CN117377482A

CN117377482A - 用于神经保护的基因疗法

Info

Publication number: CN117377482A
Application number: CN202280030177.9A
Authority: CN
Inventors: D·S·韦尔斯比; M·T·武; C·D·李; A·K·帕特尔
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2022-04-11
Publication date: 2024-01-09

Abstract

本文特别提供了用于治疗和预防神经细胞死亡，例如视网膜神经节细胞死亡的方法和化合物。本文还特别提供了用于治疗和预防神经变性的方法和化合物。本文所提供的方法和化合物可以治疗或预防青光眼。

Description

用于神经保护的基因疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年5月18日提交的美国临时申请第63/190,132号和于2021年4月12日提交的美国临时申请第63/173,904号的优先权，所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用并入。

背景技术

双亮氨酸拉链激酶(DLK)和亮氨酸拉链激酶(LZK)在神经激酶信号传导通路中发挥作用，包含在神经元细胞(包含神经节细胞，如视网膜神经节细胞(RGC))中的轴突变性和细胞死亡信号传导中发挥作用(Welsbie等人,《神经元(Neuron)》94:1142-54,2017)。DLK的抑制和敲除已被证明在阿尔茨海默氏病、青光眼、帕金森氏病和其它神经退行性病状的细胞和动物模型中具有神经保护作用。(Ferratis等人,2013,双亮氨酸拉链激酶作为神经退行性病状的治疗靶标,《未来医药化学(Future Medicinal Chemistry)》5:16)。已经描述了具有显性阴性DLK(dnDLK)活性的DLK突变体(例如，Chen等人,《神经科学杂志(JNeurosci)》28:672-80,2008)。

发明内容

一方面，本文提供了一种核酸，所述核酸编码显性阴性双亮氨酸拉链激酶(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括具有与SEQ ID NO:1的区1-520具有至少95％同一性的序列的氨基酸片段，其中所述多肽包括至少一个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中所述突变选自定位43处的取代、定位302处的取代和定位516处的取代。在一些实施例中，所述dnDLK多肽包括定位302处的取代，其中所述取代是除苏氨酸外的任何氨基酸。在一些实施例中，所述定位302处的取代是S302A。在一些实施例中，所述dnDLK多肽包括定位43处的取代。在一些实施例中，所述定位43处的取代是E或D。在一些实施例中，所述dnDLK多肽包括取代T43E和S302A。在一些实施例中，所述dnDLK多肽进一步包括定位185处的取代，如K185A。在一些实施例中，所述dnDLK多肽包括定位516处的取代。在一些实施例中，所述定位516处的取代是G516V。在一些实施例中，所述dnDLK多肽进一步包括定位424或426处的取代。在一些实施例中，所述dnDLK多肽进一步包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。在一些实施例中，所述核酸编码显性阴性双亮氨酸拉链激酶(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

另一方面，本公开提供了一种分离的核酸，所述核酸编码显性阴性双亮氨酸拉链酶(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的区158-520具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包括至少一个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中所述突变选自定位302处的取代和定位516处的取代。在一些实施例中，所述dnDLK多肽包括定位S302处的取代，其中所述取代是除苏氨酸外的任何氨基酸。在一些实施例中，所述取代是S302A。在一些实施例中，所述dnDLK多肽包括定位516处的取代，例如，G516V。在一些实施例中，所述dnDLK多肽进一步包括定位185处的取代，例如，K185A。在一些实施例中，所述dnDLK多肽还包括定位424和/或426处的取代；并且在另外的实施例中，包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。

在另外的方面，本公开提供了一种分离的核酸，其编码亮氨酸拉链多肽，所述亮氨酸拉链多肽抑制同源二聚化和DLK与(LZK)的异源二聚化，其中所述多肽包括与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多肽的长度少于150个氨基酸。

另一方面，本公开提供了一种载体，所述载体包括如本文所描述的核酸，例如在本章节前面段落中描述。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施例中，所述AAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11衍生的或假型AAV衍生的载体。在一些实施例中，所述载体是AAV2.7m8。在一些实施例中，所述载体进一步包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

在另外的方面，本公开提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括编码如本文所描述的显性阴性多肽的核酸，或包括所述核酸的载体。在一些实施例中，所述神经元是视网膜神经节。在一些实施例中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是人细胞。

在另外的方面，本公开提供了一种抑制神经元细胞死亡的方法，所述方法包括将编码如本文所描述的显性阴性多肽的核酸或包括所述核酸的载体引入到神经细胞中。在一些实施例中，所述神经细胞是离体的。在一些实施例中，所述神经细胞是体内的。在一些实施例中，所述神经细胞是眼科神经元。在一些实施例中，所述眼科神经元是视网膜神经节。在一些实施例中，所述神经细胞是感光细胞。在一些实施例中，所述神经细胞是哺乳动物的。在一些实施例中，所述神经细胞是人神经细胞。

另一方面，本公开提供了一种治疗或预防有需要的受试者的神经细胞死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用编码如本文所描述的显性阴性多肽的核酸或包括所述核酸的载体。在一些实施例中，所述受试者患有青光眼、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管(CNV)、近视相关的CNV、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿或视网膜静脉阻塞。在一些实施例中，所述受试者患有遗传性视网膜疾病。在一些实施例中，所述遗传性视网膜疾病是视网膜色素变性。

另一方面，本发明提供了一种多肽，所述多肽由编码如本文所描述的显性阴性多肽的核酸编码，例如在本章节前面段落中描述。

附图说明

图1A和1B：与现有方法相比，新型的基于DLK/LZK的转基因强力提高了视网膜神经节细胞的存活率。(A)将免疫淘选的RGC用表达各种转基因的慢病毒转导，并在存在DLK/LZK抑制剂的情况下培养，以留出时间完成病毒生命周期和转基因表达。在3-4天后，在存在新型转基因(S302A，δC端DLK)或已知显性阴性(K185A)全长DLK的情况下，停用抑制剂，并在三天后测量存活量。(B)在存在LZK亮氨酸拉链(LZ)或已知显性阴性DLK-LZ的情况下测量存活率。在这两种情况下，新型转基因均更有效(接近在存在抑制剂的情况下保持的对照细胞的存活率)且更强效。

图2提供了说明各种突变体DLK多肽的活性的数据。

图3提供了说明施用dnDLK-AAV或对照AAV后的青光眼大鼠模型中的轴突的平均轴突健康评分(左图)和如通过评估轴突变性评估的视神经性头部变性的平均百分比(右图)的数据。

具体实施方式

虽然在本文中示出和描述了本发明的各个实施例和方面，但是本领域的技术人员将理解仅作为举例而提供此类实施例和方面。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将意识到许多变化、改变和取代。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。

本发明的实践涉及本领域已知的常见分子生物学技术。例如，此类技术描述于例如许多手册中，如Sambrook和Russell,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)》(第4版,2012)；和《当代分子生物学实验指南(Current Protocolsin Molecular Biology)》(Ausubel等人,纽约约翰威利父子出版公司(John Wiley andSons,New York),1987年-第133卷,2020年12月)。

提供以下定义以便于理解本文中频繁使用的某些术语，并且不意味着限制本公开的范围。

1.术语

“双亮氨酸拉链激酶”(“DLK”)是丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)混合谱系激酶家族成员和ser/thr激酶超家族成员。其在神经激酶信号传导通路中发挥作用，包含神经元细胞死亡信号传导。DLK包括N端结构域、催化结构域、包括两个亮氨酸拉链的亮氨酸拉链结构域和C端结构域。说明性人DLK多肽序列可在UniProtKB条目Q12852下获得。人DLK由丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶12基因(MAP3K12)编码，所述基因在细胞遗传学上定位于染色体区12q13.13。“人DLK”是指由人MAP3K12基因编码的任何等位基因形式。已鉴定了两种蛋白同种型：如UniProtKB条目Q12852中指定的同种型1(SEQ ID NO:13中提供的序列)和如UniProtKB条目Q12852中指定的同种型2(SEQ ID NO:1中提供的序列；另外参见GenBank登录号XM_011538725，蛋白质序列登录号XP_011537027)。如本文所使用的，“DLK”是指人和非人DLK多肽和多核苷酸，例如哺乳动物DLK序列，如小鼠或大鼠DLK序列。以下示意图描述了含有N端结构域、激酶结构域、亮氨酸拉链和C端结构域的说明性片段。人DLKSEQ ID NO:1的亮氨酸拉链结构域对应于大约氨基酸420-500，并且还可以被定义为基于在七肽的第四定位中具有亮氨酸的亮氨酸拉链基序延伸另外七个氨基酸。还参见Nihalani等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》275:7273-7279,2000。

亮氨酸拉链激酶(LZK)是一个结构上与DLK相关的MAP3K家族成员，在神经信号传导通路中，包含在神经元细胞死亡中也发挥作用。LZK包括N端结构域、催化结构域(“激酶结构域”)、包括两个亮氨酸拉链的亮氨酸拉链结构域和C端结构域。说明性人LZK多肽序列可在UniProtKB条目O43283下获得。人LZK由丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶13基因(MAP3K13)编码，所述基因在细胞遗传学上定位于染色体区3q27.2。“人LZK”是指由人MAP3K13基因编码的任何等位基因形式。已鉴定了LZK的五种同种型。同种型1(O42283-1)在UniProt条目中被指定为典型同种型。同种型1的亮氨酸拉链结构域的氨基酸序列在SEQ IDNO:8中提供。如本文所使用的，“LZK”是指人和非人LZK多肽和多核苷酸，例如哺乳动物LZK序列，如小鼠和大鼠DLK序列。

术语“显性阴性”是指显性阴性DLK蛋白变体(dnDLK)或LZK亮氨酸拉链结构域多肽(dnLZ)或其变体，当在表达内源性野生型DLK的神经元中表达时，其具有神经保护作用。在不旨在通过特定机制被结合的情况下，dnDLK可以抑制DLK同源二聚化。

在多肽序列的上下文中，“变体”或“突变体”通常与参考氨基酸序列具有至少80％的同一性或至少85％的同一性。在一些实施例中，变体多肽与参考氨基酸序列具有至少90％同一性、或至少91％、92％、93％或94％同一性。在一些实施例中，变体多肽与参考氨基酸序列具有至少95％同一性、或至少96％、97％、98％或99％同一性。术语“变体”也适用于核苷酸序列，其例如可以具有参考序列的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％或更高。

在基因修饰细胞以表达多肽的上下文中，术语“引入到”细胞中是指在多核苷酸进入细胞并被表达以产生蛋白质的条件下，使细胞与编码多肽的多核苷酸接触。关于蛋白质，如dnDLK，术语“引入到细胞中”包含例如但不限于，包括编码dnDLK的核酸的病毒载体的细胞转导，以及经编码蛋白的表达。

在两个或更多个多肽或多核苷酸序列的上下文中，当如通过手动比对和目视检查或使用描述于以下的BLAST或BLAST 2.0测量在比较窗口或指定区内进行比较和比对以获得最大对应性时，术语“相同”或“同一性百分比”是指在特定区内相同或具有特定百分比的相同同一性(例如，至少70％、至少75％、至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的氨基酸或核苷酸的两个或更多个序列或子序列：Altschul等人,(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410和Altschul等人,(1977)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402，分别地，具有默认参数的比较算法(对于核苷酸序列)；或者具有氨基酸序列的默认参数的BLASTP。BLAST分析软件可通过国家生物技术信息中心(NCBI)网站公开获得。这个算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，所述短字匹配或满足某一正值阈值评分T。T被称作邻域字评分阈值(Altschul等人,同上)。这些初始邻域字命中充当用于启动搜索的种子以找到含有所述初始邻域字命中的较长HSP。然后字命中沿每个序列在两个方向上扩展，直到累积比对评分可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。当出现以下情况时，在每个方向上的字命中扩展将停止：累积比对评分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或更低；或者到达任一序列的端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字大小(W)为11、期望阈值(E)为0.05、M＝2、N＝-3以及对两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字大小(W)6、期望阈值0.05和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》89:10915(1989))。

当在鉴定所关注多肽序列中的给定氨基酸残基的上下文中使用时，术语“对应于”、“参考……来确定”或“参考……来编号”是指当所关注多肽序列与参考序列最大程度比对和比较时，残基在特定参考氨基酸序列中的定位。因此，例如，当变体多肽序列与SEQID NO:1最佳比对时，当变体中的残基与SEQ ID NO:1中的氨基酸比对时，DLK多肽变体中的氨基酸残基“对应于”DLK序列SEQ ID NO:1中的氨基酸。与参考序列比对的多肽的长度不需要与参考序列的长度相同。类似地，当在鉴定所关注核酸序列中的给定核苷酸的上下文中使用时，术语“对应于”、“参考……来确定”或“参考……来编号”是指当所关注核酸序列与参考序列最大程度比对和比较时，核苷酸在特定多核苷酸参考序列中的定位。

如本文所使用的，“取代”表示分别用不同的氨基酸或核苷酸替代一个或多个氨基酸或核苷酸。

如本文所使用的，“保守”取代是指氨基酸的取代，使得维持电荷、极性、亲水性(疏水性、中性或亲水性)和/或侧链基团的大小。可以取代彼此的说明性氨基酸组包含(i)带正电荷的氨基酸Lys和Arg；以及pH约6的His；(ii)带负电荷的氨基酸Glu和Asp；(iii)芳香族氨基酸Phe、Tyr和Trp；(iv)脂肪族疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile；以及疏水性氨基酸Met；(v)非极性氨基酸Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp和Met；(vi)小的不带电荷的极性氨基酸，如Ser、Thr和Asn；(vii)中性亲水性氨基酸Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(viii)小的疏水性或中性氨基酸Gly、Ala和Pro；(ix)包括酰胺的氨基酸Asn和Gln；以及(x)支链氨基酸Thr、Val和Ile。在一些实施例中，保守取代可以基于大小，例如，小氨基酸可以被另一个小氨基酸，如Gly或Ala取代。在一些实施例中，含羟基的氨基酸(Ser、Thr或Tyr)可以被替代性含羟基的氨基酸取代。此段落中提及的氨基酸的电荷是指在pH 6-7时的电荷。

术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且如本文所使用的，是指RNA、cDNA、基因组DNA的有义链和反义链两者，以及上述的合成形式和混合聚合物。在具体实施例中，核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰形式和其组合。这些术语还包含但不限于单链和双链形式的DNA。另外，多核苷酸，例如cDNA或mRNA可以包含通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的一个或两个天然存在的和经修饰的核苷酸。如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。上述术语还旨在包含任何拓扑构象，包含单链或双链形式。除非另有说明，否则提及核酸序列涵盖其补体。因此，提及具有特定序列的核酸分子应理解为涵盖其互补链以及其互补序列。术语还包含编码相同多肽序列的密码子优化的核酸。

除非另有说明，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示所述核酸或蛋白质基本上不含在天然状态下与其缔合的其它细胞组分。例如，其可以处于均匀状态并且可以处于干燥或水溶液中。纯度和均匀性通常使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱确定。作为制剂中存在的主要物种的蛋白质是基本上纯化的。

如本文所使用的，关于显性阴性蛋白或LZ结构域多肽的表达的术语“载体”被理解为指包括编码要在宿主细胞中表达的dnDLK或LZ多肽的转基因的重组核酸构建体。

术语“病毒载体”是指用于将转基因递送到宿主细胞中的经修饰病毒。

如本文所使用的，术语“转基因”是指重组多核苷酸构建体，其可以使用基因疗法载体引入到细胞中，以在细胞中表达一种或多种蛋白。在本公开的上下文中，转基因可以包含控制经编码蛋白的表达的调控序列(例如，启动子、增强子、终止子序列、多腺苷酸化序列等中的一者或多者)、mRNA稳定性序列(例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；WPRE)、允许双顺反子mRNA的内部核糖体进入位点(IRES)的序列、外显体维持所需的序列(例如，ITRs和LTRs)、避免或抑制病毒被Toll样或RIG样受体识别的序列(例如，TLR-7、-8、-9、M DA-5、RIG-1和/或DAI)和/或转导到细胞中所需的序列。

如本文所使用的，术语“启动子”和“增强启动子”是指能够控制(例如，增加)编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。启动子可以包含最小启动子(包含TATA盒和用于指定转录起始位点的其它序列的短DNA序列)。增强子序列(例如，上游增强子序列)是可以与启动子相互作用以控制(例如，增加)编码序列或功能性RNA的表达的调控元件。如本文所使用的，提及“启动子”可以包含增强子序列。增强子不需要与其相互作用的启动子或编码序列邻接。

当影响经编码的mRNA或蛋白的表达或稳定性时，启动子、增强子和其它调控序列与蛋白或RNA编码的多核苷酸序列“可操作地连接”。

术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文中可互换使用以指代任何哺乳动物，包含但不限于人。在一些实施例中，受试者可以是非人灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩)、马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或任何其它哺乳动物。在一些实施例中，“受试者”、“患者”或“个体”是人。

2.具有神经保护活性的显性阴性多肽。

2.1显性阴性DLK序列：

一方面，本公开提供了显性阴性DLK(dnDLK)多肽和编码dnDLK多肽的多核苷酸。dnDLK在被引入到神经元细胞，如神经节细胞，例如视网膜神经节细胞中时具有神经保护作用。在上下文中，术语“神经保护”是指与不表达dnDLK多肽的对照神经元细胞群体相比，dnDLK抑制神经元细胞死亡的能力，例如，在如本文所描述的工程化的表达dnDLK多肽的神经元细胞群体中抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。为了说明而非限制，可以使用下文第5章节中描述的方法来测量神经保护活性。神经保护的其它测定包含基于图像的活/死细胞计数或报告基因免疫荧光，如磷酸化JUN。

人DLK存在于两种同种型中。SEQ ID NO:1是Uniprot条目12852中指定为“同种型2”的同种型的序列，并且在本文中用作描述残基定位的参考序列。应当理解，本文关于SEQID NO:1描述的突变可以引入到SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:13中。同种型在参考序列的残基46处彼此不同。Uniprot Q12852条目同种型1(SEQ ID NO:13)包括定位46处的组氨酸。此H残基被Q12852同种型2中的序列QCVLRDVVPLGGQGGGGPSPSPGGEPPPEPFANS(SEQ ID NO:1)替代，这产生比SEQ ID NO:13中所示的多肽序列长33个氨基酸的多肽，但在其它方面序列相同。

		UniProt指定
			SEQ ID NO:1	同种型编号2(892aa)	Q12852-2
SEQ ID NO:13	同种型编号1(859aa)	Q12852-1

在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:2具有至少80％或至少85％氨基酸序列同一性的DLK催化区和与SEQ ID NO:3具有至少80％或至少85％同一性的亮氨酸拉链结构域，其中所述dnDLK包括定位302和/或516处的突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中残基相对于存在于SEQ ID NO:1中的所述定位处的残基被取代。在一些实施例中，dnDLK多肽的长度为890个氨基酸或更少，850个氨基酸或更少，750个氨基酸或更少，650个氨基酸或更少，550个氨基酸或更少，450个氨基酸或更少，或400、390、380、370或360个氨基酸或更少。例如，关于SEQ ID NO:1中的全长序列，在一些实施例中，可以从SEQ ID NO:1的C端缺失超过300个氨基酸，或超过350个氨基酸，或超过370个氨基酸。在一些实施例中，可以从SEQID NO:1的N端缺失10个、20个、30个、40个、50个、60个或更多个氨基酸。在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同一性的DLK催化区和与SEQ ID NO:3具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同一性的亮氨酸拉链结构域，并且包括定位302和/或516处的突变。在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:2具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的DLK催化区和与SEQ ID NO:3具有至少具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的亮氨酸拉链结构域。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的取代，其中定位302处的残基被除苏氨酸外的任何氨基酸取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的A。在一些实施例中，dnDLK包括定位302处的残基G、V、L或I。在一些实施例中，dnDLK多肽除苏氨酸外包括定位302处的S的保守取代，例如N或Q。在一些实施例中，DLK多肽包括定位516处的取代，例如，dnDLK多肽包括除G外的任何氨基酸残基。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位516处的V。在一些实施例中，dnDLK包括定位516处的I或L。在一些实施例中，dnDLK多肽包括如本文所描述的定位302处的取代和定位516处的取代，例如在本段段落中描述的。在一些实施例中，dnDLK多肽进一步包括定位185处的取代，如参考SEQ IDNO:1所确定的。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位185处的A。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位185处的G、V、L或I。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302和/或516处的取代，并且另外包括定位424和/或426处的取代，如参考SEQ ID NO:1所确定的；以及任选地，当多肽包括定位424和/或定位426处的取代时，所述多肽包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位424处的D或E和/或定位426处的D或E。在一些实施例中，dnDLK多肽进一步包括以下中的一者或多者：定位431处的R；定位438处的D或E；定位440处的D或E；定位445处的D或E；定位447处的D或E；定位486处的R；定位491处的D和E；以及定位493处的D或E。

在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同一性的DLK催化区，以及与SEQ ID NO:3或与包括所述两个亮氨酸拉链的至少95个连续氨基酸的亮氨酸拉链结构域的片段具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同一性的亮氨酸拉链结构域；其中dnDLK包括定位302处的除S或T外的任何氨基酸，所述定位参考SEQ NO:1确定。在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQID NO:2具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的区，以及与SEQ ID NO:3、与包括所述两个亮氨酸拉链的至少95个连续氨基酸的亮氨酸拉链结构域的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的亮氨酸拉链结构域；其中dnDLK包括定位302处的除S或T外的任何氨基酸，所述定位参考SEQ NO:1确定。在一些实施例中，亮氨酸拉链结构域的片段包括所述两个亮氨酸拉链序列，但从亮氨酸拉链结构域的C端区缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸，或至多10个氨基酸，或者至多20个氨基酸，但不缺失亮氨酸拉链1或亮氨酸拉链2中的氨基酸。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的A。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的残基，如G、V、L或I。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的Q或N。在一些实施例中，dnDLK多肽包括N端结构域(SEQ ID NO:1中的从定位2到催化结构域的第一残基的SEQ ID NO:1的区)；或其片段。在一些实施例中，dnDLK包括定位43处的D或E。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43处的E。

如下文第5.2.1章节所讨论的，在残基302处引入取代突变(例如，S302A)导致dnDNK的神经保护活性比DLK K185A变体的神经保护活性更大。如下文第5.2.6章节所讨论的，在残基516处引入取代突变(例如，G516V)产生dnDNK。如下文第5.2.2章节所讨论的，从dnDLK的C端缺失>350个残基，如第5.2.2章节中通过缺失362个残基所展示的，不会对dnDLK的保护活性产生负面影响。例如，如第5.2.3章节所讨论的，从S302A dnDLK中缺失C端区不会降低突变体的保护活性，并且在一些实施例中，增强保护活性。

在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸2-520具有至少80％或至少85％氨基酸序列同一性的区，其中所述dnDLK多肽包括定位43、302或516处的一个或多个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中残基相对于SEQ ID NO:1中的所述定位处的残基被取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸1-520具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同一性的区。在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸1-520具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的区。在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸1-520的300个氨基酸区具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同一性的区，并且包括定位43、302或516处的一个或多个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的并且如下文进一步提供的。在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸1-520的300个氨基酸区具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的区，并且包括定位43、302或516处的一个或多个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的并且如下文进一步提供的。在一些实施例中，dnDLK多肽包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施例中，dnDLK包括定位43处和定位302处的取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302和定位516处的取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43和定位516处的取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43、302和516处的取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的取代，其中定位302处的残基被除苏氨酸外的任何氨基酸取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的A。在一些实施例中，dnDLK包括定位302处的残基G、V、L或I。在一些实施例中，dnDLK多肽除苏氨酸外包括定位置302处的S的保守取代，例如N或Q。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43处的D或E。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43处的E。在一些实施例中，DLK多肽包括定位516处的取代，例如，dnDLK多肽包括除G外的任何氨基酸残基。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位516处的V或定位516处的I或L。在一些实施例中，dnDLk多肽包括定位302处的A和定位43处的E。在一些实施例中，dnDLK多肽的长度为850个氨基酸或更少，长度为750个氨基酸或更少，长度为650个氨基酸或更少，或长度为550个氨基酸或更少。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43、302和/或516处的取代，并且进一步包括定位185处的取代，如参考SEQ ID NO:1所确定的。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302和定位185处的取代；定位302和516处的取代；或定位302、516和185处的取代。在一些实施例中，这种dnDLK多肽可以进一步包括定位43处的取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位185处的A。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43、定位302和/或516处的取代(并且任选地定位185处的取代)；另外包括定位424和/或426处的取代，如参考SEQ ID NO:1所确定的；以及任选地，当多肽包括定位424和/或定位426处的取代时，所述多肽包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位424处的D或E和/或定位426处的D或E。在一些实施例中，dnDLK多肽进一步包括以下中的一者或多者：定位431处的R；定位438处的D或E；定位440处的D或E；定位445处的D或E；定位447处的D或E；定位486处的R；定位491处的D和E；以及定位493处的D或E。

在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:6具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同一性的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:6具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述dnDLK包括如参考SEQID NO:1编号的定位302处的除S或T外的任何氨基酸。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的A。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的残基，如G、V、L或I。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的Q或N。在一些实施例中，dnDLK多肽包括SEQ ID NO:6。

在一些实施例中，dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％同一性的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:7具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述dnDLK包括如参考SEQID NO:1编号的定位302处的除S或T外的任何氨基酸和定位43处的取代，如参考SEQ ID NO:1所确定的。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的A。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的残基，如G、V、L或I。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的Q或N。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43处的D或E。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位43处的E。在一些实施例中，dnDLK多肽包括定位302处的A和定位43处的E。在一些实施例中，dnDLK多肽包括SEQ ID NO:7。

2.2作为DLK的显性阴性抑制剂的LZK序列

如第5.2.4章节所讨论的，令人惊讶的是，发现LZK亮氨酸拉链结构域(LZ多肽)具有强效的神经保护活性。将LZ结构域引入到神经细胞，例如视网膜神经节细胞中可以具有治疗益处。

一方面，本公开进一步提供了一种多肽，所述多肽包括抑制DLK同源二聚化的LZK亮氨酸拉链结构域，其中所述多肽在引入到神经细胞，如神经节细胞，例如视网膜神经节细胞时具有神经保护性。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性或至少96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，LZK多肽包括SEQ IDNO:8。在一些实施例中，LZK多肽的长度少于150或少于120个氨基酸。为了方便起见，这种抑制DLK的LZK多肽和编码多肽的多核苷酸序列在本文中被称为“dnDLK/LZK”序列。

2.3变体活性

如本文所描述的抑制神经元细胞死亡的变体可以使用多种测定鉴定。在一些实施例中，评估变体抑制神经元细胞死亡的能力。

在实例中提供了用于评估神经元细胞死亡抑制的说明性测定。这种测定是在视网膜神经节细胞的上下文中描述的。简而言之，例如使用表达dnDLK或dnDLK/LZK多肽的慢病毒载体，将变体和对照，如空载体对照各自引入到原代视网膜神经节细胞群体中。使用DLK/LZK抑制剂，例如GNE 3511维持细胞，以在慢病毒dnDLK或dnDLK/LZK蛋白表达时防止细胞死亡。在转导后第3-5天，当dnDLK或dnDLK/LZK蛋白表达(例如通过mScarlet报告基因表达指示)时，停止向原代RGC提供GNE 3511以引发细胞死亡。通过添加50％体积的CellTiter Glo(普洛麦格公司G8462)，测定GNE停用后3天的细胞存活率[相对光单位(RLU)]。发光可以用读板器(分子装置公司(Molecular Devices))进行测量。细胞死亡水平可以在整个测定的时间段内与用GNE3511处理的对照细胞(阳性对照)的细胞死亡水平进行比较，或者可以相对于停用GNE3511的对照细胞(阴性对照)来确定。与使用化学DLK/LZK抑制剂，例如GNE3511获得的细胞存活水平相比，如本文所描述的变体dn DLK或变体dnDLK/LZK多肽通常具有至少20％、通常至少30％、或至少40％、50％、60％、70％或更多的保护。在一些实施例中，与对照相比，如本文所描述的变体dnDLK或变体dnDLK/LZK多肽具有至少80％、至少90％或更多的保护。

在一些实施例中，采用替代性测定法来评估变体活性。许多此类测定是已知的，包含基于流式细胞术、胱天蛋白酶激活和细胞内ATP测量的测定。例如，合适的测定包含使用细胞内含物染料，如Calcein AM对所指示的活细胞，或使用基于细胞排斥的染料，如Reddot1对所指示的死细胞或垂死细胞进行基于图像的活细胞/死细胞计数。可替代地，磷酸化JUN或其它下游DLK通路成员的免疫荧光可以用作dnDLK或dnDLK/LZK构建体在抑制DLK通路中的功效的标志物。

3.多核苷酸/表达载体

另一方面，本公开提供了一种分离的核酸，所述核酸编码如本文所描述的显性阴性多肽、包括核酸的表达载体和包括表达载体的宿主细胞。用于产生显性阴性多肽的表达系统包含原核和真核系统，包含例如酵母、昆虫、禽类和哺乳动物表达系统。示例性表达系统描述于Sambrook,同上；和Ausbel,同上。

用于表达编码显性阴性多肽的核酸的合适的真核启动子(即在真核细胞中具有功能性的启动子)的非限制性实例包含巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶基因启动子；早期和晚期SV40启动子；来自逆转录病毒的长末端重复序列；人延伸因子-1启动子；鸡β肌动蛋白启动子；牛生长激素启动子；杂交构建体，其包括与鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV增强子、鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子以及β珠蛋白剪接受体；鼠干细胞病毒启动子；磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子；以及泛素基因启动子。在一些实施例中，启动子在神经细胞中具有活性。

表达载体还可以包含其它元件，例如核糖体结合位点、转录终止子等。

编码本公开的显性阴性多肽的核酸可以使用多种递送方法引入到宿主细胞中，包含包装到递送媒剂的表面中或表面上以递送到细胞。递送媒剂包含但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。在一些实施例中，可以使用靶向部分来增强这种媒剂与期望的细胞类型或位置的优先相互作用。在一些实施例中，核酸通过以下方式引入到宿主细胞中：病毒感染、转染、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。

3.1基因疗法载体

在某些实施例中，本公开提供了基因疗法载体，以用于离体或体内基因修饰细胞，例如神经元细胞，以表达如本文所描述的显性阴性多肽。在一些实施例中，基因疗法载体是质粒载体，例如，其可以作为裸DNA递送或与递送调配物，例如脂质、脂质体、纳米颗粒或泊洛沙姆复合。

在其它实施例中，基因疗法载体是病毒载体。病毒载体的非限制性实例包含但不限于慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、痘痘病毒、α病毒、肠病毒、乳多空病毒、脊髓灰质炎病毒和其它正链和负链RNA病毒、类病毒和拟病毒或其部分。

转基因可以包含定位于编码序列上游、下游或内部的调控序列，其影响RNA加工或稳定性、翻译效率或影响显性阴性多肽的高效和稳定表达的其它方面。这种调控序列的实例包含启动子、增强子、聚腺苷酸化序列等。

在一些实施例中，病毒载体进一步包括转录后调控元件，如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，以增强使用病毒载体递送的转基因的表达。

3.1.1AAV载体

在一些实施例中，基因疗法载体是腺相关病毒载体(AAV)。任何AAV血清型均可用于产生用于将显性阴性多肽引入到神经细胞中的重组AAV，包含但不限于AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV113、AAVrh.74、AAV2.7m8、AAV.ANC80、Anc80L65和衍生物；AAVDJ和其组合。在美国专利第10,662,425号中提供了说明性AAV血清型的广泛列表，包含天然存在的AAV血清类型的变体。

病毒序列包含顺式复制和将DNA包装(例如，功能性ITR)到病毒粒子中所需的AAV序列。在某些实施例中，AAV载体具有全部或部分缺失的AAV WT基因中的一个或多个，但保留功能性侧接ITR序列。AAV病毒粒子或AAV颗粒包括AAV衣壳蛋白和AAV载体。在一些情况下，AAV是杂交或嵌合AAV，例如，AAV颗粒可以包括与衣壳血清型相比为异源血清型的ITR(例如，具有AAV5、AAV6或AAV8衣壳的AAV2 ITR)。AAV ITR可以属于适合具体应用的任何血清型。在一些实施例中，AAV血清型，如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9或AAVrh8R用作载体。在一些实施例中，载体是AAV2血清型，例如AAV2.7m8的衍生物。

使用AAV载体的方法描述于例如Tal等人,《生物医学科学(J.Biomed.Sci.)》7:279(2000)，以及Monahan和Samulski,《基因递送(Gene Delivery)》7:24(2000)中，所述文献中的每个文献的公开内容通过引用并入本文，因为其涉及用于基因递送的AAV载体。为了将转基因包装到病毒粒子中，ITR是在与转基因相同的构建体中顺式所需的唯一AAV组分。cap和rep基因可以反式供应。重组AAV病毒粒子的构建也已描述于以下中，例如美国专利第5,173,414号；第5,139,941号；第5,863,541号；第5,869,305号；第6,057,152号；以及第6,376,237号；以及在Rabinowitz等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》76:791(2002)和Bowles等人,《病毒学杂志》77:423(2003)，所述文献中的每个文献的公开内容通过引用并入本文，因为其涉及用于基因递送的AAV载体。另外参见Zolotukin等人,2002，血清型1、2和5重组腺相关病毒载体的产生和纯化(PRODUCTION AND PURIFICATION OF SEROTYPE 1,2,AND5RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATEDVIRAL VECTORS)，方法28:158-167。

在一些实施例中，编码dnDLK或dnDLK/LZK多肽的转基因与编码另一种具有神经保护特性的蛋白质的转基因组合施用。如上文所讨论的，dnDLK的C端部分的缺失不会降低蛋白质的保护活性。编码截短的dnDLK的转基因的较小大小在设计编码多于一种多肽，例如多于一种神经保护多肽的构建体中是有利的。在一些实施例中，编码dnDLK或dnDLK/LZK多肽的构建体可以进一步包括编码降低眼内压力的多肽，例如用于青光眼疗法的转基因，或编码与疾病病理学相关的蛋白质的转基因。例如而非限制性地，可以使用编码dnDLK或dnDLK/LZK多肽和显性阴性SARM1的转基因(参见WO2019079572，“显性阴性Sarm1分子作为神经退行性疾病或病症的治疗策略(Dominant Negative Sarm1 Molecules As A TherapeuticStrategy For Neurodegenerative Diseases Or Disorders)”；Geisler等人,2019，“靶向SARM1的基因疗法阻断小鼠病理性轴突变性(Gene therapy targeting SARM1 blockspathological axon degeneration in mice)”《实验医学杂志(J Exp Med)》216:294-303)。作为另一实例，重组AAV载体可以表达dnDLK多肽或dnDLK/LZK多肽和如胰岛素样生长因子等多肽(参见例如Hung等人,2007,“大鼠脊髓损伤后提供神经保护的胰岛素样生长因子-I的基因转移(Gene transfer of insulin-like growth factor-I providingneuroprotection after spinal cord injury in rats)”.《神经外科杂志：脊柱(J.Neurosurgery:Spine)》6(1)；Nishida等人,2011,“侧脑室内胰岛素样生长因子-I基因疗法对衰老大鼠的运动性能的恢复作用(Restorative effect ofintracerebroventricular insulin-like growth factor-I gene therapy on motorperformance in aging rats)”.《神经科学(Neuroscience)》177:195-206；Schwerdt等人,2018,“长期胰岛素样生长因子-I基因疗法对多巴胺能功能障碍老年大鼠的下丘脑的恢复作用(Rejuvenating Effect of Long-Term Insulin-Like Growth Factor-I GeneTherapy in the Hypothalamus of Aged Rats with Dopaminergic Dysfunction)”.《抗衰老研究(Rejuv.Res.)》21(2):102-108)。作为另一实例，烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶(NMNAT)多肽，如NMNAT1(EC 2.7.7.1)蛋白可以用dnDLK或dnDLK/LZK多肽表达(参见Babetto等人,2010,“将NMNAT1靶向轴突和突触在体内转化其神经保护效力(TargetingNMNAT1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo)”《神经科学杂志(J Neurosci)》30(40):13291-304)。在一些实施例中，NMNAT多肽是主要存在于细胞质中的NMNAT多肽，例如CytNMNAT1(Sasaki等人,《神经科学杂志》26:8484-8491,2006)，其在核定位信号中突变；NMNAT2多肽或在亚细胞靶向结构域中具有缺失的NMNAT2多肽(Milde等人,《科学报告(Sci Rep.)》3:2567,2013)；或NMNAT3多肽(Berger,《生物化学杂志》280(43),36334-36341,2005)。作为另外的实例，骨桥蛋白可以表达(参见例如Chen等人,2011,“骨桥蛋白通过抑制大鼠幼崽模型中的细胞凋亡来减少缺氧-缺血新生儿脑损伤(Osteopontin reduced hypoxia-ischemia neonatal brain injury by suppression ofapoptosis in a rat pup model)”.《中风(Stroke)》42(3):764-769)。作为另一实例，胰高血糖素样肽-1可以表达(Holscher,2012,“胰高血糖蛋白样肽-1(GLP-1)在神经保护中的潜在作用(Potential Role of Glucagon-Like Peptide-1(GLP-1)in Neuroprotection)”.《CNS药物(CNSDrugs)》26:871-882；Velmurugan等人,2012,“胰高血糖素样肽-1在分化的人类神经祖细胞中的神经保护作用(Neuroprotective actions of Glucagon-likepeptide-1in differentiated human neuroprogenitor cells)”.《神经化学杂志》123(6):919-931；WO2009039964A2(“胰高血糖素样肽作为治疗剂的用途(Use of glucagon-like peptide as a therapeutic agent)”)。作为另一实例，脑源性神经营养因子可以表达(参见Osborne等人,2018,“通过一种新型基因疗法构建体对视网膜神经节细胞的神经保护，这实现了脑源性营养因子/原肌球蛋白相关激酶受体-B信号传导的持续增强(Neuroprotection of retinal ganglion cells by a novel gene therapy constructthat achieves sustained enhancement of brain-derived neurotrophic factor/tropomyosin-related kinase receptor-B signaling)”.《细胞死亡和疾病(Cell Death&Disease)》9:1007)。可以用dnDLK或dnDLK/LZK多肽表达的蛋白质的另外的实例包含慢Wallerian变性多肽(Wld^s)(例如，Conforti等人,《美国国家科学院院刊》97:11377-82,2000)；显性阴性Rho激酶(例如Amano等人,《生物化学杂志》274:32418-24,1999)；或基质金属蛋白酶(MMP)，如MMP-3(例如，O'Callaghan等人,《人类分子遗传学(Hum.Mol.Genet.)》26:1230-246,2017)或MMP-1(Borras等人,《基因疗法(Gene ther)》.23:438-49,2016)。在一种方法中，两个或更多个基因可以由相同的RNA转录物编码(使用病毒载体，例如AAV中的双顺反子表达盒)。例如，在一种方法中，两个基因的表达由双向启动子控制(Vogl等人,2018,“工程化双向启动子实现快速多基因共表达优化(Engineered bidirectionalpromoters enable rapid multi-gene co-expression optimization)”《自然通讯(NatCommun)》9,3589；Trinklein等人,2004,“人类基因组中双向启动子的丰富性(AnAbundance of Bidirectional Promoters in the Human Genome)”《基因组学研究(Genome Res)》.14:62-66；Wang等人,2006,“腺病毒介导的双基因转移对实验性骨关节炎的抑制”《中华医学杂志(英文版)(Chin Med J(Engl))》119:1365-1373)。在一些实施例中，编码dnDLK或dnDLK/LZK多肽的转基因与向导RNA组合施用，以激活编码具有神经保护特性的多肽的内源性基因的启动子。

在一些实施例中，编码dnDLk或dnDLK/LZK多肽的转基因与编码参与神经保护的多肽，如SCG10/STMN2、BCL-XL或TRKB多肽的核酸组合施用。在一些实施例中，多肽是水通道蛋白、CNTF多肽(具有信号序列)、BDNF、GDNF或NGF多肽。在一些实施例中，表达补体抑制剂多肽。在一些实施例中，表达GLP-1R或GLP-1多肽或CDKN2B-AS1多肽。在一些实施例中，表达GLDN、CHL1、QPCT、TBX20、DGKG、TIMP2、EGR1、EOMES、JUNB、IGFBP2、OSTF1、FGF1、SEMA5A、ESRRG、KBTBD11、RAMP1、ETL4、PRKCQ、CTXN3、NDNF、MAN1A、SDK2、PRPH、SDK1或IFI27多肽。在替代性实施例中，编码dnDLK或dnDLK/LZK多肽的转基因与CRISPR蛋白/向导RNA组合施用，以激活内源性神经保护基因的启动子。就本段落而言，基因命名法也用于指定多肽。

在一些实施例中，编码dnDLK或dnDLK/LZK多肽的转基因与抑制基因表达或由基因编码的产物的活性的抑制剂一起施用，以增强神经保护。在一些实施例中，抑制剂是核酸，例如靶向要抑制的基因的反义RNA或shRNA。在一些实施例中，试剂是靶向要抑制的基因或基因的启动子的CRISPR蛋白/gRNA蛋白。在一些实施例中，施用抑制性蛋白，例如抗体(此处使用的抗体包含纳米体、单链免疫球蛋白或结合靶蛋白的其它抗体片段)、显性阴性多肽和/或结合并靶向蛋白酶体降解被抑制的蛋白的蛋白质。在一些实施例中，靶向抑制的基因或基因产物参与轴突或染色体保护，例如MEKK4、MLK2/MAP3K10、PUMA/BBC3、SARM1、ROCK1、ROCK2、TAOK1、TAOK2、TAOK3、TNIK、MAP4K4、MINK1、GSK-3β、GSK-3α、MAP2K7/MKK7、MAP2K4/MKK4、PERK、CHOP、HSP90、SNRK、JNK1(MAPK8)、JNK2(MAPK9)、JNK3(MAPK10)、JUN、ATF2、MEF2A、SOX11、MST1/STK4、MST2/STK3、END1或END2。在一些实施例中，靶向抑制的基因或基因产物参与神经胶质相互作用，例如C1q、TNFα或IL-1α；或者是青光眼相关基因，例如MYOC、TBK1或CDKN2B-AS1。就本段落而言，基因命名法也用于指定多肽。

3.2对神经元细胞进行基因修饰的替代性方法

在一些实施例中，使用用于基因整合的基于转座酶的系统，例如CRISPR/Cas介导的基因整合、TALENS或锌指，进行将编码显性阴性多肽的转基因引入到神经元细胞的遗传修饰中。例如，CRISPR/Cas介导的基因整合可以用于将显性阴性多肽引入到体内神经元细胞或离体神经元细胞中，然后可以将其施用于患者。在一些实施例中，基因修饰系统，例如CRISPR/Cas、TALENS或锌指核酸酶系统用于将如本文所描述的显性阴性突变引入到内源性基因中。可以使用包含病毒载体系统的任何系统将此类系统递送到神经细胞。

3.3基因修饰的神经细胞表达显性阴性突变

DLK参与激酶信号传导的任何神经细胞都可以被修饰以表达如本公开中所描述的显性阴性多肽。如本文所使用的“神经细胞”包含与神经元有关的任何类型的细胞，以及在神经通路中发挥作用的非神经细胞，如神经胶质细胞。在一些实施例中，神经细胞是眼科神经元。在一些实施例中，神经细胞是视网膜色素上皮(RPE)细胞、感光细胞、视网膜神经节、神经胶质细胞，包含Muller细胞、其它视网膜内部神经元，如双极细胞以及无长突细胞、角膜内皮细胞等。在一些实施例中，神经细胞是眼科神经元、视网膜色素上皮(RPE)细胞、感光细胞或视网膜神经节。在一些实施例中，神经细胞是耳科神经元，包含内毛细胞和外毛细胞。在一些实施例中，神经细胞是螺旋神经节神经元。在一些实施例中，神经细胞是三叉神经神经元或面神经神经元。在一些实施例中，神经细胞是外周神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS)细胞，如CNS神经元。

4.神经元保护/抑制神经元细胞死亡

本公开另外提供了通过基因修饰神经元群体以表达如本文所描述的dnDLK多肽或dnDLK/LZK多肽来抑制神经元细胞死亡的方法。尽管在一些实施例中，多肽可以作为蛋白质施用，但在典型的实施例中，将编码dnDLK多肽或dnDLK/LZK多肽的核酸引入到神经元细胞群体中。以下章节集中于编码多肽的核酸的施用。本领域技术人员理解，dnDLK多肽或dnDLK/LZK多肽还可以用于某些治疗应用，例如，不需要多肽的持续存在。多肽的药物调配物可以基于已知的将多肽递送给受试者的参数容易地制备。

组合物可以施用于任何受试者，包含非人受试者，如小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔子、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、禽类或非人灵长类动物(例如，猕猴)。在典型的实施例中，受试者是人。

4.1药物组合物和施用

一方面，本公开提供了包括编码显性阴性多肽的核酸的药物组合物，所述药物组合物用于抑制神经元细胞死亡。使用适于治疗神经元变性疾病的给药方案以治疗有效量施用核酸。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效的量，以达到期望结果，包含减少、延迟、改善或任何改善神经疾病的一种或多种症状，如神经元变性疾病。在一些实施例中，预防性地施用编码显性阴性多肽的核酸以预防神经元疾病的一个或多个系统。这种组合物的治疗有效量可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素或者基因疗法载体在个体中引发期望应答的能力而变化。剂量方案可以调整以提供最优应答。治疗有效量还是治疗有益效果超过病毒载体的任何毒性或有害效果的量。

所述组合物可以被调配成用于多种药物递送系统。一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载剂也可以包含在用于适当调配的组合物中。例如，编码显性阴性多肽的核酸可以被调配在适于施用于患者的溶液中，如用于注射的无菌等渗溶液。在一些实施例中，载剂是水性的，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等。组合物可以含有近似生理条件所需的辅助药物，如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂等。

在一些实施例中，递送媒剂，如脂质体、纳米胶囊、纳米颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可以用于促进药物组合物的施用。例如，在一些实施例中，包括编码本文所描述的显性阴性多肽的转基因的病毒载体可以被调配成包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中以用于递送。

在典型的实施例中，将编码本文所描述的显性阴性多肽的病毒载体施用于受试者。剂量值可以随病状的严重程度而变化。应当进一步理解，对于任何具体受试者，应当根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人士的专业判断，随时间调整具体剂量方案，并且本文所示的所述剂量范围仅是说明性目的，并且不旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。

在一些实施例中，施用于受试者的病毒载体是AAV颗粒制剂。剂量方案可以调整以提供最优治疗应答。例如，可以施用单次团注，可以随时间推移施用若干分次剂量，或者可以按治疗状况的紧急情况所指出的成比例地减少或增加剂量。在一些实施例中，例如施用于人的AAV剂量可以是每次注射10⁹至10¹³个AAV颗粒，例如眼内注射。在一些实施例中，可以每次注射施用10⁹至10¹⁰、10¹⁰至10¹¹、10¹¹至10¹²或10¹²至10¹³个病毒颗粒。如本文针对剂量所使用的，AAV颗粒的数量等于病毒基因组的数量。

可以对任何受试者进行多种治疗，包含与其它基因疗法载体的组合，包含在受试者的一生中。

编码显性阴性多肽的核酸可以使用任何施用途径引入。例如，基因疗法载体可以全身施用，例如通过静脉注射或输注；或局部，例如通过视网膜注射，或眼部给药或输注。本发明不限于特定的位点或施用方法。

4.2神经病症

编码如本文所描述的显性阴性多肽的核酸，如用于施用编码多肽的转基因的基因疗法载体，可以用于治疗神经元病症，包含但不限于以下：青光眼(包含开角和窄角/闭角青光眼、原发性和继发性青光眼、正常眼压性青光眼和高IOP青光眼)；年龄相关性黄斑变性(AMD)，包含干性(非渗出性)和湿性(渗出性、新生血管性)AMD；脉络膜新生血管(CNV)；脉络膜新生血管膜(CNVM)；囊样黄斑水肿(CME)；视网膜上膜(ERM)和黄斑穿孔；近视相关脉络膜新生血管；血管样和血管条纹；视网膜脱离；糖尿病视网膜病变；糖尿病性黄斑水肿(DME)；视网膜色素上皮萎缩性和肥厚性病变；视网膜静脉阻塞；脉络膜视网膜静脉阻塞；黄斑水肿；伴肾静脉阻塞的黄斑水肿；视网膜色素变性和其它遗传性视网膜变性(例如，斯塔格特病(Stargardt disease))；早产儿视网膜病变；其它视神经病变，包含中毒性视神经病变(例如，甲醇、乙胺丁醇)；非动脉性缺血性视神经病变；动脉缺血性视神经病变/巨细胞动脉炎；外伤性视神经病变(包含外伤性脑损伤)；特发性颅内高压/假性脑瘤、炎性视神经病变(例如，视神经炎)、压缩性视神经病变(例如，垂体腺瘤)、浸润性视神经病变(例如，结节病、淋巴瘤)、自身免疫性视神经病变；脂质贮积病(例如，泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs))；营养性视神经病变；莱伯氏遗传性视神经病变(Leber's hereditary optic neuropathy)；显性视神经萎缩；弗里德赖希氏共济失调(Friedrich's ataxia)；辐射诱导的视神经病变；医源性视神经病变；太空飞行相关的神经-眼部综合征(SANS)；眼炎症疾病，例如，葡萄膜炎、巩膜炎、白内障、屈光异常，例如，近视、远视、散光或圆锥形角膜；神经营养性角膜病变；角膜变性和促进角膜再神经支配以及糖尿病性角膜病变。

神经退行性非眼科病症还可以使用编码如此处所描述的显性阴性多肽的核酸进行治疗。此类病症包含但不限于以下：肌萎缩性侧索硬化症(ALS)；阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)；帕金森氏病(Parkinson's disease)；创伤性脑损伤；帕金森氏+病；亨廷顿氏病(Huntington's disease)；外周神经病变；缺血；中风；颅内出血；脑出血；暴露于有毒化合物引起的神经损伤，所述有毒化合物选自由重金属、工业溶剂、药物和化疗药剂组成的组；由物理、机械或化学创伤引起的神经系统的损伤；三叉神经痛；舌咽神经痛；贝尔氏麻痹(Bell's Palsy)；重症肌无力；肌肉萎缩症；进行性肌萎缩；原发性侧索硬化症(PLS)；脊髓性肌萎缩；遗传性肌萎缩；无脊椎椎间盘综合征；颈椎病；神经丛紊乱；胸椎出口破坏综合征；卟啉症(porphyria)；假性球麻痹(pseudobulbar palsy)；进行性球麻痹(progressive bulbar palsy)；多系统萎缩；进行性核上性麻痹；皮质基底节变性；路易体痴呆(dementia with Lewy bodies)；额颞叶痴呆；脱髓鞘疾病；格林-巴罗综合征(Guillain-Barrésyndrome)；多发性硬化症；夏柯-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Toothdisease))；朊病毒病；克罗伊茨费尔德-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)；格斯特曼-施特劳斯-舒克尔综合征(Gerstmann--Scheinker syndrome，GSS)；致死性家族性失眠症(FFI)；牛海棉状脑病；皮克氏病(Pick's disease)；癫痫；AIDS精神错乱复合病。在一些实施例中，如本文所描述的显性阴性多肽用于防止疱疹病毒再激活。在一些实施例中，如本文所描述的显性阴性多肽用于防止异常神经细胞再生。在一些实施例中，病症是化疗诱导的外周神经病变(CIPN)，例如，由暴露于化疗剂引起的神经损伤。在一些实施例中，疾病是听力丧失病症，例如，年龄相关性听力丧失、化疗诱导的听力丧失、遗传性听力丧失、氨基糖苷类诱导的听力丧失、创伤诱导的听力丧失和噪声诱导的听力丧失。

在一些实施例中，将编码多肽的核酸施用于受试者以治疗或预防青光眼、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管形成(CNV)、近视相关脉络膜新生血管形成、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿和视网膜静脉阻塞。

在一些实施例中，将编码多肽的核酸施用于受试者以治疗视网膜疾病，如遗传性视网膜疾病，例如，视网膜色素变性。在一些实施例中，视网膜疾病涉及视紫红质错误结合和/或错折叠。

在一些实施例中，编码本文所描述的显性阴性多肽的核酸可以用于治疗和/或预防视神经病变，包含青光眼、遗传性视网膜变性、非渗出性AMD/地理性萎缩、产生缺血的视网膜血管疾病(糖尿病、静脉阻塞)、视网膜脱离和产生水肿的疾病(包含渗出性AMD)。

本公开的另一方面是用于治疗眼部和其它形式的神经退行性变的基于细胞移植的再生方法。这些包含用于治疗黄斑变性和各种形式的光感受器退化的光感器和/或RPE移植，以及用于治疗青光眼和其它形式的视神经疾病的RGC移植。因此，在一些实施例中，编码多肽的核酸可以在用于眼部退行性疾病和其它形式的神经退行性变的神经元细胞移植之前或之后被引入到细胞中以用于移植。在一些实施例中，编码多肽的核酸可以被引入到前体细胞，如干细胞中。

上述在人类中具有良好表征的疾病还可以在其它哺乳动物中以类似的病因发生，并且同样可以用本公开的化合物在其中治疗。

P1实施例

实施例P1-1.一种核酸，其编码显性阴性双亮氨酸拉链激酶(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括具有与SEQ ID NO:1的区1-520具有至少95％同一性的序列的氨基酸片段，

其中所述多肽包括至少一个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中所述突变选自定位43处的取代、定位302处的取代和定位516处的取代。

实施例P1-2.根据实施例P1-1所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位302处的取代，其中所述取代是除苏氨酸外的任何氨基酸。

实施例P1-3.根据实施例P1-2所述的核酸，其中所述定位302处的取代是S302A。

实施例P1-4.根据实施例P1-1、P1-2或P1-3中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位43处的取代。

实施例P1-5.根据实施例P1-4所述的核酸，其中所述定位43处的取代是E或D。

实施例P1-6.根据实施例P1-5所述的核酸，其中所述定位43处的取代是E。

实施例P1-7.根据实施例P1-1所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括取代T43E和S302A。

实施例P1-8.根据实施例P1-1至P1-7中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位185处的取代。

实施例P1-9.根据实施例P1-8所述的核酸，其中所述定位185处的取代是K185A。

实施例P1-10.根据实施例P1-1至P1-9中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位516处的取代。

实施例P1-11.根据实施例P1-10所述的核酸，其中所述定位516处的取代是G516V。

实施例P1-12.根据实施例P1-1至P1-11中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位424或426处的取代。

实施例P1-13.根据实施例P1-12所述的核酸，其中所述dnDLK多肽进一步包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。

实施例P1-14.根据实施例P1-1所述的核酸，其包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

实施例P1-15.一种分离的核酸，所述核酸编码显性阴性双亮氨酸拉链酶(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的区158-520具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包括至少一个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中所述突变选自定位302处的取代和定位516处的取代。

实施例P1-16.根据实施例P1-15所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位S302处的取代，其中所述取代是除苏氨酸外的任何氨基酸。

实施例P1-17.根据实施例P1-16所述的核酸，其中所述取代是S302A。

实施例P1-18.根据实施例P1-15、P1-16或P1-17中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位516处的取代。

实施例P1-19.根据实施例P1-18所述的核酸，其中所述定位516处的取代是G516V。

实施例P1-20.根据实施例P1-15至P1-19中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位185处的取代。

实施例P1-21.根据实施例P1-20所述的核酸，其中所述定位185处的取代是K185A。

实施例P1-22.根据实施例P1-15至P1-21中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位424和/或426处的取代。

实施例P1-23.根据实施例P1-22所述的核酸，其中所述dnDLK多肽进一步包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。

实施例P1-24.一种分离的核酸，其编码亮氨酸拉链多肽，所述亮氨酸拉链多肽抑制同源二聚化和DLK与(LZK)的异源二聚化，其中所述多肽包括与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的氨基酸序列。

实施例P1-25.根据实施例P1-24所述的核酸，其中所述多肽的长度小于150个氨基酸。

实施例P1-26.一种载体，其包括根据实施例P1-1至P1-25中任一项所述的核酸。

实施例P1-27.根据实施例P1-26所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

实施例P1-28.根据实施例P1-27所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

实施例P1-29.根据实施例P1-28所述的载体，其中所述AAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11衍生的或假型AAV衍生的载体。

实施例P1-30.根据实施例P1-29所述的载体，其中所述载体是AAV2.7m8。

实施例P1-31.根据实施例P1-26至P1-31中任一项所述的载体，其进一步包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

实施例P1-32.一种宿主细胞，其包括根据实施例P1-1至P1-25中任一项所述的核酸或根据实施例P1-26至P1-31中任一项所述的载体。

实施例P1-33.根据实施例P1-32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是神经元。

实施例P1-34.根据实施例P1-33所述的宿主细胞，其中所述神经元是视网膜神经节。

实施例P1-35.根据实施例P1-33或P1-34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

实施例P1-36.根据实施例P1-35所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。

实施例P1-37.一种抑制神经元细胞死亡的方法，所述方法包括将根据实施例P1-1至P1-25中任一项所述的核酸或根据实施例P1-26至P1-31中任一项所述的载体引入到神经细胞中。

实施例P1-38.根据实施例P1-37所述的方法，其中所述神经细胞是离体的。

实施例P1-39.根据实施例P1-37所述的方法，其中所述神经细胞是体内的。

实施例P1-40.根据实施例P1-37至P1-39中任一项所述的方法，其中所述神经细胞是眼科神经元。

实施例P1-41.根据实施例P1-40所述的方法，其中所述眼科神经元是视网膜神经节。

实施例P1-42.根据实施例P1-37至P1-39中任一项所述的方法，其中所述神经细胞是感光细胞。

实施例P1-43.根据实施例P1-37至P1-42所述的方法，其中所述神经细胞是哺乳动物的。

实施例P1-44.根据实施例P1-43所述的方法，其中所述神经元是人神经细胞。

实施例P1-45.一种治疗或预防有需要的受试者的神经细胞死亡的方法，所述方法包括将根据实施例P1-1至P1-25中任一项所述的核酸或根据实施例P1-26至P1-31中任一项所述的载体施用于所述受试者。

实施例P1-46.根据实施例P1-45所述的方法，其中所述受试者患有青光眼、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管(CNV)、近视相关的CNV、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿和视网膜静脉阻塞。

实施例P1-47.根据实施例P1-45所述的方法，其中所述受试者具有遗传性视网膜疾病。

实施例P1-48.根据实施例P1-47所述的方法，其中所述遗传性视网膜疾病是视网膜色素变性。

实施例P1-49.一种多肽，其由根据实施例P1-1至P1-25中任一项所述的核酸编码。

实施例

实施例1.一种核酸，其编码显性阴性双亮氨酸拉链激酶(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括具有与SEQ ID NO:1的区1-520具有至少80％同一性的序列的氨基酸片段，

其中所述dnDLK多肽包括至少一个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中所述突变是定位302处的取代，其中所述取代是除苏氨酸外的任何氨基酸。

实施例2.根据实施例1所述的核酸，其中所述定位302处的取代是S302A。

实施例3.根据实施例1或2所述的核酸，其中所述dnDLK多肽的长度小于550个氨基酸。

实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位43处的取代。

实施例5.根据实施例3所述的核酸，其中所述定位43处的取代是E或D。

实施例6.根据实施例5所述的核酸，其中所述定位43处的取代是E。

实施例7.根据实施例1至6中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位185处的取代。

实施例8.根据实施例7所述的核酸，其中所述定位185处的取代是K185A。

实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位424或426处的取代。

实施例10.根据实施例9所述的核酸，其中所述dnDLK多肽进一步包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。

实施例11.根据实施例1所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括SEQ ID NO:6或SEQID NO:7的氨基酸序列。

实施例12.根据实施例1至11中任一项所述的核酸，其包括与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的核酸序列。

实施例13.一种分离的核酸，其编码亮氨酸拉链多肽，所述亮氨酸拉链多肽抑制同源二聚化和DLK与(LZK)的异源二聚化，其中所述多肽包括与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列；或包括SEQ ID NO:8。

实施例14.根据实施例13所述的核酸，其中所述多肽的长度小于150个氨基酸。

实施例15.一种分离的核酸，其编码显性阴性双亮氨酸拉链(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的区158-520具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包括至少一个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中所述至少一个突变位于定位302处。

实施例16.根据实施例15所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位S302处的取代，其中所述取代是除苏氨酸外的任何氨基酸。

实施例17.根据实施例16所述的核酸，其中所述取代是S302A。

实施例18.根据实施例15至17中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位185处的取代。

实施例19.根据实施例18所述的核酸，其中所述定位185处的取代是K185A。

实施例20.根据实施例15-19中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位424和/或426处的取代。

实施例21.根据实施例20所述的核酸，其中所述dnDLK多肽进一步包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。

实施例22.一种载体，其包括根据实施例1至14中任一项所述的核酸。

实施例23.根据实施例22所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

实施例24.根据实施例23所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

实施例25.根据实施例24所述的载体，其中所述AAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11衍生的或假型AAV衍生的载体。

实施例26.根据实施例25所述的载体，其中所述载体是AAV2.7m8。

实施例27.根据实施例22至26中任一项所述的载体，其进一步包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

实施例28.一种宿主细胞，其包括根据实施例1至21中任一项所述的核酸或根据实施例22至27中任一项所述的载体。

实施例29.根据实施例28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是神经元。

实施例30.根据实施例29所述的宿主细胞，其中所述神经元是视网膜神经节。

实施例31.根据实施例29或30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

实施例32.根据实施例31所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。

实施例33.一种抑制神经元细胞死亡的方法，所述方法包括将根据实施例1至21中任一项所述的核酸或根据实施例22至27中任一项所述的载体引入到神经细胞中。

实施例34.根据实施例33所述的方法，其中所述神经细胞是离体的。

实施例35.根据实施例33所述的方法，其中所述神经细胞是体内的。

实施例36.根据实施例33至35中任一项所述的方法，其中所述神经细胞是眼科神经元。

实施例37.根据实施例36所述的方法，其中所述眼科神经元是视网膜神经节。

实施例38.根据实施例33至35中任一项所述的方法，其中所述神经细胞是感光细胞。

实施例39.根据实施例33至38中任一项所述的方法，其中所述神经细胞是哺乳细胞的。

实施例40.根据实施例39所述的方法，其中所述神经元是人神经细胞。

实施例41.一种治疗或预防有需要的受试者的神经细胞死亡的方法，所述方法包括将根据实施例1至21中任一项所述的核酸或根据实施例22至27中任一项所述的载体施用于所述受试者。

实施例42.根据实施例41所述的方法，其中所述受试者患有青光眼、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管(CNV)、近视相关的CNV、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿和视网膜静脉阻塞。

实施例43.根据实施例41所述的方法，其中所述受试者具有遗传性视网膜疾病。

实施例44.根据实施例43所述的方法，其中所述遗传性视网膜疾病是视网膜色素变性。

实施例45.一种多肽，其由根据实施例1至21中任一项所述的核酸编码。

5.测定、方法和实验结果

5.1方法

5.1.1慢病毒产生

表达DN DLK和LZK的慢病毒是通过使用(Kpn2I-消化的)Gibson组装将合成的DNA片段亚克隆到pLenti-EF1-mScarlet主链中来制备的。结果是DLK与具有小接头肽的mScarlet融合。对于亮氨酸拉链，在mScarlet与片段之间插入P2A序列，以在翻译期间诱导核糖体跳跃。使用Lipofectamine 2000(赛默科技公司(Thermo Scientific)编号11668019)用各种慢病毒构建体转染293-HEK细胞。转染后24小时添加1M丁酸钠(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)编号B5887)。转染后48小时收集病毒上清液，并用Lenti-X浓缩器(Takara)浓缩。

5.1.2原代RGC

从出生后第0-3天的小鼠中分离视网膜，并与木瓜蛋白酶解离。用与抗CD11b缀合的CELLection Dynabeads(英杰公司(Invitrogen))(BD Pharmingen，554859)对小胶质细胞进行免疫耗竭。将视网膜细胞的悬浮液在室温(RT)下在与抗Thy1.2抗体(伯乐公司(BioRad)，MCA02R)和山羊抗小鼠IgM(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch)，115-001-020)预缀合的板上进行免疫淘选。在洗涤后，用胰蛋白酶(西格玛公司T9201)从板中释放视网膜神经节细胞(RGC)，计数，并以每孔5,000-10,000个的密度接种在96孔板(Nunclon板和聚-D-赖氨酸涂覆的)中。生长培养基由Neurobasal(生命科技公司(LifeTechnologies))构成，补充有NS21、Sato、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、N-乙酰基-半胱氨酸、胰岛素、丙酮酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、毛喉素(Chen等人,2008)和1μM GNE 3511(基因技术公司(Genentech))，以防止RGC死亡。在分离时进行慢病毒DN DLK和LZK的转导。

5.1.3活力测定

在转导后第3-5天，停止向原代RGC提供GNE 3511(DLK/LZK抑制剂)以引发细胞死亡。通过添加50％体积的CellTiter Glo(CTG)(普洛麦格公司G8462)，测定GNE停用后3天的细胞存活率[相对光单位(RLU)]。发光用读板器(分子装置公司)进行测量。这允许计算活细胞的数量。通过测定产生CTG测量的存活效果的最低慢病毒滴度(表示为病毒基因组水平(vg))来评估慢病毒构建体的“效力”。通过比较不同构建体在相同慢病毒浓度下的存活率来评估构建体的“功效”。

5.1.4定量逆转录酶PCR定量慢病毒基因组拷贝数

如第5.1.1章节所描述的，将293-HEK细胞用表达DN DLK和LZK的慢病毒转导。将细胞采集并使用QuickExtract RNA提取试剂盒(Lucigen编号QE09050)提取DNA。使用CFXConnect实时PCR检测系统(伯乐公司1855200)进行PCR分析。用SsoAdvanced UniversalSYBR Green Supermix(伯乐公司1725270)使用正向(CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT)和反向(GCAGAATCCAGGTGGCAACA)引物进行qPCR以检测慢病毒mRNA水平(即，基因组拷贝数)。扩增Sox11作为内部对照(Sox11，正向引物：CACCGATGAACGGGATCTTCTCGC，反向引物：AAACGCGAGAAGATCCCGTTCATC)。

5.1.5随机诱变筛选

从全长DLK cDNA中扩增大约1kb的DLK区段(核苷酸772-1830)。使用GeneMorph II易错PCR试剂盒(安捷伦公司(Agilent))使用易错PCR对扩增子进行随机诱变，保持大约1个突变/kb的突变频率。然后用AarI和BstXI消化诱变的插入物和主链，并使用快速连接酶(NEB)连接。将慢病毒DN DLK文库转导到原代RGC中是在分离时在0.3的感染复数下进行的。通过在转导后第3-5天停用GNE 3511来诱导选择性压力。收集停用GNE 3511后第5-7天的存活细胞，并通过下一代测序进行分析。

5.2神经保护性DLK变体的产生

制备了一系列构建体，以评估野生型人DLK(SEQ ID NO:1)在具体定位处的突变的效果，并测试DLK在C端处的截短效果。

5.2.1S302 dnDLK

产生了在定位302处具有取代的DLK突变体，即DLK磷酸化位点。在定位302处用丙氨酸取代S(S302A)，并如上文所描述的评估对小鼠视网膜神经节神经元存活率的影响。在一些实验中，将保护活性与dnDLK K185A进行了比较。K185A突变阻断DLK自磷酸化。发现DNK的S302A变体具有神经保护作用。事实上，S302 DLK的神经保护活性比DLK K185A变体的神经保护活性大。参见图2(K185A对S302A)。在不旨在被特定机制结合的情况下，S302A突变被认为通过磷酸激酶A(PKA)阻断DLK激活。

图2还提供了示出被引入到较短的人DLK同种型SEQ ID NO:13(图2中的构建体K185A(同种型2))中的K185A突变也具有神经保护作用的数据，尽管与这项实验中评估的用其它突变体构建体获得的神经保护作用相比处于较低水平。

5.2.2C端截短(ΔC-dnDLK)

发现去除K185A DLK的C端氨基酸521-892并没有显著降低K185A DLK的保护活性。参见图2(K185A对K185A/ΔC)。得出结论，可以通过缺失C端同时保留dnDLK活性来减小DLK的大小。ΔC-dnDLK的较小大小意味着可以使用更短的转基因将活性dnDLK递送到细胞。

5.2.3S302/ΔC dnDLK

制备了一种变体，其中S302A取代与残基521-892的C端缺失相组合。如图1A所示，S302/ΔC dnDLK比K185A变体更具保护性。转基因的效力增加了10倍，而最大效力增加了2.5倍。

5.2.4LZK LZ具有神经保护性

已知DLK通过DLK亮氨酸拉链同源二聚化。还表明DLK亮氨酸拉链本身可以充当dnDLK(Nihalani等人,《生物化学杂志)》275:7273-7279,2000)，推测是由于其结合DLK和防止同源二聚化的能力。

制备了表达LZK亮氨酸拉链结构域(SEQ ID NO:8)的构建体。令人惊讶的是，LZK亮氨酸拉链结构域(在图1B中被指定为P2A LZK LZ的构建体)具有神经保护活性。构建体的效力增加了10倍，并且功效增加了大约8.5倍(参见图1B)。表达DLK亮氨酸拉链结构域的构建体(在图2中指定为P2A DLK LZ)没有表现出保护活性。还产生了DLK LZ和LZK LZ P2A融合的构建体，其对RGC存活率没有影响(数据未示出)。类似地，编码DLK LZ和LZK LZ的构建体的共转染没有提供改善的存活率(数据未示出)。在不旨在被特定机制结合的情况下，认为LZK LZ多肽抑制DLK-LZK异源二聚化。

5.2.5T43E dnDLK

在此实例中，制备了一系列磷酸模拟的突变体(T9E、S11E、T43E、S272E和S533E)。其中T43E变体具有神经保护作用，参见图2(K185A对K185A/T43E)。

Huntwork-Rodriguez(《细胞生物学杂志(J.Cell Biol)》202:747-763,2013)证明，在神经元损伤后，通过DLK长度的特异性位点经历c-Jun N端激酶的磷酸化。这些磷酸化事件通过减少DLK泛素化导致DLK丰度增加。假设可以在这些位点处引入磷酸模拟的突变，以产生更稳定的显性阴性DLK多肽。位点T9、S11、T43、S272和S533如上文所指示的被诱变。将磷酸模拟的突变引入到K185A突变体背景中。

如第5.1.1章节所描述的，产生编码各种磷酸模拟的DN DLK突变体的慢病毒，并以相等滴度转导到RGC中。DLK/LZK抑制剂GNE 3511存在于培养基中以防止细胞死亡。在转导后第3-5天，停止向原代RGC中提供GNE 3511以引发细胞死亡。在停用GNE后3天测定细胞的存活率。测量发光(相对光单位(RLU))以测定活细胞的数量。

在这项分析中，相对于K185A，只有T43E K185A显示出增强的神经保护作用。所有构建体的神经保护活性总结如下：

-T9E S11E K185A-与单独的K185A突变相比没有显著差异

-S533E K185A-与单独的K185A突变相比没有显著差异

-T9E S11E S272E S533E K185A-与单独的K185A突变相比没有显著差异

-T43E S272E S533E K185A -与阴性对照组相比，存活率没有提高(GNE停用)

-T43E K185A-与单独的K185A相比，存活率提高了约3倍

5.2.6G516 dnDLK

作为发现dnDLK突变的替代性方法，随机诱变人DLK，转导RGC，并回收存活细胞中剩余的序列(即定向进化)。

生成了慢病毒文库，其中DLK被随机诱变。RGC以1的感染倍数(MOI)感染，使得平均每个细胞接收一种病毒。LK/LZK抑制剂GNE 3511初始存在于培养基中以防止细胞死亡。然后，通过停用GN 3511施加选择性压力，使得仅存活细胞才会含有活性DLK显性阴性。在应用选择性压力之前，下一代测序显示出突变的基线分布。在选择性压力后，存活细胞的下一代测序确定G516V在基线分布上富集程度最高。因此，这项筛选鉴定了一种新的突变体G516V，其也产生了dnDLK。

5.3dnDLK的体内施用

5.3.1青光眼大鼠模型

在青光眼大鼠模型中评估了施用编码dnDLK变体(SEQ ID NO:6)的AAV的效果，其中S302A取代与残基521-892的C端缺失相组合。

将动物(每组8只)用异氟烷麻醉，并玻璃体内注射一次剂量为5x 10⁹的表达dnDLK或作为对照的表达GFP的病毒基因组AAV。

在4周后，将动物用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉，并将眼睛用丙美卡因滴眼液局部麻醉。麻醉后，用低温烧烙笔(700-1000F)轻触眼睛边缘神经丛周围。通过结膜轻微褐变和巩膜外血管变白可观察到适当的烧灼。然后将眼睛涂覆抗生素软膏，以防止感染和角膜干燥。损伤后六周，将动物麻醉，并且然后用4％ PFA灌注，并用RBPMS和SNCG免疫荧光标记视网膜。

为了定量青光眼模型中的RGC存活率，在10倍放大率下，每个视网膜共拍摄了总共16张RBPMS标记的RGC图像，其中中心区和外周区具有相等代表性。使用自动图像分析软件对每张图片的RGC数量进行定量，并且然后对每个视网膜取平均值。

为了评估轴突变性，以10倍放大率对SNCG标记的视神经头进行成像并使用蒙太奇手法以评估轴突健康。蒙太奇图像由一组研究人员评估愈合水平，评分从1至5，其中5个是健康的轴突，并且1个是完全变性的。评估健康状况的标准包含轴突束的厚度、轴突形状的均匀性或平直度以及视网膜轴突缺失的百分比。

图3示出了左图中接受dnDLK的动物的轴突相对于对照的平均轴突健康评分，以及右图中如通过评估轴突变性评估的视神经性头部变性的平均百分比。来自注射有表达dnDLK的AAV的眼睛的视网膜被保护免受青光眼的影响，其中平均评分为4分(满分5分)，而来自注射有表达GFP的AAV的眼睛的视网膜具有变性的轴突，其中平均评分为2。此外，青光眼损伤导致GFP视网膜平均65％的轴突变性，而dnDLK视网膜的轴突完整性仅损失20％。通过dnDLK改善了青光眼后RGC存活率，其中与没有损伤的具有dnDLK的视网膜相比，RGC的平均损失为8％。与没有损伤的GFP视网膜相比，具有GFP的视网膜在损伤时平均有37.5％的RGC损失。

因此，结果表明dnDLK在体内大鼠模型中保护RGC免受青光眼损伤。

***

应当理解，本文所描述的实例和实施例仅是出于说明性目的，并且根据其进行的各种修改或改变将启发本领域的技术人员并且将被包含在本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。

关于明确引用的材料，本文所引用的所有公开、专利和专利申请均特此通过引用并入。

说明性序列的表

SEQ ID NO:1人DLK激酶结构域多肽序列，UniProt Q12852-2；包含替代UniProtQ12852-1的定位46处的组氨酸的氨基酸序列QCVLRDVVPLGGQGGGGPSPSPGGEPPPEPFANS；参见SEQ ID NO:13。实例中添加的C端缺失序列带有下划线。

SEQ ID NO:2如UniProt Q12852中所定义的催化(激酶)结构域氨基酸序列

SEQ ID NO:3人DLK亮氨酸拉链结构域序列

SEQ ID NO:4人DLK的亮氨酸拉链1序列(如Uniprot Q12852中所定义)

VKLHFEKIKSEGTCLHRLEEEL

SEQ ID NO:5人DLK的亮氨酸拉链2序列(如Uniprot Q12852中所定义)

LNALMLQLELKERELLRREQAL

SEQ ID NO:6C端缺失的具有302处的突变的dnDLK

SEQ ID NO:7C端缺失的具有302和43处的突变的dnDLK

SEQ ID NO:8人MAP3K13(亮氨酸拉链激酶)亮氨酸拉链结构域氨基酸序列

LATPQETYFKSQAEWREEVKKHFEKIKSEGTCIHRLDEELIRRRREELRHALDIREHYERKLERANNLYMELSAIMLQLEMREKELIKREQAVEKKYPGTYKRHPVRPIIHPNAME

SEQ ID NO:9编码SEQ ID NO:1的DLK全长cDNA序列

ATGGCTTGCCTCCATGAGACCCGAACACCCTCTCCTTCCTTTGGGGGCTTTGTGTCTACCCTAAGTGAGGCATCCATGCGCAAGCTGGACCCAGACACTTCTGACTGCACTCCCGAGAAGGACCTGACGCCTACCCAGTGTGTACTTCGAGATGTGGTACCCCTTGGTGGGCAGGGTGGGGGAGGGCCCAGCCCCTCCCCAGGTGGAGAGCCGCCCCCTGAGCCTTTTGCCAACAGTGTCCTGCAGCTACATGAGCAGGATGCAGGGGGCCCAGGGGGAGCAGCTGGGTCACCTGAGAGTCGGGCATCCAGAGTTCGAGCTGACGAGGTGCGACTGCAGTGCCAGAGTGGCAGTGGCTTCCTTGAGGGCCTCTTTGGCTGCCTGCGCCCTGTCTGGACCATGATTGGCAAAGCCTACTCCACTGAGCACAAGCAGCAGCAGGAAGACCTTTGGGAGGTCCCCTTTGAGGAAATCCTGGACCTGCAGTGGGTGGGCTCAGGGGCCCAGGGTGCTGTCTTCCTGGGGCGCTTCCACGGGGAGGAGGTGGCTGTGAAGAAGGTGCGAGACCTCAAAGAAwACCGACATCAAGCACTTGCGAAAGCTGAAGCACCCCAACATCATCACTTTCAAGGGTGTGTGCACCCAGGCTCCCTGCTACTGCATCCTCATGGAGTTCTGCGCCCAGGGCCAGCTGTATGAGGTACTGCGGGCTGGCCGCCCTGTCACCCCCTCCTTACTGGTTGACTGGTCCATGGGCATCGCTGGTGGCATGAACTACCTGCACCTGCACAAGATTATCCACAGGGATCTCAAGTCACCCAACATGCTAATCACCTACGACGATGTGGTGAAGATCTCAGATTTTGGCACTTCCAAGGAGCTGAGTGACAAGAGCACCAAGATGTCCTTTGCAGGGACAGTAGCCTGGATGGCCCCTGAGGTGATCCGCAATGAACCTGTGTCTGAGAAGGTCGACATCTGGTCCTTTGGCGTGGTGCTATGGGAACTGCTGACTGGTGAGATCCCCTACAAAGACGTAGATTCCTCAGCCATTATCTGGGGTGTGGGAAGCAACAGTCTCCATCTGCCCGTGCCCTCCAGTTGCCCAGATGGTTTCAAGATCCTGCTTCGCCAGTGCTGGAATAGCAAACCACGAAATCGCCCATCATTCCGACAGATCCTGCTGCATCTGGACATTGCCTCAGCTGATGTACTCTCCACACCCCAGGAGACTTACTTTAAGTCCCAGGCAGAGTGGCGGGAAGAAGTAAAACTGCACTTTGAAAAGATTAAGTCAGAAGGGACCTGTCTGCACCGCCTAGAAGAGGAACTGGTGATGAGGAGGAGGGAGGAGCTCAGACACGCCCTGGACATCAGGGAGCACTATGAAAGGAAGCTGGAGAGAGCCAACAACCTGTATATGGAACTTAATGCCCTCATGTTGCAGCTGGAACTCAAGGAGAGGGAGCTGCTCAGGCGAGAGCAAGCTTTAGAGCGGAGGTGCCCAGGCCTGCTGAAGCCACACCCTTCCCGGGGCCTCCTGCATGGAAACACAATGGAGAAGCTTATCAAGAAGAGGAATGTGCCACAGAAGCTGTCACCCCATAGCAAAAGGCCAGATATCCTCAAGACGGAGTCTTTGCTCCCTAAACTAGATGCAGCCCTGAGTGGGGTGGGGCTTCCTGGGTGTCCTAAGGGCCCCCCCTCACCAGGACGGAGTCGCCGTGGCAAGACCCGTCACCGCAAGGCCAGCGCCAAGGGGAGCTGTGGGGACCTGCCTGGGCTTCGTACAGCTGTGCCACCCCATGAACCTGGAGGACCAGGAAGCCCAGGGGGCCTAGGAGGGGGACCCTCAGCCTGGGAGGCCTGCCCTCCCGCCCTCCGTGGGCTTCATCATGACCTCCTGCTCCGCAAAATGTCTTCATCGTCCCCAGACCTGCTGTCAGCAGCACTAGGGTCCCGGGGCCGGGGGGCCACAGGCGGAGCTGGGGATCCTGGCTCACCACCTCCGGCCCGGGGTGACACCCCACCAAGTGAGGGCTCAGCCCCTGGCTCCACCAGCCCAGATTCACCTGGGGGAGCCAAAGGGGAACCACCTCCTCCAGTAGGGCCTGGTGAAGGTGTGGGGCTTCTGGGAACTGGAAGGGAAGGGACCTCAGGCCGGGGAGGAAGCCGGGCTGGGTCCCAGCACTTGACCCCAGCTGCACTGCTGTACAGGGCTGCCGTCACCCGAAGTCAGAAACGTGGCATCTCATCGGAAGAGGAGGAAGGAGAGGTAGACAGTGAAGTAGAGCTGACATCAAGCCAGAGGTGGCCTCAGAGCCTGAACATGCGCCAGTCACTATCTACCTTCAGCTCAGAGAATCCATCAGATGGGGAGGAAGGCACAGCTAGTGAACCTTCCCCCAGTGGCACACCTGAAGTTGGCAGCACCAACACTGATGAGCGGCCAGATGAGCGGTCTGATGACATGTGCTCCCAGGGCTCAGAAATCCCACTGGACCCACCTCCTTCAGAGGTCATCCCTGGCCCTGAACCCAGCTCCCTGCCCATTCCACACCAGGAACTTCTCAGAGAGCGGGGCCCTCCCAATTCTGAGGACTCAGACTGTGACAGCACTGAATTGGACAACTCCAACAGCGTTGATGCCTTGCGGCCCCCAGCTTCCCTCCCTCCATGA

SEQ ID NO:10dnDLK S302AΔC末端WPRE多核苷酸序列

ATGGCTTGCCTCCATGAGACCCGAACACCCTCTCCTTCCTTTGGGGGCTTTGTGTCTACCCTAAGTGAGGCATCCATGCGCAAGCTGGACCCAGACACTTCTGACTGCACTCCCGAGAAGGACCTGACGCCTACCCAGTGTGTACTTCGAGATGTGGTACCCCTTGGTGGGCAGGGTGGGGGAGGGCCCAGCCCCTCCCCAGGTGGAGAGCCGCCCCCTGAGCCTTTTGCCAACAGTGTCCTGCAGCTACATGAGCAGGATGCAGGGGGCCCAGGGGGAGCAGCTGGGTCACCTGAGAGTCGGGCATCCAGAGTTCGAGCTGACGAGGTGCGACTGCAGTGCCAGAGTGGCAGTGGCTTCCTTGAGGGCCTCTTTGGCTGCCTGCGCCCTGTCTGGACCATGATTGGCAAAGCCTACTCCACTGAGCACAAGCAGCAGCAGGAAGACCTTTGGGAGGTCCCCTTTGAGGAAATCCTGGACCTGCAGTGGGTGGGCTCAGGGGCCCAGGGTGCTGTCTTCCTGGGGCGCTTCCACGGGGAGGAGGTGGCTGTGAAGAAGGTGCGAGACCTCAAAGAAACCGACATCAAGCACTTGCGAAAGCTGAAGCACCCCAACATCATCACTTTCAAGGGTGTGTGCACCCAGGCTCCCTGCTACTGCATCCTCATGGAGTTCTGCGCCCAGGGCCAGCTGTATGAGGTACTGCGGGCTGGCCGCCCTGTCACCCCCTCCTTACTGGTTGACTGGTCCATGGGCATCGCTGGTGGCATGAACTACCTGCACCTGCACAAGATTATCCACAGGGATCTCAAGTCACCCAACATGCTAATCACCTACGACGATGTGGTGAAGATCTCAGATTTTGGCACTTCCAAGGAGCTGAGTGACAAGAGCACCAAGATGGCCTTTGCAGGGACAGTAGCCTGGATGGCCCCTGAGGTGATCCGCAATGAACCTGTGTCTGAGAAGGTCGACATCTGGTCCTTTGGCGTGGTGCTATGGGAACTGCTGACTGGTGAGATCCCCTACAAAGACGTAGATTCCTCAGCCATTATCTGGGGTGTGGGAAGCAACAGTCTCCATCTGCCCGTGCCCTCCAGTTGCCCAGATGGTTTCAAGATCCTGCTTCGCCAGTGCTGGAATAGCAAACCACGAAATCGCCCATCATTCCGACAGATCCTGCTGCATCTGGACATTGCCTCAGCTGATGTACTCTCCACACCCCAGGAGACTTACTTTAAGTCCCAGGCAGAGTGGCGGGAAGAAGTAAAACTGCACTTTGAAAAGATTAAGTCAGAAGGGACCTGTCTGCACCGCCTAGAAGAGGAACTGGTGATGAGGAGGAGGGAGGAGCTCAGACACGCCCTGGACATCAGGGAGCACTATGAAAGGAAGCTGGAGAGAGCCAACAACCTGTATATGGAACTTAATGCCCTCATGTTGCAGCTGGAACTCAAGGAGAGGGAGCTGCTCAGGCGAGAGCAAGCTTTAGAGCGGAGGTGCCCAGGCCTGCTGAAGCCACACCCTTCCCGGGGCCTCCTGCATGGAAACACAATGGAGTAG

SEQ ID NO:11dnDLK T43E S302AΔC末端WPRE多核苷酸序列

ATGGCTTGCCTCCATGAGACCCGAACACCCTCTCCTTCCTTTGGGGGCTTTGTGTCTACCCTAAGTGAGGCATCCATGCGCAAGCTGGACCCAGACACTTCTGACTGCACTCCCGAGAAGGACCTGGAGCCTACCCAGTGTGTACTTCGAGATGTGGTACCCCTTGGTGGGCAGGGTGGGGGAGGGCCCAGCCCCTCCCCAGGTGGAGAGCCGCCCCCTGAGCCTTTTGCCAACAGTGTCCTGCAGCTACATGAGCAGGATGCAGGGGGCCCAGGGGGAGCAGCTGGGTCACCTGAGAGTCGGGCATCCAGAGTTCGAGCTGACGAGGTGCGACTGCAGTGCCAGAGTGGCAGTGGCTTCCTTGAGGGCCTCTTTGGCTGCCTGCGCCCTGTCTGGACCATGATTGGCAAAGCCTACTCCACTGAGCACAAGCAGCAGCAGGAAGACCTTTGGGAGGTCCCCTTTGAGGAAATCCTGGACCTGCAGTGGGTGGGCTCAGGGGCCCAGGGTGCTGTCTTCCTGGGGCGCTTCCACGGGGAGGAGGTGGCTGTGAAGAAGGTGCGAGACCTCAAAGAAACCGACATCAAGCACTTGCGAAAGCTGAAGCACCCCAACATCATCACTTTCAAGGGTGTGTGCACCCAGGCTCCCTGCTACTGCATCCTCATGGAGTTCTGCGCCCAGGGCCAGCTGTATGAGGTACTGCGGGCTGGCCGCCCTGTCACCCCCTCCTTACTGGTTGACTGGTCCATGGGCATCGCTGGTGGCATGAACTACCTGCACCTGCACAAGATTATCCACAGGGATCTCAAGTCACCCAACATGCTAATCACCTACGACGATGTGGTGAAGATCTCAGATTTTGGCACTTCCAAGGAGCTGAGTGACAAGAGCACCAAGATGGCCTTTGCAGGGACAGTAGCCTGGATGGCCCCTGAGGTGATCCGCAATGAACCTGTGTCTGAGAAGGTCGACATCTGGTCCTTTGGCGTGGTGCTATGGGAACTGCTGACTGGTGAGATCCCCTACAAAGACGTAGATTCCTCAGCCATTATCTGGGGTGTGGGAAGCAACAGTCTCCATCTGCCCGTGCCCTCCAGTTGCCCAGATGGTTTCAAGATCCTGCTTCGCCAGTGCTGGAATAGCAAACCACGAAATCGCCCATCATTCCGACAGATCCTGCTGCATCTGGACATTGCCTCAGCTGATGTACTCTCCACACCCCAGGAGACTTACTTTAAGTCCCAGGCAGAGTGGCGGGAAGAAGTAAAACTGCACTTTGAAAAGATTAAGTCAGAAGGGACCTGTCTGCACCGCCTAGAAGAGGAACTGGTGATGAGGAGGAGGGAGGAGCTCAGACACGCCCTGGACATCAGGGAGCACTATGAAAGGAAGCTGGAGAGAGCCAACAACCTGTATATGGAACTTAATGCCCTCATGTTGCAGCTGGAACTCAAGGAGAGGGAGCTGCTCAGGCGAGAGCAAGCTTTAGAGCGGAGGTGCCCAGGCCTGCTGAAGCCACACCCTTCCCGGGGCCTCCTGCATGGAAACACAATGGAGTAG

SEQ ID NO:12显性阴性LZK亮氨酸拉链结构域多核苷酸序列WPRE

ATGCTTGCCACCCCACAAGAAACTTACTTCAAGTCTCAGGCTGAATGGAGAGAAGAAGTGAAAAAACATTTTGAGAAGATCAAAAGTGAAGGAACTTGTATACACCGGTTAGATGAAGAACTGATTCGAAGGCGCAGAGAAGAGCTCAGGCATGCGCTGGATATTCGTGAACACTATGAGCGGAAGCTTGAGCGGGCGAATAATTTATACATGGAATTGAGTGCCATCATGCTGCAGCTAGAAATGCGGGAGAAGGAGCTCATTAAGCGTGAGCAAGCAGTGGAAAAGAAGTATCCTGGGACCTACAAACGACACCCTGTTCGTCCTATCATCCATCCCAATGCCATGGAGTGA

SEQ ID NO:13人DLK多肽序列，同种型1，UniProt Q12852-1

MACLHETRTP SPSFGGFVST LSEASMRKLD PDTSDCTPEK DLTPTHVLQL

HEQDAGGPGG AAGSPESRAS RVRADEVRLQ CQSGSGFLEG LFGCLRPVWT

MIGKAYSTEH KQQQEDLWEV PFEEILDLQW VGSGAQGAVF LGRFHGEEVA

VKKVRDLKET DIKHLRKLKH PNIITFKGVC TQAPCYCILM EFCAQGQLYE

VLRAGRPVTP SLLVDWSMGI AGGMNYLHLH KIIHRDLKSP NMLITYDDVV

KISDFGTSKE LSDKSTKMSF AGTVAWMAPE VIRNEPVSEK VDIWSFGVVL

WELLTGEIPY KDVDSSAIIW GVGSNSLHLP VPSSCPDGFK ILLRQCWNSK

PRNRPSFRQI LLHLDIASAD VLSTPQETYF KSQAEWREEV KLHFEKIKSE

GTCLHRLEEE LVMRRREELR HALDIREHYE RKLERANNLY MELNALMLQL

ELKERELLRR EQALERRCPG LLKPHPSRGL LHGNTMEKLI KKRNVPQKLS

PHSKRPDILK TESLLPKLDA ALSGVGLPGC PKGPPSPGRS RRGKTRHRKA

SAKGSCGDLP GLRTAVPPHE PGGPGSPGGL GGGPSAWEAC PPALRGLHHD

LLLRKMSSSS PDLLSAALGS RGRGATGGAG DPGSPPPARG DTPPSEGSAP

GSTSPDSPGG AKGEPPPPVG PGEGVGLLGT GREGTSGRGG SRAGSQHLTP

AALLYRAAVT RSQKRGISSE EEEGEVDSEV ELTSSQRWPQ SLNMRQSLST

FSSENPSDGE EGTASEPSPS GTPEVGSTNT DERPDERSDD MCSQGSEIPL

DPPPSEVIPG PEPSSLPIPH QELLRERGPP NSEDSDCDST ELDNSNSVDA

LRPPASLPP

SEQ ID NO:14WPRE核酸序列

ATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCTCTCAATCCAGCGGACCTCCCTTCCCGAGGCCTTCTGCCGGTTCTGCGGCCTCTCCCGCGTCTTCGCTTTCGGCCTCCGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG

Claims

1.一种核酸，其编码显性阴性双亮氨酸拉链激酶(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括具有与SEQ ID NO:1的区1-520具有至少80％同一性的序列的氨基酸片段，其中所述dnDLK多肽包括至少一个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中所述突变是定位302处的取代，其中所述取代是除苏氨酸外的任何氨基酸。

2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述定位302处的取代是S302A。

3.根据权利要求1所述的核酸，其中所述dnDLK多肽的长度少于550个氨基酸。

4.根据权利要求1所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位43处的取代。

5.根据权利要求4所述的核酸，其所述中定位43处的取代是E或D。

6.根据权利要求5所述的核酸，其中所述定位43处的取代是E。

7.根据权利要求1所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位185处的取代。

8.根据权利要求7所述的核酸，其中所述定位185处的取代是K185A。

9.根据权利要求1所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位424或426处的取代。

10.根据权利要求9所述的核酸，其中所述dnDLK多肽进一步包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。

11.根据权利要求1所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

12.根据权利要求1所述的核酸，其包括与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的核酸序列。

13.一种分离的核酸，其编码亮氨酸拉链多肽，所述亮氨酸拉链多肽抑制同源二聚化和DLK与(LZK)的异源二聚化，其中所述多肽包括与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列；或包括SEQ ID NO:8。

14.根据权利要求13所述的核酸，其中所述多肽的长度少于150个氨基酸。

15.一种分离的核酸，其编码显性阴性双亮氨酸拉链(dnDLK)多肽，所述dnDLK多肽包括与SEQ ID NO:1的区158-520具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包括至少一个突变，如参考SEQ ID NO:1所确定的，其中所述至少一个突变位于定位302处。

16.根据权利要求15所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位S302处的取代，其中所述取代是除苏氨酸外的任何氨基酸。

17.根据权利要求16所述的核酸，其中所述取代是S302A。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位185处的取代。

19.根据权利要求18所述的核酸，其中所述定位185处的取代是K185A。

20.根据权利要求15所述的核酸，其中所述dnDLK多肽包括定位424和/或426处的取代。

21.根据权利要求20所述的核酸，其中所述dnDLK多肽进一步包括定位431、438、440、445、447、486、491或493处的取代。

22.一种载体，其包括根据权利要求1所述的核酸。

23.根据权利要求22所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

24.根据权利要求23所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

25.根据权利要求24所述的载体，其中所述AAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11衍生的或假型AAV衍生的载体。

26.根据权利要求25所述的载体，其中所述载体是AAV2.7m8。

27.根据权利要求22所述的载体，其进一步包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

28.一种宿主细胞，其包括根据权利要求1所述的核酸或根据权利要求22所述的载体。

29.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是神经元。

30.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述神经元是视网膜神经节。

31.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

32.根据权利要求31所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。

33.一种抑制神经元细胞死亡的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的核酸或根据权利要求22所述的载体引入到神经细胞中。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述神经细胞是离体的。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述神经细胞是体内的。

36.根据权利要求33所述的方法，其中所述神经细胞是眼科神经元。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述眼科神经元是视网膜神经节。

38.根据权利要求33所述的方法，其中所述神经细胞是感光细胞。

39.根据权利要求33所述的方法，其中所述神经细胞是哺乳动物的。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述神经元是人神经细胞。

41.一种治疗或预防有需要的受试者的神经细胞死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的核酸或根据权利要求22所述的载体。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者患有青光眼、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管(CNV)、近视相关的CNV、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿和视网膜静脉阻塞。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者患有遗传性视网膜疾病。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述遗传性视网膜疾病是视网膜色素变性。

45.一种多肽，其由根据权利要求1所述的核酸编码。