CN112424368A

CN112424368A - 用于调节眼内压和颅内压的材料和方法

Info

Publication number: CN112424368A
Application number: CN201980046870.3A
Authority: CN
Inventors: 科林·乔纳森·楚
Original assignee: University of Bristol
Current assignee: University of Bristol
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2021-02-26
Also published as: CA3103203A1; GB201809588D0; JP7430917B2; EP3807414A1; WO2019238692A1; JP2021526839A; US20210246453A1

Abstract

本发明涉及用于调节眼内和颅内压以及治疗相关病症(例如青光眼和脑积水)的材料和方法。更具体地，本发明涉及血清型ShH10的腺病毒载体，及其在将CRISPR系统转导至睫状体或脉络丛中以调节水通道蛋白或碳酸酐酶基因表达中的治疗用途。

Description

用于调节眼内压和颅内压的材料和方法

技术领域

本发明涉及ShH10血清型的病毒载体及其用于调节眼内压和颅内压以及治疗相关病症、例如青光眼和脑积水的用途。

背景技术

青光眼是全世界不可逆性目盲的主要原因，并且到2020年，估计有1,120万人将会因该疾病而双侧目盲。仅在美国，直接医疗成本目前估计为每年30亿美元，其中处方药支出占成本的45％。英国也是类似的，其中青光眼的患病率估计为占40岁以上所有人的2％。目前的治疗选择是不足的，在诊断之后需要终身监测和治疗加剧了这种情况。

起始病理状况是多种多样的，并且不存在确定性治愈疗法。然而，临床试验表明，充分的眼内压(intraocular pressure，IOP)长期降低通过停止对视神经的持续损害在很大程度上防止其进展和视力丧失。

脑积水或颅内压升高是由广泛神经障碍引起的一种重要病症。一致的原因是脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)的产生与排出之间的不平衡。许多病症，例如先天性畸形、脑膜炎和脑肿瘤均可引起脑积水。另一些病症，例如特发性颅内高压，也可因CSF压力升高而导致显著的发病率和目盲。

目前的治疗涉及具有许多不可接受的副作用的经口药物，所述副作用限制了它们的使用。分流形式的手术干预失败和并发症的比率很高(在一项研究中，儿童中5年内高至48％，以及成人中高至27％)。

因此，需要针对青光眼、脑积水及相关病症的其他治疗选择。

发明概述

本发明涉及能够优先于周围组织而转导睫状体和脉络丛的腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体。特别地，已经发现腺相关病毒的ShH10血清型可提供对睫状体和脉络丛的有效且特异性的转导。

睫状体参与眼内房水(aqueous humour)的产生，并且已经被旨在通过降低房水产生来降低眼内压(IOP)的针对青光眼的许多治疗所靶向。

脉络丛在生理上与睫状体非常相似，并且负责产生脑脊液(CSF)。脑中CSF的积聚可导致颅内压(ICP)增高和例如特发性颅内高压和脑积水的病症。

其他类型的病毒(包括其他腺病毒血清型)根本无法转导睫状体和脉络丛，或者对这些组织的特异性不足而不能代表用于临床应用的可行选择。

因此，本发明的病毒载体能够为治疗可从眼内压或颅内压降低和/或房水或CSF产生降低受益的病症(例如青光眼和脑积水)提供高度靶向的基因编辑方法。

本发明提供了血清型ShH10的AAV载体病毒体，其包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

(ii)编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列。

本发明还提供了用于调节眼内压或房水产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述AAV载体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了用于调节颅内压或CSF产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述AAV载体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了AAV载体病毒体在制备用于调节眼内压或房水产生的药物中的用途，其中所述AAV载体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了AAV载体病毒体在制备用于调节颅内压或CSF产生的药物中的用途，其中所述AAV载体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了调节眼内压或房水产生的方法，其包括向对象施用AAV载体病毒体，其中所述AAV载体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了调节颅内压或CSF产生的方法，其包括向对象施用AAV载体病毒体，其中所述AAV载体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

因此，本发明的载体和方法可用于治疗可从调节眼内压、颅内压、房水产生或CSF产生中受益或者通过调节眼内压、颅内压、房水产生或CSF产生而减轻的病症或症状。治疗可以是治疗性的(对于预先存在的病症或症状)或预防性的(试图预防、抑制或延迟处于病症或症状风险中的个体的病症或症状的发生)。在本发明的上下文中，“调节”通常指示相关特征的降低，但是也可指示抑制增高的趋势。因此，调节可构成相关特征的绝对降低，但是也可构成维持相关特征的稳态，或者相比于另外在不存在治疗的情况下可发生的提供更慢的增高速率。

眼内压升高(高眼压)是青光眼发生的一个主要风险因素。已表明眼内压(IOP)的降低是有益的，即使在其中IOP处于正常范围内的青光眼类型中也是如此。因此，本发明的载体和方法可用于治疗高眼压和/或青光眼。

青光眼可以是原发性或继发性的。

原发性青光眼可以是开角型青光眼(open-angle glaucoma)、闭角型青光眼(closed-angle glaucoma)或正常眼压性青光眼(normal tension glaucoma，NTG)。

颅内压升高、CSF产生过度或CSF排出受损可导致例如脑积水和特发性颅内高压的病症。因此，本发明的载体和方法可用于治疗脑积水和特发性颅内高压。

脑积水可以是交通性脑积水(包括正常压力脑积水)或非交通性脑积水。无论在何种情况下，其均可以是先天性的或获得性的。

AAV载体病毒体包含单链DNA基因组，其包含侧翼为反向末端重复(invertedterminal repeat，ITR)的“有效载荷(payload)”序列。因此，当本说明书涉及包含特定核酸序列的载体病毒体时，应理解，载体病毒体包含含有这样的序列的单链DNA基因组分子。当称载体病毒体包含两个或更多个特定的核酸序列时，这些序列通常将形成同一单链DNA基因组分子的一部分。类似地，当称载体病毒体编码特定分子(例如，RNA或蛋白质)时，应理解，载体病毒体包含含有编码该分子的序列的单链DNA基因组。

RNA指导的内切核酸酶可以是Cas9酶，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(SaCas9)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(SpCas9)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)(NM Cas9)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(STCas9)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)(TD Cas9)，或其变体，例如SpCas9 D1135E、SpCas9 VRER、SpCas9 EQR或SpCas9 VQR。

鉴于AAV基因组的编码容量有限，SaCas9及其变体由于其相对较小的尺寸而可以是优选的。

然而，也可使用其他RNA指导的内切核酸酶，例如Cpf1。

RNA指导的内切核酸酶通常具有催化活性。然而，在一些情况下，可使用催化失活的(catalytically dead)RNA指导的内切核酸酶。催化失活的RNA指导的内切核酸酶也可包含转录阻遏物结构域，例如Kruppel相关盒(Kruppel associated box，KRAB)结构域、CS结构域、WRPW结构域、MXI1、mSin3相互作用结构域或组蛋白去甲基化酶LSD1结构域。因此，载体基因组将包含编码包含催化失活的RNA指导的内切核酸酶和阻遏物结构域的融合蛋白的基因。

RNA指导的内切核酸酶可还包含在哺乳动物细胞中有效的核定位序列。

指导RNA通常是sgRNA，尤其是当内切核酸酶是Cas9酶时。

然而，指导RNA可替代地是crRNA。在这样的情况下，如果需要内切核酸酶活性，例如当内切核酸酶是Cas9酶时，载体病毒体还可包含编码tracrRNA的核酸序列。Cpf1被认为不需要tracrRNA。

水通道蛋白基因可以是其产物在睫状体或脉络丛中表达的任何水通道蛋白(aquaporin，AQP)基因，例如AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

在睫状体中，AQP1、AQP4和AQP5是最高度表达的水通道蛋白，并且可代表眼病症的特别良好的靶标。

AQP1和AQP4也在脉络丛中表达，因此可以是脑病症的特别良好的靶标。

在一些实施方案中，水通道蛋白基因是AQP1，并且靶序列位于外显子1中。例如，指导RNA可包含含有以下序列或由以下序列组成的crRNA部分：

例如，指导RNA可包含含有以下序列或由以下序列组成的crRNA部分：

在涉及递送靶向AQP1基因的两种指导RNA的本发明的方面中，可使用这些crRNA序列中的任意两个，例如序列

以上示出的crRNA序列是为与鼠AQP1互补而设计的，但可以预期在其他哺乳动物物种(例如人)中发挥作用。技术人员将能够设计合适的序列以靶向任何给定物种中的任何选择基因。例如，用于靶向人AQP1的gRNA可包含以下序列或由以下序列组成：

类似地，碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CAR)基因可以是其产物在睫状体或脉络丛中表达的任何CAR基因，例如CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。CAR15也在小鼠中的睫状体中表达。CAR2、CAR3、CAR4、CAR12和CAR14，例如CAR2、CAR3和CAR14可代表眼中特别良好的靶标。CAR2、CAR4和CAR12被认为在脉络丛中高度表达。

本发明还提供了药物组合物，其包含与可药用载体组合的如所述的载体病毒体。

所述药物组合物可被配制成用于眼内注射，并且更特别地，配制成用于玻璃体内或眼房内注射(例如，用于眼应用，例如青光眼的治疗)。所述药物组合物可被配制成用于中枢施用，即直接施用于中枢神经系统(central nervous system，CNS)。用于中枢施用的组合物可例如配制成用于鞘内注射，或颅内注射或输注，例如通过脑室内注射或输注进行。这样的施用特别适合于脑积水的治疗。

本发明还提供了包装细胞，其产生如所述的AAV载体病毒体。

本发明还提供了包含多个如所述载体病毒体群的治疗药盒，其中每个群编码不同的指导RNA。由不同群编码的指导RNA可针对同一基因中或不同基因中的靶序列。提供编码针对同一基因的不同指导RNA的至少两个载体病毒体群可是特别期望的，因为这可提高基因失活的效率，例如，通过使基因的一部分缺失。通常来说，这种方法需要催化活性的内切核酸酶。

因此，所述药盒可包含第一和第二如所述的AAV载体病毒体(或载体病毒体群)，所述第一和第二载体(或载体病毒体群)编码与各自不同的第一和第二靶序列互补的各自不同的第一和第二指导RNA，其中第一和第二靶序列可来自同一水通道蛋白或碳酸酐酶基因。

不同的载体病毒体或载体病毒体群可以除其编码的指导RNA之外在其他方面是相同的。

不同的载体病毒体或载体病毒体群可作为同一组合物的一部分或以分开的组合物提供。每种组合物可独立地是包含与可药用载体组合的相应的载体病毒体或病毒体群的药物组合物。

因此，本发明提供了包含以下的治疗药盒：

(a)血清型ShH10的第一AAV载体病毒体，其包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

(ii)编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的第一靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至第一所述靶序列的第一指导RNA的核酸序列；以及

(b)血清型ShH10的第二AAV载体病毒体，其包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

(ii)编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的第二靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述第二靶序列的第二指导RNA的核酸序列。

本发明还提供了用于调节眼内压或房水产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

(ii)编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的第一靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至第一所述靶序列的第一指导RNA的核酸序列；

其中所述AAV载体病毒体用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体组合施用，所述血清型ShH10的第二AAV载体病毒体包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了用于调节颅内压或CSF产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了AAV载体病毒体在制备用于调节眼内压或房水产生的药物中的用途，其中所述AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了AAV载体病毒体在制备用于调节颅内压或CSF产生的药物中的用途，其中所述AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了调节眼内压或房水产生的方法，其包括向对象施用第一和第二AAV载体病毒体，其中所述第一AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

以及所述第二AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

本发明还提供了调节颅内压或CSF产生的方法，其包括向对象施用第一和第二AAV载体病毒体，其中所述第一AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

以及所述第二AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

在所有这样的情况下，第一和第二靶序列是不同的，并且可来自同一基因或不同基因。如上所述，可期望第一和第二靶序列来自同一基因，因为这可提高基因失活的效率，例如，通过使基因的一部分缺失。

也可通过共施用分开的载体来递送RNA指导的内切核酸酶和指导RNA。

因此，本发明还提供了包含以下的治疗药盒：

(a)血清型ShH10的第一AAV载体病毒体，其包含编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；

和

(b)血清型ShH10的第二AAV载体病毒体，其包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列。

第二载体病毒体可编码多个指导RNA，例如两个指导RNA，其各自与不同靶序列互补。靶序列可来自同一基因或不同基因。如上所述，可期望两个靶序列来自同一基因，因为这可提高基因失活的效率，例如，通过使基因的一部分缺失。

每个指导RNA可以是sgRNA或crRNA。

在载体编码多个sgRNA的情况下，sgRNA可各自包含相同的crRNA组件。

在载体编码一个crRNA或多个crRNA的情况下，其也可编码相容的tracrRNA，如果第一载体编码的内切核酸酶的活性需要的话。然而，任何tracrRNA可另外或作为替代地由第一载体编码。

第一和第二载体病毒体可作为同一组合物的一部分或以分开的组合物提供。每种组合物可独立地是包含与可药用载体组合的相应的载体病毒体的药物组合物。

本发明还提供了用于调节眼内压或房水产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述载体病毒体为血清型ShH10且包含编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列，并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列。

本发明还提供了用于调节眼内压或房水产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补且能够将RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列；并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码所述RNA指导的内切核酸酶的核酸序列。

本发明还提供了用于调节颅内压或CSF产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述载体病毒体为血清型ShH10且包含编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列，并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列。

本发明还提供了用于调节颅内压或CSF产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补且能够将RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列；并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码所述RNA指导的内切核酸酶的核酸序列。

本发明还提供了AAV载体病毒体在制备用于调节眼内压或房水产生的药物中的用途，其中所述载体病毒体为血清型ShH10且包含编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列，并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列。

本发明还提供了AAV载体病毒体在制备用于调节眼内压或房水产生的药物中的用途，其中所述载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补且能够将RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列；并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码所述RNA指导的内切核酸酶的核酸序列。

本发明还提供了AAV载体病毒体在制备用于调节颅内压或CSF产生的药物中的用途，其中所述载体病毒体为血清型ShH10且包含编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列，并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列。

本发明还提供了AAV载体病毒体在制备用于调节颅内压或CSF产生的药物中的用途，其中所述载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补且能够将RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列；并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码所述RNA指导的内切核酸酶的核酸序列。

本发明还提供了调节眼内压或房水产生的方法，其包括向对象施用第一和第二载体病毒体，其中所述第一载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补且能够将RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列；以及第二AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码所述RNA指导的内切核酸酶的核酸序列。

本发明还提供了调节颅内压或CSF产生的方法，其包括向对象施用第一和第二载体病毒体，其中所述第一载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补且能够将RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列；以及第二AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码所述RNA指导的内切核酸酶的核酸序列。

所述病毒体可以以任何合适的剂量施用，并且技术人员能够根据所使用的具体载体和临床情况来确定合适的剂量。例如，所述载体或每种载体的单剂量为1×10⁷至1×10¹¹个基因组拷贝(genome copy，gc)可以是合适的，例如所述载体或每种载体的5×10⁷至5×10¹⁰gc，例如所述载体或每种载体的1×10⁸至1×10¹⁰gc。然而，更低的滴度可以是可行的。

当将本发明的载体施用于眼时，已发现这样的剂量提供了良好的睫状体转导水平与相对低的米勒胶质细胞(Muller glial cell)转导水平。

术语“患者”、“对象”和“个体”可互换使用。应用本发明的组合物和方法的对象通常是哺乳动物，并且可以是人或非人哺乳动物，例如非人灵长类(例如，猿、旧世界猴(OldWorld monkey)或新世界猴(New World monkey))、牲畜动物(例如，牛或猪)、伴生动物(例如，犬或猫)或实验动物例如啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)。

附图说明

图1.发表的微阵列数据的分析确定水通道蛋白1、4、5和碳酸酐酶2、3和14是小鼠睫状体中最丰富同种型。CEL数据文件直接从GEO储存库(GSE10246-Lattin JE etal.Expression analysis of G Protein-Coupled Receptors in mousemacrophages.Immunome Res.2008Apr 29；4:5.)下载，并导入Partek Genomics Suite 6.6(Partek Inc)中。使用稳健多阵列平均(Robust Multi-array Average)背景校正对数据进行归一化(用中位数平滑进行分位数归一化汇总)。然后生成了睫状体在芯片上所有AQP和CAR基因的表达的直方图。通过在其他眼组织之间进行比较，AQP4、AQP5和Car2、3、6和14特别富含于睫状体中。

图2.在小鼠睫状体中可检测到关键的水通道蛋白和碳酸酐酶同种型。A)解剖的小鼠眼组织的Western印迹分析确定了角膜、视网膜和RPE之间Aqp1、4和Car2蛋白的相对水平。B)在解剖的小鼠眼组织上使用Taqman探针进行定量PCR显示了相当的RNA转录物组织水平。n＝3只眼/组。

图3.T7内切核酸酶1基因组切割测定通过体外测试鉴定了数种活性SaCas9 sgRNA指导物。在将不同pAAV-SaCas9-sgRNA质粒Lipofectamine 3000转染到小鼠B6-RPE细胞系中之后3天，进行基因组切割测定。使用DNA1000 tapestation评估DNA切割产物的相对强度，并允许计算匹配区中相对基因组插入缺失发生率。

图4.AAV-SaCas9质粒mAqp1外显子1指导物1B的质粒图谱和序列。

图5.AAV-SaCas9质粒mAqp1外显子1指导物1E的质粒图谱和序列。

图6.水通道蛋白1在小鼠睫状体中表达，并且可被CRISPR-SaCas9破坏。小鼠眼主要在角膜、睫状体和RPE中表达水通道蛋白1(Aqp1)。A)代表性Western印迹与B)蛋白质以及C)定量PCR，n＝3至4只眼。D)示出了受试短指导RNA(sgRNA)的序列和位置的小鼠Aqp1外显子1的示意图。E)经质粒转染的小鼠Aqp1 sgRNA的T7内切核酸酶1测定，其确定了每种sgRNA的插入缺失产生效率。将标记为B和E的包装到ShH10血清型AAV载体中，并用于单独和组合地感染小鼠B6-RPE细胞系。进行了针对mAqp1的F)T7内切核酸酶1测定和G)定量PCR。使用单独的和与B组合(Mix)的sgRNA E，Aqp1表达均显著降低。Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较。***p＝0.001，****p<0.001，n＝10至12。H)使用质粒连接和测序由经Mix sgRNA处理的B6-RPE细胞测序的中靶(on-target)基因组DNA改变的图示，其显示中间83bp区域的完全切除和碱基插入是主要变化。

图7.CRISPR-Cas9介导的睫状体水通道蛋白1破坏降低了小鼠中的眼内压。在将编码等比例的mAqp1 B和E sgRNA(Mix)的2×10¹⁰个基因组拷贝的ShH10病毒玻璃体内注射到野生型C57BL/6J小鼠的一只眼中之后3周，A)T7内切核酸酶1测定显示仅在从经处理的眼解剖的睫状体中有基因组DNA切割。B)也仅在来自经注射眼的睫状体组织中通过PCR检测到SaCas9 DNA。C)通过mAqp1破坏使眼内压(IOP)降低了平均2.9mmHg，配对t检验，n＝18对。D)对照ShH10 CMV-GFP病毒注射未改变IOP，单因素ANOVA，n＝12至42只眼。示出了分离的睫状体中Aqp1蛋白降低的E)代表性Western印迹和F)密度测定法，配对t检验，p＝0.009，n＝7对。在G)角膜或H)视网膜中均未看到厚度的显著“脱靶(off-target)”提高，配对t检验，n＝9对。UN＝未经注射，MIX＝ShH10-CMV-SaCas9-sgRNA B和E。

图8.在两种实验性青光眼模型中，睫状体水通道蛋白1的破坏降低了眼内压。使用微珠模型，示出的数据是由3至5只小鼠/运行的3个独立实验合并的。A)未经处理(UN)和经ShH10-CMV-SaCas9-sgRNA B和E(Mix)处理的眼的眼内压(IOP)。在诱导高眼压之后一周注射，处理抑制了IOP增高。双因素ANOVA，P＝0.0003，n＝12只小鼠。B)在最终时间点的分析显示，IOP平均降低3.9mmHg，配对t检验，p＝0.002，n＝12对。虚线表示在第0天的平均基线IOP为12.7mmHg。显示在经处理的眼中水平降低的匹配的离体睫状体mAQP1蛋白D)的C)代表性Western印迹。配对t检验，p＝0.0008，n＝12。使用皮质类固醇诱导的高眼压模型，示出的数据是由5只和6只小鼠/运行的两个独立实验合并的。E)在经Mix处理的眼中，类固醇诱导3周之后的IOP降低了平均2.9mmHg，配对t检验，p<0.0001，n＝11。虚线表示在第0天的平均基线IOP为11.3mmHg。显示mAQP1蛋白水平降低的离体睫状体G)的F)代表性Western印迹，配对t检验，p＝0.0025，n＝11。

图9.人睫状体表达水通道蛋白1，并且可被ShH10病毒靶向以允许CRISPR-Cas9介导的基因破坏。获得了来自6个供体的角膜移植剩余的人离体睫状体组织，并且可将其在培养物中维持长至7天。A)来自经受立即解剖的2个供体的水通道蛋白1(hAQP1)的代表性Western印迹。B)来自所有供体的组织的合并的qPCR表达数据，n＝2至6。AQP1富含于睫状体和角膜内皮中。产生了类似地靶向hAQP1外显子1的3种人sgRNA，并且C)通过质粒转染和T7内切核酸酶1测定在293T细胞中进行测试。D)选择sgRNA K并将其包装到ShH10病毒中。通过T7内切核酸酶1测定，感染293T细胞显示出甚至更高的插入缺失形成率。用在泛素CMV启动子的控制下表达GFP的ShH10病毒培养人睫状体。

发明详述

RNA指导的内切核酸酶和CRISPR系统

本发明使用CRISPR(“成簇规律间隔短回文重复(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat)”)系统来调节靶基因的表达。

CRISPR(或CRISPR-Cas)系统来源于原核RNA指导的防御系统。存在至少11种不同的CRISPR-Cas系统，其已被分组为3种主要类型(I至III)。已将II型CRISPR-Cas系统改造为基因组改造工具。

大多数II型CRISPR-Cas系统采用3个组件：

-具有DNA切口酶活性的蛋白质内切核酸酶Cas(CRISPR相关蛋白)，其在本说明书中称为RNA指导的内切核酸酶(或RNA指导的DNA内切核酸酶)，

-“靶向”或“指导”RNA(CRISPR-RNA或crRNA)，其包含与靶基因中的靶序列(“原间隔子(protospacer)”)互补的通常为约20个核苷酸的短序列；

-和“支架”RNA(反式作用CRISPR RNA或tracrRNA)，其与crRNA相互作用并募集Cas内切核酸酶。

这些组件的组装以及crRNA与其在染色体中靶序列的杂交导致内切核酸酶切割染色体，通常在靶序列处或接近靶序列处切割。

切割还需要靶DNA包含Cas酶的识别位点(原间隔子邻近基序或PAM)，其位于足够接近crRNA靶序列处，通常紧邻靶序列的3’端。

DNA断裂的细胞修复可导致碱基的插入/缺失/突变以及靶基因座处的突变，这通常导致基因座失活。

该3-组件系统通过将crRNA和tracrRNA融合在一起以创建嵌合单指导RNA(缩写为sgRNA或简称为gRNA)来简化。sgRNA与靶序列的杂交导致靶DNA在邻近/上游PAM位点处的切割。因此，可认为sgRNA包含crRNA组件(其确定靶序列)和tracrRNA组件(其募集内切核酸酶)。因此，如在此所述应用的载体可编码多个sgRNA，每个具有相同的tracrRNA组件。

SaCas9识别的来自sgRNA的tracrRNA组件的一个实例具有以下序列：

并将其用于以下实例中描述的载体中。

在本发明背景下可用的大多数II型CRISPR系统，内切核酸酶是Cas9蛋白。一些实例包括金黄色葡萄球菌(SaCas9)、酿脓链球菌(SpCas9)、脑膜炎奈瑟菌(NM Cas9)、嗜热链球菌(ST Cas9)、齿垢密螺旋体(TD Cas9)，或其变体，例如SpCas9的D1135E、VRER、EQR或VQR变体。

这些酶识别的PAM序列如下：

物种/变体	PAM序列
		酿脓链球菌(SpCas9)	NGG
SpCas9 D1135E变体	NGG
		SpCas9 VRER变体	NGCG
SpCas9 EQR变体	NGAG
		SpCas9 VQR变体	NGAN或NGNG
嗜热链球菌(ST Cas9)	NNAGAAW
		齿垢密螺旋体(TD Cas9)	NAAAAC
脑膜炎奈瑟菌(NM Cas9)	NNNNGATT
		金黄色葡萄球菌(SaCas9)	NNGRRT或NNGRR(N)

鉴于AAV基因组的编码容量有限，SaCas9及其变体由于其相对较小的尺寸而可以是优选的。参见，例如，Ran et al.,Nature 520,186-191(2015)和其中引用的参考文献。

某些CRISPR-Cas系统可以不需要tracrRNA即可发挥功能。例如，Cpf1是2类CRISPR-Cas系统的单RNA指导的内切核酸酶，据报道其以不同于Cas9的特征介导稳健的DNA干扰，不需要tracrRNA，并且识别富含T的PAM序列。它通过交错的双链断裂切割DNA。参见Zetsche et al.,Cell,Volume 163(3),p759–771,22October 2015，首次在线发表于2015年9月25日。

在本说明书中，术语“指导RNA”用于涵盖crRNA和sgRNA。通常来说，本发明的载体编码针对相关靶位点的sgRNA。然而，也可使用采用crRNA的载体，只要如果在内切核酸酶需要tracrRNA以发挥功能的话还提供tracrRNA即可。在需要的情况下，tracrRNA可与crRNA由同一载体编码或与内切核酸酶由同一载体编码，视情况而定。

CRISPR系统的蛋白质组件称为内切核酸酶，并且当与合适的RNA因子缔合时可具有酶活性(即，DNA切口酶活性)。在这样的一些实施方案中，内切核酸酶在相关靶位点切割染色体DNA。

当使用具有催化活性的内切核酸酶时，由指导RNA识别的靶序列可以在其中切割会导致基因失活的该基因的任何部分中。在某些实施方案中，可期望靶序列位于基因的转录部分中，并且任选地位于编码序列中。

如果在水通道蛋白基因，尤其是AQP1的情况下，则可期望靶序列(或两个靶序列，如果使用两种指导RNA的话)位于第一外显子序列中。

在此所述的某些方法使用两种不同的指导RNA递送到单细胞中，每种针对同一基因中的不同靶序列。这可通过引起相关基因的一部分缺失来提高基因失活的效率。在这样的情况下，两个靶序列均可位于同一基因的转录部分中，并且任选地均位于同一基因的编码序列中。

由指导RNA指定的切割位点可隔开任何合适的距离，例如，大于1kb、大至1kb、大至500bp或大至250bp，例如50bp至250bp。它们可隔开至少10bp、至少25bp、至少50bp。

然而，内切核酸酶蛋白不必具有酶活性。非催化活性的(或“催化失活的”)内切核酸酶蛋白也可用于本发明背景下，因为它们保留了其在由指导RNA靶向的原间隔子位点处结合的能力。当结合时，催化失活的内切核酸酶可在空间上抑制转录起始(例如，当原间隔子位点位于基因的启动子中时)或延伸(当其位于外显子或内含子中时)。或者，可将催化失活的内切核酸酶与转录阻遏物结构域融合，以抑制靶向基因的表达。这样的阻遏物结构域可通过多种机制引起转录阻遏或沉默，所述机制包括DNA甲基化或异染色质化、或组蛋白脱乙酰化。取决于相关机制，内切核酸酶-阻遏子融合物可靶向(通过设计合适的指导RNA)相关基因的不同部分，包括转录区(包括外显子和内含子序列)，以及调节序列，包括启动子和其他转录因子结合位点，例如转录增强子。一些实例包括Kruppel相关盒(KRAB)结构域(例如来自Kox1蛋白)、HP1α蛋白的CS(染色体阴影(chromo shadow))结构域、Hes1蛋白的WRPW结构域、MXI1(Max相互作用蛋白(Max-interacting protein))、mSin3相互作用结构域和组蛋白去甲基化酶LSD1(Lys-特异性组蛋白去甲基化酶1，其可靶向增强子区)。

内切核酸酶-阻遏物融合物可包含多个阻遏物结构域。例如，它可包含同一阻遏物结构域的多个拷贝，例如，同一阻遏物结构域的2、3、4或5个连续重复。例如，将串联的4个mSin3相互作用结构域的序列命名为SID4X。

对于转录阻遏物结构域及其与催化失活的内切核酸酶一起使用的更多详情，参见，例如，Gilbert et al.,Cell 154,442–451(2013)，Dominguez et al.,Nature ReviewsMolecular Cell Biology 17,5-15,(2016)，及其中引用的参考文献。

因此，除非上下文另外要求，否则术语“内切核酸酶”用于涵盖催化活性和催化失活的蛋白质二者。催化失活的内切核酸酶可用前缀“d”指示，例如，dCas、dCas9或dCpf1。使用催化失活的内切核酸酶抑制基因表达(无论是否与阻遏物结构域联合)通常被称为CRISPR干扰或“CRISPRi”。

内切核酸酶可包含在哺乳动物细胞中有效的核定位序列(nuclear localisationsequence，NLS)，例如具有序列PKKKRKV的SV40大T抗原NLS。许多其他哺乳动物NLS序列是技术人员已知的。内切核酸酶可包含NLS的多个拷贝，例如NLS的2个或3个拷贝。在存在多个NLS序列的情况下，它们通常是同一NLS的重复。

通常来说，在AAV载体基因组中，编码系统的内切核酸酶组件的基因在RNA聚合酶II启动子，例如病毒或人RNA聚合酶II启动子的转录控制下。一些实例包括巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)或SV40启动子，或哺乳动物“管家”启动子。编码任何RNA组件(sgRNA、crRNA或tracrRNA)的基因通常在RNA聚合酶III启动子(例如，人RNA聚合酶UII启动子)(例如U6或H1启动子)或其保留活性或活性增强的变体的转录控制下。

在一些情况下，使用携带不同有效载荷的多个载体病毒体可是有益的，这在很大程度上是由于由AAV载体可以携带的基因组的相对受限制尺寸造成的限制，这在上文已讨论。

例如，将两种不同的指导RNA递送到单细胞中，每种针对同一基因中的不同靶序列，可通过引起相关基因的一部分缺失来提高基因失活的效率。然而，由于尺寸限制，单个载体基因组可能无法编码内切核酸酶和多个指导RNA。一种可能的解决方案涉及使用两个载体病毒体，每个载体病毒体都编码内切核酸酶和一个指导RNA。另一种涉及使用一个病毒体编码内切核酸酶，另一个病毒体编码两个(或更多个)指导RNA。第一种选择(两个载体病毒体，每个编码内切核酸酶和一个指导RNA)可更具吸引力，因为每个病毒体单独携带完整的CRISPR装置，并因此应该能够下调靶基因的表达。将内切核酸酶和指导RNA分开到不同载体中的“拆分”方法依赖于细胞被每种类型的一种载体转导来实现下调。仅通过单独的一种病毒体的转导将不会发挥作用。

或者，使用大的内切核酸酶可需要内切核酸酶由一个载体编码，而一个指导RNA(或更多个指导RNA)由另一个载体编码。例如，如果使用其中内切核酸酶包含转录阻遏物结构域的CRIPSRi方法，AAV载体基因组可能也没有足够的容量来编码指导RNA，因此需要使用另外的载体编码指导RNA。

腺相关病毒(AAV)载体

腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包含145个核苷酸的反向末端重复(ITR)。AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列示于Srivastava el al.,J Virol,45:555-564(1983)(Ruffing el al.,J Gen Virol,75:3385-3392(1994)修正版)中。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR中。3个AAV启动子(因其相对图谱位置而命名为p5、pl9和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p i9)，加上单AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)，导致由rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶特性。cap基因是从p40启动子表达的，并且它编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。VP2和VP3是VP1蛋白的逐渐缩短的形式，具有相同的C端，但缺少来自VP1的N端的逐渐增长量的序列。

由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此基因组的内部序列的一些或全部(编码复制和结构性衣壳蛋白，rep-cap)可用外源DNA，例如表达盒代替，其中rep和cap蛋白反式提供。位于AAV载体基因组的ITR之间的序列在本文中被称为“有效载荷”。

任何特定的AAV颗粒的实际容量可根据所使用的病毒蛋白而变化。通常来说，载体基因组(包含ITR)为约.7kb至约5kb，例如不超过约5kb，例如，不超过约4.9kb、4.8kb或4.7kb。

野生型AAV ITR的长度各自通常为145个碱基，但是较短的序列也可以发挥功能。例如，以下实例中描述的载体利用130个碱基的序列，其在功能上等同于野生型AAV2 ITR。因此，有效载荷的长度通常不超过约4.7kb、4.6kb、4.5kb或4.4kb。优选地，其长度不超过4.4kb。

因此，重组AAV(rAAV)可包含最多约4.7kb、4.6kb、4.5kb或4.4kb的独特有效载荷序列。

在感染靶细胞之后，从载体表达蛋白质和复制需要合成互补的DNA链以形成双链基因组。该第二链合成代表转基因表达中的限速步骤。

使用所谓的“自互补AAV”(self complementary AAV，scAAV)载体可避免对第二链合成的需求，在所述scAAV中有效载荷包含彼此为相反方向的同一转基因有效载荷的两个拷贝，即，第一有效载荷序列，随后为该序列的反向互补序列。这些scAAV基因组能够采用其中互补有效载荷序列彼此分子内杂交的发夹结构或彼此杂交的两个基因组分子的双链复合物。来自这样的scAAV的转基因表达比来自常规rAAV高效得多，但是由于需要基因组携带有效载荷序列的两个互补拷贝，因此载体基因组的有效的有效载荷容量减半。

编码RNA指导的内切核酸酶的基因通常太大而无法容纳在scAAV载体中，但是scAAV载体可用于携带指导RNA序列(和tracrRNA，如果需要的话)，而内切核酸酶则是由分开的载体反式提供。

scAAV载体基因组可在一个ITR序列中包含一个或更多个突变，以抑制一个末端重复的分解，并且从而提高scAAV制备物的产量。因此，scAAV中的一个ITR可在末端分解位点缺失或可在末端分解位点中包含失活突变。参见，例如，Wang et al.,Gene Therapy(2003)10,2105-2111和McCarty et al.,Gene Therapy(2003)10,2112-2118。因此，很明显，两个在AAV基因组任一端的ITR序列不必相同。

scAAV综述于McCarty,Molecular Therapy,16(10),2008,1648-1656中。

在本说明书中，术语“rAAV载体”通常用于指仅具有任何给定有效载荷序列的一个拷贝的载体(即，rAAV载体不是scAAV载体)，并且术语“AAV载体”用于涵盖rAAV和scAAV载体二者。

AAV载体基因组中的AAV序列(例如，ITR)可来自可衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV PHP.B。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。例如，AAV1的完整基因组提供于GenBank登录号NC_002077中；AAV2的完整基因组提供于GenBank登录号NC001401和Srivastava et al.,J.Virol.,45:555-564{1983)中；AAV3的完整基因组提供于GenBank登录号NC_1829中；AAV-4的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001829中；AAV5基因组提供于GenBank登录号AF085716中；AAV6的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001862中；AAV7和AAV8基因组的至少一部分分别提供于GenBank登录号AX753246和AX753249中；AAV9基因组提供于Gao et al.,J.Virol.,78:6381-6388(2004)中；AAV-10基因组提供于Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中；AAV11基因组提供于Virology,330(2):375-383(2004)中；AAV PHP.B由Deverman et al.,Nature Biotech.34(2),204-209描述及其序列以GenBank登录号KU056473.1保藏。

ITR序列可来自任何合适的AAV类型。例如，它们可来自AAV2，或者是其功能等同物。以下实例中描述的scAAV载体包含在功能上等同于野生型AAV2 ITR并且具有以下序列的ITR：

和

AAV载体可具有来自第一血清型(“A”)的基因组ITR和来自第二血清型(“B”)的蛋白质。这样的载体可被称为“AAV A/B”型。然而，由于病毒蛋白在很大程度上决定了病毒体颗粒的血清学特性，因此这样的载体仍可被称作为血清型B。因此，实例中所述的载体是2/ShH10型，但由于其衣壳蛋白而通常被认为是血清型ShH10。

包含本发明载体基因组的病毒体颗粒通常在能够复制病毒基因组、表达病毒蛋白(例如rep和cap蛋白)，并组装病毒体颗粒的包装细胞中产生。包装细胞还可需要辅助病毒功能，例如来自腺病毒、El缺失的腺病毒或疱疹病毒的辅助病毒功能。在包装细胞中产生AAV载体颗粒的技术是本领域的标准技术。假型化AAV的产生公开于例如WO 01/83692中。在多个实施方案中，可修饰AAV衣壳蛋白以增强重组载体的递送。对衣壳蛋白的修饰是本领域公知的。参见，例如，US 2005/0053922和US 2009/0202490。

产生包装细胞的一种方法是创建稳定表达用于AAV颗粒产生的所有必需组件的细胞系。例如，将包含缺少AAV rep和cap基因的AAV基因组、与AAV基因组分离的AAV rep和cap基因以及选择标记(例如新霉素抗性基因)的质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中。已通过例如GC加尾(Samulski et al.,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79:2077-2081)、添加包含限制性内切核酸酶切割位点的合成接头(Laughlin et al.,1983,Gene,23:65-73)或通过直接的平端连接(Senapathy&Carter,1984,J.Biol.Chem.,259:4661-4666)的操作将AAV基因组引入到细菌质粒中。然后用辅助病毒(例如腺病毒)感染包装细胞系。该方法的优点在于细胞是可选择的并且适合于大规模生产AAV。合适方法的另一些实例使用腺病毒或杆状病毒而不是质粒，以将AAV基因组和/或rep和cap基因引入到包装细胞中。

或者，可通过用编码AAV基因组、AAV蛋白以及任何所需辅助病毒功能的一种或更多种质粒简单转化合适的细胞来产生包装细胞。所谓的“三重转染(tripletransfection)”方法利用三种质粒，每种携带这些基因集之一。参见Grieger et al.,Nature Protocols 1(3),1412-128(2006)及其中引用的参考文献。

AAV产生的一般原理综述于例如Carter,1992,Current Opinions inBiotechnology,1533-539；和Muzyczka,1992,Curr.Topics in Microbial,and Immunol.,158:97-129中。多种方法描述于以下中：Ratschin et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072(1984)；Hermonat et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)；Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251(1985)；McLaughlin et al.,J.Virol.,62:1963(1988)；以及Lebkowski et al.,1988Mol.Cell.Biol.,7:349(1988)；Samulski et al.(1989,J.Virol.,63:3822-3828)；美国专利No.5,173,414；WO 95/13365和相应的美国专利No.5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin et al.(1995)Vaccine 13:1244-1250；Paul et al.(1993)Human Gene Therapy 4:609-615；Clark et al.(1996)Gene Therapy 3:1124-1132；美国专利No.5,786,211；美国专利No.5,871,982；以及美国专利No.6,258,595。

用于scAAV产生的技术由Grieger et al.,Molecular Therapy 24(2),287–297,2016描述。

因此，本发明提供了能够产生本文中所述单独感染性AAV病毒体颗粒中的任一种的包装细胞。包装细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如，灵长类细胞，例如，人细胞。通常来说，它是细胞系。在一个实施方案中，包装细胞可以是经稳定转化的癌细胞，例如HeLa细胞、293细胞(HEK293或HEK293T细胞)和PerC.6细胞(同源293品系)。在另一个实施方案中，包装细胞是未经转化的癌细胞的细胞，例如低代293细胞(用腺病毒的El转化的人胎儿肾细胞)、MRC-5细胞(人胎儿成纤维细胞)、WI-38细胞(人胎儿成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胎儿肺细胞)。

ShH10血清型

本发明的AAV病毒体颗粒为ShH10血清型，如由Klimcsak et al.,(2009)ANovelAdeno-Associated Viral Variant for Efficient and Selective IntravitrealTransduction of Rat Müller Cells.PLoS ONE 4(10):e7467(doi:10.1371/journal.pone.0007467)所述。已经发现该血清型提供了睫状体和脉络丛的有效且特异性转导。

AAV载体病毒体中血清型的主要决定因素是衣壳蛋白。ShH10衣壳蛋白VP1的公布序列为以下，并且在此将其称为“天然”ShH10 VP1序列：

VP1：

该序列除以下残基之外与AAV6的VP1衣壳蛋白相同：V319(AAV6中的I)、D451(AAV6中的N)、N532(AAV6中的D)和N642(AAV6中的H)。

类似于AAV6(Rutledge et al.,J.Virol.,72(1),309-319,1998)，VP2和VP3的天然序列被认为如下：

VP2：

VP3：

因此，本发明的AAV病毒体通常包含具有以上所示天然VP1序列或与其具有至少90％同一性的VP1衣壳蛋白。VP1衣壳蛋白可与天然序列具有至少90％、96％、97％、98％或99％同一性。通常将期望VP2衣壳蛋白包含残基V319、D451、N532和N642中的1个、2个、3个或全部4个，并且优选这些残基中的全部4个。

另外地或作为替代地，本发明的AAV病毒体通常包含具有以上所示天然VP2序列或与其具有至少90％同一性的VP2衣壳蛋白。VP2衣壳蛋白可与天然序列具有至少90％、96％、97％、98％或99％同一性。通常将期望VP2衣壳蛋白包含残基V182、D314、N395和N505中的1个、2个、3个或全部4个，并且优选这些残基中的全部4个。

另外地或作为替代地，本发明的AAV病毒体通常包含具有以上所示天然VP3序列或与其具有至少90％同一性的VP3衣壳蛋白。VP3衣壳蛋白可与天然序列具有至少90％、96％、97％、98％或99％同一性。通常将期望VP3衣壳蛋白包含残基V117、D249、N330和N440中的1个、2个、3个或全部4个，并且优选这些残基中的全部4个。

通常来说，VP1、VP2和VP3蛋白中的全部3个与各自的天然序列具有至少90％同一性，例如，与天然序列具有至少90％、96％、97％、98％或99％同一性。

另外地或作为替代地，VP1、VP2和VP3蛋白中的全部3个可包含残基V117、D249、N330和N440(如在VP1序列中编号)中的1个、2个、3个或全部4个，并且优选这些残基中的全部4个。

以上示出的候选序列与参考序列之间的氨基酸序列同一性百分比(％)定义为在将序列对齐并为了实现最佳比对而引入空位(如果必要的话)之后并且在不将任何保守替换视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与参考序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。同一性(％)值可通过WU-BLAST-2(Altschul et al.,Methods inEnzymology,266:460-480(1996))确定。WU-BLAST-2使用数个检索参数，其中大多数设置为默认值。可调的参数设置为以下值：重叠跨度＝1、重叠分数＝0.125、字阈值(T)＝11。氨基酸序列同一性(％)值由如由WU-BLAST-2确定的匹配相同残基的数目除以参考序列的残基的总数目(由WU-BLAST-2引入到参考序列中以使比对评分最大化的空位被忽略)乘以100来确定。

保守替换可定义为一个氨基酸类别内的替换和/或在BLOSUM62矩阵中评分为正的替换。

根据一种分类，氨基酸类别是酸性的、碱性的、不带电荷的极性的和非极性的，其中酸性氨基酸是Asp和Glu；碱性氨基酸是Arg、Lys和His；不带电荷的极性氨基酸是Asn、Gln、Ser、Thr和Tyr；以及非极性氨基酸是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp和Cys。

根据另一种分类，氨基酸类别是小的亲水性的、酸/酰胺/亲水性的、碱性的、小的疏水性的和芳香族的，其中小的亲水性氨基酸是Ser、Thr、Pro、Ala和Gly；酸/酰胺/亲水性氨基酸是Asn、Asp、Glu和Gln；碱性氨基酸是His、Arg和Lys；小的疏水性氨基酸是Met、Ile、Leu和Val；以及芳香族氨基酸是Phe、Tyr和Trp。

在BLOSUM62矩阵中评分为正的替换如下：

水通道蛋白(AQP)

水通道蛋白是促进水分子跨生物膜运输的整合膜蛋白。它们共有共同的总体结构，具有通过5个环区连接的6个跨膜螺旋的束，在所述环区中两个具有保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)基序，一个位于膜的每一侧。

由于它们在水运输中的作用，它们涉及多种功能，包括细胞外液(例如房水和CSF)的产生。与正常小鼠相比，AQP1敲除小鼠显示出降低的IOP(Zhang et al.,J.Gen.Physiol.,2002,119:561-569)，并且已经提出了针对AQP4的siRNA作为降低IOP的治疗(WO2008/067382)，但没有对效力的任何证明。

哺乳动物被认为具有13种不同的水通道蛋白基因。人和鼠水通道蛋白基因的详情示于下表1和2中。

至少水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7和AQP11被认为在睫状体和/或脉络丛中表达。因此，这些中的任一种都可代表治疗靶标。

AQP1和AQP4也在脉络丛中高度表达，因此可以是脑病症的特别良好的靶标。

表1：智人(Homo sapiens)AQP基因

表1(续)：智人AQP基因

表2：家鼠(Mus musculus)AQP基因

表2(续)：家鼠AQP基因

碳酸酐酶(CAR)

碳酸酐酶是催化二氧化碳和水与碳酸氢根和质子的相互转换的酶家族。表面用碳酸酐酶抑制剂(例如乙酰唑胺、甲氮酰胺、多佐胺和布林佐胺)用于青光眼的治疗，主要是由于它们对房水产生具有抑制作用。

酶的细胞位置是可变的。它们可以是胞质的(CAR 1、2、3、7和13)、线粒体的(CAR5a和5b)、分泌的(CAR6)或膜缔合的(CAR 4、9、12和14，以及15，其在除人和黑猩猩之外的物种中)。CAR 8、10和11的功能尚不清楚，并且它们可能没有催化活性。CAR15显示不在人和黑猩猩中表达。

人和鼠碳酸酐酶基因的详情示于下表3和4中。CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12和CAR14被认为在睫状体和/或脉络丛中表达。CAR15也在小鼠中睫状体中表达。CAR2、CAR3和CAR14被认为在睫状体中最高度表达，并因此代表了良好的靶标。涉及使用siRNA以降低青光眼中碳酸酐酶的先前研究(Jiménez et al.,RNAi:A New Strategyfor Treating Ocular Hypertension Silencing Carbonic Anhydrases.ARVO Abnr 405,2006)报道，针对CAR2、CAR4和CAR12的siRNA在兔中降低了IOP。因此，CAR4和CAR12也可代表良好的靶标。

CAR2、CAR4和CAR12被认为在脉络丛中最高度表达。

表3：智人CAR基因

表3(续)：智人CAR基因

表4：家鼠CAR基因

基因ID	符号	描述	核苷酸登录号	图谱位置	染色体
						12346	Car1	碳酸酐酶1	NC_000069.6	3 3.18cM	3
12349	Car2	碳酸酐酶2	NC_000069.6	3 3.23cM	3
						12350	Car3	碳酸酐酶3	NC_000069.6	3 3.22cM	3
12351	Car4	碳酸酐酶4	NC_000077.6	11C	11
						12352	Car5a	碳酸酐酶5a，线粒体的	NC_000074.6	8 70.81cM	8
56078	Car5b	碳酸酐酶5b，线粒体的	NC_000086.7	X F5	X
						12353	Car6	碳酸酐酶6	NC_000070.6	4E2	4
12354	Car7	碳酸酐酶7	NC_000074.6	8D3	8
						12319	Car8	碳酸酐酶8	NC_000070.6	4 3.53cM	4
230099	Car9	碳酸酐酶9	NC_000070.6	4A5	4
						72605	Car10	碳酸酐酶10	NC_000077.6	11D	11
12348	Car11	碳酸酐酶11	NC_000073.6	7B3	7
						76459	Car12	碳酸酐酶12	NC_000075.6	9C	9
71934	Car13	碳酸酐酶13	NC_000069.6	3A1	3
						23831	Car14	碳酸酐酶14	NC_000069.6	3F2.1	3
80733	Car15	碳酸酐酶15	NC_000082.6	16 11.05cM	16

表4(续)：家鼠CAR基因

青光眼

青光眼是影响眼的一种病症，其中视神经发生损伤，这可导致视力丧失。

青光眼可以是原发性或继发性的。(在继发性青光眼中，由于另外病症或损伤而导致发生IOP增高。)

原发性青光眼的亚型包括开角型青光眼(最常见的类型)、闭角型青光眼和正常眼压性青光眼(NTG，也称为低眼压性青光眼或正常压力青光眼)。

继发性青光眼可以是例如由于以下所致：眼损伤、炎症(例如，葡萄膜炎)、白内障、限制血流至眼的病症(例如糖尿病(糖尿病视网膜病变))、视网膜中央静脉阻塞、新血管形成(例如虹膜的新血管形成，导致新生血管性青光眼)和肿瘤。

在所有情况下，视神经损害的主要原因是眼内压(IOP)。眼内压(IOP)的降低通过停止对视神经的持续损害而在很大程度上防止了进展和视力丧失。这甚至在其中IOP处于正常限度内的正常眼压性青光眼的情况下也是如此(Anderson DR；Normal TensionGlaucoma Study.Collaborative normal tension glaucoma study.Curr.Opin.Ophthalmol.2003Apr；14(2):86-90)。

目前，降低IOP的治疗方法中的大多数都集中在提高房水从眼中的排出(或流出)，例如通过小梁网或施莱姆管(Schlemm’s canal)。通过睫状体降低房水产生已被相对忽略，也许是因为尚未确定合适的方法。然而，本发明的材料和方法提供了抑制房水产生的简单且直接的方法。由于所有类型的青光眼均可从降低IOP或抑制其增高中受益，因此认为本文中所述的载体和方法具有用于治疗任何种类的青光眼(包括(但不限于)上述那些)的潜力。

在引起虹膜红变(iris rubeosis)(虹膜发红(rubeosis iridis))的病症，例如新生血管性青光眼、视网膜中央静脉阻塞、眼缺血综合征和慢性视网膜脱离中，本说明书中描述的材料和方法也可以是有益的。它们还可用于导致“盲痛眼(blind painful eye)”的病症中。

与CSF产生和颅内压相关的病症

脑脊液(CSF)由在生理上与睫状体非常相似的脉络丛产生。作为结果，本说明书中描述的载体和方法可用于治疗其中抑制CSF产生将减轻病理状况或症状的任何病症。

脑积水是其中脑脊液(CSF)积聚在脑中，通常(但不总是)导致颅内压升高的一种病症。脑积水可分类为“交通性的”(由再吸收或循环排出缺陷引起)或“非交通性的”(由脑内CSF流动缺陷引起)，其中的任一者均可以是先天性的或获得性的。

获得性脑积水可由广泛的病症引起，所述病症包括脑膜炎、脑肿瘤和神经障碍。

正常压力脑积水是交通性脑积水的一种特殊形式，其中CSF压力在正常范围内或仅间歇性升高。

目前的治疗涉及经口药物，但是目前的药物显示出许多不可接受的副作用，限制了它们的使用。手术干预也是可以的，通过在脑室与腹之间引入分流器，但是这样的操作失败和并发症的比率很高(在一项研究中，儿童中5年内高至48％，以及成人中高至27％)。

不管病症的根本原因如何，抑制CSF产生都应有助于降低颅内压，并因此提供了治疗益处。

可从抑制CSF产生中受益的其他相关病症包括特发性颅内高压(idiopathicintracranial hypertension，IIH)，也称为良性颅内高压(benign intracranialhypertension，BIH)或脑假瘤(pseudotumour cerebri，PTC)。患有IIH的患者表现出头痛、恶心、呕吐和耳鸣。如果不治疗，该病症可因视盘肿胀而导致目盲。

药物组合物和施用途径

本文中所述的核酸、病毒体等可配制在药物组合物中。

施用可以是外周的，例如，静脉内、皮肤或皮下、经鼻、肌内或腹膜内。通常来说，尽管如此，用于治疗青光眼的施用通过玻璃体内或眼房内注射进行，并且用于治疗脑积水的施用是中枢的，即直接施用于中枢神经系统(CNS)，例如通过鞘内注射或颅内注射或输注，例如脑室内注射或输注。

除以上物质之一之外，药物组合物还可包含可药用的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这样的材料应是无毒的，并且不应干扰活性成分的效力。载体或其他材料的确切性质可取决于施用途径。

对于静脉内、皮肤或皮下注射，活性成分是为无热原的且具有合适的pH、等张性和稳定性的肠胃外可接受的水溶液的形式。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等张载剂(例如氯化钠注射液、林格注射液(Ringer’s Injection)、乳酸盐林格注射液(LactatedRinger's Injection))来制备合适的溶液。防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂可根据需要包含在内。

直接施用于CNS的组合物通常是不含防腐剂和其他赋形剂的基本组合物，并且可以特别地在施用时制备。

施用优选以“预防有效量”或“治疗有效量”进行(视情况而定)，这足以显示出对个体的益处。施用的实际量以及施用的速率和时程可取决于个体对象及其病症的性质和严重程度。治疗处方，例如剂量等的决定，在医学实践者和其他医师的责任之内，并且通常要考虑待治疗的障碍、个体患者的状况、递送部位、施用方法和实践者已知的其他因素。

以上提及的技术和方案的一些实例可见于Remington’s PharmaceuticalSciences,20th Edition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins中。

实施例

材料和方法

DNA克隆

带有用于sgRNA指导物插入的接受位点的编码AAV-SaCas9的质粒购自Addgene(https://www.addgene.org/61591)。使用Golden Gate方法，插入合成的寡核苷酸(Sigma，UK)以创建不同的sgRNA指导物。使用大提质粒试剂盒(Qiagen，UK)对质粒进行扩增。

基因	外显子和名称	SaCas9 sgRNA序列
			小鼠水通道蛋白1	外显子1–1B	GATGATGTACATGACAGCCCG
小鼠水通道蛋白1	外显子1–1E	ATCGCTACTCTGGCCCAAAGT

细胞培养

将自发转化的小鼠RPE(视网膜色素上皮(Retinal Pigmented Epithelium))细胞系B6-RPE07¹和人米勒细胞系(Müller cell line)(UCLB，London，UK)在补充有10％热灭活胎牛血清(fetal calf serum，FCS)、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素(所有均来自PAA Laboratories，Pasching，Austria)的DMEM培养基中于37℃、5％CO₂的气氛中培养。

小鼠饲养

在所有体内实验中均使用6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠。小鼠获自CharlesRiver Laboratories，并在英国内政部(United Kingdom Home office)许可下在布里斯托大学(University of Bristol)维持。在用氯胺酮/隆朋(Rompun)混合物的150μl腹膜内注射剂麻醉之后进行体内操作，例如使用Micron IV平台(Phoenix research labs，USA)进行眼底成像或Tonolab回弹式眼压计测量(iCare，Finland)。

小鼠和人sgRNA的设计

将从Ensembl(https://www.ensembl.org)导出的小鼠Aqp1 cDNA序列加载在Benchling(https://benchling.com)上。基于每个靶标的计算预测的脱靶位点，选择了数个最合适的sgRNA，并使用Golden Gate Assembly方案(New England BioLabs)将其克隆到质粒中。简言之，使用T4 PNK酶和T4连接酶缓冲液(New England BioLabs)将选择的sgRNA退火为DNA片段碎片，然后使用T7连接酶酶和T7连接酶缓冲液(Enzymatics)以及Bsal-HF酶(New England BioLabs)将其插入到SaCas9-AAV质粒中。接下来，将克隆的质粒转化到感受态大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen)中，并在溶原性肉汤(lysogeny broth，LB)中培养，以产生大量的质粒用于进一步实验。通过质粒小提试剂盒(Sigma)或大提试剂盒(Qiagen)按照制造商的方案提取质粒DNA。对所有克隆的质粒DNA进行测序(Eurofins Genomics)，以检查sgRNA是否已成功插入。

体外质粒转染

将小鼠RPE细胞和人米勒细胞以2.5×10⁴/cm²的密度接种以达到60％至70％的细胞汇合。在转染当天，将培养基减少至一半，并用普通DMEM代替，以实现转染率的更好效率。对于每个细胞孔，添加具有0.5至0.75μl Lipofectamine 3000(Invitrogen，UK)的100ulOpti-MEM(GIBCO，UK)中的1至2μg质粒DNA。将细胞转染48小时，然后进行以下实验。

腺相关病毒和眼内注射

编码血清型AAV 2/1、2/2、2/5、2/6和2/8的AAV-CMV-eGFP购自Vector Biolabs，USA。为ShH10血清型的载体在伦敦UCL眼科研究所(UCL Institute of Ophthalmology)产生，以及衣壳质粒由John Flannery(伯克利大学(Berkeley University)，CA，USA)友好馈赠，其可从Addgene(https://www.addgene.org/64867)获得。通过三重质粒转染在HEK-293T细胞中产生了ShH10病毒，然后使用AVB培养基FPLC柱(GE life sciences)进行纯化。将所有病毒调节至起始浓度为1×10¹³基因组拷贝/ml，并使用32号针和Hamilton注射器在手术显微镜下以玻璃体内注射注射2μl体积。

免疫组织化学

在通过颈脱位进行安乐死之后，将眼取出并将其在冷4％多聚甲醛(PFA)中固定30分钟，然后置于最佳切割温度包埋介质(Thermo Scientific，UK)中并进行冷冻切片(LEICA，CM3050S)，以提供每只眼的宽截面切片(cross-section)，厚度为12μm。将眼立即封固以进行GFP检测或者染色以进行免疫组织化学分析。

Western印迹(WB)

通过Cellytic MT缓冲液(Sigma)根据制造商的方案，从细胞或组织中提取蛋白质。使用BCA试剂盒(Thermo Fisher Scientific)确定蛋白质的浓度。在进行4％至12％Bis-Tris Plus凝胶电泳(Thermo Fisher Scientific)之后，将蛋白质转移至iBlot PVDF膜(Thermo Fisher Scientific)。在用0.1％TBST中的5％乳封闭1小时之后，将膜用封闭缓冲液中抗Aqp1(1:1000，Abcam)于4℃下染色过夜。在0.1％TBST中洗涤之后，将膜与HRP缀合的二抗(Cell signalling，MA，USA)或DyLight 800二抗(Thermo Fisher Scientific)一起孵育。用ECL试剂(Sigma)对信号进行显影，并通过电子成像系统(Konica Minolta)或Li-Cor成像系统(LI-COR Biosciences)将其捕获。使用β-肌动蛋白(Cell signalling)或核纤层蛋白B1(LaminB1)(Abcam)作为管家对照。

RNA分离和定量RT-PCR

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Hamburg，Germany)如制造商方案所述，从小鼠REP、小鼠眼组织(例如角膜、睫状体、脉络膜和视网膜)中纯化总mRNA。使用一步式TaqManq-PCR方法(AppliedBiosystems)测试Aqp1基因表达。在同一样品中测量结果，并使用2^-ΔΔCt方法通过刺激计算来自每个处理组的产物的荧光强度的相对比率²。

GeneArt基因组切割测定

使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)从经转染细胞中提取基因组DNA。使用Q5高保真DNA聚合酶(New England BioLabs)和以下引物通过PCR扩增其中发生基因特异性双链断裂的基因座：正向：5’-GGAGGAACTGCTGGCATGCACC-3’；反向：5’-CTAGAGTGCCAGCCTCTGCCCT-3′。使PCR产物变性并再退火，使得在具有插入缺失的链再退火至不具有插入缺失或具有不同插入缺失的链时产生错配。随后检测错配，并在37℃下通过T7内切核酸酶(New England BioLabs)切割20分钟，并在37℃下通过蛋白酶K(New EnglandBioLabs)终止，持续5分钟孵育时间。随后通过琼脂糖凝胶电泳分析片段。为了获得更精确的切割活性结果，将PCR反应物送至布里斯托大学基因组学设施以进行Agilent DNA1000测定(Agilent Technologies)。使用ImageJ 1.46r(国立卫生研究院(National Institutesof Health))对结果进行定量。

体内实验

通过腹膜内(i.p.)注射以比率0.6:1:84与无菌水混合的Vetelar(盐酸氯胺酮100mg/mL，Pfizer，UK)和隆朋(盐酸甲苯噻嗪20mg/mL，Bayer，UK)使成年C57BL/6小鼠麻醉。使用装有无菌33号针的Hamilton微量注射器，向一只眼玻璃体内注射2μl体积的ShH10-Aqp1(混合两种质粒)。使用作对照的对侧眼保持未处理或玻璃体内注射ShH10-GFP。排除发生眼异常的数只小鼠。

当使用2.5％异氟烷和100％氧麻醉小鼠时，通过TonoLab回弹式眼压计(TonoVet)测量IOP。在午后(约4pm)测量IOP。在处理之后3周或6周之后将小鼠处死以进行进一步分析。

所述方法根据批准的布里斯托大学机构指导方针进行，并且内政部项目许可证30/3045和30/3281下的所有实验方案均通过布里斯托大学伦理审查组批准。

高眼压模型

用Vetelar和隆朋使成年C57BL/6小鼠麻醉。按照前述程序，通过每只小鼠的两只眼的眼周结膜穹窿注射地塞米松-21-乙酸盐(DEX-Ac)(Sigma，200μg/眼)³。每周一次进行相同的DEXA处理，以使IOP稳定在一定水平。在DEX-Ac处理之后2周，随机向每只小鼠的一只眼玻璃体内注射AAV处理物。

之前描述了微珠阻塞模型(microbead occlusion model)的诱导和微珠(Invitrogen)的制备⁴。测量IOP基线，然后进行微珠注射。在通过托吡卡胺滴眼剂使瞳孔散大之后，向每只眼的前房注射约3×10⁶个珠。在微珠注射之后1周，随机向每只小鼠的一只眼玻璃体内注射AAV处理物。

在AAV处理之后3周之后，所有小鼠均接受IOP测量。使用Micron IV(Phoenixresearch labs)在实验的终点测量视网膜和角膜的厚度。然后将小鼠处死以进行睫状体中Aqp1蛋白表达和视网膜中节细胞计数。

免疫荧光和免疫组织化学

将小鼠眼解剖并将其在2％多聚甲醛(Thermo Fisher)中于4℃下固定过夜，随后用乙醇脱水，然后送至布里斯托大学的组织学实验室进行石蜡包埋以及苏木精和伊红(H&E)染色。

使用干冰将小鼠眼在OCT(光学切割温度复合物(optical cutting temperaturecompound)，Thermo，Waltham，MA，USA)中速冻。将12μm厚度的冷冻切片在4％PFA中固定10分钟，并用兔抗小鼠Aqp1(稀释度1:100，Abcam)和山羊抗小鼠CD45(稀释度1:100，BDBiosciences)抗体结合二抗(稀释度1:200，Life Technologies)进行免疫染色。将小鼠视网膜解剖并将其在4％PFA中固定2小时。在2％Trition和2％BSA中封闭一小时之后，将视网膜用Brn-3α(稀释度为1:50，SantaCruz)染色过夜，然后进行平铺封固(flat mount)。所有图像均在Leica SP5-AOBS共焦激光扫描显微镜下采集。通过Volocity(版本6.2.1)分析Brn-3α的节细胞计数。

溴代胸腺嘧啶类似物5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)测定

以100ul(1μg)通过i.p.向每只小鼠注射BrdU溶液(BD Biosciences)。在24小时之后，将小鼠处死进行眼冷冻切片。将冷冻切片通过4％PFA固定10分钟。在用PBS洗涤之后，将切片与2N HCl在37℃下孵育15分钟。在PBS洗涤之后，然后将切片与抗BudU生物素抗体(eBioscience)在室温下孵育2小时，随后孵育链霉抗生物素蛋白以进行BrdU eFluor 570(eBioscience)。最后，将切片封固以进行共焦成像(Leica SP5-AOBS)。

人组织培养和转染

从正常供体眼分离出人眼组织。所有供体眼均在收到供体家属知情同意之后获自布里斯托眼库(Bristol Eye Bank)，并根据《赫尔辛基宣言》中有关涉及人组织研究的指导方针进行管理。将分离的人睫状体在上皮细胞培养基(ScienCell ResearchLaboratories)中培养。将睫状体用ShH10-GFP或ShH10-Aqp1处理以进行时程孵育。收集睫状体组织进行冷冻切片，以检测培养24小时、72小时和7天时的GFP表达。在结束时间点，在经处理的睫状体组织中还检测并定量切割活性和Aqp1蛋白表达。

统计学

因此，将结果表示为平均值±标准偏差(S.D.)。通过非配对Student t检验和曼-惠特尼检验(Mann-Whimey test)进行两个单独的实验组的比较。对于多重比较，使用单因素ANOVA检验与Dunn检验进行非参数分析。所有分析均使用GraphPad Prism 6(GraphPad软件，版本6.01，La Jolla，USA)进行。自始至终使用双尾检验。在P≤0.05时认为显著性差异。

1Chen，M.et al.Characterization of a spontaneous mouse retinal pigmentepithelial cell line B6-RPE07.Investigative ophthalmology&visual science 49，3699-3706，doi：10.1167/iovs.07-1522(2008).

2Livak，K.J.&Schmittgen，T.D.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods(San Diego，Calif.)25，402-408，doi：10.1006/meth.2001.1262(2001).

3Patel，G.C.et al.Dexamethasone-Induced Ocular Hypertension in Mice：Effects of Myocilin and Route of Administration.The American journal ofpathology 187，713-723，doi：10.1016/j.ajpath.2016.12.003(2017).

4Ito，Y.A.，Belforte，N.，Cueva Vargas，J.L.&Di Polo，A.A MagneticMicrobead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma inMice.Journal of visualized experiments：JoVE，e53731，doi：10.3791/53731(2016).

结果

AAV可在有丝分裂后细胞中永久表达，并且由于睫状体上皮几乎没有更新，因此向这些细胞进行的基因递送应持续存在。我们已经确定了，在小鼠中玻璃体内注射ShH10血清型导致有效的睫状体转导，并且是能够通过玻璃体内途径感染睫状体的唯一受试血清型(表1)。脱靶眼组织也被表征。在玻璃体内注射2μl滴度为5×10¹³、5×10¹²和5×10¹¹基因组拷贝/ml的ShH10-CMV-eGFP之后三周，通过冰冻切片检查眼是否存在GFP信号。在睫状体上皮细胞中观察到GFP表达，而随着用于施用的滴度降低，视网膜转导水平下降(数据未示出)。使用来自供体眼的离体组织，我们还确定了ShH10可感染人睫状体上皮。从死亡之后24小时内获得的供体眼解剖巩膜环，并将其在培养物中维持48小时，然后添加载剂或2μl的1×10¹³基因组拷贝/ml的ShH10-CMV-eGFP。在培养48小时之后，荧光显微术显示在无病毒的培养物中无GFP信号，而用1×10¹³gc ShH10-CMV-eGFP处理的那些显示出广泛的低水平信号和在边缘区域的强信号焦点(数据未示出)。

随后的实验表明，在1×10¹¹gc/ml浓度下的2μl推注剂(bolus)，可实现良好的睫状体转导水平，而米勒胶质细胞感染很少。

通过分析微阵列数据库，我们构建了小鼠眼中水通道蛋白和碳酸酐酶同种型的相对表达图谱。这鉴定了Aqp1、4、5和Car2、3和14为最丰富的转录物，并因此可能在房水产生中发挥关键作用(图1)。确定了小鼠眼的关键水通道蛋白和碳酸酐酶同种型的蛋白质和RNA的表达以及组织分布(图2)。其确定了睫状体表达并指导了基因靶标的选择。

测试了使用新描述SaCas9、能够包装到AAV中的CRISPR-Cas9系统。该系统使用RNA指导物(sgRNA)引导引起双链DNA断裂的SaCas9到靶基因，通常导致插入缺失形成和过早终止密码子。用靶向Aqp1和Car2的小鼠眼细胞系体外测试数种SaCas9指导RNA。T7内切核酸酶I切割测定鉴定了数种活性指导RNA，其插入缺失效率高至26％(图3)。产生了两种有前景的指导RNA并将其包装到ShH10载体中。质粒图谱和序列示于图4和5中。

Aqp1富含于小鼠睫状体中，尽管也在角膜中存在。通过定量PCR和Western印迹表征水平(图6A至C)。设计了靶向小鼠Aqp1外显子1的数种SaCas9特异性sgRNA，并使用T7内切核酸酶1测定对小鼠B6-RPE细胞系测试效力。选择了两种Aqp1 sgRNA(B和E，也称为1B和1E)包装到载体中，因为它们相比于其他sgRNA在B6-RPE细胞中破坏Aqp1转录的效率更好，并且跨外显子1的间隔最佳。将所述两种载体的混合物用于体外感染B6-RPE细胞，并在72小时之后确定与未经处理或经GFP病毒感染的细胞相比Aqp1 RNA转录物的破坏(图6F)。还使用编码SaCas9以及sgRNA 1B和1E的病毒的50:50混合物(称为“Mix”)在B6-RPE系中确定了Aqp1RNA转录物的破坏(图6G)。确定了中靶作用，包括完全切除中间外显子1区域(图6H)。

将靶向Aqp1外显子1的两种ShH10载体的相同混合物(“Mix”)注射到野生型C57BL/6J小鼠的玻璃体腔中。在注射之后三周，从选择的眼解剖睫状体，并且观察到Aqp1基因座的基因组编辑、存在SaCas9 DNA和IOP降低了平均2.9mmHg二者(图7C)。使用对照GFP表达ShH10病毒未观察到IOP降低。通过Western印迹针对Aqp1测试了睫状体Aqp1蛋白水平(图7E至F)。与对照眼相比，在经CRISPR处理的眼中，Aqp1水平降低。由于仅解剖经病毒转导的非色素睫状体上皮进行Western印迹是不可行的，因此无法看到完全的破坏。使用体内OCT成像未看到脱靶作用，包括角膜水肿和增厚或视网膜水肿(图7G至H)。

将ShH10-SaCas9载体的相同混合物引入到两只高眼压小鼠模型的一只眼中。在载体处理之后三周，在两种模型中的睫状体中，IOP和Aqp1蛋白表达均显著降低。在微珠模型和类固醇模型中，平均IOP降低分别为3.9mmHg和2.9mmHg(图8)。

使用离体供体人眼，也通过Western印迹和定量PCR检测到Aqp1，并且其富含于人睫状体中(图9A至B)。因此，设计了数种人sgRNA指导物，并对人293T细胞系进行测试。从许多sgRNA中选出人Aqp1的一种sgRNA K作为最有效的，将其进一步包装到ShH10载体中，并随后对293T细胞进行测试，这确定了在人Aqp1基因座中的基因组编辑(图9D)。我们还使用在泛素CMV启动子的控制下编码GFP的ShH10病毒表明了，通过共培养长至7天，ShH10能够感染和转导人睫状体(数据未示出)。

表1.ShH10是在玻璃体内注射之后能够实现睫状体上皮转导的受试的唯一AAV血清型。C57BL/6J小鼠经受玻璃体内注射2μl 1x10¹³ gc/ml的在CMV启动子下表达eGFP的不同AAV血清型。在三周之后，摘除眼，以16μm厚度进行冷冻切片，封固并通过共焦显微术成像。对用每种血清型注射的五只独立的眼进行检查，并示出了结果汇总。(ND＝未检出)。

进行了进一步的研究以研究我们的方法用于调节脉络丛中脑脊液形成，例如作为脑积水治疗的适用性。

解剖得到来自C57BL/6J小鼠的侧脑室的脉络丛，并将其置于组织培养物中。添加编码CMV-GFP的ShH10的5×10¹¹个基因组拷贝，并孵育72小时。沿脉络丛上皮看到GFP表达，表明ShH10具有感染这些细胞类型的能力(数据未示出)。对C57BL/6J小鼠脑的冠状冷冻切片的免疫组织化学显示，脉络丛中存在Aqp1和Aqp4。Aqp1表达显示仅限于脉络丛，而Aqp4存在于皮质神经元中(数据未示出)。

尽管已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是当给出本公开内容时，许多等同的修改方案和变化方案对于本领域技术人员而言将是明显的。因此，认为陈述的本发明的示例性实施方案是举例说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行对所述实施方案的多种改变。本文中引用的所有文件均明确地通过引用并入。

本申请中所有参考文献的教导，包括专利申请和授权专利，均通过引用完全并入本文。本申请要求其优先权的任何专利申请均以本文中所述的出版物和参考文献的方式通过引用以其整体并入本文。

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应理解，本文中所述的特定实施方案通过举例说明示出，而不作为对本发明的限制。本发明的主要特征可用于多个实施方案中，而不脱离本发明的范围。本领域技术人员将意识到或者仅仅利用常规的研究就能够确定，本文中所述的特定操作的许多等同方案。这样的等同方案被认为在本发明的范围内，并被权利要求书涵盖。说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，程度犹如每个单独的出版物或专利申请都被具体地和单独地指示通过引用并入一样。

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如本说明书和权利要求书中使用的，词语“包含”(以及任何变化形式)、“具有”(以及任何变化形式)、“包括”(以及任何变化形式)或“含有”(以及任何变化形式)是包含性的或开放式的并且不排除另外的、未引用的要素或方法步骤。

如本文中使用的，术语“或其组合”是指在该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下中的至少一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，如果顺序在特定情况下很重要，则也包括以下中的至少一种：BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这一实例，明确包括包含一个或更多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员将理解，除非从上下文中另外明显的，否则通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制。

根据本公开内容，无需过度实验即可制备和实施本文中公开和要求保护的组合物和/或方法中的所有。尽管按照一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，可对本文中所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变，而不脱离本发明的理念、精神和范围。对本领域技术人员而言明显的所有这样的类似的替换和修改都被认为在如所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和理念之内。

Claims

1.血清型ShH10的AAV载体病毒体，其包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

2.用于调节眼内压或房水产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述AAV载体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

3.根据权利要求2所述应用的AAV载体病毒体，其中所述应用是用于治疗高眼压和/或青光眼。

4.根据权利要求3所述应用的AAV载体病毒体，其中所述青光眼是原发性或继发性青光眼。

5.根据权利要求3或权利要求4所述应用的AAV载体病毒体，其中所述原发性青光眼是开角型青光眼、闭角型青光眼或正常眼压性青光眼(NTG)。

6.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白(AQP)基因是AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

7.根据权利要求6所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白基因是AQP1、AQP4或AQP5。

8.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述碳酸酐酶(CAR)基因是CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。

9.根据权利要求8所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CAR12或CAR14。

10.用于调节颅内压或CSF产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述AAV载体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

11.根据权利要求10所述应用的AAV载体病毒体，其中所述应用是用于治疗脑积水或特发性颅内高压。

12.根据权利要求11所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是交通性脑积水或非交通性脑积水。

13.根据权利要求11或权利要求12所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是正常压力脑积水。

14.根据权利要求11至13中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是先天性的或获得性的。

15.根据权利要求1所述的AAV载体病毒体或根据权利要求10至14中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白(AQP)基因是AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

16.根据权利要求15所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白基因是AQP1或AQP4。

17.根据权利要求1或10至16中任一项所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述碳酸酐酶(CAR)基因是CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。

18.根据权利要求17所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CAR12或CAR14。

19.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述RNA指导的内切核酸酶是Cas9酶。

20.根据权利要求19所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述Cas9酶是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)Cas9(NM Cas9)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9(ST Cas9)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)Cas9(TD Cas9)，或其变体。

21.根据权利要求20所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述变体是SpCas9 D1135E、SpCas9 VRER、SpCas9 EQR或SpCas9 VQR。

22.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述RNA指导的内切核酸酶是具有催化活性的。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述RNA指导的内切核酸酶是催化失活的，并且还包含转录阻遏物结构域。

24.根据权利要求23所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述转录阻遏物结构域是Kruppel相关盒(KRAB)结构域、CS结构域、WRPW结构域、MXI1、mSin3相互作用结构域或组蛋白去甲基化酶LSD1结构域。

25.根据前述权利要求中任一项所述的AAV载体病毒体或应用的AAV载体病毒体，其中所述内切核酸酶还包含在哺乳动物细胞中有效的核定位序列。

26.药物组合物，其包含与可药用载体组合的前述权利要求任一项中所限定的AAV载体病毒体。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，其被配制成用于眼内注射。

28.根据权利要求26所述的药物组合物，其被配制成用于玻璃体内或眼房内注射。

29.根据权利要求26所述的药物组合物，其被配制成用于中枢施用。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，其被配制成用于鞘内注射、颅内注射、颅内输注、脑室内注射或脑室内输注。

31.包装细胞，其产生权利要求1至25任一项中所限定的AAV载体病毒体。

32.治疗药盒，其包含权利要求1至25任一项中所限定的第一和第二AAV载体病毒体，所述第一和第二AAV载体病毒体编码与各自不同的第一和第二靶序列互补的各自不同的第一和第二指导RNA。

33.根据权利要求32所述的治疗药盒，其中所述第一和第二靶序列来自同一水通道蛋白或碳酸酐酶基因。

34.根据权利要求32或权利要求33所述的治疗药盒，其中所述第一和第二载体病毒体除编码的指导RNA之外在其他方面是相同的。

35.根据权利要求32至34中任一项所述的治疗药盒，其中所述第一和第二载体病毒体各自与可药用载体组合配制在分开的组合物中。

36.根据权利要求32至34中任一项所述的治疗药盒，其中所述第一和第二载体病毒体与可药用载体组合配制在同一组合物中。

37.治疗药盒，其包含：

(a)血清型ShH10的第一AAV载体病毒体，其包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

(b)血清型ShH10的第二AAV载体病毒体，其包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

38.根据权利要求37所述的药盒，其中所述第一靶序列和/或第二靶序列来自水通道蛋白(AQP)基因。

39.根据权利要求38所述的药盒，其中所述水通道蛋白(AQP)基因是AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

40.根据权利要求39所述的药盒，其中所述水通道蛋白基因是AQP1、AQP4或AQP5。

41.根据权利要求37至40中任一项所述的药盒，其中所述第一靶序列和/或第二靶序列来自碳酸酐酶(CAR)基因。

42.根据权利要求41所述的药盒，其中所述碳酸酐酶(CAR)基因是CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。

43.根据权利要求43所述的药盒，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CAR12或CAR14。

44.根据权利要求37至43中任一项所述的药盒，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶是Cas9酶。

45.根据权利要求44所述的药盒，其中所述Cas9酶是金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、酿脓链球菌Cas9(SpCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NM Cas9)、嗜热链球菌Cas9(ST Cas9)、齿垢密螺旋体Cas9(TD Cas9)，或其变体。

46.根据权利要求45所述的药盒，其中所述变体是SpCas9 D1135E、SpCas9 VRER、SpCas9 EQR或SpCas9 VQR。

47.根据权利要求37至46中任一项所述的药盒，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶具有催化活性。

48.根据权利要求37至46中任一项所述的药盒，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶是催化失活的，并且还包含转录阻遏物结构域。

49.根据权利要求48所述的药盒，其中所述转录阻遏物结构域是Kruppel相关盒(KRAB)结构域、CS结构域、WRPW结构域、MXI1、mSin3相互作用结构域或组蛋白去甲基化酶LSD1结构域。

50.根据权利要求37至49中任一项所述的药盒，其中所述内切核酸酶或每种内切核酸酶还包含在哺乳动物细胞中有效的核定位序列。

51.根据权利要求37至50中任一项所述的药盒，其中所述第一靶序列和所述第二靶序列来自同一基因。

52.用于调节眼内压或房水产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

53.根据权利要求52所述应用的AAV载体病毒体，其中所述应用是用于治疗高眼压和/或青光眼。

54.根据权利要求53所述应用的AAV载体病毒体，其中所述青光眼是原发性或继发性青光眼。

55.根据权利要求53或权利要求54所述应用的AAV载体病毒体，其中所述原发性青光眼是开角型青光眼、闭角型青光眼或正常眼压性青光眼(NTG)。

56.根据权利要求52至55中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述第一靶序列和/或第二靶序列来自水通道蛋白(AQP)基因。

57.根据权利要求56所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白基因是AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

58.根据权利要求57所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白基因是AQP1、AQP4或AQP5。

59.根据权利要求52至58中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述第一靶序列和/或第二靶序列来自碳酸酐酶(CAR)基因。

60.根据权利要求59所述应用的AAV载体病毒体，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。

61.根据权利要求60所述应用的AAV载体病毒体，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CAR12或CAR14。

62.用于调节颅内压或CSF产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述AAV载体病毒体为血清型ShH10，并且包含：

(i)编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列；和

63.根据权利要求62所述应用的AAV载体病毒体，其中所述应用是用于治疗脑积水或特发性颅内高压。

64.根据权利要求63所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是交通性脑积水或非交通性脑积水。

65.根据权利要求63或权利要求64所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是正常压力脑积水。

66.根据权利要求62至65中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是先天性的或获得性的。

67.根据权利要求62至66中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述第一靶序列和/或第二靶序列来自水通道蛋白(AQP)基因。

68.根据权利要求62至67中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白(AQP)基因是AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

69.根据权利要求68所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白基因是AQP1或AQP4。

70.根据权利要求62至69中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述第一靶序列和/或第二靶序列来自碳酸酐酶(CAR)基因。

71.根据权利要求70所述应用的AAV载体病毒体，其中所述碳酸酐酶(CAR)基因是CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。

72.根据权利要求71所述应用的AAV载体病毒体，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CAR12或CAR14。

73.根据权利要求52至72中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶是Cas9酶。

74.根据权利要求73所述应用的AAV载体病毒体，其中所述Cas9酶是金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、酿脓链球菌Cas9(SpCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NM Cas9)、嗜热链球菌Cas9(ST Cas9)、齿垢密螺旋体Cas9(TD Cas9)，或其变体。

75.根据权利要求74所述应用的AAV载体病毒体，其中所述变体是SpCas9 D1135E、SpCas9 VRER、SpCas9 EQR或SpCas9 VQR。

76.根据权利要求52至75中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶具有催化活性。

77.根据权利要求52至75中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶是催化失活的，并且还包含转录阻遏物结构域。

78.根据权利要求77所述的药盒，其中所述转录阻遏物结构域是Kruppel相关盒(KRAB)结构域、CS结构域、WRPW结构域、MXI1、mSin3相互作用结构域或组蛋白去甲基化酶LSD1结构域。

79.根据权利要求52至78中任一项所述的药盒，其中所述内切核酸酶或每种内切核酸酶还包含在哺乳动物细胞中有效的核定位序列。

80.根据权利要求52至79中任一项所述的药盒，其中所述第一靶序列和所述第二靶序列来自同一基因。

81.治疗药盒，其包含：

和

82.根据权利要求81所述的药盒，其中所述水通道蛋白(AQP)基因是AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

83.根据权利要求82所述的药盒，其中所述水通道蛋白基因是AQP1、AQP4或AQP5。

84.根据权利要求81所述的药盒，其中所述碳酸酐酶(CAR)基因是CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。

85.根据权利要求84所述的药盒，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CAR12或CAR14。

86.根据权利要求81至85中任一项所述的药盒，其中所述RNA指导的内切核酸酶是Cas9酶。

87.根据权利要求86所述的药盒，其中所述Cas9酶是金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、酿脓链球菌Cas9(SpCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NM Cas9)、嗜热链球菌Cas9(ST Cas9)、齿垢密螺旋体Cas9(TD Cas9)，或其变体。

88.根据权利要求87所述的药盒，其中所述变体是SpCas9 D1135E、SpCas9 VRER、SpCas9 EQR或SpCas9 VQR。

89.根据权利要求81至89中任一项所述的药盒，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶具有催化活性。

90.根据权利要求81至89中任一项所述的药盒，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶是催化失活的，并且还包含转录阻遏物结构域。

91.根据权利要求90所述的药盒，其中所述转录阻遏物结构域是Kruppel相关盒(KRAB)结构域、CS结构域、WRPW结构域、MXI1、mSin3相互作用结构域或组蛋白去甲基化酶LSD1结构域。

92.根据权利要求81至91中任一项所述的药盒，其中所述内切核酸酶还包含在哺乳动物细胞中有效的核定位序列。

93.根据权利要求81至92中任一项所述的药盒，其中所述第二载体病毒体编码多个指导RNA，其各自与不同靶序列互补。

94.根据权利要求93所述的药盒，其中所述靶序列来自同一基因。

95.用于调节眼内压或房水产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述载体病毒体为血清型ShH10且包含编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列，并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列。

96.用于调节眼内压或房水产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补且能够将RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列；并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码所述RNA指导的内切核酸酶的核酸序列。

97.根据权利要求95或权利要求96所述应用的AAV载体病毒体，其中所述应用是用于治疗高眼压和/或青光眼。

98.根据权利要求97所述应用的AAV载体病毒体，其中所述青光眼是原发性或继发性青光眼。

99.根据权利要求97或权利要求98所述应用的AAV载体病毒体，其中所述原发性青光眼是开角型青光眼、闭角型青光眼或正常眼压性青光眼(NTG)。

100.根据权利要求95至99中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白(AQP)基因是AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

101.根据权利要求100所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白基因是AQP1、AQP4或AQP5。

102.根据权利要求95至99中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述碳酸酐酶(CAR)基因是CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。

103.根据权利要求102所述应用的AAV载体病毒体，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CAR12或CAR14。

104.用于调节颅内压或CSF产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述载体病毒体为血清型ShH10且包含编码RNA指导的内切核酸酶的核酸序列，并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补并且能够将所述RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列。

105.用于调节颅内压或CSF产生的方法中的AAV载体病毒体，其中所述载体病毒体为血清型ShH10，并且包含编码与来自水通道蛋白基因或碳酸酐酶基因的靶序列互补且能够将RNA指导的内切核酸酶引导至所述靶序列的指导RNA的核酸序列；并且用于与血清型ShH10的第二AAV载体病毒体联合施用，所述第二载体病毒体包含编码所述RNA指导的内切核酸酶的核酸序列。

106.根据权利要求104或权利要求105所述应用的AAV载体病毒体，其中所述应用是用于治疗脑积水或特发性颅内高压。

107.根据权利要求106所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是交通性脑积水或非交通性脑积水。

108.根据权利要求106或权利要求107所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是正常压力脑积水。

109.根据权利要求106至108中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述脑积水是先天性的或获得性的。

110.根据权利要求104至109中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白(AQP)基因是AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7或AQP11。

111.根据权利要求110所述应用的AAV载体病毒体，其中所述水通道蛋白基因是AQP1或AQP4。

112.根据权利要求104至109中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述碳酸酐酶(CAR)基因是CAR2、CAR3、CAR4、CR5b、CAR6、CAR8、CAR9、CAR10、CAR12或CAR14。

113.根据权利要求112所述应用的AAV载体病毒体，其中所述CAR基因是CAR2、CAR3、CAR4、CAR12或CAR14。

114.根据权利要求95至113中任一项所述应用的AAV载体病毒体，其中所述RNA指导的内切核酸酶是Cas9酶。

115.根据权利要求114所述应用的AAV载体病毒体，其中所述Cas9酶是金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、酿脓链球菌Cas9(SpCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NM Cas9)、嗜热链球菌Cas9(ST Cas9)、齿垢密螺旋体Cas9(TD Cas9)，或其变体。

116.根据权利要求115所述的药盒，其中所述变体是SpCas9 D1135E、SpCas9 VRER、SpCas9 EQR或SpCas9 VQR。

117.根据权利要求95至116中任一项所述的药盒，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶具有催化活性。

118.根据权利要求95至116中任一项所述的药盒，其中所述RNA指导的内切核酸酶或每种RNA指导的内切核酸酶是催化失活的，并且还包含转录阻遏物结构域。

119.根据权利要求118所述的药盒，其中所述转录阻遏物结构域是Kruppel相关盒(KRAB)结构域、CS结构域、WRPW结构域、MXI1、mSin3相互作用结构域或组蛋白去甲基化酶LSD1结构域。

120.根据权利要求95至119中任一项所述的药盒，其中所述内切核酸酶还包含在哺乳动物细胞中有效的核定位序列。

121.根据权利要求95至120中任一项所述的药盒，其中编码指导RNA的所述核酸序列编码多个指导RNA，其各自与不同靶序列互补。

122.根据权利要求121所述的药盒，其中所述靶序列来自同一基因。