用于CEX纯化的使用专用缓冲液的SOP分步梯度的表。
图238是示出用于实验B的60个柱体积(CV)的0至100％流动相B以及然后步进到10CV的100％MPC的SOP线性梯度的表。
图239是示出用于实验B的制备性运行条件的表。
图240是来自用于实验B的运行HIC-26的代表性色谱图。整个运行-装载阶段(上图)，放大的洗脱部分(下图)。图例：蓝色线是在280nm下的UV检测，红色线是在260nm下的UV检测，棕色线是电导率，深绿色线是压力。在装载期间的压力升高是0.5巴。用棕色标记记录级分。主要洗脱液是E1。
图241是用于实验B的基于HPLC分析的代表性色谱图。HIC-26的总方法。A-空白(缓冲液)运行；B-收获物；C-负载；D-流过液(FT)；E-洗涤液1(W1)；F-洗涤液2(W2)，G-洗脱液(E1)；H-洗涤液3(W3)；I-CIP；J-荧光信号叠加。图例：图例：荧光(Ex 280nm，EM 348nm)：绿色曲线，在260nm下的吸光度：红色曲线，在280nm下的吸光度：蓝色曲线，电导率(mS/cm)：黑色曲线。与其他级分相比，主要洗脱液(E1)是10倍稀释的。所有色谱图都是呈相同标度。
图242是用于实验B的基于ddPCR和HPLC总分析的HIC-26运行的回收率的表。
图243是用于实验B的HIC-26运行的代表性SDS-PAGE结果。M-阶梯。级分E1、级分W3和级分CIP分别是5倍稀释的、5倍稀释的和2倍稀释的。主要级分是E1。VP1-VP3蛋白由红色矩形标记。
图244是示出用于实验B的制备成匹配结合条件并装载到CEX-SO3柱的E1 HIC-OH的制备性运行条件的表。
图245是来自实验B的运行SO3-17的代表性色谱图。整个运行-装载阶段(上图)，放大的洗脱部分(下图)。图例：蓝色线是在280nm下的UV检测，红色线是在260nm下的UV检测，棕色线是电导率，深绿色线是压力。在装载期间没有压力升高。用棕色标记记录级分。主要洗脱液是E1。
图246是来自实验B的基于HPLC分析的代表性色谱图。SO3-17的总方法。A-空白(缓冲液)运行；B-负载BF；C-负载；D-流过液+洗涤液1(W1)(FT)；E-洗涤液2(W1)；F-洗脱液(E1)；G-洗涤液3(W3)；H-CIP。图例：图例：荧光(Ex 280nm，EM 348nm)：绿色曲线，在260nm下的吸光度：红色曲线，在280nm下的吸光度：蓝色曲线，电导率(mS/cm)：黑色曲线。主要洗脱液(E1)是100倍稀释的，其中其他级分是2.5倍稀释的或5倍稀释的(W3和CIP)。所有色谱图都是呈相同标度。
图247是示出用于实验B的制备性运行SO3-17的基于ddPCR和HPLC总分析的回收率的表。
图248是来自实验B的SO3-17运行的代表性SDS-PAGE。M-阶梯。级分E1是5倍稀释的和10倍稀释的，级分W3和级分CIP是2倍稀释的。主要级分是E1。VP1-VP3蛋白由红色矩形标记。
图249是示出实验B中用于将来自SO3-17的全部洗脱液(E1)装载到AEX-QA(QA-15)柱的制备性运行条件的表。
图250是来自用于实验B的运行QA-15的代表性色谱图。整个运行-装载阶段(上图)，放大的洗脱部分(下图)。图例：蓝色线是在280nm下的UV检测，红色线是在260nm下的UV检测，棕色线是电导率，深绿色线是压力。在装载期间没有压力升高。用棕色标记记录级分。主要洗脱液(完整衣壳AAV)是E3。
图251是用于实验B的QA-15的基于HPLC分析空粒子-完整粒子方法的代表性色谱图。A-SO3-16 E1；B-FT+W；C-E1；D-E2(空AAV衣壳)；E-E3(完整AAV衣壳)；F-E4(完整主峰的尾部)；G-E5；H-E6；I-CIP。图例：图例：荧光(Ex 280nm，EM 348nm)：绿色曲线，在260nm下的吸光度：红色曲线，在280nm下的吸光度：蓝色曲线，电导率(mS/cm)：黑色曲线，多角度光散射检测器(MALS)是粉红色曲线。图片B、C、G、H和I都是呈相同标度，A、D、E和F呈2倍大的标度。各级分是20倍稀释的(图片A)或10倍稀释的(图片H)，其他级分是5倍稀释的。对于相应级分呈现比率A260/A280。
图252是示出通过对用于实验B的QA-15 E3样品实施TFF的浓缩和缓冲液交换条件的表。
图253示出来自实验B的制备性运行QA-15TFF和总DSP收率的基于ddPCR和HPLC E/F分析的回收率的表。
图254示出用于实验B的基于HPLC E/F分析的空AAV衣壳和完整AAV衣壳两者的纯度的表。
图255示出用于实验B的通过TEM评价的完整AAV和空AAV的比率的表。
图256示出用于实验B的通过TEM评价的来自在TFF后QA-15的代表性级分。QA-15E3级分(上图)；E5级分(下图)。
图257示出用于实验B的QA-15运行的代表性SDS-PAGE结果。M-阶梯。级分E3是纯的并且是5倍稀释的，其他级分是纯的。主要级分是E3。AAV8 FULLS是TFF后的E3级分。使用Genscript Express Plus 4-20％凝胶。
图258示出来自实验B的代表性HPLC色谱图指纹法。呈现每个色谱阶段的叠加。A：HIC-OH步骤的收获物和主要洗脱液的叠加。与收获物相比，HIC洗脱液是60倍稀释的。B：收获物和主要SO3洗脱液(E1)的叠加。与收获的材料相比，SO3洗脱液是200倍稀释的。C：收获物、QA负载和QA主要洗脱液(E3)的叠加。与收获物相比，负载是10倍稀释的，并且E3是60倍稀释的。所有色谱图都是呈相同标度。Y轴为在260nm下的吸光度。
图259是示出用于ABCA4的HIC(OH)色谱条件的表。
图260A至图260B是用于ABCA4的代表性HIC(OH)色谱图和载体回收率分析。(A)示出色谱图的放大的洗脱部分。洗脱片段用括号表示。(B)如通过HPLC总粒子分析测量的HIC级分中的载体回收率。需要进行HIC洗脱步骤优化以增加总步骤收率。
图261是示出用于ABCA4的CEX(SO3)色谱条件的表。所有级分都通过添加1M TrispH9.0来中和；添加10％的总级分体积。
图262A至图262B是用于ABCA4的代表性CEX(SO3)色谱图和载体分析回收率。(A)示出放大的洗脱。(B)示出如通过HPLC总粒子分析测量的在SO3级分中回收的载体。
图263是示出用于ABCA4的AEX(QA)色谱条件的表。所有级分都通过添加1M BTP pH6.5来中和；添加5％的总级分体积。
图264A至图264B是用于ABCA4的代表性AEX(QA)色谱图和载体回收率分析。(A)示出放大的洗脱，其中空粒子和完整粒子示出在括号中。(B)示出如通过总粒子HPLC分析测量的QA级分中空粒子(顶部)和完整粒子(底部)的载体回收率。
图265是示出用于ABCA4的基于HPLC分析的(完整：空)粒子的纯度的表。通过FLD和MALS检测器给出纯度(E/F)比率的最佳呈现。通过QA步骤实现从大约55％-94％的完整AAV粒子富集。
图266A至图266B是用于ABCA4的基于TEM的粒子(完整粒子∶空粒子)的代表性纯度。(A)示出样品详情的表(B)示出用碘克沙醇纯化的样品(AAV8Y733F)(两个左图)和通过QA色谱法纯化的样品(AAV8 QA-1E3)(两个右图)。
图267是用于ABCA4的通过SDS-PAGE分析确定的代表性粒子纯化。
图268是示出用于ABCA4的HIC色谱单元操作的示意性流程图。
图269是示出用于ABCA4的HIC捕获步骤的参数和操作范围的表。
图270是示出用于ABCA4的HIC色谱操作参数的表。
图271是用于ABCA4的HIC步骤的代表性色谱图；包括装载阶段、洗涤阶段、洗脱阶段和CIP阶段。图例：流过液(F1)、装载后洗涤液(W1)、装载后洗涤液2(W2)、洗脱液(E1)、洗脱后洗涤液(W3)、原位清洁液(CIP)。
图272是用于ABCA4的HIC步骤的代表性放大色谱图。图例：装载后洗涤液(W1)、装载后洗涤液2(W2)、洗脱液(E1)、洗脱后洗涤液(W3)、原位清洁液(CIP)。
图273是示出用于ABCA4的HIC缓冲液组成和目标规格的表。
图274是示出将在用于ABCA4的HIC色谱步骤中使用的关键材料和消耗品的详情的表。
图275是示出用于ABCA4的SO3色谱单元操作的示意性流程图。
图276是示出用于ABCA4的SO3色谱步骤的参数和操作范围/设定点的表。
图277是示出用于ABCA4的单个色谱步骤和操作参数的表。
图278是对于ABCA4运行的代表性典型完整SO3色谱图。
图279是用于ABCA4的色谱图的代表性放大洗脱部分。红色矩形标记洗脱液主峰。图例：装载后洗涤液2(W2)、洗脱液(E1)、洗脱后洗涤液(W3)、原位清洁液(CIP)。
图280是示出用于ABCA4的SO3缓冲液组成的表。
图281是示出在用于ABCA4的离心浓缩步骤中使用的关键性材料/消耗品的表。
图282是示出用于ABCA4的QA色谱单元操作过程流程的示意性流程图。
图283是示出将用于ABCA4的QA色谱步骤的参数和相关操作范围或设定点的表。
图284是示出与用于ABCA4的色谱运行相关的具体步骤的表。
图285是用于ABCA4的线性梯度洗脱的代表性完整QA色谱图。
图286是放大到梯度洗脱上的代表性QA色谱图。E2-空粒子。E3-完整粒子。E4-峰尾含有完整粒子、空粒子和受损粒子的混合物。
图287是示出用于ABCA4的QA缓冲液组成和目标规格的表。
图288是示出在用于ABCA4的QA色谱单元操作中使用的关键性材料/消耗品的表。
图289是用于纯化AAV-ABCA4载体的切向流过滤单元操作的流程图的示意图。
图290是列出可以用于TFF运行以纯化AAV-ABCA4载体的的示例性参数和相关操作范围或设定点的表。
图291是提供可以在用于纯化AAV-ABCA4载体的切向流过滤单元操作中使用的示例性材料和消耗品的表。
图292是提供可以在AAV-ABCA4产品的制造期间使用的在过程点(in-processpoint)处的示例性保持时间的表。
图293是示出上游转基因结构和下游转基因结构的示意图，所述转基因结构组合形成完整的ABCA4转基因。
图294是示出重叠C序列的示意图，其中框外AUG密码子在框内AUG密码子前面。
图295是示出重叠区C和重叠区B的预测的二级结构的示意图。
图296是示出示例性重叠载体的示意图。
图297A至图297D是用ABCA4重叠双载体系统转导之后的转基因结果的一系列图。(A)上游和下游转基因单链DNA形式。这些可以通过单链退火(SSA)经由它们在互补转基因上的同源区域(B)来退火，随后可以生成完全重组的大转基因(C)。缩写：CDS＝编码序列；DSB＝双链断裂；HR＝同源重组；ITR＝反向末端重复；pA＝polyA信号；SSA＝单链退火；WPRE＝土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
图298是示出重叠的上游和下游双载体的示意图。
图299是示出重叠的上游和下游双载体的一系列图。
图300是示出双载体上游和下游变体A、B、C、D、E、F、G和X的图，这些变体可以包含在AAV2/8Y733F ABCA4或AAV2/8-ABCA4中。ABCA4的全长或截短版本(tABCA4)受双载体系统的重叠区域影响。
图301是示出双载体重叠变体的示意图。示出在每个转基因中包含的ABCA4编码序列(SEQ ID NO：11)的核苷酸。
图302是示出来自上游转基因变体B的核苷酸序列片段的图。来自SwaI位点的序列在所有上游转基因变体中是一致的，并且突出显示可能的隐秘性poly A信号的特征。
图303是ABCA4双载体系统的开发的一对图。A.考虑并评估载体设计的不同方面，包括转基因的遗传元件和结构以及载体衣壳和剂量。B.比较携带不同重叠长度的双载体变体以确定在两个转基因之间重组的最佳区域。AAV＝腺相关病毒；ABCA4＝ATP-结合盒转运蛋白家族成员4；Do＝下游转基因变体；GRK1＝人视紫红质激酶启动子；In＝内含子；ITR＝反向末端重复；pA＝polyA信号；Up＝上游转基因变体；WPRE＝土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
图304A至图304B是示出(A)使用由上游转基因提供的结合ABCA4 CDS的正向引物和下游转基因中的结合ABCA4 CDS的反向引物以从重组转基因扩增转录物的示意图。对扩增子进行测序以证实在转录物的重叠区域上含有正确的ABCA4 CDS。(B)使用结合预测的GRK1转录起始位点(TSS)的下游的正向引物和结合在上游ABCA4 CDS内的反向引物以评估来自注射双载体C的眼睛和注射双载体5′C的眼睛的转录物形式。
图305是可以用于驱动ABCA4上游序列的表达的启动子和额外序列的示意图。RK＝GRK1启动子，IntEx＝内含子和外显子序列，CMV＝巨细胞病毒早期增强子；CBA＝鸡β肌动蛋白启动子；SA/SD＝剪接受体和剪接供体。
图306是用于表达ABCA4上游序列或GFP的AAV载体的图。ITR＝反向末端重复，WPRE＝土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，GFP＝绿色荧光蛋白，IntEx＝内含子和外显子序列，CBA＝鸡β肌动蛋白启动子，CMV＝巨细胞病毒增强子，RK＝视紫红质激酶启动子(GRK1启动子)，RBG＝兔β球蛋白，SA/SD＝剪接受体和剪接供体序列。
图307是CMVCBA.In.GFP.pA载体的序列(SEQ ID NO：17)。
图308是CMVCBA.GFP.pA载体的序列(SEQ ID NO：18)。
图309是CBA.IntEx.GFP.pA载体的序列(SEQ ID NO：19)。
图310是CAG.GFP.pA载体的序列(SEQ ID NO：20)。
图311是AAV.5′CMVCBA.In.ABCA4.WPRE.kan载体的序列(SEQ ID NO：21)。
图312是AAV.5′CMVCBA.ABCA4.WPRE.kan载体的序列(SEQ ID NO：22)。
图313是AAV.5′CBA.IntEx.ABCA4.WPRE.kan载体的序列(SEQ ID NO：23)。
图314是描绘本公开的示例性ABCA4表达构建体的一系列示意图。
图315是pAAV.RK.5’ABCA4.kan的ITR到ITR部分的序列(SEQ ID NO：26)，其包含编码5′ITR的序列(SEQ ID NO：27)、编码RK启动子的序列(SEQ ID NO：28)、编码兔β-球蛋白(RBG)内含子/外显子(Int/Ex)的序列(SEQ ID NO：39)、编码ABCA4基因的编码序列的5′部分的序列(SEQ ID NO：29)和编码3′ITR的序列(SEQ ID NO：30)。
图316是pAAV.3’ABCA4.WPRE.kan的ITR到ITR部分的序列(SEQ ID NO：30)，其包含编码5′ITR的序列(SEQ ID NO：27)、编码ABCA4基因的编码序列的3′部分的序列(SEQ IDNO：31)、编码WPRE的序列(SEQ ID NO：32)、编码bGH polyA的序列和编码3′ITR的序列(SEQID NO：33)。
图317A至图317C是示出由双链DNA(dsDNA)编码的转基因转变为单链有义DNA和反义DNA(ssDNA)以及ssDNA衣壳包裹在AAV病毒粒子中的一系列图片。
图318A至图318D是示出含有有义ssDNA和反义ssDNA的AAV病毒粒子被细胞核摄取(A)、从病毒粒子释放有义链和反义链(B)、合成互补链以再生dsDNA(C)和转录转基因(D)的一系列图片。
图319A至图319H是描绘在AAV双载体系统中的大转基因通过单链退火和第二链合成实现的衣壳包裹、转导和再形成的一系列图片。大转基因起初编码为dsDNA(A-B)。随后，大转基因的重叠5′片段和3′片段的ssDNA被AAV病毒粒子衣壳包裹(C)。生成包含大转基因的5′片段和3′片段的互补链的病毒粒子，并且这些ssDNA包含互补的重叠序列区域(以红色示出)。在此实施例中，描绘5′片段的反义ssDNA和3’片段的有义链。转导包含ssDNA的AAV粒子(D)，并且将ssDNA从病毒粒子释放到细胞核中(E)。5’片段和3′片段在细胞核环境中在互补的重叠序列处杂交(F)，通过第二链合成生成整个大转基因的dsDNA(G)，并且随后转录此dsDNA并表达转基因(H)。
图320是本公开的ABCA4重叠双载体系统的略图。腺相关病毒(AAV)转基因的元件被分为两个独立的转基因，即“上游”和“下游”。上游转基因含有启动子和ABCA4编码序列的上游片段，而下游转基因携带ABCA4编码序列的下游片段加上WPRE和牛生长激素(bGH)pA信号。在所描绘的优化的重叠双载体系统中，两种转基因携带由ABCA4编码序列碱基3,494-3,701形成的207bp重叠区域。一旦进入同一宿主细胞核，两个转基因就经由重叠区域比对和重组。ABCA4＝ATP-结合盒转运蛋白家族成员4；GRK1＝人视紫红质激酶启动子；In＝内含子；ITR＝反向末端重复；pA＝polyA信号；WPRE＝土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
图321是示出所测试的双载体组合的转基因详情的表。最后一行含有优化的重叠双载体系统的详情。ABCA4＝ATP-结合盒转运蛋白家族成员4；bp＝碱基对；CDS＝编码DNA序列；GRK1＝人视紫红质激酶启动子；pA＝polyA信号；WPRE＝土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
图322是描绘AAV-ABCA4、上游和/或下游载体的制造过程的下游和填充和整理步骤的概述的示意图。
图323A至图323B是代表性的优化HIC色谱图。示出优化的峰值切割注释(1.02M缓冲液)和未优化的峰值切割注释(1.08M缓冲液)。关键词：W2＝装载后洗涤液2，E1＝洗脱级分，W3＝洗脱后缓冲液。
图324A至图324B是代表性的优化CEX色谱图。示出优化的峰值切割注释(1.33M缓冲液)和未优化的峰值切割注释(1.3M缓冲液)。关键词：W2＝装载后洗涤液2，E1＝洗脱级分，W3＝洗脱后缓冲液。
图325A至图325C是分别运行通过HIC步骤、CEX步骤和QA步骤的色谱图的一系列代表性优化条件。
图326是详述用于优化过程的步骤回收率的表。
图327A是详述通过MALS进行的QA分离得到完整AAV：空AAV结果的表。图327B是详述通过MALS和TEM进行的QA分离的完整AAV：空AAV结果的表。
图328A至图328D是提供来自AAV-RPGR双载体的四种验证性转染和纯化运行的数据的概念验证表和一系列三张图，然而，这些转染和纯化运行可以使用包括ABCA4的任何转基因。按照初始范围界定研究的结果，评价四种转染条件(A)。对每种条件定量载体粒子的数目(衣壳ELISA)和含有基因组插入片段的粒子的数目(基因组滴度)(B)。
图329A至图329B是描绘评价AAV-RPGR的完整粒子∶空粒子比率的正交法的定量的概念验证图(A)和表(B)，然而，评价完整粒子∶空粒子比率的正交法可以使用包括ABCA4的任何转基因。在图328中呈现的完整粒子分析可能低估实际值，然而趋势是有效的。因此，通过正交法进一步测量来自这四种条件的样品。来自正交法的结果反映从完整粒子分析可见的趋势(图328)。与来自用不同转染剂(CaPO4)生成的材料的早期结果的比较表明，转染剂的选择也可能对完整粒子与空粒子的比率具有影响。
图330是描绘转染试剂(PEI相对CaPO4)对AAV完整载体∶空载体比率的影响的图表。PEI相对CaPO4比较转染研究生成使用HPLC分析完整载体∶空载体比率的材料。正如先前的分析，所述材料没有进行将富集完整粒子的过程步骤。在两种转染条件之间保持恒定的先前可变条件是总DNA、PEI/DNA比率和转染质粒比率。对于两种转染试剂中的每一种，左侧条是FLD并且右侧条是MALS。
图331是说明性质粒pAAV.stbIR.3’ABCA4.WPRE.kan的注释序列(SEQ ID NO：41)，其包含编码5′ITR的序列(AAV2衍生的ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：42)、编码3′ABCA4的序列(核苷酸176-3509，SEQ ID NO：43)、编码WPRE的序列(核苷酸3516-4108，SEQ ID NO：44)、编码BGH PolyA的序列(核苷酸4115-4278，SEQ ID NO：45)和编码3′IR的序列(AAV衍生的ITR，核苷酸4422-4542，SEQ ID NO：46)。在某些实施方案中，ITR包含核苷酸1-130或由其组成，3′ABCA4编码序列包含核苷酸181-3509或由其组成，WPRE包含核苷酸3522-4110或由其组成，和/或BGH PolyA包含核苷酸4115-4383或由其组成。IR＝ITR。
图332是说明性质粒pAAV.stbITR.CBA.InEx.5′ABCA4.kan的注释序列(SEQ IDNO：47)，其包含编码5′IR的序列(AAV2衍生的ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：48)、编码CBA启动子的序列(核苷酸190-467，SEQ ID NO：49)、编码内含子的序列(核苷酸468-590，SEQID NO：50)、编码外显子的序列(核苷酸591-630，SEQ ID NO：51)、5′ABCA4(核苷酸650-4351，SEQ ID NO：52)和编码3′IR的序列(AAV2衍生的ITR，核苷酸4389-4509，SEQ ID NO：53)。在某些实施方案中，ITR包含核苷酸1-130或由其组成，CBA启动子包含核苷酸186-468或由其组成，InEx包含核苷酸469-643或由其组成，并且5′ABCA4包含核苷酸650-4350或由其组成。IR＝ITR。
图333是说明性质粒pAAV.stbITR.CBA.RBG.5′ABCA4.kan的注释序列(SEQ ID NO：54)，其包含编码5′ITR的序列(AAV2衍生的ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：55)、编码CBA启动子的序列(核苷酸190-467，SEQ ID NO：56)、编码RGB内含子的序列(核苷酸704-876，SEQID NO：57)、编码5’ABCA4的序列(核苷酸919-4620，SEQ ID NO：58)和编码3′IR的序列(核苷酸4667-4788，SEQ ID NO：59)。在某些实施方案中，ITR包含核苷酸1-130或由其组成，CBA包含核苷酸186-468或由其组成，RGB包含核苷酸469-881或由其组成，5′ABCA4包含核苷酸919-4619或由其组成，并且3′ITR包含核苷酸4658-4778或由其组成。IR＝ITR。
图334是说明性质粒pAAV.stbITR.CMV.CBA.5′ABCA4.kan的注释序列(SEQ ID NO：60)，其包含编码5′IR的序列(AAV2衍生的ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：61)、编码CMV增强子的序列(核苷酸322-556，SEQ ID NO：62)、编码CBA启动子的序列(核苷酸571-849，SEQ IDNO：63)、编码5′ABCA4的序列(核苷酸856-4557，SEQ ID NO：64)和编码3′IR的序列(核苷酸4667-4788，SEQ ID NO：65)。在一些实施方案中，ITR包含核苷酸1-130或由其组成，CMV序列包含核苷酸186-568或由其组成，CBA序列包含核苷酸569-849或由其组成，5′ABCA4包含核苷酸556-4556或由其组成，并且3′ITR包含核苷酸4595-4715或由其组成。IR＝ITR。
图335是说明性质粒pAAV.stbITR.RK.5′ABCA4.kan的注释序列(SEQ ID NO：66)，其包含编码5′IR的序列(AAV2衍生的ITR，核苷酸16-130，SEQ ID NO：67)、编码RK启动子的序列(核苷酸186-384，SEQ ID NO：68)、编码5′ABCA4的序列(核苷酸576-4267，SEQ ID NO：69)和编码3′IR的序列(核苷酸4275-4425，SEQ ID NO：70)。
图336提供用于ABCA4 HIC(图336A)、CEX(图336B)和AEX(图336C)制备性运行和分析性运行(图336D)的缓冲液的描述。
图337是示出用于ABCA4制备性运行的HIC色谱条件的表。
图338是示出用于ABCA4制备性运行的CEX(SO3)色谱条件的表。
图339是示出用于ABCA4制备性运行的AEX色谱条件的表。
图340是示出使用OH柱HPLC分析方法在HIC上进行捕获步骤的条件的表。对于制备性运行，将澄清的收获材料(1.2L，分到两个瓶中，每瓶含0.6L)在室温下解冻，合并，并用稀释缓冲液1∶1稀释(1.2L收获物+1.2L缓冲液)。使用系统泵以5 CV/min装载到柱。技术转移运行(Tech transfer run)是HIC条件的第八(8)次运行(HIC-8)。
图341A和图341B是具有整个运行-装载阶段(图341A)和放大的洗脱部分(图341B)的运行HIC-8的色谱图。对于图341A，在1000处，顶部线是在260nm下的UV检测，下一条线是电导率，再下一条线是在280nm下的UV检测，并且最下一条线是压力。对于图341B，在约2400处，最高峰是在280nm下的UV检测，第二高峰是在260nm下的UV检测，并且更下一条线是电导率。在装载期间的压力升高是0.3巴。用标记记录级分。主要洗脱液是E1。
图342A至图342J示出基于HPLC分析(HIC-8的总方法)的色谱图。图342A-空白(缓冲液)运行；图342B-收获物；图342C-负载；图342D-流过液(FT)；图342E-洗涤液1(W1)；图342F-洗涤液2(W2)；图342G-洗脱液(E1)；图342H-洗涤液3(W3)；图342I-CIP；图342J-荧光和MALS信号的重加。对于图342A至图342I中的每个图，x轴示出保留时间(分钟)，并且y轴示出吸光度、电导率和光散射。源自y轴中间周围的线是荧光(Ex 280nm，EM 348nm)；源自y轴底部周围的两条线是在260nm下的吸光度和在280nm下的吸光度；并且在约10分钟保留时间处达到峰值的线是电导率(mS/cm)。与其他级分相比，主要洗脱液(E1)是10倍稀释的。所有色谱图都是呈相同标度。
图343是示出基于ddPCR和HPLC总分析的HIC-8运行的回收率的表。
图344示出HIC-8运行的SDS-PAGE结果。M-阶梯。级分E1、级分W3和级分CIP分别是5倍稀释的、5倍稀释的和2倍稀释的。主要级分是E1。VP1-VP3蛋白在E1 5x dill.泳道中由矩形标记。将所有级分脱盐并在还原条件下以纯的或稀释的形式装载到凝胶中。
图345是示出使用CIM SO3柱在CEX上进行中间精制的条件的表。对于制备性运行，制备来自HIC-OH的全部洗脱液(E1)以匹配结合条件，并且将其装载到CEX-SO3柱。运行是CEX条件的第七次运行(SO3-7)。
图346A和图346B示出来自运行SO3-7的色谱图。整个运行-装载阶段(图346A)，放大的洗脱部分(图346B)。图例：蓝色线是在280nm下的UV检测，红色线是在260nm下的UV检测，棕色线是电导率，深绿色线是压力。在装载期间没有压力升高。用棕色标记记录级分。主要洗脱液是E1。
图347A至图347J是基于HPLC分析(SO3-7的总方法)的色谱图。图347A-空白(缓冲液)运行；图347B-负载BF；图347C-负载；图347D-流过液+洗涤液1(FT+W1)；图347E-洗涤液2(W2)；图347F-洗脱液(E1)；图347G-洗涤液3(W3)；图347H-CIP；图347I-荧光信号的叠加；图347J-MALS信号的叠加。图例：荧光(Ex 280nm，EM 348nm)：绿色曲线，在260nm下的吸光度；红色曲线，在280nm下的吸光度；蓝色曲线，电导率(mS/cm)：黑色曲线。主要洗脱液(E1)是5倍稀释的，而其他级分是未稀释的。所有色谱图都是呈相同标度。
图348是示出制备运行SO3-7的基于ddPCR和HPLC总分析的回收率的表。与起始HIC-8 E1材料相比，中间精制步骤CEX-SO3的回收率对于ddPCR和HPLC总分析(MALS)分别为90％和86％。两种方法之间的差异较小。在HPLC分析的情况下，质量平衡不是100％。两个(ddPCR和HPLC总分析(MALS)结果的归一化提供更准确的值，主要级分中AAV的平均回收率为97％。
图349示出SO3-7运行的SDS-PAGE结果。M-阶梯。级分E1是5倍稀释的和10倍稀释的，级分W3和级分CIP是2倍稀释的。主要级分是E1。VP1-VP3蛋白由矩形标记。
图350是示出使用CIM QA柱在AEX上分离空AAV衣壳和完整AAV衣壳的条件的表。在制备性运行期间，将来自SO3-7的全部洗脱液(E1)稀释以匹配结合条件并且将其装载到AEX-QA柱。运行是AEX条件的第三次运行(QA-3)。
图351A和图351B示出来自运行QA-3的色谱图。整个运行-装载阶段(图351A)，放大的洗脱部分(图351B)。图例：蓝色线是在280nm下的UV检测，红色线是在260nm下的UV检测，棕色线是电导率。在装载期间没有压力升高。用棕色标记记录级分。主要洗脱液(完整衣壳AAV)是E3。
图352A至图352H示出QA-3的基于HPLC分析(空粒子完整粒子方法)的色谱图。图352A-SO3-7 E1；图352B-FT+W；图352C-E1；图352D-E2(空AAV衣壳)；图352E-E3(完整AAV衣壳)；图352F-E4(完整主峰的尾部)；图352G-E5；图352H-E6；图352I-CIP；图352J-MALS信号的叠加。图例：图例：荧光(Ex 280nm，EM 348nm)：绿色曲线，在260nm下的吸光度：红色曲线，在280nm下的吸光度：蓝色曲线，电导率(mS/cm)：黑色曲线，多角度光散射检测器(MALS)是粉红色曲线。B、C、D、F和G呈相同标度，A和E分别呈3倍大的标度和8倍大的标度。各级分是20倍稀释的(图片I)或10倍稀释的(图片E和H)，其他级分是5倍稀释的。对于相应级分呈现比率A260/A280。
图353是示出对QA-3 E3样品使用渗析实现缓冲液交换的条件的表。样品的最终体积为3mL。
图354A至图354C是示出制备性运行A-3(图354A)、基因组DSP收率(图354B)和归一化DSP收率(图354C)的基于ddPCR和HPLC E/F分析的回收率的表。
图355是示出基于HPLC E/F分析的纯度(空AAV衣壳与完整AAV衣壳之间的比率)的表。
图356是示出在稀释的QA-15和未稀释的QA-15中以及TFF后的样品中通过TEM评价的完整AAV衣壳和空AAV衣壳的比率的表。
图357提供通过TEM评价的SO3-7 E1(顶行)、QA-3 E3(中行)和渗析后(底行)的显微照片。左：低放大倍数，右：用于计数的放大倍数。
图358示出QA-3运行的银染色SDS-PAGE结果。M-阶梯。级分E3是纯的并且是5倍稀释的，除CIP(2倍稀释)以外，其他级分是纯的。主要级分是E3。AAV8-PD是渗析后的E3级分。使用Biorad TGX 4-20％凝胶，银染色程序。
图359A和图359B示出HPLC色谱图-指纹法。呈现每个色谱阶段的叠加。图359A：A260信号的叠加。图359B：MALS信号的叠加，其仅描绘较大的粒子并且不受蛋白质的影响，并且因此，获得E/F的更好的解析率。按比例稀释级分以具有相似的反应。
具体实施方式
本公开提供一种从哺乳动物宿主细胞培养物纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法，其包括以下步骤：(a)在适用于形成多个rAAV粒子的条件下在生长培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞，其中所述多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染，以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞；(b)在适用于将rAAV粒子释放到收获培养基中的条件下使所述多个转染的哺乳动物宿主细胞与病毒释放溶液接触，以产生包含多个rAAV粒子、病毒释放溶液和收获培养基的组合物；(c)通过疏水作用色谱法(HIC)从(b)的组合物纯化所述多个rAAV粒子，以产生包含所述多个rAAV粒子的HIC洗脱液；(d)通过阳离子交换色谱法(CEX)从(b)的HIC洗脱液纯化所述多个rAAV病毒粒子，以产生包含多个rAAV粒子的CEX洗脱液；(e)通过阴离子交换(AEX)色谱法从(d)的CEX洗脱液分离多个完整rAAV粒子，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的AEX洗脱液；和(f)通过切向流过滤(TFF)渗滤并浓缩(e)的AEX洗脱液至最终制剂缓冲液中，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子和最终制剂缓冲液的最终组合物。
本公开还涉及生产重组AAV(rAAV)粒子的方法，其包括以下步骤：(a)用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染多个哺乳动物宿主细胞，以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞，其中所述细胞使用PEI作为转染试剂转染，并且其中使所述细胞与所述PEI和指定的质粒载体比率的所述载体接触。
AAV-RPGR
本公开提供一种使用本公开的方法制造的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含(a)0.5x1011个载体基因组(vg)/mL与1x1013vg/mL之间的复制缺陷型和重组腺相关病毒(rAAV)，(b)小于50％的空衣壳；和(c)多个功能性vg/mL，其中每个功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达RPGRORF15序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(a)0.5x1011个载体基因组(vg)/mL与1x1013vg/mL之间的复制缺陷型和重组腺相关病毒(rAAV)，(b)小于30％的空衣壳；和(c)多个功能性vg/mL，其中每个功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达RPGRORF15序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(a)0.5x1011个载体基因组(vg)/mL与1x1013vg/mL之间的复制缺陷型和重组腺相关病毒(rAAV)，(b)小于99％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％或在其之间的任何百分比的空衣壳；和(c)多个功能性vg/mL，其中每个功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达RPGRORF15序列。在一些实施方案中，在用本公开的组合物转导细胞后，RPGRORF15序列编码RPGRORF15蛋白。在一些实施方案中，由RPGRORF15序列编码的蛋白质的活性水平等于或大于由未转导细胞的相应序列编码的RPGRORF15的活性水平。在一些实施方案中，外源性RPGRORF15序列和相应内源性RPGRORF15序列是相同的。在一些实施方案中，外源性RPGRORF15序列和相应内源性RPGRORF15序列是不同的。在一些实施方案中，外源性RPGRORF15序列和相应内源性RPGRORF15序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或在其之间的任何百分比的同一性。
在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)，(b)至少70％的完整衣壳，和(c)多个功能性vg/mL，其中每个功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达RPGRORF15序列。在一些实施方案中，组合物包含(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)，(b)至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在其之间的任何百分比的完整衣壳，和(c)多个功能性vg/mL，其中每个功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达RPGRORF15序列。在一些实施方案中，组合物包含0.5x1011vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含1x1012vg/mL。
本公开的组合物包含适用于全身或局部施用到哺乳动物且优选地施用到人的治疗性RPGRORF15构建体。本公开的示例性RPGRORF15构建体包含编码RPGRORF15或其一部分的序列。优选地，本公开的RPGRORF15构建体包含编码人RPGRORF15或其一部分的序列。本公开的示例性RPGRORF15构建体还可包含编码调节元件以使得实现或增强基因或其一部分的表达的一个或多个序列。示例性调节元件包括但不限于启动子、内含子、增强子元件、反应元件(包括转录后反应元件或转录后调节元件)、聚腺苷(polyA)序列和促进转录有效终止的基因片段(包括β-球蛋白基因片段和兔β-球蛋白基因片段)。
在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGRORF15构建体包含对应于人色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)蛋白或其一部分的人基因或其一部分。人RPGR包含多种剪接同种型。同种型ORF15 RPGR(RPGRORF15)定位到光感受器。在一些实施方案中，RPGR蛋白是RPGRORF15。在一些实施方案中，RPGRORF15构建体包含含有密码子优化的序列的人基因或其一部分。在一些实施方案中，序列是密码子优化的，以在哺乳动物中表达。在一些实施方案中，序列是密码子优化的，以在人中表达。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-RPGRORF15产物由编码RPGRORF15的cDNA的纯化的重组血清型2(rAAV)组成。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列包含：AAV2 5′反向末端重复(ITR)、199bp GRK1启动子、3459bp人RPGRORF15cDNA、270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)和AAV2 3′ITR，以及侧接所述元件的短克隆序列。
在一些实施方案中，RPGRORF15构建体包含编码RPGROR15的序列。在一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列为人RPGRORF15序列。在一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列包含编码与以下氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或相同的氨基酸序列的核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000501
在一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列包含野生型核苷酸序列。在一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列包含与以下核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或在其之间的任何百分比的同一性的核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000502
Figure BPA0000305202160000511
在一些实施方案中，编码RPGRORF15的序列包含密码子优化的核苷酸序列。RPGRORF15在3′-端含有高度重复的富嘌呤区，并且在紧接上游含有剪接位点，这对AAV.RPGR的克隆会产生重大的挑战。在一些实施方案中，密码子优化可以用于使内源性剪接位点失效并稳定RPGRORF15转录物中的富嘌呤序列，而不改变RPGRORF15蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，在密码子优化后保留RPGR蛋白的翻译后修饰，例如谷氨酰化。在一些实施方案中，RPGRORF15核苷酸序列是密码子优化的，以在哺乳动物中表达。在一些实施方案中，RPGRORF15核苷酸序列是密码子优化的，以在人中表达。
在一些实施方案中，密码子优化的3459bp人RPGRORF15cDNA包含与以下核苷酸序列具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或在其之间的任何百分比的同一性的核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000521
Figure BPA0000305202160000531
在一些实施方案中，密码子优化的3459bp人RPGRORF15cDNA包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000532
Figure BPA0000305202160000541
在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGRORF15构建体包含启动子。在一些实施方案中，启动子包括视紫红质激酶启动子。在一些实施方案中，视紫红质激酶启动子从G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)基因的启动子分离或衍生。在一些实施方案中，启动子为GRK1启动子。在一些实施方案中，编码GRK1启动子的序列包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的序列：
Figure BPA0000305202160000542
在一些实施方案中，GRK1启动子包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000543
在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGRORF15构建体包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，编码polyA信号的序列包含从牛生长激素(BGH)polyA信号分离或衍生的polyA信号。在一些实施方案中，BGH polyA信号包含与以下核苷酸序列具有至少80％同一性、至少97％同一性或100％同一性的核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000551
在一些实施方案中，编码BGH polyA的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000552
在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGRORF15构建体还包含对应于5′反向末端重复(ITR)的序列和对应于3′反向末端重复(ITR)的序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列是相同的。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列是不同的。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列从血清型2的腺相关病毒载体(AAV2)分离或衍生。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含野生型序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含截短的野生型AAV2序列。在一些实施方案中，当与野生型AAV2序列相比时，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含变异。在一些实施方案中，变异包括取代、插入、缺失、倒位或转座。在一些实施方案中，变异包括野生型或变体序列的截短或延伸。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含对应于5′反向末端重复(ITR)的序列和对应于3′反向末端重复(ITR)的序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列是相同的。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列是不同的。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列从血清型2的腺相关病毒载体(AAV2)分离或衍生。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含野生型序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含截短的野生型AAV2序列。在一些实施方案中，当与野生型AAV2序列相比时，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含变异。在一些实施方案中，变异包括取代、插入、缺失、倒位或转座。在一些实施方案中，变异包括野生型或变体序列的截短或延伸。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含形成复制缺陷型AAV所必需的病毒序列。在一些实施方案中，病毒序列从与编码5′ITR的序列或编码3′ITR的序列中的一者或两者相同的血清型的AAV分离或衍生。在一些实施方案中，病毒序列、编码5′ITR的序列或编码3′ITR的序列从AAV2分离或衍生。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含形成复制缺陷型AAV所必需的病毒序列、编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列，但不包含从AAV分离或衍生的任何其他序列。在一些实施方案中，AAV是重组AAV(rAAV)，其包含形成复制缺陷型AAV所必需的病毒序列、编码5′ITR的序列、编码3′ITR的序列和编码本公开的RPGRORF15构建体的序列。
在一些实施方案中，用于在宿主细胞中产生rAAV的质粒DNA包含选择标记。示例性选择标记包括但不限于抗生素抗性基因。示例性抗生素抗性基因包括但不限于氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因。示例性选择标记包括但不限于药物或小分子抗性基因。示例性选择标记包括但不限于dapD和可阻遏的操纵基因，所述可阻遏的操纵基因包括但不限于控制或抑制dapD表达的lacO/P构建体，其中质粒选择通过施用转化细胞和能够进行操纵基因阻遏物滴定(ORT)的质粒或使所述转化细胞与所述质粒接触来执行。示例性选择标记包括但不限于ccd选择基因。在一些实施方案中，ccd选择基因包含编码ccdA选择基因的序列，所述ccdA选择基因拯救被工程改造以表达毒性ccdB基因的宿主细胞系。示例性选择标记包括但不限于sacB，其中向宿主细胞施用RNA或使其与宿主细胞接触以抑制sacB基因在蔗糖培养基中的表达。示例性选择标记包括但不限于分离杀伤机制，诸如由Hok(宿主杀伤基因)和Sok(杀伤抑制)组成的parAB+基因座。
AAV-RPGR构建体结构
AAV-RPGRORF15构建体产物由编码cDNA(其编码治疗性构建体)的纯化的重组血清型2腺相关病毒载体(rAAV)组成。
在一些实施方案中，AAV-RPGRORF15构建体包含编码5′ITR的序列、编码3′ITR的序列和从血清型8腺相关病毒载体(AAV8)分离和/或衍生的编码衣壳蛋白的序列中的一种或多种。在一些实施方案中，AAV-RPGRORF15构建体包含编码5′ITR的序列、编码3′ITR的序列和从血清型8腺相关病毒载体(AAV8)分离和/或衍生的编码衣壳蛋白的序列。在一些实施方案中，AAV-RPGRORF15构建体包含从血清型2腺相关病毒载体(AAV2)分离和/或衍生的编码5′ITR的截短序列和编码3′ITR的序列以及从血清型8腺相关病毒载体(AAV8)分离和/或衍生的编码衣壳蛋白的序列。在一些实施方案中，AAV构建体包含野生型AAV2ITR(野生型5′ITR和野生型3′ITR)。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5′反向末端重复(ITR)，(b)适用于在哺乳动物细胞中表达的启动子，(c)编码RPGRORF15的cDNA，和(d)3′ITR。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5′反向末端重复(ITR)，(b)适用于在哺乳动物细胞中表达的启动子，(c)编码RPGRORF15的cDNA，(c)聚腺苷酸化信号，和(d)1bp 3’ITR。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5′反向末端重复(ITR)，(b)适用于在哺乳动物细胞中表达的启动子，(c)编码RPGRORF15的cDNA，(d)转录后调节元件(PRE)，(e)聚腺苷酸化序列(polyA)，和(f)3′ITR。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5′反向末端重复(ITR)，(b)启动子，任选地199bp GRK1启动子，(c)编码RPGRORF15的cDNA，(d)270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)，和(e)3′ITR。
在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5′反向末端重复(ITR)，(b)启动子，任选地199bp GRK1启动子，(c)编码RPGRORF15的cDNA，(d)270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)，和(e)3′ITR。
本公开的AAV或RPGRORF15构建体可包含编码能够在哺乳动物细胞中表达的启动子的序列。优选地，本公开的AAV或RPGRORF15构建体可包含编码能够在人细胞中表达的启动子的序列。本公开的示例性启动子包括但不限于组成型活性启动子、细胞类型特异性启动子、病毒启动子、哺乳动物启动子和杂合或重组启动子。在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-构建体的治疗性构建体是在G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)启动子的控制下。
本公开的AAV或RPGRORF15构建体可以包含聚腺苷(polyA)序列。本公开的示例性polyA序列包括但不限于牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)序列。BGH-polyA序列用于增强基因表达，并且已显示产生比诸如SV40和人胶原polyA的其他polyA序列高三倍的表达水平。这种表达增加很大程度上不依赖于上游启动子或转基因的类型。使用BGH-polyA序列增加表达水平允许注射较低总剂量的AAV或质粒载体，其不太可能产生宿主免疫反应。
在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含原料药。如本文所用，原料药包含本公开的rAAV，所述rAAV包含本公开的RPGRORF15构建体。
AAV-ABCA4
本公开提供一种使用本公开的方法制造的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含(a)分别在0.5x1011个载体基因组(vg)/mL与5x1013vg之间或在0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间的复制缺陷型重组腺相关病毒(rAAV)上游载体或下游载体；(b)小于50％的空衣壳；和(c)多个功能性vg/mL，其中一对上游和下游功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达ABCA4序列。在一些实施方案中，组合物包含(a)分别在0.5x1011个载体基因组(vg)/mL与5x1013vg/mL之间或在0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间的复制缺陷型重组腺相关病毒(rAAV)上游载体或下游载体；(b)小于30％的空衣壳；和(c)多个功能性vg/mL，其中一对上游和下游功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达ABCA4序列。在一些实施方案中，组合物包含(a)分别在0.5x1011个载体基因组(vg)/mL与5x1013vg/mL之间或在0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间的复制缺陷型重组腺相关病毒(rAAV)上游载体或下游载体；(b)小于99％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％或在其之间的任何百分比的空衣壳；和(c)多个功能性vg/mL，其中一对上游和下游功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达ABCA4序列。在一些实施方案中，用本公开的组合物转导细胞后，ABCA4序列编码ABCA4蛋白。在一些实施方案中，由ABCA4序列编码的蛋白质的活性水平等于或大于由未转导细胞的相应序列编码的ABCA4的活性水平。在一些实施方案中，外源性ABCA4序列和相应内源性ABCA4序列是相同的。在一些实施方案中，外源性ABCA4序列和相应内源性ABCA4序列是不同的。在一些实施方案中，外源性ABCA4序列和相应内源性ABCA4序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或在其之间的任何百分比的同一性。
在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含(a)分别在0.5x1011vg/mL与5x1013vg/mL之间或在0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)的上游载体或下游载体，(b)至少70％的完整衣壳，和(c)多个功能性vg/mL，其中一对上游和下游功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达ABCA4序列。在一些实施方案中，组合物包含(a)分别在0.5x1011vg/mL与5x1013vg/mL之间或在0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间(包括端点在内)的上游载体和下游载体，(b)至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在其之间的任何百分比的完整衣壳，和(c)多个功能性vg/mL，其中一对上游和下游功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达ABCA4序列。
本公开的组合物包含适用于全身或局部施用到哺乳动物且优选地施用到人的治疗性ABCA4构建体。本公开的示例性ABCA4构建体包含编码ABCA4或其一部分的序列。优选地，本公开的ABCA4构建体包含编码人ABCA4或其一部分的序列。本公开的示例性ABCA4构建体还可以包含编码调节元件以使得实现或增强基因或其一部分的表达的一个或多个序列。示例性调节元件包括但不限于启动子、内含子、增强子元件、反应元件(包括转录后反应元件或转录后调节元件)、聚腺苷(polyA)序列和促进转录有效终止的基因片段(包括β-球蛋白基因片段和兔β-球蛋白基因片段)。
在本公开的组合物的一些实施方案中，ABCA4构建体包含对应于人ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)蛋白或其一部分的人基因(或其变体)或其一部分。人ABCA4定位到光感受器。在一些实施方案中，ABCA4构建体包含含有野生型或密码子优化的序列的人基因或其一部分。在一些实施方案中，序列是密码子优化的，以在哺乳动物中表达。在一些实施方案中，序列是密码子优化的，以在人中表达。在一些实施方案中，上游ABCA4构建体包含人ABCA4基因的5′部分，并且下游ABCA4构建体包含人ABCA4基因的3′部分。在一些实施方案中，人ABCA4基因的5′部分和人ABCA4基因的3′部分各自包含彼此“重叠”的序列，这意味着重叠序列形成双链体，其中人ABCA4基因的5′部分的重叠部分的序列与人ABCA4基因的3′部分的重叠部分的序列互补。在一些实施方案中，人ABCA4基因的5′部分的重叠部分的序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或在其之间的任何数目的核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，人ABCA4基因的5′部分的重叠部分的序列包含20个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，人ABCA4基因的3′部分的重叠部分的序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或在其之间的任何数目的核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，人ABCA4基因的3′部分的重叠部分的序列包含20个核苷酸或由其组成。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-ABCA4产物包含编码ABCA4的cDNA的纯化的重组血清型8(rAAV8)或由其组成。在一些实施方案中，AAV-ABCA4产物包含纯化的突变rAAV8衣壳蛋白，其中突变rAAV8包含在氨基酸位置733处苯丙氨酸取代酪氨酸(AAV8 Y773F突变体)。在一些实施方案中，AAV-ABCA4上游产物包含编码ABCA4的5′部分的cDNA的纯化的重组血清型8(rAAV8)或由其组成。在一些实施方案中，AAV-ABCA4下游产物包含编码ABCA4的3′部分的cDNA的纯化的重组血清型8(rAAV8)或由其组成。在一些实施方案中，ABCA4或其部分为人ABCA4。
在本公开的AAV-ABCA4产物的一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列包含：AAV2 5′反向末端重复(ITR)、ABCA4 cDNA和AAV2 3′ITR以及侧接元件的短克隆序列。
在本公开的AAV-ABCA4上游产物的一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列包含：AAV2 5′反向末端重复(ITR)、启动子、ABCA4cDNA和AAV2 3′ITR以及侧接元件的短克隆序列。在一些实施方案中，ABCA4 cDNA包含编码人ABCA4基因的5′部分的序列。在一些实施方案中，启动子包括GRK1启动子。在一些实施方案中，启动子包含单独的或与巨细胞病毒(CMV)增强子和兔β-球蛋白(RBG)剪接受体位点中的一个或多个组合的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，启动子包含鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、CMV增强子和RBG剪接受体位点，本文另外称为“CAG”启动子。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列还包含编码内含子的序列和/或编码外显子的序列。
在本公开的AAV-ABCA4下游产物的一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列包含：AAV2 5′反向末端重复(ITR)、ABCA4 cDNA和AAV2 3′ITR以及侧接元件的短克隆序列。在一些实施方案中，ABCA4 cDNA包含编码人ABCA4基因的3′部分的序列。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列还包含编码翻译后调节元件(PRE)的序列。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列还包含编码土拨鼠PRE(WPRE)的序列。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列还包含编码聚腺苷酸化信号的序列。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列，所述单链DNA插入序列还包含编码牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号的序列。
在一些实施方案中，ABCA4构建体包含编码人ABCA4或其一部分的序列。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含编码与以下氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或相同的氨基酸序列的核苷酸序列或其一部分：
Figure BPA0000305202160000611
在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含野生型核苷酸序列。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含与以下核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或在其之间的任何百分比的同一性的核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000621
Figure BPA0000305202160000631
Figure BPA0000305202160000641
在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码ABCA4的序列包含与以下核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或在其之间的任何百分比的同一性的核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000642
Figure BPA0000305202160000651
Figure BPA0000305202160000661
在本公开的组合物的一些实施方案中，ABCA4构建体包含启动子。在一些实施方案中，启动子包括视紫红质激酶启动子。在一些实施方案中，视紫红质激酶启动子从G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)基因的启动子分离或衍生。在一些实施方案中，启动子为GRK1启动子。在一些实施方案中，编码GRK1启动子的序列包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的序列：
Figure BPA0000305202160000662
在一些实施方案中，GRK1启动子包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000671
在本公开的组合物的一些实施方案中，ABCA4构建体包含启动子。在一些实施方案中，启动子包括鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，编码CBA启动子的序列包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的序列：
Figure BPA0000305202160000672
在一些实施方案中，CBA启动子包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000673
在本公开的组合物的一些实施方案中，ABCA4构建体包含启动子变体，例如CMV.CBA启动子、CBA.RBG启动子或CBA.InEx启动子。
在一些实施方案中，启动子包含CMV.CBA启动子变体，例如包含CMV增强子和CBA启动子。在一些实施方案中，编码CMV.CBA启动子的序列包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的序列：
Figure BPA0000305202160000674
Figure BPA0000305202160000681
在一些实施方案中，启动子包含CBA.RBG启动子变体，例如包含CBA启动子和RGB内含子。在一些实施方案中，编码CBA.RBG启动子的序列包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的序列：
Figure BPA0000305202160000682
在一些实施方案中，启动子包含CBA.InEx启动子变体，例如包含CBA启动子、内含子和外显子。在一些实施方案中，编码CBA.InEx启动子的序列包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的序列(内含子是斜体的)：
Figure BPA0000305202160000683
在本公开的组合物的一些实施方案中，ABCA4构建体包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，编码polyA信号的序列包含从牛生长激素(BGH)polyA信号分离或衍生的polyA信号。在一些实施方案中，BGH polyA信号包含与以下核苷酸序列具有至少80％同一性、至少97％同一性或100％同一性的核苷酸序列：
Figure BPA0000305202160000691
在一些实施方案中，编码BGH polyA的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000692
在本公开的组合物的一些实施方案中，ABCA4构建体还包含对应于5′反向末端重复(ITR)的序列和对应于3′反向末端重复(ITR)的序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列是相同的。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列是不同的。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列从血清型2的腺相关病毒载体(AAV2)分离或衍生。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含野生型序列。在一些实施方案中，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含截短的野生型AAV2序列。在一些实施方案中，当与野生型AAV2序列相比时，编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列包含变异。在一些实施方案中，变异包括取代、插入、缺失、倒位或转座。在一些实施方案中，变异包括野生型或变体序列的截短或延伸。在一些实施方案中，ITR以正向和反向取向衍生自3′AAV2ITR，随后缺失，以产生稳定的ITR。在某些实施方案中，5′ITR包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000693
在一些实施方案中，3′ITR包含以下序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000694
在一些实施方案中，编码5′ITR的序列包含以下序列：
Figure BPA0000305202160000695
在一些实施方案中，编码3′ITR的序列包含从AAV2分离或衍生的野生型序列。在一些实施方案中，编码3′ITR的序列包含以下序列：
Figure BPA0000305202160000696
Figure BPA0000305202160000701
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含形成复制缺陷型AAV所必需的病毒序列。在一些实施方案中，病毒序列从与编码5′ITR的序列或编码3′ITR的序列中的一者或两者相同的血清型的AAV分离或衍生。在一些实施方案中，病毒序列、编码5′ITR的序列或编码3′ITR的序列从AAV2分离或衍生。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含形成复制缺陷型AAV所必需的病毒序列、编码5′ITR的序列和编码3′ITR的序列，但不包含从AAV分离或衍生的任何其他序列。在一些实施方案中，AAV是重组AAV(rAAV)，其包含形成复制缺陷型AAV所必需的病毒序列、编码5′ITR的序列、编码3′ITR的序列和编码本公开的ABCA4构建体的序列。
在一些实施方案中，用于在宿主细胞中产生rAAV的质粒DNA包含选择标记。示例性选择标记包括但不限于抗生素抗性基因。示例性抗生素抗性基因包括但不限于氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因。示例性选择标记包括但不限于药物或小分子抗性基因。示例性选择标记包括但不限于dapD和可阻遏的操纵基因，所述可阻遏的操纵基因包括但不限于控制或抑制dapD表达的lacO/P构建体，其中质粒选择通过施用转化细胞和能够进行操纵基因阻遏物滴定(ORT)的质粒或使所述转化细胞与所述质粒接触来执行。示例性选择标记包括但不限于ccd选择基因。在一些实施方案中，ccd选择基因包含编码ccdA选择基因的序列，所述ccdA选择基因拯救被工程改造以表达毒性ccdB基因的宿主细胞系。示例性选择标记包括但不限于sacB，其中向宿主细胞施用RNA或使其与宿主细胞接触以抑制sacB基因在蔗糖培养基中的表达。示例性选择标记包括但不限于分离杀伤机制，诸如由Hok(宿主杀伤基因)和Sok(杀伤抑制)组成的parAB+基因座。
AAV-ABCA4双载体构建体
AAV是呈现非常低的免疫原性并且与任何已知的人疾病都无关的小病毒。缺乏相关炎症反应意味着AAV在被注射到眼中时不会引起视网膜损伤。
然而，AAV衣壳的大小对可以包装在其中的DNA的量有限制。AAV基因组的大小为大约4.7千碱基(kb)，并且认为对包装在AAV中的DNA的相应大小上限为大约5kb。ABCA4基因的编码序列的大小为大约6.8kb(基因表达需要另外的遗传元件)，使其太大而不能并入标准AAV载体中。
“双”载体
一种替代方法是制备双载体系统，其中大于大约5kb极限的转基因被大约一分为二地分裂成两个具有确定序列的单独载体：含有转基因的5′部分的“上游”载体和含有转基因的3′部分的“下游”载体。通过上游载体和下游载体两者转导靶细胞允许使用多种细胞内机制由这两个片段重新组装全长转基因。本文公开的方法可以用于产生双载体系统的任一载体或两种载体。本文公开的组合物可以包含双载体系统的一种载体或两种载体。
本公开的双载体系统使用“重叠”方法。在重叠双载体系统中，在上游编码序列部分的3’端的编码序列的部分与在下游编码序列部分的5’端的同源序列重叠。通过上游载体和下游载体转导靶细胞时，编码序列的上游部分和下游部分之间的同源重组允许重建全长转基因，可以由其转录相应mRNA并表达全长蛋白质。
不希望受任何具体理论的束缚，全长转基因(例如ABCA4)可以通过第二链合成、随后同源重组由重叠双载体系统产生。通过上游AAV粒子和下游粒子转导细胞时，相应ssDNA上游AAV载体和下游AAV载体释放到细胞或其细胞核中，并且通过第二链合成由每个ssDNA产生包含转基因的5′(上游)部分和转基因的3′(下游)部分的dsDNA。然后dsDNA在编码序列的上游部分与下游部分之间的重叠区域经历同源重组，这允许重建全长转基因，可以由其转录相应mRNA并表达全长蛋白。例如，WO 2014/170480描述编码人ABCA4蛋白的双AAV载体系统(其内容整体并入本文中)。
在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，第一AAV载体包含ABCA4编码序列的5′部分。在一些实施方案中，第二AAV载体包含ABCA4编码序列的3′部分。在一些实施方案中，5′端部分和3′端部分重叠至少约20个核苷酸。在一些实施方案中，第一AAV载体和第二AAV载体各自包含单链DNA(ssDNA)。在一些实施方案中，第一AAV载体包含ABCA4编码序列的序列和/或与ABCA4编码序列互补的序列。在一些实施方案中，第二AAV载体包含ABCA4编码序列的序列和/或与ABCA4编码序列互补的序列。在一些实施方案中，第一AAV载体包含5′ABCA4编码序列的序列和与3′ABCA4编码序列的一部分互补的序列。在一些实施方案中，第二AAV载体包含3′ABCA4编码序列的序列和与5′ABCA4编码序列的一部分互补的序列。在一些实施方案中，第一AAV载体和第二AAV载体经历第二链合成以产生第一dsDNA AAV载体和第二dsDNA AAV载体。在一些实施方案中，第一dsDNA AAV载体和第二dsDNA AAV载体通过同源重组产生全长ABCA4转基因。
不希望受任何具体理论的束缚，全长转基因也可以通过单链退火和第二链合成由重叠双载体系统产生。通过上游AAV载体和下游AAV载体转导细胞时，其中上游AAV载体和下游AAV载体各自包含ssDNA，并且其中上游AAV载体包含编码转基因的5′部分的序列并且下游AAV载体包含编码转基因的3′部分的序列，互补的上游载体和下游载体被释放到细胞或其细胞核中。在一些实施方案中，上游AAV载体包含编码转基因的5′部分的序列和与转基因的3′部分互补的序列。在一些实施方案中，上游AAV载体包含编码转基因的5′部分的有义序列和与转基因的3′部分互补的序列。在一些实施方案中，上游AAV载体包含编码转基因的5′部分的反义序列和与转基因的3′部分互补的序列。在一些实施方案中，下游AAV载体包含编码转基因的3′部分的序列和与转基因的5′部分互补的序列。在一些实施方案中，下游AAV载体包含编码转基因的3′部分的反义序列和与转基因的5′部分互补的序列。在一些实施方案中，下游AAV载体包含编码转基因的3′部分的有义序列和与转基因的5′部分互补的序列。在一些实施方案中，上游载体和下游载体在互补性(重叠)区域处杂交。在杂交后，全长转基因通过第二链合成产生。
在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，第一AAV载体包含ABCA4编码序列的5′部分，第二AAV载体包含ABCA4编码序列的3′部分，并且5′部分和3′部分重叠至少20个连续核苷酸。在一些实施方案中，第一AAV载体和第二AAV载体各自包含单链DNA(ssDNA)。在一些实施方案中，第一AAV载体包含ABCA4编码序列的序列，并且第二AAV载体包含与ABCA4编码序列互补的序列。在一些实施方案中，第二AAV载体包含ABCA4编码序列的序列，并且第一AAV载体包含与ABCA4编码序列互补的序列。在一些实施方案中，第一AAV载体和第二AAV载体在互补重叠区域退火，以通过随后的第二链合成产生全长dsDNA ABCA4转基因。在一些实施方案中，全长dsDNA ABCA4转基因在体外或体内(在细胞中或在受试者中)产生。
本公开通过提供如权利要求中所述的腺相关病毒(AAV)载体系统解决上述现有技术问题。
双载体方法增加AAV基因疗法的能力，但也可以显著降低靶蛋白的水平，这可能不足以实现治疗效果。在双载体系统的一些实施方案中，双载体重组的功效取决于正链与负链(有义链与反义链)之间DNA重叠的长度。ABCA4编码序列的大小允许探索正链与负链之间各种长度的重叠，以鉴定用于治疗由大基因中的突变导致的病症的最佳双载体策略的区域。这些策略可以导致产生足够的靶蛋白以提供治疗效果。在斯塔加特(Stargardt)小鼠模型中，可以容易地评估治疗效果，因为在视网膜的光感受器细胞中需要丰富的靶蛋白ABCA4，并且其缺乏诱导双维甲酸化合物的累积，这又导致790nm自发荧光的增加。重叠双载体系统的治疗潜力可以通过在治疗后观察到此双维甲酸累积的减少和随后790nm自发荧光水平的减少而在体内验证。
有利地是，本公开的AAV载体系统提供全长ABCA4蛋白在转导细胞中的惊人的高水平表达，其中ABCA4的不需要的截短片段的产生有限。利用优化的重组，全长ABCA4蛋白在Abca4-/-小鼠的光感受器外节中表达，并且其表达水平足以减少双维甲酸形成并校正视网膜成像上的自发荧光表型。这些观察结果支持用于AAV基因疗法以治疗斯塔加特病的双载体方法。
在第一方面，本发明提供一种用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白的腺相关病毒(AAV)载体系统，所述AAV载体系统包含含有第一核酸序列的第一AAV载体和含有第二核酸序列的第二AAV载体；其中所述第一核酸序列包含ABCA4编码序列(CDS)的5′端部分，并且所述第二核酸序列包含ABCA4 CDS的3′端部分，并且所述5′端部分和所述3′端部分一起涵盖整个ABCA4 CDS；其中第一核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3597的连续核苷酸的序列；其中第二核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3806至6926的连续核苷酸的序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列各自包含彼此序列重叠区域；并且其中所述序列重叠区域包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的核酸序列的至少约20个连续核苷酸。
术语“AAV载体系统”用于包括第一AAV载体和第二AAV载体旨在以互补方式一起起作用的事实。
本发明的AAV载体系统的第一AAV载体和第二AAV载体一起编码整个ABCA4转基因。因此，编码的ABCA4转基因在靶细胞中的表达需要用第一(上游)载体和第二(下游)载体两者转导靶细胞。
本发明的AAV载体系统的AAV载体通常是呈AAV粒子(也称为病毒体)的形式。AAV粒子包含围绕核酸的核心的蛋白外壳(衣壳)，所述核心为AAV基因组。本发明还涵盖编码本文所述的AAV载体系统的AAV载体基因组的核酸序列。
SEQ ID NO：1为对应于NCBI参考序列NM_000350.2的人ABCA4核酸序列。SEQ IDNO：1与NCBI参考序列NM_000350.2相同。ABCA4编码序列跨越SEQ ID NO：1的核苷酸105至6926。
除以下突变之外，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1相同：核苷酸1640 G＞T、核苷酸5279 G＞A、核苷酸6173 T＞C。这些突变不改变编码的氨基酸序列，并且因此由SEQ ID NO：2编码的ABCA4蛋白与由SEQ ID NO：1编码的ABCA4蛋白相同。
在一些实施方案中，第一AAV载体包含含有ABCA4 CDS的5′端部分的第一核酸序列。ABCA4 CDS的5′端部分是ABCA4 CDS的包含其5′端的部分。因为它仅是CDS的一部分，所以ABCA4 CDS的5′端部分不是全长(即不是整个)ABCA4 CDS。因此，第一核酸序列(并且因此第一AAV载体)不包含全长ABCA4 CDS。
在一些实施方案中，第二AAV载体包含含有ABCA4 CDS的3′端部分的第二核酸序列。ABCA4 CDS的3′端部分是ABCA4 CDS的包含其3′端的部分。因为它仅是CDS的一部分，所以ABCA4 CDS的3′端部分不是全长(即不是整个)ABCA4 CDS。因此，第二核酸序列(并且因此第二AAV载体)不包含全长ABCA4 CDS。
5′端部分和3′端部分一起涵盖整个ABCA4 CDS(具有序列重叠区域，如下文所讨论)。因此，全长ABCA4 CDS包含在本发明的AAV载体系统中，分裂为第一AAV载体和第二AAV载体，并且可以在用第一AAV载体和第二AAV载体转导靶细胞后在靶细胞中重新组装。
在一些实施方案中，如上文所述的第一核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1的核苷酸105至3597的连续核苷酸的序列。ABCA4 CDS开始于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105。
在一些实施方案中，如上文所述的第二核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的核苷酸3806至6926的连续核苷酸的序列。
为了涵盖整个ABCA4 CDS，第一核酸序列和第二核酸序列各自还包含对应于SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的ABCA4 CDS的至少一部分，使得当第一核酸序列与第二核酸序列比对时，涵盖对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的ABCA4 CDS的整体。因此，当比对时，第一核酸序列和第二核酸序列一起涵盖整个ABCA4CDS。
此外，第一核酸序列和第二核酸序列包含序列重叠区域，从而允许在用本发明的第一AAV载体和第二AAV载体转导的靶细胞内重新构建整个ABCA4 CDS作为全长转基因的一部分。
当第一核酸序列和第二核酸序列彼此比对时，第一核酸序列的3′端的区域与第二核酸序列的5′端的相应区域重叠。因此，第一核酸序列和第二核酸序列两者都包含ABCA4CDS的形成序列重叠区域的一部分。
当在第一核酸序列与第二核酸序列之间的重叠区域包含ABCA4 CDS的对应于SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的部分的至少约20个连续核苷酸时，获得特别有利的结果。
重叠区域可以在所述20个连续核苷酸的上游和/或下游延伸。因此，重叠区域的长度可以大于20个核苷酸。
重叠区域可以包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598的位置上游的核苷酸。可替代地或另外地，重叠区域可以包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3805的位置下游的核苷酸。
可替代地，核酸序列重叠区域可以包含在ABCA4 CDS的对应于SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的核苷酸3598至3805的部分内。
因此，在一个实施方案中，核酸序列重叠区域的长度在20个核苷酸与550个核苷酸之间；优选地长度在50个核苷酸与250个核苷酸之间；优选地长度在175个核苷酸与225个核苷酸之间；优选地长度在195个核苷酸与215个核苷酸之间。
在一个实施方案中，核酸序列重叠区域包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的核酸序列的至少约50个连续核苷酸；优选地至少约75个连续核苷酸；优选地至少约100个连续核苷酸；优选地至少约150个连续核苷酸；优选地至少约200个连续核苷酸；优选地全部208个连续核苷酸。
在一个优选的实施方案中，核酸序列重叠区域在对应于SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的核苷酸3598的核苷酸处开始。术语“开始”意指核酸序列重叠区域从对应于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598的核苷酸处开始沿5′到3’方向延伸。因此，在一个优选的实施方案中，核酸序列重叠区域的最边缘5′核苷酸对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598。
在另一个优选的实施方案中，在第一核酸序列与第二核酸序列载体之间的核酸序列重叠区域对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805。
本发明的另一个优点在于，构建包含如上文所述的核酸序列重叠区域的双AAV载体可以有利地降低不需要的截短ABCA4肽的翻译水平。
当仅从由下游载体衍生的mRNA转录物启动翻译时，截短的ABCA4肽的翻译问题可能在双AAV载体系统中出现。在这点上，诸如AAV25′ITR的AAV ITR可以具有启动子活性；这与下游载体中WPRE和bGH聚腺苷酸化序列(如下文所讨论)的存在一起可以导致由未组合的下游载体产生稳定的mRNA转录物。野生型ABCA4 CDS在其下游部分携带多个框内AUG密码子，所述框内AUG密码子不能在不改变氨基酸序列的情况下取代其他密码子。这产生从稳定转录物发生翻译的可能性，导致存在截短的ABCA4肽。
在本发明的优选实施方案中，其中核酸序列重叠区域在对应于SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的核苷酸3598的核苷酸处开始，重叠区的起始序列包含在较弱背景下的框内AUG密码子之前在良好背景(关于潜在Kozak共有序列)下的框外AUG(起始)密码子，以便鼓励翻译机构启动未组合的仅下游转录物从框外位点翻译。在本发明的特别优选的实施方案中，在框内AUG之前，总共有四个在各种背景下的框外AUG密码子。所有这些都将翻译成在10个氨基酸内的终止密码子，从而阻止不需要的截短ABCA4肽的翻译。
优选地，第一核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805的连续核苷酸的序列，并且第二核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926的连续核苷酸的序列，因此涵盖如上文所述的特别优选的核酸序列重叠区域。
因此，在一个优选的实施方案中，ABCA4 CDS的5′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805的连续核苷酸的序列组成，并且ABCA4 CDS的3′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926的连续核苷酸的序列组成。
在另一个优选的实施方案中，ABCA4 CDS的5′端部分由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805组成，并且ABCA4 CDS的3′端部分由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926组成。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供一种用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白的AAV载体系统，所述AAV载体系统包含含有第一核酸序列的第一AAV载体和含有第二核酸序列的第二AAV载体，其中第一核酸序列包含ABCA4编码序列(CDS)的5′端部分，并且第二核酸序列包含ABCA4 CDS的3′端部分，并且5′端部分和3′端部分一起涵盖整个ABCA4 CDS；其中ABCA4 CDS的5′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805的连续核苷酸的序列组成，并且其中ABCA4 CDS的3′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926的连续核苷酸的序列组成。
在另一个优选的实施方案中，本公开提供一种用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白的AAV载体系统，所述AAV载体系统包含含有第一核酸序列的第一AAV载体和含有第二核酸序列的第二AAV载体，其中第一核酸序列包含ABCA4编码序列(CDS)的5′端部分，并且第二核酸序列包含ABCA4 CDS的3′端部分，并且5′端部分和3′端部分一起涵盖整个ABCA4 CDS；其中ABCA4 CDS的5′端部分由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805组成，并且其中ABCA4 CDS的3′端部分由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926组成。
根据术语“由......组成”，在其中ABCA4 CDS的5′端部分和ABCA4 CDS的3′端部分由如上文所述的连续核苷酸的特定序列组成的实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列各自不包含任何额外ABCA4 CDS。
通常，第一AAV载体和第二AAV载体各自包含5′反向末端重复(ITR)和3′反向末端重复(ITR)。
通常，AAV的天然衍生的血清型、分离株或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。ITR序列以顺式起作用，以提供功能性复制起点，并且允许载体整合到细胞的基因组中和从细胞的基因组中切除。认为AAV ITR有助于在AAV感染细胞的细胞核中形成多联体，例如在宿主细胞DNA聚合酶的作用下将单链载体DNA转化为双链DNA之后。此类游离基因多联体的形成可以用于在宿主细胞的生命期间保护载体构建体，从而允许转基因在体内延长表达。
因此，在一个实施方案中，ITR为AAV ITR(即，ITR序列衍生自AAV基因组中发现的ITR序列)。
本发明的AAV载体系统的第一AAV载体和第二AAV载体一起构成功能完善的ABCA4转基因在由两种载体转导后的靶细胞中重新组装所需的所有组件。技术人员将知道通常用于确保在病毒载体转导的细胞中的转基因表达的额外遗传元件。这些元件可以被称为表达控制序列。因此，本发明的AAV病毒载体系统的AAV载体通常包含可操作地连接到编码ABCA4转基因的核苷酸序列的表达控制序列(例如包含启动子序列)。
5′表达控制序列组件合适地位于病毒载体系统的第一(“上游”)AAV载体中，而3′表达控制序列合适地位于病毒载体系统的第二(“下游”)AAV载体中。
因此，第一AAV载体通常包含可操作地连接到ABCA4 CDS的5′端部分的启动子。启动子根据其性质需要位于ABCA4 CDS的5′，因此其位于第一AAV载体中。
可以使用任何合适的启动子，其选择可以容易地由技术人员进行。启动子序列可以是组成型活性的(即在任何宿主细胞背景中是可操作的)，或者可替代地可以仅在特定宿主细胞环境中是有活性的，从而允许转基因在具体细胞类型(例如组织特异性启动子)中靶向表达。启动子可以响应于另一种因子的存在而显示出诱导型表达，所述另一种因子例如为宿主细胞中存在的因子。在任何情况下，当施用载体以用于治疗时，优选的是启动子应在靶细胞背景中具有功能性。
在一些实施方案中，优选的是启动子显示出视网膜细胞特异性表达，以便允许转基因仅在视网膜细胞群体中表达。因此，由启动子表达可以是视网膜细胞特异性表达，例如仅局限于感觉神经性视网膜和视网膜色素上皮的细胞。
适用于本发明的示例性启动子为鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子，任选地与巨细胞病毒(CMV)增强子元件组合。用于本发明的另一种示例性启动子为杂合CBA/CAG启动子，例如用于rAVE表达盒(GeneDetect.com)的启动子。可以使用本文公开的任何启动子。
将诱导视网膜特异性基因表达的基于人序列的启动子的实例包括视杆细胞和视锥细胞的视紫红质激酶、仅视锥细胞的PR2.1和视网膜色素上皮的RPE65。
AAV-GRK1-ABCA4双载体构建体
本发明人已发现使用GRK1启动子可以实现特别有利的基因表达水平。因此，在一个实施方案中，所述启动子为人视紫红质激酶(GRK1)启动子。
本发明的GRK1启动子序列的长度可以是199个核苷酸，并且包含GRK1基因的核苷酸-112至+87。在一个优选的实施方案中，启动子包含核酸序列SEQ ID NO：5或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％或99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
Figure BPA0000305202160000781
第一AAV载体可以包含位于启动子与上游ABCA4核酸序列之间的非翻译区(UTR)(即5′UTR)。
可以使用任何合适的UTR序列，其选择可以容易地由技术人员进行。
UTR可以包含以下元件中的一个或多个：原鸡(Gallus gallus)β肌动蛋白(CBA)内含子1片段、欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)β球蛋白(RBG)内含子2片段和欧洲兔β球蛋白外显子3片段。
UTR可以包含Kozak共有序列。可以使用任何合适的Kozak共有序列，其选择可以容易地由技术人员进行。
在一个优选的实施方案中，UTR包含SEQ ID NO：6中指定的核酸序列或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
SEQ ID NO：6的UTR的长度为186个核苷酸，并且包含在Kozak共有序列之前紧邻的原鸡β肌动蛋白(CBA)内含子1片段(具有预测的剪接供体位点)、欧洲兔β球蛋白(RBG)内含子2片段(包含预测的分支点和剪接受体位点)和欧洲兔β球蛋白外显子3片段。
本发明人已惊奇地发现，如上文所述的UTR，特别是如SEQ ID NO：6中指定的UTR序列或其具有至少90％序列同一性的变体的存在有利地增加来自ABCA4转基因的翻译收率。
Figure BPA0000305202160000791
本发明的AAV载体系统的第二(“下游”)AAV载体可以包含转录后反应元件(也称为转录后调节元件)或PRE。可以使用任何合适的PRE，其选择可以容易地由技术人员进行。合适PRE的存在可以增强ABCA4转基因的表达。
在一个优选的实施方案中，PRE为土拨鼠肝炎病毒PRE(WPRE)。在一个特别优选的实施方案中，WPRE具有如SEQ ID NO：7中指定的序列或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
Figure BPA0000305202160000792
第二AAV载体可以包含位于下游ABCA4核酸序列的3′的聚腺苷酸化序列。可以使用任何合适的聚腺苷酸化序列，其选择可以容易地由技术人员进行。
在一个优选的实施方案中，聚腺苷酸化序列为牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化序列。在一个特别优选的实施方案中，bGH聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO：8中指定的序列或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在本发明的AAV载体系统的一个优选的实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9，并且第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10。
在本发明的AAV载体系统的另一个优选实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：3，并且第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：4。
本发明的AAV载体系统适用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白。
因此，在一个方面，本发明提供一种用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：用如上文所述的第一AAV载体和第二AAV载体转导靶细胞，使得功能性ABCA4蛋白在靶细胞中表达。
人ABCA4蛋白的表达需要用第一AAV载体和第二AAV载体两者转导靶细胞；然而，顺序并不重要。因此，靶细胞可以用第一AAV载体和第二AAV载体以任何顺序(第一AAV载体接着第二AAV载体，或第二AAV载体接着第一AAV载体)或同时地转导。
用于用AAV载体转导靶细胞的方法是本领域已知的，并且是技术人员熟悉的。
靶细胞优选地是眼睛细胞，优选地是视网膜细胞(例如，神经元光感受器细胞、视杆细胞、视锥细胞或视网膜色素上皮细胞)。
本发明还提供如上文定义的第一AAV载体。还提供如上文定义的第二AAV载体。
在另一个方面，本发明提供一种包含含有ABCA4 CDS的5′端部分的核酸序列的AAV载体，其中ABCA4 CDS的5′端部分由对应于SEQ ID NO：1的核苷酸105至3805的连续核苷酸的序列组成。因此，此AAV载体不包含除所述连续核苷酸序列之外的任何额外ABCA4 CDS。
第一AAV载体可以包含5′ITR和3′ITR，优选地AAV ITR；启动子，优选地GRK1启动子；和/或UTR；所述元件如上文关于本发明的AAV载体系统所述。
在一个实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9。
在一个实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一个实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9(条件是在对应于SEQID NO：1的核苷酸1640的位置处的核苷酸为G)或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一个实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：3。
在一个实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：3或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一个实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：3(条件是在对应于SEQID NO：1的核苷酸1640的位置处的核苷酸为G)或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在另一个方面，本发明提供一种AAV载体，其包含含有ABCA4 CDS的3′端部分的核酸序列，其中ABCA4 CDS的3′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926的连续核苷酸的序列组成。因此，此AAV载体不包含除所述连续核苷酸序列之外的任何额外ABCA4 CDS。
第二载体可以包含5′ITR和3′ITR，优选地AAV ITR；PRE，优选地WPRE：和/或聚腺苷酸化序列，优选地bGH聚腺苷酸化序列；所述元件如上文关于本发明的AAV载体系统所述。
在一个实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10。
在一个实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一个实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10(条件是对应于SEQID NO：1的核苷酸5279的位置处的核苷酸为G并且对应于SEQ ID NO：1的核苷酸6173的位置处的核苷酸为T)或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一个实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：4。
在一个实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：4或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一个实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：4(条件是对应于SEQID NO：1的核苷酸5279的位置处的核苷酸为G并且对应于SEQ ID NO：1的核苷酸6173的位置处的核苷酸为T)或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
本发明还提供包含上文所述的核酸序列的核酸。
本发明还提供一种可衍生自如上文所述的AAV载体的AAV载体基因组。
本发明的示例性AAV载体系统包含第一AAV载体和第二AAV载体；其中第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9；并且第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10。
本发明的另一示例性AAV载体系统包含第一AAV载体和第二AAV载体；其中第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体；并且第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在具体实施方案中，本文公开的方法和组合物涉及以下载体中的任一种：CMVCBA.In.GFP.pA载体(SEQ ID NO：17)；CMVCBA.GFP.pA载体(SEQ ID NO：18)；CBA.IntEx.GFP.pA载体(SEQ ID NO：19)；CAG.GFP.pA载体(SEQ ID NO：20)；AAV.5′CMVCBA.In.ABCA4.WPRE.kan载体(SEQ ID NO：21)；AAV.5′CMVCBA.ABCA4.WPRE.kan载体(SEQ ID NO：22)；或AAV.5′CBA.IntEx.ABCA4.WPRE.kan载体(SEQ ID NO：23)。
在具体实施方案中，本文公开的方法和组合物涉及以下序列中的任一个：(i)pAAV.RK.5’ABCA4.kan(SEQ ID NO：26)的ITR至ITR部分，其包含编码5′ITR的序列(SEQ IDNO：27)、编码RK启动子的序列(SEQ ID NO：28)、编码兔β-球蛋白(RBG)内含子/外显子(Int/Ex)的序列(SEQ ID NO：39)、编码ABCA4基因的编码序列的5′部分的序列(SEQ ID NO：29)和编码3′ITR的序列(SEQ ID NO：30)；或(ii)pAAV.3’ABCA4.WPRE.kan的ITR至ITR部分的序列(SEQ ID NO：30)，其包含编码5′ITR的序列(SEQ ID NO：27)、编码ABCA4基因的编码序列的3′部分的序列(SEQ ID NO：31)、编码WPRE的序列(SEQ ID NO：32)、编码bGH polyA的序列和编码3′ITR的序列(SEQ ID NO：33)。
本发明还可以在将SEQ ID NO：2代替SEQ ID NO：1用作参考序列的情况下执行。
在这点上，除以下突变之外，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1相同：核苷酸1640 G＞T、核苷酸5279 G＞A、核苷酸6173 T＞C。这些突变不改变编码的氨基酸序列，并且因此由SEQID NO：2编码的ABCA4蛋白与由SEQ ID NO：1编码的ABCA4蛋白相同。
因此，在本发明的替代性实施方案中，上文提及的SEQ ID NO：1可以用提及的SEQID NO：2替换。另外，本文公开的任何构建体都可以可替代地包含不同的启动子，例如像CMV.CBA启动子、CBA.RBG启动子或CBA.InEx启动子。类似地，任何构建体都可以包含5’ITR和/或3’ITR，所述5’ITR包含SEQ ID NO：6或由其组成，所述3’ITR包含SEQ ID NO：37或由其组成。
序列对应性
如本文所用，术语“对应于”当关于给定核酸序列中的核苷酸使用时通过提及具体SEQ ID NO来定义核苷酸位置。然而，当进行此类提及时，应当理解本发明不限于在所提及的具体SEQ ID NO中列出的确切序列，而包括其变体序列。通过序列比对，例如通过使用序列比对程序，可以容易地确定对应于SEQ ID NO：1中的核苷酸位置的核苷酸，所述序列比对程序的使用是本领域众所周知的。在这方面，技术人员将容易地理解遗传密码的简并性质意味着在不改变编码的多肽的氨基酸序列的情况下编码给定多肽的核酸序列中可能存在变异。因此，预期鉴定在其他ABCA4编码序列中的核苷酸位置(即，技术人员认为对应于例如SEQ ID NO：1中鉴定的位置的位置处的核苷酸)。
例如，除如上文所述的三个特异性突变(这三个突变不改变编码的ABCA4多肽的氨基酸序列)之外，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1相同。在这种情况下，技术人员因此将认为SEQID NO：2中的给定核苷酸位置对应于SEQ ID NO：1中的相同编号的核苷酸位置。
通常，AAV基因组的衍生物将包含至少一个反向末端重复序列(ITR)，优选地多于一个ITR，诸如两个或更多个ITR。这些ITR中的一个或多个可以衍生自具有不同血清型的AAV基因组，或者可以是嵌合或突变ITR。优选的突变ITR是具有trs(末端解析位点)缺失的突变ITR。此缺失允许基因组连续复制，以产生含有编码序列和互补序列两者的单链基因组，即自身互补的AAV基因组。这允许绕过靶细胞中的DNA复制，并且因此能够加速转基因表达。
本公开的AAV载体包括转衣壳化形式，其中具有一种血清型的ITR的AAV基因组或衍生物被包装在不同血清型的衣壳中。本发明的AAV载体还包括嵌合体形式，其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰衣壳蛋白的混合物构成病毒衣壳。AAV载体还可以包括带有吸附到衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如，此类配体可以包括用于靶向具体细胞表面受体的抗体。
因此，例如，本发明的AAV载体包括具有AAV2基因组和AAV2衣壳蛋白的AAV载体(AAV2/2)、具有AAV2基因组和AAV5衣壳蛋白的AAV载体(AAV2/5)和具有AAV2基因组和AAV8衣壳蛋白的AAV载体(AAV2/8)。
本发明的AAV载体可以包含突变AAV衣壳蛋白。在一个实施方案中，本发明的AAV载体包含突变AAV8衣壳蛋白。优选地，突变AAV8衣壳蛋白为AAV8Y 733F衣壳蛋白。
AAV-CBA-ABCA4双载体构建体
本公开提供一种用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白的腺相关病毒(AAV)载体系统，所述AAV载体系统包含含有第一核酸序列的第一AAV载体和含有第二核酸序列的第二AAV载体；其中所述第一核酸序列包含ABCA4编码序列(CDS)的5′端部分，并且所述第二核酸序列包含ABCA4 CDS的3′端部分，并且所述5′端部分和所述3′端部分一起涵盖整个ABCA4 CDS；其中第一核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3597的连续核苷酸的序列；其中第二核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3806至6926的连续核苷酸的序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列各自包含彼此序列重叠区域；并且其中所述序列重叠区域包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的核酸序列的至少约20个连续核苷酸。
AAV载体通常是本领域众所周知的，并且技术人员根据本领域的公知常识熟悉适用于制备AAV载体的一般技术。本领域技术人员的知识包括适用于将目标核酸序列并入AAV载体的基因组的技术。
术语“AAV载体系统”用于包括第一AAV载体和第二AAV载体旨在以互补方式一起起作用的事实。
本公开的AAV载体系统的第一AAV载体和第二AAV载体一起编码整个ABCA4转基因。因此，编码的ABCA4转基因在靶细胞中的表达需要用第一(上游)载体和第二(下游)载体两者转导靶细胞。
本公开的AAV载体系统的AAV载体可以是呈AAV粒子(也称为病毒体)的形式。AAV粒子包含围绕核酸的核心的蛋白外壳(衣壳)，所述核心为AAV基因组。本公开还涵盖编码本文所述的AAV载体系统的AAV载体基因组的核酸序列。
SEQ ID NO：1是对应于NCBI参考序列NM_000350.2的人ABCA4核酸序列。SEQ IDNO：1与NCBI参考序列NM_000350.2相同。ABCA4编码序列跨越SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至6926。
第一AAV载体包含含有ABCA4 CDS的5′端部分的第一核酸序列。ABCA4 CDS的5′端部分是ABCA4 CDS的包含其5′端的部分。因为它仅是CDS的一部分，所以ABCA4 CDS的5′端部分不是全长(即不是整个)ABCA4 CDS。因此，第一核酸序列(并且因此第一AAV载体)不包含全长ABCA4 CDS。
第二AAV载体包含含有ABCA4 CDS的3′端部分的第二核酸序列。ABCA4 CDS的3′端部分是ABCA4 CDS的包含其3′端的部分。因为它仅是CDS的一部分，所以ABCA4 CDS的3′端部分不是全长(即不是整个)ABCA4 CDS。因此，第二核酸序列(并且因此第二AAV载体)不包含全长ABCA4 CDS。
5′端部分和3′端部分一起涵盖整个ABCA4 CDS(具有序列重叠区域，如下文所讨论)。因此，全长ABCA4 CDS包含在本公开的AAV载体系统中，分裂为第一AAV载体和第二AAV载体，并且可以在用第一AAV载体和第二AAV载体转导靶细胞后在靶细胞中重新组装。
如上文所述的第一核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3597的连续核苷酸的序列。ABCA4 CDS在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105处开始。
如上文所述的第二核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3806至6926的连续核苷酸的序列。
为了涵盖整个ABCA4 CDS，第一核酸序列和第二核酸序列各自还包含对应于SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的ABCA4 CDS的至少一部分，使得当第一核酸序列与第二核酸序列比对时，涵盖对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的ABCA4 CDS的整体。因此，当比对时，第一核酸序列和第二核酸序列一起涵盖整个ABCA4CDS。
此外，第一核酸序列和第二核酸序列包含序列重叠区域，从而允许在用本公开的第一AAV载体和第二AAV载体转导的靶细胞内重新构建整个ABCA4 CDS作为全长转基因的一部分。
当第一核酸序列和第二核酸序列彼此比对时，第一核酸序列的3′端的区域与第二核酸序列的5′端的相应区域重叠。因此，第一核酸序列和第二核酸序列两者都包含ABCA4CDS的形成序列重叠区域的一部分。
在一些实施方案中，第一核酸序列与第二核酸序列之间的重叠区域包含ABCA4CDS的对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的部分的至少约20个连续核苷酸。
在一些实施方案中，重叠区域可以在所述20个连续核苷酸的上游和/或下游延伸。因此，重叠区域的长度可以大于20个核苷酸。
重叠区域可以包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598的位置上游的核苷酸。可替代地或另外地，重叠区域可以包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3805的位置下游的核苷酸。
可替代地，核酸序列重叠区域可以包含在ABCA4 CDS的对应于SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的核苷酸3598至3805的部分内。
因此，在一个实施方案中，核酸序列重叠区域的长度在20个核苷酸与550个核苷酸之间；优选地长度在50个核苷酸与250个核苷酸之间；优选地长度在175个核苷酸与225个核苷酸之间；优选地长度在195个核苷酸与215个核苷酸之间。
在一个实施方案中，核酸序列重叠区域包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805的核酸序列的至少约50个连续核苷酸；优选地至少约75个连续核苷酸；优选地至少约100个连续核苷酸；优选地至少约150个连续核苷酸；优选地至少约200个连续核苷酸；优选地全部208个连续核苷酸。
在某些优选的实施方案中，核酸序列重叠区域在对应于SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的核苷酸3598的核苷酸处开始。术语“开始”意指核酸序列重叠区域从对应于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598的核苷酸处开始沿5′到3’方向延伸。因此，在一个优选的实施方案中，核酸序列重叠区域的最边缘5′核苷酸对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598。
在某些优选的实施方案中，在第一核酸序列与第二核酸序列载体之间的核酸序列重叠区域对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至3805。
构建包含如上文所述的核酸序列重叠区域的双AAV载体可以降低不需要的截短ABCA4肽的翻译水平。
当仅从由下游载体衍生的mRNA转录物启动翻译时，截短的ABCA4肽的翻译问题可能在双AAV载体系统中出现。在这点上，诸如AAV2 5′ITR的AAV ITR可以具有启动子活性；这与下游载体中WPRE和bGH聚腺苷酸化序列(如下文所讨论)的存在一起可以导致由未组合的下游载体产生稳定的mRNA转录物。野生型ABCA4 CDS在其下游部分携带多个框内AUG密码子，所述框内AUG密码子不能在不改变氨基酸序列的情况下取代其他密码子。这产生从稳定转录物发生翻译的可能性，导致存在截短的ABCA4肽。
在本公开的某些优选的实施方案中，其中核酸序列重叠区域在对应于SEQ ID NO：1的核苷酸3598的核苷酸处开始，重叠区的起始序列包含在较弱背景下的框内AUG密码子之前在良好背景(关于潜在Kozak共有序列)下的框外AUG(起始)密码子，以便鼓励翻译机构启动未组合的仅下游转录物从框外位点翻译。在本公开的某些特别优选的实施方案中，在框内AUG之前，总共有四个在各种背景下的框外AUG密码子。所有这些都翻译成在10个氨基酸内的终止密码子，从而阻止不需要的截短ABCA4肽的翻译。
在某些优选的实施方案中，第一核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1的核苷酸105至3805的连续核苷酸的序列，并且第二核酸序列包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926的连续核苷酸的序列，因此涵盖如上文所述的核酸序列重叠区域。
因此，在某些优选的实施方案中，ABCA4 CDS的5′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805的连续核苷酸的序列组成，并且ABCA4 CDS的3′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926的连续核苷酸的序列组成。
在某些优选的实施方案中，ABCA4 CDS的5′端部分由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805组成，并且ABCA4 CDS的3′端部分由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926组成。
因此，在某些优选的实施方案中，本公开提供一种用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白的AAV载体系统，所述AAV载体系统包含含有第一核酸序列的第一AAV载体和含有第二核酸序列的第二AAV载体，其中第一核酸序列包含ABCA4编码序列(CDS)的5′端部分，并且第二核酸序列包含ABCA4 CDS的3′端部分，并且5′端部分和3′端部分一起涵盖整个ABCA4 CDS；其中ABCA4 CDS的5′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805的连续核苷酸的序列组成，并且其中ABCA4 CDS的3′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926的连续核苷酸的序列组成。
在某些优选的实施方案中，本公开提供一种用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白的AAV载体系统，所述AAV载体系统包含含有第一核酸序列的第一AAV载体和含有第二核酸序列的第二AAV载体，其中第一核酸序列包含ABCA4编码序列(CDS)的5′端部分，并且第二核酸序列包含ABCA4 CDS的3′端部分，并且5′端部分和3′端部分一起涵盖整个ABCA4 CDS；其中ABCA4 CDS的5′端部分由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸105至3805组成，并且其中ABCA4 CDS的3′端部分由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926组成。
根据术语“由......组成”，在其中ABCA4 CDS的5′端部分和ABCA4 CDS的3′端部分由如上文所述的连续核苷酸的特定序列组成的实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列各自不包含任何额外ABCA4 CDS。
在某些实施方案中，第一AAV载体和第二AAV载体各自包含5′反向末端重复(ITR)和3′反向末端重复(ITR)。
在某些实施方案中，AAV的天然衍生的血清型、分离株或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。ITR序列以顺式起作用，以提供功能性复制起点，并且允许载体整合到细胞的基因组中和从细胞的基因组中切除。认为AAV ITR有助于在AAV感染细胞的细胞核中形成多联体，例如在宿主细胞DNA聚合酶的作用下将单链载体DNA转化为双链DNA之后。此类游离基因多联体的形成可以用于在宿主细胞的生命期间保护载体构建体，从而允许转基因在体内延长表达。
因此，在一些实施方案中，ITR为AAV ITR(即，ITR序列衍生自AAV基因组中发现的ITR序列)。
本公开的AAV载体系统的第一AAV载体和第二AAV载体一起构成功能完善的ABCA4转基因在由两种载体转导后的靶细胞中重新组装所需的所有组件。技术人员知道通常用于确保在病毒载体转导的细胞中的转基因表达的额外遗传元件。这些元件可以被称为表达控制序列。因此，本公开的AAV病毒载体系统的AAV载体可以包含可操作地连接到编码ABCA4转基因的核苷酸序列的表达控制序列(例如包含启动子序列)。
5′表达控制序列组件可以位于病毒载体系统的第一(“上游”)AAV载体中，而3′表达控制序列可以位于病毒载体系统的第二(“下游”)AAV载体中。
因此，在一些实施方案中，第一AAV载体可以包含可操作地连接到ABCA4 CDS的5′端部分的启动子。启动子根据其性质可能需要位于ABCA4 CDS的5′，因此其位于第一AAV载体中。
可以使用任何合适的启动子，其选择可以容易地由技术人员进行。启动子序列可以是组成型活性的(即在任何宿主细胞背景中是可操作的)，或者可替代地可以仅在特定宿主细胞环境中是有活性的，从而允许转基因在具体细胞类型(例如组织特异性启动子)中靶向表达。启动子可以响应于另一种因子的存在而显示出诱导型表达，所述另一种因子例如为宿主细胞中存在的因子。在那些实施方案中，其中施用载体以用于治疗，启动子应在靶细胞背景中具有功能性。
在一些实施方案中，启动子显示出视网膜细胞特异性表达，以便允许转基因仅在视网膜细胞群体中表达。因此，由启动子表达可以是视网膜细胞特异性表达，例如仅局限于感觉神经性视网膜和视网膜色素上皮的细胞。
元件可以包含在本公开的上游载体和下游载体两者中以增加ABCA4蛋白的表达。例如，在载体(诸如本公开的上游载体)中包含内含子可以增加来自所述载体的目标RNA或蛋白质的表达。内含子是基因内的核苷酸序列，其在RNA成熟期间通过RNA剪接而被去除。内含子的长度可以从数十个碱基对到数兆碱基变化。然而，剪接体内含子(即，被真核剪接体剪接的内含子)可以包含在内含子的5′端的剪接供体(SD)位点、在内含子中在3′端附近的分支位点和在3′端的剪接受体(SA)位点。这些内含子元件促进适当的内含子剪接。SD位点可以包含在内含子的5′端的共有GU，并且在内含子的3′端的SA位点可以“AG”终止。在SA位点的上游，内含子通常含有高嘧啶区，其在分支点腺嘌呤核苷酸与SA之间。不希望受任何具体理论的束缚，内含子的存在可以影响RNA转录的速率、核输出或RNA转录物稳定性。此外，内含子的存在也可以增加mRNA翻译的效率，从而产生更多的目标蛋白质(例如ABCA4)。图309和图310描述用于ABCA4双载体的两种示例性内含子(和伴随的外显子)、IntEx和RBGSA/SD。然而，本公开涵盖在本公开的构建体中使用在真核细胞中加强基因表达并促进剪接的任何内含子。
在本公开的载体的一些实施方案中，内含子、IntEx或SA/SD(包括RBD SA/SD)可以是起作用来增加来自载体的蛋白质表达的若干元件中的一种。例如，启动子和任选的增强子不仅可以影响基因表达的细胞或组织特异性，而且可以影响从载体转录的mRNA的水平。启动子为启动RNA转录的DNA区域。根据启动子的特定序列元件，启动子的强度和组织特异性可以不同。增强子是通过影响启动子募集RNA聚合酶并启动转录的能力来调节由启动子的转录的DNA序列。因此，载体中启动子的选择和任选地增强子的包含和/或增强子本身的选择可以显著影响由载体编码的基因的表达。示例性启动子(诸如视紫红质激酶启动子或鸡β肌动蛋白启动子)任选地与CMV增强子组合示出于图310和图311中。在一些实施方案中，本公开的载体包含示例性启动子，诸如视紫红质激酶启动子或鸡β肌动蛋白启动子，同时排除使用增强子元件。在一些实施方案中，本公开的载体包含示例性启动子，诸如鸡β肌动蛋白启动子，同时排除使用增强子元件，诸如CMV增强子元件。在一些实施方案中，本公开的载体包含示例性启动子，诸如视紫红质激酶启动子或鸡β肌动蛋白启动子，同时排除使用增强子元件，并且同时包含内含子、IntEx或SD/SA。在一些实施方案中，本公开的载体包含示例性启动子，诸如鸡β肌动蛋白启动子，同时排除使用增强子元件，诸如CMV增强子元件，并且同时包含内含子、IntEx或SD/SA。
mRNA转录物本身的非编码序列中的元件也可以影响载体中编码的序列的蛋白质水平。不希望受任何具体理论的限制，mRNA非翻译区(UTR)中的序列元件可以影响mRNA稳定性，这进而影响蛋白质翻译的水平。示例性序列元件是转录后调节元件(PRE)(例如土拨鼠肝炎PRE(WPRE))，其增加mRNA稳定性。示例性启动子、增强子、PRE和这些元件在本公开的载体中的排列示出于图307至图316中。
在本公开的第一AAV载体的一些实施方案中，启动子可以与内含子和外显子序列可操作地连接。在本公开的第一AAV载体的一些实施方案中，核酸序列可以包含启动子、内含子和外显子序列。内含子和外显子序列可以在启动子序列的下游。内含子和外显子序列可以定位在启动子序列与上游ABCA4核酸序列(US-ABCA4)之间。内含子和外显子的存在可以增加蛋白质表达的水平。在一些实施方案中，内含子定位在启动子与外显子之间。在一些实施方案中，包括其中内含子定位在启动子与外显子之间的那些实施方案，外显子定位在US-ABCA4序列的5′。在一些实施方案中，启动子包含从脊椎动物基因分离或衍生的启动子。在一些实施方案中，启动子为GRK1启动子或鸡β肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，启动子为CMV.CBA启动子、CBA.RGB启动子或CBA.InEx启动子。
外显子可以包含编码序列、非编码序列或两者的组合。在一些实施方案中，外显子包含非编码序列。在一些实施方案中，外显子从哺乳动物基因分离或衍生。在实施方案中，哺乳动物是兔(欧洲兔)。在一些实施方案中，哺乳动物基因包括兔β球蛋白基因或其一部分。在一些实施方案中，外显子包含与以下核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列或由其组成：CTCCTGGGCAACGTGCTGGT TATTGTGCTG TCTCATCATT TTGGCAAAGA ATT(SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，外显子包含与以下核酸序列具有100％同一性的核酸序列或由其组成：CTCCTGGGCA ACGTGCTGGT TATTGTGCTG TCTCATCATT TTGGCAAAGA ATT(SEQ IDNO：14)。
内含子可以包含剪接供体位点、剪接受体位点或分支点。内含子可以包含剪接供体位点、剪接受体位点和分支点。示例性剪接受体位点包含在内含子的5′端的核苷酸“GT”(前mRNA中的“GU”)。示例性剪接受体位点包含在内含子的3′端的“AG”。在一些实施方案中，分支点包含在内含子的3′端上游的20个核苷酸与40个核苷酸之间(包括端点在内)的腺苷(A)。内含子可以包含人工或非天然存在的序列。可替代地，内含子可以从脊椎动物基因分离或衍生。内含子可以包含编码两个序列的融合体的序列，所述两个序列各自可以从脊椎动物基因分离或衍生。在一些实施方案中，衍生出内含子核酸序列或其一部分的脊椎动物基因包括鸡(原鸡)基因。在一些实施方案中，鸡基因包括鸡β肌动蛋白基因。在一些实施方案中，衍生出内含子核酸序列或其一部分的脊椎动物基因包括兔(欧洲兔)基因。在一些实施方案中，兔基因包括兔β球蛋白基因或其一部分。在一些实施方案中，内含子包含与以下核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000901
在一些实施方案中，内含子包含与以下核酸序列具有100％同一性的核酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000902
在第一(或上游)AAV载体的一些实施方案中，启动子包括杂合启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子与鸡β肌动蛋白(CBA)启动子)。在一些实施方案中，CMV增强子序列包含与以下核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少在其之间的任何百分比的同一性的核酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000911
在一些实施方案中，编码第一(或上游)AAV载体的序列包含编码CBA启动子(不含CMV增强子元件)的序列、编码内含子的序列和编码外显子的序列。在一些实施方案中，CBA启动子序列包含与以下核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少在其之间的任何百分比的同一性的核酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000912
在一些实施方案中，CBA启动子序列包含与以下核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少在其之间的任何百分比的同一性的核酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000913
在一些实施方案中，编码内含子的序列包含核酸序列SEQ ID NO：13或由其组成。在一些实施方案中，编码外显子的序列包含核酸序列SEQ ID NO：14或由其组成。
第一AAV载体可以包含位于启动子与上游ABCA4核酸序列之间的非翻译区(UTR)(即5′UTR)。
可以使用任何合适的UTR序列，其选择可以容易地由技术人员进行。
UTR可以包含以下元件中的一个或多个或由其组成：原鸡β肌动蛋白(CBA)内含子1或其一部分、欧洲兔β球蛋白(RBG)内含子2或其一部分和欧洲兔β球蛋白外显子3或其一部分。
UTR可以包含Kozak共有序列。可以使用任何合适的Kozak共有序列。
在某些优选的实施方案中，UTR包含SEQ ID NO：6中指定的核酸序列、其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体或一部分。
SEQ ID NO：6的UTR的长度为186个核苷酸，并且包含在Kozak共有序列之前紧邻的原鸡β肌动蛋白(CBA)内含子1片段(具有预测的剪接供体位点)、欧洲兔β球蛋白(RBG)内含子2片段(包含预测的分支点和剪接受体位点)和欧洲兔β球蛋白外显子3片段。
如上文所述的UTR，特别是如SEQ ID NO：6中指定的UTR序列或其具有至少90％序列同一性的变体的存在可以增加来自ABCA4转基因的翻译收率。
本公开的AAV载体系统的第二(“下游”)AAV载体可以包含转录后反应元件(也称为转录后调节元件)或PRE。可以使用任何合适的PRE，其选择可以容易地由技术人员进行。在某些实施方案中，合适PRE的存在可以增强ABCA4转基因的表达。
在某些优选的实施方案中，PRE为土拨鼠肝炎病毒PRE(WPRE)。在某些特别优选的实施方案中，WPRE具有如SEQ ID NO：7中指定的序列或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
第二AAV载体可以包含位于下游ABCA4核酸序列的3′的聚腺苷酸化序列。可以使用任何合适的聚腺苷酸化序列，其选择可以容易地由技术人员进行。
在某些优选的实施方案中，聚腺苷酸化序列为牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化序列。在一个特别优选的实施方案中，bGH聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO：8中指定的序列或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。在某些实施方案中，编码聚腺苷酸化序列的序列包含与以下核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少在其之间的任何百分比的同一性的核酸序列或由其组成：
Figure BPA0000305202160000921
在本公开的AAV载体系统的某些优选的实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9，并且第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10。
在本公开的AAV载体系统的某些优选的实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：3，并且第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：4。
本公开的AAV载体系统可以适用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白。
本公开提供一种用于在靶细胞中表达人ABCA4蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：用如上文所述的第一AAV载体和第二AAV载体转导靶细胞，使得功能性ABCA4蛋白在靶细胞中表达。
人ABCA4蛋白的表达需要用第一AAV载体和第二AAV载体两者转导靶细胞。在某些实施方案中，靶细胞可以用第一AAV载体和第二AAV载体以任何顺序(第一AAV载体接着第二AAV载体，或第二AAV载体接着第一AAV载体)或同时地转导。
用于用AAV载体转导靶细胞的方法是本领域已知的，并且是技术人员熟悉的。
靶细胞可以是眼睛细胞，优选地是视网膜细胞(例如，神经元光感受器细胞、视杆细胞、视锥细胞或视网膜色素上皮细胞)。
本公开还提供如上文定义的第一AAV载体。还提供如上文定义的第二AAV载体。
本公开提供一种AAV载体，其包含含有ABCA4 CDS的5′端部分的核酸序列，其中ABCA4 CDS的5′端部分由对应于SEQ ID NO：1的核苷酸105至3805的连续核苷酸的序列组成。在某些实施方案中，此AAV载体不包含除所述连续核苷酸序列之外的任何额外ABCA4CDS。
第一AAV载体可以包含5′ITR和3′ITR，优选地AAV ITR；启动子，例如GRK1启动子；和/或UTR；所述元件如上文关于本公开的AAV载体系统所述。在一些实施方案中，启动子为CMV.CBA启动子、CBA.RGB启动子或CBA.InEx启动子。
在一些实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9。
在一些实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9(条件是在对应于SEQID NO：1的核苷酸1640的位置处的核苷酸为G)或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：3。
在一些实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：3或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：3(条件是在对应于SEQID NO：1的核苷酸1640的位置处的核苷酸为G)或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
本公开提供一种AAV载体，其包含含有ABCA4 CDS的3′端部分的核酸序列，其中ABCA4 CDS的3′端部分由对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸3598至6926的连续核苷酸的序列组成。在一些实施方案中，此AAV载体不包含除所述连续核苷酸序列之外的任何额外ABCA4 CDS。
第二载体可以包含5′ITR和3′ITR，优选地AAV ITR；PRE，优选地WPRE；和/或聚腺苷酸化序列，优选地bGH聚腺苷酸化序列；所述元件如上文关于本公开的AAV载体系统所述。
在一些实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10。
在一些实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10(条件是对应于SEQID NO：1的核苷酸5279的位置处的核苷酸为G并且对应于SEQ ID NO：1的核苷酸6173的位置处的核苷酸为T)或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：4。
在一些实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：4或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、
99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：4(条件是对应于SEQID NO：1的核苷酸5279的位置处的核苷酸为G并且对应于SEQ ID NO：1的核苷酸6173的位置处的核苷酸为T)或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
本公开还提供包含上文所述的核酸序列的核酸。本公开还提供一种可衍生自如上文所述的AAV载体的AAV载体基因组。
还提供一种包含如上文所述的第一AAV载体和第二AAV载体的药盒。AAV载体可以AAV粒子的形式提供于药盒中。
还提供一种如上文所述的药盒，其包含含有第一核酸序列的核酸和含有第二核酸序列的核酸。
本公开还提供一种包含如上文所述的AAV载体系统和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本公开的AAV载体系统、本公开的药盒和本公开的药物组合物可以用于基因疗法。例如，本公开的AAV载体系统、本公开的药盒和本公开的药物组合物可以用于预防或治疗疾病。
在一些实施方案中，本公开的组合物和方法预防或治疗疾病的用途包括将第一AAV载体和第二AAV载体施用到靶细胞，以提供ABCA4蛋白的表达。
在一些实施方案中，待预防或治疗的疾病的特征在于视网膜细胞的退化。此种疾病的一个实例为斯塔加特病。在一些实施方案中，本公开的第一AAV载体和第二AAV载体可以施用到患者的眼，例如眼的视网膜组织，使得表达功能性ABCA4蛋白补偿疾病中存在的一种或多种突变。
本公开的AAV载体可以被配制为药物组合物或药剂。
本公开的示例性AAV载体系统包含第一AAV载体和第二AAV载体；其中第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9；并且第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10。
本公开的另一示例性AAV载体系统包含第一AAV载体和第二AAV载体；其中第一AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：9或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体；并且第二AAV载体包含核酸序列SEQ ID NO：10或其具有至少90％(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，本公开的方法和用途也可以在将SEQ ID NO：2代替SEQ IDNO：1用作参考序列的情况下执行。
在这点上，除以下突变之外，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1相同：核苷酸1640 G＞T、核苷酸5279 G＞A、核苷酸6173 T＞C。这些突变不改变编码的氨基酸序列，并且因此由SEQID NO：2编码的ABCA4蛋白与由SEQ ID NO：1编码的ABCA4蛋白相同。
因此，在本公开的替代性实施方案中，上文提及的SEQ ID NO：1可以用提及的SEQID NO：2替换。
另外，本文公开的任何构建体都可以可替代地包含不同的启动子，例如CMV.CBA启动子、CBA.RBG启动子或CBA.InEx启动子。类似地，任何构建体都可以包含5’ITR和/或3’ITR，所述5’ITR包含SEQ ID NO：6或由其组成，所述3’ITR包含SEQ ID NO：37或由其组成。
序列对应性
如本文所用，术语“对应于”当关于给定核酸序列中的核苷酸使用时通过提及具体SEQ ID NO来定义核苷酸位置。然而，当进行此类提及时，应当理解本公开不限于在所提及的具体SEQ ID NO中列出的确切序列，而包括其变体序列。通过序列比对，例如通过使用序列比对程序，可以容易地确定对应于SEQ ID NO：1中的核苷酸位置的核苷酸，所述序列比对程序的使用是本领域众所周知的。在这方面，技术人员将容易地理解遗传密码的简并性质意味着在不改变编码的多肽的氨基酸序列的情况下编码给定多肽的核酸序列中可能存在变异。因此，预期鉴定在其他ABCA4编码序列中的核苷酸位置(即，技术人员认为对应于例如SEQ ID NO：1中鉴定的位置的位置处的核苷酸)。
例如，除如上文所述的三个特异性突变(这三个突变不改变编码的ABCA4多肽的氨基酸序列)之外，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1相同。在这种情况下，技术人员因此将认为SEQID NO：2中的给定核苷酸位置对应于SEQ ID NO：1中的相同编号的核苷酸位置。
AAV载体
本公开的病毒载体包含腺相关病毒(AAV)载体。本公开的AAV载体可以是成熟AAV粒子或病毒体的形式，即被AAV蛋白衣壳包围的核酸。
AAV载体可以包含AAV基因组或其衍生物。
AAV基因组是多核苷酸序列，在一些实施方案中，其可以编码用于产生AAV粒子的功能。这些功能包括例如在宿主细胞中AAV的复制和包装循环方面起作用的那些功能，包括将AAV基因组衣壳包裹到AAV粒子中。天然存在的AAV是复制缺陷型AAV，并且依赖于反式提供辅助功能以完成复制和包装循环。因此，本公开的载体的AAV基因组可以是复制缺陷型AAV基因组。
AAV基因组可以是呈正义或负义的单链形式，或者可替代地是呈双链形式。在一些实施方案中，使用双链形式允许绕过靶细胞中的DNA复制步骤，并且因此可以加速转基因表达。
在一些实施方案中，本公开的载体的AAV基因组可以是呈单链形式。
AAV基因组可以来自AAV的任何天然衍生的血清型、分离株或进化枝。因此，AAV基因组可以是天然存在的AAV的全基因组。如本领域技术人员所知，自然界中存在的AAV可以根据各种生物系统进行分类。
AAV根据其血清型来提及。血清型对应于AAV的变体亚种，由于其衣壳表面抗原的表达谱，所述变体亚种具有独特的反应性，这可以用于将其与其他变体亚种区分。具有具体AAV血清型的病毒不能有效地与对任何其他AAV血清型具有特异性的中和抗体交叉反应。
AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及最近从灵长类动物脑中鉴定的重组血清型，诸如Rec2和Rec3。这些AAV血清型中的任一种都可以用于本公开中。因此，在本公开的一个实施方案中，本公开的AAV载体可以衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rec2或Rec3AAV。
AAV血清型的综述可见于Choi等人(2005)Curr.Gene Ther.5：299-310和Wu等(2006)Molecular Therapy 14：316-27中。AAV基因组的序列或AAV基因组的包括ITR序列、rep或cap基因的元件的序列可以衍生自以下AAV全基因组序列的以下登录号：腺相关病毒1NC_002077、AF063497；腺相关病毒2 NC_001401；腺相关病毒3 NC_001729；腺相关病毒3BNC_001863；腺相关病毒4 Nc_001829；腺相关病毒5 Y18065、AF085716；腺相关病毒6 NC_001862；鸟AAV ATCC VR-865 AY186198、AY629583、NC_004828；鸟AAV病毒株DA-1 NC_006263、AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。
AAV也可以根据进化枝或克隆来提及。这是指例如天然衍生的AAV的系统发育关系，或是指可以追溯回到共同祖先的AAV的系统发育组，并且包括其所有后代。另外，AAV可以根据具体分离株，即在自然界中发现的特定AAV的遗传分离株来提及。术语遗传分离株描述经历与其他天然存在的AAV的有限遗传混合的AAV群体，从而在遗传水平上定义可识别的不同群体。
技术人员可以基于其公知常识选择用于本公开的AAV的适当血清型、进化枝、克隆或分离株。例如，已经显示AAV5衣壳有效转导灵长类动物视锥细胞光感受器，如由遗传性色觉缺陷的成功矫正所证明(Mancuso等人(2009)Nature 461：784-7)。
AAV血清型可以确定AAV病毒感染(或嗜性)的组织特异性。因此，在一些优选的实施方案中，用于本公开的施用到患者的AAV的AAV血清型是对眼内的靶细胞具有天然嗜性或具有高效感染的那些AAV血清型。在一个实施方案中，用于本公开的AAV血清型是感染感觉神经性视网膜、视网膜色素上皮和/或脉络膜的细胞的那些AAV血清型。
在一些实施方案中，AAV的天然衍生的血清型、分离株或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。ITR序列可以顺式起作用，以提供功能性复制起点，并且允许载体整合到细胞的基因组中和从细胞的基因组中切除。AAV基因组还可以包含编码AAV粒子的包装功能的包装基因，诸如rep基因和/或cap基因。rep基因编码蛋白质Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一种或多种。cap基因编码诸如VP1、VP2和VP3的一种或多种衣壳蛋白或其变体。这些蛋白质可以构成AAV粒子的衣壳。衣壳变体在下文中讨论。
在一些实施方案中，启动子可以可操作地连接到每个包装基因。此类启动子的特定实例包括p5启动子、p19启动子和p40启动子(Laughlin等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：5567-5571)。例如，p5启动子和p19启动子可以用于表达rep基因，而p40启动子可以用于表达cap基因。
在一些实施方案中，本公开的载体中使用的AAV基因组因此可以是天然存在的AAV的全基因组。例如，包含全AAV基因组的载体可以用于在体外制备AAV载体。在一些实施方案中，此类载体原则上可以施用到患者。在一些优选的实施方案中，AAV基因组将是用于施用到患者的目的的衍生物。此类衍生化是本领域已知的，并且本公开涵盖AAV基因组的任何已知衍生物的用途，以及可以通过应用本领域已知的技术产生的衍生物。AAV基因组和AAV衣壳的衍生化在Coura和Nardi(2007)Virology Journal 4：99和Choi等以及Wu等人，上文提及文献中综述。
AAV基因组的衍生物包括AAV基因组的任何截短或修饰形式，其允许转基因在体内从本公开的载体表达。在一些实施方案中，可以截短AAV基因组以包含最小病毒序列但仍保留上述功能。这可能有助于AAV基因组的安全性，例如降低载体与野生型病毒重组的风险，并且还避免由靶细胞中病毒基因蛋白的存在触发细胞免疫反应。
AAV基因组的衍生物可以包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，AAV基因组的衍生物可以包含多于一个ITR，诸如两个或更多个ITR。这些ITR中的一个或多个可以衍生自具有不同血清型的AAV基因组，或者可以是嵌合或突变ITR。示例性突变ITR是具有trs(末端解析位点)缺失的突变ITR。这种缺失允许基因组连续复制，以产生含有编码序列和互补序列两者的单链基因组，即自身互补的AAV基因组。这允许绕过靶细胞中的DNA复制，并且因此能够加速转基因表达。
包含一个或多个ITR可以有助于本公开的载体在宿主细胞的细胞核中形成多联体，例如在宿主细胞DNA聚合酶的作用下将单链载体DNA转化为双链DNA之后。此类游离基因多联体的形成在宿主细胞的生命期间保护载体构建体，从而允许转基因在体内延长表达。
在一些优选的实施方案中，ITR元件将是衍生物中从天然AAV基因组保留的唯一序列。因此，衍生物可能不包含天然基因组的rep基因和/或cap基因以及天然基因组的任何其他序列。这也可以降低将载体整合到宿主细胞基因组中的可能性。另外，减小AAV基因组的大小使得在载体内除转基因之外还并入其他序列元件(诸如调节元件)的灵活性增加。
在本公开的衍生物中可以去除以下部分：一个反向末端重复(ITR)序列、复制(rep)基因和衣壳(cap)基因。然而，在一些实施方案中，衍生物可以另外包含一个或多个rep基因和/或cap基因或者AAV基因组的其他病毒序列。天然存在的AAV以高频率整合在人染色体19上的特定位点，并且显示出可忽略的随机整合频率，使得在治疗环境中可以耐受在载体中保留整合能力。
当衍生物包含衣壳蛋白，即VP1、VP2和/或VP3时，所述衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV的嵌合的、改组的或衣壳修饰的衍生物。本公开涵盖提供来自同一载体(即假型载体)内AAV的不同血清型、进化枝、克隆或分离株的衣壳蛋白序列。
可以选择嵌合的、改组的或衣壳修饰的衍生物以提供病毒载体的一种或多种功能。例如，与诸如AAV2载体的包含天然存在的AAV基因组的AAV载体相比，这些衍生物可以展示基因递送效率提高、免疫原性(体液或细胞)降低、嗜性范围改变和/或对具体细胞类型的靶向性改善。基因递送效率提高可以通过改善细胞表面处的受体或共受体结合、改善内化、改善细胞内运输和进入细胞核的运输、改善病毒粒子的脱壳以及改善单链基因组向双链形式的转化来实现。效率增加还可以涉及嗜性范围或对具体细胞群体的靶向性发生改变，使得在不需要的情况下，载体剂量不通过施用到组织而稀释。
嵌合衣壳蛋白包括通过在天然存在的AAV血清型的两个或更多个衣壳编码序列之间重组产生的那些嵌合衣壳蛋白。这可以例如通过标记拯救方法来执行，其中一种血清型的非感染性衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染，并且使用定向选择来选择具有所需性质的衣壳序列。不同血清型的衣壳序列可以通过在细胞内同源重组而改变，以产生新型嵌合衣壳蛋白。
本公开的嵌合衣壳蛋白还包括通过工程改造衣壳蛋白序列以在两种或更多种衣壳蛋白之间，例如在不同血清型的两种或更多种衣壳蛋白之间转移特异性衣壳蛋白结构域、表面环或特异性氨基酸残基而产生的那些嵌合衣壳蛋白。
改组的或嵌合的衣壳蛋白也可以通过DNA改组或通过易错PCR产生。杂合AAV衣壳基因可以通过使相关AAV基因的序列(例如编码多种不同血清型的衣壳蛋白的那些序列)随机片段化并且然后在自激发聚合酶反应中重新组装片段来产生，这也可以导致序列同源区域中的交叉。可以筛选以这种方式通过改组几种血清型的衣壳基因产生的杂合AAV基因文库，以鉴定具有所需功能的病毒克隆。类似地，易错PCR可以用于使AAV衣壳基因随机突变，以产生变体的多样性文库，然后可以对于所需性质进行选择。
衣壳基因的序列也可以被遗传修饰以引入相对于天然野生型序列的特异性缺失、取代或插入。例如，可以通过在衣壳编码序列的开放阅读框内或在衣壳编码序列的N-末端和/或C-末端插入不相关的蛋白质或肽的序列来修饰衣壳基因。
不相关的蛋白质或肽可以是充当具体细胞类型的配体，从而赋予改善的与靶细胞的结合或改善载体靶向具体细胞群体的特异性的蛋白质或肽。不相关的蛋白质也可以是作为生产过程的一部分辅助病毒粒子的纯化的蛋白质，即表位或亲和标签。可以选择插入位点以便不干扰病毒粒子的其他功能，例如病毒粒子的内化、运输。技术人员可以基于其公知常识来鉴定用于插入的合适位点。具体位点公开在Choi等人，上文提及文献中。
本公开另外涵盖提供与天然AAV基因组的序列不同的顺序和构型的AAV基因组序列。本公开还涵盖用来自另一病毒的序列或用由来自多于一种病毒的序列组成的嵌合基因置换一种或多种AAV序列或基因。此类嵌合基因可以由来自不同病毒种类的两种或更多种相关病毒蛋白的序列组成。
本公开的AAV载体包括转衣壳化形式，其中具有一种血清型的ITR的AAV基因组或衍生物被包装在不同血清型的衣壳中。本公开的AAV载体还包括嵌合体形式，其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰衣壳蛋白的混合物构成病毒衣壳。AAV载体还可以包括带有吸附到衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如，此类配体可以包括用于靶向具体细胞表面受体的抗体。
因此，例如，本公开的AAV载体可以包括具有AAV2基因组和AAV2衣壳蛋白的AAV载体(AAV2/2)、具有AAV2基因组和AAV5衣壳蛋白的AAV载体(AAV2/5)和具有AAV2基因组和AAV8衣壳蛋白的AAV载体(AAV2/8)。
本公开的AAV载体可以包含突变AAV衣壳蛋白。在一个实施方案中，本公开的AAV载体包含突变AAV8衣壳蛋白。在一些实施方案中，突变AAV8衣壳蛋白为AAV8Y733F衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV8 Y733F突变衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：12具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：12的位置733处以苯丙氨酸取代酪氨酸。在一些实施方案中，AAV8 Y733F突变衣壳蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，其中在SEQ ID NO：12的位置733处以苯丙氨酸取代酪氨酸。
AAV RPGR药物产品
在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物包括药物产品。如本文所用，药物产品包含原料药，其被配制成用于施用到受试者以治疗或预防疾病或病症。
本公开的示例性药物产品的组分、其功能和规格列出于表1A中。
表1A：AAV2-构建体药物产品的组成
Figure BPA0000305202160001011
AAV-RPGR剂型
本公开的组合物可以被配制成用于全身或局部施用。
本公开的组合物可以被配制为用于注射或输注的混悬剂。
本公开的组合物可以被配制成用于通过任何途径注射或输注，所述途径包括但不限于玻璃体内注射或输注、视网膜下注射或输注或脉络膜上注射或输注。
在一些实施方案中，本公开的组合物可以被配制成浓度为0.5x10^11DRP/mL与1.0x10^12DRP/mL之间(包括端点在内)。在一些实施方案中，本公开的组合物可以被配制成浓度为约0.5x10^11DRP/ml或0.5x10^11DRP/ml。在一些实施方案中，本公开的组合物可以被配制成浓度为约0.5x10^11DRP/mL。在一些实施方案中，本公开的组合物可以被配制成浓度为约1x10^12DRP/mL。
本公开的组合物可以在施用前使用本公开的稀释剂稀释。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-RPGRORF15药物产品的制剂缓冲液相同。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-构建体药物产品的制剂缓冲液不同。
本公开的组合物(包括表1A中描述的AAV-RPGRORF15构建体药物产品)可以被配制为含有在0.5x10^11DRP/mL与1.0x10^13DRP/mL之间(包括端点在内)的AAV粒子的注射用混悬剂。本公开的组合物(包括表1A中描述的AAV-RPGRORF15构建体药物产品)可以被配制为含有在2.5x10^12DRP/mL与5x10^12DRP/mL DRP/mL之间的AAV粒子的注射用混悬剂。在一些实施方案中，表1A中描述的AAV-RPGRORF15药物产品可以被配制为含有0.5x10^11DRP/mL、2.5x10^12DRP/mL、0.5x10^12DRP/mL、5x10^12DRP/mL或1.0x10^13DRP/mL的AAV粒子的注射用混悬剂。如果方案需要，则可以在施用前在诊所中(即，由医学专业人员)使用本公开的稀释剂稀释AAV-RPGRORF15药物产品。在一些实施方案中，此稀释剂是用于制备AAV-RPGRORF15药物产品的相同制剂缓冲液。
本公开的组合物可以包含完整AAV粒子和空AAV粒子。在一些实施方案中，完整AAV粒子包含编码本公开的AAV-RPGRORF15构建体的单链DNA。普通技术人员可以通过例如透射电子显微镜分析、qPCR或ddPCR来确定AAV粒子是完整粒子还是空粒子。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、65％、至少67％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少76％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的完整AAV粒子。在一些实施方案中，组合物包含至少70％的完整AAV粒子。
本公开的组合物可以在施用前使用本公开的稀释剂稀释。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-RPGRORF15药物产品的制剂缓冲液相同。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-RPGRORF15药物产品的制剂缓冲液不同。
本公开的组合物(包括表1A中描述的AAV-RPGRORF15药物产品)可以被配制为含有在0.5x10^11DRP/mL与1.0x10^12DRP/mL之间(包括端点在内)的注射用混悬剂。在一些实施方案中，本公开的组合物(包括表1A中描述的AAV-RPGRORF15药物产品)可以被配制为含有1.0x10^12DRP/mL至5x10^12DRP/mL，例如2.5x10^12DRP/mL或5x10^12DRP/mL的注射用混悬剂。在一些实施方案中，本公开的组合物(包括表1A中描述的AAV-RPGRORF15药物产品)可以被配制为含有0.5x10^11DRP/mL、2.5x10^12DRP/mL、5x10^12DRP/mL或1.0x10^12DRP/mL的注射用混悬剂。如果方案需要，则可以在施用前在诊所中(即，由医学专业人员)使用本公开的稀释剂稀释AAV-RPGRORF15药物产品。在一些实施方案中，此稀释剂是用于制备AAV-RPGRORF15药物产品的相同制剂缓冲液。
AAV ABCA4药物产品
在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物包括药物产品。如本文所用，药物产品包含原料药，其被配制成用于施用到受试者以治疗或预防疾病或病症。
本公开的说明性药物产品的组分、其功能和规格列出于表1B中。
表1B：AAV2-构建体药物产品的组成
Figure BPA0000305202160001031
AAV-ABCA4剂型
本公开的组合物可以被配制成用于全身或局部施用。
本公开的组合物可以被配制为用于注射或输注的混悬剂。
本公开的组合物可以被配制成用于通过任何途径注射或输注，所述途径包括但不限于玻璃体内注射或输注、视网膜下注射或输注或脉络膜上注射或输注。
本公开的组合物可以被配制成对于上游载体和/或下游载体而言浓度分别为在0.5x10^11DRP/mL与1.0x10^12DRP/mL之间(包括端点在内)。
本公开的组合物可以在施用前使用本公开的稀释剂稀释。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-ABCA4药物产品的制剂缓冲液相同。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-构建体药物产品的制剂缓冲液不同。
本公开的组合物(包括表1B中描述的AAV-ABCA4构建体药物产品)可以被配制为含有对于上游载体和/或下游载体而言分别在0.5x10^11DRP/mL与1.0x10^13DRP/mL之间的AAV粒子(包括端点在内)的注射用混悬剂。如果方案需要，则可以在施用前在诊所中(即，由医学专业人员)使用本公开的稀释剂稀释AAV-ABCA4药物产品。在一些实施方案中，此稀释剂是用于制备AAV-ABCA4药物产品的相同制剂缓冲液。
本公开的组合物可以包含完整AAV粒子和空AAV粒子。在一些实施方案中，完整AAV粒子包含编码本公开的AAV-ABCA4构建体的单链DNA。普通技术人员可以通过例如透射电子显微镜分析、qPCR或ddPCR来确定AAV粒子是完整粒子还是空粒子。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、65％、至少67％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少76％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的完整AAV粒子。在一些实施方案中，组合物包含至少70％的完整AAV粒子。
本公开的组合物可以在施用前使用本公开的稀释剂稀释。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-ABCA4药物产品的制剂缓冲液相同。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-ABCA4药物产品的制剂缓冲液不同。
本公开的组合物(包括表1B中描述的AAV-ABCA4药物产品)可以被配制为含有对于上游载体和/或下游载体而言分别在0.5x10^11DRP/mL与1.0x10^12DRP/mL之间(包括端点在内)的注射用混悬剂。如果方案需要，则可以在施用前在诊所中(即，由医学专业人员)使用本公开的稀释剂稀释AAV-ABCA4药物产品。在一些实施方案中，此稀释剂是用于制备AAV-ABCA4药物产品的相同制剂缓冲液。
AAV-RPGR药物制制
本公开的组合物可以包含原料药。在一些实施方案中，原料药包含AAV-RPGRORF15或由其组成。在一些实施方案中，原料药包含AAV-RPGRORF15和制剂缓冲液或由其组成。在一些实施方案中，制剂缓冲液在pH 8下包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl。在一些实施方案中，制剂缓冲液在pH 8下包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl以及0.001％的泊洛沙姆188。
赋形剂
本公开的组合物可以包含药物产品。在一些实施方案中，药物产品包含原料药和制剂缓冲液或由其组成。在一些实施方案中，药物产品包含稀释于制剂缓冲液中的原料药或由其组成。在一些实施方案中，药物产品包含在制剂缓冲液中稀释至最终药物产品AAV8-RPGRORF15载体基因组(vg)浓度的AAV-RPGRORF15原料药或由组成。
眼用制剂
本公开的组合物可以被配制成包含在用于眼部注射或输注的最佳浓度下的AAV-RPGRORF15原料药，基本上由其组成或由组成。
本公开的组合物可以包含一种或多种增加或增强本公开的AAV的稳定性的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的组合物可以包含一种或多种确保或增强本公开的AAV的稳定性的缓冲剂。可替代地或另外地，本公开的组合物可以包含一种或多种防止、减少或最小化AAV粒子聚集的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的组合物可以包含一种或多种防止、减少或最小化AAV粒子聚集的缓冲液。
本公开的组合物可以包含一种或多种诱导或维持中性或微碱性pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持在7与9之间的中性或微碱性pH(包括端点在内)的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持约8的pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持在7.5与8.5之间的pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持在7.7与8.3之间的pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持在7.9与8.1之间的pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持8的pH的组分。
在本公开的组合物与细胞接触后，AAV-构建体表达基因或其一部分，从而导致产生由所述基因或其一部分编码的产物。在一些实施方案中，细胞是靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞是视网膜细胞。在一些实施方案中，视网膜细胞是神经元。在一些实施方案中，神经元是光感受器。在一些实施方案中，细胞是体内、体外、离体或原位细胞。在一些实施方案中，包括其中细胞是体内细胞的那些实施方案，接触在将组合物施用到受试者之后发生。在一些实施方案中，AAV-构建体表达基因或其一部分，导致产生以基因产物的治疗有效表达水平由所述基因或其一部分编码的产物。在一些实施方案中，基因产物是蛋白质。
视网膜下批次制剂
本公开的组合物可以每批次1个至1000个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或药物产品可以每批50个至500个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或药物产品可以每批100个至250个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。
本公开的示例性批次可以包含在0.01mL与100mL之间(包括端点在内)的本公开的组合物、原料药或药物产品。
表2A：用于AAV-RPGRORF15药物产品的小瓶的示例性批次制剂
Figure BPA0000305202160001051
Figure BPA0000305202160001061
在本公开的用于制备药物产品的方法的一些实施方案中，将原料药在+35±2℃下解冻，并根据需要在无菌制剂缓冲液中稀释至目标浓度(例如，0.5x10^12DRP/mL、5x10^12DRP/mL或1.0x10^13DRP/mL)。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-RPGRORF15药物产品的目标最终DRP滴度为1x10^13DRP/mL，最小可接受滴度和最大可接受滴度分别为1.0x10^12DRP/mL和3.0x10^13DRP/mL。在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-RPGRORF15药物产品的目标最终DRP滴度为5x10^12DRP/mL。在一些实施方案中，将AAV-RPGRORF15药物产品无菌过滤并填充到0.5ml聚丙烯管或0.5mL Crystal
Figure BPA0000305202160001062
(环烯烃聚合物)小瓶中，以便在至多10X稀释后或在不稀释的情况下施用。
然后将小瓶冷冻并储存在≤-60℃下。为了在QP发布并发放到现场前进行标记和储存，将药物产品转移到合格的临床发放者。将药物产品在温度监测的冰箱中储存在≤-60℃下，直到QP发布和发放。
可以将AAV-RPGRORF15药物产品预填充到用于视网膜下递送的微递送装置中。适用于视网膜下递送的微递送装置可以包括微针，并且AAV-RPGRORF15药物产品还可以被配制成用于在微递送装置中预填充储存、室温储存或预填充冷储存。
脉络膜上批次制剂
本公开的组合物可以每批次1个至1000个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或药物产品可以每批50个至500个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或药物产品可以每批100个至250个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。
本公开的示例性批次可以包含在0.01mL与500mL之间(包括端点在内)的本公开的组合物、原料药或药物产品。
表3A：用于AAV-RPGRORF15药物产品的小瓶的示例性批次制剂
组分 量 参考标准
AAV-构建体 5x10^12DRP 内部、GMP
Tris，pH 8.0 20mM EP、BP、USP、JPC
MgCl<sub>2</sub>(无水) 1mM EP、BP、USP、JPC、FCC
NaCl 200mM EP、BP、USP、JP
泊洛沙姆188 0.001％ EP、USP
注射用水 适量至125mL EP、USP
在本公开的用于制备药物产品的方法的一些实施方案中，将原料药在+35±2℃下解冻，并根据需要在无菌制剂缓冲液中稀释至目标浓度(例如，0.5x10^12DRP/mL、5x10^12DRP/mL或1.0x10^13DRP/mL)。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-RPGRORF15药物产品的目标最终DRP滴度为1x10^13DRP/mL，最小可接受滴度和最大可接受滴度分别为1.0x10^12DRP/mL和3.0x10^13DRP/mL。在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-RPGRORF15药物产品的目标最终DRP滴度为5x10^12DRP/mL。在一些实施方案中，将AAV-RPGRORF15药物产品无菌过滤并填充到0.5ml聚丙烯管或0.5mL Crystal
Figure BPA0000305202160001071
(环烯烃聚合物)小瓶中，以便在至多10X稀释后或在不稀释的情况下施用。
然后将小瓶冷冻并储存在≤-60℃下。为了在QP发布并发放到现场前进行标记和储存，将药物产品转移到合格的临床发放者。将药物产品在温度监测的冰箱中储存在≤-60℃下，直到QP发布和发放。
可以将AAV-RPGRORF15药物产品预填充到用于脉络膜上递送的微递送装置中。适用于脉络膜上递送的微递送装置可以包括微导管，并且AAV-RPGRORF15药物产品还可以被配制成用于在微递送装置中预填充储存、室温储存或预填充冷储存。
AAV-ABCA4药物制剂
本公开的组合物可以包含原料药。在一些实施方案中，原料药包含AAV-ABCA4或由其组成。在一些实施方案中，原料药包含AAV-ABCA4和制剂缓冲液或由其组成。在一些实施方案中，制剂缓冲液在pH 8下包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl。在一些实施方案中，制剂缓冲液在pH 8下包含20mM Tris、1mM MgCl2和200mM NaCl以及0.001％的泊洛沙姆188。
赋形剂
本公开的组合物可以包含药物产品。在一些实施方案中，药物产品包含原料药和制剂缓冲液或由其组成。在一些实施方案中，药物产品包含稀释于制剂缓冲液中的原料药或由其组成。在一些实施方案中，药物产品包含在制剂缓冲液中稀释至最终药物产品AAV-ABCA4载体基因组(vg)浓度的AAV8-ABCA4原料药或由组成。
眼用制剂
本公开的组合物可以被配制成包含在用于眼部注射或输注的最佳浓度下的AAV-ABCA4原料药，基本上由其组成或由组成。
本公开的组合物可以包含一种或多种增加或增强本公开的AAV的稳定性的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的组合物可以包含一种或多种确保或增强本公开的AAV的稳定性的缓冲剂。可替代地或另外地，本公开的组合物可以包含一种或多种防止、减少或最小化AAV粒子聚集的缓冲液。在一些实施方案中，本公开的组合物可以包含一种或多种防止、减少或最小化AAV粒子聚集的缓冲液。
本公开的组合物可以包含一种或多种诱导或维持中性或微碱性pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持在7与9之间的中性或微碱性pH(包括端点在内)的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持约8的pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持在7.5与8.5之间的pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持在7.7与8.3之间的pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持在7.9与8.1之间的pH的组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种诱导或维持8的pH的组分。
在本公开的组合物与细胞接触后，AAV-构建体表达基因或其一部分，从而导致产生由所述基因或其一部分编码的产物。在一些实施方案中，细胞是靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞是视网膜细胞。在一些实施方案中，视网膜细胞是神经元。在一些实施方案中，神经元是光感受器。在一些实施方案中，细胞是体内、体外、离体或原位细胞。在一些实施方案中，包括其中细胞是体内细胞的那些实施方案，接触在将组合物施用到受试者之后发生。在一些实施方案中，AAV-构建体表达基因或其一部分，导致产生以基因产物的治疗有效表达水平由所述基因或其一部分编码的产物。在一些实施方案中，基因产物是蛋白质。
视网膜下批次制剂
本公开的组合物可以每批次1个至1000个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或药物产品可以每批50个至500个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或药物产品可以每批100个至250个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。
本公开的示例性批次可以包含在0.01mL与100mL之间(包括端点在内)的本公开的组合物、原料药或药物产品。
表2B：用于AAV-ABCA4药物产品的小瓶的示例性批次制剂
Figure BPA0000305202160001081
Figure BPA0000305202160001091
在本公开的用于制备药物产品的方法的一些实施方案中，将原料药在+35±2℃下解冻，并根据需要在无菌制剂缓冲液中稀释至目标浓度(例如，0.5x10^12DRP/mL、5x10^12DRP/mL或1.0x10^13DRP/mL)。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-ABCA4药物产品的目标最终DRP滴度为1x10^13DRP/mL，最小可接受滴度和最大可接受滴度分别为1.0x10^12DRP/mL和3.0x10^13DRP/mL。在一些实施方案中，将AAV-ABCA4药物产品无菌过滤并填充到0.5ml聚丙烯管或0.5mL Crystal
Figure BPA0000305202160001092
(环烯烃聚合物)小瓶中，以便在至多10X稀释后或在不稀释的情况下施用。
然后将小瓶冷冻并储存在≤-60℃下。为了在QP发布并发放到现场前进行标记和储存，将药物产品转移到合格的临床发放者。将药物产品在温度监测的冰箱中储存在≤-60℃下，直到QP发布和发放。
可以将AAV-ABCA4药物产品预填充到用于视网膜下递送的微递送装置中。适用于视网膜下递送的微递送装置可以包括微针，并且AAV-ABCA4药物产品还可以被配制成用于在微递送装置中预填充储存、室温储存或预填充冷储存。
脉络膜上批次制剂
本公开的组合物可以每批次1个至1000个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或药物产品可以每批50个至500个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物、原料药或药物产品可以每批100个至250个小瓶之间(包括端点在内)的规模制造。
本公开的示例性批次可以包含在0.01mL与500mL之间(包括端点在内)的本公开的组合物、原料药或药物产品。
表3B：用于AAV-ABCA4药物产品的小瓶的示例性批次制剂
组分 量 参考标准
AAV-构建体 内部、GMP
Tris，pH 8.0 20mM EP、BP、USP、JPC
MgCl<sub>2</sub>(无水) 1mM EP、BP、USP、JPC、FCC
NaCl 200mM EP、BP、USP、JP
泊洛沙姆188 0.001％ EP、USP
注射用水 适量至125mL EP、USP
在本公开的用于制备药物产品的方法的一些实施方案中，将原料药在+35±2℃下解冻，并根据需要在无菌制剂缓冲液中稀释至目标浓度(例如，0.5x10^12DRP/mL、5x10^12DRP/mL或1.0x10^13DRP/mL)。
在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV-ABCA4药物产品的目标最终DRP滴度为1x10^13DRP/mL，最小可接受滴度和最大可接受滴度分别为1.0x10^12DRP/mL和3.0x10^13DRP/mL。在一些实施方案中，将AAV-ABCA4药物产品无菌过滤并填充到0.5ml聚丙烯管或0.5mL Crystal
Figure BPA0000305202160001101
(环烯烃聚合物)小瓶中，以便在至多10X稀释后或在不稀释的情况下施用。
然后将小瓶冷冻并储存在≤-60℃下。为了在QP发布并发放到现场前进行标记和储存，将药物产品转移到合格的临床发放者。将药物产品在温度监测的冰箱中储存在≤-60℃下，直到QP发布和发放。
可以将AAV-ABCA4药物产品预填充到用于脉络膜上递送的微递送装置中。适用于脉络膜上递送的微递送装置可以包括微导管，并且AAV-ABCA4药物产品还可以被配制成用于在微递送装置中预填充储存、室温储存或预填充冷储存。
组合物的储存
在本公开的组合物的一些实施方案中，包括其中组合物包含药物产品并且组合物在无菌小瓶中供应的那些实施方案，组合物可以储存在零(℃)以下。在一些实施方案中，组合物可以在不损失药物产品的功效或无菌包装的完整性的情况下解冻和冷冻。在一些实施方案中，组合物可以经历多轮解冻和冷冻，而不损失药物产品的功效或无菌包装的完整性。
在本公开的组合物的一些实施方案中，包括其中组合物包含药物产品并且组合物在无菌小瓶中供应的那些实施方案，组合物可以储存在室温下。
有机材料
用于制备本公开的缓冲液和介质的起始材料被认证为不含动物来源的材料。
过滤器和色谱基质
用于过滤原料药和药物产品的过滤器的非限制性实例为Sartopore 0.45μm和0.2μm过滤器。过滤器在购买时不是无菌的，并且在合同制造商处通过高压灭菌在内部进行灭菌。在一些实施方案中，过滤器通过在阈值压力(例如3.2巴)下进行泡点测试来进行完整性测试。
所有色谱材料在使用前都在分析证书上发布。柱以预充填形式购买，并在使用前消毒。
制造AAV-构建体药物产品的方法
细胞构造
包括10次传代的示例性传代方案示出于图1中。简言之，将起始HEK293细胞在T25培养瓶和生长培养基(培养基汇总在表7中)中培养五天。五天后，将HEK293细胞转移到T175培养瓶中，再培养四天，并且将其分到四个T175瓶中。将细胞再培养三天，然后转移到两个CF-1细胞工厂(Cell Factory)(例如NuncTM牌细胞工厂)中。将细胞再培养四天，转移到两个CF-1细胞工厂，再培养三天，转移到两个CF-1细胞工厂，再培养四天，并且转移到两个CF-2细胞工厂。将细胞再培养两天并分到两个CF-10细胞工厂中，再培养四天并且分到六个CF-10细胞工厂中，再培养三天，并且转移到二十个HYPERstack中，所述HYPERstack是36-层粘附细胞培养容器。在转染前，将细胞在HYPERstack中再培养三天。
T25培养瓶至T175培养瓶：丢弃培养基，并且用预热的PBS洗涤细胞。用TrypLE细胞解离试剂使细胞松弛。将T-培养瓶或细胞叠层(Cell Stack)在设定为37±1℃的孵育器中孵育5至10分钟，并通过轻轻敲击容器来完全移出细胞。添加生长培养基以抑制TrypLE。用于不同支撑物的生长培养基、PBS和TrypLE的体积呈现在表6中。然后合并所有细胞悬浮液。
测定细胞计数和细胞活力，并且根据表4对细胞进行接种、孵育和传代。
表4：用于传代的过程参数
Figure BPA0000305202160001111
本公开的细胞构造过程可以根据待使用的HYPERstack的数量而按比例放大或缩小。使用HYPERstack提供细胞培养的优异的可缩放性和效率。
转染
可以根据所用细胞类型等因素，调节以下温度、持续时间、旋转速度和体积以获得最佳结果。对于下文描述的示例性实施方案，优化条件以用于使用HEK293细胞。可以优化这些方法以用于较大规模生产。
用于制造本公开的AAV构建体的示例性转染过程包括以下步骤或由其组成。将质粒DNA(例如，编码包含RPGRORF15或ABCA4序列的AAV构建体的质粒、编码Ad5辅助功能的质粒和编码AAV8rep和cap基因的质粒)和转染组合物(例如，包含聚合物或PEI)单独地稀释成转染溶液以分别产生DNA转染组合物和稀释的转染组合物。将稀释的转染组合物添加到DNA转染组合物中，并且在室温下孵育以产生可转染DNA组合物。将所得的可转染DNA组合物添加到转染培养基中。从HYPERstack中去除生长培养基，并且将包含可转染DNA组合物的转染培养基添加到空的HYPERstack中。将HYPERstack在37℃、5％CO2下孵育至少12、16、20、24、28、32、36、40、44或48小时。
用于制造本公开的AAV构建体的示例性转染过程的概要示出于图10中。将质粒DNA(例如，编码包含RPGRORF15或ABCA4序列的AAV构建体的质粒和编码AAV8 rep和cap基因的质粒)和聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂
Figure BPA0000305202160001123
(Polyplus Transfection)单独地稀释成转染溶液。将
Figure BPA0000305202160001124
溶液逐滴添加到DNA溶液中，并且在室温下孵育10分钟。将所得的
Figure BPA0000305202160001125
溶液添加到转染培养基中。从HYPERstack中去除生长培养基，并且将包含
Figure BPA0000305202160001126
溶液的转染培养基添加到空的HYPERstack中。将HYPERstack在37℃，5％CO2下孵育24小时。
表5：转导条件
Figure BPA0000305202160001121
将质粒和PEI用转染培养基制备(表5)。
在某些实施方案中，质粒DNA的量呈现在表6中。
表6：质粒DNA的量
Figure BPA0000305202160001122
Figure BPA0000305202160001131
在具体实施方案中，
Figure BPA0000305202160001132
比率(mL∶mg)分别为约0.5∶1至约5∶1或约1∶1至约5∶1，任选地约2∶1至约4∶1、约4∶1、约3∶1或约2∶1。在某些实施方案中，使用PEI进行转染，其中包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以1∶1∶1的摩尔比提供。在某些实施方案中，转染使用PEI以分别约0.5∶1至5∶1或约1∶1至约5∶1，任选地约2∶1至约4∶1、约4∶1、约3∶1或约2∶1的PEI∶DNA比率(mL∶mg)进行，其中包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体以约0.5∶1∶1至约10∶1∶1、约1∶1∶1至约10∶1∶1、约2∶1∶1至约10∶1∶1，任选地约0.5∶1∶1、约1∶1∶1、约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1、约9∶1∶1或约10∶1∶1的摩尔比提供。在某些实施方案中，转染使用PEI(例如PEI
Figure BPA0000305202160001134
)以分别约1∶1至约5∶1，任选地约2∶1至约4∶1、约4∶1、约3∶1或约2∶1的PEI∶DNA(mL∶mg)比率进行，其中包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约1∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以3∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以10∶1∶1的摩尔比提供。在一些实施方案中，包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体分别以约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1或约9∶1∶1的摩尔比提供。
在转染后，从HYPERstack中去除转染培养基，并且添加收获培养基。将细胞在收获培养基中在37℃、5％CO2下孵育72小时。将病毒释放溶液以1∶20的体积比添加到HYPERstack中，并且将细胞在37℃、5％CO2下孵育18小时。
用于培养细胞、转染细胞并释放AAV病毒粒子的不同类型的培养基和溶液的示例性制剂公开于表7中。
表7.培养基和溶液
Figure BPA0000305202160001133
Figure BPA0000305202160001141
收获
在与病毒释放溶液一起孵育后，从HYPERstack中去除含有从转染的HEK293细胞中释放的AAV病毒粒子的收获培养基。在一些实施方案中，从收获培养基纯化AAV病毒粒子。
下游加工
示例性下游加工步骤的概要示出于图21中，并且在所附实施例中描述。简言之，在收集包含多个AAV粒子的收获培养基后，通过疏水作用色谱法(HIC)纯化多个AAV粒子，以产生包含多个AAV粒子的HIC洗脱液。稀释HIC洗脱液，并且通过阳离子交换色谱法(CEX)进一步纯化多个AAV粒子，以产生包含多个rAAV粒子的CEX洗脱液。通过阴离子交换(AEX)色谱法纯化来自CEX的多个rAAV粒子，以富集完整rAAV粒子。最后，通过切向流过滤(TFF)将包含多个纯化且富集的rAAV粒子的AEX洗脱液渗滤并浓缩到制剂缓冲液中，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子和制剂缓冲液的最终组合物。在一些实施方案中，将泊洛沙姆188添加到制剂缓冲液中，并且将原料药在＜-60℃下冷冻。在一些实施方案中，TFF步骤包括单个TFF程序。在一些实施方案中，TFF步骤包括两个或更多个连续的TFF程序。
疏水作用色谱法
疏水作用色谱法(HIC)基于病毒衣壳蛋白与色谱柱的基质通过疏水相互作用的结合而捕获rAAV病毒粒子。在一些实施方案中，使用高盐浓度来促进疏水性表面的簇聚。
本公开的制造过程的示例性疏水作用色谱法(HIC)步骤的过程概要示出于图27中。
在一些实施方案中，HIC步骤包括以下步骤：(i)稀释包含多个释放的rAAV粒子的收获培养基；(ii)将稀释的收获培养基装载到HIC柱上；(iii)生成HIC色谱图；和(iv)在HIC色谱图上选择含有rAAV粒子的峰，以产生包含多个rAAV病毒粒子的HIC洗脱液。在一些实施方案中，HIC柱中使用的色谱基质为疏水作用(OH)基质。在一些实施方案中，HIC柱为800mL整料。在一些实施方案中，将收获培养基稀释到高盐缓冲液中。在一些实施方案中，分步梯度以洗脱rAAV粒子。在一些实施方案中，等度洗脱以洗脱rAAV粒子。说明性缓冲条件例如提供在图212和图336中。
在一些实施方案中，在额外纯化前，即在阳离子交换色谱法(CEX)之前，稀释并过滤HIC洗脱液。选择合适的过滤器以使过滤期间rAAV粒子的损失最小化。在一些实施方案中，HIC洗脱液使用0.8/0.45μM聚醚砜(PES)过滤器来过滤。
阳离子交换色谱法
在本公开的方法的一些实施方案中，阳离子交换色谱法(CEX)可以用于进一步纯化由HIC步骤产生的HIC洗脱液中的多个rAAV粒子。CEX是一种类型的离子交换色谱法，其基于分子的表面净电荷来分离分子。在一些实施方案中，CEX使用对带正电荷的分子具有亲和力的带负电荷的离子交换树脂。当pH低于AAV粒子的等电点(pI)时，AAV病毒粒子带有正电荷，并且可以通过CEX纯化。
本公开的制造过程的示例性阳离子交换色谱法(CEX)步骤的过程概要示出于图68中。
在本公开的方法的一些实施方案中，CEX步骤包括以下步骤：(i)稀释来自HIC步骤的包含多个rAAV病毒粒子的HIC洗脱液，并且任选地过滤HIC洗脱液；(ii)将稀释的HIC洗脱液装载到CEX柱上；(iii)生成CEX色谱图；和(iv)从CEX色谱图中选择含有rAAV粒子的级分，以产生包含多个rAAV病毒粒子的CEX洗脱液。在一些实施方案中，CEX色谱法在色谱柱中包含SO3-阳离子交换基质。在一些实施方案中，色谱柱为80mL整料。在一些实施方案中，在CEX步骤前，将HIC洗脱液稀释到低盐缓冲液中。在一些实施方案中，将稀释的HIC洗脱液调节到pH 3.0-4.0。在一些实施方案中，将稀释的HIC洗脱液调节到pH 3.6+/-0.1。在一些实施方案中，这使pH低于rAAV病毒粒子的pI，从而产生带正电荷的rAAV病毒粒子。在一些实施方案中，使用分步梯度来洗脱rAAV粒子。在一些实施方案中，所述方法还包括中和CEX洗脱液的pH。说明性缓冲条件例如提供在图213和图336中。
阴离子交换色谱法
在本公开的方法的一些实施方案中，阴离子交换色谱法(AEX)可以用于富集多个rAAV粒子以获得完整rAAV粒子。完整rAAV粒子是包含含有本公开的AAV-构建体的单链DNA的AAV粒子。在一些实施方案中，完整rAAV粒子包含编码5′ITR的序列、编码GRK1启动子的序列、编码RPGRORF15的序列、编码BGH polyA信号的序列和编码3′ITR的序列。在一些实施方案中，完整rAAV粒子包含编码5′ITR的序列、编码ABCA4或其一部分的序列和编码3′ITR的序列。
AEX是一种类型的离子交换色谱法，其基于表面净电荷来分离分子。完整AAV病毒粒子、空AAV病毒粒子和受损AAV病毒粒子和/或聚集的AAV病毒粒子具有不同的等电点(pI)。在一些实施方案中，完整粒子和空粒子基于粒子的不同电荷来分离。由于存在DNA基因组，完整粒子的负电荷稍微多于空粒子。在一些实施方案中，将rAAV粒子稀释成pH高于AAV粒子的pI的溶液。在一些实施方案中，通过从溶液中去除MgCl2来进一步增强分离。
本公开的制造过程的示例性阴离子交换色谱法(AEX)步骤的过程概要示出于图101中。
在本公开的方法的一些实施方案中，AEX色谱步骤包括以下步骤：(i)稀释包含多个rAAV病毒粒子的CEX洗脱液；(ii)将稀释的CEX洗脱液装载在AEX柱上；(iii)生成AEX色谱图；和(iv)从AEX色谱图中选择含有完整rAAV粒子的级分，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的AEX洗脱液。在一些实施方案中，AEX色谱法在色谱柱中包含阴离子交换(QA)基质。在一些实施方案中，所述柱为80mL大孔基质组合物。在一些实施方案中，在AEX步骤前将CEX洗脱液稀释到低盐缓冲液中。在一些实施方案中，线性梯度用于洗脱完整rAAV粒子。在一些实施方案中，所述方法还包括中和包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的洗脱液的pH。说明性缓冲条件例如提供在图213和图336中。
TFF浓缩和渗滤
在本公开的方法的一些实施方案中，使用切向流过滤(TFF)将包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的AEX洗脱液渗滤并浓缩到最终制剂缓冲液(FFB)中。切向流过滤是一种膜过滤技术，根据特定TFF实施方案中的膜孔隙率，其可以被分类为微滤或超滤过程。在TFF中，进料流平行于膜面通过，此时一部分渗透膜，而渗余物被再循环回到储存器。此过程使用切向流过滤(TFF)的原理实现体积减小和额外纯化。
此过程使用渗滤将AAV产物配制到所需的最终制剂缓冲液(20mM Tris pH 8、1mMMgCl2、200mM NaCl，任选地具有0.001％泊洛沙姆)中。
使用具有100kDa分子量截留的中空纤维过滤器(HFF)滤筒(Spectrum)进行洗脱产物的切向流过滤。将滤筒和系统用Tris 20mM、MgCl2 1mM、NaCl 200mM pH 8缓冲液平衡以在渗透侧获得pH 8.0±0.2。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述方法包括两个TFF步骤，第一TFF和第二TFF两者都使用100kDa HFF执行。
在以连续模式对最少6个体积的制剂缓冲液进行渗滤之前，将产物浓缩至最小体积。收集渗余物。用制剂缓冲液冲洗系统。将此冲洗液收集在不同的容器中。
如果需要长期储存(＞60天)，则在长期储存方法的一些非限制性实施例中，使用0.2μm过滤器对产物进行亚微米过滤。一旦原料药被完全过滤，则用最终的制剂缓冲液冲洗过滤器。
在QC取样后，将纯化的散装原料药储存在＜-80℃下。任选地，在冷冻和储存在＜-80℃下之前将泊洛沙姆188添加到原料药中。
由原料药制造药物产品的方法
本公开的组合物可以作为液体供应。在本公开的组合物的一些实施方案中，所述组合物包括其中组合物包含药物产品的那些组合物，药物产品在无菌玻璃小瓶中供应。在一些实施方案中，无菌玻璃小瓶为无菌透明玻璃小瓶。在一些实施方案中，将无菌玻璃小瓶用塞子封盖。在一些实施方案中，塞子是塑料塞子。在一些实施方案中，将无菌玻璃小瓶封盖并且进一步用外密封件封闭。
本公开的原料药的控制
示例性原料药通过表8中列出的测试来表征。
表8：
Figure BPA0000305202160001171
n/a：不适用
分析程序
物理滴度：
在一些实施方案中，使用qPCR测定基因组滴度。此方法允许定量基因组拷贝数。将载体储备液样品在缓冲液中稀释。对样品进行DNA酶处理，并且用蛋白酶K裂解病毒衣壳以释放基因组DNA。然后进行系列稀释。使用基于Taqman的引物/探针组对每个样品的重复样品进行qPCR。通过对标准质粒稀释系列的线性范围中的每个点取平均值并相对于每个点的平均CT值将对数拷贝数绘图来产生标准曲线。在一些实施方案中，标准曲线中使用的质粒DNA是呈超螺旋构象，并且在其他实施方案中呈线性构象。线性化质粒可以例如通过用HindIII限制酶消化来制备，通过琼脂糖凝胶电泳来显现，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照生产商的说明书来纯化。在用于生成标准曲线的质粒内切割的其他限制酶也可以是合适的。在一些实施方案中，与使用线性化质粒相比，使用超螺旋质粒作为标准增加了AAV载体的滴度。rAAV载体的滴度可以由标准曲线计算，并且表示为DNA酶抗性粒子(DRP)/mL。
在一些实施方案中，使用微滴式数字PCR(ddPCR)测定基因组滴度。AAV或其基因组DNA的样品可以被分级分离成多个包含油/水乳液的纳升规模的微滴(例如20,000个微滴)。PCR在多个微滴中的每个微滴中发生。与不使用微滴的情况下执行的反应相比，此技术提供需要更少样品和更小体积试剂的优点。在PCR之后，分析或读取每个微滴以确定原始样品中PCR阳性微滴的分数。然后使用泊松统计(Poisson statistics)分析这些数据，以确定原始样品中的靶DNA模板浓度。在微滴生成期间，模板分子随机分布到微滴中。一些微滴不含模板，一些微滴含有一个模板分子，而其他微滴含有超过一个的模板分子。由于配分的随机性质，扩增后的荧光数据通过泊松分布来很好地拟合。阳性微滴的数量对应于样品中靶序列的浓度。ddPCR系统可以准确地分析样品，其中在同一微滴中扩增多个靶，从而去除在反应开始时对每个微滴一个模板的任何需要，或者在反应后对每个微滴一个靶的任何需要，以定量每个微滴的靶拷贝。ddPCR可以使用与标准PCR相同的PCR试剂。
感染单位(IU)滴度：此测定定量AAV的感染粒子的数量。通过用载体样品的系列稀释液和均一浓度的提供辅助功能的野生型腺病毒感染RC32细胞(表达AAV8 Rep/Cap的HeLa)来执行定量。感染后几天，将细胞裂解稀释以减少PCR抑制剂，并且以与上文在物理滴度测定中所述相同的方式通过qPCR进行测定，不同之处在于省略了DNA酶和蛋白酶K消化，并且仅执行qPCR部分。单个孔的AAV扩增被评定为阳性或阴性。使用评定的孔使用寇氏法(Karber method)确定以IU/mL为单位的TCID50。
总粒子：所述测定使用ELISA技术(AAV8滴定ELISA试剂盒)。将对组装的AAV8衣壳上的构象表位具有特异性的单克隆抗体涂覆到微量滴定条上，并且用于从样本中捕获AAV8粒子。以两个步骤检测捕获的AAV粒子。首先，将AAV8的生物素缀合的单克隆抗体结合到免疫复合物。在第二步骤中，将链霉亲和素过氧化物酶缀合物与生物素分子反应。添加底物溶液导致发生颜色反应，其与特异性结合的病毒粒子的量成比例。在450nm处用光度测定法测量吸光度。
完整粒子∶空粒子比率(透射电子显微镜法)：AAV2粒子的完整粒子∶空粒子比率可以使用负染色透射电子显微镜法(TEM)测定。将样品施用到固定的栅格。将样品用透射电子显微镜显现，并且基于其形态对完整AAV2衣壳粒子(即含有DNA)和空AAV2衣壳粒子执行计数。完整粒子∶空粒子的比率由粒子计数计算。
完整粒子∶空粒子比率(分析超速离心)：AAV8粒子的完整粒子∶空粒子比率可以使用分析超速离心(AUC)来测定。AUC具有优于其他非破坏性方法的优点，这意味着可以在AUC之后回收样品以进行额外测试。将包含空AAV8粒子和完整AAV8粒子的样品施用到液体组合物，在超速离心期间AAV8移动通过所述液体组合物。一个或多个AAV8粒子的沉降速度的测量结果提供关于AAV粒子的大小和形状的流体动力学信息。沉降平衡的量度提供关于AAV8粒子的溶液摩尔质量、化学计量、缔合常数和溶液非理想性的热力学信息。在AUC期间获取的示例性测量结果是径向浓度分布或“扫描”。在一些实施方案中，以在数分钟(对于速度沉降)至数小时(对于平衡沉降)范围内的间隔获取扫描。本公开的方法的扫描可以含有光学测量结果(例如，光吸收、干涉和/或荧光)。超速离心速度可以在10,000转/分钟(rpm)至75,000rpm的范围内(包括端点在内)。由于完整AAV8粒子和空AAV8粒子通过AUC展示不同的测量结果，因此可以使用此方法测定样品的完整粒子/空粒子比率。
载体同一性(DNA)：此测定提供病毒DNA序列的确认。所述测定通过消化病毒衣壳并纯化病毒DNA来执行。对DNA进行测序，其对可能的正向区域和反向区域二者具有最小2倍覆盖率(一些区域例如ITR的序列是有问题的)。将DNA测序重叠群与预期序列进行比较以确认同一性。
总蛋白：此测定通过使用Micro-BCA试剂盒来定量存在于测试物品中的蛋白质的总量。为了消除制剂缓冲液的基质效应，用丙酮沉淀样品，并且在分析前将沉淀的蛋白质再悬浮于等体积的水中。通过将测试物品或稀释的测试物品与试剂盒中提供的Micro-BCA试剂混合来执行蛋白质浓度测定。使用牛血清白蛋白(BSA)标准品的稀释液执行同样的操作。将混合物在60℃下孵育，并且在562nm处测量吸光度。使用线性回归拟合由标准吸光度和已知浓度生成标准曲线。根据线性回归对未知样品进行定量。
纯度：此测定提供AAV纯度的半定量测定。基于AAV8衣壳粒子ELISA的结果，通过SpeedVac浓缩样品，并装载4x10^10或1x10^11个粒子，并且在SDS-PAGE凝胶上分离衣壳蛋白。SYPRO橙色染色凝胶的密度测定法分析允许计算相对于衣壳蛋白(Vp1、Vp2和Vp3)的近似杂质水平。
复制型AAV：在存在或不存在野生型腺病毒的情况下，使用测试物品转导HEK293细胞。将进行三轮连续细胞扩增，并且在每个扩增步骤处提取总基因组DNA。
通过实时定量PCR检测rcAAV8。两个序列是分离的基因组DNA；一个序列对HEK293细胞的AAV2Rep基因具有特异性并且一个序列对其内源性基因(人白蛋白)具有特异性。确定每个细胞的Rep基因的相对拷贝数。阳性对照是单独测试或在rAAV载体制剂存在下测试的野生型AAV病毒血清型8。
对于每个测试批次，测定的检测极限受到挑战。检测极限是测试样品的“X”个rcAAV/“Y”个基因组拷贝。如果测试样品对于Rep序列呈阴性，则此样品的结果将报告为：无复制，测试样品的＜“X”个rcAAV/“Y”个基因组拷贝。如果测试样品对于Rep序列呈阳性，则此样品的结果将报告为：复制，测试样品的＞“X”个rcAAV/“Y”个基因组拷贝。
HEK293宿主细胞蛋白：HEK293宿主细胞蛋白(HCP)测定是免疫酶学测定。纯化的病毒样品在涂覆有亲和纯化的捕获抗体的微量滴定条中反应。二次辣根过氧化酶(HRP)缀合酶同时反应，从而导致形成固相抗体-HCP-酶标记抗体的夹心复合物。洗涤微量滴定条以去除任何未结合的反应物。通过向每个孔中添加3，3′，5，5′四甲基联苯胺过氧化酶(HRP底物)来检测HEK293 HCP的量。在读板仪上读取水解的底物的量，并且其与存在的HEK293 HCP的浓度成正比。
总DNA：Picogreen试剂是结合双链DNA且形成高度发光复合物的超敏感荧光核酸染色(λ激发＝480nm-λ发射＝520nm)。此荧光发射强度与溶液中的dsDNA量成比例。使用具有已知浓度的DNA标准曲线，通过转换测量的荧光来获得测试样品中的DNA含量。
HEK293宿主细胞DNA：原始过程测量3种不同扩增子的大小和量，然而改善的过程测量包括高分子量和剪切DNA的总hcDNA。改善过程的鉴定数据展示所述测定具有特异性并足够敏感地符合评估每剂量(＜10ng/剂量)hcDNA的要求(WHO生物制品标准化专家委员会(WHO Expert Committee on Biological Standardization)，2013)。
残留BSA：残留BSA用Bethyl制造和销售的市售ELISA试剂盒定量。ELISA试剂盒的科学原理与对宿主细胞蛋白ELISA指定的科学原理非常相似。
残留Benzonase：此测定使用对Benzonase内切核酸酶具有特异性的纯化的多克隆抗体，以通过夹心式ELISA检测测试样品中的残留Benzonase。通过比较样品信号与在同一时间测定的Benzonase内切核酸酶标准来获得准确测量结果。
生物负载测定：此程序用于定量测定(如果可检测的话)样品中存在的生物负载的量。所用方法涉及将一半样品膜过滤到两个膜中的每一个上。将膜放置到单独的琼脂培养基板上，将板在需氧条件和厌氧条件下依次在20-25℃和30-35℃下孵育。在孵育结束时，将需氧菌、厌氧菌和真菌计数表示为CFU/mL样品。
内毒素测定：此测定用于确定细菌内毒素是否存在于测试物品中。通过动力学-显色法执行定量程序。将已知量的内毒素与测试物品平行测试，以准确测定细菌内毒素的水平。通过以指定水平的内毒素掺加测试物品加上LAL试剂来检查测试物品的干涉潜力。在抑制/增强测试后，测定测试物品的内毒素含量。
定量PCR(qPCR)：qPCR可以用于确认HPLC色谱图结果(也称为实时PCR或逆转录PCR，两者均缩写为RT-PCR)。qPCR在标准PCR反应中使用聚合酶(例如Taq聚合酶)，以使用预先验证的引物或引物/探针测定由复杂样品扩增靶DNA片段。PCR反应使用荧光报告子来测量在每个PCR循环时扩增的DNA的生成，从而提供DNA量的绝对或相对量度。当DNA处于对数线性扩增阶段时，由PCR产生的荧光量增加到超过背景。荧光变得可测量的点被称为阈值循环(CT)或交叉点。通过将测试样品的CT与已知样品的CT或标准曲线(使用已知样品的一系列稀释液得到)进行比较，可以确定测试样品中DNA的量。在优选的实施方案中，将样品/测试DNA的量与宿主细胞的不变或内源性基因(例如管家基因，包括但不限于β-肌动蛋白)进行比较。
微滴式数字PCR(ddPCR)：ddPCR可以用于确认HPLC色谱图结果。ddPCR在标准PCR反应中使用Taq聚合酶，以使用预验证的引物或引物/探针测定由复杂样品扩增靶DNA片段。在扩增前，将PCR反应配分到数千个单个反应容器，并在反应终点获取数据。ddPCR在未使用标准曲线的情况下提供直接且独立的DNA定量，并且可以给出精确且可再现的数据。终点测量结果能够不依赖于反应效率而实现核酸定量。ddPCR可以用于对不同污染的样品进行极低的靶定量。
AAV组合物的稳定性
本公开的组合物在储存于＜-60℃下时维持长期稳定性。例如，本公开的组合物在储存于-80℃与40℃(大约人体温度)之间(包括端点在内)的温度下时维持长期稳定性。例如，本公开的组合物在储存于-80℃与5℃之间(包括端点在内)的温度下时维持长期稳定性。例如，本公开的组合物在储存于-80℃、-20℃或5℃下时维持长期稳定性。在一些实施方案中，本公开的组合物被配制成液体或悬浮液，等分到一个或多个容器(例如小瓶)中，并且储存在＜-60℃下。在一些实施方案中，本公开的组合物被配制成液体或悬浮液，等分到一个或多个容器(例如小瓶)中，并且储存在-80℃、-20℃或5℃下。
本公开的组合物可以提供在具有最佳表面积与体积比的容器中，以在储存于＜-60℃下时维持长期稳定性。本公开的组合物可以提供在具有最佳表面积与体积比的容器中，以在储存于-80℃、-20℃或5℃下时维持长期稳定性。在一些实施方案中，本公开的组合物被配制成液体或悬浮液，等分到一个或多个容器(例如小瓶)中，并且当考虑所有储存要求时，储存在一个或多个具有尽可能大的表面积与体积比的容器中。
本公开的组合物在储存于环境相对湿度下时维持长期稳定性。
实施例
实施例1
纯化过程的开发
图23示出整料色谱法相对珠粒色谱法的比较。大孔柱(膜和整料)已成为用于纯化诸如rAAV病毒载体的大分子的所选色谱介质。大孔技术相对于常规珠粒的优点包括但不限于：靶结合不依赖于扩散，导致结合动力学更快和运行时间减少；流动通道更大，导致当以高流速运行时背压降低；结合位点可接近性更好，导致结合能力更高；以及流动特性优异，导致过程中体积减少。虽然常规珠粒技术具有较大的总体结合能力，但是由于与扩散驱动结合相关的孔排斥和限制，有效结合能力降低。因此，大孔技术是用于纯化rAAV病毒粒子的优异方法。另外，过程规模的整料技术提供固定在整料支撑物上的广泛范围的结合化学(比膜更强)。
总粒子高效液相色谱法(HPLC)色谱图是用于筛选目的优选方法，因为其具有快速的周转时间(＜24小时)。此方法是用于实验的回收率测定的主要报告测定。HPLC结果的验证用微滴式数字PCR(ddPCR)测量来确认。
图60示出示例性HIC捕获步骤，其已经从1mL柱按比例放大到80mL柱。在图60A中，洗涤液、E1、E2、E3和原位清洁液(CIP)级分在x轴上表示，并且吸光度(以mAU为单位)在y-轴上表示。AAV粒子在级分E2中洗脱，在图60A至图60B中由绿色方框表示。关于洗脱条件的灵敏度分析已表明这是稳健的单元操作。图60B示出收获培养基、流过液、洗涤液、洗脱级分和CIP的SDS-PAGE分析。级分E2由绿色方框表示。观察到在ddPCR与总粒子HPLC方法之间的良好相关性。对于此单元操作，预期回收率＞80％。
在HIC捕获后，在HIC洗脱液中观察到蛋白质毛发样材料，其导致在后续色谱步骤期间不可持续的压力增加。使用0.45μm乙酸纤维素(CA)过滤器来保留纤维，但这导致载体损失50％。随后，筛选用于rAAV保留的过滤器以找到合适的替代物(图63)。选择0.8/0.45μm聚醚砜(PES)组合过滤器用于过滤HIC洗脱液。在实施此过滤器后观察到最少的损失。过滤器的选择基于在较大规模下的过滤器回收率和过滤器可用率两者。
对HIC步骤测试梯度洗脱方法和等度洗脱方法两者(图61)。将梯度洗脱转换为等度洗脱是成功的。在一些实施方案中，等度洗脱是用于按比例放大的优选方法，因为它是更稳健的方法。然而，使用等度洗脱策略不可能实现洗脱物质的完全分配。在一些实施方案中，梯度洗脱是优选的。
HIC开发确认需要三步过程，包括中间CEX SO3-(精制步骤)(图62)。HIC步骤的纯度和随后的HIC纯度(图62A)以及AEX QA纯化产物(图62B)是不够的。需要中间精制步骤(CEX阳离子交换，SO3-)。
图97A示出使用CEX和SO3-柱基质的示例性中间精制步骤的色谱图。观察到在ddPCR与总粒子HPLC方法之间的良好相关性。对于此单元操作，预期回收率＞80％。图97B示出SDS-PAGE凝胶，其比较四次不同CEX中间精制运行的含有AAV粒子的级分，其中将pH调节到pH 3.5、pH 3.6、pH 4.0和pH 4.0。所有凝胶都稍微过度展开以便暴露存在于样品中的所有蛋白质条带。与pH较高的样品相比，pH较低的样品含有稍微较少的污染物(橙色方框)。最佳pH是pH 3.6+/-0.1。
图98示出两个示例性CEX色谱图和相应的SDS-PAGE凝胶，一个具有pH 4.0(顶部图)并且另一个具有pH 3.5(底部图)。与在pH 4.0下相比，在pH 3.5下观察到更高的纯化。使用CEX中间精制步骤将纯度增加到适当的水平。在流过液级分(FT)中分离出DNA，而蛋白质杂质保留在柱上。使用较低pH(3.5)改善纯化因子。这是由于具有低等电点的蛋白质(诸如AAV粒子中发现的那些蛋白质)对柱的亲和力增加。
含有rAAV粒子的示例性CEX SO3-洗脱液的TEM分析揭示，27.2％的粒子是完整粒子，并且51.1％的粒子是空粒子或受损粒子(图99)。21.8％的粒子不能被分类为完整粒子或空粒子。这些粒子的表面的明亮度不均匀，存在一些暗点，并且它们表现出中间具有白点的灰色圆圈。这些粒子被假定为不完全是空的。此材料由具有包含的3′ITR区的基因组质粒生成。3′ITR可能具有受影响的衣壳包裹。用于分离完整粒子和空粒子的进一步展开工作将使用具有不同3′ITR的新材料。
完整粒子峰和空粒子峰的最佳解析率取决于MgCl2的pH浓度。已经显示MG2+与空AAV粒子的优先相互作用有助于分离空粒子与完整粒子。图103A示出通过在pH 9.5下在AEXQA柱上运行CEX洗脱液并改变MgCl2的浓度而生成的色谱图的叠加图。在0mM MgCl2下观察到最清晰的分离(黑色箭头和线)。图103A示出热图，其说明在AEX步骤中在pH 9.0和0mMMgCl2下发生最佳的完整粒子与空粒子的分离。在AEX E3级分中回收高百分比的完整粒子(图105)。根据HPLC，据估计在E3洗脱液中回收的96％粒子是完整粒子，并且在E3洗脱液中回收78-81％完整粒子。
实施例2：rAAV粒子的纯化
显示从收获培养基纯化本公开的rAAV粒子的示例性HIC色谱图示出于图64中。将包含rAAV粒子的收获培养基稀释到高盐缓冲液中，并在800mL具有疏水作用(OH)基质的HIC整料上使用结合和洗脱色谱模式运行。使用逐步梯度来洗脱rAAV粒子。图64A中的色谱图显示rAAV粒子在加框的E2级分和E3级分中洗脱。图64B示出从图64A中的HIC步骤回收的级分的SDS-PAGE凝胶，从左到右示出标记、收获培养基、负载、流过液(FT)、洗涤液(W)、级分E1、级分E2、两倍稀释的级分E2(E2.2X)、级分E3、两倍稀释的级分E3(E3.2X)、原位清洁步骤(CIP)和两倍稀释的CIP(CIP.2X)。E2和E2.2X含有rAAV粒子并被加框。
图65A示出示例性HIC色谱图，其中rAAV粒子在E3级分、E4级分和E5级分中洗脱。如HPLC和ddPCR中可见，E3级分中总粒子的收率最高(图65B)。图66B示出来自级分E3、级分E4和级分E5的rAAV粒子的透射电子显微照片。在主峰(E3)中，rAAV载体均匀排列，其中大多数是完整衣壳。聚集体或受损粒子不多。产物在完整衣壳、聚集体和受损粒子的比例方面的质量随每个后续级分而降低。
图100A示出使用CEX从HIC洗脱液纯化的rAAV粒子的示例性色谱图。大多数rAAV粒子在加框的级分E2中洗脱。图100B示出SDS-PAGE凝胶。从左到右装载的是：HIC-20中和、负载-BF、负载、流过液+洗涤液(FT+W)、级分E1、稀释两倍的级分E2(E2.2X)、稀释十倍的级分E2(E2.10X)、级分E3、CIP、CIP.2X和标记。rAAV粒子存在于加框的E2.2X和E2.10X中。
图104A示出进一步纯化CEX洗脱液的示例性AEX色谱图。完整rAAV粒子富集在加框的E3级分中。通过基于粒子的电荷分离完整粒子和空粒子来实现完整粒子富集。由于存在DNA基因组，完整粒子的负电荷极其稍微多于空粒子。可通过从用于血清型AAV8粒子的缓冲液中去除MgCl2来进一步增强分离。图104B示出通过SDS-PAGE凝胶得到的纯度。泳道从左到右示出：标记、SQ3 13 E2 10X、QA2负载、QA2 FT+W、级分QA2 E1、级分QA2 E2、级分QA2 E3、级分QA2 E4、级分QA2 E5、级分QA2 E6、空白和QA2 CIP。来自图104A的色谱图的级分QA2 E3的透射电子显微照片示出E3级分中AAV粒子的回收率(图106A)。当计数出2090个完整粒子和空粒子时，77％是完整粒子，并且23％是空粒子或受损粒子(图106C)。当通过微滴式数字PCR(ddPCR)测定滴度时，级分E3具有3.1x10^11c/mL的滴度、4.53mL的体积和1.4x10^12个载体基因组。柱上装载的输入样品的回收率为60％，并且来自初始起始材料的回收率为29％(图106B)。
据估计所述过程的过程回收率示出于图107中。三步色谱过程的总预期收率为40％与65％之间。这大于常规的基于超速离心的过程。
实施例3：AAV8-RPGR制造过程描述-上游和初级收获单元操作-PD-USP-001
X连锁型色素性视网膜炎(XLRP)是非常严重形式的色素性视网膜炎(RP)，其导致快速的疾病进展和严重的视网膜功能障碍。XLRP的全世界患病率为大约1∶30,000至1∶40,000(Tee等人，2016)。患有XLRP的患者通常在前十年经历夜盲症发作，接着经历视野和敏锐度降低以及进行性严重的视力损害。大多数患者在第四个十年结束时是法定失明的。
迄今为止，3个基因已被定位到XLRP：RP2；RP3，也称为RP GTP酶调节物(RPGR)基因；和OFD1，其已被鉴定为XLRP的罕见原因(Webb等人，2012)。大约75％的XLRP病例是由于RPGR变体，并且由于RPGR变体，XLRP的全世界患病率是大约1∶40,000至1∶53,000(Pelletier等人，2007；Shu等人，2008)。RPGR参与光感受器中的蛋白质分布，并且在光转导组分和其他外节蛋白质跨越连接纤毛的转运中起作用(Tee等人，2016)。对于光感受器活力所必需的RPGR基因产物位于视杆光感受器的外节中(Ferrari等人，2011)。视网膜中RPGR功能的丧失导致视杆和视锥视觉进行性丧失。
Nightstar Therapeutics正在开发AAV8-RPGR作为用于治疗由于RPGR中的突变引起的XLRP的潜在基因治疗医药产品(GTMP)。预期用新的和有活性的RPGR替换XLRP患者中的缺陷RPGR来减缓或停止视网膜变性并维持或改善视觉功能。
本文件描述用于制造AAV8-RPGR产物的上游和初级收获过程。本文件包括所有上游和初级收获加工步骤。
制造过程描述和过程控制
批次定义
一批产品定义为由20个含有产生AAV8-RPGR生物产品的质粒DNA转染的HEK293细胞的Corning 36-层
Figure BPA0000305202160001251
容器组成的单个生产运动。细胞培养基从20个Corning
Figure BPA0000305202160001252
容器收获并合并，且接着进行单一纯化过程。
上游过程的概要
使用Corning培养瓶和叠层扩增细胞，以允许产生足够的细胞质量用于接种二十个
Figure BPA0000305202160001253
单元以便于载体产生。使用优化的磷酸钙共沉淀方法，使用两生产质粒系统进行细胞的转染。
转染后，更换培养基，并且将
Figure BPA0000305202160001254
内切核酸酶添加到培养基中，以消化培养基中存在的游离基因组和质粒DNA。为了促进载体释放到培养基中，将36层
Figure BPA0000305202160001255
单元用HEPES缓冲的Na2HPO4溶液掺料，并在收获前孵育。使用一次性生物处理包无菌收获来自每个36-层
Figure BPA0000305202160001256
的培养基，并且将其合并成单个体积(约82L)。
然后使用胶囊0.65μm孔预过滤器，接着使用0.2μm灭菌级胶囊过滤器使含有重组AAV(rAAV)的合并的培养基澄清。
制造流程图
AAV8-RPGR的制造过程的上游和初级回收步骤的概述连同执行的当前过程控制和QC/分析测试的概述一起示出于图22中。
上游制造过程描述
小瓶解冻
将来自HEK293MCB的小瓶从-150℃储存中移出，并且随后在设定为37±1℃的温度的水浴中解冻。执行目视检查以确保细胞解冻。预期WCB将用于任何进一步生产运行。
将解冻的细胞添加到含有4mL已预热到37±1℃的生长培养基(DMEM+10％血清)的T-25瓶中。将细胞置于设定为37℃和5％CO2的湿润的CO2孵育器中，并且静置过夜。图27示出细胞解冻步骤的流程图。在细胞解冻程序期间需遵守的参数和操作条件包含在图28中。图29含有细胞解冻过程所需的关键材料和消耗品的详情。
细胞扩增
细胞通过一系列传代从最初的T-25培养瓶扩增到36-层
Figure BPA0000305202160001261
单元。使细胞在设定为37℃和5％CO2的湿润的孵育器中生长。当细胞融合度达到80％时，细胞就传代，这通常是每三天至五天。
一般传代方案由以下组成：
从当前的细胞培养瓶/叠层中去除培养基。
-使用预热的汉克斯平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution，HBSS)洗涤细胞。
-添加预热的细胞1x解离溶液并使溶液旋转以确保细胞表面被覆盖。去除过量的细胞解离溶液。
-将细胞培养瓶/叠层再孵育3-5分钟。使用小心的手动轻敲移出细胞。
-添加另外的生长培养基以帮助移动细胞。
-将细胞移出到中间储存容器中。
-将细胞悬浮液与新的预热的生长培养基混合
-接种新的细胞培养瓶/叠层。
-在37℃和5％CO2下孵育细胞。
图30提供一般传代程序的高级概要，而图31详述细胞传代的一般标准。图32含有关于从每个可能的细胞培养容器传代直至36-层
Figure BPA0000305202160001271
单元的推荐的体积和接种密度。推荐的最少加热时间包含在图33中。图34含有细胞解冻和常规传代步骤所需的关键材料和消耗品的详情。推荐将细胞次培养大约30代。当接近它们的有效传代极限时，应当在丢弃旧细胞前解冻新的小瓶。
瞬时转染、
Figure BPA0000305202160001272
添加、培养基释放和收获
在接种后生长3天之后，将
Figure BPA0000305202160001273
培养基用含有血清和氯喹的新鲜DMEM培养基替换；这在转染前2小时至8小时执行。然后使用优化的磷酸钙共沉淀方法，使用两种生产质粒转染细胞。
在生物安全柜中制备足够的DNA质粒转染沉淀物，以转染5x36-层
Figure BPA0000305202160001274
起初，制备含有载体质粒、pDP8.ape辅助质粒和CaCl2的DNA/钙混合物。充分混合后，将质粒/CaCl2溶液添加到等体积的2x HEPES缓冲的NaHPO4中，同时在一次性处理袋中轻轻搅动，以获得最佳沉淀物。将所述溶液在室温下静置至少5分钟，并且然后添加到用歧管连接的五5个
Figure BPA0000305202160001275
中。重复此程序四次，以完成所需20个
Figure BPA0000305202160001276
单元的转染。
转染后，将细胞在设定为37℃和5％CO2的孵育器中孵育。转染后大约22小时，使用无血清的DMEM更换培养基。此时，将
Figure BPA0000305202160001277
内切核酸酶以90U/mL的浓度添加到培养基中，以消化培养基中存在的游离基因组DNA和质粒DNA。执行此步骤以使最终载体产物中残留宿主细胞DNA的量最小化。然后将细胞在设定为37℃和5％CO2的孵育器中再孵育69小时至75小时。为了促进载体释放，将36-层
Figure BPA0000305202160001278
用HEPES缓冲的NaHPO4溶液掺料，并在收获前在设定为39℃和5％CO2的孵育器中孵育大约18小时。使用一次性生物处理包无菌收获来自每个36-层
Figure BPA0000305202160001279
的培养基，并且将其合并成单个体积(约82L)。图182示出瞬时转染和培养基收获步骤的流程图。图183含有每细胞培养单位的氯喹体积，并且图184详述转染和收获步骤的操作范围。图185含有在转染过程中使用的关键消耗品和材料的详情。
通过过滤进行澄清
然后通过胶囊预过滤器，接着通过灭菌级胶囊过滤器使含有重组AAV(rAAV)的合并的培养基澄清。第二备用预过滤器作为过滤装置的一部分安装，并且当第一预过滤器处于使用中时，如果入口压力达到10psi，则使用第二备用预过滤器。预过滤器具有0.65μm的孔径，并且由玻璃纤维构造。生物负载减少过滤器是由聚醚砜(PES)构造的0.2μm灭菌级过滤器。为了实现最大回收率，在产物过滤后，无菌吹拂过滤器并用缓冲液逐出。图186示出过滤澄清步骤的流程图。图187含有用于过滤澄清单元操作的操作参数。图188示出在澄清过滤步骤中使用的关键性材料/消耗品。
用于溶液制备的优选化学品
只要可能，就使用法定(Compendial)或多法定化学品。图208提供已在所述过程中使用的优选化学品和相关等级的列表。
实施例4：AAV8-RPGR制造过程描述-上游和初级收获单元操作-PD-USP-002
X连锁型色素性视网膜炎(XLRP)是非常严重形式的色素性视网膜炎(RP)，其导致快速的疾病进展和严重的视网膜功能障碍。XLRP的全世界患病率为大约1∶30,000至1∶40,000(Tee等人，2016)。患有XLRP的患者通常在前十年经历夜盲症发作，接着经历视野和敏锐度降低以及进行性严重的视力损害。大多数患者在第四个十年结束时是法定失明的。
迄今为止，3个基因已被定位到XLRP：RP2；RP3，也称为RP GTP酶调节物(RPGR)基因；和OFD1，其已被鉴定为XLRP的罕见原因(Webb等人，2012)。大约75％的XLRP病例是由于RPGR变体，并且由于RPGR变体，XLRP的全世界患病率是大约1∶40,000至1∶53,000(Pelletier等人，2007；Shu等人，2008)。RPGR参与光感受器中的蛋白质分布，并且在光转导组分和其他外节蛋白质跨越连接纤毛的转运中起作用(Tee等人，2016)。对于光感受器活力所必需的RPGR基因产物位于视杆光感受器的外节中(Ferrari等人，2011)。视网膜中RPGR功能的丧失导致视杆和视锥视觉进行性丧失。
Nightstar Therapeutics正在开发AAV8-RPGR作为用于治疗由于RPGR中的突变引起的XLRP的潜在基因治疗医药产品(GTMP)。预期用新的和有活性的RPGR替换XLRP患者中的缺陷RPGR来减缓或停止视网膜变性并维持或改善视觉功能。
本文件描述用于制造AAV8-RPGR产物的上游和初级收获过程。本文件包括所有上游和初级收获加工步骤。
制造过程描述和过程控制
批次定义
一批产品定义为由20个含有产生AAV8-RPGR生物产品的质粒DNA转染的HEK293细胞的Corning 36-层
Figure BPA0000305202160001281
容器组成的单个生产运动。细胞培养基从20个Corning
Figure BPA0000305202160001282
容器收获并合并，且接着进行单一纯化过程。
上游过程的概要
使用Corning培养瓶和叠层扩增细胞，以允许产生足够的细胞质量用于接种二十个
Figure BPA0000305202160001283
单元以便于载体产生。使用优化的磷酸钙或
Figure BPA0000305202160001284
介导的方法，使用三生产质粒系统进行细胞的转染。
转染后，更换培养基，并且将
Figure BPA0000305202160001291
内切核酸酶添加到培养基中，以消化培养基中存在的游离基因组和质粒DNA。为了促进载体释放到培养基中，将36层
Figure BPA0000305202160001292
单元用HEPES缓冲的Na2HPO4溶液掺料，并在收获前孵育。使用一次性生物处理包无菌收获来自每个36-层
Figure BPA0000305202160001293
的培养基，并且将其合并成单个体积(约82L)。
然后使用胶囊0.65μm孔预过滤器，接着使用0.2μm灭菌级胶囊过滤器使含有重组AAV(rAAV)的合并的培养基澄清。
制造流程图
AAV8-RPGR的制造过程的上游和初级回收步骤的概述连同执行的当前过程控制和QC/分析测试的概述一起示出于图44中。
上游制造过程描述
小瓶解冻
将来自HEK293MCB的小瓶从-150℃储存中移出，并且随后在设定为37±1℃的温度的水浴中解冻。执行目视检查以确保细胞解冻。预期WCB将用于任何进一步生产运行。
将解冻的细胞添加到含有4mL已预热到37±1℃的生长培养基(DMEM+10％血清)的T-25瓶中。将细胞置于设定为37℃和5％CO2的湿润的CO2孵育器中，并且静置过夜。图45示出细胞解冻步骤的流程图。在细胞解冻程序期间需遵守的参数和操作条件包含在图46中。图47含有细胞解冻过程所需的关键材料和消耗品的详情。
细胞扩增
细胞通过一系列传代从最初的T-25培养瓶扩增到36-层
Figure BPA0000305202160001294
单元。使细胞在设定为37℃和5％CO2的湿润的孵育器中生长。当细胞融合度达到80％时，细胞就传代，这通常是每三天至五天。
一般传代方案由以下组成：
-从当前的细胞培养瓶/叠层中去除培养基。
-使用预热的汉克斯平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution，HBSS)洗涤细胞。
-添加预热的细胞1x解离溶液并使溶液旋转以确保细胞表面被覆盖。去除过量的细胞解离溶液。
-将细胞培养瓶/叠层再孵育3-5分钟。使用小心的手动轻敲移出细胞。
-添加另外的生长培养基以帮助移动细胞。
-将细胞移出到中间储存容器中。
-将细胞悬浮液与新的预热的生长培养基混合
-接种新的细胞培养瓶/叠层。
-在37℃和5％CO2下孵育细胞。
图178提供一般传代程序的高级概要，而图179详述细胞传代的一般标准。图180含有关于从每个可能的细胞培养容器传代直至36-层
Figure BPA0000305202160001301
单元的推荐的体积和接种密度。推荐的最少加热时间包含在图176中。图181含有细胞解冻和常规传代步骤所需的关键材料和消耗品的详情。推荐将细胞次培养大约30代。当接近它们的有效传代极限时，应当在丢弃旧细胞前解冻新的小瓶。
瞬时转染、
Figure BPA0000305202160001302
添加、培养基释放和收获
在接种后生长3天之后，将
Figure BPA0000305202160001303
培养基用含有血清和氯喹(所述氯喹是磷酸钙转染方法唯一需要的)的新鲜DMEM培养基替换；这在转染前2小时至8小时执行。然后使用优化的磷酸钙或
Figure BPA0000305202160001304
介导的方法，使用三种生产质粒转染细胞。
在生物安全柜中制备足够的DNA质粒转染沉淀物，以转染5x36-层
Figure BPA0000305202160001305
存在执行磷酸钙介导的转染或使用
Figure BPA0000305202160001306
的转染的选项。两种方法将在过程描述的此部分中描述。许多步骤将是这两种方法之间共有的，然而当存在差异时，将给出关于讨论的是哪种转染方法的明确说明。
磷酸钙特异性转染
起初，制备含有转基因质粒、AV辅助质粒、衣壳质粒和CaCl2的DNA/钙混合物。充分混合后，将质粒/CaCl2溶液添加到等体积的2x HEPES缓冲的NaHPO4中，同时在一次性处理袋中轻轻搅动，以获得最佳沉淀物。将所述溶液在室温下静置至少5分钟，然后添加到用歧管连接的五个
Figure BPA0000305202160001307
中。重复此程序四次，以完成20个
Figure BPA0000305202160001308
单元的转染。
Figure BPA0000305202160001309
特异性转染
将转基因质粒、AV辅助质粒和衣壳质粒DNA在无血清培养基中稀释并轻轻搅拌。将稀释的
Figure BPA00003052021600013010
一次性添加到DNA溶液中。然后需要轻轻搅动所得溶液并使其平衡至室温。然后将
Figure BPA00003052021600013011
复合溶液添加到用歧管连接的五个
Figure BPA00003052021600013012
中。重复此程序四次，以完成20个
Figure BPA00003052021600013013
单元的转染。
转染后，将细胞在设定为37℃和5％CO2的孵育器中孵育。转染后大约22小时，使用无血清的DMEM更换培养基。此时，将
Figure BPA00003052021600013014
内切核酸酶以90U/mL的浓度添加到培养基中，以消化培养基中存在的游离基因组DNA和质粒DNA。执行此步骤以使最终载体产物中残留宿主细胞DNA的量最小化。然后将细胞在设定为37℃和5％CO2的孵育器中再孵育69小时至75小时。为了促进载体释放，将36-层
Figure BPA0000305202160001311
用HEPES缓冲的NaHPO4溶液掺料，并在收获前在设定为39℃和5％CO2的孵育器中孵育大约18小时。使用一次性生物处理包无菌收获来自每个36-层
Figure BPA0000305202160001312
的培养基，并且将其合并成单个体积(约82L)。图10示出瞬时转染和培养基收获步骤的流程图。图183含有每细胞培养单位的氯喹体积，并且图184详述转染和收获步骤的操作范围。对于磷酸钙和
Figure BPA0000305202160001313
转染方法，用于形成转染的具体指导方针分别包含在图11和图12中。在图12中PEI∶DNA比的比率以2∶1比率给出，然而使用其他比率例如在1∶1至4∶1范围内的比率是可接受的。图16含有磷酸钙转染过程中使用的关键消耗品和材料的详情。图17含有在PEI转染过程中使用的关键消耗品和材料的详情。
通过过滤进行澄清
然后通过胶囊预过滤器，接着通过灭菌级胶囊过滤器使含有重组AAV(rAAV)的合并的培养基澄清。第二备用预过滤器作为过滤装置的一部分安装，并且当第一预过滤器处于使用中时，如果入口压力达到10psi，则使用第二备用预过滤器。预过滤器具有0.65μm的孔径，并且由玻璃纤维构造。生物负载减少过滤器是由聚醚砜(PES)构造的0.2μm灭菌级过滤器。为了实现最大回收率，在产物过滤后，无菌吹拂过滤器并用缓冲液逐出。图186示出过滤澄清步骤的流程图。图187含有用于过滤澄清单元操作的操作参数。图188示出在澄清过滤步骤中使用的关键性材料/消耗品。
用于溶液制备的优选化学品
只要可能，就使用法定或多法定化学品。图208提供已在所述过程中使用的优选化学品和相关等级的列表。
实施例5：AAV8-RPGR制造过程描述-下游和填充和整理单元操作
X连锁型色素性视网膜炎(XLRP)是非常严重形式的色素性视网膜炎(RP)，其导致快速的疾病进展和严重的视网膜功能障碍。XLRP的全世界患病率为大约1∶30,000至1∶40,000(Tee等人，2016)。患有XLRP的患者通常在前十年经历夜盲症发作，接着经历视野和敏锐度降低以及进行性严重的视力损害。大多数患者在第四个十年结束时是法定失明的。
迄今为止，3个基因已被定位到XLRP：RP2；RP3，也称为RP GTP酶调节物(RPGR)基因；和OFD1，其已被鉴定为XLRP的罕见原因(Webb等人，2012)。大约75％的XLRP病例是由于RPGR变体，并且由于RPGR变体，XLRP的全世界患病率是大约1∶40,000至1∶53,000(Pelletier等人，2007；Shu等人，2008)。RPGR参与光感受器中的蛋白质分布，并且在光转导组分和其他外节蛋白质跨越连接纤毛的转运中起作用(Tee等人，2016)。对于光感受器活力所必需的RPGR基因产物位于视杆光感受器的外节中(Ferrari等人，2011)。视网膜中RPGR功能的丧失导致视杆和视锥视觉进行性丧失。
Nightstar Therapeutics正在开发AAV8-RPGR作为用于治疗由于RPGR中的突变引起的XLRP的潜在基因治疗医药产品(GTMP)。预期用新的和有活性的RPGR替换XLRP患者中的缺陷RPGR来减缓或停止视网膜变性并改善视觉功能。
本文件描述用于制造AAV8-RPGR产物的上游和初级收获过程。本文件包括所有下游和初级填充和整理加工步骤。
制造过程描述和过程控制
批次定义
一批产品定义为由20个含有产生AAV8-RPGR生物产品的质粒DNA转染的HEK293细胞的Corning 36-叠层
Figure BPA0000305202160001321
容器组成的单个生产运动。细胞培养基从20个Corning
Figure BPA0000305202160001322
容器收获并合并，且接着进行单一纯化过程。
下游过程的概要
在过程流的澄清后，使用切向流过滤(TFF)步骤执行产物的100倍因子体积浓缩，接着在TMN500T缓冲液中执行渗滤步骤。对于此步骤采用100kDA改性的聚醚砜(mPES)膜。
使用不连续的碘克沙醇梯度进一步纯化TFF浓缩的培养基。此步骤用于富集含DNA的rAAV粒子的制剂，同时基于这些粒子的差异浮力密度来去除大部分不含DNA的rAAV粒子(空粒子)。为了获得最大生产量，在两个梯度步骤中完成此过程。
在琼脂糖凝胶高效(SPHP)柱上进一步纯化碘克沙醇级分，这是阳离子交换步骤，其捕获带正电荷的AAV载体，同时从过程流中去除其他残留杂质和碘克沙醇。
使用100kDa的TFF mPES膜实现最终的载体浓缩和渗滤。将产物渗滤到最终的制剂缓冲液(20mM Tris pH 8.0、1mM MgCl2、200mM NaCl)中。在最终配制前，使用qPCR方法分析过程中样品的载体回收率，以确定载体滴度和DNA酶抗性粒子(DRP)的收率。此数据用于估计实现最终目标滴度所需的最终体积。将赋形剂泊洛沙姆188手动添加到过程流中，达到0.001％(v/v)最终浓度。在最终配制后，最终通过0.22μm过滤器无菌过滤产物，得到纯化的散装原料药(PBDS)。填充PBDS来完成所述过程并产生最终药物产品(FDP)。对PBDS和FDP两者进行释放测试。
制造流程图
AAV8-RPGR的制造过程的下游和填充和整理步骤的概述连同在整个制造过程中执行的当前过程控制和QC/分析测试的概述一起示出于图63中。
下游制造过程描述
大规模切向流过滤
将SSS(盐和表面活性剂溶液)使用1份SSS缓冲液比9份澄清培养基的比率添加到澄清的收获物中。执行SSS缓冲液的添加以维持蛋白质在澄清培养基中的溶解度。使用100kDA mPES中空纤维膜执行产物的100倍体积浓缩。浓缩后进行四次渗滤，所述渗漏用缓冲液将产物交换到TMN500T(20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、0.1％Tween 20)中。在渗滤步骤后进行最终浓缩以达到目标体积浓缩因子。图189提供TFF步骤的步骤概述。图190列出将用于大规模TFF运行的参数和相关操作范围或设定点。图191含有将在大规模切向流过滤单元操作中使用的关键材料和消耗品的详情。
附加备注-注意在最终浓缩步骤期间不允许空气进入流动回路，因为这可以启动产品的发泡。
初始碘克沙醇浓缩
执行初始超离心浓缩步骤以减少将在随后的碘克沙醇梯度步骤中处理的体积。由于碘克沙醇梯度分离的体积通量有限，所以体积的减少是必要的。
将来自前述TFF步骤的产物等分成32mL体积，并置于离心管中。在可能小于32mL的情况下，可以使用1xTMNK缓冲液来加满最后的离心管。将3mL 57％碘克沙醇溶液的单层作为垫层加到每个含有产物的管中。将离心管装载到离心机中，并且使用4℃温度在65,000rpm下旋转30分钟。根据需要重复离心以处理全部产物流。沿着1mL57％界面边缘收获整个57％碘克沙醇条带。然后将收获的产物在1xTMNK缓冲液中稀释。图192提供碘克沙醇浓缩步骤的说明性概要。图193详述将用于离心浓缩步骤的参数和设定点。将在离心浓缩步骤中使用的关键材料和消耗品包含在图194中。
附加备注
-避免在将‘Lg TFF浓缩物’合并样品转移到超离心管的底部时生成气泡或泡沫。
-缓慢添加57％垫层以避免不需要的相混合。
-当收获时，刺穿离心管的顶部以停止在收集产物时形成的真空
碘克沙醇梯度纯化
使用不连续的碘克沙醇梯度进一步纯化离心浓缩的培养基。此步骤用于富集含DNA的rAAV粒子的制剂，同时基于超速离心后在碘克沙醇梯度培养基中这些粒子的差异浮力密度来去除大部分不含DNA的rAAV粒子(空粒子)。所述不连续梯度由25％、40％和57％碘克沙醇相形成。离心后，从40％/57％界面稍下面收获富含DNA的载体。大部分空粒子包含在25％/40％界面中。将收获的合并载体在1xTMNK缓冲液中稀释以防止AAV载体聚集。图195提供完成碘克沙醇梯度纯化步骤所需的步骤的图解概述。图196列出将用于碘克沙醇梯度离心步骤的参数和相关操作范围或设定点，而图197含有相关的关键材料和消耗品。
附加备注
-避免在转移添加的碘克沙醇条带时生成气泡或泡沫。
-缓慢添加碘克沙醇溶液以避免不需要的相混合。
-当收获时，刺穿离心管的顶部以停止在收集产物时形成的真空
阳离子交换色谱法
通过阳离子交换(CEX)色谱柱纯化碘克沙醇收获级分，所述色谱柱用于去除包括碘克沙醇在内的残留污染物。
首先使用稀释缓冲液将碘克沙醇合并液稀释7倍(稀释缓冲液与碘克沙醇合并液的比率为6∶1)。然后在此之后，使用WFI进行2倍稀释(WFI与稀释的碘克沙醇合并液的比率为1∶1)。碘克沙醇合并液的稀释是必需的，从而允许通过降低样品的电导率并降低pH使载体与阳离子交换柱结合。
14倍完全稀释的碘克沙醇合并液成为使用SP SepharoseTM HP树脂的阳离子交换步骤的负载。载体的结合在低电导率和低pH的基于柠檬酸盐的缓冲液中发生，并且通过使用高盐缓冲液来实现洗脱。然后将含载体的洗脱峰用AMPD缓冲液稀释(AMPD缓冲液与CEX洗脱液的比率为1∶9)，然后将其储存在2-8℃下，随后进行加工。CEX单元操作的概述示出于图198中，而用于阳离子交换色谱步骤的全部操作参数包含在图199和图200中。成功执行CEX步骤所需的关键材料和消耗品连同它们的相关详情一起列出在图201中。
小规模切向流过滤和赋形剂添加
使用100kDa的TFF mPES膜实现最终载体配制。在最终配制前，使用qPCR方法分析过程中样品的载体回收率，以确定载体滴度和DNA酶抗性粒子(DRP)的收率。此数据用于估计实现最终目标滴度所需的最终体积。将产物渗滤到最终的制剂缓冲液(20mM Tris pH8.0、1mM MgCl2、200mM NaCl)中。手动添加赋形剂泊洛沙姆188，达到0.001％(v/v)的最终浓度。图202提供完成小规模切向流过滤步骤所需的步骤的图解概述。图203列出将用于小规模TFF运行的参数和相关操作范围或设定点。图204含有将在小规模切向流过滤单元操作中使用的关键材料和消耗品的详情。
无菌过滤和装瓶(Vialling)
在最终配制后，测定最终滴度，并且然后最终通过0.22μm过滤器无菌过滤产物，得到纯化的散装原料药(PBDS)。将PBDS填充到无菌管中，此时产品成为最终药物产品(FDP)。对FDP进行检查，然后将其储存在＜-60℃下。图204示出无菌过滤和填充单元操作的流程图。图205列出将用于无菌过滤和填充操作的参数和相关操作范围或设定点。图206含有将在无菌过滤和填充步骤中使用的关键材料和消耗品的详情。
过程中保持条件
图207含有已在AAV8-RPGR产品的制造期间使用的过程中点的保持时间的详情。随着更多信息变得可用，将细化过程中保持时间以反映最新数据。
用于溶液制备的优选化学品
只要可能，就使用法定或多法定化学品。图208提供已在所述过程中使用的优选化学品和相关等级的列表。
实施例6：用于AAV8-RPGR生产的下游过程
项目的目的在于开发用于rAAV8RPGR晚期临床和商业程序的工业色谱下游过程(DSP)。项目包括所有开发的步骤，即捕获、中间精制和使用大孔OH、SO3和QA柱分离空-完整(E/F)AAV8衣壳以及按照客户方案的切向流过滤(TFF)。基于澄清的收获材料进行开发，其中将磷酸钙用作转染试剂。
材料和方法
样品
样品在澄清的DMEM培养基中配制。在不同日期进行两个不同的实验，实验A和实验B。图210含有实验A的样品详情。图234含有实验B的样品详情。
FPLC系统(制备性运行)
FPLC 2：
-GE Healthcare Akta Explorer 100，UV流动池2mm
-0.75mm内径的毛细管(与8mL柱和80mL柱一起使用)
-样品装载：经由系统泵装载
-检测：UV 280nm、UV 260nm、电导率、pH
HPLC系统(分析性运行)
HPLC 1：
-PATfixTM，10mL泵头，0.25mm内径的毛细管
-样品装载：500μL样品环
-检测：UV 280nm、UV 260nm、荧光280/348(FLU，FLD)、电导率、MALS
-流速：1-2mL/min
整料固定相
分析性运行(3个柱)：
-大孔Adeno-0.1
-大孔SO3-0.1
-大孔AAV空粒子/完整粒子-0.1
制备性运行(3个柱)：
-大孔OH-80
-大孔SO3-8
-大孔QA-8
缓冲液
在新鲜的纯化水中制备缓冲液，并通过0.22μm过滤器过滤。图211示出用于实验A的制备性运行和分析性运行的缓冲液。图235示出用于实验B的制备性运行和分析性运行的缓冲液。
色谱方法
制备性运行：
-HIC步骤-如下游加工SOP中所指定执行HIC纯化步骤。图212示出用于实验A的使用专用缓冲液的SOP分步梯度。图236示出用于实验B的使用专用缓冲液的SOP分步梯度。
-CEX步骤-如在下游加工SOP中所指定执行CEX纯化步骤。图213示出用于实验A的使用专用缓冲液的SOP分步梯度。图237示出用于实验B的使用专用缓冲液的SOP分步梯度。
-AEX步骤-在下游加工SOP中执行AEX纯化步骤。图214示出用于实验A的60个柱体积(CV)的0至100％流动相B以及然后步进到10CV的100％MPC的SOP线性梯度。图238示出用于实验B的60个柱体积(CV)的0至100％流动相B以及然后步进到10CV的100％MPC的SOP线性梯度。
分析性运行：
-部分分离-50CV的0至35％流动相B，然后5 CV的35％至100％流动相B的线性梯度。如分析HPLC SOP中所指定执行部分分离方法。
-总分析-50CV的0至100％流动相B的线性梯度。如分析HPLC SOP中所指定执行总方法。
-空粒子/完整粒子-50个柱体积(CV)的0至40％流动相B，然后10CV的40％至100％流动相B的线性梯度。
总蛋白测定
在两次测定后测试样品的总蛋白浓度。根据缓冲液组成，使用BCA皮尔斯法(Pierce method)或布拉德福德法(Bradford method)。遵循制造商方案。
总DNA测定
对于样品中的总DNA定量，使用Quant-ITTM
Figure BPA0000305202160001371
测定。遵循制造商方案。
SDS-PAGE
根据制造商说明书(Bio-Rad)使用Mini-Protean II电泳槽(Bio-Rad)使用4-20％梯度凝胶在还原条件下进行SDS-PAGE。使用不连续的Tris-甘氨酸缓冲系统在200V下运行凝胶35分钟。通过Plus one银染试剂(GE Healthcare)使蛋白质条带显现。使用10-200kDa的分子量标准(Fermentas Life Sciences)。每次将20ul适当稀释的样品装载到孔中。
TEM
制备样品以使用负染色法使用TEM进行检查。将解冻的样品轻轻混合并施用在新鲜辉光放电的铜栅格(400目，碳涂覆的弗姆瓦)上5分钟，洗涤并用1微滴乙酸双氧铀的1％(w/v)水溶液染色。
用在80kV下操作的透射电子显微镜Philips CM 100(FEI，The Netherlands)观察栅格。彻底检查至少10个栅格，并拍摄若干显微照片(照相机ORIUS SC 200，Gatan，Inc.)以评价完整粒子与空粒子之间的比率。在栅格上的不同位置一致地拍摄显微照片。
ddPCR
用DNA酶处理样品(和对照)并一式两份地在三个点稀释(每个样品6个反应)。反应混合物：ddPCR Supermix for Probes(无dUTP)。反应体积：20uL，DNA体积5uL，微滴体积0.000739。所用设备：Bio-Rad QX100TM Droplet DigitalTM PCR系统、Bio-Rad QX200TMAutoDGTM Droplet DigitalTM PCR系统、Fluidigm Biomark HD。基于客户推荐使用的引物和探针。
使用大孔OH柱HPLC分析方法在疏水作用色谱(HIC)上进行的捕获步骤
制备性运行
将澄清的收获材料(8L，分装于1L瓶中)在室温下解冻过夜。第二天，将其合并，并使用蠕动泵以400mL/min的速度用稀释缓冲液以1∶1稀释(8L收获物+8L缓冲液)。使用系统泵以1CV/min装载到柱。技术转移运行是用于实验A的HIC条件的第二十五(25)次运行(HIC-25)。图215详述用于实验A的制备性运行条件。图216示出用于实验A的运行HIC-25的示例性色谱图。技术转移运行是用于实验B的HIC条件的第二十六(26)次运行(HIC-26)。图239详述用于实验B的制备性运行条件。图240示出来自用于实验B的运行HIC-26的示例性色谱图。
HPLC总分析
在HPLC上使用总粒子方法来测定色谱回收率。使用Amicon Ultra 0.5使级分脱盐。在注入前将主要洗脱液进一步稀释10倍。图217示出实验A的基于HPLC分析的示例性色谱图。从图217中，可以确认所有AAV都结合到柱，并且在级分W2、级分E1和级分W3中洗脱。当观察图片J(叠加图)时，可以看到与主要E1洗脱液相比，级分W2和级分W3两者都存在其他蛋白质杂质。还必须考虑到，与其他两种级分相比，级分E1是10倍稀释的，因此洗脱液周围的级分中载体的损失可忽略不计。比较负载面积峰和收获物面积峰的峰面积，以确定回收率。
图241示出实验B的基于HPLC分析的示例性色谱图。从图241中，可以确认所有AAV都结合到柱，并且在级分W2、级分E1和级分W3中洗脱。当观察图片J(叠加图)时，可以看到与主要E1洗脱液相比，级分W2和级分W3两者都存在其他蛋白质杂质。还必须考虑到，与其他两种级分相比，级分E1是10倍稀释的，因此洗脱液周围的级分中载体的损失可忽略不计。比较负载面积峰和收获物面积峰的峰面积，以确定回收率。
制备性运行的回收率
与起始澄清的收获材料相比，捕获步骤HIC-OH的回收率对于ddPCR和HPLC总分析分别为102％和68％。两种方法之间的差异主要是由样品中的高盐浓度引起，而且在两种情况下质量平衡都不是100％，因此两种方法的归一化将得到更准确的结果，其中在主要级分中AAV的平均回收率为80-90％。图218详述来自实验A的基于ddPCR和HPLC总分析的HIC-25运行的回收率。图242详述来自实验B的基于ddPCR和HPLC总分析的HIC-26运行的回收率。图219是用于实验A的HIC-25运行的代表性SDS-PAGE结果。M-阶梯。级分E1、级分W3和级分CIP分别是5倍稀释的、5倍稀释的和2倍稀释的。主要级分是E1。VP1-VP3蛋白由红色矩形标记。
SDS-PAGE
首先将所有级分脱盐并且然后在还原条件下以纯的或稀释的形式装载到凝胶中。图218示出AAV的浓缩并且成功捕获由用于实验A的澄清的收获材料实现。HIC步骤后的主要洗脱液具有许多蛋白质杂质，其通过下一个色谱步骤CEX-SO3去除。从HIC-25运行中得到SDS-PAGE结果。图242示出AAV的浓缩并且成功捕获由用于实验B的澄清的收获材料实现。HIC步骤后的主要洗脱液具有许多蛋白质杂质，其通过下一个色谱步骤CEX-SO3去除。从HIC-26运行得到SDS-PAGE结果。
使用大孔SO3柱在阳离子交换色谱(CEX)上进行的中间精制
制备性运行
准备来自HIC-OH的全部洗脱液(E1)以匹配结合条件，并将其装载到CEX-SO3柱。技术转移运行是用于实验A的CEX条件的第十六(16)次运行(SO3-16)。图220详述用于实验A的制备性运行条件。图221示出用于实验A的运行SO3-16的示例性色谱图。
技术转移运行是用于实验B的CEX条件的第十七(17)次运行(SO3-17)。图244详述用于实验B的制备性运行条件。图245示出用于实验B的运行SO3-17的示例性色谱图。
HPLC总分析
在HPLC上使用总粒子方法来测定色谱回收率。在注入前，级分是100倍稀释的(E1)或2.5倍稀释的(其他级分)。图222示出用于实验A的SO3-16的基于HPLC分析-总方法的示例性色谱图。从图222中，可以确认所有AAV都结合到柱，并且在级分E1和级分W3中洗脱。必须考虑到，相比之下，级分E1是100倍稀释的，并且W3是5倍稀释的，因此W3级分中载体的损失可忽略不计。比较负载和初始HIC-25 E1材料的峰面积，以确定回收率。图223详述用于实验A的制备性运行SO3-16的基于ddPCR和HPLC总分析的回收率。与起始HIC-28 E1材料相比，中间精制步骤CEX-SO3的回收率对于ddPCR和HPLC总分析分别为99％和87％。两种方法之间的差异较小。在HPLC分析的情况下，质量平衡不是100％。
图246示出用于实验B的SO3-17的基于HPLC分析-总方法的示例性色谱图。从图246中，可以确认所有AAV都结合到柱，并且在级分E1和级分W3中洗脱。必须考虑到，相比之下，级分E1是100倍稀释的，级分W3是5倍稀释的，因此W3级分中载体的损失可忽略不计。比较负载和初始HIC-26 E1材料的峰面积，以测定回收率。图247详述用于实验B的制备性运行SO3-17的基于ddPCR和HPLC总分析的回收率。与起始HIC-28 E1材料相比，中间精制步骤CEX-SO3的回收率对于ddPCR和HPLC总分析分别为99％和87％。两种方法之间的差异较小。在HPLC分析的情况下，质量平衡不是100％。
SDS-PAGE
将所有级分在还原条件下以纯的或稀释的形式装载到凝胶中。图224示出用于实验A的SO3-16运行的SDS-PAGE结果。图224描绘AAV的进一步浓缩，因为从HIC步骤到CEX步骤使用缩小10倍的柱大小。HIC步骤后的主要洗脱液具有除AAV病毒条带以外的其他蛋白质杂质。在洗涤液3中，有一小部分AAV条带可见。通过用CIP洗提去除大部分宿主细胞蛋白质。
图248示出用于实验B的SO3-17运行的SDS-PAGE结果。图248描绘AAV的进一步浓缩，因为从HIC步骤到CEX步骤使用缩小10倍的柱大小。HIC步骤后的主要洗脱液具有除AAV病毒条带以外的其他蛋白质杂质。在洗涤液3中，有一小部分AAV条带可见。通过用CIP洗提去除大部分宿主细胞蛋白质。
使用大孔QA柱在阴离子交换色谱(AEX)上分离空AAV衣壳和完整AAV衣壳
制备性运行
将来自SO3-16的全部洗脱液(E1)稀释以匹配结合条件，并装载到AEX-QA柱以用于实验A。技术转移运行是用于AEX条件的第十四(14)次运行(QA-14)。图225详述用于实验A的制备性运行条件。图226示出来自实验A的运行QA-14的示例性色谱图。
将来自SO3-17的全部洗脱液(E1)稀释以匹配结合条件，并装载到AEX-QA柱以用于实验B。技术转移运行是用于AEX条件的第十五(15)次运行(QA-15)。图249详述用于实验B的制备性运行条件。图250示出来自实验B的运行QA-15的示例性色谱图。
HPLC空粒子-完整粒子分析
在HPLC上使用空粒子-完整粒子方法以确定色谱回收率和纯度(E衣壳/F衣壳比率)。在注入前稀释级分。图227示出用于来自实验A的QA-14的基于HPLC分析-空粒子-完整粒子方法的示例性色谱图。从图227中，可以确认所有AAV都结合到柱，因为在FT+W级分中没有可见的峰。由于电荷的轻微差异，空衣壳开始首先洗脱出来(E2)，随后在E3中发现完整衣壳。A260/A280比率的差异确认AAV在空衣壳或完整衣壳中是纯的。A260/A280比率中0.6的值对应于主要具有蛋白质组成的空衣壳，其中具有DNA插入片段的完整衣壳根据纯度给出1.3和更高的值。单独收集级分E4，因为由于来自下一个洗脱峰的空衣壳污染而获得较低的纯度。E5级分主要具有空衣壳、聚集的衣壳和受损衣壳(两个峰)，在E6级分中没有AAV洗脱。比较负载和初始SO3-16 E1材料的峰面积，以确定回收率和纯度。
图251示出用于来自实验B的QA-15的基于HPLC分析-空粒子-完整粒子方法的示例性色谱图。从图251中，可以确认所有AAV都结合到柱，因为在FT+W级分中没有可见的峰。由于电荷的轻微差异，空衣壳开始首先洗脱出来(E2)，随后在E3中发现完整衣壳。A260/A280比率的差异确认AAV在空衣壳或完整衣壳中是纯的。A260/A280比率中0.6的值对应于主要具有蛋白质组成的空衣壳，其中具有DNA插入片段的完整衣壳根据纯度给出1.3和更高的值。单独收集级分E4，因为由于来自下一个洗脱峰的空衣壳污染而获得较低的纯度。E5级分主要具有空衣壳、聚集的衣壳和受损衣壳(两个峰)，在E6级分中没有AAV洗脱。比较负载和初始SO3-17 E1材料的峰面积，以确定回收率和纯度。
切向流过滤
通过对用于实验A的QA-14 E3样品实施TFF来实现浓缩和缓冲液交换。样品的最终体积为25mL(10mL样品+15mL系统滞留体积)。图228详述用于实验A的切向流过滤条件。
通过对用于实验B的QA-15 E3样品实施TFF来实现浓缩和缓冲液交换。样品的最终体积为35mL(10mL样品+25mL系统滞留体积)。图252详述用于实验B的切向流过滤条件。
制备性运行的回收率
对于实验A，与起始SO3-16 E1材料相比，完整衣壳富集步骤(空粒子和完整粒子分离)步骤AEX-QA的回收率对于ddPCR和HPLC总分析分别为73％和67％。两种方法之间的差异较小。在HPLC分析的情况下，并且ddPCR质量平衡不是100％。对于HPLC E/F分析，仅考虑A260面积和A280面积，因为由于DNA(插入片段)猝灭FLD信号，荧光给出对完整AAV衣壳回收率的较低反应。在TFF之后获得大约60-70％的回收率，这意味着如果将QA洗脱液与澄清的收获材料进行比较，则整个下游收率为43％或73％。图229详述用于实验A的制备性运行QA-14TFF和总DSP收率的基于ddPCR和HPLC E/F分析的回收率。
对于实验B，与起始SO3-17 E1材料相比，完整衣壳富集步骤(空粒子和完整粒子分离)步骤AEX-QA的回收率对于ddPCR和HPLC总分析分别为62％和64％。两种方法之间的差异较小。在HPLC分析的情况下，并且ddPCR质量平衡不是100％。对于HPLC E/F分析，仅考虑A260面积和A280面积，因为由于DNA(插入片段)猝灭FLD信号，荧光给出对完整AAV衣壳回收率的较低反应。在TFF之后获得大约70-80％的回收率，这意味着如果将QA洗脱液与澄清的收获材料进行比较，则整个下游收率为55％或82％。图253详述用于实验B的制备性运行QA-15TFF和总DSP收率的基于ddPCR和HPLC E/F分析的回收率。
纯度(空AAV衣壳与完整AAV衣壳之间的比率)
图230详述用于实验A的基于HPLC E/F分析的空AAV衣壳和完整AAV衣壳两者的纯度。图230表明如果考虑FLD，则主要E3级分的纯度(完整衣壳的百分比)为87％。由于两种吸收的消光系数未知，所以不能依赖于它们的信号；这使得FLD成为最可靠的值。所述比率在主峰洗脱液(级分E4)基底中发生剧烈改变，其中所述比率仅为55％。收集仅3.5 CV(大约80％峰)的原因是在E3中实现更高纯度并且仅有较少的载体损失(E4)(7％)。
图254详述用于实验B的基于HPLC E/F分析的空AAV衣壳和完整AAV衣壳两者的纯度。图254表明如果考虑MALS和FLD两者，则主要E3级分的纯度(完整衣壳的百分比)为90％。由于两种吸收的消光系数未知，所以不能依赖于它们的信号；这使得MALS成为最可靠的检测器，因为它测量粒子的直径。关于准确度，下一个是FLD检测器。所述比率在主峰洗脱液(级分E4)基底中发生剧烈改变，其中所述比率仅为60-70％。收集仅3.5 CV(大约80％峰)的原因是在E3中实现更高纯度并且仅有较少的载体损失(E4)(6％)。
对于实验A，另外通过TEM测试E2(空衣壳)和E3(完整衣壳)的纯度，然而对于完整衣壳，在评价在TFF之后不同阶段-QA-14 E3样品。样品TFF AAV8-RPGR FULLS含有不同种类的杂质，与仅含有受损粒子的小聚集体的样品QA-14 E2相反。两种样品中完整病毒和空病毒/受损病毒之间的比率相似，在样品TFF AAV8-RPGR FULLS中所述比率为62％并且在样品QA-14 E2中所述比率为65％。相对高的百分比代表未分类的粒子。来自此组的病毒在整个表面上不是电子透明的，而在表面上仅展示电子致密点。此类病毒可能是不完全完整的、未正确形成的或受损的。图231详述用于实验A的通过TEM评价的完整AAV和空AAV的比率。图232示出用于实验A的通过TEM评价的TFF后的QA-14 E3级分、QA-14 E2级分。
仅在TFF后的样品中发现丝状杂质，这后来被确认来源于未适当消毒的TFF。通过级分收集方法解释在空粒子峰中发现的大部分完整衣壳，其中延长E2级分直至吸光度交叉，其中完整粒子已经洗脱出来并因此污染空级分E2。
对于实验B，另外通过TEM来测试QA-15 E3(完整衣壳)和TFF后的样品(TT BBRPGR-FULLS)的纯度。样品TT BB AAV8-RPGR FULLS和QA-15 E3仅含有受损粒子的小聚集体。在两种样品中，一些聚集体还包括通常称为圆盘且最可能代表蛋白质的结构。在两种样品中，完整粒子占优势，但在栅格检查时，注意到样品QA-15 E3的未稀释样品与稀释样品之间的差异。单独对稀释样品和未稀释样品的粒子进行计数并计算。提出仅考虑来自未稀释样品的计算。样品TT BB AAV8-RPGR FULLS含有76％的完整粒子，并且样品QA-15 E3含有84％的完整粒子。图255详述用于实验B的通过TEM评价的完整AAV和空AAV的比率。图256示出用于实验B的通过TEM评价的TFF后的QA-15 E3级分、QA-14 E2级分。
SDS-PAGE
将所有级分在还原条件下以纯的或稀释的形式装载到凝胶中。图233示出来自实验A的QA-14运行的SDS-PAGE结果。图233描绘从E2至E6的所有级分都含有AAV。存在于E3级分和E4级分中的高于200kDa标记的蛋白质条带对应于仅在完整衣壳中发现的DNA插入片段，表示仅这两个级分含有完整衣壳，补充了HPLC E/F分析结果。在E3级分中发现除VP1-VP3之外的其他蛋白质杂质。通过TFF部分地去除这些杂质(AAV8 FULLS)，但是其他蛋白质仍然存在，同样通过TEM确认。由于TFF系统的消毒不充分，存在额外蛋白质条带。
图257示出来自实验B的QA-15运行的SDS-PAGE结果。图257描绘从E2至E6的所有级分都含有AAV。存在于E3级分和E4级分中的高于200kDa标记的蛋白质条带对应于仅在完整衣壳中发现的DNA插入片段，表示仅这两个级分含有完整衣壳，补充了HPLC E/F分析结果。在E3级分中发现除VP1-VP3之外的其他蛋白质杂质。通过TFF部分地去除这些杂质(AAV8FULLS)。
HPLC分析-部分分离方法
图258示出使用用于实验B的部分分离方法得到的示例性色谱图。从图258中，可以观察到大部分杂质通过HIC步骤去除(图片A)。样品纯度不足以实现空衣壳和完整衣壳的分离，因此对CEX-SO3执行额外精制。来自此阶段的洗脱液主要是纯的且高度浓缩的，但是仍然由空衣壳和完整衣壳两者组成。最后的AEX-QA步骤分离这两种衣壳，并且因此分离并富集完整衣壳。通过比较收获材料与QA主要级分，可以从起始材料中鉴定出AAV峰。
结论
使用澄清的收获物作为起始材料执行无缝的下游纯化运行。通过HIC-OH步骤实现AAV的捕获和浓缩，其中在流过液中发现蛋白质，并且AAV结合到柱。去除W2级分或W3级分中的蛋白质杂质。
HIC步骤后，大部分蛋白质杂质仍存在于主要洗脱级分(E1)中。通过中间精制步骤使用CEX-SO3柱去除大部分蛋白质杂质，其中通过实施缩小10倍的柱规模来实现AAV的额外浓缩。此阶段的完整衣壳的百分比对于实验A为大约55％并且对于实、验B为大约34％，因此使用AEX-QA执行完整粒子富集。
在将完整衣壳与空衣壳分离后，使用TFF执行缓冲液交换成制剂缓冲液。对于实验A，从澄清收获物到TFF完成的整个下游过程的收率为43％，并且从澄清收获物到QA完整粒子富集步骤完成的整个下游过程的收率为73％。对于实验B，从澄清收获物到TFF完成的整个下游过程的收率为55％，并且从澄清收获物到QA完整粒子富集步骤完成的整个下游过程的收率为82％。
实施例7：ABCA4纯化过程相容性研究
本公开提供用于斯塔加特(ABCA4)晚期临床和商业程序的工业色谱下游过程(DSP)。项目包括所有开发的步骤，即捕获、中间精制和使用大孔OH、SO3和QA柱分离空-完整(E/F)AAV8衣壳以及切向流过滤(TFF)。
对ABACA4载体执行相容性研究，其中使用代用载体。所述代用载体具有与ABCA4载体相同的衣壳(AAV8/Y733F)。所述衣壳是载体在HIC步骤和SO3步骤中的行为的决定因素。图259详述HIC(OH)色谱条件。图260示出如通过HPLC总粒子分析测量的示例性HIC(OH)色谱图和载体回收率分析。
图261详述CEX(SO3)色谱条件。图262示出CEX(SO3)示例性色谱图和载体回收率分析。
包装的基因组是包含斑萎蛋白(Bestrophin)-1基因(其小于ABCA4基因并且不需要双载体，允许对载体本身进行概念证明研究)的构建体。包装的基因组对QA步骤的行为有影响。此步骤采用线性梯度，因此预期当使用ABCA4转基因时，QA步骤的操作条件没有变化。图263详述AEX(QA)色谱条件。图264示出QA级分中空粒子和完整粒子的示例性色谱图和载体回收率分析。
通过FLD和MALS检测器给出纯度(E/F)比率的最佳呈现。通过QA步骤实现从大约55％至94％的完整AAV粒子富集。图265详述基于HPLC分析的(完整∶空)粒子的纯度。图266示出基于TEM的纯度(完整粒子∶空粒子)。图267示出通过SDS-PAGE分析得到的纯度。
实施例8：用于AAV-ABCA4生产的下游过程
AAV-ABCA4载体的下游过程集中在使用三种不同化学的整料色谱柱，其形成用于AAV载体纯化的有效和稳健的解决方案的基础。由于其允许配体-靶相互作用以不依赖于扩散的方式发生的大流动通道，整料尤其适于纯化例如病毒载体的大分子。
纯化组列中的第一单元操作是以结合和洗脱模式操作的疏水作用色谱(HIC)捕获步骤。为了促进载体与柱结合，必须通过用高摩尔浓度储备溶液稀释进料流来增加盐析剂的浓度。通过分步改变到较低摩尔浓度盐缓冲液来实现产物洗脱。
HIC步骤后，需要进一步调节进料流以使载体结合带负电荷的强阳离子交换(CEXSO3)柱。调节缓冲液使AAV载体质子化并降低抗衡离子浓度，从而允许载体与带负电荷的配体结合。在进料调节后执行过滤步骤，以去除任何微粒并保持SO3色谱柱的有效性。也以结合和洗脱模式操作SO3步骤，其中洗脱在盐浓度的分步增加下进行。
通过利用存在于完整粒子和空粒子之间的微小电荷变化来实现完整AAV粒子的富集。利用强阴离子交换色谱(AEX QA)柱进行线性盐梯度洗脱，允许在完整物质与空物质之间有足够的解析率。如同所有其他单元操作一样，需要调节进料以允许载体结合到色谱支撑物。
使用100kDa的TFF mPES膜实现最终的载体浓缩和渗滤。将产物渗滤到最终的制剂缓冲液(20mM Tris pH 8.0、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.001％泊洛沙姆188)中。在最终配制前，使用qPCR方法分析过程中样品的载体回收率，以确定载体滴度和DNA酶抗性粒子(DRP)的收率。此数据用于估计实现最终目标滴度所需的最终体积。将赋形剂泊洛沙姆188手动添加到过程流中，达到0.001％(v/v)最终浓度。在最终配制后，最终通过0.22μm过滤器无菌过滤产物，得到纯化的散装原料药(PBDS)。填充PBDS来完成所述过程并产生最终药物产品(FDP)。对PBDS和FDP两者进行释放测试。
下游制造过程描述
疏水作用色谱捕获步骤
使用疏水作用色谱柱执行澄清的收获材料的捕获步骤。为了确保载体结合到疏水支撑物，需要增加摩尔浓度，并且通过添加2.6M磷酸钾、2％山梨糖醇，pH 7掺料缓冲液来实现。通过将稀释缓冲液添加到澄清的收获物中执行1∶1体积添加，同时充分搅动所得溶液。
使用OH整料柱(2μm孔)作为此单元步骤的色谱单元。在使用前对柱执行脉冲测试，以确保柱的完整性没有受到损害。
在柱饱和且平衡后，将产物装载到整料上。执行两次洗涤以降低摩尔浓度，之后使用等度变化到较低摩尔浓度的盐缓冲液(0.73M磷酸钾、1％山梨糖醇、pH 7)来实现产物洗脱。
在正向加工(待确定储存期的限制)前，可以将洗脱液在2-8℃下储存过夜。
图268示出与HIC色谱单元操作相关的过程流程。图269示出将用于HIC捕获步骤的参数和相关操作范围或设定点。图270示出色谱程序中特别需要的步骤。
图271示出代表性色谱图，其示出典型的完整色谱HIC图谱。图272示出代表性色谱图，其通过放大来更清楚地提供洗涤、洗脱和CIP阶段。
图273示出对应于图270中列出的阶段的缓冲液的详情。图274示出将在HIC色谱步骤中使用的关键材料和消耗品的详情。
阳离子交换色谱法
基于阳离子交换的中间精制色谱步骤进一步减少过程杂质。来自HIC步骤的洗脱液需要进行调节，以允许载体结合到带负电荷的配体。调节的第一部分需要降低过程流的pH，所述pH需要低于等电点(pI)，从而赋予载体总体正表面电荷。稀释步骤也降低负载的电导率，从而降低溶液中来自抗衡离子的竞争性结合。在调节过程流后，执行过滤步骤(0.8/0.45μm组合过滤器)，以去除任何微粒并保持SO3色谱柱的有效性。添加中和缓冲液以使pH恢复到接近生理水平。在正向加工(待确定储存期的限制)前，可以将洗脱液在2-8℃下储存过夜。图275概述执行SO3色谱单元操作所需的步骤。
使用SO3整料柱(2μm孔)作为此单元步骤的色谱单元。在使用前对柱执行脉冲测试，以确保柱的完整性没有受到损害。图275示出SO3色谱单元操作的流程图。图276和图277详述用于SO3色谱步骤的参数和操作范围/设定点。
图278示出代表性的典型完整色谱图。图279示出对装载后活性物，即柱洗涤、洗脱和CIP步骤的关注。图280示出用于此步骤的缓冲液的详情。图281示出在离心浓缩步骤中使用的示例性材料和消耗品的详情。
QA色谱步骤
通过利用存在于完整粒子和空粒子之间的微小电荷变化来实现完整AAV粒子的富集。利用阴离子交换色谱柱进行线性梯度洗脱，允许在完整物质与空物质之间有足够的解析率，这容许使用峰切割方法。由于存在最小的电荷变化，分步洗脱将不形成稳健分离操作的基础。需要可以准确地且可再现地形成梯度以及能够监测UV吸收信号的生物处理系统，以允许有效地形成并监测洗脱曲线。添加中和缓冲液以使pH恢复到接近生理水平。在正向加工(待确定储存期的限制)前，可以将洗脱液在2-8℃下储存过夜。
使用QA整料柱(2μm孔)作为此单元步骤的色谱单元。在使用前对柱执行脉冲测试，以确保柱的完整性没有受到损害。图282示出QA色谱单元操作的流程图。图283示出将用于QA色谱步骤的参数和相关操作范围和设定点。图284示出与色谱运行相关的具体步骤。图285和图286示出代表性色谱图(分别为完全洗脱和梯度洗脱)。
已使用A260波长和A280波长开发洗脱收集标准。在A260迹线与A280迹线的交叉点启动收集开始，其对应于E3级分。注意：为了使所述标准有意义，需要以相同标度表示A260波长和A280波长。在收集开始后3.5 CV时发生峰收集结束。实现相同目标但使用不同方法的收集标准是可接受的；这将是仅能监测一个波长的情况。图287示出QA缓冲条件和目标规格。图288示出在QA色谱单元操作中使用的关键性材料/消耗品。
切向流过滤和赋形剂添加
使用100kDa的TFF mPES膜实现最终载体配制。在最终配制前，使用qPCR方法分析过程中样品的载体回收率，以确定载体滴度和DNA酶抗性粒子(DRP)的收率。此数据用于估计实现最终目标滴度所需的最终体积。将产物渗滤到最终的制剂缓冲液(20mM Tris pH8.0、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.001％泊洛沙姆188)中。图289示出完成切向流过滤步骤所需的步骤的图解概述。图290示出用于切向流过滤步骤的参数和操作范围。图291示出将在切向流过滤单元操作中使用的关键材料和消耗品的详情。
过程中保持条件
图292示出已在AAV产物的过程开发期间使用的过程中点的保持时间的详情。
实施例9：ABCA4纯化过程优化
代用载体
将代用载体用于相容性研究。所述代用载体具有与ABCA4载体相同的衣壳(AAV8/Y773F)。所述衣壳是载体在HIC步骤和SO3步骤中的行为的决定因素。包装的基因组对QA步骤的行为有影响。所用的示例性包装的基因组是野生型斑萎蛋白-1，因为其尺寸小，然而，此步骤使用线性梯度并且因此预期当使用例如ABCA4转基因或其他类似尺寸的转基因时，QA步骤的操作条件没有变化。
HIC捕获步骤的优化
已执行ABCA4载体的色谱过程的优化。对用于HIC过程的洗涤缓冲液和用于CEX过程的洗脱缓冲液进行改变。图323详述通过使用梯度洗脱运行优化的HIC步骤参数，并且示出示例性HIC色谱图。优化的峰切割注释是1.02M缓冲液。未优化的峰切割注释是1.08M缓冲液。将装载后洗涤2缓冲液(W2)从1.08M磷酸钾、1％山梨糖醇pH 7.0调节至1.02M磷酸钾、1％山梨糖醇pH 7.0。装载后W2缓冲液的摩尔浓度降低减少了过程相关杂质被带入到洗脱级分。所有其他操作参数都保持恒定。在具体实施方案中，用于RPGR载体的HIC洗涤缓冲液是1.08M K2HPO4+KH2PO4+1％山梨糖醇pH 7.0，并且用于ABCA4载体的HIC洗涤缓冲液是1.02M K2HPO4+KH2PO4+1％山梨糖醇pH 7.0。
CEX步骤的优化
通过使用梯度洗脱运行来优化CEX步骤。图324示出使用优化的洗脱缓冲液(E1)进行的CEX运行的示例性色谱图。优化的峰切割注释是1.33M缓冲液，并且未优化的峰切割注释是1.3M缓冲液。将E1缓冲液由50mM乙酸盐、1.3M NaCL、0.1％泊洛沙姆188pH 3.6改变成50mM乙酸盐、1.33M NaCl、0.1％泊洛沙姆188pH 3.6。E1的摩尔浓度增加改善了CEX步骤的步骤回收率。在具体实施方案中，用于RPGR的CEX洗脱缓冲液是0.05M乙酸盐+1.3M NaCl+0.1％泊洛沙姆188pH 3.6±0.05，并且用于ABCA4载体的CEX洗脱缓冲液是0.05M乙酸盐+1.33M NaCl+0.1％泊洛沙姆188pH 3.6±0.05。
图325示出通过使用优化的HIC色谱步骤和CEX色谱步骤两者运行的示例性优化条件。使用野生型BEST-1的示例性包装的基因组(这是由于其尺寸小)运行示例性QA色谱图。图326详述每次洗脱的步骤回收率。图327A详述通过MALS得到的QA分离步骤的完整载体：空载体结果。图327B详述通过MALS和TEM得到的QA分离步骤的完整载体∶空载体结果。
实施例10：转染条件对AAV产物质量的影响
此项目的目的在于鉴定产生高质量AAV产物的转染条件。使用聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂
Figure BPA0000305202160001481
(Polyplus Transfection)使用各种比率的质粒DNA(即，编码包含RPGRORF15序列(ITR)的AAV构建体的质粒、编码AAV8rep和cap基因的质粒(RepCap)和pHelper质粒)转染HEK293细胞。将质粒
Figure BPA0000305202160001482
混合物添加到细胞中，将其在37℃，5％CO2下孵育96小时，之后收获，并且评价所得AAV病毒粒子。评价四种转染条件，并且对每种条件定量载体粒子的数目(衣壳ELISA)和含有基因组插入片段的粒子的数目(基因组滴度)。图328A示出测试的转染条件，包括评价的PEI∶DNA(mL∶mg)比率和质粒摩尔比。图328B示出定量由衣壳ELISA的比率和基因组滴度结果推导的完整粒子百分比的图表，所述结果被计算出来并突出显示各种条件之间的差异。图328C和图328D分别示出如图323A所示的由转染条件1、2、3和4产生的基因组滴度(GC/mL)和衣壳ELISA(粒子/mL)的定量值的图表。
正交的完整粒子与空粒子定量
据信图328(A-D)中的完整粒子分析低估了实际值，然而，趋势是有效的。因此，通过正交法测量来自这四种条件的样品(图328B)。图329A示出如使用正交法测量的完整粒子与空粒子的定量的代表性图表。图329B示出实验条件和结果的表。结果反映图328(A-D)中的趋势。与使用不同转染试剂(CaPO4)生成的材料的早期结果的比较表明，转染剂的选择也可能对完整粒子∶空粒子比率具有影响，并且使用PEI产生更高百分比的完整粒子，这可以通过使用三种质粒的摩尔比(其中与Rep-Cap或pHelp质粒相比，存在更高的ITR相对量)和/或使用4∶1或更低(例如2∶1)的PEI∶DNA(mL∶mg)比率来增强。
转染剂(PEI相对CaPO4)对完整AAV与空AAV比率的影响
进行PEI相对CaPO4比较转染研究，以确定哪种试剂产生优异的产物。使用由PEI转染或CaPO4生成的材料，以通过HPLC定量完整载体与空载体比率。所述材料没有经过将富集完整粒子的过程步骤。前述可变条件在这两种转染条件之间保持恒定，所述可变条件包括总DNA、PEI/DNA比率和转染质粒比率。图330示出代表性图表，其示出如通过FLD(每种试剂的左侧条)或MALS(每种试剂的右侧条)所测量的作为CaPO4相对PEI转染的函数的完整载体粒子(％)分析的比较。来自此并排研究的结果进一步表明，代替CaPO4，使用PEI作为转染剂产生更高比率的完整载体粒子。
实施例11：用于AAV8-ABCA4生产的下游过程
项目的目的在于开发用于rAAV/Y733F ABCA4晚期临床和商业程序的工业色谱下游过程(DSP)。项目包括所有开发的步骤，即捕获、中间精制和使用大孔OH、SO3和QA柱分离空-完整(E/F)AAV8衣壳以及通过渗析实现的缓冲液交换。基于粗收获材料进行开发，其中PEI用作转染剂。
材料和方法
样品
对样品进行BerzonaseTM处理并将其在DMEM培养基中配制。样品是具有与ABCA4载体相同的衣壳(AAV8/Y733F)的ABCA4代用载体。运送的体积为4L，滴度为2.24E+10vp/mL，并且总载体为8.96+13个载体基因组(Vg)。
FPLC系统(制备性运行)
FPLC 1：
-GE Healthcare Akta Explorer 100，UV流动池2mm
-0.75mm内径的毛细管(与8mL柱和1mL柱一起使用)
-样品装载：经由系统泵装载
-检测：UV 280nm、UV 260nm、电导率、pH
HPLC系统(分析性运行)
HPLC 1：
-PATfixTM，10mL泵头，0.25mm内径的毛细管
-样品装载：500μL样品环
-检测：UV 280nm、UV 260nm、荧光280/348(FLU，FLD)、电导率、MALS
-流速：1-2mL/min
整料固定相
分析性运行(2个柱)：
-大孔Adeno-0.1
-大孔SO3-0.1
制备性运行(3个柱)：
-大孔OH-80
-大孔SO3-1
-大孔QA-1
缓冲液
在新鲜的纯化水中制备缓冲液，并通过0.22μm过滤器过滤。图336示出用于制备性运行和分析性运行的缓冲液。
色谱方法
制备性运行：
-HIC步骤-使用如图337中所示的分步梯度和专用缓冲液执行HIC纯化步骤。
-CEX步骤-使用如图338中所示的分步梯度和专用缓冲液执行CEX纯化步骤。
-AEX步骤-使用60个柱体积(CV)的0至100％流动相B以及然后步进到10CV的100％MPC的线性梯度执行AEX纯化步骤，如图339中所示。
分析性运行：
-指纹-50CV的0至35％流动相B，然后5 CV的35％至100％流动相B的线性梯度；使用CIMacTM Adeno-0.1柱。
-总分析-50CV的0至100％流动相B的线性梯度；使用CIMacTM SO3-0.1柱。
-空粒子/完整粒子-50个柱体积(CV)的0至40％流动相B，然后10CV的40％至100％流动相B的线性梯度；使用CIMacTM Adeno-0.1柱。
SDS-PAGE
根据制造商说明书(Bio-Rad)使用Mini-Protean II电泳槽(Bio-Rad)使用4-20％梯度凝胶在还原条件下进行SDS-PAGE。使用不连续的Tris-甘氨酸缓冲系统在200V下运行凝胶35分钟。通过Plus one银染试剂(GE Healthcare)使蛋白质条带显现。使用10-200kDa的分子量标准(PageRulerTM Unstained，thermos Fisher Scientific)。每次将20ul适当稀释的样品装载到孔中。
TEM
制备样品以使用负染色法使用TEM进行检查。将解冻的样品轻轻混合并施用在新鲜辉光放电的铜栅格(400目，碳涂覆的弗姆瓦)上5分钟，洗涤并用1微滴乙酸双氧铀的1％(w/v)水溶液染色。
用在80kV下操作的透射电子显微镜Philips CM 100(FEI，The Netherlands)观察栅格。彻底检查至少10个栅格，并拍摄若干显微照片(照相机ORIUS SC 200，Gatan，Inc.)以评价完整粒子与空粒子之间的比率。在栅格上的不同位置一致地拍摄显微照片。
ddPCR
用DNA酶处理样品(和对照)并一式两份地在三个点稀释(每个样品6个反应)。反应混合物：ddPCR Supermix for Probes(无dUTP)。反应体积：20uL，DNA体积5uL，微滴体积0.000739。所用设备：Bio-Rad QX100TM Droplet DigitalTM PCR系统、Bio-Rad QX200TMAutoDGTM Droplet DigitalTM PCR系统、Fluidigm Biomark HD。基于所检测的靶来确定所用的引物和探针。
结果和讨论
使用大孔OH柱HPLC分析方法在疏水作用色谱(HIC)上进行的捕获步骤
制备性运行
将澄清的收获材料(1.2L，分到两个瓶中，每瓶含0.6L)在室温下解冻，合并，并用稀释缓冲液1∶1稀释(1.2L收获物+1.2L缓冲液)。使用系统泵以5 CV/min装载到柱。运行是HIC条件的第八(8)次运行(HIC-8)。图340详述制备性运行条件。图341A和图341B示出来自运行HIC-8的色谱图。
HPLC总分析
在HPLC上使用总粒子方法来测定色谱回收率。使用Amicon Ultra 0.5使级分脱盐。在注入前将主要洗脱液进一步稀释10倍。图342A至图342J示出基于HPLC分析的示例性色谱图。从图342J中，确认所有AAV都结合到柱，并且在级分W2、级分E1和级分W3中洗脱。当观察图342J(叠加图)时，观察到与主要的E1洗脱液相比，级分W2和级分W3两者都存在其他蛋白质杂质。必须考虑到，与其他两种级分相比，级分E1是10倍稀释的，因此洗脱液周围的级分中载体的损失可忽略不计。比较负载面积峰和收获物面积峰的峰面积，以确定回收率。
制备性运行的回收率
与起始澄清的收获材料相比，捕获步骤HIC-OH的回收率对于ddPCR和HPLC总分析(MALS)分别为76％和71％。在其他检测器(A260、A280、FLD)中的其他方法之间的差异主要由样品中的高盐浓度引起，此外，在两种情况下质量平衡都不是100％，因此两者(ddPCR和HPLC总分析(MALS))的归一化将得到更准确的结果，其中在主要级分中AAV的平均回收率为72％±2％。图343详述基于ddPCR和HPLC总分析的HIC-8运行的回收率。图344是用于HIC-8运行的代表性SDS-PAGE结果。图344描绘AAV的浓缩并且成功捕获由澄清的收获材料实现。HIC步骤后的主要洗脱液是高度浓缩的，但具有许多蛋白质杂质，这些杂质通过下一个色谱步骤CEX-SO3去除。
使用SO3柱在阳离子交换色谱(CEX)上进行的中间精制
制备来自HIC-OH的全部洗脱液(E1)以匹配结合条件，并将其装载到CEX-SO3柱(SO3-7)。图345提供关于运行参数的详情。图346A和图346B提供来自运行S03-7的色谱图。图347A至图347J提供用于SO3-7的基于HPLC分析-总方法的色谱图。从图347A至图347J中，可以确认所有AAV都结合到柱，并且在级分E1和级分W3中洗脱。必须考虑到，与级分W3相比，级分E1是5倍稀释的，因此W3中载体的损失可忽略不计。比较负载和初始HIC-8 R1材料的峰面积，以确定回收率。图348提供用于制备性运行SO3-7的基于ddPCR和HPLC总分析的回收率。与起始HIC-8 E1材料相比，中间精制步骤CEX-SO3的回收率对于ddPCR和HPLC总分析(MALS)分别为90％和86％。两种方法之间的差异较小。在HPLC分析的情况下，质量平衡不是100％。两个(ddPCR和HPLC总分析(MALS)的归一化得到更准确的值，主要级分中AAV的平均回收率为97％。
HPLC总分析
在HPLC上使用总粒子方法来测定色谱回收率。在注入前将级分E1稀释5倍。
SDS-PAGE
将所有级分在还原条件下以纯的或稀释的形式装载到凝胶中。图349描绘AAV的进一步浓缩，因为从HIC步骤到CEX步骤使用缩小8倍的柱大小。HIC步骤后的主要洗脱液具有除来自HIC步骤至CEX步骤的杂质以外存在的其他蛋白质杂质。在洗涤液3中，有一小部分AAV条带可见。通过用CIP洗提去除大部分宿主细胞蛋白质。
使用CIM QA柱在阴离子交换色谱(AEX)上分离空AAV衣壳和完整AAV衣壳
制备性运行
将来自SO3-7的全部洗脱液(E1)稀释以匹配结合条件并且将其装载到AEX-QA柱。运行是AEX条件的第三(3)次运行(QA-3)。图350详述制备性运行条件。图351A和图351B示出来自运行SO3-7的示例性色谱图。
HPLC总分析
在HPLC上使用空粒子-完整粒子方法以确定色谱回收率和纯度(E.F衣壳比率)。在注入前稀释级分。图352A至图352H显示出用于SO3-7的基于HPLC分析-总方法的示例性色谱图。从图352A至图352H中，可以确认所有AAV都结合到柱，因为在FT+W级分中没有可见的峰。由于电荷的轻微差异，空衣壳开始首先洗脱出来(E2)，随后在E3中发现完整衣壳。A260/A280比率的差异确认AAV在空衣壳或完整衣壳中是纯的。A260/A280比率中0.6的值对应于主要具有蛋白质组成的空衣壳，其中具有DNA插入片段的完整衣壳根据纯度给出1.3和更高的值。单独收集级分E4，因为由于来自下一个洗脱峰的空衣壳污染而获得较低的纯度。E5级分主要具有空衣壳、聚集的衣壳和受损衣壳(两个峰)，在E6级分中没有AAV洗脱。比较负载和初始SO3-7 E1材料的峰面积，以确定回收率和纯度。
渗析
通过对QA-3 E3样品实施渗析来实现缓冲液交换。渗析方法的详情提供在图353中。样品的最终体积为3mL。
制备性运行的回收率
制备性运行的回收率汇总在图354A至图354C中。与起始SO3-7 E1材料相比，完整衣壳富集步骤(空衣壳和完整衣壳分离)步骤AEX-QA的回收率对于ddPCR为72％，并且对于基于MALS检测的HPLC总分析为61％(图354A)。在两种情况(ddPCR和HPLC分析)下，质量平衡都没有达到100％。如果对于相应检测器/测定，将主要级分的百分比归一化为质量平衡百分比，则获得83％±3％的值。渗析后获得大约61％的回收率(不考虑样品损失(0.66mL))。
仅基于初始体积和最终体积及其基因组值，获得28％(渗析后)或45％(QA主要级分)的DSP收率，然而，必须考虑到，在每个纯化步骤后主要级分的取样对最终体积低的较小规模的总回收率具有显著影响。通过考虑每个纯化步骤后的损失来获得DSP收率的更准确呈现。通过考虑归一化值(图354C)，在色谱步骤后总DSP收率达到大约58％，并且渗析后总DSP收率达到大约42％。
纯度
图355表明如果考虑MALS和FLD两者，主要E3级分的纯度(完整衣壳的百分比)为大约100％。由于两种吸收的消光系数未知，这使得MALS成为更可靠的检测器，因为它测量粒子的直径。关于准确度，下一个是FLD。所述比率在平均峰洗脱液(级分E4)基底中发生改变，其中所述比率仅为80-83％。收集仅3.5 CV(大约80％峰)的原因是在E3中实现更高纯度并且仅有较少载体损失(E4)(11％-图354A至图354C)。
对于SO3中间步骤后QA-3 E3(完整衣壳)和渗析后的最终样品(FULL AAV)的比率，另外通过TEM测试纯度。表示用于观察和所有三个样品SO3-7 E1、FULL AAV和QA-3E3的适当质量的所有栅格都是透明的，没有杂质且没有粒子聚集。样品SO3-7 E1仅含有50％的完整粒子，而其他两个样品中完整粒子的百分比更高(在样品FULL AAV中为79％并且在样品QA-3 E3中为88％；图356)。图357示出：通过TEM评价的SO3-7 E1(上图；A和B)、QA-3 E3(中图；C和D)和渗析后(下图；E和F)。左(A、C和E)：低放大倍数，右(B、D和F)：用于计数的放大倍数。
SDS-PAGE
将所有级分在还原条件下以纯的或稀释的形式装载到凝胶中。图358描绘从E2至E5的所有级分都含有AAV。存在于E3级分和E4级分中的高于200kDa标记的蛋白质条带对应于仅在完整衣壳中发现的DNA插入片段，这表明这两个级分都含有完整衣壳，补充了HPLCE/F分析结果。在E3级分中发现除VP1-VP3之外的其他蛋白质杂质。通过渗析(AAV8-PD)没有去除那些杂质，然而，在使用具有100kDa MWCO的TFE的较高规模上，预期成功地去除额外条带。
HPLC分析-指纹法
图359A和图359B显示通过HIC步骤去除大部分杂质(图359A)。通过在CEX-SO3上精制来进一步纯化样品。来自此阶段的洗脱液主要是纯的且高度浓缩的，但是仍然由空衣壳和完整衣壳两者组成。最后的AEX-QA步骤分离这两种衣壳，并且因此分离并富集完整衣壳。通过比较收获物和QA主要级分，鉴定来自起始材料的AAV峰。
结论
使用澄清的收获物作为起始材料执行下游纯化运行。
通过HIC-OH步骤实现AAV的捕获和浓缩，其中在流过液中发现蛋白质，并且AAV结合到柱。去除W2级分或W3级分中的蛋白质杂质。通过使用CEX-SO3柱进行中间精制步骤来去除在HIC步骤后保留在主要洗脱级分(E1)中的大部分蛋白质杂质，其中通过实施缩小8倍的柱规模来实现AAV的额外浓缩。在此状态下完整衣壳的百分比为大约50-65％，因此使用AEX-QA执行完整粒子富集。在将完整衣壳与空衣壳分离后，使用渗析执行缓冲液交换成制剂缓冲液。从澄清的收获物到渗析完成的整个下游过程收率为42％(色谱步骤后为58％)，并且达到大约90％完整AAV衣壳的纯度。所述过程在制造规模上成功地执行。
以引用的方式并入
除非明确排除或另外限制，否则本文引用的每个文件(包括任何交叉引用或相关专利或申请)均据此以引用的方式整体并入本文。任何文件的引用都不是承认其是本文公开或要求保护的任何发明的现有技术，或者承认其单独地或与任何其他一种或多种参考文件的任何组合地教导、建议或公开任何此类发明。此外，当本文件中术语的任何含义或定义与以引入方式并入的文件中术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本文件中赋予该术语的含义或定义。
其他实施方案
尽管已经说明并描述了本公开的具体实施方案，但在不背离本公开的精神和范围的情况下可以作出许多其他改变和修改。所附权利要求书的范围包括在本公开的范围内的所有此类改变和修改。
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Claims (161)

1.一种从哺乳动物宿主细胞培养物纯化重组AAV(rAAV)粒子的方法，其包括以下步骤：
(a)通过疏水作用色谱法(HIC)纯化所述多个rAAV粒子，以产生包含所述多个rAAV粒子的HIC洗脱液；
(b)通过阳离子交换色谱法(CEX)纯化(a)的所述HIC洗脱液，以产生包含多个rAAV粒子的CEX洗脱液；
(c)通过阴离子交换(AEX)色谱法从(b)的所述CEX洗脱液中分离多个完整rAAV粒子，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的AEX洗脱液；和
(d)通过切向流过滤(TFF)渗滤并浓缩来自(c)的所述AEX洗脱液至制剂缓冲液中，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子和最终制剂缓冲液的最终组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
在适用于将所述多个rAAV粒子释放到收获培养基中的条件下，使多个转染的哺乳动物宿主细胞与病毒释放溶液接触，以产生包含多个rAAV粒子、病毒释放溶液和收获培养基的组合物；和
通过疏水作用色谱法(HIC)从所述组合物纯化所述多个rAAV粒子，以产生包含所述多个rAAV粒子的HIC洗脱液。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
在适用于形成多个rAAV粒子的条件下在收获培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞，其中在所述接触步骤之前，所述多个哺乳动物宿主细胞已用包含外源性序列的质粒载体、辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体转染，以产生多个转染的哺乳动物宿主细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述收获培养基包含杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、稳定的谷氨酰胺、稳定的谷氨酰胺二肽和Benzonase中的一种或多种。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述收获培养基包含甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐脱水物、L-缬氨酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、i-肌醇、氯化钙(CaCl2)(无水)、硝酸铁(Fe(NO3)3″9H2O)、硫酸镁(MgSO4)(无水)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)和D-葡萄糖(右旋糖)。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述收获培养基包含4mM稳定的谷氨酰胺或稳定的谷氨酰胺二肽。
7.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述收获培养基包含无血清培养基。
8.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述收获培养基由无血清培养基组成。
9.如权利要求3至8中任一项所述的方法，其中所述收获培养基包含无蛋白培养基。
10.如权利要求3至8中任一项所述的方法，其中所述收获培养基由无蛋白培养基组成。
11.如权利要求3至10中任一项所述的方法，其中所述收获培养基包含澄清培养基。
12.如权利要求3至10中任一项所述的方法，其中所述收获培养基由澄清培养基组成。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述外源性序列包含：
(a)编码视紫红质激酶启动子的序列；
(b)编码色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)的序列；和
(c)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述视紫红质激酶启动子为GRK1启动子。
15.如权利要求14所述的方法，其中编码所述GRK1启动子的所述序列包含以下序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000031
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中编码所述RPGRORF15的所述序列为密码子优化的人RPGRORF15序列。
17.如权利要求16所述的方法，其中编码RPGRORF15的所述序列包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：
Figure FPA0000305202150000032
18.如权利要求16或17所述的方法，其中编码RPGRORF15的所述序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000041
19.如权利要求13至18中任一项所述的方法，其中编码所述polyA信号的所述序列包含牛生长激素(BGH)polyA序列。
20.如权利要求19所述的方法，其中编码所述BGH polyA信号的所述序列包含以下核苷酸序列：
Figure FPA0000305202150000051
21.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述外源性序列包含编码ATP结合盒亚家族成员4(ABCA4)蛋白或其一部分的序列。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述外源性序列包含编码ABCA4蛋白或其一部分的5′序列。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述外源性序列包含编码ABCA4蛋白或其一部分的3′序列。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述外源性序列还包含编码启动子的序列。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述外源性序列包含编码视紫红质激酶(RK)启动子的序列。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述RK启动子为GRK1启动子。
27.如权利要求26所述的方法，其中编码所述GRK1启动子的所述序列包含以下序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000052
28.如权利要求24所述的方法，其中所述外源性序列还包含编码鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的序列。
29.如权利要求28所述的方法，其中编码所述CBA启动子的所述序列包含以下序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000061
或
Figure FPA0000305202150000062
30.如权利要求21至29中任一项所述的方法，其中编码所述ABCA4的所述序列为人ABCA4序列。
31.如权利要求30所述的方法，其中编码ABCA4的所述序列包含含有SEQ ID NO：2或SEQID NO：1的核苷酸1-3701或1-4326的5’核苷酸序列。
32.如权利要求30所述的方法，其中编码ABCA4的所述序列包含含有SEQ ID NO：2或SEQID NO：1的核苷酸3154-6822、3196-6822、3494-6822、3603-6822、3653-6822、3678-6822、3702-6822或3494-6822的3’核苷酸序列。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中编码所述5′ITR的所述序列和编码所述3′ITR的所述序列衍生自AAV血清型2(AAV2)的5′ITR序列和3′ITR序列。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中编码所述5′ITR的所述序列和编码所述3′ITR的所述序列包含与AAV2的5′ITR的序列和3′ITR的序列相同的序列。
36.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中编码所述5′ITR的所述序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000071
37.如权利要求1至34或36中任一项所述的方法，其中编码所述3’ITR的所述序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000072
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述外源性序列还包含编码Kozak序列的序列。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述Kozak序列包含核苷酸序列GGCCACCATG(SEQID NO：73)。
40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体、所述辅助质粒载体或包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的所述序列的所述质粒载体还包含编码选择标记的序列。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中编码所述病毒Rep蛋白的所述序列和编码所述病毒Cap蛋白的所述序列包含从AAV血清型8(AAV8)病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白序列分离或衍生的序列。
42.如权利要求2至41中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞已用包含聚合物、磷酸钙、脂质和能够穿过细胞膜的载体中的一种或多种的组合物转染。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述聚合物包括聚乙烯亚胺(PEI)。
44.如权利要求43所述的方法，其中能够穿过细胞膜的所述载体包括脂质体、胶束或纳米粒子。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述纳米粒子包括碳、硅或金。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述纳米粒子包括聚合物。
47.如权利要求2至46中任一项所述的方法，其中所述病毒释放溶液包含盐和高pH。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述盐包括NaCl。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述高pH包括大于或等于7.1的pH。
50.如权利要求41或42所述的方法，其中所述高pH包括大于或等于9.0的pH。
51.如权利要求2至50中任一项所述的方法，其中适用于形成多个rAAV粒子的条件包括在37℃和5％CO2下将所述哺乳动物宿主细胞孵育18小时。
52.如权利要求2至50中任一项所述的方法，其中适用于形成多个rAAV粒子的所述条件包括在等于或小于10％CO2的CO2水平下孵育所述哺乳动物宿主细胞。
53.如权利要求1至52中任一项所述的方法，其中(a)的HIC步骤还包括以下步骤：
(i)生成HIC色谱图；和
(ii)在所述HIC色谱图上选择含有rAAV粒子的级分，以产生包含多个rAAV病毒粒子的所述HIC洗脱液。
54.如权利要求53所述的方法，其还包括在生成所述HIC色谱图之前将所述收获培养基稀释到高盐缓冲液中。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中所述多个rAAV粒子使用分步梯度洗脱。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述分步梯度包含在每个分步梯度下盐浓度的降低。
57.如权利要求1至56中任一项所述的方法，其中(b)的所述CEX步骤还包括以下步骤：
(i)生成CEX色谱图；和
(ii)从所述CEX色谱图中选择含有rAAV粒子的级分，以产生包含多个rAAV病毒粒子的所述CEX洗脱液。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述CEX色谱法包括SO3-阳离子交换基质。
59.如权利要求57或58所述的方法，其还包括在生成所述CEX色谱图之前将所述HIC洗脱液调节到低盐缓冲液中。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述调节包括稀释步骤。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述调节步骤包括TFF步骤。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述TFF步骤使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述TFF步骤使用70kDa HFF执行。
64.如权利要求61所述的方法，其中所述TFF步骤使用50kDa HFF执行。
65.如权利要求61所述的方法，其中所述TFF步骤使用至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100kDa或在其之间的任何数目的kDa HFF执行。
66.如权利要求57至62中任一项所述的方法，其中将所述HIC洗脱液的pH调节到pH 3.0至pH 4.0，包括端点在内。
67.如权利要求57至62中任一项所述的方法，其中将所述HIC洗脱液的pH调节到pH 3.5至pH 3.7，包括端点在内。
68.如权利要求57至67中任一项所述的方法，其还包括过滤所述HIC洗脱液。
69.如权利要求68所述的方法，其中过滤所述HIC洗脱液包括0.8/0.45μm聚醚砜(PES)过滤器。
70.如权利要求57至69中任一项所述的方法，其中所述多个rAAV粒子使用分步梯度洗脱。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述分步梯度包括pH梯度、盐梯度或其组合。
72.如权利要求57至69中任一项所述的方法，其中所述多个rAAV粒子使用线性梯度洗脱。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述线性梯度包括pH梯度、盐梯度或其组合。
74.如权利要求57至73中任一项所述的方法，其还包括中和所述CEX洗脱液的pH。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述中和的CEX洗脱液的pH为pH 9.0。
76.如权利要求1至75中任一项所述的方法，其中(c)的所述AEX色谱步骤还包括以下步骤：
(i)生成AEX色谱图；和
(ii)从所述AEX色谱图中选择含有完整rAAV粒子的级分，以产生包含纯化且富集的多个完整rAAV粒子的所述AEX洗脱液。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述AEX色谱法包括阴离子交换(QA)基质。
78.如权利要求76或77所述的方法，其还包括在生成所述AEX色谱图之前将所述CEX洗脱液调节到低盐缓冲液中。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述调节包括稀释步骤。
80.如权利要求78所述的方法，其中所述调节步骤包括TFF步骤。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述调节步骤包括第一TFF步骤和第二TFF步骤。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述TFF步骤使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。
83.如权利要求81所述的方法，其中所述第一TFF步骤和所述第二TFF步骤两者使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。
84.如权利要求78至83中任一项所述的方法，其中所述稀释的CEX洗脱液为pH 9.0。
85.如权利要求76至84中任一项所述的方法，其中所述纯化且富集的多个完整rAAV粒子使用线性梯度洗脱。
86.如权利要求76至84中任一项所述的方法，其中所述纯化且富集的多个完整rAAV粒子使用分步梯度洗脱。
87.如权利要求76至86中任一项所述的方法，其还包括中和包含所述纯化且富集的多个完整rAAV粒子的所述洗脱液的pH。
88.如权利要求1至87中任一项所述的方法，其中(d)的所述TFF步骤使用100kDa中空纤维过滤器(HFF)执行。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述方法还包括第二TFF，并且其中所述第一TFF步骤和所述第二TFF步骤两者均使用100kDa HFF执行。
90.如权利要求1至89中任一项所述的方法，其中所述最终制剂缓冲液包含Tris、MgCl2和NaCl。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述最终制剂缓冲液在pH 8下包含20mM Tris、1mMMgCl2和200mM NaCl。
92.如权利要求90或91所述的方法，其中所述最终制剂缓冲液还包含0.001％的泊洛沙姆188。
93.如权利要求1至92中任一项所述的方法，其还包括将pluronic F-68添加到所述最终组合物中。
94.如权利要求93所述的方法，其中包含所述纯化且富集的多个完整rAAV粒子和最终制剂缓冲液的所述最终组合物在-80℃下冷冻。
95.一种组合物，其包含通过如权利要求1至94中任一项所述的方法产生的多个rAAV粒子。
96.如权利要求95所述的组合物，其中所述组合物包含
(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间，包括端点在内；和
(b)小于30％的空衣壳。
97.如权利要求95所述的组合物，其中所述组合物包含
(a)0.5x1011vg/mL与1x1013vg/mL之间，包括端点在内；和
(b)小于25％的空衣壳。
98.如权利要求96或97所述的组合物，其中所述组合物包含约0.5x1011vg/mL。
99.如权利要求96或97所述的组合物，其中所述组合物包含约1.0x1013vg/mL。
100.如权利要求96或97所述的组合物，其中所述组合物包含约5x1012vg/mL。
101.如权利要求96至100中任一项所述的组合物，其中所述多个rAAV的一部分包含功能性载体基因组，其中每个功能性载体基因组能够在转导后的细胞中表达外源性序列。
102.如权利要求101所述的组合物，其中当与未转导细胞中相应内源性序列的表达水平相比时，包含功能性载体基因组的所述多个rAAV的所述部分以2倍增加表达所述外源性序列。
103.如权利要求101所述的组合物，其中当与未转导细胞中相应内源性序列的表达水平相比时，包含功能性载体基因组的所述多个rAAV的所述部分以3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或在其之间的任何其他增量倍数增加来表达所述外源性序列。
104.如权利要求101至103中任一项所述的组合物，其中所述外源性序列和所述相应内源性序列是不同的。
105.如权利要求102或103所述的组合物，其中所述外源性序列和所述相应内源性序列是不同的，但由所述外源性序列编码的蛋白质和由所述内源性序列编码的蛋白质是相同的。
106.如权利要求104或105所述的组合物，其中所述外源性序列和所述相应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或在其之间的任何百分比的同一性。
107.如权利要求95至106中任一项所述的组合物，其中当与所述内源性序列相比时，所述外源性序列是密码子优化的。
108.如权利要求107所述的组合物，其中所述外源性序列和所述相应内源性序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或在其之间的任何百分比的同一性。
109.如权利要求95至108中任一项所述的组合物，其中在用所述组合物转导细胞后，所述外源性序列编码蛋白质。
110.如权利要求109所述的组合物，其中由所述外源性序列编码的所述蛋白质的活性水平等于或大于由未转导细胞的相应序列编码的蛋白质的活性水平。
111.如权利要求110所述的组合物，其中所述外源性序列和所述相应内源性序列是相同的。
112.如权利要求110所述的组合物，其中所述外源性序列和所述相应内源性序列是不同的。
113.如权利要求112所述的组合物，其中所述外源性序列和所述相应内源性序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或在其之间的任何百分比的同一性。
114.如权利要求95至113中任一项所述的组合物，其中在用所述组合物转导细胞后，所述外源性序列编码蛋白质。
115.如权利要求3至114中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体、所述辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的所述质粒载体的摩尔比分别为约0.5∶1∶1至约10∶1∶1或约1∶1∶1至约10∶1∶1，任选地摩尔比分别为约1∶1∶1、约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1、约9∶1∶1或约10∶1∶1，任选地其中所述细胞使用PEI转染。
116.如权利要求3至114中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体、所述辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的所述质粒载体分别以约3∶1∶1的摩尔比提供，任选地其中所述细胞使用PEI转染。
117.如权利要求3至114中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体、所述辅助质粒载体和包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的所述质粒载体分别以约10∶1∶1的摩尔比提供，任选地其中所述细胞使用PEI转染。
118.如权利要求3至114中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体(pITR)与所述辅助质粒载体(pHELP)的摩尔比在1∶1与20∶19之间，任选地其中所述细胞使用PEI转染。
119.如权利要求3至114中任一项所述的方法，其中所述pITR与包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的所述质粒载体(pREPCAP)的摩尔比在1∶1与20∶19之间，任选地其中所述细胞使用PEI转染。
120.如权利要求115至119中任一项所述的方法，其中所述在适用于形成多个rAAV粒子的条件下在收获培养基中培养多个哺乳动物宿主细胞包括在转染剂存在下培养。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述转染剂包括磷酸钙(CaPO4)。
122.如权利要求120所述的方法，其中所述转染剂包括聚乙烯亚胺(PEI)。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述转染剂包含分别为约5∶1至约1∶1(mL∶mg)，任选地约2∶1至约4∶1、约4∶1、约3∶1或约2∶1的比率的PEI和DNA。
124.如权利要求122或123所述的方法，其中所述转染剂包含PEI和DNA，其中所述DNA包含分别为约0.5∶1∶1至约10∶1∶1或约1∶1∶1至约10∶1∶1，任选地约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1、约9∶1∶1或约10∶1∶1的摩尔比的包含外源性序列的质粒载体、包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体和辅助质粒。
125.一种产生重组AAV载体的方法，其包括用以下转染哺乳动物宿主细胞：
(i)包含外源性序列的质粒载体；
(ii)包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的质粒载体；和
(iii)辅助质粒载体，
其中使所述哺乳动物宿主细胞与转染培养基接触，所述转染培养基包含分别为约1∶1∶1至约10∶1∶1，任选地约2∶1∶1、约3∶1∶1、约4∶1∶1、约5∶1∶1、约6∶1∶1、约7∶1∶1、约8∶1∶1、约9∶1∶1或约10∶1∶1的摩尔比的包含所述外源性序列的所述质粒载体、包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的序列的所述质粒载体和所述辅助质粒。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述转染培养基包含选自聚乙烯亚胺(PEI)和CaPO4的转染剂。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述转染剂为PEI，并且其中所述转染培养基包含约5∶1至约1∶1、约2∶1至约4∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1或约1∶1的比率的PEI和DNA。
128.如权利要求125至127中任一项所述的方法，其中所述外源性序列包含：
(a)编码视紫红质激酶启动子的序列；
(b)编码色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)的序列；和
(c)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述视紫红质激酶启动子为GRK1启动子。
130.如权利要求129所述的方法，其中编码所述GRK1启动子的所述序列包含以下序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000161
131.如权利要求128至130中任一项所述的方法，其中编码所述RPGRORF15的所述序列为密码子优化的人RPGRORF15序列。
132.如权利要求131所述的方法，其中编码RPGRORF15的所述序列包含编码以下氨基酸序列的核苷酸序列：
Figure FPA0000305202150000162
133.如权利要求131或132所述的方法，其中编码RPGRORF15的所述序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000171
134.如权利要求128至132中任一项所述的方法，其中编码所述polyA信号的所述序列包含牛生长激素(BGH)polyA序列。
135.如权利要求133所述的方法，其中编码所述BGH polyA信号的所述序列包含以下核苷酸序列：
Figure FPA0000305202150000181
136.如权利要求128至134中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列。
137.如权利要求128至134中任一项所述的方法，其中编码所述5′ITR的所述序列和编码所述3′ITR的所述序列衍生自AAV血清型2(AAV2)的5′ITR序列和3′ITR序列。
138.如权利要求128至136中任一项所述的方法，其中编码所述5′ITR的所述序列和编码所述3′ITR的所述序列包含与AAV2的5′ITR的序列和3′ITR的序列相同的序列。
139.如权利要求128至136中任一项所述的方法，其中编码所述5′ITR的所述序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000182
140.如权利要求128至136或138中任一项所述的方法，其中编码所述3’ITR的所述序列包含以下核苷酸序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000183
141.如权利要求128至139中任一项所述的方法，其中所述外源性序列还包含编码Kozak序列的序列，任选地其中所述Kozak序列包含核苷酸序列GGCCACCATG(SEQ ID NO：73)。
142.如权利要求128至140中任一项所述的方法，其中所述外源性序列包含以下序列：
Figure FPA0000305202150000191
Figure FPA0000305202150000201
Figure FPA0000305202150000211
143.如权利要求125至127中任一项所述的方法，其中所述外源性序列包含编码ATP结合盒亚家族成员4(ABCA4)蛋白或其一部分的序列。
144.如权利要求142所述的方法，其中所述外源性序列包含编码ABCA4蛋白或其一部分的5′序列。
145.如权利要求142所述的方法，其中所述外源性序列包含编码ABCA4蛋白或其一部分的3′序列。
146.如权利要求142所述的方法，其中所述外源性序列还包含启动子序列。
147.如权利要求145所述的方法，其中所述外源性序列包含视紫红质激酶(RK)启动子序列，任选地GRK1启动子序列。
148.如权利要求146所述的方法，其中所述GRK1启动子序列包含以下序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000212
149.如权利要求145所述的方法，其中所述外源性序列包含鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子序列。
150.如权利要求148所述的方法，其中所述CBA启动子序列包含以下序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000221
或
Figure FPA0000305202150000222
151.如权利要求142所述的方法，其中所述外源性序列包含CMV.CBA启动子序列、CBA.RBG启动子序列或CBA.InEx启动子序列。
152.如权利要求142至150中任一项所述的方法，其中编码所述ABCA4的所述序列为人ABCA4序列或其变体。
153.如权利要求151所述的方法，其中编码ABCA4的所述序列包含含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸1-3701或1-4326的5’核苷酸序列。
154.如权利要求151所述的方法，其中编码ABCA4的所述序列包含含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的核苷酸3154-6822、3196-6822、3494-6822、3603-6822、3653-6822、3678-6822、3702-6822或3494-6822的3’核苷酸序列。
155.如权利要求142至153中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体还包含编码5’反向末端重复(ITR)的序列和编码3’ITR的序列。
156.如权利要求154所述的方法，其中编码所述5′ITR的所述序列和编码所述3′ITR的所述序列衍生自AAV血清型2(AAV2)或其变体的5′ITR序列和3′ITR序列。
157.如权利要求154所述的方法，其中所述5’ITR包含以下序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000231
158.如权利要求142至156中任一项所述的方法，其中所述外源性序列包含3’ITR。
159.如权利要求157所述的方法，其中所述5’ITR包含以下序列或由其组成：
Figure FPA0000305202150000232
160.如权利要求125至158中任一项所述的方法，其中包含外源性序列的所述质粒载体、所述辅助质粒载体或包含编码病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白的所述序列的所述质粒载体还包含编码选择标记的序列。
161.如权利要求125至159中任一项所述的方法，其中编码所述病毒Rep蛋白的所述序列和编码所述病毒Cap蛋白的所述序列包含从AAV血清型8(AAV8)病毒Rep蛋白和病毒Cap蛋白序列分离或衍生的序列。
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