CN115851712B - 谷氨酰氨肽酶在害虫防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了谷氨酰氨肽酶在害虫防治中的应用。本发明首次公开了谷氨酰氨肽酶在调控害虫存活率、害虫蜕皮、害虫表皮透明度、害虫生长发育、害虫茧层率以及防治害虫中的应用，抑制谷氨酰氨肽酶表达和/或其活性可以导致害虫不能正常完成蜕皮、幼虫表皮变半透明、多出一个发育龄期，从而导致害虫死亡；同时，降低害中的茧层率，达到防治害虫的效果，并且在防治过程中，不会产生抗药性、对人畜没有危害，且对环境没有污染。

Description

谷氨酰氨肽酶在害虫防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及谷氨酰氨肽酶在害虫防治中的应用。

背景技术

谷氨酰氨肽酶(Glutamyl aminopeptidase，GluAP)是氨基肽酶A的一种，能够从底物N末端水解释放酸性氨基酸残基，如谷氨酸和天冬氨酸。GluAP在哺乳动物中的研究较多。研究发现，GluAP参与肾素-血管紧张素系统(RAS)的代谢途径，能够从肾素AngII的N末端切除一个天冬氨酸残基，将AngII降解为AngIII。AngIII是RAS的主要效应肽之一，对血压起到强直刺激作用。然而，昆虫是一种开放的循环系统，且没有找到GluAP的底物AngII的同源物，因此GluAP在昆虫中的生物学功能并不清楚。RAS体系中另一关键酶血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)在多种昆虫中均已被发现，例如果蝇、蜜蜂、伊蚊、蝗虫、家蚕、赤拟谷盗等。已有研究证明，在烟草天蛾幼虫中注射ACE抑制剂后，会有很高机率使得旧角质层的脱落发生障碍。在赤拟谷盗蜕皮液中发现了ACE相关基因，敲除ANC E后，蜕皮发生障碍。目前，暂无关于：谷氨酰氨肽酶在害虫防治中的应用的报道。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供谷氨酰氨肽酶的应用。

本发明第二方面的目的，在于提供sgRNA。

本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第二方面的sgRNA相关的生物材料。

本发明第四方面的目的，在于提供一种CRISPR/Cas系统。

本发明第五方面的目的，在于提供一种试剂。

本发明第六方面的目的，在于提供一种方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供谷氨酰氨肽酶(GluAP)在a1)～a12)中至少一项中的应用：

a1)调控害虫存活率；

a2)制备调控害虫存活率的产品；

a3)调控害虫蜕皮；

a4)制备调控害虫蜕皮的产品；

a5)调控害虫表皮透明度；

a6)制备调控害虫表皮透明度的产品；

a7)调控害虫生长发育；

a8)制备调控害虫生长发育的产品；

a9)调控害虫茧层率；

a10)制备调控害虫茧层率的产品；

a11)防治害虫；

a12)制备防治害虫的产品。

优选地，谷氨酰氨肽酶抑制剂在b1)～b12)中至少一项中的应用：

b1)降低害虫存活率；

b2)制备降低害虫存活率的产品；

b3)抑制害虫蜕皮；

b4)制备抑制害虫蜕皮的产品；

b5)增加害虫表皮透明度；

b6)制备增加害虫表皮透明度的产品；

b7)抑制害虫生长发育；

b8)制备抑制害虫生长发育的产品；

b9)降低害虫茧层率；

b10)制备降低害虫茧层率的产品；

b11)防治害虫；

b12)制备防治害虫的产品。

优选地，所述谷氨酰氨肽酶的登录号为XM_021347553。

优选地，所述害虫包含无脊椎昆虫；进一步优选地，所述害虫包含鳞翅目昆虫；更进一步优选地，所述害虫包含蚕。

优选地，所述谷氨酰氨肽酶抑制剂包含抑制谷氨酰氨肽酶活性的物质、降解谷氨酰氨肽酶的物质、降低谷氨酰氨肽酶表达水平的物质中的至少一种。

优选地，所述降低谷氨酰氨肽酶表达水平的物质包含c1)～c9)中至少一种：

c1)靶向谷氨酰氨肽酶的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、shRNA、CRISPR/Cas系统中的至少一种；

c2)编码c1)的核酸分子；

c3)包含c2)所述核酸分子的表达盒；

c4)包含c2)所述核酸分子的载体；

c5)包含c3)所述表达盒的载体；

c6)包含c2)所述核酸分子的转基因细胞系；

c7)包含c3)所述表达盒的转基因细胞系；

c8)包含c4)所述载体的转基因细胞系；

c9)包含c5)所述载体的转基因细胞系。

优选地，所述谷氨酰氨肽酶抑制剂包含靶向谷氨酰氨肽酶的CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统包含sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列包含d1)～d3)中任一种：

d1)SEQ ID NO.6；

d2)将SEQ ID NO.6经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.6所示的sgRN A具有相同功能的核苷酸序列；

d3)与SEQ ID NO.6具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.6所示的sgRNA具有相同功能的核苷酸序列。

优选地，所述靶向谷氨酰氨肽酶的CRISPR/Cas系统还包含Cas蛋白。

优选地，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。

本发明的第二个方面，提供sgRNA，其核苷酸序列包含d1)～d3)中任一种：

d1)SEQ ID NO.6；

d2)将SEQ ID NO.6经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.6所示的sgRN A具有相同功能的核苷酸序列；

d3)与SEQ ID NO.6具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.6所示的sgRNA具有相同功能的核苷酸序列。

优选地，所述sgRNA用于h1)～h6)中至少一种：

h1)降低害虫存活率；

h2)抑制害虫蜕皮；

h3)增加害虫表皮透明度；

h4)抑制害虫生长发育；

h5)降低害虫茧层率；

h6)防治害虫。

优选地，所述害虫包含无脊椎昆虫；进一步优选地，所述害虫包含鳞翅目昆虫；更进一步优选地，所述害虫包含蚕。

本发明第三个方面，提供与本发明第二个方面的sgRNA相关的生物材料，所述生物材料包含e1)～e8)中至少一种：

e1)编码本发明第二个方面的sgRNA的核酸分子；

e2)包含e1)所述核酸分子的表达盒；

e3)包含e1)所述核酸分子的载体；

e4)包含e2)所述表达盒的载体；

e5)包含e1)所述核酸分子的转基因细胞系；

e6)包含e2)所述表达盒的转基因细胞系；

e7)包含e3)所述载体的转基因细胞系；

e8)包含e4)所述载体的转基因细胞系。

优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。

优选地，所述生物材料用于h1)～h6)中至少一种：

h1)降低害虫存活率；

h2)抑制害虫蜕皮；

h3)增加害虫表皮透明度；

h4)抑制害虫生长发育；

h5)降低害虫茧层率；

h6)防治害虫。

优选地，所述害虫包含无脊椎昆虫；进一步优选地，所述害虫包含鳞翅目昆虫；更进一步优选地，所述害虫包含蚕。

本发明的第四个方面，提供一种CRISPR/Cas系统，包含本发明第二个方面的sgRNA和/或本发明第三个方面的生物材料。

优选地，所述CRISPR/Cas系统还包含：Cas蛋白和/或与Cas蛋白相关的生物材料；所述生物材料包含：f1)～f8)中至少一种：

f1)编码Cas蛋白的核酸分子；

f2)包含f1)所述核酸分子的表达盒；

f3)包含f1)所述核酸分子的载体；

f4)包含f2)所述表达盒的载体；

f5)包含f1)所述核酸分子的转基因细胞系；

f6)包含f2)所述表达盒的转基因细胞系；

f7)包含f3)所述载体的转基因细胞系；

f8)包含f4)所述载体的转基因细胞系。

优选地，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。

优选地，所述系统用于h1)～h6)中至少一种：

h1)降低害虫存活率；

h2)抑制害虫蜕皮；

h3)增加害虫表皮透明度；

h4)抑制害虫生长发育；

h5)降低害虫茧层率；

h6)防治害虫。

优选地，所述害虫包含无脊椎昆虫；进一步优选地，所述害虫包含鳞翅目昆虫；更进一步优选地，所述害虫包含蚕。

本发明的第五个方面，提供一种试剂，包含：g1)～g3)中至少一种；

g1)本发明第二个方面的sgRNA；

g2)本发明第三个方面的生物材料；

g3)本发明第四个方面的CRISPR/Cas系统。

优选地，所述试剂用于h1)～h6)中至少一种：

h1)降低害虫存活率；

h2)抑制害虫蜕皮；

h3)增加害虫表皮透明度；

h4)抑制害虫生长发育；

h5)降低害虫茧层率；

h6)防治害虫。

优选地，所述害虫包含无脊椎昆虫；进一步优选地，所述害虫包含鳞翅目昆虫；更进一步优选地，所述害虫包含蚕。

本发明的第六个方面，提供一种方法，包含：降低害虫中谷氨酰氨肽酶的表达量和/或活性的步骤；

所述方法为h1)～h6)中至少一种：

h1)降低害虫存活率；

h2)抑制害虫蜕皮；

h3)增加害虫表皮透明度；

h4)抑制害虫生长发育；

h5)降低害虫茧层率；

h6)防治害虫。

优选地，所述谷氨酰氨肽酶的登录号为XM_021347553。

优选地，所述降低害虫中谷氨酰氨肽酶的表达量和/或活性的步骤是将i1)～i4)中至少一种导入害虫体内和/或害虫卵内；

i1)本发明第二个方面的sgRNA；

i2)本发明第三个方面的生物材料；

i3)本发明第四个方面的CRISPR/Cas系统；

i4)本发明第五个方面的试剂。

优选地，所述导入的方式包含注射。

优选地，所述害虫包含无脊椎昆虫；进一步优选地，所述害虫包含鳞翅目昆虫；更进一步优选地，所述害虫包含蚕。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了谷氨酰氨肽酶在调控害虫存活率、害虫蜕皮、害虫表皮透明度、害虫生长发育、害虫茧层率以及防治害虫中的应用，抑制GluAP表达和/或其活性可以导致害虫不能正常完成蜕皮、幼虫表皮变半透明、多出一个发育龄期，从而导致害虫死亡；同时，降低害中的茧层率，达到防治害虫的效果，并且在防治过程中，不会产生抗药性、对人畜没有危害，且对环境没有污染。

附图说明

图1是家蚕GluAP突变体的基因型图：靶位所在的区域用直线标注，PAM序列用方框标注，发生缺失的碱基在峰形图和序列对比图中分别用红色箭头和短横线标注，靶位点的碱基用黄色背景标注；GluAP缺失纯合突变体的基因型缺失了1个碱基。

图2是缺失GluAP对家蚕存活的影响图：其中，(A)是GluAP缺失的家蚕(GluAP^-/-)幼虫各龄期的死亡率图；(B)是缺失GluAP对家蚕总死亡率的影响图；*表示p＜0.05。

图3是缺失GluAP对家蚕幼虫蜕皮的影响图：其中，(A)是GluAP缺失的家蚕(GluAP^-/-)幼虫各龄期的不能正常蜕皮导致死亡的比例图；(B)是缺失GluAP对家蚕幼虫蜕皮影响的直观图；*表示p＜0.05。

图4是缺失GluAP对家蚕表皮透明度的影响图。

图5是缺失GluAP对家蚕生长发育的影响图。

图6是缺失GluAP对家蚕吐丝能力的影响图：其中，(A)是缺失GluAP对家蚕茧层厚度影响的直观图；(B)是缺失GluAP对家蚕茧层率的影响图；*表示p＜0.05。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、设计并合成GluAP的sgRNA：

(1)从GenBank中下载家蚕GluAP的核酸序列(XM_021347553)，采用在线分析工具Splign(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi)分析该基因的内含子和外显子结构；GluAP基因的序列为：

ATGCTTACTAGACTCCTTACACACAATTTAAGAAAACTTGCTAACTTATTGAAGAATAACGCTAAGCATAGTCATTTTCCTTCAAAACTAGTAACAGAATACTCTGAGACTAAAATGAAAGATTGTGATCGATTGACACCTTTGGTTTATCCAACGAACTACGACCTCGTATTAAAACCCGATCTCAAGACAGGCGTTTTCGAGGGAACAGTAAAAATTAATATAACTGTAAAGGCGGACCAGAAAAAAATTGCTTTACACTCTAAGTTTTTAAAAATTAAGGGCTTAACGTTAAATAGAGGCGATGAAGCTATATCCATATTAAAGTATTCTAGAGAAAAACAATCACAGCAACTAGTGGTACATTTTGAGAATGTATTGAATTCAGGAAACTATCAAATGAATATTGAGTTCAGTGGTGATTTGACTAGAAAAATTGTTGGTTTCTATCTTTCACATTTAAAGGATAATAGgtatatgttaacaaactacttattctcaagaatacattatacaaatcaattataatataacaaagatattcaatgtaaattgtagagatggggccattctctgcaatatcatcttagaattttttatattaaatgtatattcttttacattatatgtaattataaattcaattctataaatttttcaatttgactaattttgagtattaagagtaacaaataattcacaataatttttttctaatttcagAACAATGGTAGCCAGTAAATTTCAGCCAACATATGCTCGCCAAGCATTCCCTTGTTTTGATGAGCCAGATTTCAAAGCCACATATGATATTGCACTTGTTAAACCCGAAGGGTATGTGGCATTGTCAAACATGAATgtaagtgtgtaaatccatttttagttatttatacctaaatagagcagagtaaataaaaactgtgggcgttttatgtgttttaatttttattattaaaagaagtgttctatccattcaagctttgtgatttttcagGAAATATCAGTGACACGGGACCCATCATCTGATTTAGAAACTGTCAAATTTGCGACCAGTGTCCCAATGTCGACATATCTGGCTTGTTTTGTTGTATGTGATTTTGGATATAAGGATGTTGAAATTAATACTTCTGGTATCGGAAATACTTTCAAACTTAGATCTTTTGCTCAAAAAAATGAACTTCATAAGATTGATTTTGCTCAAGACATTGGGAAGAGAGCTACTGAATTTTACATAAGATATTATGAAGTAGAATTTCCCTTGCCAAAATTAGgtaaaatatgttttatgattaaaaattatatttagggtgcactattattcaaaatattgccattgattataatcaataggtcagtttctgacttttgcaaagtatgagatgttatgcatgataaacattttttttatttacacatgaggattattgttcacttagaaatttatttatcacactgtttactatttttttcagATATGATTGCAATACCTGACTACATTTCTGGAGCCACTGAGCACTGGGGTCTTATAACATACAGAGAAACATCATTTCTGGTTGATGAGGCTACTGCTTCTGTTAAAAATAAGATCAGTATTGCTAATACTATAGCTCATGAACTGGCTCACATGTGGTTTGGAAATTTAGgtaaaactacggattagattattttacaaaagatgctattgatgtagaatatatgggcctacggtataataattttaccaataaaaataaaggaacaatgttattattatgatatcaaatatcatgttcatcggtcattgtcctgtgataattgccccagttttctgaataaaataaatatttttcaactaatcttgcagTGACAATGAAATGGTGGGATGAAGTATGGCTAAATGAAGGTTTTGCTTCCTACATGCAAGTTAAATCATTGAATGCAATTGAACCATCGTGGGCCATGgtaaatagtattttaataattaataattttattataatgcaattatatagtttcaaacacaaattgataatatcaagaaattggttttatgtgatagcctgatttgtaaatgatagccaattttttttaaattcattgatgtctcttttttcttttcctacctaagctggtagccttgagaggctattccagcgtaaccttaactagtaggtgagctcacggggctcaaacctgacgacgttgctaacacgaaccctagcaagagtcgtgcttcgcagaatctaccaccggatcggaaacacgacccactgagaatatccggcgagaaactcagtgggctgtgtctgagagttaatttactcgtcgagccctttgtcgcaagcgacggattcgacgagaacggtgaccggtgcttgaagtacctagaagcacctttagtggatcgatagttttgggcgacgtcgactgcttttcattttttccgcaggatcgggaatgttgatgtctccaataatagtttgacgtattgtaagctagcacaggtactaatactctgcctatttctggtgcgaagcagtcacgcgtttggattggaagtctatctaattacacaacccattttcgcatatttttaactgtcacaagtatatcaatattccgttttttcgtatacattagtgaaaaaactgataccgttttatttgcagTTGGATCAATTCTTAACAAAAACTGTTCATCCTGTACTAGTGACTGATGCCAAACTTTCAAGTCATCCTATAGTACAAACTGTGTCTACACCCGATCAGATAACATCAATATTTGACACAATTTCTTACAATAAAgtaagtatattgttactaggaccatggattgaagtacgattggtttaaaaaatattaattgcgcccagaagtgtggataacttttatactgtcactggagatattttaaagactagccattgatttcaattcttatttagtgcaatggtaatgtagacatatcatcaacttcagtgtggacttgtctactagtggaaatatgtaggtctctcaattttcactactaaacatgtacctttgcagattgttggaagaagaattatttgttattctcggtcattgagctcaatgcaaagtcagggtcaactgctagtgcagtcagatgccgttaattaccgtatgtaataccgctatttgtcacgataaaagaccaatcttgaggatttgctctgcaagccactaaggattggcgcacagctaactcgatctggtcagtccaccatatggatgaccccccacgtgattcggttacttctttggatactttatagcctttgcatatgagcacacggcccgcctgatggcatggtcaagttattggcaagatagaaatctagggtaaagtttacagggtaaattaaattaaagtcgtaattgaagtcgtcgtggcctaaaggataagacgtccggtgcattcggatctaacgatgcaccgatgttcgaatcccgcaggcgggtaccaaattttgtaatgaaatacgtagttcacaactgttcacgattgccttccattatcgaggaataacatcttatattaaaaataaaacctgcaaaaagtataatttgcgtaattatcagcgccctttctgcagtaatgcgtttcggtttgaagggctgggcaaccgttgtactgtatatatggggacgtagactcatatctcaatgtaggtggcagcatttacgttggagatgtctataggttccggtaatcatccatttaatcaataaattagtaaaaaatatcgtaatttctacaataaccactgattgtttaactgcagactaccgtttttgttttctctaaaccaaaactatgaaaccattaattcacagGGCGCATCCATATTAAGAATGCTCGAGGGTTTCATTGGCGAAGAAAACTTCCGTCGTGGCGTTTCAGATTACCTCAAGAAGTTTCAGTACGGTAATACAGTGACTCAAGATTTACTATCCTGTCTTGAAGTTTACTTTAAACAGGAAAATCCTGATTTAAGCCTGACgtaagtttagatatgacaatatgaaccatcataaataaataataaatgtttgtttggtttctgcttagcattttgctattgcctacgaatgtatggtccatttggtggatagtgtctctcatgaacatcggcattcgtagaatcataattattgacactgtatagggtaatgtgagcggccaagaagtgatttaaaaccaatcatttctgatgtcataaaattaaactgaataccttaagatttcagttttcagtcatggttagattaaggaatagagaaataagaaataattgagctgagagtgttttatgcttgcctaacttctatgattgctcttgttctccttggtttgacgagcatatggggttcaatctgagagaattcctaacatctgccctagcaagagcattgcttctctgtcggaattgcgacccgctgaaaagatccggcaagaaactcagtggattgtggattcctccgcggattaagttgcacgttgaaatctgtccggtgctttgaatgcctcaaagtaccgaaagtgaatgggcaggatcagaaatggcatgtatactcgtatttatggctattaatctaatgtataagggacatctatctaatttcccaaggtggtcttgacattgtgccgtcaatggactcaaagacttaagaataatcgatcttgataaataacgacccaaataacattttagTCACATCATGGATACGTGGACACAACAAATGGGTTATCCACTACTCTACGTTGAACCGGGGAATGGAACAAACACATACGTTGTTACTCAAAAACGGTTTTTGCTCGATCCTGACGCAGAATACACGAACGATTCGAAGTTCAAgtaagttttacttaacagaatcattatgaaatagaattgggtgttttaatttttctttttttaactaaatcaccgatttaagttgagtatttccataaaagttaatcgattaagtaaaaccgtattgctattggaatagaaa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ID NO.1，大写字母标注的为外显子区域，小写字母标注的为内含子区域，下划线标注的为sgRNA对应的靶位点区域)。

(2)根据N₂₀NGG的原则选择第一个外显区域(AAAACAATCACAGCAACTAGTGG，SEQ IDNO.2)作为靶位点；

(3)合成靶向该位点的一对sgRNA引物，GluAP_F1:TAATACGACTCACTATAGGAAAACAATCAC AGCAACTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC(SEQ ID NO.3)；GluAP_R1:AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTAT TTCT(SEQ ID NO.4)；并通过PCR法，其中，PCR反应体系为：ExTaq酶0.2μL，10×PCR Buffer 2μL，GluAP_F1(10μmol/L)1μL，GluAP_R1(10μmol/L)1μL，dNTP mix 1μL，灭菌水14.8μL；PCR反应程序为：95℃3min，95℃30s、55℃30s、72℃30s、35个循环，72℃10min；获得该sgRNA的双链DNA，序列为TAATACGACTCACTATAGGAAAACAATCACAGCAACTAGGTTTTAGAGCTAGAA ATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT(SE Q ID NO.5)。

(4)体外转录合成sgRNA：将步骤(3)得到的PCR产物进行胶回收后直接连接入T载体(大连宝生物公司)，并提取质粒DNA；以该质粒DNA为模板，用18T-F和18T-R(大连宝生物公司)为引物，按照上述步骤(3)中的PCR反应体系和反应程序通过PCR扩增获得sgRNA的DNA(PCR产物)；以该DNA为模板，使用MEGAscript^TM T7转录试剂盒(Promega)在体外合成sgRNA，合成体系如下：DNA模板1μg，10×反应缓冲液2μL，10mM ATP 1μL，10mM GTP 1μL，10mM CTP1μL，10mM UTP 1μL，T7Enzyme Mix 2μL，无核酸酶水to 20μL；反应过程如下：混匀反应液，37℃PCR仪中反应过夜。反应完成后，加入1μL TURBO Dnase，混匀后于37℃继续反应30min以消化掉DNA模板，得到sgRNA，其序列为：AAAACAAUCACAGCAACUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO.6)。

(5)sgRNA的纯化：向步骤(4)的反应产物内加入RNase-free water补至总体积200μL；加入等体积的体积比为25：24：1的酚：氯仿：异戊醇，12000rpm，4℃离心10min；取上清于新离心管中，加入1/10体积的NaAc(3M，pH＝5.2)和2倍体积预冷的异丙醇，-20℃静置1h；12000rpm，4℃离心10min，弃上清，加500uL预冷的75％乙醇洗涤沉淀；12000rpm，4℃离心5min，弃上清，通风橱内开盖晾干，加10～20μL RNase-free water溶解沉淀，取1μL稀释至5μL，测浓度并电泳检测纯度。sgRNA溶液于-80℃保存，以便用于后续显微注射。

2、显微注射及阳性突变体鉴定

(1)通过显微注射将sgRNA(600ng/μL)与cas9蛋白(400ng/μL)一起注射入发育早期的家蚕(广东省农科院蚕业与农产品加工研究所P50品系)卵内(总的注射量为1μg)，记为G0代。收集末龄幼虫退的皮，提取基因组DNA，用于后续的PCR鉴定。

(2)阳性突变体的PCR鉴定：采用PCR扩增sgRNA靶位点附近的GluAP基因片段。设计引物GluAP_F2：TAACGCTAAGCATAGTCATTTTCC(SEQ ID NO.7)和GluAP_R2:TGGCCCCATCTCTACAATTT AC(SEQ ID NO.8)；以家蚕基因组DNA为模板，进行PCR扩增，其中，PCR反应体系为：ExTaq酶0.2μL，10×PCR Buffer 2μL，GluAP_F2(10μmol/L)1μL，GluAP_R2(10μmol/L)1μL，dNTP mi x 1μL，基因组DNA 1μL，灭菌水13.8μL；PCR反应程序为：95℃3min，95℃30s、55℃30s、72℃30s、35个循环，72℃10min。

(3)PCR产物测序分析：将PCR产物直接进行测序，如果测序峰图在靶位点附近出现杂峰，则认为该个体的GluAP基因发生了移码突变(图1)；对于发生了移码突变的阳性个体，将其与野生型个体交配，并获得其卵，记为G1代；采用上述PCR扩增和测序的方法鉴定出G1代阳性个体，并自交，产下的卵记为G2代；采用上述PCR扩增和测序的方法，从G2代中鉴定出纯合的缺失突变体(sgRNA靶位点的两条DNA链均出现移码突变)，即为缺失GluAP的突变体家蚕(GluAP^-/-)。

3、GluAP缺失对家蚕发育的影响：

从第二龄幼虫开始，观察记录GluAP缺失突变体家蚕(GluAP^-/-)的蜕皮及死亡情况，每次随机检测50头个体，重复3次，并与野生型家蚕(CK，WT)相比较。结果发现，突变体家蚕在每个龄期均出现大量的死亡(死亡率显著高于野生型家蚕)，在4龄期的死亡率高达39.4％，但对照组在每个龄期的死亡率均低于4％(图2中(A))。所有GluAP缺失突变体个体在发育至成虫之前的总体死亡率(2龄期到5龄期的死亡率之和)为100％，而对照组的总体死亡率仅为12.4％(图2中(B))。对死亡的个体进一步分析后发现，突变组中有大量的个体死于蜕皮过程中，其中在4龄末期蜕皮时死亡的比率最高(23.4％，每个龄期死亡的头数相对于实验昆虫的总数的比率)，而对照组在各个龄期蜕皮时的死亡率均低于2％(图3)。此外，突变体家蚕幼虫相对于野生型家蚕表皮变得半透明(图4)，突变体相对于野生型家蚕个体变小，并且少数幼虫会多出一个发育龄期(图5)。这些结果意味着，缺失GluAP后家蚕的生长发育受到显著的影响，在发育至成虫前100％死亡。

4、GluAP缺失对茧层率的影响

采用电子天平称量突变体家蚕的茧丝重以及裸蛹重，计算茧层率(茧丝重/裸蛹重，这是衡量家蚕吐丝能力的关键指标)，并与野生型家蚕相比较。每次随机选取30头茧进行测量，重复3次。结果发现缺失突变体家蚕的茧显著变薄，并且突变体的茧层率(7.5％)显著低于野生型家蚕(14.3％)，即突变体家蚕的吐丝能力受到明显的影响(图6)。

综上所述，通过缺失GluAP基因(抑制GluAP基因的表达)，能够导致家蚕不能正常完成蜕皮、幼虫表皮变半透明、多出一个发育龄期，从而导致家蚕100％死亡；同时，降低家蚕的茧层率；即抑制GluAP表达和/或其活性可以导致家蚕不能正常完成蜕皮、幼虫表皮变半透明、多出一个发育龄期，从而导致家蚕死亡；同时，降低家蚕的茧层率，抑制其吐丝结茧。家蚕是一种典型的鳞翅目昆虫，因此该方法对鳞翅目类昆虫将具有很好的防治效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.谷氨酰氨肽酶抑制剂在b1)～b12)中至少一项中的应用：

b1)降低害虫存活率；

b2)制备降低害虫存活率的产品；

b3)抑制害虫蜕皮；

b4)制备抑制害虫蜕皮的产品；

b5)增加害虫表皮透明度；

b6)制备增加害虫表皮透明度的产品；

b7)抑制害虫生长发育；

b8)制备抑制害虫生长发育的产品；

b9)降低害虫茧层率；

b10)制备降低害虫茧层率的产品；

b11)防治害虫；

b12)制备防治害虫的产品；

所述害虫为家蚕；

所述谷氨酰氨肽酶抑制剂包含靶向谷氨酰氨肽酶的CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包含sgRNA；

所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统还包含：Cas9蛋白。

3.一种方法，包含：降低害虫中谷氨酰氨肽酶的表达量和/或活性的步骤；

所述方法为h1)～h6)中任一种：

h1)降低害虫存活率的方法；

h2)抑制害虫蜕皮的方法；

h3)增加害虫表皮透明度的方法；

h4)抑制害虫生长发育的方法；

h5)降低害虫茧层率的方法；

h6)防治害虫的方法；

所述降低害虫中谷氨酰氨肽酶的表达量和/或活性的步骤是将CRISPR/Cas9系统导入害虫体内和/或害虫卵内；

所述CRISPR/Cas9系统包含sgRNA；

所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述害虫为家蚕。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述CRISPR/Cas9系统还包含：Cas9蛋白。

5.根据权利要求3～4任一项所述的方法，其特征在于：

所述导入的方式为注射。