CN115851840B - 水孔蛋白在调控蚕丝产量和/或品质中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了水孔蛋白在调控蚕丝产量和/或品质中的应用。本发明首次公开了水孔蛋白在调控蚕的个体大小、蚕丝直径、蚕的茧层率中的应用，抑制水孔蛋白表达和/或其活性可以使蚕个体减小、蚕丝直径降低、提高茧层率，从而提高蚕丝的产量和质量，具有较好的经济价值。

Description

水孔蛋白在调控蚕丝产量和/或品质中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及水孔蛋白在调控蚕丝产量和/或品质中的应用。

背景技术

家蚕是我国重要的经济昆虫。以顺德、南海和中山为代表的广东省珠江三角地区是我国现代的三大蚕桑养殖基地之一。蚕桑产业已成为许多地区的支柱产业。一直以来，如何提高蚕丝的产量和品质是人们研究的热点问题。

近年来，细蚕丝越来越受到人们的关注。相比普通蚕丝，细蚕丝具有很多优良的特性，例如光泽度更好、韧性更高、吸水吸油性更好等。因此，在特种医用手术缝合线、特种创新型复合包芯丝、特种刺绣用丝、特色织物与服饰等特殊领域具有更高的价值。传统的培育细蚕丝家蚕品种的方法主要有以下几种方法：1.通过诱变使蚕种产生变异，从而获得可生产细纤度蚕丝的品种；2.通过不同蚕品种杂交育种或激素处理培育三眠蚕品种(三眠蚕个体小，蚕丝更细)；3.利用平衡致死系统专养雄蚕(雄蚕蚕丝更细)。这些方法都相对比较麻烦。Crispr/Cas9在动物基因组编辑方面得到了非常广泛的应用。Crispr/Cas9能够在基因组特定的位置插入或缺失碱基，从而影响基因的功能。水孔蛋白(Aquaporin,AQP)一种广泛存在的膜蛋白，除了具有良好的水和甘油的运输功能外，还能够运输其他小分子。已鉴定出的昆虫AQP都主要参与调控水的渗透性，直接或间接在排泄过程中起着重要的作用。目前，暂无关于：水孔蛋白在调控蚕丝产量和/或品质中的应用的报道。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供水孔蛋白的应用。

本发明第二方面的目的，在于提供sgRNA。

本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第二方面的sgRNA相关的生物材料。

本发明第四方面的目的，在于提供一种CRISPR/Cas系统。

本发明第五方面的目的，在于提供一种试剂。

本发明第六方面的目的，在于提供一种方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供水孔蛋白在a1)～a8)中至少一项中的应用：

a1)调控蚕的个体大小；

a2)制备调控蚕的个体大小的产品；

a3)调控蚕丝直径；

a4)制备调控蚕丝直径的产品；

a5)调控蚕的茧层率；

a6)制备调控蚕的茧层率的产品；

a7)蚕品种培育；

a8)制备蚕品种培育的产品。

优选地，水孔蛋白抑制剂在b1)～b8)中至少一项中的应用：

b1)降低蚕的个体大小；

b2)制备降低蚕的个体大小的产品；

b3)降低蚕丝直径；

b4)制备降低蚕丝直径的产品；

b5)提高蚕的茧层率；

b6)制备提高蚕的茧层率的产品；

b7)蚕品种培育；

b8)制备蚕品种培育的产品。

优选地，所述蚕品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)个体变小；(2)蚕丝直径变小；(3)茧层率提高。

优选地，所述蚕品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)个体相对于参考水平变小；(2)蚕丝直径相对于参考水平变小；(3)茧层率相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

优选地，所述水孔蛋白包含水孔蛋白1和水孔蛋白3中的至少一种；进一步优选地，所述水孔蛋白包含：水孔蛋白3；或

水孔蛋白3和水孔蛋白1。

优选地，所述水孔蛋白包含水孔蛋白3和水孔蛋白1。

优选地，所述水孔蛋白3的登录号为NM_001160189。

优选地，所述水孔蛋白1的登录号为XM_012692288。

优选地，所述蚕包含家蚕。

优选地，所述水孔蛋白抑制剂包含抑制水控蛋白活性的物质、降解水孔蛋白的物质、降低水孔蛋白表达水平的物质中的至少一种。

优选地，所述降低水孔蛋白表达水平的物质包含c1)～c9)中至少一种：

c1)靶向水孔蛋白的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、shRNA、CRISPR/Cas系统中的至少一种；

c2)编码c1)的核酸分子；

c3)包含c2)所述核酸分子的表达盒；

c4)包含c2)所述核酸分子的载体；

c5)包含c3)所述表达盒的载体；

c6)包含c2)所述核酸分子的转基因细胞系；

c7)包含c3)所述表达盒的转基因细胞系；

c8)包含c4)所述载体的转基因细胞系；

c9)包含c5)所述载体的转基因细胞系。

优选地，所述水孔蛋白抑制剂包含靶向水孔蛋白的CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统包含sgRNA1和/或sgRNA2；

所述sgRNA1的核苷酸序列包含d1)～d3)中任一种：

d1)SEQ ID NO.6；

d2)将SEQ ID NO.6经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.6所示的sgRNA1具有相同功能的核苷酸序列；

d3)与SEQ ID NO.6具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.6所示的sgRNA1具有相同功能的核苷酸序列；

所述sgRNA2的核苷酸序列包含d4)～d6)中任一种：

d4)SEQ ID NO.13；

d5)将SEQ ID NO.13经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.13所示的sgRNA2具有相同功能的核苷酸序列；

d6)与SEQ ID NO.13具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.13所示的sgRNA3具有相同功能的核苷酸序列。

优选地，所述靶向水孔蛋白的CRISPR/Cas系统还包含Cas蛋白。

优选地，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。

本发明的第二个方面，提供sgRNA，包含sgRNA1和/或sgRNA2；

所述sgRNA1的核苷酸序列包含d1)～d3)中任一种：

d1)SEQ ID NO.6；

d2)将SEQ ID NO.6经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.6所示的sgRNA1具有相同功能的核苷酸序列；

d3)与SEQ ID NO.6具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.6所示的sgRNA1具有相同功能的核苷酸序列；

所述sgRNA2的核苷酸序列包含d4)～d6)中任一种：

d4)SEQ ID NO.13；

d5)将SEQ ID NO.13经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.13所示的sgRNA2具有相同功能的核苷酸序列；

d6)与SEQ ID NO.13具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.13所示的sgRNA3具有相同功能的核苷酸序列。

优选地，所述sgRNA用于h1)～h4)中至少一种：

h1)降低蚕的个体大小；

h2)降低蚕丝直径；

h3)提高蚕的茧层率；

h4)蚕品种培育。

本发明第三个方面，提供与本发明第二个方面的sgRNA相关的生物材料，所述生物材料包含e1)～e8)中至少一种：

e1)编码本发明第二个方面的sgRNA的核酸分子；

e2)包含e1)所述核酸分子的表达盒；

e3)包含e1)所述核酸分子的载体；

e4)包含e2)所述表达盒的载体；

e5)包含e1)所述核酸分子的转基因细胞系；

e6)包含e2)所述表达盒的转基因细胞系；

e7)包含e3)所述载体的转基因细胞系；

e8)包含e4)所述载体的转基因细胞系。

优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。

优选地，所述生物材料用于h1)～h4)中至少一种：

h1)降低蚕的个体大小；

h2)降低蚕丝直径；

h3)提高蚕的茧层率；

h4)蚕品种培育。

本发明的第四个方面，提供一种CRISPR/Cas系统，包含本发明第二个方面的sgRNA和/或本发明第三个方面的生物材料。

优选地，所述CRISPR/Cas系统还包含：Cas蛋白和/或与Cas蛋白相关的生物材料；所述生物材料包含：f1)～f8)中至少一种：

f1)编码Cas蛋白的核酸分子；

f2)包含f1)所述核酸分子的表达盒；

f3)包含f1)所述核酸分子的载体；

f4)包含f2)所述表达盒的载体；

f5)包含f1)所述核酸分子的转基因细胞系；

f6)包含f2)所述表达盒的转基因细胞系；

f7)包含f3)所述载体的转基因细胞系；

f8)包含f4)所述载体的转基因细胞系。

优选地，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。

优选地，所述系统用于h1)～h4)中至少一种：

h1)降低蚕的个体大小；

h2)降低蚕丝直径；

h3)提高蚕的茧层率；

h4)蚕品种培育。

本发明的第五个方面，提供一种试剂，包含：g1)～g3)中至少一种；

g1)本发明第二个方面的sgRNA；

g2)本发明第三个方面的生物材料；

g3)本发明第四个方面的CRISPR/Cas系统。

优选地，所述试剂用于h1)～h4)中至少一种：

h1)降低蚕的个体大小；

h2)降低蚕丝直径；

h3)提高蚕的茧层率；

h4)蚕品种培育。

优选地，所述蚕品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)个体变小；(2)蚕丝直径变小；(3)茧层率提高。

优选地，所述蚕品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)个体相对于参考水平变小；(2)蚕丝直径相对于参考水平变小；(3)茧层率相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

优选地，所述蚕包含家蚕。

本发明的第六个方面，提供一种方法，包含：降低蚕中水孔蛋白的表达量和/或活性的步骤；

所述方法为h1)～h4)中至少一种：

h1)降低蚕的个体大小；

h2)降低蚕丝直径；

h3)提高蚕的茧层率；

h4)蚕品种培育。

优选地，所述蚕品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)个体变小；(2)蚕丝直径变小；(3)茧层率提高。

优选地，所述蚕品种包含(1)～(3)中至少一种特征：(1)个体相对于参考水平变小；(2)蚕丝直径相对于参考水平变小；(3)茧层率相对于参考水平提高；所述参考水平为野生型的水平。

优选地，所述蚕包含家蚕。

优选地，所述水孔蛋白包含水孔蛋白1和水孔蛋白3中的至少一种；进一步优选地，所述水孔蛋白包含：水孔蛋白3；或

水孔蛋白3和水孔蛋白1。

优选地，所述水孔蛋白包含水孔蛋白3和水孔蛋白1。

优选地，所述水孔蛋白3的登录号为NM_001160189。

优选地，所述水孔蛋白1的登录号为XM_012692288。

优选地，所述降低蚕中水孔蛋白的表达量和/或活性的步骤是将i1)～i4)中至少一种导入蚕体内和/或蚕卵内；

i1)本发明第二个方面的sgRNA；

i2)本发明第三个方面的生物材料；

i3)本发明第四个方面的CRISPR/Cas系统；

i4)本发明第五个方面的试剂。

优选地，所述导入的方式包含注射。

优选地，所述蚕包含家蚕。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了水孔蛋白在调控蚕的个体大小、蚕丝直径、蚕的茧层率中的应用，抑制水孔蛋白表达和/或其活性可以使蚕个体减小、蚕丝直径降低、提高茧层率，从而提高蚕丝的产量和质量，具有较好的经济价值。

附图说明

图1是家蚕AQP3突变体的基因型图：方框内为PAM序列，黄色标记为靶位点处的核酸序列，短横线代表碱基的缺失；WT：野生型。

图2是家蚕AQP1突变体的基因型图：黄色标记为靶位点处的核酸序列，短横线代表碱基的缺失；WT：野生型。

图3是缺失AQP3和/或AQP1对不同龄期的家蚕个体大小影响的直观图。

图4是缺失AQP3和/或AQP1对不同龄期的家蚕个体体重的影响图：不同字母表示差异显著。

图5是缺失AQP3和/或AQP1对家蚕蚕丝的直径的影响图：不同字母表示差异显著。

图6是缺失AQP3和/或AQP1对家蚕的茧层率的影响图：不同字母表示差异显著。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、设计并合成AQP3的sgRNA：

(1)从GenBank中下载家蚕AQP3的核酸序列(NM_001160189)，采用在线分析工具Splign(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi)分析该基因的内含子和外显子结构；AQP3基因的序列为：

ATGGGTGAGCTTGGTACTAAACTGGGATTGGATGAGCTGACCGGAGGAGCCGCTACGATCAGCAGAGCACTACTCGCTGAGTTTATCGgtacggtcttagcatacacttttattgaatattttttcatgtattacttgtactttgataatttacagcgttactagctggccccgcaaacgttgttttgccatataaactatttctaggaaagataaatagataccgactgcagcgacatctgccgggctgatttgtaaatctaaaccattctcgaatccacctgaaggtacacagaaaatttcattaaaatcggtccagccgcttacgagaagt 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ID NO.1，大写字母标注的为外显子区域，小写字母标注的为内含子区域，下划线标注的为sgRNA对应的靶位点区域)。

(2)根据N₂₀NGG的原则选择第一个外显区域(GCTGATCGTAGCGGCTCCTCCGG，SEQ IDNO.2)作为靶位点；

(3)合成靶向该位点的一对sgRNA引物，AQP3_F1:TAATACGACTCACTATAGGGCTGATCGTAGCGGCTCCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC(SEQ ID NO.3)；AQP3_R1:AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCT(SEQ IDNO.4)；并通过PCR法，其中，PCR反应体系为：rTaq酶0.5μL，10×PCR Buffer 2μL，AQP3_F1 2μL(10μmol/L)，AQP3_R1(10μmol/L)2μL，dNTP mix 2μL，灭菌水11.5μL；PCR反应程序为：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃30s、32个循环，72℃10min；获得该sgRNA的双链DNA，序列为TAATACGACTCACTATAGGGCTGATCGTAGCGGCTCCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT(SEQ ID NO.5)。

(4)体外转录合成sgRNA：将步骤(3)得到的PCR产物与氯仿：异戊醇(24：1，v/v)的混合液按质量比1：1比例混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入2.5倍体积无水乙醇于-20℃静置2h，12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL 75％乙醇12000rpm离心5min，重复一次，弃上清，室温晾干后加入无核酸酶水溶解；以该PCR产物为模板，使用MEGAscri pt^TM T7转录试剂盒(Promega)在体外合成sgRNA，合成体系如下：DNA模板1μg，10×反应缓冲液1μL，10mMATP 0.5μL，10mM GTP 0.5μL，10mM CTP 0.5μL，10mM UTP 0.5μL，T7 Enzyme Mix 1μL，无核酸酶水to 5μL；反应过程如下：混匀反应液，37℃反应过夜。反应6h，加入1μL TURBO Dnase，混匀后于37℃继续反应15min以消化掉DNA模板，加入189μL无核酸酶水，200μL的氯仿：异戊醇(24：1，v/v)溶液，4℃12000rpm离心15min，取上清，加入1.5倍体积异丙醇，-20℃静置2h，4℃12000rpm离心20min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥，加入10μL无核酸酶水溶解沉淀，即为sgRNA，其序列为：GCUGAUCGUAGCGGCUCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQID NO.6)。

2、AQP3的sgRNA体外切割活性检测

(1)提取家蚕(广东省农科院蚕业与农产品加工研究所P50品系)基因组DNA；

(2)设计引物AQP3_F2：CCGTCACCACATGAGGTCTAA(SEQ ID NO.7)和AQP3_R2:GCAGTCGGTATCTATTTATCTTTCC(SEQ ID NO.8)；以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：rTaq酶0.5μL，10×PCR Buffer 2μL，AQP3_F2(10μmol/L)1μL，AQP3_R2(10μmol/L)1μL，dNTP mix 2μL，基因组DNA 0.5μg灭菌水12.5μL；PCR反应程序为：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃30s、35个循环，72℃10min；得到PCR产物；

(3)配置以下体外切割的反应体系：Cas9蛋白(NEB)1μL，Cas9蛋白缓冲液1μL，PCR产物500ng，sgRNA300ng，灭菌水to 10μL；

(4)电泳检测：将步骤(3)的反应液进行凝胶电泳，此时可以发现，该PCR产物被切割，这说明sgRNA具有体外切割活性，可用于后续的显微注射实验。

3、显微注射及阳性突变体鉴定

(1)通过显微注射将sgRNA(600ng/μL)与cas9蛋白(400ng/μL)一起注射入发育早期的家蚕卵内(总的注射量为1μg)，记为G0代。收集末龄幼虫退的皮，提取基因组DNA，用于后续的PCR鉴定。

(2)阳性突变体的PCR鉴定：采用引物AQP_F2和AQP_R2来进行PCR扩增(反应体系及反应程序同步骤2)。

(3)PCR产物测序分析：将PCR产物直接进行测序，如果测序峰图在靶位点附近出现杂峰，则认为该个体的AQP3基因发生了移码突变(如图1所示)；对于发生了移码突变的阳性个体，将其与野生型个体交配，并获得其卵，记为G1代；采用上述PCR扩增和测序的方法鉴定出G1代阳性个体，并自交，产下的卵记为G2代；采用上述PCR扩增和测序的方法，从G2代中鉴定出纯合的缺失突变体(sgRNA靶位点的两条DNA链均出现移码突变)，即为缺失AQP3的突变体家蚕(AQP3^-/-)。

4、在AQP3缺失突变体家蚕(AQP3^-/-)的基础上引入AQP1缺失突变，步骤与1、2、3相同，其中：

(1)AQP1的基因序列号为：XM_012692288，AQP3基因的序列为：

ATGGCAACGAAAACTACTGAGAAGACAAGCTCCATCATCGGGCTGTCAGATGTAACGGACAACAAGCTGATCTGGAGGCAGCTGGTCGCGGAACTGGTTGGCACCTTCCTCCTTACTTCTATTGGCGTGGCCGCCTGCATCACCATCAACGCCAGCACAGCGCCCCACACCACCAGCATTGCGTTGTGCTTTGGCTTGCTCGTTGGATCTATTGTGCAGGGCATCGGTCACGTGTCTGGAGGACACATCAACCCCGCGGTGACAGCCGGTCTCTTCGCGGCGGGAGACATTAAGCTGCTAAAAGCAATCTTCTACATCGTAGTGCAGAGCCTCGGAGCAGTAGCTGGAGCCGCCTTTATCAGGTTGGCGATTCCTGCCGACAGCATCGGTGGTTTTGGTATGACCCTACCCGGACCCGGAGTTACAGAAGCGCAGGCCGTGCTGGTGGAGGCTCTGATCACGTTCGTGTTGGTCATGGTGGTGATGGGTGTGTGCGACCCGCAACGTAATGACCTCAAGGGTTCCGCTCCCCTGGCTATCGGACTCAGCATCACCGCCTGCCACGCTGCTGTCATACCTTTCACGGGATCCAGCATGAACCCGGCCCGAACATTCGGCCCAGCCTTGGTGATCGGCAACTGGACATCTCAATGGGTTTACTGGGTGGGTCCCGTCGTGGGCGGCGTGATCGCTGGACTACTCTACAAATTCGTTCTGCGCATCAAAAAAGCCGGAGACACCGGCTCTTATGACTTCTAA(SEQ ID NO.9，下划线标注的为sgRNA对应的靶位点区域)。

(2)选在AQP1的外显子区域(CCATCATCGGGCTGTCAGATGTA，SEQ ID NO.10)的互补链作为sgRNA的靶位点。

(3)合成AQP1_sgRNA的一对引物序列为：AQP1_F1(TAATACGACTCACTATAGGTACATCTGACAGCCCGATGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA，SEQ ID NO.11)，AQP1_R1(AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAA，SEQ IDNO.12)；合成的该sgRNA的序列为：UACAUCUGACAGCCCGAUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO.13)。

(4)AQP1的sgRNA体外切割活性检测及阳性突变体鉴定所用的一对引物序列为：AQP1_F2(ATTTCTTAACTCAGACGCGCA，SEQ ID NO.14)，AQP1_R2(TTAGATGATTGCAGAAAACGTGT，SEQ ID NO.15)；如果测序峰图在靶位点附近出现杂峰，则认为该个体的AQP1基因发生了移码突变(如图2所示)。

(5)最终筛选得到AQP1纯合缺失突变体即为AQP1和AQP3同时缺失的双突变体AQP^{3 +1-/-}，也即为最终的“小体型”家蚕。

5、个体大小分析

从第二龄幼虫开始，观察记录不同龄期突变家蚕(野生型WT(P50)、AQP3单缺失突变体AQP^3-/-、AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^3+1-/-)的个体重量，每个品系每个龄期随机测量20头个体，重复3次。结果如图3、4所示：AQP3单缺失突变体AQP^3-/-和AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^3+1-/-(“小体型”家蚕)在各个龄期的重量均显著小于野生型家蚕，即AQP3缺失突变可以显著降低家蚕体重；并且AQP3单缺失突变体AQP^3-/-在各个龄期的重量显著高于AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^3+1-/-(“小体型”家蚕)，表明AQP1缺失突变可以进一步显著降低家蚕体重；五龄期“小体型”家蚕的体重大约为野生型个体的60％左右。

6、蚕丝粗细分析

剪取野生型WT、AQP3单缺失突变体AQP^3-/-、AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^3+1-/-家蚕茧突出于表面的蚕丝，置于40倍光学显微镜下测量蚕丝的直径。每个品系随机选取10个茧，每个茧测量5根不同的蚕丝。

结果如图5所示：AQP3单缺失突变体AQP^3-/-和AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^3+1-/-(“小体型”家蚕)的家蚕蚕丝的直径平均为13.07μm、11.66μm，显著小于野生型家蚕蚕丝的直径(15.92μm)，即AQP3缺失突变可以显著降低家蚕蚕丝的直径；并且AQP3单缺失突变体AQP^3-/-家蚕蚕丝的直径显著高于AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^3+1-/-(“小体型”家蚕)，表明AQP1缺失突变可以进一步显著降低家蚕蚕丝的直径。

7、吐丝能力分析

采用电子天平称量野生型WT、AQP3单缺失突变体AQP^3-/-、AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^3+1-/-家蚕的茧丝重以及裸蛹重，计算茧层率(茧丝重/裸蛹重，这是衡量家蚕吐丝能力的关键指标)。每个品系随机选取20个茧进行测量，重复3次。结果如图6所示：AQP3单缺失突变体AQP^3-/-和AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^3+1-/-(“小体型”家蚕)的家蚕的茧层率分别为13.9％、14.2％，显著高于野生型家蚕(13.5％)；即AQP3缺失突变可以显著增加家蚕的茧层率；并且AQP3单缺失突变体AQP^3-/-家蚕的茧层率显著小于AQP3和AQP1双缺失突变体AQP^{3 +1-/-}(“小体型”家蚕)，表明AQP1缺失突变可以进一步显著增加家蚕的茧层率。

综上所述，通过缺失水孔蛋白(AQP3和/或AQP1)基因(抑制水孔蛋白(AQP3和/或AQP1基因)的表达)，能够使家蚕体重降低、蚕丝直径降低、提高茧层率；即抑制水孔蛋白(AQP3和/或AQP1)表达和/或其活性可以使家蚕体重降低、蚕丝直径降低、提高茧层率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.水孔蛋白抑制剂在b1)～b8)中至少一项中的应用：

b1)降低蚕的个体大小；

b2)制备降低蚕的个体大小的产品；

b3)降低蚕丝直径；

b4)制备降低蚕丝直径的产品；

b5)提高蚕的茧层率；

b6)制备提高蚕的茧层率的产品；

b7) 蚕品种培育；

b8) 制备蚕品种培育的产品；

所述水孔蛋白为k1)或k2）：

k1)水孔蛋白1和水孔蛋白3；

k2）水孔蛋白3；

所述蚕品种包含（1）～（3）中至少一种特征：（1）个体变小；（2）蚕丝直径变小；（3）茧层率提高；

所述水孔蛋白3的GenBank号为NM_001160189；

所述水孔蛋白1的序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述水孔蛋白抑制剂包含c1)～c9）中至少一种：

c1)靶向水孔蛋白的CRISPR/Cas系统；

c2)编码c1)的核酸分子；

c3)包含c2)所述核酸分子的表达盒；

c4)包含c2)所述核酸分子的载体；

c5)包含c3)所述表达盒的载体；

c6)包含c2) 所述核酸分子的转基因细胞系；

c7) 包含c3)所述表达盒的转基因细胞系；

c8)包含c4)所述载体的转基因细胞系；

c9)包含c5）所述载体的转基因细胞系。

3.sgRNA在b1)～b8)中至少一项中的应用：

b1)降低蚕的个体大小；

b2)制备降低蚕的个体大小的产品；

b3)降低蚕丝直径；

b4)制备降低蚕丝直径的产品；

b5)提高蚕的茧层率；

b6)制备提高蚕的茧层率的产品；

b7) 蚕品种培育；

b8) 制备蚕品种培育的产品；

所述蚕品种包含（1）～（3）中至少一种特征：（1）个体变小；（2）蚕丝直径变小；（3）茧层率提高；

所述sgRNA为l1)或l2)：

l1)sgRNA1；

l2) sgRNA1和sgRNA2；

所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

4.与权利要求3中所述的sgRNA相关的生物材料在b1)～b8)中至少一项中的应用：

b1)降低蚕的个体大小；

b2)制备降低蚕的个体大小的产品；

b3)降低蚕丝直径；

b4)制备降低蚕丝直径的产品；

b5)提高蚕的茧层率；

b6)制备提高蚕的茧层率的产品；

b7) 蚕品种培育；

b8) 制备蚕品种培育的产品；

所述蚕品种包含（1）～（3）中至少一种特征：（1）个体变小；（2）蚕丝直径变小；（3）茧层率提高；

所述生物材料包含e1)～e8)中至少一种：

e1)编码权利要求3中所述的sgRNA的核酸分子；

e2)包含e1)所述核酸分子的表达盒；

e3)包含e1)所述核酸分子的载体；

e4)包含e2)所述表达盒的载体；

e5)包含e1) 所述核酸分子的转基因细胞系；

e6) 包含e2)所述表达盒的转基因细胞系；

e7)包含e3)所述载体的转基因细胞系；

e8)包含e4）所述载体的转基因细胞系。

5.CRISPR/Cas系统在b1)～b8)中至少一项中的应用：

b1)降低蚕的个体大小；

b2)制备降低蚕的个体大小的产品；

b3)降低蚕丝直径；

b4)制备降低蚕丝直径的产品；

b5)提高蚕的茧层率；

b6)制备提高蚕的茧层率的产品；

b7) 蚕品种培育；

b8) 制备蚕品种培育的产品；

所述蚕品种包含（1）～（3）中至少一种特征：（1）个体变小；（2）蚕丝直径变小；（3）茧层率提高；

所述CRISPR/Cas系统包含权利要求3中所述的sgRNA和/或权利要求4中所述的生物材料。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述CRISPR/Cas系统还包含：Cas蛋白和/或与Cas蛋白相关的生物材料；

所述与Cas蛋白相关的生物材料包含：f1)～f8)中至少一种：

f1)编码Cas蛋白的核酸分子；

f2)包含f1)所述核酸分子的表达盒；

f3)包含f1)所述核酸分子的载体；

f4)包含f2)所述表达盒的载体；

f5)包含f1) 所述核酸分子的转基因细胞系；

f6) 包含f2)所述表达盒的转基因细胞系；

f7)包含f3)所述载体的转基因细胞系；

f8)包含f4)所述载体的转基因细胞系。

7.试剂在b1)～b8)中至少一项中的应用：

b1)降低蚕的个体大小；

b2)制备降低蚕的个体大小的产品；

b3)降低蚕丝直径；

b4)制备降低蚕丝直径的产品；

b5)提高蚕的茧层率；

b6)制备提高蚕的茧层率的产品；

b7) 蚕品种培育；

b8) 制备蚕品种培育的产品；

所述蚕品种包含（1）～（3）中至少一种特征：（1）个体变小；（2）蚕丝直径变小；（3）茧层率提高；

所述试剂包含：g1)～g3)中至少一种；

g1) 权利要求3中所述的 sgRNA；

g2) 权利要求4中所述的生物材料；

g3) 权利要求5或6中所述的 CRISPR/Cas系统。

8.一种方法，包含：降低蚕中水孔蛋白的表达量和/或活性的步骤；

所述方法为h1)～h4)中至少一种：

h1) 降低蚕的个体大小；

h2) 降低蚕丝直径；

h3) 提高蚕的茧层率；

h4) 蚕品种培育；

所述水孔蛋白为k1)或k2）：

k1)水孔蛋白1和水孔蛋白3；

k2）水孔蛋白3；

所述蚕品种包含（1）～（3）中至少一种特征：（1）个体变小；（2）蚕丝直径变小；（3）茧层率提高；

所述水孔蛋白3的GenBank号为NM_001160189；

所述水孔蛋白1的序列如SEQ ID NO.9所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述降低蚕中水孔蛋白的表达量和/或活性的步骤是将i1)～i4)中至少一种导入蚕卵内；

i1) 权利要求3中所述的sgRNA；

i2) 权利要求4中所述的生物材料；

i3) 权利要求5或6中所述的CRISPR/Cas系统；

i4) 权利要求7中所述的试剂。