CN114058618A - 谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用。本发明首次公开了谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用，通过过靶标基因筛选并结合CRISPR/Cas9技术敲除GDH，证明了谷氨酸脱氢酶对害虫生长发育的重要性。本发明在害虫中利用转基因CRISPR/Cas9技术成功获得了GDH基因突变体，GDH基因突变严重影响害虫正常生长发育，个体变小，幼虫期易感染病毒而死亡：GDH基因突变导致的幼虫期大量死亡可用于害虫防治。

Description

谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用。

背景技术

昆虫是动物界种类和数量最多的生物类群之一，由35个目组成。鳞翅目是昆虫第二大目，不仅包括家蚕(Bombyx mori)这一重要的经济性昆虫，也包括棉铃虫(Helicoverpaarmigera)，斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，小菜蛾(Plutella xylostella)和松毛虫(Dendrolimus punctatus)等农林业害虫。针对这些害虫，传统的以化学农药为主的防治措施在杀灭害虫的同时对环境和其他生物造成了严重的危害，并且长期使用杀虫剂还会产生抗药性，因此提出一种既不污染生态环境又能有效防治鳞翅目害虫的手段是十分必要的。家蚕(Bmobyx mori)是鳞翅目的模式昆虫。家蚕除了具有模式生物的基本要素外，还有自身的特殊优势，例如基础研究历史悠久、多重测序数据和已实现人为控制等。家蚕作为现代生命科学研究的模式生物，已被应用到环境安全检测、抗菌药物筛选和人类疾病模型简历等多个方面，极大地推动了基础科学研究的发展。以模式昆虫家蚕为对象研究害虫防治，相关研究结果不仅能应用于害虫的检测及生物防治，而且能推广至益虫利用，使“益虫更益，害虫不害”，进而更好的开发利用昆虫资源。

谷氨酸脱氢酶(GDH)是一种六聚酶，可催化谷氨酸可逆转化为α-酮戊二酸和氨，同时将NAD(P)⁺还原为NAD(P)H。它存在于所有参与分解代谢和合成代谢反应的生物体中，是谷氨酸代谢的关键酶。由于其通过ADP激活和通过GTP失活的模式，并且α-酮戊二酸进入TCA循环可产生能量，这使得谷氨酸可取代葡萄糖作为能量来源，因而可以认为GDH在低能量供应状态下具有重要意义。GDH是能量和氨基酸代谢耦合的关键酶，在葡萄糖剥夺的条件下，它对谷氨酸和能量稳态的重要作用可能会增强。此外，由于它能够将谷氨酸的碳骨架汇集到TCA循环中，因此它是TCA循环中间体回补的一个组成部分。GDH的激活可以增加谷氨酸的氧化代谢，而谷氨酸是主要的兴奋性神经递质，被认为是大脑中的补充能量贡献者。

通过对多个代表性品系的家蚕和野蚕的重测序数据分析发现，这个基因是位于家蚕第六号染色体的一个被定位到家蚕茧丝产量相关的一个QTL基因。研究表明GDH敲除的转基因小鼠中枢神经系统中谷氨酸的代谢发生了变化；在培养的小鼠星形胶质细胞中，抑制GDH表达会导致TCA循环功能失调；脑GDH敲除的小鼠的下丘脑表现出能量剥夺状态，从而改变了整个身体的能量稳态。然而，人们对家蚕GDH的功能却了解很少。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用。

本发明第二方面的目的，在于提供谷氨酸脱氢酶抑制剂的应用。

本发明第三方面的目的，在于提供sgRNA。

本发明第四方面的目的，在于提供编码本发明第三方面的sgRNA的核酸分子。

本发明第五方面的目的，在于提供包含本发明第四方面的核酸分子的表达盒、载体或转基因细胞系。

本发明第六方面的目的，在于提供本发明第三方面的sgRNA、本发明第四方面的核酸分子、本发明第五方面的表达盒、载体或转基因细胞系的应用。

本发明第七方面的目的，在于提供一种CRISPR/Cas9系统。

本发明第八方面的目的，在于提供一种防治害虫的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用。

优选地，所述害虫为鳞翅目昆虫；进一步为蚕；更进一步为家蚕。

优选地，所述谷氨酸脱氢酶的基因的CDS如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个方面，提供谷氨酸脱氢酶抑制剂在(1)～(6)中任一种中的应用；

(1)防治害虫；

(2)制备防治害虫的产品；

(3)增加害虫幼虫期死亡率；

(4)制备增加害虫幼虫期死亡率的产品；

(5)降低害虫的幼虫体重；

(6)制备降低害虫的幼虫体重的产品。

优选地，所述谷氨酸脱氢酶抑制剂为降低谷氨酸脱氢酶活性的物质、或降解谷氨酸脱氢酶的物质、或降低谷氨酸脱氢酶表达水平的物质。

优选地，所述降低谷氨酸脱氢酶表达水平的物质为靶向谷氨酸脱氢酶的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、shRNA或CRISPR/Cas9系统。

优选地，所述谷氨酸脱氢酶抑制剂为靶向谷氨酸脱氢酶的CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统包含sgRNA，所述sgRNA包含sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

优选地，所述谷氨酸脱氢酶的基因的CDS如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述害虫为鳞翅目昆虫；进一步为蚕；更进一步为家蚕。

本发明的第三个方面，提供sgRNA，所述sgRNA包含sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明的第四个方面，提供编码本发明第三方面的sgRNA的核酸分子。

本发明的第五个方面，提供包含本发明第四方面的核酸分子的表达盒、载体或转基因细胞系。

优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。

本发明的第六个方面，提供本发明第三方面的sgRNA、本发明第四方面的核酸分子、本发明第五方面的表达盒、载体或转基因细胞系的应用。

(a1)～(a3)中任一种在(1)～(6)中任一种中的应用；

(a1)本发明第三方面的sgRNA；

(a2)本发明第四方面的核酸分子；

(a3)本发明第五方面的表达盒、载体或转基因细胞系；

(1)防治害虫；

(2)制备防治害虫的产品；

(3)增加害虫幼虫期死亡率；

(4)制备增加害虫幼虫期死亡率的产品；

(5)降低害虫的幼虫体重；

(6)制备降低害虫的幼虫体重的产品。

优选地，所述害虫为鳞翅目昆虫；进一步为蚕；更进一步为家蚕。

本发明的第七个方面，提供一种CRISPR/Cas9系统，包含：本发明第三方面的sgRNA。

优选地，所述CRISPR/Cas9系统还包含Cas9。

本发明的第八个方面，提供一种防治害虫的方法，将本发明七方面的CRISPR/Cas9系统导入害虫体内。

优选地，所述导入的方式为注射。

优选地，所述害虫为鳞翅目昆虫；进一步为蚕；更进一步为家蚕。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了谷氨酸脱氢酶(GDH)作为靶点在防治害虫中的应用，通过靶标基因筛选并结合CRISPR/Cas9技术敲除GDH，证明了谷氨酸脱氢酶(GDH)对害虫生长发育的重要性。本发明在害虫中利用转基因CRISPR/Cas9技术成功获得了GDH突变体，GDH突变严重影响害虫正常生长发育，个体变小，幼虫期易感染病毒而死亡：GDH突变导致的幼虫期大量死亡可用于害虫防治。在制备防治虫害药剂中使用昆虫谷氨酸脱氢酶抑制剂(降低谷氨酸脱氢酶活性的物质、或降解谷氨酸脱氢酶的物质、或降低谷氨酸脱氢酶表达水平的物质)，使得害虫在摄食旺盛、对农作物危害大的幼虫期就大量死亡，对病虫害可以达到持久性的控制，并且在防治过程中，不会产生抗药性、对人畜没有危害，且对环境没有污染。

附图说明

图1是11个物种中GDH蛋白系统进化分析图。

图2是7个鳞翅目物种中GDH蛋白序列分析图。

图3是转基因CRISPR/Cas9系统敲除GDH基因的靶位点选择图。

图4是家蚕遗传转化流程图。

图5是CRISPR/Cas9靶向突变GDH的结果图：其中，A是外显子区域选择两个23bp的靶标位点(TS1和TS2)图；B是激活品系质粒和效应品系质粒的结构图；C是家蚕GDH基因突变结果图。

图6是家蚕GDH基因突变体GDH基因表达量结果图。

图7是家蚕GDH基因敲除后幼虫期感染病毒性软化病的直观图。

图8是家蚕GDH基因敲除后幼虫期存活率结果图。

图9是家蚕GDH基因敲除后四、五龄期个体的直观图：其中，A是对照组四龄第二天时个体的直观图；B是GDH基因敲除后(△GDH)四龄第二天时个体的直观图；C是对照组五龄第三天时个体的直观图；D是GDH基因敲除后(△GDH)五龄第三天时个体的直观图。

图10是家蚕GDH基因敲除(△GDH)后四龄第二天(L4 D2)时、五龄第三天(L5 D3)时个体的体重统计结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1GDH蛋白系统发育树构建和蛋白序列分析

对11个物种中GDH蛋白同源序列进行了进化保守性分析。这些物种包括鳞翅目：家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、小菜蛾(Plutella xylostella)、菜青虫(Pieris rapae)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、金凤蝶(Papilio machaon)；双翅目：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；啮齿目：小家鼠(Mus musculus)；偶蹄目：野猪(Sus scrofa)；灵长目：人(Homo sapiens)。利用ML法(Maximum Likelihood)构建GDH蛋白系统发育树，通过自展法(Bootstrap,1000replicates)进行检验，使用泊松校验(Poisson correction)分析进化距离，并通过MEGA7进行数据分析。其蛋白序列系统进化分析结果表明进化相对保守，鳞翅目相聚一支(图1)。利用DNAMAN软件进行蛋白序列分析物种间GDH蛋白序列相似度，发现7种鳞翅目昆虫中GDH蛋白序列在进化上高度保守，一致性高达91.75％(图2)。这些数据为支撑GDH基因作为害虫防治的靶标提供了理论依据。

实施例2转基因CRISPR/Cas9系统敲除家蚕谷氨酸脱氢酶(GDH)基因

1、靶位点的选择

GDH基因的CDS序列共1665bp，具体序列为：ATGCTGCATCTCAAGAATATCGCCAAGTCAGTGGTTCCGCCGCTCAAGAATTCTGTTCAAAATGAAGCCCTCAATACAATGTTCCGAATCATACCAGCTGGAGTGAATGTCTGCTGCCGCACATACGCTAGTCATGAGATTCCAGATAAGCTCAAAGATATTCCTACAAGTGCGAATCCGAAGTTCTTCCACATGGTAGAATATTTTTTCCACCGAGCCTGTCAAGTTGTCGAAGACAAGCTTGTTGAAGATTTGAAGTCAAGGACACCCATTGAAGAGAAGAAAAAGAAAGTAGCCGGTATTCTAAAACTTATGGAACCATGCGATCACATTCTTGAGATTCAATTTCCTCTGAGGCGCGATTCTGGCGATTACGAAATGATATTAGGCTATCGCGCACAACATTCCACACACAGGACTCCAACCAAAGGAGGTATTCGATTCTCAACGGACGTAACCAGAGATGAAGTTAAGGCGTTATCAGCTTTGATGACCTTCAAGTGCGCGTGCGTGGACGTGCCTTTCGGCGGTGCTAAGGCCGGTATCAAGATCAATCCCAAAGAATACTCCGAGCATGAACTGGAAAAGATCACTCGTCGTTTCACCCTTGAACTTGCCAAAAAAGGATTCATTGGGCCTGGCGTGGATGTCCCCGCTCCTGACATGGGTACCGGCGAACGAGAAATGTCTTGGATCGCCGATACTTATGCGAAGACCGTCGGTTTTCAAGACATCAACGCTCACGCCTGCGTCACTGGCAAACCTATTAACCAGGGTGGCATCCACGGCAGAGTTTCAGCCACGGGCAGGGGCGTATTCCACGGCTTGGAGAACTTCATCAACGAAGCCAACTACATGAGCATGATCGGTACAACCCCCGGTTGGGGTGGCAAGACGTTCATCGTCCAAGGTTTCGGTAACGTGGGACTCCACACTTGCCGCTACCTCGTCCGCGCCGGCGCCACTTGCATCGGAGTTATCGAGCACGACGGCTCCATTTACAACCCTGATGGCATCAACCCTAAGGCCTTGGAGGACTACAGAATCGAGAACGGTACGGTAGTCGGTTTCCCCGGCGCTAAGGCCTACGAAGGCGAGAACATGCTTTACGAGAAGTGCGACATTCTTGTACCCGCCGCCATCGAACAGGTCATAAACAAGGACAACGCTCACAGGATCCAAGCTAAGATCATTGCGGAGGCCGCCAACGGTCCCACCACACCTGCTGCAGACAAGATCCTCATCGATCGCAACATTCTCGTGATCCCCGACCTCTACATCAACGCTGGTGGTGTCACCGTCTCATTCTTCGAGTGGCTCAAGAACCTCAATCACGTGTCTTACGGACGTCTGACATTCAAATACGAGAGGGAATCTAACTACCATCTGCTGGAATCGGTCCAAGAGTCTCTCGAGCGGCGGTTCGGTCGCGTGGGAGGCCGCATCCCCGTCACTCCCTCAGAGTCCTTCCAGAAGAGAATCTCCGGCGCCTCCGAGAAGGACATCGTGCACTCCGGACTCGACTACACCATGGAGAGATCCGCTAGGGCCATCATGAAGACAGCCATGAGGTTCAACCTCGGTTTAGATCTGAGGACAGCCGCGTATGCGAACTCCATCGAAAAGATATTCACCACGTATGCCGATGCCGGTCTAGCTTTCTAA(SEQ ID NO.1)，根据GDH基因的CDS序列，以GG(19N)GG的选择原则选择合适的位点；靶点选择后确认分别在第一、第七个外显子上(图3)，本申请中sgRNA作用的靶点一序列为GGCGATTACGAAATGATATTAGG(SEQ ID NO.2)，靶点二序列为GGAATCTAACTACCATCTGCTGG(SEQ ID NO.3)，sgRNA1的核苷酸序列为“GGCGATTACGAAATGATATT(SEQ ID NO.13)”、sgRNA2的核苷酸序列为“GGAATCTAACTACCATCTGC(SEQ ID NO.14)”，sgRNA中“T”相当于“U”。

2.转基因质粒的构建

为了敲除目标基因，构建双系统的CRISPR/Cas9体系，具体如下：激活品系质粒：pBac[IE1-EGFP-nos-Cas9](nos-Cas9)(已在文献：Xu J,Chen S,Zeng B,James AA,Tan A,Huang Y(2017)Bombyx mori P-element Somatic Inhibitor(BmPSI)Is a Key AuxiliaryFactor for Silkworm Male Sex Determination.PLoS Genet 13(1):e1006576.中公开)，表达Cas9蛋白的质粒由启动子Nos驱动，标记基因即绿色荧光蛋白基因(EGFP)由启动子IE1驱动；效应品系质粒为pXL-[3’pBac-IE1-DsRed2-U6₁-sgRNA_1--U6₂-sgRNA₂-5’pBac](U6-sgRNAs)(pBac[IE1-DsRed2-U6-BmGDHsgRNAs](U6-sgRNAs))，由U6₁启动子驱动sgRNA₁、U6₂启动子驱动sgRNA₂。通过SalI和NheI对已有基础质粒pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNA](已在文献：Xu J,Chen S,Zeng B,James AA,Tan A,Huang Y(2017)Bombyx mori P-elementSomatic Inhibitor(BmPSI)Is a Key Auxiliary Factor for Silkworm Male SexDetermination.PLoS Genet 13(1):e1006576.中公开)进行酶切，获得线性化的pXL-[3’pBac-IE1-DsRed2-U6₁-5’pBac]；按照5′-GG-N18-NGG-3′的规则在外显子上设计两个靶标序列sgRNA₁、sgRNA₂(CRISPRdirect：http://crispr.dbcls.jp/)然后设计两对引物(GDH-sg1-F、GDH-sg1-R、GDH-sg2-F、sg2-R)，以基础质粒：pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNA](U6-sgRNA)(已在文献：Xu J,Chen S,Zeng B,James AA,Tan A,Huang Y(2017)Bombyx mori P-element Somatic Inhibitor(BmPSI)Is a Key Auxiliary Factor for Silkworm MaleSex Determination.PLoS Genet13(1):e1006576.中公开)为模板进行两次PCR扩增分别获得sgRNA₁-U6₂、sgRNA₂。酶切产物、两次PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后回收胶产物，进行三片段同源重组，获得最终质粒pBac[IE1-DsRed2-U6-BmGDHsgRNAs](U6-sgRNAs)，重组完后进行转化、测序，测序结果正确的菌液进行大摇、大抽。具体如下：

(1)PCR获得sgRNA₁-U6₂、sgRNA₂，反应所用试剂盒为KOD(Toyobo)，反应体系，反应条件如下所示：

a反应体系：2mM dNTPs 5μL；10×Buffer for KOD-Plus-5μL；KOD Enzyme 1μL；25mM MgSO₄ 2μL；pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNA](100ng/μL)1μL；10pmol/μL Primer-F(GDH-sg1-F/GDH-sg2-F，序列如表1所示)1.5μL；10pmol/μL Primer-R(GDH-sg1-R/sg2-R，序列如表1所示)1.5μL；ddH₂O 33μL；

b反应条件：95℃变性5min，95℃变性30s，55℃复性30s，68℃延伸1min/1kb，扩增35个循环；68℃延伸保温10min，10℃保温。

表1引物序列

(2)双酶切基础质粒pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNA]

对基础质粒进行双酶切，反应体系如下：10×Buffer 2μL；SalI 1μL；NheI 1μL；基础质粒pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNA]2000ng；ddH₂O up to 20μL；反应条件：37℃，3h。

(3)琼脂糖凝胶电泳

分别将步骤(1)得到的PCR产物、步骤(2)得到的酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳来检测片段的大小：步骤(1)得到的PCR产物、步骤(2)得到的酶切产物中分别加入10μL的上样缓冲液(5×Loding Buffer)，用移液枪轻轻吹打混匀，然后加入到1.5％琼脂糖凝胶的胶孔中；将加入样品的琼脂糖凝胶放置于电泳槽中，170V恒压电泳10min；随后将琼脂糖凝胶转移至紫外照胶仪中拍照验证。

(4)胶收

电泳后，将琼脂糖凝胶放置于切胶仪上，切割目的条带进行胶回收，使用Omega^TMGel Extration Kit进行胶回收；具体如下：

1)将切割含有目的条带的胶块放入1.5mL离心管中，用移液枪加入400μL BindingBuffer，60℃水浴10min；

2)待胶块溶解后，用移液枪将溶解液加入至吸附柱中，使用常温离心机12000rpm离心1min；

3)缓缓弃掉下部液体，用移液枪加入700μL SPW Wash Buffer，使用常温离心机12000rpm离心1min；

4)缓缓弃掉下部液体，使用常温离心机12000rpm离心2min；

5)取出吸附柱，室温放置5min；

6)将吸附柱转移至1.5mL离心管中，用移液枪在吸附柱的吸附膜中间加入30μLRNA free H₂O，使用常温离心机12000rpm离心1min；

7)使用Onedrop OD-1000紫外-可见光全光谱分光光度计测量胶收产物浓度。

(5)三片段同源重组

将步骤(4)胶回收得到的pXL-[3’pBac-IE1-DsRed2-U6₁-5’pBac]、sgRNA₁-U6₂、sgRNA₂利用

Seamless Cloning and Assembly Kit试剂盒进行同源重组，反应体系如下：pXL-[3’pBac-IE1-DsRed2-U6₁-5’pBac](100ng/μL)1μL；sgRNA₁-U6₂(50ng/μL)2.5μL；sgRNA₂(50ng/μL)1.5μL；2×Basic Assembly Mix 5μL；反应条件为50℃，15min。

(6)转化

感受态细胞为商业化的DH5α感受态细胞，培养基为液体和固体的LB(Luria-Bertani)培养基(10g/L NaCl)，所有操作都在超净工作台中进行；具体如下：

1)取-80℃超低温冷冻的DH5α感受态细胞置于冰上，用移液枪缓缓转移至1.5mL离心管，同时将10μL连接产物(步骤(5)同源重组产物)加入离心管，并用移液枪轻轻吹打混匀后冰上放置20min。

2)将步骤1)得到的含有混合液的1.5mL离心管密封后置于42℃水浴锅中热处理90s，立即冰上放置3min。

3)用移液枪加入200uL液体LB(Luria-Bertani)培养基，置于37℃恒温培养箱复苏培养1h。

4)将复苏后的菌液涂于含有100μg/mL氨苄青霉素抗生素的固体LB培养基，置于37℃恒温培养箱中培养10h。

5)使用已高温灭菌的牙签挑取培养基上的单菌种，接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的100mL液体LB培养基，置于37℃恒温培养箱培养10h，并收集菌液。

(7)质粒大抽及纯化

将构建好并且测序正确的转基因质粒转化到感受态DH5α细胞中进行大量扩增，置于200mL的液体LB培养基250rpm过夜培养(16小时)，质粒提取使用德国QIAGEN公司的大抽试剂盒(QIAGEN plasmid midi kit)，步骤按照说明书进行并稍作优化：

1)将过夜培养的细菌4℃离心收集并晾干；

2)加入4mL的Buffer P1彻底充分悬浮细菌；

3)加入4mL的Buffer P2，轻轻的上下颠倒几次，并静置5分钟，使其充分裂解；

4)加入4mL的Buffer P3，轻轻的上下颠倒几次，使蓝色指示剂全部变白即可；

5)冰上放置15分钟；

6)6000rpm离心10分钟，在此期间将吸附柱放于收集管中，并加入4mL的平衡液Buffer QBT，自然重力流干；

7)将上清液倒入吸附柱中，自然重力流干；

8)分两次加入10mL的Buffer QC，自然重力流干；

9)加5mL的Buffer QF，过滤液收集在7个1.5mL的离心管中；

10)在1.5mL的离心管中的过滤液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，pH8.0，上海生工)，剧烈震荡混匀；

11)12000rpm离心10分钟；

12)取上清至新的离心管中，加入2.5倍的无水乙醇和0.1倍的醋酸钠；

13)-70℃放置20分钟；

14)13200rpm离心10分钟；

15)倒掉上清，加入1mL的75％的乙醇，上下颠倒；

16)13200rpm离心5分钟；

17)重复(15)、(16)步骤三次；

18)收集沉淀并晾干，加入Nuclease-Free water(Invitrogen)，放入-20℃保存。

(8)体外转录piggyBac转座子mRNA

1)构建含有piggyBac体外转录载体piggyBac mRNA IFP2：piggyBac转座酶IFP2基因(序列已在文献：Cary LC,Goebel M,Corsaro BG,Wang HG,Rosen E,FraserMJ.Transposon mutagenesis of baculoviruses:analysis of Trichoplusia nitransposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosisviruses.Virology.1989Sep；172(1):156-69.中公开)送公司合成后、连接到含有T7启动子的pJET1.2-blunt载体上，反应体系如下：pJET1.2/blunt(CloneJET PCR Cloning Kitwith DH10B Competent Cells，货号：K123240，公司：Thermo)1μL；10XReactionBuffer 1μL；T4 lingase 1μL；IFP2(200ng/μL)7μL；反应条件为16℃，12h；

2)质粒线性化：1)中连接好的质粒用Anza^TM 12XbaI(Fermentas)试剂盒进行线性化，反应体系：Buffer 10μL；XbaI 5μL；质粒模板(1000ng/μL)10μL；FastAp 2μL；ddH₂O 73μL；反应条件为37℃，15min；

3)纯化线性化的质粒：加入100μL的Nuclease-Free water(Invitrogen)，将步骤2)得到的酶切产物补齐至200μL；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，pH 8.0，上海生工)，涡旋充分混匀，4℃，12000rpm，离心10min；将上清液转移至新的进口EP管中，加入10％体积的3M NaAc，混匀；加入600μL的无水乙醇，上下颠倒混匀；静置于-80℃沉淀20分钟；4℃，12000rpm，离心10min；弃上清，加入1000mL75％的乙醇4℃，12000rpm，离心10min；重复步骤上一步两次；弃上清，待酒精挥发干净后加入10μL体积的Nuclease-Free water(Invitrogen)溶解沉淀、分装备用；

4)合成mRNA：用mMESSAGE

T7 Kit(Ambion)试剂盒进行体外转录，反应体系如下：2XNTP/CAP 10μL；线性化的质粒(500ng/μL)1μL；10X ReactionBuffer 2μL；Enzyme Mix 2μL；Nuclease-Free water to 5μL；反应条件为37℃，12h；

5)去除基因组DNA并纯化：合成的mRNA用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion)去除基因组DNA，具体如下：在4)中反应体系中加入2μL DNaseI，37℃消化30min；纯化步骤同3)，最后加入50μl Nuclease-Free water(Invitrogen)溶解沉淀、分装备用。

3、胚胎显微注射和阳性个体筛选

将转基因质粒(步骤2得到的效应品系质粒，终浓度为400ng/uL)、helper plasmid(辅助质粒，终浓度为400ng/uL，已在文献：an A,Tanaka H,Tamura T,ShiotsukiT.Precocious metamorphosis in transgenic silkworms overexpressing juvenilehormone esterase.Proc Natl Acad Sci USA.2005Aug 16；102(33):11751-6.中公开)和piggyBac转座子mRNA(终浓度为200ng/uL)均匀混合起来，得到混合质粒一；将转基因质粒(步骤2中的激活品系质粒，终浓度为400ng/uL)、helper plasmid(辅助质粒，终浓度为400ng/uL，已在文献：an A,Tanaka H,Tamura T,Shiotsuki T.Precocious metamorphosisin transgenic silkworms overexpressing juvenile hormone esterase.Proc NatlAcad Sci USA.2005Aug 16；102(33):11751-6.中公开)和piggyBac转座子mRNA(终浓度为200ng/uL)均匀混合起来，得到混合质粒二。

野生型Nistari品系成虫交配5h后，收集雌蛾2h内产下的新鲜蚕卵，清洗干净之后整齐成排摆于载玻片上并用胶水固定，用甲醛熏5min进行表面消毒。使用Eppendorf显微注射仪将混合质粒一、二注射入家蚕胚胎，并用胶水封闭注射孔。注射之后的卵置于25℃恒温培养箱中恒温培养，大约10天后蚕卵孵化出蚁蚕，收集蚁蚕养至成虫，此代即为G0代。将G0代雌雄蛾交配，随后将交配后的雌蛾放置于产卵纸上产卵，此卵成为G1代。注射混合质粒一的G1代蚕卵发育到点青期时在荧光显微镜下筛选带有红色荧光标记的阳性效应品系个体，注射混合质粒二的G1代蚕卵发育到点青期时在荧光显微镜下筛选带有绿色荧光标记的阳性激活品系个体。将G1代阳性激活品系与G1代阳性效应品系进行杂交获得G2代，利用荧光显微镜筛选G2代中同时具有绿光和红光的双阳性突变体品系为实验组，即突变体，无光的个体为对照组(图4)。

4、突变检测和稳定性遗传分析

在基因靶点上下游约350bp～1000bp的位置，设计并合成正、反向引物(BmGDH-KO-F1、BmGDH-KO-R1、BmGDH-KO-F2、BmGDH-KO-R2，序列如表1所示)，以突变体(G2代中双阳性突变体品系)基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，将PCR产物收集并连接至pJET1.2-blunt载体中，然后转化于DH5α感受态细胞，经过涂板后挑选单克隆进行碱基测序，测序获得的结果通过SnapGene软件进行碱基序列比对分析，并确认不同的序列碱基突变情况，经过检测，产生了不同数量碱基缺失的GDH突变体，在基因的cds序列上设计并合成qPCR正、反向引物(BmGDH-q-F、BmGDH-q-R，序列如表1所示)，提取突变体(G2代中双阳性突变体品系)预蛹期全虫RNA并反转录成cDNA，用TOYOBO SYBR Green Realtime PCR Master Mix进行mRNA相对含量的测定。具体如下：

(1)RNA提取和cDNA合成：取突变体和对照组预蛹期全虫加入500μL TRIzol(Invitrogen)试剂，用灭菌的匀浆器进行匀浆，混匀后室温放置5分钟；加入100μL氯仿，充分混匀，室温静置5分钟后于4℃，13200rmp离心10分钟；吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，pH 8.0，上海生工)进行纯化；离心后取上清液，加入10％体积的3M的醋酸钠于-80℃沉淀20分钟以上；离心后弃上清，加入1000m L 75％的乙醇4℃，12000rpm，离心10min；重复步骤上一步两次；弃上清，待酒精挥发干净后加入50μL体积的Nuclease-Free water(Invitrogen)溶解沉淀；取1μg的纯化后总RNA，用RevertAid First-StrandcDNA synthesis kit(Fermentas)进行cDNA合成；反应体系：RNA(1000μg/μL)1μL；5XReaction buffer 4μL；Random Hexamer Primer 0.5μL；Oligo(dT)18Primer 0.5μL；RevertAid Reverse Transcriptase 1μL；RiboLock RNase Inhibitor 1μL；dNTP Mix 2μL；Nuclease-Free water 10μL，反应条件：25℃5min；42℃60min；70℃5min。

(2)用TOYOBO SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒进行mRNA相对含量的测定。反应体系：SYBR 10μL；cDNA 1μL；BmGDH-q-F(10pmol/μL)0.5μL；Bm GDH-q-R(10pmol/μL)0.5μL；Nuclease-Free water(Invitrogen)8μL；反应程序：步骤194℃,3min；步骤2 94℃,20s；步骤3 55℃,20s；步骤2与步骤3循环35次；每组反应取三个生物学重复进行；cDNA 进行10倍梯度稀释后作为标准曲线的模板；以家蚕ribosomal protein 49(Bmrp49)为内参，(基因序列如下：TTTCTTTTCCCTTCTCGTGCGGCCGTGTCACCGCGTGGTTCACTGTCGCGTTTCTAAAAGAAACATACAAGATGGCTATAAGACCTGTTTACAGGCCGACAATCGTCAAAAAGAGGACGAAGAGATTTATCAGGCATCAATCGGATCGCTATGACAAACTTAAGAGGAATTGGCGTAAACCTAGAGGTATGTTCACATGTCATTTATAAAGTTGAACATAAACTTTGTAAAAACTGTGATTAAGGACTAATATCACCCGTATAGTTAAATTTTAGGAATTGATGCAATATATAAACGATTGTTACTATATTTAATGTGATTTTTTTTTATTTACAAAAATAACCTGTTCTTAGGTTATGTATTGAAACCGTATTAATTAAAAAAAGAATACAAGTGTACTAAACGTAATTTCTACAGCATTATAACCAAAAATATTTTATCTACTAATTAATAAAATTACAAATCTTTACAATTCTCATTCAAAACTAATCAACACATTTCAAACAGGAACACATTTTTTCTATACAAAACATGCAAGGGCACTCTGTGTTATACATCCTAAATATGATAATTACAATTTGTTACCTTGCTACATAAAATCTGCTGAACCCTATTCCGGACAGCTTTGAAGTTGTCGTTCGGTCATATTGGCAGAAACATTTTAATAATAAGAAAAATTACACTAGAAATATGCGACTGAAGGTTCATTAGGCCGTGGCTTCGATGTTGAGAACATATATTGCATGAAGAAAGTATCTTAAGTAAAGAGCTGTCATGGGGGTCTGGTTTGAGGGACAAGACACACCTTAATTAATTCGAGGCATACAAAATTACCAAGAGAGCAACAAACAAATATTTTGTCAATATTTGATATTTATCATGCACATGGGATCGACATCACTGGCCTGATGGATAAAGCCCCTGCTGTTCTCATATCGAGCAATGCAAGATTGTCACTGTTCAATTCCTGAATGCATGTTCACAAATGACTCACAATTTGAACCCTTGGTAATTGATACACAATTGGGATACAGACTGAGTCGAGTCTCAAATTGCATGTCTATGGGTTACAATAATCACTTCACATTAAGTGAGCCATGAGCTTGTTCATTTGCTATTATGATAAAAATAAAAAATCTCCACCTTAATGTTGAAAAATCTATACTACCCACAAGTTCTGACAGACACAAAAACTAGCACATAATTGTTAAATCGTTAAATAAATTTCAGGTATTGACAACAGAGTCCGCAGGCGGTTCAAGGGTCAATACTTGATGCCCAACATTGGTTACGGTTCCAACAAGAAGACCCGTCATATGCTCCCAAATGGATTCCGTAAGGTTTGTAATGAATATTGTAAGATACACAAGCAGATCGATAATTTAAATGATTTTTGTACACAACAATTGACTGTTTACCGTGCTATCATCCCAGCCATACCATTAGCTAATATGATATGCAAAAAATTATAGTTTAAGGTTTCAAGCTATAAAGAACTGTTTCTCCACTCGGATATTATTATTTGGAATTTGAGGCCTTAATTCCATCAGATCCATACTTTAAGATTATAAATGGTATTTTTTGTTTGTCCTTCTTCCCATCGAGACAAAACAATAGATTGATATGTTATTTAAAAGTGATCATATTAGGTCAAGAGTGTAAAATGTATGCATTAGTTAATCCTCTAGTGATAAGTGTATGCAGCCCGTTTTTGCATCTTTACCAGACATTTAAAGTTCAAAATTTGTAAAAAGATATGTATGGCTTAACAAAAAAACTTCTTCGACTGTTTAAACAGAGTAAACTTAATTGTAGTTCAATTAAAAATGGTAAACTGTTGATGCCGATACCAAATAAAACGCACCTATAATTAAAAGATATATTTTGCGTATAAAACCTCCATGATATAGCTGTTTATATGGATTATTTCTCTCATTTCTGTATTACCGTCTATTAGGGTGTTTCCCAATGTGGGTCCCATGCTCCACAAGAGGGTAATTTGATAATTAAGGGAGGCAATTGCACTAAATTAATATAGAAAATCTGTGTTAACATTATTTTGAAATTGAATTTCAGTTTTTTATTATATGTTCTGATAACAATTTCATAGTGATTTCTTCCTAAAACCTATCATTTATGTTAAATGAACAAATCAATTTTTTTATGTTAAACTTTCAGCATGGGGGGCATAAAAATTTTAGAGGTGTTACAGCGGTCTACTGGTGTTTTGTTTACTGGTGGTAGTACCTCTTGTGAGTCTGCACGGGTAGGTACCACCACCCCTCTTATTTCCGCCATGAAGCAGTAATGCATTTCGGTTTGAAGGGTAGGGCAGCCGTTGTAGCTATACTTGAGACCTTAGAACTTATGTCTCAAGATGGGTGGCGCATTTACGTTGTAGATGTCTGAGCTCCAGTAACCACATAACACCAGGTGGACTGTGGGTTCGTCCACCAATCTATGCAATAAAAAAAAATAAAAAAAACATACAGACAGACAGACAATCCAATTTTCTTTATATGGATAGATTTCTAACTTAAAACTTATGTATGGGGGCGGGCAGAAAAATTTTAGAAATGTTACAGTGGGGCGTGGTACAAAAAAAGGTTGGGAAACACTGGTCTAGTCTAAAGGGGTTAAAACTTCAATAAATTTACCAATAAATCTTTCAACAGGTCCTAGTTCACAATGTTAAAGAGCTGGAAATCTTGATGATGCAAAACAGGAAGTACTGCGCAGAGATCGCTCATGGTGTCTCTTCGAAGAAGCGGAAGCTGATCGTGGAAAGAGCCCAGCAGCTCAGCATCAGAGTGACGAATGCGGCCGCTCGCCTCCGCTCCCAGGAGAATGAATAAATATAATTGTATTATAAGTTC，SEQ ID NO.12)所有数据用Bmrp49的值进行校正后，用Graph PadPrism version 5.01进行作图。

家蚕激活品系(nos-Cas9)和效应品系(U6-sgRNAs)杂交后会产生四种品系，包括有双荧光的突变品系、nos-Cas9品系、U6-sgRNAs品系和无荧光非突变体品系，双荧光突变体在每一代中重复检测和确认突变，即便这四种品系任意杂交也只会产生这四种类型的后代。

由于家蚕GDH基因由9个外显子和8个内含子组成，本实施例在外显子区域选择两个20bp的靶标位点(TS1和TS2)(图5中A)。利用piggyBac转座子介导的转基因载体，构建含有荧光蛋白标记的转基因敲除质粒，包括激活品系质粒和效应品系质粒，其质粒分别含有绿色荧光蛋白标记和红色荧光蛋白标记(图5中B)，对筛选得到的突变体基因组进行突变检测，测序发现两个位点均有不同碱基数量的删除(图5中C，图中1、2、3、4为随机选取的4个突变体)，结果显示，家蚕GDH基因组序列破坏并成功获得家蚕GDH基因突变阳性个体。对筛选得到的突变体GDH表达量进行检测，qPCR结果显示突变体GDH表达量(△BmGDH)相较对照组(Wild type)显著降低(图6)。上述结果均表明，家蚕GDH基因组序列破坏并成功获得家蚕GDH基因突变阳性个体。

实施例3家蚕GDH基因敲除(采用CRISPR/Cas9系统敲除)的表型

(1)幼虫期死亡率增加

相比对照组(GDH未敲除，Wild type)，GDH敲除的突变体(△BmGDH)在实验室环境中更易感染病菌而死亡，如图7所示，GDH敲除(△BmGDH)的虫体相比对照组更容易感染病毒性软化病，三龄期死亡率高达58.9％(图8)；极少个体能够存活至五龄和游走期，因而敲除鳞翅目昆虫GDH会导致幼虫期大量死亡。

(2)幼虫体重降低

相比对照组(GDH未敲除，Wild type)，GDH敲除的突变体(△BmGDH)从三龄起个体大小与对照组差异逐渐增大(图9)，体重明显降低(图10)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南师范大学

中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1665

<212> DNA

<213> Bombyx mori Linnaeus

<400> 1

atgctgcatc tcaagaatat cgccaagtca gtggttccgc cgctcaagaa ttctgttcaa 60

aatgaagccc tcaatacaat gttccgaatc ataccagctg gagtgaatgt ctgctgccgc 120

acatacgcta gtcatgagat tccagataag ctcaaagata ttcctacaag tgcgaatccg 180

aagttcttcc acatggtaga atattttttc caccgagcct gtcaagttgt cgaagacaag 240

cttgttgaag atttgaagtc aaggacaccc attgaagaga agaaaaagaa agtagccggt 300

attctaaaac ttatggaacc atgcgatcac attcttgaga ttcaatttcc tctgaggcgc 360

gattctggcg attacgaaat gatattaggc tatcgcgcac aacattccac acacaggact 420

ccaaccaaag gaggtattcg attctcaacg gacgtaacca gagatgaagt taaggcgtta 480

tcagctttga tgaccttcaa gtgcgcgtgc gtggacgtgc ctttcggcgg tgctaaggcc 540

ggtatcaaga tcaatcccaa agaatactcc gagcatgaac tggaaaagat cactcgtcgt 600

ttcacccttg aacttgccaa aaaaggattc attgggcctg gcgtggatgt ccccgctcct 660

gacatgggta ccggcgaacg agaaatgtct tggatcgccg atacttatgc gaagaccgtc 720

ggttttcaag acatcaacgc tcacgcctgc gtcactggca aacctattaa ccagggtggc 780

atccacggca gagtttcagc cacgggcagg ggcgtattcc acggcttgga gaacttcatc 840

aacgaagcca actacatgag catgatcggt acaacccccg gttggggtgg caagacgttc 900

atcgtccaag gtttcggtaa cgtgggactc cacacttgcc gctacctcgt ccgcgccggc 960

gccacttgca tcggagttat cgagcacgac ggctccattt acaaccctga tggcatcaac 1020

cctaaggcct tggaggacta cagaatcgag aacggtacgg tagtcggttt ccccggcgct 1080

aaggcctacg aaggcgagaa catgctttac gagaagtgcg acattcttgt acccgccgcc 1140

atcgaacagg tcataaacaa ggacaacgct cacaggatcc aagctaagat cattgcggag 1200

gccgccaacg gtcccaccac acctgctgca gacaagatcc tcatcgatcg caacattctc 1260

gtgatccccg acctctacat caacgctggt ggtgtcaccg tctcattctt cgagtggctc 1320

aagaacctca atcacgtgtc ttacggacgt ctgacattca aatacgagag ggaatctaac 1380

taccatctgc tggaatcggt ccaagagtct ctcgagcggc ggttcggtcg cgtgggaggc 1440

cgcatccccg tcactccctc agagtccttc cagaagagaa tctccggcgc ctccgagaag 1500

gacatcgtgc actccggact cgactacacc atggagagat ccgctagggc catcatgaag 1560

acagccatga ggttcaacct cggtttagat ctgaggacag ccgcgtatgc gaactccatc 1620

gaaaagatat tcaccacgta tgccgatgcc ggtctagctt tctaa 1665

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcgattacg aaatgatatt agg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaatctaac taccatctgc tgg 23

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atatcgtgct ctacaagtgg cgattacgaa atgatattgt tttagagcta gaaata 56

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcagatggta gttagattcc acttgtagag cacgatattt 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggaatctaac taccatctgc gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttttcttgtt atagatatca agctgctaga aaaaaaagca ccgactcgg 49

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgctgcatc tcaagaatat cgc 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cattcgacat cgaaaccatt caca 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgctcacagg atccaagcta ag 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctcgagagac tcttggaccg att 23

<210> 12

<211> 2876

<212> DNA

<213> Bombyx mori Linnaeus

<400> 12

tttcttttcc cttctcgtgc ggccgtgtca ccgcgtggtt cactgtcgcg tttctaaaag 60

aaacatacaa gatggctata agacctgttt acaggccgac aatcgtcaaa aagaggacga 120

agagatttat caggcatcaa tcggatcgct atgacaaact taagaggaat tggcgtaaac 180

ctagaggtat gttcacatgt catttataaa gttgaacata aactttgtaa aaactgtgat 240

taaggactaa tatcacccgt atagttaaat tttaggaatt gatgcaatat ataaacgatt 300

gttactatat ttaatgtgat ttttttttat ttacaaaaat aacctgttct taggttatgt 360

attgaaaccg tattaattaa aaaaagaata caagtgtact aaacgtaatt tctacagcat 420

tataaccaaa aatattttat ctactaatta ataaaattac aaatctttac aattctcatt 480

caaaactaat caacacattt caaacaggaa cacatttttt ctatacaaaa catgcaaggg 540

cactctgtgt tatacatcct aaatatgata attacaattt gttaccttgc tacataaaat 600

ctgctgaacc ctattccgga cagctttgaa gttgtcgttc ggtcatattg gcagaaacat 660

tttaataata agaaaaatta cactagaaat atgcgactga aggttcatta ggccgtggct 720

tcgatgttga gaacatatat tgcatgaaga aagtatctta agtaaagagc tgtcatgggg 780

gtctggtttg agggacaaga cacaccttaa ttaattcgag gcatacaaaa ttaccaagag 840

agcaacaaac aaatattttg tcaatatttg atatttatca tgcacatggg atcgacatca 900

ctggcctgat ggataaagcc cctgctgttc tcatatcgag caatgcaaga ttgtcactgt 960

tcaattcctg aatgcatgtt cacaaatgac tcacaatttg aacccttggt aattgataca 1020

caattgggat acagactgag tcgagtctca aattgcatgt ctatgggtta caataatcac 1080

ttcacattaa gtgagccatg agcttgttca tttgctatta tgataaaaat aaaaaatctc 1140

caccttaatg ttgaaaaatc tatactaccc acaagttctg acagacacaa aaactagcac 1200

ataattgtta aatcgttaaa taaatttcag gtattgacaa cagagtccgc aggcggttca 1260

agggtcaata cttgatgccc aacattggtt acggttccaa caagaagacc cgtcatatgc 1320

tcccaaatgg attccgtaag gtttgtaatg aatattgtaa gatacacaag cagatcgata 1380

atttaaatga tttttgtaca caacaattga ctgtttaccg tgctatcatc ccagccatac 1440

cattagctaa tatgatatgc aaaaaattat agtttaaggt ttcaagctat aaagaactgt 1500

ttctccactc ggatattatt atttggaatt tgaggcctta attccatcag atccatactt 1560

taagattata aatggtattt tttgtttgtc cttcttccca tcgagacaaa acaatagatt 1620

gatatgttat ttaaaagtga tcatattagg tcaagagtgt aaaatgtatg cattagttaa 1680

tcctctagtg ataagtgtat gcagcccgtt tttgcatctt taccagacat ttaaagttca 1740

aaatttgtaa aaagatatgt atggcttaac aaaaaaactt cttcgactgt ttaaacagag 1800

taaacttaat tgtagttcaa ttaaaaatgg taaactgttg atgccgatac caaataaaac 1860

gcacctataa ttaaaagata tattttgcgt ataaaacctc catgatatag ctgtttatat 1920

ggattatttc tctcatttct gtattaccgt ctattagggt gtttcccaat gtgggtccca 1980

tgctccacaa gagggtaatt tgataattaa gggaggcaat tgcactaaat taatatagaa 2040

aatctgtgtt aacattattt tgaaattgaa tttcagtttt ttattatatg ttctgataac 2100

aatttcatag tgatttcttc ctaaaaccta tcatttatgt taaatgaaca aatcaatttt 2160

tttatgttaa actttcagca tggggggcat aaaaatttta gaggtgttac agcggtctac 2220

tggtgttttg tttactggtg gtagtacctc ttgtgagtct gcacgggtag gtaccaccac 2280

ccctcttatt tccgccatga agcagtaatg catttcggtt tgaagggtag ggcagccgtt 2340

gtagctatac ttgagacctt agaacttatg tctcaagatg ggtggcgcat ttacgttgta 2400

gatgtctgag ctccagtaac cacataacac caggtggact gtgggttcgt ccaccaatct 2460

atgcaataaa aaaaaataaa aaaaacatac agacagacag acaatccaat tttctttata 2520

tggatagatt tctaacttaa aacttatgta tgggggcggg cagaaaaatt ttagaaatgt 2580

tacagtgggg cgtggtacaa aaaaaggttg ggaaacactg gtctagtcta aaggggttaa 2640

aacttcaata aatttaccaa taaatctttc aacaggtcct agttcacaat gttaaagagc 2700

tggaaatctt gatgatgcaa aacaggaagt actgcgcaga gatcgctcat ggtgtctctt 2760

cgaagaagcg gaagctgatc gtggaaagag cccagcagct cagcatcaga gtgacgaatg 2820

cggccgctcg cctccgctcc caggagaatg aataaatata attgtattat aagttc 2876

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggcgattacg aaatgatatt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggaatctaac taccatctgc 20

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggaaccatgc gatcacattc ttgagat 27

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggtcatcaaa gctgataacg ccttaa 26

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcaatcggat cgctatgaca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgacgggtc ttcttgttgg 20

Claims (10)

1.谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用。

2.谷氨酸脱氢酶抑制剂在(1)～(6)中任一种中的应用；

(1)防治害虫；

(2)制备防治害虫的产品；

(3)增加害虫幼虫期死亡率；

(4)制备增加害虫幼虫期死亡率的产品；

(5)降低害虫的幼虫体重；

(6)制备降低害虫的幼虫体重的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述谷氨酸脱氢酶抑制剂为降低谷氨酸脱氢酶活性的物质、或降解谷氨酸脱氢酶的物质、或降低谷氨酸脱氢酶表达水平的物质。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述降低谷氨酸脱氢酶表达水平的物质为靶向谷氨酸脱氢酶的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶、shRNA或CRISPR/Cas9系统；

优选地，所述谷氨酸脱氢酶抑制剂为靶向谷氨酸脱氢酶的CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统包含sgRNA，所述sgRNA包含sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

5.sgRNA，所述sgRNA包含sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

6.编码权利要求5所述的sgRNA的核酸分子。

7.包含权利要求6所述的核酸分子的表达盒、载体或转基因细胞系。

8.(a1)～(a3)中任一种在(1)～(6)中任一种中的应用；

(a1)权利要求5所述的sgRNA；

(a2)权利要求6所述的核酸分子；

(a3)权利要求7所述的表达盒、载体或转基因细胞系；

(1)防治害虫；

(2)制备防治害虫的产品；

(3)增加害虫幼虫期死亡率；

(4)制备增加害虫幼虫期死亡率的产品；

(5)降低害虫的幼虫体重；

(6)制备降低害虫的幼虫体重的产品。

9.一种CRISPR/Cas9系统，包含：权利要求5所述的sgRNA；

优选地，所述CRISPR/Cas9系统还包含Cas9。

10.一种防治害虫的方法，将权利要求9所述的CRISPR/Cas9系统导入害虫体内。

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