KR20230167312A - 망막 또는 황반 질환 치료용 조성물 - Google Patents

망막 또는 황반 질환 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230167312A
KR20230167312A KR1020230068976A KR20230068976A KR20230167312A KR 20230167312 A KR20230167312 A KR 20230167312A KR 1020230068976 A KR1020230068976 A KR 1020230068976A KR 20230068976 A KR20230068976 A KR 20230068976A KR 20230167312 A KR20230167312 A KR 20230167312A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
sequence
amino acid
acid sequence
terminus
Prior art date
Application number
KR1020230068976A
Other languages
English (en)
Inventor
김지용
박정윤
심주원
이준우
한주석
Original Assignee
주식회사 뉴라클제네틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 뉴라클제네틱스 filed Critical 주식회사 뉴라클제네틱스
Priority to PCT/KR2023/007442 priority Critical patent/WO2023234701A1/ko
Publication of KR20230167312A publication Critical patent/KR20230167312A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 TAFA 단백질(예를 들어, TAFA1 내지 TAFA4)의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TAFA 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 상기 AAV 벡터와 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자에 관한 것이다. 본 발명의 AAV 벡터, 재조합 바이러스 또는 이를 포함하는 조성물은 손상된 망막을 회복시킴으로써, 망막 또는 황반질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

망막 또는 황반 질환 치료용 조성물{Composition for Treating Retinal or Macular Disease}
본 발명의 개시 내용은 TAFA 단백질(예를 들어, TAFA1 내지 TAFA4)의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
망막은 안구 벽의 가장 안쪽에 위치하여 유리체(vitreous body)와 접하고 있는 투명하고 얇은 막으로서, 사물의 광학적 정보를 전기적 신호로 변환하여 시각신경을 통해 뇌의 중추 시각영역으로 영상을 전달하는 일차 시각정보기관의 역할을 한다. 망막에는 1억 개가 넘는 빛감지세포(광수용체세포, light-sensitive photoreceptor cells)와 1백만 개가 넘는 시각신경세포인 신경절세포(ganglion cells), 그리고 이들을 연결하는 신경세포로 이루어져 있다. 황반은 망막의 중심부에 위치한 신경조직으로 시세포의 대부분이 이곳에 모여 있으며, 물체의 상이 맺히는 곳으로 중심시력을 담당한다. 황반부(macula lutea)는 원뿔세포로 구성된 광수용체세포층과 신경절세포층으로 이루어져 있어 망막의 두께가 얇으며, 밝은 빛 상태에서 영상의 전기적 신호가 화학적 신호로 전환되어 신경절세포의 축삭인 시각신경(optic nerve)을 타고 뇌로 전달되고, 황반부 이외의 망막은 주변부를 알아보고 어두울 때 주 역할을 담당한다. 따라서 노화 또는 외부적인 요인으로 망막 또는 황반에 이상이 발생되면 시력과 시야에 문제가 생기는 시각장애와 함께 실명에 이를 수 있다. 망막 또는 황반 질환에는 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기 등이 있다.
TAFA 단백질군은 뇌 영역 전반에 걸쳐 풍부하게 발현되는 단백질군으로 TAFA1 내지 5까지의 5가지 단백질로 이루어져 있다. 이들 단백질은 구조적으로 보존된 시스테인 잔기를 함유하고 있으며, 시스테인 사이의 C, CC, CXC 모티프는 케모카인과 관련이 있다. TAFA1 내지 4는 시스테인의 개수와 시스테인 사이 공간의 유사도가 높으며, TAFA5는 이들보다 적은 시스테인을 갖는다.
이들 단백질들은 척추동물 내에서 진화적으로 매우 잘 보존되어 있고 중추신경계의 정상적 기능에 중요하다고 밝혀졌다. TAFA1을 knockout한 마우스의 경우 몸무게의 감소와 불안행동의 감소, 두려움에 대한 기억의 장애 등이 보고되었다 (Lei X, Liu L, Terrillion CE, et al. FASEB J. 2019;33(12):14734-14747. 및 Yong HJ, Ha N, Cho EB, et al. Sci Rep. 2020;10(1):3969.). 반대로 TAFA2와 TAFA3를 knockout했을 경우 불안행동의 증가가 보고되었다 (Choi JH, Jeong YM, Kim S, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;115(5):E1041-E1050. 및 Kim S, Lee B, Choi JH, Kim JH, Kim CH, Shin HS. Sci Rep. 2017;7(1):16503.). TAFA4-null 마우스의 경우 이질통과 통각과민이 나타남이 보고되었다(Delfini MC, Mantilleri A, Gaillard S, et al. Cell Rep. 2013;5(2):378-388.). TAFA5를 knockout한 마우스에서는 우울행동의 증가와 공간 기억능력의 상실과 같은 행동의 변화가 보고되었다 (Huang S, Zheng C, Xie G, et al. FAM19A5/TAFA5, a novel neurokine, plays a crucial role in depressive-like and spatial memory-related behaviors in mice. Mol Psychiatry. 2021;26(6):2363-2379.)
이들 단백질이 중추 신경계에서 하는 역할이 중요함에도 불구하고 각각의 단백질이 갖는 기능과 병태생리학적 혹은 치료제로서의 기능에 대해 알려진 것은 매우 제한적이며 또한 중추 신경계 이외에서의 역할에 대해서 밝혀진 것도 제한적이다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명은 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포의 치료적 용도(for use in therapy)를 제공한다.
본 발명은 또한 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료 방법에 사용하기 위한 상기 AAV 벡터 또는 상기 재조합 바이러스 입자의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 필요로 하는 대상에서 망막 또는 황반 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 일반식 1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 것이다:
<일반식 1>
X1-X2-X3-G-T-C-E-V-X4-A-X5-H-X6-C-C-N-X7-N-X8-I-E-E-X9-S-Q-T-X10-X11-C-S-C-X12-X13-G-X14-V-A-G-T-T-X15-X16-X17-P-S-C-V-X18-A-X19-I-V-X20-X21-X22-W-W-C-X23-M-X24-P-C-X25-X26-G-E-X27-C-K-X28-L-P-D-X29-X30-G-W-X31-C-X32-X33-G-X34-K-X35-K-T-T-X36-X37-X38-X39
상기 일반식 1에서,
X1은 존재하지 않거나, V, I 또는 L이고,
X2는 K, E, R 또는 Q이고,
X3은 G, T, Q, P 또는 A이고,
X4는 V 또는 I이고,
X5는 A, L, V 또는 I이고,
X6은 R 또는 L이고,
X7은 K, R 또는 Q이고,
X8은 R 또는 K이고,
X9는 R 또는 L이고,
X10은 V 또는 G이고,
X11은 K 또는 N이고,
X12는 F 또는 L이고,
X13은 P 또는 S이고,
X14는 Q 또는 K이고,
X15는 R, H 또는 Q이고,
X16은 A, N, S 또는 T이고,
X17은 A, Q, R, K 또는 T이고,
X18은 D 또는 E이고,
X19는 S 또는 A이고,
X20은 I, E, L, A 또는 V이고,
X21은 Q, G 또는 E이고,
X22는 K 또는 R이고,
X23은 H, Q 또는 E이고,
X24는 E, Q, N, D, S 또는 H이고,
X25는 L, V 또는 M이고,
X26은 E, D, P, L 또는 A이고,
X27은 E 또는 D이고,
X28은 V, T, A 또는 I이고,
X29는 L, N, R, Y, S 또는 Q이고,
X30은 S, K 또는 T이고,
X31은 S 또는 M이고,
X32는 S, A 또는 Y이고,
X33은 S, T 또는 R이고,
X34는 N 또는 H이고,
X35는 V 또는 I이고,
X36은 R 또는 K이고,
X37은 존재하지 않거나 V, A, G, M 또는 N이고,
X38은 존재하지 않거나 T, I, N, F 또는 S이고, 및
X39는 존재하지 않거나 R, H, V, K, I 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 2의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 2>
X1-X2-H-H-K-A-X3-H
상기 일반식 2에서,
X1은 A 또는 V이고,
X2는 N 또는 I이고, 및
X3은 H 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식2-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 3의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 3>
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
상기 일반식 3에서,
X1은 A 또는 S이고,
X2는 L, T 또는 S이고,
X3은 Q, E 또는 H이고,
X4는 존재하지 않거나, P, L 또는 H이고,
X5는 P 또는 R이고,
X6은 T, S 또는 I이고,
X7은 A, P, T, S 또는 H이고,
X8은 T, A, S 또는 I이고,
X9는 V 또는 A이고, 및
X10은 L 또는 H이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식3-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 4의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 4>
X1-X2
상기 일반식 4에서,
X1은 H 또는 Y이고, 및
X2는 Q, V 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식4-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
LHRP(서열번호 293);
LHQSGFTSGHFPHHRKLGE(서열번호 294); 또는
LAPPGTNIQI(서열번호 295).
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 5의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다.
<일반식 5>
X1-X2-X3
상기 일반식 5에서,
X1은 P 또는 G이고,
X2는 R 또는 H이고, 및
X3는 T, S 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다.
PYTSL(서열번호 296); 또는
QEDKLK(서열번호 297).
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 LHRP-일반식1, LHQSGFTSGHFPHHRKLGE-일반식1 또는 LAPPGTNIQI-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식1-일반식5, 일반식1-PYTSL 또는 일반식1-QEDKLK의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 LHRP-일반식1-일반식5, LHQSGFTSGHFPHHRKLGE-일반식1-일반식5, LAPPGTNIQI-일반식1-QEDKLK 또는 LAPPGTNIQI-일반식1-PYTSL의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 75 내지 129에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 184 내지 238에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 130 내지 183에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 239 내지 292에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 신호 서열을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 상기 벡터는 바이러스성 벡터이다. 일부 양태에서, 상기 바이러스는 아데노-연관 바이러스(AAV)이다. 일부 양태에서, 상기 AAV는 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh10인 것이다.
일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반의 전체 또는 일부의 손상에 기인한 것이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환인 것이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반의 광수용체 세포(photoreceptor cells) 및/또는 망막색소상피(RPE) 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반병증, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리, 유전성 망막질환 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성, Best 황반 이영양증, Sorsby 안저 이영양증, Mallatia Leventinese, Doyne 벌집 모양 망막 이영양증, 스타르가르트(Stargardt 병(Stargardt 황반 이영양증), 근시성 황반변성 또는 색소 상피 박리 관련 황반변성이다. 일부 양태에서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성이다. 일부 양태에서, 연령-관련 황반변성은 습성 또는 건성 연령-관련 황반변성이다. 일부 양태에서, 상기 망막병증은 망막 이영양증이다. 일부 양태에서, 상기 망막병증은 당뇨병성 망막병증이다. 일부 양태에서, 상기 당뇨병성 망막병증은 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 당뇨병성 황반병증, 당뇨병성 황반부종 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 유전성 망막 질환이다. 일부 양태에서, 상기 유전성 망막 질환은 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa, RP), 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital Amaurosis), 스타르가르트병(Stargardt's disease), 코츠망막병증(Coats retinopathy), 원추세포 이상증(Cone dystrophy), 범맥락막위축(Choroideremia), 어셔 증후근(Usher syndrome), 베스트 질환(Best's Disease), X-연관 망막층간분리증(X-linked Retinoschisis) 또는 상세불명의 유전자 이상으로 인한 망막 이상증(Unspecified hereditary retinal dystrophy)이다.
본 발명은 또한 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다.
일부 양태에서, 상기 벡터는 프로모터 서열, 인핸서 서열, 엑손 서열, 인트론 서열, 신호 서열 코딩 서열, 스플라이싱 공여체 서열 및 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 역전된 말단 반복(ITR) 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 서열을 더 포함한다.
일부 양태에서, 상기 인트론은 51개 내지 117개의 뉴클레오타이드로 구성되며, 서열번호 57에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인트론은 (i) 서열번호 1의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 58), (ii) 서열번호 1의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 59), (iii) 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 3), (iv) 서열번호 1의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 61), (v) 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 2), (vi) 서열번호 1의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 63), (vii) 서열번호 1의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 64), 또는 (viii) 서열번호 1의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 65)와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 인트론은 (i) 서열번호 1의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 58), (ii) 서열번호 1의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 59), (iii) 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 3), (iv) 서열번호 1의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 61), (v) 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 2), (vi) 서열번호 1의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 63), (vii) 서열번호 1의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 64), 또는 (viii) 서열번호 1의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 65)를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 벡터는 하기의 구성을 포함한다: (1) 서열번호 4에 나타낸 CMV 인핸서 서열; (2) 서열번호 5 또는 6에 나타낸 CMV 프로모터 서열, 서열번호 7에 나타낸 EF-1α 프로모터 서열 또는 서열번호 8에 나타낸 치킨 β액틴 프로모터 서열로부터 선택되는 프로모터 서열; (3) 서열번호 12에 나타낸 CMV E1 서열, 서열번호 13에 나타낸 EF-1α E1 서열 또는 서열번호 14 또는 15에 나타낸 치킨 β액틴 E1 서열로부터 선택되는 엑손 1(E1) 서열; (4) 서열번호 9 또는 10에 나타낸 스플라이싱 공여체 서열; 및/또는 (5) 서열번호 11에 나타낸 EF-1α E2 서열.
일부 양태에서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)은 하기의 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이다:
<일반식 1>
X1-X2-X3-G-T-C-E-V-X4-A-X5-H-X6-C-C-N-X7-N-X8-I-E-E-X9-S-Q-T-X10-X11-C-S-C-X12-X13-G-X14-V-A-G-T-T-X15-X16-X17-P-S-C-V-X18-A-X19-I-V-X20-X21-X22-W-W-C-X23-M-X24-P-C-X25-X26-G-E-X27-C-K-X28-L-P-D-X29-X30-G-W-X31-C-X32-X33-G-X34-K-X35-K-T-T-X36-X37-X38-X39
상기 일반식 1에서,
X1은 존재하지 않거나, V, I 또는 L이고,
X2는 K, E, R 또는 Q이고,
X3은 G, T, Q, P 또는 A이고,
X4는 V 또는 I이고,
X5는 A, L, V 또는 I이고,
X6은 R 또는 L이고,
X7은 K, R 또는 Q이고,
X8은 R 또는 K이고,
X9는 R 또는 L이고,
X10은 V 또는 G이고,
X11은 K 또는 N이고,
X12는 F 또는 L이고,
X13은 P 또는 S이고,
X14는 Q 또는 K이고,
X15는 R, H 또는 Q이고,
X16은 A, N, S 또는 T이고,
X17은 A, Q, R, K 또는 T이고,
X18은 D 또는 E이고,
X19는 S 또는 A이고,
X20은 I, E, L, A 또는 V이고,
X21은 Q, G 또는 E이고,
X22는 K 또는 R이고,
X23은 H, Q 또는 E이고,
X24는 E, Q, N, D, S 또는 H이고,
X25는 L, V 또는 M이고,
X26은 E, D, P, L 또는 A이고,
X27은 E 또는 D이고,
X28은 V, T, A 또는 I이고,
X29는 L, N, R, Y, S 또는 Q이고,
X30은 S, K 또는 T이고,
X31은 S 또는 M이고,
X32는 S, A 또는 Y이고,
X33은 S, T 또는 R이고,
X34는 N 또는 H이고,
X35는 V 또는 I이고,
X36은 R 또는 K이고,
X37은 존재하지 않거나 V, A, G, M 또는 N이고,
X38은 존재하지 않거나 T, I, N, F 또는 S이고, 및
X39는 존재하지 않거나 R, H, V, K, I 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 80 내지 130개, 보다 바람직하게는 90 내지 120개, 가장 바람직하게는 91 내지 119개의 아미노산 서열로 구성된 것이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 2의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 2>
X1-X2-H-H-K-A-X3-H
상기 일반식 2에서,
X1은 A 또는 V이고,
X2는 N 또는 I이고, 및
X3은 H 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 3의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 3>
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
상기 일반식 3에서,
X1은 A 또는 S이고,
X2는 L, T 또는 S이고,
X3은 Q, E 또는 H이고,
X4는 존재하지 않거나, P, L 또는 H이고,
X5는 P 또는 R이고,
X6은 T, S 또는 H이고,
X7은 A, P, T, S 또는 I이고,
X8은 T, A, S 또는 I이고,
X9는 V 또는 A이고, 및
X10은 L 또는 H이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 4의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 4>
X1-X2
상기 일반식 4에서,
X1은 H 또는 Y이고, 및
X2는 Q, V 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
LHRP(서열번호 293);
LHQSGFTSGHFPHHRKLGE(서열번호 294); 또는
LAPPGTNIQI(서열번호 295).
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 5의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 5>
X1-X2-X3
상기 일반식 5에서,
X1은 P 또는 G이고,
X2는 R 또는 H이고, 및
X3는 T, S 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다.
PYTSL(서열번호 296); 또는
QEDKLK(서열번호 297).
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 75 내지 129에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 184 내지 238에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 130 내지 183에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 239 내지 292에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것이다.
일부 양태에서, 상기 AAV 벡터는 유전자 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서 상기 AAV 벡터는 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 상기 AAV 벡터를 포함하는 단리된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 AAV 벡터로 형질전환된 단리된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 AAV 벡터 또는 상기 AAV 벡터를 포함하거나 상기 AAV 벡터로 형질전환된 숙주세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료용인 것이다.
본 발명은 또한 상기 AAV 벡터 또는 상기 AAV 벡터를 포함하거나 상기 AAV 벡터로 형질전환된 숙주세포를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 키트는 사용설명서를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 상기 i) AAV 벡터, 및 ii) rep 및 cap 유전자를 함유한 구축물로 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 생산된 재조합 바이러스 입자를 분리하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생산된 재조합 바이러스 입자를 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 캡시드 단백질 및 (b) 상기 AAV 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 AAV 벡터 또는 상기 재조합 바이러스 입자의 치료적 용도(for use in therapy)를 제공한다.
본 발명은 또한 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 상기 AAV 벡터 또는 상기 재조합 바이러스 입자의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 필요로 하는 대상에서 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 AAV 벡터 또는 상기 재조합 바이러스 입자를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 망막 또는 황반 질환을 포함하는 것이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반의 전체 또는 일부의 손상에 기인한 것이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환인 것이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반의 광수용체 세포(photoreceptor cells) 및/또는 망막색소상피(RPE) 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반병증, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기, 망막부종, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리, 유전성 망막질환 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 추가 치료제를 상기 대상에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 망막 또는 황반 질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용하기 위한, 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시 내용은 망막 또는 황반 질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용하기 위한, 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(예를 들어, 척추동물의 TAFA1 내지 TAFA4 서열)을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시 내용은 또한, 상기 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 본 개시 내용은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; AAV 벡터를 포함하거나 상기 AAV 벡터로 형질전환된 숙주세포; AAV 벡터 또는 상기 AAV 벡터를 포함하거나 상기 AAV 벡터로 형질전환된 숙주세포를 포함하는 조성물 또는 키트; 상기 AAV 벡터, 및 rep 및 cap 유전자를 함유한 구축물로 세포를 형질도입하는 것을 포함하는 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법; 상기 방법에 의해 생산된 재조합 바이러스 입자: 상기 AAV 벡터 또는 상기 재조합 바이러스 입자를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상에서 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 출원인은 다양한 종의 TAFA 유전자들의 발현(인간의 TAFA1, 인간의 TAFA2, 인간의 TAFA3, 인간의 TAFA4, 마우스 TAFA4, zebrafish의 TAFA4, gecko TAFA4)이 손상된 망막을 우수한 능력으로 회복 또는 손상으로부터 보호한다는 것을 확인하였으며, 상기 효과에 핵심적인 역할을 갖는 고도로 보존된 인간의 TAFA4 성숙 단백질의 서열 (서열번호 75)을 도출하였다. 본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 손상된 망막을 정상과 대등한 수준으로 회복시킨다. 본 개시 내용의 추가 양태들은 본 출원 전체에 걸쳐 제공되어 있다.
본 명세서에 개시된 개시 내용의 이해를 용이하게 하기 위해서 다수의 용어 및 문구를 정의하기로 한다. 추가 정의들은 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
I. 정의
본 개시 내용 전반에 걸쳐, 용어 "한" 또는 "어떤" 실체는 그 실체의 하나 이상을 말하는 것으로; 예를 들어, "한 폴리펩타이드"는 하나 이상의 폴리펩타이드를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "한"(또는 "어떤"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본 명세서에서 혼용될 수 있다.
또한 본 명세서에서 사용하는 "및/또는"은 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각을 나머지 다른 특징 또는 구성요소와 함께 또는 단독으로 구체적인 개시로서 간주되어야 한다. 이에 따라 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용하는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용하는 용어 "및/또는"은 다음과 같은 양태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
하나의 숫자 또는 일련의 숫자 앞에 있는 용어 "적어도"는 용어 "적어도" 다음에 오는 숫자 및 문맥상 명백하게 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 숫자 또는 정수들을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자 내 뉴클레오타이드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들어, "21개 뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 18개 뉴클레오타이드"는 18개, 19개, 20개 또는 21개 뉴클레오타이드가 소정의 특성을 가진다는 것을 의미한다. 일련의 숫자 또는 범위 앞에 "적어도"가 있으면 "적어도"가 상기 일련의 또는 범위의 숫자 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다. "적어도"는 또한 정수로 국한되지 않는다(예를 들어 "적어도 5%"는 유효 숫자의 개수를 고려하는 것 없이 5.0%, 5.1%, 5.18%를 포함한다).
본 명세서에서 양태들을 용어 "포함하는"으로 기재하면 "이루어지는" 및/또는 "필수적으로 이루어지는"의 관점으로 기재된 다른 유사한 양태 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용하는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시 내용과 관련된 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed, 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 당업자에게 본 개시 내용에서 사용되고 있는 용어들 중 다수의 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 이들의 Systeme International de Unites(SI)에서 인정한 형태로 표시된다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측으로부터 우측으로 쓰여진다. 본 명세서에서 제공된 표제는 개시 내용의 다양한 양태들의 제한이 아니며 이들은 전체적으로 명세서를 참조한 것일 수 있다. 따라서 바로 아래에 정의된 용어들은 명세서를 전체적으로 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
본 명세서에서 용어 "약"은 거의, 대략, 가량 또는 그의 영역 내를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우에 기재되어 있는 수치의 위와 아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 명시된 값의 위와 아래의 수치를 예를 들어 위 또는 아래(더 높거나 더 낮은) 10%의 변화량만큼 변경할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "아데노-연관 바이러스"(AAV)는 단일사슬 DNA 바이러스로서 헬퍼 구축물 의존적 사람 파보바이러스(Helper-dependent human parvovirus)이다. 게놈크기는 약 4.6 kbp이며, 게놈의 N-말단 부분은 바이러스 복제와 바이러스 유전자의 발현에 관여하는 rep 유전자를 코딩하고, C-말단 부분은 바이러스의 캡시드(capsid) 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 코딩하고 있으며, 양 말단부위에 약 145 염기가 삽입된 반복영역(ITR)으로 구성되어 있다. T자 모양의 구조를 가진 145 bp 크기의 ITRs(역반복말단, inverted terminal repeats)의 기능은 바이러스 유전체 복제시 복제원점의 기능을 하고, 1차적인 패키징 신호로 작용한다. ITR은 재조합 AAV 구축물을 만들 때 유일하게 필요한 cis-acting 염기서열이고, Rep 단백질 존재 하에서는 인핸서 활성을 갖지만, Rep 단백질이 없을 때에는 매우 약한 활성을 가지므로, 재조합 AAV 구축물에 외래 유전자를 클로닝할 때 이를 고려하여 인핸서, 프로모터, pA 등을 적절히 구성하여 발현 구축물을 제작한다(RJ Samulski and N Muzyczka, Annu. Rev. Virolo. 2014. 1:427-451). rep 유전자로부터는 4개의 단백질이 번역되는데, 이들은 그 분자량에 따라 rep78, rep68, rep52, rep40으로 구분되며, AAV DNA복제에 중요한 기능을 수행한다. cap 유전자로부터는 4개의 단백질이 번역되는데, 이중, VP1, VP2, VP3 단백질은 AAV 입자를 구성하는 구조단백질들이며, 조립-활성화 단백질 (AAP, assembly-activating protein)은 상기 구조단백질들에 의한 AAV 입자의 형성(assembly)을 촉진한다. 상기 아데노-연관 바이러스가 효율적으로 복제되기 위해서는 아데노바이러스 혹은 헤르페스 심플렉스 바이러스 같은 헬퍼바이러스(helper virus)에서 유래한 일부 단백질들 및 RNA들을 필요로 한다 (Muzyczka N. Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129, 1992).
AAV는 AAV 1형, AAV 2형, AAV 3형(3A형 및 3B형 포함), AAV 4형, AAV 5형, AAV 6형, AAV 7형, AAV 8형, AAV 9형, AAV 10형, AAV 11형, AAV 12형, AAV 13형, AAVrh.74, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, Gao 등(J. Virol. 78:6381 (2004)) 및 Moris 등(Virol. 33:375 (2004))이 개시하고 있는 AAV 혈청형 및 계통 분기 및 그 외 현재 알려져 있거나 이후 발견된 다른 AAV를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, FIELDS 등. VIROLOGY, volume 2, chaptor 69(4th ed., Lippincott-Raven Publishers)를 참조할 것. 일부 양태에서, "AAV"는 공지된 AAV의 파생물들을 포함한다. 일부 양태에서, "AAV"는 변형 또는 인공 AAV를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "투여", "투여하는" 및 이들의 문법적 변형 형태들은 약제학적으로 허용되는 경로를 통해 대상에 조성물(예를 들어 본 명세서에 기재된 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드)을 도입하는 것을 지칭한다. 조성물은 종양내, 경구, 폐내, 비강내, 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 척추강내, 안구 주위(periocular), 안내 또는 국소 투여를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 대상에 도입된다. 투여는 자가 투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다. 조성물 또는 제제는 적합한 투여 경로를 통해 그의 의도된 기능을 발휘한다. 예를 들어 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 제제를 대상의 정맥에 도입함으로써 투여된다.
본 명세서에서 용어 "안내"는 눈 조직 내부 또는 하부를 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "안내 투여"는 조성물을 눈의 테논낭하(sub-Tenon), 결막하, 맥락막상(suprachoroidal), 망막하(subretinal), 유리체내 및 유사 위치에 전달할 수 있는 임의의 투여를 지칭한다. 몇몇 측면에 있어서, 안내 투여는 맥락막상(suprachoroidal), 망막하(subretinal), 유리체내 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 "CEE" 구축물은 CMV 인핸서, EF-1α 프로모터 및 EF-1α 인트론 단편을 포함한다. "CE" 구축물은 CMV 인핸서 및 EF-1α 프로모터를 포함하지만 인트론 단편을 포함하지는 않는다(예를 들어 EF-1α 인트론 단편을 포함하지 않음). "CAE" 구축물은 CMV 인핸서, 치킨 β액틴 프로모터 및 EF-1α 인트론 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 "CAG" 구축물은 CMV 인핸서, 치킨 β액틴 프로모터 및 치킨 β액틴/토끼 β글로빈 하이브리드 인트론 단편을 포함한다. "CA" 구축물은 CMV 인핸서 및 치킨 β액틴 프로모터를 포함하지만 인트론 단편을 포함하지는 않는다(예를 들어 EF-1α 인트론 단편을 포함하지 않음). 도 4a, 5a 및 5c를 참조할 것.
본 명세서에서 사용하는 용어 "보존된"은 비교할 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변하지 않고 나타나는 것들인 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 지칭한다. 상대적으로 보존되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 서열 내 다른 위치에서 나타나는 뉴클레오타이드 또는 아미노산보다 더 관련이 있는 서열 중에서 보존되는 것들이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “아미노산”은 자연적으로 펩타이드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들(아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H), 글루탐산(E), 아스파르트산(D), 글루타민(Q), 아스파라긴(N), 류신(L), 이소류신(I), 발린(V), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 티로신(Y), 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 프롤린(P), 시스테인(C) 등)뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 또한, 상기 펩타이드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 번역 후 변형은 인산화(phosphorylation), 당화 (glycosylation), 아실화(acylation) (예를 들면, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예를 들면, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예를 들면, 이황화물 브릿지의 형성)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펩타이드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩타이드 일 수 있다. 한편, 상기 펩타이드는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수도 있다. 인공 변이체뿐만 아니라 야생형 폴리펩타이드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 보존성 치환은 염기성 아미노산(아르기닌(R), 리신(K) 및 히스티딘(H)), 산성 아미노산(글루탐산(E) 및 아스파르트산(D)), 극성 아미노산(글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)), 소수성 아미노산(류신(L), 이소류신(I), 발린(V) 및 메티오닌(M)), 방향족 아미노산 (페닐알라닌(F), 트립토판(W) 및 티로신(Y)) 및 작은 아미노산(글리신(G), 알라닌(A), 세린(S) 및 트레오닌(T))을 포함할 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 기술분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 100% 동일한 경우에는 "완전히 보존된" 또는 "동일한" 것이라고 말한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일 또는 적어도 95% 동일한 경우에는 "고도로 보존된" 것이라고 말한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 경우에 "고도로 보존된" 것이라고 말한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 30% 동일, 적어도 40% 동일, 적어도 50% 동일, 적어도 60% 동일, 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일 또는 적어도 90% 동일 또는 적어도 95% 동일한 경우에 "보존된" 것이라고 말한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 30% 동일, 약 40% 동일, 약 50% 동일, 약 60% 동일, 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일 또는 약 99% 동일한 경우에 "보존된" 것이라고 말한다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 적용되거나 그의 일부, 영역 또는 특징부에 적용될 수 있다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 규칙에 의해 서로 연관되는 2개 이상의 올리고머(즉, 각각 핵염기 서열을 포함) 또는 올리고머와 타겟 유전자 사이를 지칭한다. 예를 들어 핵염기 서열 "T-G-A(5'→는 핵염기 서열 "A-C-T(3'→에 상보적이다. 염기쌍 규칙에 따라 소정의 핵염기 서열의 모든 핵염기보다 적은 수가 다른 핵염기 서열과 일치하면, 상보성은 "부분적"인 것일 수 있다. 예를 들어 일부 양태에서, 소정의 핵염기 서열 및 다른 핵염기 서열 사이의 상보성은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%일 수 있다. 따라서 특정 양태에서, 용어 "상보적"은 타겟 핵산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 일치 또는 상보성을 지칭한다. 또는 예시를 계속하기 위해서 소정의 핵염기 서열 및 다른 핵염기 서열 간 "완전한" 또는 "완벽한"(100%) 상보성이 있을 수 있다. 일부 양태에서, 핵염기 서열 간의 상보성 정도는 서열 간 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
본 명세서에서 사용하는 표현 "연속 또는 비연속 뉴클레오타이드가 결실된다"는 야생형(또는 원래의) 서열에 비해 결실의 결과로서 남아있는 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 의도하지만, 임의의 결실 과정을 포함하는 것을 의도하는 것은 아니다. 상기 용어는 "연속 뉴클레오타이드의 결실", "결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실" 및 "결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입"을 포함할 수 있다. 예를 들어 뉴클레오타이드 서열 "A-T-G-C-C-G-T-C"의 경우에, 연속 뉴클레오타이드의 결실은 "A-_-_-_-C-G-T-C"와 같이 하나 이상의 연속 뉴클레오타이드의 결실을 포함하고, 비연속 뉴클레오타이드의 결실은 "A-_-G-_-C-G-T-_"와 같이 하나 이상의 뉴클레오타이드가 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 것을 의미하며, 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입은 "A-A-G-_-C-G-T-G"와 같이 원래의 뉴클레오타이드와 서로 다른 하나 이상의 뉴클레오타이드가 결실된 뉴클레오타이드의 위치에 삽입되는 것을 의미한다.
용어 "하류(downstream)"는 기준 뉴클레오타이드 서열에 대해 3'에 위치해 있는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 특정 양태에서, 하류 뉴클레오타이드 서열은 전사의 시작점 이후의 서열과 관련이 있다. 예를 들어 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 시작 부위의 하류에 위치해 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "인핸서"는 증강된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부의 경우에 또 다른 조절 서열에 대한 그의 배향과 무관하게 작용할 수 있는 DNA의 부분을 지칭한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협력하여 또는 추가로 작용할 수 있다.
용어 "부형제" 및 "담체"는 호환적으로 사용되며, 약제학적 조성물에 첨가되어 복합체(compound), 예를 들어 본 명세서에 기재된 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 투여를 더욱 용이하게 하는 불활성 물질을 지칭한다.
용어 "엑손"은 단백질을 코딩하는 핵산의 소정 부분 또는 전처리된(또는 전구체) RNA의 어느 부분을 스플라이싱에 의해 제거한 후 RNA 분자의 성숙한 형태에서 나타나는 핵산 서열을 지칭한다. 상기 성숙한 RNA 분자는 메신저 RNA(mRNA)이거나 또는 rRNA 또는 tRNA와 같은 비코딩 RNA의 기능적 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생성하는 과정을 지칭한다. 이는 폴리뉴클레오타이드를 메신저 RNA(mRNA)로 전사하고 mRNA를 폴리펩타이드로 번역하는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 발현은 "유전자 산물"을 생성한다. 본 명세서에서 사용하는 유전자 산물은 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생성된 RNA와 같은 핵산일 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 유전자 산물은 전사체로부터 번역되는 핵산 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자 산물은 전사후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱에 의한 핵산 또는 번역후 변형, 예를 들어 인산화, 메틸화, 글리코실화, 지질 추가, 다른 단백질 소단위체와의 회합 또는 단백질 가수분해 절단에 의한 폴리펩타이드를 더 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "동일성"은 폴리머 분자들, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 분자들 사이에서 전체 모노머 보존을 지칭한다. 어떠한 추가 수식어도 사용하지 않은 용어 "동일한", 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 A는 폴리뉴클레오타이드 B와 동일하다는 것은 폴리뉴클레오타이드 서열이 100% 동일(100%의 서열 동일성)하다는 것을 의미한다. 2개의 서열이 예를 들어 "70% 동일"이라고 기재하는 것은 이들을 예를 들어 "70%의 서열 동일성"을 갖는 것으로 기재하는 것과 같다.
예를 들어 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 동일성(퍼센트) 계산은 최적의 비교 목적을 위해 상기 2개의 서열을 정렬시켜 수행할 수 있다(예를 들어 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 2개 모두에 갭(gap)을 도입할 수 있고 비교 목적으로 동일하지 않은 서열은 무시할 수 있다). 특정 양태에서, 비교 목적으로 정렬한 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다. 이후, 대응하는 아미노산 위치의 아미노산을 또는 폴리뉴클레오타이드의 경우에는 염기를 비교한다.
제1 서열 내 특정 위치를 제2 서열 내 해당 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드가 차지하는 경우, 상기 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간 동일성(퍼센트)은 상기 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입할 필요가 있는 갭의 수 및 상기 갭 각각의 길이를 고려하여 상기 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열 비교 및 2개의 서열 간 동일성(퍼센트)의 결정은 수학 알고리즘을 이용하여 이루어질 수 있다.
서로 다른 서열(예를 들어 폴리뉴클레오타이드 서열)을 정렬하기 위해 사용할 수 있는 적합한 소프트웨어 프로그램은 여러 공급처로부터 입수 가능하다. 서열 동일성(퍼센트)을 결정하기 위해 적합한 하나의 프로그램은 미국정부의 국립생명공학정보센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수할 수 있는 BLAST 프로그램 제품군의 일부인 bl2seq이다. bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 2개의 서열 간 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하기 위해 사용되는 반면에, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하기 위해 사용된다. 다른 적합한 프로그램으로는 예를 들어 생물정보학 프로그램 EMBOSS 제품군의 일부이고 또한 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 생물정보학 연구소(EBI)로부터 입수할 수 있는 Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher가 있다.
서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같이 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 기준 서열과 정렬해 있는 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 타겟 서열 내 서로 다른 영역은 각각 이들 자체의 서열 동일성(퍼센트)을 가질 수 있다. 서열 동일성(퍼센트) 값은 가장 가까운 소수점 첫째자리로 반올림/반내림한다는 점에 유의한다. 예를 들어 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 반내림하고 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 반올림한다. 또한 길이 값은 항상 정수일 것이라는 점에 유의한다.
특정 양태에서, 제1 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 제2 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 동일성(퍼센트, %ID)은 %ID = 100 × (Y/Z)로서 계산되는데, 여기서 Y는 상기 제1 및 제2 서열의 정렬에 있어서(육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬했을 때) 동일한 일치로서 점수화한 아미노산 잔기(또는 핵염기)의 수이고 Z는 상기 제2 서열 내 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 길면, 상기 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성(퍼센트)은 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성(퍼센트)보다 높을 것이다.
당업자라면 서열 동일성(퍼센트)을 계산하기 위한 서열 정렬의 생성이 1차 서열 데이터에 의해 전적으로 처리되는 이원(binary) 서열-서열 비교에 한정되지 않는다는 점을 이해할 것이다. 또한 서열 데이터를 구조 데이터(예를 들어 결정학적 단백질 구조), 기능 데이터(예를 들어 돌연변이의 위치) 또는 계통 발생 데이터와 같은 이종의 출처(heterogeneous sources)로부터의 데이터와 통합함으로써 서열 정렬이 이루어질 수 있음을 이해될 것이다. 이종의 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 이루게 하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용 가능하고 이와 달리 예를 들어 EBI로부터도 이용 가능한 T-Coffee이다. 또한 서열 동일성(퍼센트)을 계산하기 위해 사용되는 최종 정렬은 자동 또는 수동으로 체계화될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "인트론"은 유전자가 생산하는 단백질의 일부를 코딩하지 않고 세포핵으로부터 내보내기 전에 유전자로부터 전사되는 mRNA로부터 스플라이싱되는 유전자 내 DNA의 부분(개재 서열)을 지칭한다. "인트론 서열"은 인트론의 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 서열은 본 명세서에서 "비번역 핵산 서열"이라고도 한다. 이에 따라 인트론은 코딩 서열(엑손)과 함께 전사되지만 성숙 mRNA가 형성되는 동안 제거되는 DNA 서열의 영역들이다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "인트론 단편"은 전장 EF-1α 인트론 A 서열로부터 유래되는 단편(즉, 예를 들어 서열번호 제1서열에 나타낸 것과 같은 EF-1α의 제1 인트론)을 지칭한다. 상기 단편은 전장 EF-1α 인트론을 제외하는 의미이다. 일부 양태에서, 상기 "인트론 단편"은 EF-1α 인트론 A의 모든 뉴클레오타이드가 결여되어 있는 대응하는 구축물로 달성되는 발현 수준을 초과하는 발현 수준을 달성하는데 필요한 최소수의 뉴클레오타이드 또는 구성을 포함한다. 따라서 본 개시 내용의 인트론 단편(본 명세서에서는 "비번역 핵산 서열"이라고도 함)은 EF-1α 인트론의 단편을 포함하고 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 인트론 단편(즉, 비번역 핵산 서열)은 외래 유전자의 전사를 증가시켜 상기 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 인트론 단편은 비번역 조절 요소일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "단리된", "정제된", "추출된" 및 이들의 문법적 변형 형태들은 호환적으로 사용되며 하나 이상의 정제 과정을 거친 본 개시 내용의 원하는 조성물, 예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 제제의 상태를 지칭한다. 일부 양태에서, 본 명세서에서 사용하는 단리 또는 정제는 오염물을 함유한 샘플로부터 본 개시 내용의 조성물, 예를 들어 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 제거 또는 일부 제거(예를 들어 분획물)하는 과정이다.
일부 양태에서, 단리된 조성물은 검출 가능한 바람직하지 않은 활성을 갖지 않거나 또는 이와 달리 바람직하지 않은 활성의 수준 또는 양이 허용되는 수준 또는 양 이하이다. 다른 양태에서, 단리된 조성물은 허용되는 양 및/또는 농도 및/또는 활성 이상으로 본 개시 내용의 원하는 조성물의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 상기 단리된 조성물은 상기 조성물이 얻어지는 출발 물질에 비해 농축된 것이다. 이러한 농축은 출발 물질에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999%이거나 또는 99.9999%보다 클 수 있다.
일부 양태에서, 단리된 제제에는 실질적으로 잔류 생물학적 산물이 없다. 일부 양태에서, 상기 단리된 제제에는 임의의 생물학적 오염 물질이 100%, 적어도 약 99%, 적어도 약 98%, 적어도 약 97%, 적어도 약 96%, 적어도 약 95%, 적어도 약 95%, 적어도 약 94%, 적어도 약 93%, 적어도 약 92%, 적어도 약 91% 또는 적어도 약 90% 없다. 잔류 생물학적 산물은 비생물적(abiotic) 물질(화학물질 포함) 또는 원치 않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사산물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "연결된(linked)"은 제2 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 각각 공유 또는 비공유 결합된(joined) 제1 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 상기 제1 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 제2 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 직접 결합 또는 병치될 수 있거나, 이와 다르게 개재 서열이 상기 제1 서열을 제2 서열에 공유 결합시킬 수 있다. 용어 "연결된"은 5'-말단 또는 3'-말단에서 제2 폴리뉴클레오타이드 서열에 제1 폴리뉴클레오타이드 서열의 융합(fusion)을 의미할 뿐만 아니라 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 전체 서열(또는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열)을 제2 폴리뉴클레오타이드 서열(또는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열) 내 임의의 2개의 뉴클레오타이드에 각각 삽입하는 것을 포함한다. 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 상기 링커는 예를 들어 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "망막질환” 또는 “황반질환”은 안구의 망막 또는 황반의 일부 또는 영역에 영향을 주거나 이와 관련되는 질환, 질병 또는 증상을 지칭한다. 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반의 전체 또는 일부의 손상에 기인한 질환, 질병 또는 증상일 수 있다. 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생될 수 있다. 또한, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반의 광수용체 세포(photoreceptor cells) 및/또는 망막색소상피(RPE) 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생될 수 있다.
NaIO3(sodium iodate)는 망막의 외부 및 내부의 일부 또는 전체에 걸쳐 망막의 손상 및/또는 변성을 유도하며, 망막색소상피(RPE) 및 광수용체의 손상을 유도한다고 보고되어 있다(A.E.-H. Koh, et al. Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 196 (2019) 111514). 따라서, NaIO3 모델을 이용하면, 망막 또는 황반의 손상 (예를 들어, 광수용체 세포 및/또는 망막색소상피 세포의 기능 이상 또는 손상)을 원인으로 발생되는 질환의 예방 또는 치료 효과를 확인할 수 있다. 상기 광수용체 세포 및/또는 망막색소상피 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환의 예로는 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반병증, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기, 망막부종, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리, 유전성 망막질환 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "망막 색소 상피"(RPE)는 맥락막 혈액 공급(맥락막 모세혈관층)과 신경망막 사이의 척추동물의 눈의 뒤쪽에 위치한 상피 세포의 단일 단층을 지칭한다. RPE는 혈액-망막 장벽의 구성요소 중 하나로서 작용하고, RPE 세포는 시각 사이클 유지, 광수용체 외부 세그먼트 식균 작용 및 원위 망막과 맥락막모세혈관층 사이에서 영양소, 대사 폐기물, 이온 및 체액 수송에 있어 중요한 역할을 한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "망막병증"은 망막(즉, 각막과 수정체를 통과하는 상을 포착하는 눈 뒤쪽의 안쪽 표면을 감싸고 있는 조직) 또는 망막 세포의 질환 또는 손상을 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "당뇨병성 망막병증"(DR)은 당뇨병과 관련된 합병증에 의해 유발되는 망막병증을 지칭한다. 상기 질환의 중증도에 따라 DR은 무증상이거나 경미한 시력 문제를 초래하거나 실명으로 이어질 수 있다. DR은 미세혈관 망막 변화의 결과이다. 고혈당증-유도 벽내(intramural) 혈관 주위 세포의 사멸과 기저막의 비후는 혈관벽의 부전으로 이어질 수 있다. 이들 손상은 혈액-망막 장벽의 형성을 변화시키고 망막 혈관을 더 잘 투과할 수 있게 한다. 혈관 주위 세포의 사멸은 고혈당증이 단백질 키나아제 C-δ에 의해 코딩된 PKC-δ와 p38 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK)를 지속적으로 활성화하여 종전에 알려지지 않은 PKC-δ신호전달의 표적으로서 단백질 티로신 포스파타아제인 Src 상동-2 도메인-함유 포스파타아제-1(SHP-1)의 발현을 증가시킬 때 유발될 수 있다. 이 신호전달 캐스케이드는 PDGF 수용체-탈인산화 및 이 수용체로부터의 하위 신호전달(downstream signaling) 감소로 이어져 “혈관 주위 세포 사멸”이 일어날 수 있다. 눈에 있는 작은 혈관과 같은 작은 혈관은 특히 혈당에 대한 조절 불량에 취약할 수 있다. 포도당 및/또는 과당의 과다 축적은 망막에 있는 작은 혈관을 손상시킬 수 있다.
DR은 2개의 별도 단계로 분류될 수 있다(Wu L., el al., World J Diabetes 4(6): 290-294 (2013)). 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)이라고 하는 제1기는 조기 당뇨병성 망막병증과 관련이 있다. NPDR은 일반적으로 분명한 증상이 없거나 주변 조직으로 체액이 빠져나가는 혈관으로 인해 초래되는 경미한 시력 왜곡(vision distortion)과 관련이 있다. NPDR을 알아내는 유일한 방법은 미세동맥류(동맥벽에 혈액이 채워진 미세한 융기부)를 볼 수 있는 안저 쵤영에 의한 방법이다. 치료하지 않고 방치하면 DR 환자는 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR)이라고 하는 더욱 진행된 제2기로 진행될 수 있다. PDR은 파열과 출혈을 일으켜 시야를 흐려지게 할 수 있는 비정상적인 새로운 혈관 형성(즉, 혈관신생)을 특징으로 한다. PDR의 다른 증상으로는 시야에 떠다니는 반점이나 짙은 줄("비문증(floaters)"), 시력 변화, 색각 손상, 시야에 짙거나 빈 영역, 통증, 고르지 못한 시력과 완전한 시력 상실 등을 포함한다.
용어 "당뇨병성 망막병증"은 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 당뇨병성 황반병증 및 당뇨병성 황반부종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 유형의 당뇨병성 망막병증을 포함한다.
몇몇 측면에 있어서, PDR은 NPDR의 발병 후에 발생한다(예를 들어, 처음에 NPDR로 진단되고 질환이 PDR로 진행됨). 다른 측면에 있어서, PDR은 NPDR와 무관하게 발생한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "당뇨병성 망막병증"은 또한 원인에 관계없이 모든 유형의 당뇨병성 망막병증과 당뇨병성 망막병증의 임의 및 모든 증상들을 포함한다. 당뇨병성 망막병증에 대한 위험 인자의 비제한적인 예는 당뇨병 지속기간, 유전, 알코올 과다 섭취, 흡연, 고혈압, 비만, 이상지질혈증, 높은 콜레스테롤, 신장 질환, 임신 및 신장 손상이 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "황반병증"은 매우 민감하고 정확한 시력과 관련이 있는 망막의 중심 영역인 황반의 임의의 병리학적 증상을 의미한다. 몇몇 측면에 있어서, 용어 "황반병증" 및 "망막병증"은 호환하여 사용될 수 있다(즉, 황반의 영향만 받는 경우). 몇몇 측면에 있어서, 상기 황반병증은 당뇨병성 황반병증이다.
"당뇨병성 황반병증"은 황반이 당뇨병에 의해 초래된 망막 변화에 의한 영향을 받게 될 때 발생한다. 상기 용어는 2개의 구별되는 안질환인 당뇨병성 황반부종과 당뇨병성 허혈성 황반병증을 포함한다. 상기 두 유형의 황반병증은 종종 동반이환(comorbid)으로, 즉 황반부종이 있는 사람은 또한 종종 허혈성 황반병증을 갖고 있다. 허혈성 황반병증은 황반부종과 함께 발생하며 황반부종이 경증인 경우라도 발생할 수 있다. 몇몇 측면에 있어서, 당뇨병성 황반병증과 관련된 망막 변화는 대상의 망막 내에서 망막 전위의 감소, 혈관 주위 세포의 손실, 무세포성 모세혈관 형성, 혈관 울혈, 혈관 기능 장애, 혈관 누출, 혈관 폐색, 조직 종창(부종), 조직 허혈 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "무세포성 모세혈관"은 길이를 따라 어디에도 핵을 갖지 않은 모세혈관 크기의 혈관 튜브(vessel tube)를 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "혈관 울혈"은 혈관 손상의 한 유형을 지칭하는 것으로, 본 명세서에 개시된 다양한 안구 질환(예를 들어, 당뇨병성 황반부종)의 병인에 있어서 중요한 인자이다. 혈관 울혈은 혈관 조직 내 체액(예를 들어 혈관 내 혈액) 축적과 관련이 있다. 몇몇 측면에 있어서, 혈관 울혈은 고혈당증(즉, 고혈당)으로 인해 발생할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "망막 이영양증"(RD)은 유전적 또는 기타 다른 원인으로 발생된 망막병증을 지칭한다(망막의 퇴행성 장애).
본 명세서에서 사용하는 용어 "황반변성"은 망막의 중앙부(즉, 황반)가 변성되거나 기능적 활성을 상실한 임의의 수의 장애 및 병태를 지칭한다. 상기 변성 또는 기능적 활성의 상실은 예를 들어 세포사멸, 세포 증식 감소, 정상적인 생물학적 기능 상실 또는 이들의 조합의 결과로서 일어날 수 있다. 황반변성은 세포 및/또는 황반의 세포외 기질의 구조적 완전성 변화, 정상 세포 및/또는 세포외 기질 구성의 변화 및/또는 황반 세포의 기능 상실로 이어질 수 있고/또는 이들로서 발현될 수 있다. 상기 세포는 RPE 세포, 광수용체 및/또는 모세혈관 내피 세포를 포함한 황반 내 또는 근방에 정상적으로 존재하는 임의의 세포 유형일 수 있다. 연령-관련 황반변성은 황반변성 중 가장 흔하지만 용어 "황반변성"은 노인이 아닌 환자의 황반변성을 반드시 배제하는 것은 아니다. 황반변성의 비제한적인 예는: 연령-관련 황반변성(습성 또는 건성); 베스트(Best) 황반 이영양증, 소르스비(Sorsby) 안저 이영양증, 말라티아 레벤티네스(Malattia Leventinese), 도인(Doyne) 벌집 모양 망막 이영양증, 스타가르트병(Stargardt disease)(스타가르트 황반 이영양증, 청소년 황반변성 또는 노란점 안저(fundus flavimaculatus)라고도 함) 및 색소 상피 박리 관련 황반변성을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "연령-관련 황반변성"(AMD)은 일반적으로 노인에게 영향을 미치고 망막의 중앙부(즉, 황반) 손상으로 인한 중심시 상실과 관련된 망막병증을 의미한다. AMD는 일반적으로 황반(주로 망막 색소 상피(RPE)와 그 밑에 있는 맥락막 사이) 내 드루젠(아밀로이드 베타와 같은 세포외 단백질 및 지질의 축적)이라고 하는 황색을 띠는 불용성 세포외 침착물의 점진적인 축적 또는 응집을 특징으로 한다. 황반 내 이들 침착물의 축적 또는 응집은 황반을 점차 악화시켜 중심시 손상을 초래할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "황반"은 중앙의 고해상도 색각을 담당하는 망막의 중심부를 의미한다.
산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애 및 염증 과정을 포함한 몇몇 이론들이 제안되었지만 연령-관련 황반변성의 병인은 잘 알려져 있지 않다. 손상된 세포 성분의 생성과 분해 사이의 불균형은 예를 들어 세포내 리포푸신과 세포외 드루젠과 같은 유해 산물의 축적으로 이어진다. 초기 위축은 AMD의 초기 단계에서 지도 모양 위축에 선행하는 망막 색소 상피(RPE) 박층화 또는 탈색의 영역에 의해 구분된다. AMD의 진행 단계에서 RPE의 위축(지도 모양 위축) 및/또는 새로운 혈관의 발달(혈관신생)은 광수용체의 사멸과 중심시 상실을 초래한다. 건성(비삼출성) AMD에서 드루젠이라고 하는 세포 파편이 망막과 맥락막 사이에 축적되어 망막에 위축과 흉터가 생긴다. 더 중증인 습성(삼출성) AMD에서는 혈관이 망막 뒤의 맥락막에서 성장하여(혈관신생) 삼출물과 체액이 누액되고 출혈을 유발할 수도 있다.
존재하는 드루젠의 정도에 따라 AMD는 3개의 주요 단계로 분류될 수 있다: (i) 초기, (ii) 중기 및 (iii) 진행기 또는 후기. 초기 AMD는 여러 개의 작은(예를 들어 직경이 약 63 미크론 미만인) 드루젠 또는 몇 개의 중간 크기의(예를 들어 직경이 약 63 내지 124 미크론인) 드루젠이 존재하는 것을 특징으로 한다. 초기 단계 중에 환자는 시력 상실이 없으면서 분명한 증상이 없다. 중기는 많은 중간 크기의 드루젠 또는 하나 이상의 큰(예를 들어 직경이 약 125 미크론을 초과하는) 드루젠이 존재하는 것을 특징으로 한다. 이 단계 중에 몇몇 환자는 시야 중앙에 흐릿한 반점을 경험하기 시작할 수 있다. 진행기 또는 후기 AMD는 망막 조직의 넓은 면적의 손상으로 중앙의 사각 지대와 결국에는 중심시 상실을 일으키는 것을 특징으로 한다. 손상 유형(예를 들어 혈관신생의 유무)을 토대로 진행기 또는 후기 AMD는 다음과 같은 2개의 하위 유형으로 더 나눌 수 있다: (i) 지도 모양 위축(위축성 AMD라고도 함) 및 (ii) 습성 AMD(신생혈관성 또는 삼출성 AMD라고도 함).
AMD에는 2가지 주요 형태인 (i) 건성 AMD 및 (ii) 습성 AMD가 있다. 달리 특정하지 않는 한, 용어 "연령-관련 황반변성"은 건성 AMD 및 습성 AMD 모두를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "연령-관련 황반변성"은 또한 원인에 관계없이 모든 유형의 연령-관련 황반변성과 연령-관련 황반변성의 임의 및 모든 증상들을 포함한다. 황반변성(예를 들어 연령-관련 황반변성)과 관련한 증상의 비제한적인 예는: 중심시 상실, 왜곡, 조영제 감도 감소, 시야 흐림, 저조도 적응의 어려움, 갑작스런 발병 및 증상의 급속 악화 및 색각 감소를 포함한다. 일부 양태에서, 황반변성(예를 들어 연령-관련 황반변성)은 황반부종(즉, 황반 위 또는 아래에 체액과 단백질 침착물의 포집으로 인한 황반 종창)을 일으킬 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "건성 AMD"(위축성 연령-관련 황반변성 또는 비-삼출성 AMD라고도 함)는 습성(혈관신생성) AMD가 아닌 모든 형태의 AMD를 지칭한다. 이는 초기 및 중기 형태의 AMD뿐만 아니라 지도 모양 위축으로 알려진 진행기 형태의 건성 AMD를 포함한다. 건성 AMD 환자는 더 이른 초기에서 최소 증상을 갖는 경향이 있고; 시각 기능 상실은 증상이 지도 모양 위축으로 진행되는 경우에 더 자주 발생한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "습성 AMD"(혈관신생성 연령-관련 황반변성 또는 삼출성 AMD라고도 함)은 망막 혈관신생의 존재를 특징으로 하는 망막 증상을 지칭하는 것으로, 가장 진행된 형태의 AMD이다. 습성 AMD에서 혈관은 브루크막(Bruch's membrane)의 결함을 통해 맥락막 모세혈관 및 일부의 경우에는 하부의 망막 색소 상피(맥락막 신생혈관 형성 또는 혈관신생)로부터 성장한다. 이들 혈관으로부터 빠져나가는 장액성 또는 출혈성 삼출물의 조직화는 신경망막의 부수적 변성, 망막 색소 상피의 박리 및 파열, 유리체 출혈 및 중심시의 영구 손상과 함께 황반 부위의 섬유 혈관 흉터 생성을 일으킬 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "혈관신생"은 출혈을 유발하고 시력 상실을 일으킬 수 있는 눈의 서로 다른 부분에서 새로운 비정상적인 혈관의 성장을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "맥락막 혈관신생"은 맥락막(즉, 결합 조직을 포함하고 망막과 공막 사이에 있는 눈의 혈관층)에서 새로운 혈관의 비정상적인 성장을 지칭한다. 습성 AMD에서 새로운 혈관은 망막 색소 상피(RPE)와 맥락막을 통해 망막으로 성장할 수 있으며 혈액 및 지질 누출로 인해 시각 기능에 손상을 줄 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "망막 혈관신생"은 망막 상부 또는 내부, 예를 들어 망막 표면에서 혈관의 비정상적인 발달, 증식 및/또는 성장을 지칭한다. 망막 혈관신생은 망막 허혈과 관련된 망막병증(예를 들어 당뇨병성 망막병증, 겸상 적혈구 망막병증, 일스(Eales)병, 안허혈 증후군, 경동맥 해면 정맥동루(carotid cavernous fistula), 가족성 삼출성 유리체 망막병증, 과점도 증후군, 방사선 망막병증, 망막 정맥 폐색, 망막 동맥 폐색, 망막 색전증, 버드샷 망막맥락막증(birdshot retinochoroidopathy), 맥락막 흑색종, 만성 망막 박리, 전방 허혈성 시신경병증(AION), 비-동맥성 전방 허혈성 시신경병증(NAION) 및 색소실조증(incontinentia pigmenti)과 같은 많은 망막병증에서 발생할 수 있다. 혈관신생을 검출하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 조직에서 CD31(혈소판 내피 세포 부착 분자, PECAM-1이라고도 알려짐) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 발현을 측정하는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 Schluter A., et al., BMC Cancer l8(1): 272 (2018)를 참고할 것.
본 명세서에서 사용하는 용어 "유전성 망막 질환"은 유전자의 결함 또는 이상에 의해 망막 세포의 구조와 기능이 이상이 발생하는 망막 질환을 지칭한다. 유전성 망막 질환의 원인 유전자에 따라 발생시기와 증상이 다르다. 유전성 망막질환의 비제한적인 예는 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa, RP), 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital Amaurosis), 스타르가르트병(Stargardt's disease), 코츠망막병증(Coats retinopathy), 원추세포 이상증(Cone dystrophy), 범맥락막위축(Choroideremia), 어셔 증후근(Usher syndrome), 베스트 질환(Best's Disease), X-연관 망막층간분리증(X-linked Retinoschisis) 및 상세불명의 유전자 이상으로 인한 망막 이상증(Unspecified hereditary retinal dystrophy)을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "망막색소변성"(RP)는 망막의 시각세포(optic cell)와 망막색소상피 세포가 손상(변성)되는 망막 질환을 지칭한다. 시각세포가 손상됨에 따라 초기에 야맹증이 나타나며 정차적으로 시야가 좁아지고 결국 실명을 하게 된다. 시각 세포 내에서 빛을 전기신호로 전환하는 기전에 관여하는 유전자의 결함이 주요 원인이며, 일부 망막색소 상피에 관하여 유전자 이상이 발견되기도 하며, 이들 유전자 이상이 광범위한 망막 손상을 일으킨다.
망막색소변성은 간상세포(rod cell)와 원추세포(cone cell)가 점차적으로 파괴되는 것이 가장 먼저 눈에 띄는 증상이며, 간상세포가 원추세포보다 먼저 손상된다. 시각세포의 파괴가 원추세포까지 진행되면 중심시야도 볼 수 없게 되면서 완전히 실명한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "레베르 선천성 흑암시" (Leber congenital Amaurosis)는 출생시 혹은 출생 직후에 선천 실명을 일으킬 수 있는 유전성 망막 질환을 지칭한다. 레베르 선청성 흑암시 질환을 가진 환아는 정상기능을 갖는 망막의 간상세포와 원추세포가 존재하지 않아 망막전위도검사에서 원추세포반응과 간상세포반응이 모두 소실되어 있다. 레베르 선천성 흑암시는 유전자 이상에 의한 질환으로, 40 내지 50%의 환자에서 유전자의　돌연변이가 발견된다. 알려진 12가지 유전자 이상 중 상염색체 열성으로 유전하는 돌연변이가 11가지(GUCY2D, RPE65, SPATA7, AIPL1, LCA5, RPGRIP1, CRB1, CEP290, IMPDH1, RD3, RDH12)이며, 드물게　상염색체 우성으로 유전하는 경우(CRX)도 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "스타르가르트병"(Stargardt's disease)은 상염색체 열성으로 유전되는 망막이영양증의 일종을 지칭한다. 스타르가르트병은 8-15세 사이에 나타나면서 양안의 황반부 변성으로 서서히 중심시력의 저하가 일어나다. 현재는 ABCA4라 불리는 유전자 돌연변이가 스타르가르트병의 원인이 된다고 생각된다. ABCA4는 유전자 변이는 lipofuscin과 유사한 물질이 망막색소상피층의 축적을 야기하여 RPE 세포사멸과 광수용체의 소실을 초래한다. ABCA4의 돌연변이는 원추세포, 간상세포의 이형증과 심한 망막이영양증까지 연관된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 " 코츠망막병증"(Coats retinopathy)은 망막모세혈관의 확장 및 혈관류를 발생시켜 망막내부 및 망막아래 공간에 삼출물을 축적시켜 삼출망막박리를 일으키는 망막혈관 질환을 지칭한다. X 염색체의 NDP 유전자의 체세포 돌연변이로 인하여, 망막 발생에 필요한 norrin 단백질 결핍으로 발하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "원추세포 이상증"(Cone dystrophy)은 망막의 세포 중에 색각 및 중심시력을 담당하는 원추세포가 유전적 이상에 의해 변성이 되어 중심시력을 잃는 질환을 지칭한다. 원추세포 이상증은 크게 순수원추세포 이상증(Pure cone dystrophy)과 원추-간상세포 이상증(Cone-rod dystrophy)으로 나누어진다. 유전의 형태는 상염색체 우성, 열성, 성염색체 연관등으로 다양하며, 유전적 형태를 보이지 않고 본인자체의 돌연변이에 의해서도 발생할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "범맥락막위축" (Choroideremia)은 맥락막, 망막 색소 상피 및 광수용체의 희귀한 X 염색체 연관 진행성 변성을 지칭한다. 환자에서 CHM 유전자 돌연변이로 인해 Rab escort protein 1 (REP1) 단백이 결핍되면서 망막의 감광세포들이 기능을 잃고 점차 죽는다. 대개는 남성에서 질환의 증상이 나며, 전형적으로는 유소년기의 야맹증을 첫 증상으로 하여 질병이 진행함에 따라 주변 시력부터 감소되고, 중심시력은 초기에는 어느 정도 보존되는 것으로 알려져 있다. 보통 40대 남성 환자들의 경우 시력은 좋으나 시야가 매우 좁아져 있고 50~70세에 이르러 시력도 상실하게 된다. 일부 환자에서는 색 지각 능력의 저하가 나타나기도 한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "어셔 증후근" (Usher syndrome)는 청각장애와 함께 시각장애가 진행되는 유전 질환을 지칭한다. 어셔 증후근의 청각장애는 내이의 이상으로 인하며, 시각장애는 망막색소변성(RP)와 관련 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "베스트 질환"(Best Disease)은 BEST1 (VMD2) 유전자의 변이에 의해 발생하는 유전성 망막질환을 지칭한다. 서서히 진행하여 중심시력 저하를 일으킬 수 있다. BEST1 (VMD2)유전자의 돌연변이로 인해 망막색소상피 기저형질막의 칼슘-염소 채널 단백질인 베스트로핀(Bestrophin)의 기능 이상으로 망막색소상피를 통한 수분 이동의 장애가 생겨 장액망막박리 혹은 망막색소상피박리 등이 생길 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "X-연관 망막층간분리증"(X-linked Retinoschisis)은 망막층간분리유전자(retinoschisis gene, RS 1)의 돌연변이에 의하여 내측망막의 층간 분리가 발생하는 질환을 지칭한다. 망막층간분리는 망막을 구성하는 10개의 층 중 신경 섬유층의 비정상적인 분리로 인하여 시력장애를 야기한다. 연소망막층간분리는 전세계 유병률이 1:120,000으로 드물게 발생하는 X 염색체 열성유전 질환이다.
용어 "miRNA", "miR" 및 "microRNA"는 호환적으로 사용되며 RNA-기반 유전자 조절에 관여하는 진핵생물에서 발견되는 microRNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 전구체로부터 처리된 단일-가닥 RNA 분자를 지칭하기 위해서 사용될 것이다. 일부 양태에서, 용어 "안티센스 올리고머"는 본 개시 내용의 microRNA 분자를 기술하기 위해서 사용될 수도 있다. 본 개시 내용과 관련이 있는 miRNA 및 이의 서열의 명칭은 본 명세서에 제공되어 있다. microRNA는 불완전한 염기쌍을 통해 타겟 mRNA를 인식하고 상기 타겟 mRNA에 결합하여 상기 타겟 mRNA의 불안정화 또는 번역 저해로 이어짐으로써 타겟 유전자 발현을 하향 조절한다. 반대로, miRNA 결합 부위를 포함하는 분자(일반적으로 miRNA의 시드 영역(seed region)에 상보적인 서열을 포함하는 분자)를 통한 miRNA 타겟화는 miRNA-유도 번역 저해를 감소시키거나 저해하여 타겟 유전자의 상향 조절로 나타날 수 있다.
"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오타이드 서열", "폴리뉴클레오타이드" 및 이들의 문법적 변형 형태들은 호환적으로 사용되며 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오타이드의 서열을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 5'로부터 3' 방향으로 표시되어 있다. 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 분자 또는 리보핵산(RNA) 분자일 수 있다. 뉴클레오타이드 염기는 본 명세서에 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 이노신(I) 및 우라실(U)과 같은 단일 문자 코드로 표시되어 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 원하는 기능을 수행하도록 인접하여 위치함을 의미한다. 예를 들어, 특정 프로모터가 코딩 서열(예를 들어 외래 유전자)의 전사를 개시하는 데 도움을 주는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 영역과 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한은 프로모터와 코딩 영역이 반드시 인접하여 위치할 필요는 없다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체", "약제학적으로 허용되는 부형제" 및 이들의 문법적 변형 형태들은 미국연방정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 인간을 포함한 동물에서 사용하기 위해 미국 약전에 등재된 모든 제제들뿐 아니라 대상에 조성물 투여를 못하게 할 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 발생을 일으키지 않고 투여된 복합체의 생물학적 활성 및 특성을 없어지게 하지 않는 모든 담체 또는 희석제를 포함한다. 약제학적 조성물을 제조하는데 유용하고 일반적으로 안전하고 무독성이며 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "약제학적 조성물"은 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제와 같은 하나 이상의 다른 화학 성분과 혼합 또는 섞거나 상기 화학 성분에 현탁된 본 명세서에 기재된 조성물들(예를 들어 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 및/또는 재조합 바이러스) 중 하나 이상을 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "프로모터" 및 "프로모터 서열"은 호환적인 것으로 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치해 있다. 프로모터는 전체가 천연 유전자로부터 유래되거나 자연에서 발견되는 서로 다른 프로모터로부터 유래된 서로 다른 요소들로 구성될 수 있거나 또는 나아가 합성 DNA 부분을 포함할 수도 있다. 당업자라면 서로 다른 프로모터가 서로 다른 조직 또는 세포 유형에서 또는 서로 다른 발생 단계에서 또는 서로 다른 환경 또는 생리적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 점을 이해한다. 대부분의 숙주 세포 유형에서 유전자가 대부분 발현되도록 하는 프로모터를 통상적으로 "구성적(constitutive) 프로모터"라고 한다. 특정 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"라고 한다. 특정 발생 또는 세포 분화 단계에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "발생-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"라고 한다. 프로모터를 유도하는 작용제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 빛 등으로 세포를 노출 또는 처리한 후 유도되고 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절성 프로모터"라고 한다. 또한 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되어 있는 것은 아니었기 때문에 서로 다른 길이의 DNA 단편들은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인식되어 있다.
상기 프로모터 서열은 전형적으로 그의 3' 말단에서 전사 개시 부위와 경계를 이루고 배경 이상의 검출 가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 최소수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 방향(5' 방향)으로 연장되어 있다. 상기 프로모터 서열 내에는 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(공통 서열) 뿐 아니라 전사 개시 부위(예를 들어 뉴클레아제 S1과 맵핑에 의해 편리하게 정의됨)도 발견될 것이다. 일부 양태에서, 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 프로모터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "유전자 조절 영역" 또는 "조절 영역"은 코딩 영역의 상류(5' 비코딩 서열), 내에 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치하여 관련 코딩 영역의 전사, RNA 처리, 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 부위, 이펙터 결합 부위 또는 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현용으로 의도된 경우에, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)는 프로모터 및/또는 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 연관된 다른 발현(예를 들어 전사) 조절 요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 연관에 있어서, 유전자 산물을 위한 코딩 영역은 상기 유전자 산물의 발현이 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 놓이도록 하는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 연관된다. 예를 들어 코딩 영역과 프로모터는 프로모터 기능의 유도가 상기 코딩 영역에 의해 코딩되는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA의 전사를 일으키고 상기 프로모터와 코딩 영역 간 연결 특성이 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우에 "작동 가능하게 연관된다". 프로모터 외 다른 발현 조절 요소들, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 또한 유전자 산물 발현을 지시하는 코딩 영역과 작동 가능하게 연관될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "대상", "환자", "개체" 및 "숙주" 및 이들의 변이체는 호환 가능하며 본 명세서에 기재된 조성물들(예를 들어 폴리뉴클레오타이드, 재조합 발현 구축물, 벡터, 세포, 약제학적 조성물 또는 재조합 바이러스) 중 임의의 조성물이 투여되는 임의의 포유류 대상을 지칭한다. 비제한적인 예로는 진단, 처치 또는 치료가 필요한 인간, 가축(예를 들어 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물(예를 들어 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그 등), 특히 인간을 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간의 예방 또는 치료 및 수의학적 용도 모두에 적용 가능하다.
본 명세서에서 사용하는 문구 "필요로 하는 대상"은 본 명세서에 기재된 조성물의 투여 이익이 있을 포유류 대상과 같은 대상을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료 유효량"은 필요로 하는 대상에 대해 원하는 치료 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻기에 충분한 본 개시 내용의 조성물(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드)을 포함하는 시약 또는 악제학적 복합체의 양이다. 치료 유효량은 예방을 치료로 볼 수 있기 때문에 "예방 유효량"일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "외래 유전자"는 재조합 발현 구축물에서 코딩되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역의 발현 산물, 폴리펩타이드 또는 다중-폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 촉진 또는 조절 핵산을 지칭한다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 삽입(또는 형질도입)되는 세포에 이종(즉, 세포에서 자연적으로 발현되지 않는 것)일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 예를 들어 질환 또는 병태의 중증도 감소, 질환 경과 기간의 감소, 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 개선 또는 제거, 질환 또는 병태를 반드시 치유하지 않고도 질환 또는 병태가 있는 대상에게 유익한 효과를 제공하는 것을 지칭한다. 상기 용어는 또한 질환 또는 병태 또는 이의 증상을 예방 또는 방지하는 것을 포함한다.
용어 "상류"는 기준 뉴클레오타이드 서열에 대해 5'에 위치해 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "벡터" 또는 "구축물"은 핵산 또는 유전자가 삽입될 수 있는 임의의 비히클(vehicle), 예를 들어 핵산 서열이 삽입되어 복제될 수 있는 세포 내 도입될 수 있는 전달 비히클을 지칭한다. 벡터 내로 삽입될 수 있는 상기 핵산 서열은 외생 또는 이종일 수 있다. 상기 핵산 서열은 외래 유전자일 수 있다. 구축물의 예는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들어 AAV)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 상기 벡터 또는 구축물을 제작할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등). 본 명세서에서 사용하는 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물"은 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한 벡터 또는 구축물을 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 구축물에는 다양한 조절요소를 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절 서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 다른 기능도 제공하는 뉴클레오타이드 서열도 포함될 수 있다. 본 발명에서 이용가능한 바이러스는 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 백시니아 바이러스, 랩도바이러스(Rhabdovirus), 아데노바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus: AAV) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
벡터는 상기 벡터를 혼입한 세포의 선택 또는 식별을 위해 제공되는 선택성 마커 또는 리포터를 코딩하도록 조작될 수 있다. 선택성 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 포함된 다른 코딩 영역을 통합 및 발현하는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 가능하게 한다. 당업계에 공지되어 있고 사용하고 있는 선택성 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 바이알라포스 제초제, 설폰아미드 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라아제 유전자 등을 포함한다. 당업계에 공지되어 있고 사용하고 있는 리포터의 예는 루시퍼라아제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β갈락토시다아제(LacZ), β글루쿠로니다아제(Gus) 등을 포함한다. 선택성 마커는 리포터인 것으로 볼 수도 있다.
일반적으로 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV)는 숙주 세포(예를 들어 HEK293 세포)의 삼중 형질감염에 의해 생성된다. 그것은 1) ITRs(inverted terminal repeats) 옆에 있는 유전자 발현 카세트를 가진 AAV 작제 플라스미드, 2) 아데노 관련 바이러스 게놈의 복제에 필요한 Rep 단백질과 바이러스 입자를 구성하는 캡시드 단백질을 제공하는 "Rep-Cap 플라스미드", 마지막으로 3) AAV의 생명주기를 돕는 아데노바이러스의 단백질(E2a, E4)과 RNA(VA RNA)를 제공하는 "헬퍼 플라스미드"이다. AAV는 이 세 종류의 플라스미드가 아데노 바이러스의 E1 및 E3 유전자를 제공하는 HEK293 세포 등에 형질 감염될 때 생성된다.
본 명세서에서 용어 " "이중 헬퍼 플라스미드"는 세포에서 AAV를 생성하기 위한 요건 중 2개 이상을 제공할 수 있는 플라스미드를 의미한다. 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본원에 기재된 이중 헬퍼 플라스미드는 상기 기재된 요건 2) “플라스미드” 및 3)” 헬퍼 플라스미드”을 제공한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 이중 헬퍼 플라스미드는 rep 유전자, cap 유전자, E2a 유전자, E4 유전자 및 VA RNA 유전자를 포함한다.
본원에 기술된 이중 헬퍼 플라스미드는 상기 기술된 유전자를 포함할 뿐만 아니라 유전자는 또한 플라스미드 내에서 특정 구성으로 배열된다. 예를 들어, 일부 측면에서, E2a 유전자, E4 유전자 및 VA RNA 유전자는 이중 헬퍼 플라스미드 내에서 순차적으로 연결되고, rep 유전자 및 cap 유전자(본원에서 집합적으로 "rep-cap 유전자"로 지칭됨)는 E2a 유전자의 5' 말단과 VA RNA 유전자의 3' 말단 사이를 시계 방향(5'에서 3'으로)으로 순차적으로 연결한다. 보다 구체적으로, 일부 측면에서, rep-cap 유전자의 5'-말단은 E2a 유전자의 5'-말단에 연결되고, 여기서 rep-cap 유전자의 3'-말단은 VA RNA 유전자의 3' 말단에 연결된다. 일부 측면에서, E2a 유전자, E4 유전자 및 VA RNA 유전자는 순차적으로 연결되고, rep-cap 유전자는 E2a 유전자의 5'-말단과 VA RNA 유전자의 3'-말단 사이에 시계 반대 방향(3'에서 5'로) 있다. 보다 구체적으로, 일부 측면에서, rep-cap 유전자의 3'-말단은 E2a 유전자의 5'-말단에 연결되고, 여기서 rep-cap 유전자의 5'-말단은 VA RNA 유전자의 3' 말단에 연결된다.
본 명세서에서 용어 "세포"는 진핵세포 및 원핵세포를 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 세포를 의미한다. 세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(Transfected), 형질도입(Transduced) 또는 형질전환(Transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 폴리뉴클레오타이드(핵산분자)가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "형질전환"은 상기 형질감염(Transfected) 및 형질도입(Transduced)을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 (숙주)세포는 제한되지 않으나, 바람직하게는 곤충세포 또는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 곤충세포의 경우 Sf9, 포유동물 세포의 경우 HEK293 세포, HeLa 세포, ARPE-19 세포, RPE-1 세포, HepG2 세포, Hep3B 세포, Huh-7 세포, C8D1a 세포, Neuro2A 세포, CHO 세포, MES13 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, MCF-7 세포, HC70 세포, HCC1428 세포, BT-549 세포, PC3 세포, LNCaP 세포, Capan-1 세포, Panc-1 세포, MIA PaCa-2 세포, SW480 세포, HCT166 세포, LoVo 세포, A172 세포, MKN-45 세포, MKN-74 세포, Kato-III 세포, NCI-N87 세포, HT-144 세포, SK-MEL-2 세포, SH-SY5Y 세포, C6 세포, HT-22 세포, PC-12 세포, NIH3T3 세포 등을 이용할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 숙주세포는 단리된 숙주세포이다.
본 명세서에서 사용하는 "서열 유사성 19를 갖는 패밀리" 또는 "FAM19", 또는 “TAFA”라는 용어는 5개의 단백질의 TAFA 패밀리(또한 FAM19 패밀리로 알려짐)에 속하고 주로 뇌 및 척수에서 발현되는 단백질을 의미한다. FAM19A1은 TAFA1, FAM19A2는 TAFA2, FAM19A3은 TAFA3, FAM19A4는 TAFA4, FAM19A5는 TAFA5라고도 알려져 있다.
인간의 TAFA1 유전자는 133개의 아미노산 서열을 암호화하며, 신호 서열(signal peptide)과 성숙 단백질 (mature protein)의 길이에는 이견이 존재하지만 인간 TAFA1 단백질(서열번호 302)의 경우 35개 아미노산의 신호서열과 98개 아미노산의 성숙 단백질로 구성되었을 것으로 예상된다. TAFA1은 전두, 측두, 후두, 정중후부 피질에서 높은 발현을 보이며, 기저핵, 측관, 소뇌에서는 낮은 발현을 보인다. 세포 실험을 통해 TAFA1은 신경 줄기세포의 분화 운명 결정에 영향을 주며, 신경 줄기 세포의 성상 교세포의 분화를 억제하고 신경 세포로의 분화를 촉진하는 것이 밝혀졌다. TAFA1 Knock-Out (KO) 마우스 실험을 통해 TAFA1이 운동 활동, 불안에 대한 행동, 학습과 기억, 체감 감각 기능을 조절할 수 있음이 알려져 있다.
인간의 TAFA2 유전자는 131개의 아미노산 서열을 암호화하며, 신호 서열(signal peptide)과 성숙 단백질 (mature protein)의 길이에는 이견이 존재하지만 인간 TAFA2 단백질(서열번호 303)의 경우 30개 아미노산의 신호서열과 101개 아미노산의 성숙 단백질로 구성되었을 것으로 예상된다. TAFA2는 중추신경계 내에서 후두와 전두 피질, 연수에서 풍부하게 발현된다. TAFA2 재조합 단백질을 마우스의 제3뇌실에 주입하였을 때, 마우스의 음식 섭취량과 식사 횟수를 증가시키며 에너지 소비가 증가하고 호흡 교환 비율이 증가하는 것이 알려졌다. 따라서 TAFA2는 음식 섭취 및 에너지 대사 조절에서 역할을 할 수 있음을 시사한다. 또한 zebrafish와 마우스에서 TAFA2를 억제하였을 때 불안 관련 행동이 증가함이 알려져 있다.
인간의 TAFA3 유전자는 133개의 아미노산 서열을 암호화하며, 신호 서열(signal peptide)과 성숙 단백질 (mature protein)의 길이에는 이견이 존재하지만 인간 TAFA3 단백질(서열번호 304)의 경우 30개 아미노산의 신호서열과 103개 아미노산의 성숙 단백질로 구성되었을 것으로 예상된다. 일과성 국소 뇌허혈 마우스 모델에서 미아교세포에서 TAFA3의 발현이 증가하고, TAFA3를 처리한 미아교세포는 항염증성 미아교세포로 분극함이 알려져 있다. 또한 마우스 모델에서 TAFA3를 KO하였을 때, 사회적 새로움에 대한 반응 감소, 사회적 소통 장애, 반복적인 행동 증가와 같은 자폐 스펙트럼에서 관찰되는 3가지 주요 행동 결함이 나타나, TAFA3가 사회적 관계 형성에 대한 정상적인 기능에 관여함을 시사한다.
인간의 TAFA4 유전자는 140개의 아미노산 서열을 암호화하며, 신호 서열(signal peptide)과 성숙 단백질 (mature protein)의 길이에는 이견이 존재하지만 인간 TAFA4 단백질(서열번호 299)의 경우 45개 아미노산의 신호서열과 95개 아미노산의 성숙 단백질로 구성되었을 것으로 예상된다. TAFA4는 말초신경계의 감각신경세포에서 주로 발현된다. TAFA4 단백질은 특히 저역치 기계적 수용체(C-low-threshold mechanoreceptors)에서 특이적으로 발현되며 연합 신경 세포(interneuron), 특히 GABAergic 신경 세포의 활성을 조절하여 통증을 감소시키는 것으로 보인다.
인간의 TAFA5 유전자는 132개의 아미노산 서열을 암호화하며, 신호 서열(signal peptide)과 성숙 단백질 (mature protein)의 길이에는 이견이 존재하지만 인간 TAFA5 단백질의 경우 43개 아미노산의 신호서열과 89개 아미노산의 성숙 단백질로 구성되었을 것으로 예상된다. TAFA5는 기저핵 영역과 소뇌에서 높은 발현을 보인다. TNF-α와 같은 염증성 자극에 의해 마우스의 시상하부에서 TAFA5의 발현이 증가하며 TAFA5를 KO했을 때, TNF-α에 의해 감소한 음식섭취, 몸무게 감소, 염증성 사이토카인의 증가가 부분적으로 회복됨이 알려져 있다.
상기 5가지의 TAFA 패밀리들은 생체 내에서 각각 다른 기능을 할 것으로 예상되나, TAFA1 내지 TAFA4 성숙 단백질의 경우, 높은 서열 동일성(예를 들어, 인간 TAFA4는 TAFA1과 73.7%의 서열 동일성, TAFA2와 85.3%의 서열 동일성 및 TAFA3와 81.1%의 서열 동일성)을 나타낸다. 한편, TAFA5는 TAFA1 내지 4와 낮은 서열 동일성(예를 들어, 인간 TAFA5는 TAFA1와 48.9%의 서열 동일성, TAFA2와 51.1%의 서열 동일성, TAFA3와 47.7%의 서열 동일성 및 TAFA4와 50.0%의 서열 동일성)을 나타내어 서로 전혀 다른 기능을 할 것으로 예상할 수 있다(도 21 참조).
인간 TAFA4 (TAFA Chemokine Like Family Member 4) 단백질(서열번호 299)은 뇌 영역 전반에 걸쳐 풍부하게 발현되는 TAFA 단백질 군(TAFA1-5)의 하나이다. 140개의 아미노산으로 구성된 상기 TAFA4는 앞부분의 45개의 아미노산을 제외한 95개의 아미노산(서열번호 171)이 척추동물 내에서 진화적으로 매우 잘 보존되어 있다. 또한, TAFA 단백질 군 중에서 상기 TAFA1 내지 4는 척추동물 내에서 종간 서열 동일성이 매우 잘 보존되어 있는 것으로 확인된다. i) 인간의 성숙 TAFA4 아미노산 서열은 포유류 및 양서류의 TAFA4와 비교하여 90% 이상, 조류의 TAFA4와 비교하여 95% 이상, 파충류 및 어류의 TAFA4와 비교하여 85% 이상 서열 동일성을 나타내며(도 19 참조), ii) 인간의 TAFA1 아미노산 서열은 포유류 및 양서류의 TAFA1과 비교하여 90% 이상, 조류의 TAFA1과 비교하여 95% 이상, 파충류 및 어류의 TAFA1과 비교하여 85% 이상 서열 동일성을 나타내며(도 16 참조), iii) 인간의 TAFA2 아미노산 서열은 포유류 및 양서류의 TAFA2와 비교하여 90% 이상, 조류의 TAFA2와 비교하여 95% 이상, 파충류 및 어류의 TAFA2와 비교하여 80% 이상 서열 동일성을 나타내며(도 17 참조), iv) 인간의 TAFA3 아미노산 서열은 포유류 및 양서류의 TAFA3와 비교하여 75% 이상, 조류의 TAFA3와 비교하여 80% 이상, 파충류 및 어류의 TAFA3와 비교하여 75% 이상 서열 동일성을 나타내는 바(도 18 참조), 종에 상관없이 매우 높은 서열 동일성을 나타냄을 확인할 수 있다.
II. 폴리뉴클레오타이드
II.A. 비번역 핵산 서열
본 개시 내용은 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 비번역 핵산 서열이 번역시 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 명세서는 전장 EF-1α 인트론보다 짧은 신장 인자-1 알파(EF-1α) 인트론 서열을 제공한다.
신장 인자 1 알파(EF-1α)는 6번 염색체에 위치해 있는 유전자이다(GenBank 수탁번호 NC_000006.12의 73,489,308번째 내지 73,525,587번째 뉴클레오타이드; 음성 가닥 방향). EF-1α 유전자는 8개의 엑손과 7개의 인트론을 포함하고 mRNA 번역에 중요한 역할을 하는(예를 들어 아미노아실-tRNA를 삼원 복합체 eEF1A1-GTP-aa-tRNA로서 리보솜의 A 부위로 운반하는) 진핵생물 신장 인자 1A(eEF1A1 및 eEF1A라고도 알려짐) 단백질을 코딩한다. Scaggiante et al., Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 19(4): 256-265(2015년 3월)를 참조할 것. 상기 전장 EF-1α 인트론의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1(924개 뉴클레오타이드 길이)에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편 서열)은 전장 EF-1α 인트론(또는 당업계에 공지되어 있는 그 밖의 다른 인트론)에 비해 뚜렷한 이점을 제공한다. 예를 들어 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 전장 EF-1α 인트론보다 외래 유전자의 발현을 더 크게 증가시킬 수 있다. 또한 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열이 전장의 대응물보다 더 짧기 때문에, 일부 양태에서, 이들을 더 큰 외래 유전자와 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어 AAV 캡시드(본 명세서에 기재된 것들과 같은)는 최대 약 4.7 kb의 핵산을 수용할 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 유전자 발현을 훨씬 더 증가시키기 위해 더 큰 외래 유전자 및/또는 추가 시스-요소(cis-elements)를 본 명세서에 기재된 EF-1α 인트론 단편(즉, 비번역 핵산 서열)과 통합할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 서열번호 1에 나타낸 서열의 874번째 내지 924번째 위치의 뉴클레오타이드를 포함하지만 서열번호 1은 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 874 번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진다. 일부 양태에서, 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 874 번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 이루어진다. 이러한 EF-1α 인트론 단편은 본 명세서에서 "T3.2 단편"이라고도 하며 서열번호 57에 나타나 있다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖되, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하지만 서열번호 1을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진다. 일부 양태에서, 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 이루어진다. 이러한 EF-1α 인트론 단편은 본 명세서에서 "T3.1.2 단편"이라고도 하고 서열번호 3에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖되, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하지만 서열번호 1을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 이루어진다. 이러한 EF-1α 인트론 단편은 본 명세서에서 "T3.1.1 단편"이라고도 하고 서열번호 2에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖되, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 29개 내지 174개의 뉴클레오타이드로 구성되며, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 57에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 51개 내지 117개의 뉴클레오타이드로 구성되며, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 57에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 51개 내지 117개의 뉴클레오타이드로 구성되며, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 57에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 (i) 서열번호 1의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 58), (ii) 서열번호 1의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 59), (iii) 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 60), (iv) 서열번호 1의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 61), (v) 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 2), (vi) 서열번호 1의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 63), (vii) 서열번호 1의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 64), (viii) 서열번호 1의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 65), (ix) 서열번호 1의 801번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 66), (x) 서열번호 1의 751번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 67), (xi) 서열번호 1의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 68), (xii) 서열번호 1의 701번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 69), (xiii) 서열번호 1의 651번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 70), (xiv) 서열번호 1의 601번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 71), (xv) 서열번호 1의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 72), (xvi) 서열번호 1의 551번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 73) 또는 (xvii) 서열번호 1의 501번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 74)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 58)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 59)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 60)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 61)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 2)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 63)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 64)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 65)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 801번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 66)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 751번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 67)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 68)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 701번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 69)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 651번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 70)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 601번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 71)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 72)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 551번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 73)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열번호 1의 501번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열번호 74)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
상기 개시 내용으로부터 명백한 바와 같이, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 5' 말단("5' 영역")에 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 3' 말단("3' 영역")에 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 5' 말단("5' 영역")과 3' 말단("3' 영역") 모두에 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 5' 영역에 서열번호 1 내 1번째 내지 873번째 위치에 해당하는 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
II.B. 외래 유전자
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 외래 유전자를 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산이다. 일부 양태에서, 상기 핵산은 서열번호 184와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산이다.
II.C. 조절 요소
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 조절 요소를 더 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (1) 조절 요소, (2) 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자(예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열)를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "조절 요소"는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 조절하는(예를 들어 증가 또는 감소시키는) 핵산 서열을 지칭한다. 본 개시 내용에 유용한 조절 요소는 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 또는 β액틴 프로모터), 엑손(예를 들어 엑손 1 또는 엑손 2), 스플라이싱 공여체 서열, 수용체 서열 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조절 요소는 전사 종결을 위한 서열(예를 들어 poly A), 외래 유전자를 안정적으로 발현시키기 위한 서열(예를 들어 WPRE 서열), 외래 유전자-특이적 면역의 발생을 감소시키기 위한 서열(예를 들어 miRNA 타겟 서열) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
II.C.1. 인핸서
일부 양태에서, 상기 조절 요소는 인핸서이다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 인핸서, (2) 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서, (2) 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자를 포함한다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 인핸서를 본 개시 내용에서 사용할 수 있다. 적합한 인핸서의 비제한적인 예로는: 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, SV40 초기 인핸서, 아데노바이러스 5 E1A 인핸서, HBV 인핸서-1 조절 영역(Eh-1), HPV-16 또는 -18 E6/7 긴 조절 영역(LCR), HIV-1 긴 반복말단(LTR) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인핸서는 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서이다. 일부 양태에서, 상기 CMV 인핸서는 서열번호 4와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서는 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.2. 프로모터
일부 양태에서, 상기 조절 요소는 프로모터이다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 프로모터, (2) 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 프로모터, (2) 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조절 요소는 인핸서 및 프로모터 2개 모두를 포함한다. 이러한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 인핸서, (2) 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서, (2) 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함한다. 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 프로모터를 본 개시 내용에서 사용할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF-1α 프로모터, β액틴 프로모터, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 70-kDa 열 충격 단백질(HSP70) 프로모터, 78-kDa 포도당-조절 단백질(GRP78) 프로모터, 진핵생물 개시 인자-4A(eIF4a) 프로모터, 알파-1-항트립신(AAT) 프로모터, 트랜스티레틴(TTR) 프로모터, 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 원숭이 공포 바이러스 40(SV40) 프로모터의 초기 프로모터, 시냅신 I(SYN1) 프로모터, G 단백질-결합 수용체 키나아제(GRK) 프로모터, 로돕신(Rho) 프로모터 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에 유용한 프로모터는 CMV 프로모터이다. 따라서 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) CMV 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CMV 프로모터는 서열번호 5 또는 6과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CMV 프로모터는 서열번호 5 또는 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 프로모터는 EF-1α 프로모터이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) EF-1α 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α 프로모터는 서열번호 7과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α 프로모터는 서열번호 7에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 프로모터는 β액틴 프로모터이다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) β액틴 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 β액틴 프로모터는 서열번호 8과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 β액틴 프로모터는 서열번호 8에 나타낸 것과 같은 치킨 β액틴 프로모터이다.
본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이(도 4a 참조), 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)는 다중 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CMV 프로모터 및 EF-1α 프로모터 2개 모두를 포함한다. 이러한 양태에서, 상기 CMV 프로모터는 서열번호 5에 나타낸 서열(즉, 서열번호 6의 5'-말단으로부터의 처음 31개의 뉴클레오타이드)과 같이 전장 CMV 프로모터의 일부일 수 있다.
II.C.3. 스플라이싱 공여체 서열
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(즉, 비번역 핵산 서열을 포함)는 스플라이싱 공여체 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "스플라이싱 공여체 서열" 또는 "스플라이싱 공여체 부위"는 인트론(예를 들어 EF-1α 인트론)의 5'-말단에 존재하는 구아닌-티민(GT)이 풍부한 도메인을 지칭한다(인트론과 엑손 사이의 경계를 암시함). 본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이, 이러한 서열은 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열을 생성하도록 타겟화될 수 있다. 일부 양태에서, 스플라이싱 공여체 서열은 EF-1α 인트론 단편(즉, 비번역 핵산 서열)의 상류에 연결된다. 예를 들어 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 (특정 순서 없이) (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) 스플라이싱 공여체 서열, (4) 비번역 핵산 서열 및 (5) 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) 스플라이싱 공여체 서열, (4) 비번역 핵산 서열 및 (5) 외래 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에 유용한 스플라이싱 공여체 서열은 서열번호 9 또는 10에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 스플라이싱 공여체 서열은 서열번호 9 또는 10에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.4. 엑손 서열
본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 엑손 서열을 더 포함한다. 예를 들어 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 다음과 같은 특징부를 포함한다(특정 순서 없이): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) 스플라이싱 공여체 서열, (4) 비번역 핵산 서열, (5) EF-1α E2 서열 및 (6) 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열). 일부 양태에서, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) 스플라이싱 공여체 서열, (4) 비번역 핵산 서열, (5) EF-1α E2 서열 및 (6) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E2 서열은 서열번호 11과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E2 서열은 서열번호 11에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 하나 이상의 엑손 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV), EF-1α 또는 β액틴 엑손 1(E1) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 E1 및 E2 서열 2개 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열 및 (7) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열 및 (7) 외래 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 E1 서열은 CMV E1 서열이다. 일부 양태에서, 상기 CMV E1 서열은 서열번호 12와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 CMV E1 서열은 서열번호 12에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 E1 서열은 EF-1α E1 서열이다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E1 서열은 서열번호 13과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E1 서열은 서열번호 13에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 E1 서열은 β액틴 E1 서열이다. 일부 양태에서, 상기 β액틴 E1 서열은 서열번호 14 또는 15와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 β액틴 E1 서열은 서열번호 14 또는 15에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.5. miRNA 타겟 서열
본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 조절 요소는 면역세포에 특이적인 microRNA(miRNA)에 대한 하나 이상의 타겟 서열("miRNA 타겟 서열")을 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 다음과 같은 특징부를 포함한다(특정 순서 없이): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열) 및 (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자 및 (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 miRNA 타겟 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 miRNA에 대한 상기 타겟 서열의 수는 약 2 내지 약 6개(예를 들어 2 내지 6개)이다. 일부 양태에서, 상기 다중 miRNA 타겟 서열들은 동일하다. 일부 양태에서, 상기 다중 miRNA 타겟 서열들 중 하나 이상은 서로 다르다.
본 개시 내용으로부터 명백한 바와 같이, 하나 이상의 miRNA 타겟 서열을 포함하면 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 특이성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어 특정 세포 유형(예를 들어 면역세포)에서 상기 외래 유전자의 저해가 바람직할 때, 면역세포에 특이적인 miRNA에 대한 타겟 서열을 사용하여 면역세포 내에서 외래 유전자의 발현을 억제할 수 있으며, 그 결과 면역세포에 의한 외래 유전자-특이적 면역의 발생을 차단할 수 있다. 따라서 서로 다른 miRNA 타겟 서열들을 사용함으로써 서로 다른 세포/조직에서 외래 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 miRNA 타겟 서열을 본 개시 내용에서 사용할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 miRNA 타겟 서열은 miR142-3p 또는 miR142-5p에 특이적이다. 일부 양태에서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열은 miR142-3p 또는 miR142-5p의 전장 또는 일부 서열에 상보적인 서열을 가진 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어, 소헤어핀 RNA(shRNA) 분자, 소방해 RNA(siRNA) 분자, 라이보자임, 펩타이드 핵산(PNA) 올리고뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합들로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 miRNA 타겟 서열은 서열번호 16과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 miRNA 타겟 서열은 서열번호 17과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 miRNA 타겟 서열은 서열번호 16 또는 17에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.6. WPRE 서열
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(즉, 비번역 핵산 서열을 포함)는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE) 서열을 더 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열), (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열 및 (9) WPRE 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자, (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열 및 (9) WPRE 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 WPRE 서열은 서열번호 18과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 WPRE 서열은 서열번호 18에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.7. 폴리아데닐화 서열
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(즉, 비번역 핵산 서열을 포함)는 하나 이상의 폴리아데닐화(pA) 서열을 더 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열), (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열, (9) WPRE 서열 및 (10) 하나 이상의 pA 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β액틴), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자, (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열, (9) WPRE 서열 및 (10) 하나 이상의 pA 서열을 포함한다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 pA 서열을 본 개시 내용에서 사용할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리아데닐화 서열의 예는 인간 성장 호르몬(hGH) pA 서열, 소 성장 호르몬(bGH) pA 서열, 원숭이 공포 바이러스 40(SV40) 초기 pA 서열 및 SV40 후기 pA 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열번호 19와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열번호 20과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열번호 21과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열번호 22와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 폴리아데닐화 서열은 서열번호 19 내지 22에 나타낸 뉴클레오타이드 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상술한 바와 같이, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (i) 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열) 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하되, 상기 조절 요소는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 서열번호 4에 나타낸 CMV 인핸서 서열, (2) 서열번호 5 또는 6에 나타낸 CMV 프로모터 서열, 서열번호 7에 나타낸 EF-1α 프로모터 서열 또는 서열번호 8에 나타낸 치킨 β액틴 프로모터 서열, (3) 서열번호 12에 나타낸 CMV E1 서열, 서열번호 13에 나타낸 EF-1α E1 서열 또는 서열번호 14 또는 15에 나타낸 치킨 β액틴 E1 서열, (4) 서열번호 9 또는 10에 나타낸 스플라이싱 공여체 서열, (5) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 57에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 EF-1α 인트론 단편 서열(즉, 비번역 핵산 서열) 및 (6) 서열번호 11에 나타낸 EF-1α E2 서열을 포함한다.
III. TAFA
본 개시 내용은 TAFA 단백질(예를 들어, TAFA1 내지 TAFA4)의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
III.A. 폴리펩타이드
본 개시 내용은 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 일반식 1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 것이다:
<일반식 1>
X1-X2-X3-G-T-C-E-V-X4-A-X5-H-X6-C-C-N-X7-N-X8-I-E-E-X9-S-Q-T-X10-X11-C-S-C-X12-X13-G-X14-V-A-G-T-T-X15-X16-X17-P-S-C-V-X18-A-X19-I-V-X20-X21-X22-W-W-C-X23-M-X24-P-C-X25-X26-G-E-X27-C-K-X28-L-P-D-X29-X30-G-W-X31-C-X32-X33-G-X34-K-X35-K-T-T-X36-X37-X38-X39
상기 일반식 1에서,
X1은 존재하지 않거나, V, I 또는 L이고,
X2는 K, E, R 또는 Q이고,
X3은 G, T, Q, P 또는 A이고,
X4는 V 또는 I이고,
X5는 A, L, V 또는 I이고,
X6은 R 또는 L이고,
X7은 K, R 또는 Q이고,
X8은 R 또는 K이고,
X9는 R 또는 L이고,
X10은 V 또는 G이고,
X11은 K 또는 N이고,
X12는 F 또는 L이고,
X13은 P 또는 S이고,
X14는 Q 또는 K이고,
X15는 R, H 또는 Q이고,
X16은 A, N, S 또는 T이고,
X17은 A, Q, R, K 또는 T이고,
X18은 D 또는 E이고,
X19는 S 또는 A이고,
X20은 I, E, L, A 또는 V이고,
X21은 Q, G 또는 E이고,
X22는 K 또는 R이고,
X23은 H, Q 또는 E이고,
X24는 E, Q, N, D, S 또는 H이고,
X25는 L, V 또는 M이고,
X26은 E, D, P, L 또는 A이고,
X27은 E 또는 D이고,
X28은 V, T, A 또는 I이고,
X29는 L, N, R, Y, S 또는 Q이고,
X30은 S, K 또는 T이고,
X31은 S 또는 M이고,
X32는 S, A 또는 Y이고,
X33은 S, T 또는 R이고,
X34는 N 또는 H이고,
X35는 V 또는 I이고,
X36은 R 또는 K이고,
X37은 존재하지 않거나 V, A, G, M 또는 N이고,
X38은 존재하지 않거나 T, I, N, F 또는 S이고, 및
X39는 존재하지 않거나 R, H, V, K, I 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 80 내지 130개, 보다 바람직하게는 90 내지 120개, 가장 바람직하게는 91 내지 119개의 아미노산 서열로 구성된 것이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 2의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 2>
X1-X2-H-H-K-A-X3-H
상기 일반식 2에서,
X1은 A 또는 V이고,
X2는 N 또는 I이고, 및
X3은 H 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식2-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 3의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 3>
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
상기 일반식 3에서,
X1은 A 또는 S이고,
X2는 L, T 또는 S이고,
X3은 Q, E 또는 H이고,
X4는 존재하지 않거나, P, L 또는 H이고,
X5는 P 또는 R이고,
X6은 T, S 또는 I이고,
X7은 A, P, T, S 또는 H이고,
X8은 T, A, S 또는 I이고,
X9는 V 또는 A이고, 및
X10은 L 또는 H이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식3-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 4의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 4>
X1-X2
상기 일반식 4에서,
X1은 H 또는 Y이고, 및
X2는 Q, V 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식4-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
LHRP(서열번호 293);
LHQSGFTSGHFPHHRKLGE(서열번호 294); 또는
LAPPGTNIQI(서열번호 295).
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 5의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지) 을 추가로 포함한다:
<일반식 5>
X1-X2-X3
상기 일반식 5에서,
X1은 P 또는 G이고,
X2는 R 또는 H이고, 및
X3는 T, S 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다.
PYTSL(서열번호 296); 또는
QEDKLK(서열번호 297).
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 LHRP-일반식1, LHQSGFTSGHFPHHRKLGE-일반식1 또는 LAPPGTNIQI-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식1-일반식5, 일반식1-PYTSL 또는 일반식1-QEDKLK의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 LHRP-일반식1-일반식5 LHQSGFTSGHFPHHRKLGE-일반식1-일반식5, LAPPGTNIQI-일반식1-QEDKLK 또는 LAPPGTNIQI-일반식1- PYTSL의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 75 내지 129에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 130 내지 183에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서는 서열번호 298 내지 304에서 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
III.B. 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산
본 개시 내용은 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 개시 내용에 유용한 핵산은 상기 핵산이 세포에 형질도입시 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 상기 핵산 폴리펩타이드(또는 이의 임의의 변이체) 또는 융합 단백질을 코딩한다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 본 명세서에 기재된 것들과 같은 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에 유용한 단백질을 코딩한다. 일부 양태에서, 상기 핵산은 대상 또는 환자의 신체 내에서 지속적인 발현을 목적으로 하는, 특정 질환의 예방 또는 치료용 펩타이드를 코딩한다. 일부 양태에서, 상기 핵산은 서열번호 184와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 하기의 일반식 1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다:
<일반식 1>
X1-X2-X3-G-T-C-E-V-X4-A-X5-H-X6-C-C-N-X7-N-X8-I-E-E-X9-S-Q-T-X10-X11-C-S-C-X12-X13-G-X14-V-A-G-T-T-X15-X16-X17-P-S-C-V-X18-A-X19-I-V-X20-X21-X22-W-W-C-X23-M-X24-P-C-X25-X26-G-E-X27-C-K-X28-L-P-D-X29-X30-G-W-X31-C-X32-X33-G-X34-K-X35-K-T-T-X36-X37-X38-X39
상기 일반식 1에서,
X1은 존재하지 않거나, V, I 또는 L이고,
X2는 K, E, R 또는 Q이고,
X3은 G, T, Q, P 또는 A이고,
X4는 V 또는 I이고,
X5는 A, L, V 또는 I이고,
X6은 R 또는 L이고,
X7은 K, R 또는 Q이고,
X8은 R 또는 K이고,
X9는 R 또는 L이고,
X10은 V 또는 G이고,
X11은 K 또는 N이고,
X12는 F 또는 L이고,
X13은 P 또는 S이고,
X14는 Q 또는 K이고,
X15는 R, H 또는 Q이고,
X16은 A, N, S 또는 T이고,
X17은 A, Q, R, K 또는 T이고,
X18은 D 또는 E이고,
X19는 S 또는 A이고,
X20은 I, E, L, A 또는 V이고,
X21은 Q, G 또는 E이고,
X22는 K 또는 R이고,
X23은 H, Q 또는 E이고,
X24는 E, Q, N, D, S 또는 H이고,
X25는 L, V 또는 M이고,
X26은 E, D, P, L 또는 A이고,
X27은 E 또는 D이고,
X28은 V, T, A 또는 I이고,
X29는 L, N, R, Y, S 또는 Q이고,
X30은 S, K 또는 T이고,
X31은 S 또는 M이고,
X32는 S, A 또는 Y이고,
X33은 S, T 또는 R이고,
X34는 N 또는 H이고,
X35는 V 또는 I이고,
X36은 R 또는 K이고,
X37은 존재하지 않거나 V, A, G, M 또는 N이고,
X38은 존재하지 않거나 T, I, N, F 또는 S이고, 및
X39는 존재하지 않거나 R, H, V, K, I 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 하기의 일반식 2의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지) 및 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다:
<일반식 2>
X1-X2-H-H-K-A-X3-H
상기 일반식 2에서,
X1은 A 또는 V이고,
X2는 N 또는 I이고, 및
X3은 H 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 일반식2-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 하기의 일반식 3의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지) 및 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다:
<일반식 3>
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
상기 일반식 3에서,
X1은 A 또는 S이고,
X2는 L, T 또는 S이고,
X3은 Q, E 또는 H이고,
X4는 존재하지 않거나, P, L 또는 H이고,
X5는 P 또는 R이고,
X6은 T, S 또는 I이고,
X7은 A, P, T, S 또는 H이고,
X8은 T, A, S 또는 I이고,
X9는 V 또는 A이고, 및
X10은 L 또는 H이다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 일반식3-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 하기의 일반식 4의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지) 및 상기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다:
<일반식 4>
X1-X2
상기 일반식 4에서,
X1은 H 또는 Y이고, 및
X2는 Q, V 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 일반식4-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
일부 양태에서, 상기 핵산은 상기 일반식 1의 아미노산 서열에 추가하여 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다:
LHRP(서열번호 293);
LHQSGFTSGHFPHHRKLGE(서열번호 294); 또는
LAPPGTNIQI(서열번호 295).
일부 양태에서, 상기 핵산은 상기 일반식 1의 아미노산 서열에 추가하여 하기의 일반식5 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다:
<일반식 5>
X1-X2-X3
상기 일반식 5에서,
X1은 P 또는 G이고,
X2는 R 또는 H이고, 및
X3는 T, S 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
PYTSL(서열번호 296); 또는
QEDKLK(서열번호 297).
일부 양태에서, 상기 핵산은 LHRP-일반식1, LHQSGFTSGHFPHHRKLGE-일반식1 또는 LAPPGTNIQI-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다. 일부 양태에서, 상기 핵산은 일반식1-일반식5, 일반식1-PYTSL 또는 일반식1-QEDKLK의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다. 일부 양태에서, 상기 핵산은 LHRP-일반식1-일반식5, LHQSGFTSGHFPHHRKLGE-일반식1-일반식5, LAPPGTNIQI-일반식1-QEDKLK 또는 LAPPGTNIQI-일반식1- PYTSL의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 184 내지 238에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것이다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 239 내지 292에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것이다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 신호 서열을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 305 내지 311에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것이다.
IV. 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터
본 개시 내용은 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 핵산에 대해서는 III.B.에 기재된 바와 같다.
본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 이러한 벡터는 숙주 세포 및 치료적 개입을 타겟으로 하는 세포에서 재조합 발현에 유용하다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 전달에 유용한 벡터(예를 들어 외래 유전자(서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산)) 및 비번역 핵산 서열을 포함)는 바이러스 벡터를 포함한다. 본 개시 내용에서 벡터로 사용할 수 있는 바이러스의 예는 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 백시니아 바이러스, 랍도바이러스, 아데노바이러스, 헬퍼-의존적 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 배큘로바이러스 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 양태에서, 본 개시 내용에서 사용될 수 있는 벡터는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 벡터의 비제한적인 예는 플라스미드, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리오파지 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다.
일부 양태에서, 상기 벡터는 프로모터 서열, 인핸서 서열, 엑손 서열, 인트론 서열, 신호 서열 코딩 서열, 스플라이싱 공여체 서열 및 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 역전된 말단 반복(ITR) 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 서열을 더 포함한다.
일부 양태에서, 상기 인트론은 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 상기 인트론은 29개 내지 174개의 뉴클레오타이드로 구성된다. 일부 양태에서, 상기 인트론은 51개 내지 117개의 뉴클레오타이드로 구성된다.
일부 양태에서, 상기 인트론은 서열번호 57에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인트론은 서열번호 58에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인트론은 서열번호 59에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인트론은 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 인트론은 (i) 서열번호 1의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 58), (ii) 서열번호 1의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 59), (iii) 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 3), (iv) 서열번호 1의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 61), (v) 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 2), (vi) 서열번호 1의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 63), (vii) 서열번호 1의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 64), 또는 (viii) 서열번호 1의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 65)와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 상기 인트론은 (i) 서열번호 1의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 58), (ii) 서열번호 1의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 59), (iii) 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 3), (iv) 서열번호 1의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 61), (v) 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 2), (vi) 서열번호 1의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 63), (vii) 서열번호 1의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 64), 또는 (viii) 서열번호 1의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 65)를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 벡터는 하기의 구성을 포함한다:
(1) 서열번호 4에 나타낸 CMV 인핸서 서열;
(2) 서열번호 5 또는 6에 나타낸 CMV 프로모터 서열, 서열번호 7에 나타낸 EF-1α 프로모터 서열 또는 서열번호 8에 나타낸 치킨 β액틴 프로모터 서열로부터 선택되는 프로모터 서열;
(3) 서열번호 12에 나타낸 CMV E1 서열, 서열번호 13에 나타낸 EF-1α E1 서열 또는 서열번호 14 또는 15에 나타낸 치킨 β액틴 E1 서열로부터 선택되는 엑손 1(E1) 서열;
(4) 서열번호 9 또는 10에 나타낸 스플라이싱 공여체 서열; 및/또는
(5) 서열번호 11에 나타낸 EF-1α E2 서열.
일부 양태에서, 상기 AAV 벡터는 유전자 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 AAV 벡터는 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현에 사용하기 위한 것이다.
V. AAV
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)는 AAV를 사용하여 예를 들어 세포로 전달된다. 단일 가닥 DNA 바이러스로서 아데노-연관 바이러스(AAV)는 헬퍼-의존적 인간 파보바이러스이다. 상기 AAV 게놈은 약 4.7 kbp의 크기를 가지며 바이러스 복제와 바이러스 유전자의 발현에 관여하는 rep 유전자를 코딩하는 N-말단, 상기 바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 cap 유전자를 코딩하는 C-말단 및 각 말단에 약 145개의 염기가 삽입된 역반복말단(ITR)으로 이루어진다. 상기 145 bp 역반복말단(ITR)은 T자 모양의 구조를 갖고, 바이러스 유전체 복제시 복제원점의 기능을 하며, 1차적인 패키징 신호로 작용한다. 상기 ITR은 재조합 AAV(rAAV) 구축물을 만들 때 유일하게 필요한 시스 작용(cis-acting) 염기서열이다. 상기 IRT은 Rep 단백질 존재 하에서는 인핸서 활성을 갖지만, Rep 단백질이 없을 때에는 매우 약한 활성을 갖는다. 재조합 AAV 구축물에 외래 유전자를 클로닝할 때 이들 특징을 고려하여 인핸서, 프로모터, pA 등을 적절히 구성하여 발현 구축물을 제작한다(RJ Samulski and N Muzyczka, Annu. Rev. Virolo. 2014. 1:427-451). 4개의 단백질이 rep 유전자로부터 번역된다. 이들 단백질은 그 분자량에 따라 rep78, rep68, rep52 및 rep40으로 구분되며, AAV DNA 복제에 중요한 기능을 수행한다. Cap 유전자로부터는 4개의 단백질이 번역된다. 이중, VP1, VP2, VP3 단백질은 AAV 입자를 구성하는 구조단백질들이며, 조립-활성화 단백질(AAP, assembly-activating protein)은 상기 구조단백질들에 의한 AAV 입자의 형성(assembly)을 촉진한다. 아데노-연관 바이러스의 효율적 복제를 위해 아데노바이러스 혹은 헤르페스 심플렉스 바이러스 같은 헬퍼 바이러스로부터 유래한 일부 단백질들 및 RNA들을 필요로 한다(Muzyczka N. Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129, 1992).
AAV는 세포에 외래 DNA를 전달하기 위한 벡터로서 매력적이게 하는 독특한 특징을 가지고 있다. 배양물에서 세포의 AAV 감염은 일반적으로 비세포변성이었고, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 무증후성이면서 무증상이다. 나아가 AAV는 서로 다른 유형의 많은 포유류 세포를 감염시켜 생체내 서로 다른 많은 조직들을 표적으로 할 가능성이 있다. AAV는 또한 다른 형태의 유전자 전달에 비해 약한 면역 반응을 촉진하고 분열 및 정지 세포 모두에서 비통합 에피솜 벡터 DNA(non-integrating, episomal vector DNA)를 기반으로 지속 발현하는 것을 포함하여 유전자 전달을 위한 특히 매력적인 바이러스 시스템이게 하는 추가 장점을 갖고 있다. 또한 AAV는 아데노바이러스를 비활성화하는 데 사용되는 조건(수 시간 동안 56℃내지 65℃을 견디므로 rAAV-기반 백신의 저온 보존은 그다지 중요하지 않게 된다.
본 개시 내용에서 사용할 수 있는 아데노-연관 바이러스의 유형 또는 혈청형은 AAVrh.10(AAVrh10), AAV-DJ(AAVDJ), AAV-DJ8(AAVDJ8), AAV1, AAV2, AAV2G9, AAV3, AAV3a, AAV3b, AAV3-3, AAV4, AAV4-4, AAV5, AAV6, AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, AAV7, AAV7.2, AAV8, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV16.3, AAV24.1, AAV27.3, AAV42.12, AAV42-1b, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAV1-7/rh.48, AAV1-8/rh.49, AAV2-15/rh.62, AAV2-3/rh.61, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3-9/rh.52, AAV3-11/rh.53, AAV4-8/r11.64, AAV4-9/rh.54, AAV4-19/rh.55, AAV5-3/rh.57, AAV5-22/rh.58, AAV7.3/hu.7, AAV16.8/hu.10, AAV16.12/hu.11, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV106.1/hu.37, AAV114.3/hu.40, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV161.10/hu.60, AAV161.6/hu.61, AAV33.12/hu.17, AAV33.4/hu.15, AAV33.8/hu.16, AAV52/hu.19, AAV52.1/hu.20, AAV58.2/hu.25, AAVA3.3, AAVA3.4, AAVA3.5, AAVA3.7, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAVF3, AAVF5, AAVH2, AAVrh.72, AAVhu.8, AAVrh.68, AAVrh.70, AAVpi.1, AAVpi.3, AAVpi.2, AAVrh.60, AAVrh.44, AAVrh.65, AAVrh.55, AAVrh.47, AAVrh.69, AAVrh.45, AAVrh.59, AAVhu.12, AAVH6, AAVLK03, AAVH-1/hu.1, AAVH-5/hu.3, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG-9/hu.39, AAVN721-8/rh.43, AAVCh.5, AAVCh.5R1, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5R1, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAVhu.1, AAVhu.2, AAVhu.3, AAVhu.4, AAVhu.5, AAVhu.6, AAVhu.7, AAVhu.9, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.13, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.17, AAVhu.18, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44R1, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48R1, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.14/9, AAVhu.t19, AAVrh.2, AAVrh.2R, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.46, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.61, AAVrh.64, AAVrh.64R1, AAVrh.64R2, AAVrh.67, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh8R, AAVrh8R A586R 변이체, AAVrh8R R533A 변이체, AAAV, BAAV, 염소 AAV, 소 AAV, AAVhE1.1, AAVhEr1.5, AAVhER1.14, AAVhEr1.14, AAVhEr1.8, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhEr1.35, AAVhEr1.7, AAVhEr1.36, AAVhEr2.29, AAVhEr2.4, AAVhEr2.16, AAVhEr2.16, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhER1.23, AAVhEr3.1, AAV2.5T, AAV-PAEC, AAV-LK01, AAV-LK02, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK16, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV-LK19, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12, AAV-2-pre-miRNA-101, AAV-8h, AAV-8b, AAV-h, AAV-b, AAV SM 10-2, AAV Shuffle 100-1, AAV Shuffle 100-3, AAV Shuffle 100-7, AAV Shuffle 10-2, AAV Shuffle 10-6, AAV Shuffle 10-8, AAV Shuffle 100-2, AAV SM 10-1, AAV SM 10-8, AAV SM 100-3, AAV SM 100-10, B P61 AAV, B P62 AAV, B P63 AAV, AAVrh.50, AAVrh.43, AAVrh.62, AAVrh.48, AAVhu.19, AAVhu.11, AAVhu.53, AAV4-8/rh.64, AAVLG-9/hu.39, AAV54.5/hu.23, AAV54.2/hu.22, AAV54.7/hu.24, AAV54.1/hu.21, AAV54.4R/hu.27, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV128.1/hu.43, true type AAV(ttAAV), UPENN AAV 10 및 일본 AAV 10 혈청형을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 양태에서, 상기 아데노-연관 바이러스의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh10이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV2이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV5이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV8이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV9이다.
VI. 세포
일부 양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 비번역 핵산 서열을 포함) 중 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 제공한다. 예를 들어 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 외래 유전자 (예를 들어, 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산) 및 외래 유전자 발현용 비번역 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물로 형질도입, 형질감염 또는 형질전환된다.
어느 하나의 이론에 구속되지 않는 것은 아니지만, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포(예를 들어 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입됨)는 본 명세서에 기재된 외래 유전자에 의해 코딩되는 것(예를 들어, 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드)과 같은 단백질을 생산하기 위해 유용하다. 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 세포에서 상기 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질(“코딩된 단백질”)의 발현을 향상시킬 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포(예를 들어 외래 유전자 및 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입됨)는 기준 세포에 비해 상기 코딩된 단백질의 더 큰 발현을 일으킨다. 일부 양태에서, 상기 기준 세포는 해당 폴리뉴클레오타이드로 형질도입되지만 비번역 핵산 서열이 결여되어 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 시험관내에서 상기 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 특정 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 생체내에서(예를 들어 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 투여받은 대상에서) 코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 시험관내 및 생체내 모두에서 코딩된 단백질을 생산할 수 있다.
일부 양태에서, (예를 들어 시험관내에서) 외래 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 생산하기 위해 사용할 수 있는 세포는 숙주 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 “숙주 세포”는 상기 발현 구축물(예를 들어, AAV 벡터)로 형질도입되어 발현 구축물을 복제하거나 발현 구축물에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 생물의 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 “형질도입”은 형질감염과 형질전환을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 숙주 세포는 상기 발현 구축물에 의해 형질도입, 형질감염 또는 형질전환될 수 있다. 이 과정은 외생의 핵산분자가 숙주 세포 내에 전달되거나 도입되는 것을 의미한다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 상기 AAV 벡터를 포함하는 단리된 숙주세포이다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 상기 AAV 벡터로 형질전환된 단리된 숙주세포이다.
일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 트랜스제닉 포유동물 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 양태에서, 상기 원핵 세포는 박테리아 세포이다.
일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포이다. 일부 양태에서, 상기 곤충 세포는 Sf9이다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 포유동물 세포의 비제한적 예는 HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, HepG2, Hep3B, Huh-7, C8D1a, Neuro2A, CHO, MES13, BHK-21, COS7, COP5, A549, MCF-7, HC70, HCC1428, BT-549, PC3, LNCaP, Capan-1, Panc-1, MIA PaCa-2, SW480, HCT166, LoVo, A172, MKN-45, MKN-74, Kato-III, NCI-N87, HT-144, SK-MEL-2, SH-SY5Y, C6, HT-22, PC-12, NIH3T3 세포 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, (예를 들어 생체내에서) 본 명세서에 기재된 외래 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 생산하기 위해 사용할 수 있는 세포는 인간 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인간 세포는 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 투여 받은 대상의 세포이다. 특정 양태에서, 상기 인간 세포는 공여체(예를 들어 건강한 인간 대상)로부터 유래한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 AAV 벡터 또는 상기 AAV 벡터를 포함하거나 상기 AAV 벡터로 형질전환된 숙주세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
VII. 조성물
본 명세서는 상기 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 (a) 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함) 중 임의의 폴리뉴클레오타이드 및 (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다. 일부 양태에서, 본 명세서는 (a) 본 명세서에 기재된 벡터(예를 들어 rAAV) 및 (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다. 일부 양태에서, 본 명세서는 (a) 본 명세서에 기재된 세포 및 (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(예를 들어, 척추동물의 TAFA1 내지 TAFA4 서열)을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 일반식 1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 것이다:
<일반식 1>
X1-X2-X3-G-T-C-E-V-X4-A-X5-H-X6-C-C-N-X7-N-X8-I-E-E-X9-S-Q-T-X10-X11-C-S-C-X12-X13-G-X14-V-A-G-T-T-X15-X16-X17-P-S-C-V-X18-A-X19-I-V-X20-X21-X22-W-W-C-X23-M-X24-P-C-X25-X26-G-E-X27-C-K-X28-L-P-D-X29-X30-G-W-X31-C-X32-X33-G-X34-K-X35-K-T-T-X36-X37-X38-X39
상기 일반식 1에서,
X1은 존재하지 않거나, V, I 또는 L이고,
X2는 K, E, R 또는 Q이고,
X3은 G, T, Q, P 또는 A이고,
X4는 V 또는 I이고,
X5는 A, L, V 또는 I이고,
X6은 R 또는 L이고,
X7은 K, R 또는 Q이고,
X8은 R 또는 K이고,
X9는 R 또는 L이고,
X10은 V 또는 G이고,
X11은 K 또는 N이고,
X12는 F 또는 L이고,
X13은 P 또는 S이고,
X14는 Q 또는 K이고,
X15는 R, H 또는 Q이고,
X16은 A, N, S 또는 T이고,
X17은 A, Q, R, K 또는 T이고,
X18은 D 또는 E이고,
X19는 S 또는 A이고,
X20은 I, E, L, A 또는 V이고,
X21은 Q, G 또는 E이고,
X22는 K 또는 R이고,
X23은 H, Q 또는 E이고,
X24는 E, Q, N, D, S 또는 H이고,
X25는 L, V 또는 M이고,
X26은 E, D, P, L 또는 A이고,
X27은 E 또는 D이고,
X28은 V, T, A 또는 I이고,
X29는 L, N, R, Y, S 또는 Q이고,
X30은 S, K 또는 T이고,
X31은 S 또는 M이고,
X32는 S, A 또는 Y이고,
X33은 S, T 또는 R이고,
X34는 N 또는 H이고,
X35는 V 또는 I이고,
X36은 R 또는 K이고,
X37은 존재하지 않거나 V, A, G, M 또는 N이고,
X38은 존재하지 않거나 T, I, N, F 또는 S이고, 및
X39는 존재하지 않거나 R, H, V, K, I 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 80 내지 130개, 보다 바람직하게는 90 내지 120개, 가장 바람직하게는 91 내지 119개의 아미노산 서열로 구성된 것이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 2의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 2>
X1-X2-H-H-K-A-X3-H
상기 일반식 2에서,
X1은 A 또는 V이고,
X2는 N 또는 I이고, 및
X3은 H 또는 Q이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식2-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 3의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 3>
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
상기 일반식 3에서,
X1은 A 또는 S이고,
X2는 L, T 또는 S이고,
X3은 Q, E 또는 H이고,
X4는 존재하지 않거나, P, L 또는 H이고,
X5는 P 또는 R이고,
X6은 T, S 또는 I이고,
X7은 A, P, T, S 또는 H이고,
X8은 T, A, S 또는 I이고,
X9는 V 또는 A이고, 및
X10은 L 또는 H이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식3-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 4의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 4>
X1-X2
상기 일반식 4에서,
X1은 H 또는 Y이고, 및
X2는 Q, V 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식4-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
LHRP(서열번호 293);
LHQSGFTSGHFPHHRKLGE(서열번호 294); 또는
LAPPGTNIQI(서열번호 295).
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 5의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다:
<일반식 5>
X1-X2-X3
상기 일반식 5에서,
X1은 P 또는 G이고,
X2는 R 또는 H이고, 및
X3는 T, S 또는 L이다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함한다.
PYTSL(서열번호 296); 또는
QEDKLK(서열번호 297).
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 LHRP-일반식1, LHQSGFTSGHFPHHRKLGE-일반식1 또는 LAPPGTNIQI-일반식1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 일반식1-일반식5, 일반식1-PYTSL 또는 일반식1-QEDKLK의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 LHRP-일반식1-일반식5, LHQSGFTSGHFPHHRKLGE-일반식1-일반식5, LAPPGTNIQI-일반식1-QEDKLK 또는 LAPPGTNIQI-일반식1- PYTSL의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 75 내지 129에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 130 내지 183에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 신호 서열을 추가로 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 298 내지 304에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 재조합 아데노-연관 바이러스 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하되, 상기 재조합 아데노-연관 바이러스가 (a) AAV 8형 캡시드 단백질 및 (b) (i) 서열번호 184에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외래 유전자 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 조절 요소가 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 서열번호 4에 나타낸 CMV 인핸서 서열; (2) 서열번호 8에 나타낸 치킨 β액틴 프로모터 서열; (3) 서열번호 15에 나타낸 치킨 β액틴 엑손 1(E1) 서열; (4) 서열번호 10에 나타낸 치킨 β액틴 인트론의 스플라이싱 공여체 서열; (5) 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 57에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 비번역 핵산 서열; 및 (6) 서열번호 11에 나타낸 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 망막 또는 황반 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물이다.
일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반의 전체 또는 일부의 손상에 기인한 것이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환인 것이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막 또는 황반의 광수용체 세포(photoreceptor cells) 및/또는 망막색소상피(RPE) 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반병증, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기, 망막부종, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리, 유전성 망막질환 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성, Best 황반 이영양증, Sorsby 안저 이영양증, Mallatia Leventinese, Doyne 벌집 모양 망막 이영양증, 스타르가르트(Stargardt 병(Stargardt 황반 이영양증), 근시성 황반변성 또는 색소 상피 박리 관련 황반변성이다. 일부 양태에서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성이다. 일부 양태에서, 연령-관련 황반변성은 습성 또는 건성 연령-관련 황반변성이다. 일부 양태에서, 상기 망막병증은 망막 이영양증이다. 일부 양태에서, 상기 망막병증은 당뇨병성 망막병증이다. 일부 양태에서, 상기 당뇨병성 망막병증은 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 당뇨병성 황반병증, 당뇨병성 황반부종 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 유전성 망막 질환이다. 일부 양태에서, 상기 유전성 망막 질환은 망막색소변성증(Retinitis pigmentosa, RP), 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital Amaurosis), 스타르가르트병(Stargardt's disease), 코츠망막병증(Coats retinopathy), 원추세포 이상증(Cone dystrophy), 범맥락막위축(Choroideremia), 어셔 증후근(Usher syndrome), 베스트 질환(Best's Disease), X-연관 망막층간분리증(X-linked Retinoschisis) 또는 상세불명의 유전자 이상으로 인한 망막 이상증(Unspecified hereditary retinal dystrophy)이다.
본 개시 내용에서 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 사용되는 것들이다. 상기 약학적으로 허용되는 담체의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 개시 내용의 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제의 상세한 내용은 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에서 찾을 수 있다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제제화된다. 적합한 비경구 투여 경로의 예는 정맥내 주입, 경피 투여, 피하 주입, 근육내 주입, 안내(예를 들어, 테논낭하(sub-Tenon), 결막하, 맥락막상(suprachoroidal), 맥락막위공간, 망막하(subretinal), 유리체내 및 유사 위치에 전달할 수 있는 임의의 투여) 주입, 점안 투여, 뇌실내 주입, 척추강내 주입, 양막 내 주입, 동맥내 주입, 관절광내 주입, 심장내 주입, 음경해면체내 주입, 뇌내 주입, 뇌수조 주입, 관상내 주입, 두개내 주입, 경막내 주입, 경막외 주입, 해마내 주입, 비강내 주입, 골강내 주입, 복강내 주입, 흉강내 주입, 척수내 주입, 흉곽내 주입, 흉선내 주입, 자궁내 주입, 질내 주입, 심실내 주입, 방광내 주입, 결막하 주입, 종양내 주입, 국소 주입, 복강 주입 및 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 측면에 있어서, 안내 투여는 맥락막상(suprachoroidal), 망막하(subretinal), 유리체내 투여를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 0.0001 내지 100 mg/kg의 1일 투여량으로 투여된다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 제공되거나 다용량 용기에 분배될 수 있다. 상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수 있다. 상기 제형은 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.
VIII. 키트
본 명세서는 또한 본 명세서에 개시된 하나 이상의 폴리펩타이드, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함), 본 명세서에 개시된 하나 이상의 벡터(예를 들어 AAV 벡터), 본 명세서에 개시된 하나 이상의 세포(예를 들어, 상기 AAV 벡터를 포함하거나 상기 AAV 벡터로 형질전환된 숙주세포), 본 명세서에 개시된 임의의 조성물 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 키트를 개시한다. 일부 양태에서, 상기 키트는 사용 설명서를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "키트" 및 "시스템"은 일부 양태에서 하나 이상의 다른 유형의 요소 또는 성분(예를 들어 다른 유형의 생화학적 시약, 용기, 시판용 패키징과 같은 패키지, 사용 설명서 등)과 조합한 본 명세서에 개시된 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 벡터(예를 들어 AAV 벡터), 본 명세서에 개시된 하나 이상의 숙주 세포, 본 명세서에 개시된 임의의 약제학적 조성물 또는 이들의 임의의 조합을 지칭하도록 의도된다.
IX. 용도 및 방법
IX.A. 생산 방법
본 명세서는 또한 외래 유전자(예를 들어, 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 서열번호 184와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 핵산)에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 개시한다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 적합한 조건에서 본 명세서에 기재된 세포(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입됨)를 배양하고 코딩된 단백질을 회수하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 외래 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 분자를 포함)를 필요로 하는 대상에 투여하여 상기 대상에서 코딩된 폴리펩타이드를 생산하는 것을 포함한다. 폴리펩타이드를 생산하는 이러한 생체내 방법에 관한 추가 개시 내용은 본 개시 내용의 다른 곳에 제공되어 있다(예를 들어 치료적 용도 참조).
일부 양태에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 이러한 재조합 AAV를 생산하는 방법은 본 명세서에 기재된 AAV 벡터로 형질감염된 세포를 재조합 AAV를 생산하는 조건에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 생산된 재조합 바이러스 입자를 분리하는 단계를 더 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 바이러스 입자를 제공한다.
일부 양태에서, 상기 재조합 바이러스 입자는 (i) 상기 외래 유전자를 포함하는 AAV 벡터(예를 들어 도 6b 참조) 및 (ii) rep 및 cap 유전자를 함유한 구축물로 세포를 형질도입하는 단계를 포함하여 생산할 수 있다. 추가적으로, (iii) 외래 유전자를 숙주 세포에 형질도입하기 위한 헬퍼 구축물을 사용하여 제작할 수 있다. 이러한 양태에서, 상기 헬퍼 구축물은 AAV 게놈 복제 및 유전자 전사를 촉진하는 E2A 유전자, AAV mRNA가 핵으로부터 세포질로 이동할 수 있도록 하는 E4 유전자 및 번역을 조절하는 역할을 하는 2개의 VA RNA를 생성하는 VA 영역을 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 상술한 3개의 구축물은 숙주 세포에 형질도입을 위한 2개의 구축물에 의해 대체될 수 있다. 이러한 양태에서, AAV 구축물은 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하고, 별도의 구축물은 상기 rep 및 cap 유전자, E2A 유전자, E4 유전자 및 VA 영역을 포함한다. 본 명세서에 기재된 AAV 입자를 생산하기 위한 추가 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 각각 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 Clement et al., Mol Ther Methods Clin Dev 3: 16002(2016년3월); Clark, Kidney Int. 61: S9-15(2002년1월); 및 Xiao et al., J Virol 72(3): 2224-32(1998년3월)를 참조할 것.
본 명세서는 또한 (a) 캡시드 단백질 및 (b) 상기 AAV 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 개시한다.
IX.B. 치료적 용도
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 핵산 (예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열 포함), 이러한 핵산을 보유한 벡터 및 재조합 바이러스(예를 들어 rAAV), 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포 및 본 명세서에 기재된 방법은 많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다. 예를 들어 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 벡터, 예를 들어 AAV 벡터는 배양물, 시험관내 또는 생체외에서 세포에 또는 인간 대상, 예를 들어 생체내 투여되어 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 본 명세서에 기재된 재조합 발현 구축물 또는 벡터, 본 명세서에 기재된 세포, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 또는 본 명세서에 기재된 재조합 바이러스의 치료용 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본 명세서는 필요로 하는 대상에서 외래 유전자를 발현시키는 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함), 본 명세서에 개시된 벡터, 본 명세서에 개시된 재조합 바이러스(예를 들어 rAAV), 본 명세서에 개시된 세포 또는 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하되, 상기 투여 후 대상에서 외래 유전자의 발현이 증가되는 방법을 개시한다.
본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열은 상기 외래 유전자가 번역될 때 상기 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 개시 내용은 세포에서 외래 유전자의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포를 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들 또는 재조합 바이러스들(예를 들어 rAAV) 중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 접촉을 생체외 또는 생체내에서 진행할 수 있다. 상기 접촉을 생체내에서 진행할 때 상기 방법은 접촉 전에 대상에 상기 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들 또는 재조합 바이러스들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 접촉 후 외래 유전자의 발현은 기준 발현에 비해 적어도 약 1배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배 또는 적어도 약 10배 이상 증가한다. 일부 양태에서, 상기 기준 발현은 접촉 전 세포 내 외래 유전자의 발현이다. 일부 양태에서, 상기 기준 발현은 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스(예를 들어 비번역 핵산 서열이 결여되어 있거나 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함)와 접촉하지 않은 해당 세포 내 외래 유전자의 발현이다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 필요로 하는 대상에서 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 상기 폴리펩타이드들, 상기 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들, 세포들, 재조합 바이러스들 또는 약제학적 조성물들 중 임의의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 재조합 바이러스 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용으로부터 명백한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 조성물(예를 들어 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 발현 구축물, 세포, 약제학적 조성물 또는 재조합 바이러스)은 예를 들어 외래 유전자를 변형시킴으로써 임의의 대상 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 추가 치료제(예를 들어, 혈관 내피세포 성장 인자("VEGF")의 저해제)를 상기 대상에 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 추가 치료제는 상기 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 재조합 바이러스 또는 약제학적 조성물의 투여와 동시, 투여 전, 투여 후 상기 대상에 투여할 수 있다.
본 개시 내용에 의해 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환은 한정되지 않으며 약물의 투여 횟수를 줄일 필요가 있는 모든 질환을 포함한다. 이러한 질환의 비제한적인 예는 망막 또는 황반 질환을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반병증, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리, 유전성 망막질환 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에 의해 예방 또는 치료할 수 있는 망막 또는 황반 질환은 황반변성을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함한다. 연령-관련 황반변성은 건성(위축성) 황반변성과 습성(신생혈관성 또는 삼출성) 황반변성으로 나눌 수 있다. 연령-관련 황반변성은 초기 AMD, 중기 AMD 및 후기 또는 진행성 AMD(지도 모양 위축)로 나눌 수도 있다. 일부 양태에서, 본 개시 내용에 의해 예방 또는 치료할 수 있는 망막 또는 황반 질환은 당뇨병성 망막병증을 포함한다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR)이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 당뇨병성 황반병증이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 당뇨병성 황반부종이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 망막 내의 허혈성 손상과 관련된 임의의 망막병증이다. 달리 명시되지 않는 한, 본 개시 내용은 모든 형태의 AMD 및/또는 당뇨병성 망막병증을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 지속적인 외래 유전자 발현을 달성할 수 있는 유전자 치료제 또는 질환의 예방 또는 치료용 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 바이러스 전달 시스템을 사용하면 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년 또는 약 10년 이상의 간격으로 본 명세서에 기재된 조성물의 투여가 가능하다. 일부 양태에서, 상기 간격은 약 2 내지 약 3개월이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 약 6개월이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 약 1년이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 적어도 약 1년이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 적어도 약 2년이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 적어도 약 3년이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 적어도 약 4년이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 적어도 약 5년이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 적어도 약 10년이다. 즉, 본 명세서에 기재된 바이러스 전달 시스템을 사용하면 상기 조성물의 투여 횟수를 획기적으로 감소시켜 의사, 환자 또는 대상으로 하여금 상기 조성물의 반복 투여에 의해 초래되는 불편함을 피할 수 있게 한다. 환자의 증상 또는 필요에 따라, 상기 조성물을 초기에는 1 내지 2주 간격으로 적어도 2 내지 3회 투여할 수 있고, 그 다음에는 2 내지 3개월마다, 6개월마다 또는 1년 이상마다 또는 2 내지 10년 이상마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 TAFA 단백질(예를 들어, TAFA1 내지 TAFA4)의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 TAFA 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 a및 상기 AAV 벡터와 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자를 제공한다.
(iii) 본 발명의 AAV 벡터, 재조합 바이러스 또는 이를 포함하는 조성물은 손상된 망막을 회복시킴으로써, 망막 또는 황반질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 이들 및/또는 다른 양태 및 이점들은 첨부 도면을 참고로 하여 상기 양태들의 후술하는 설명으로부터 분명하고 더욱 용이하게 이해될 것이다:
도 1은 본 명세서에 기재된 pAAV-eGFP 발현 구축물의 개열지도를 보여주고 있다.
도 2a 및 2b는 EF-1α 프로모터("CEE-FL")와 함께 전장 EF-1α 인트론을 포함한 발현 구축물로 형질도입된 세포에서 eGFP의 발현 증가를 보여주고 있다. 대조군 세포는 EF-1α 인트론("CE")이 결여된 해당 발현 구축물로 형질도입되었다. 도 2a에서는 ITR-결여 동물 세포 발현 구축물을 사용하였다. 도 2b에서는 ITR-함유 pAAV 발현 구축물을 사용하였다. 도 2a 및 2b 모두에서, 다음과 같은 형질도입된 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B) 내 eGFP 발현이 나타나 있다.
도 3a, 3b 및 3c는 다양한 프로모터("CCE-FL")와 함께 전장 EF-1α 인트론을 포함한 발현 구성물로 형질도입된 세포에서 eGFP의 발현을 보여주고 있다. 대조군 세포는 EF-1α 인트론이 결여된 해당 발현 구축물로 형질도입되었다. 도 3a에서, CMV 인핸서와 CMV 프로모터의 조합을 동물 세포 발현 구축물(즉, ITR 결여)에 삽입하여 상기 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. 도 3b에서, CMV 인핸서 및 CMV 프로모터의 조합을 pAAV 발현 구축물에 삽입하여 상기 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. 도 3c에서는, 상기 세포를 CMV 인핸서 및 치킨-β 액틴 프로모터의 조합을 포함한 동물 세포 발현 구축물로 형질도입하였다. 도 3a, 3b 및 3c 각각에서, 다음과 같은 형질도입된 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B) 내 eGFP 발현이 나타나 있다.
도 4a 및 4b는 유전자 발현에 대한 다양한 EF-1α 인트론 단편 서열(즉, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열)의 증가 또는 감소 효과를 보여주고 있다. 도 4a는 EF-1α 인트론 서열을 순차적으로 결실시킴으로써 제조된 일련의 CEE 구축물을 개략적으로 보여주고 있다. 나타낸 각각의 구축물은 다음을 포함하였다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) CMV 프로모터 일부(5' 말단으로부터 처음 31개 염기쌍) 및 EF-1α 프로모터(201개 염기쌍)를 포함한 프로모터; 및 (3) EF-1α 엑손 1(E1) 서열(29개 염기쌍). 대조군 "CE" 구축물은 EF-1 알파 인트론 서열을 포함하여 어떠한 추가 성분도 포함하지 않았다. 다른 구축물들은 다음과 같은 추가 성분들을 더 포함하였다: (4) 전장 EF-1 알파 인트론 서열(즉, 서열번호 제1서열)의 5'-말단으로부터 처음 19개의 염기쌍으로 이루어진 스플라이스 공여체 서열; (5) EF-1α 인트론 서열; 및 (6) EF-1α 엑손 2(E2) 서열(9개 염기쌍). 상기 EF-1α 인트론 서열은 전장 서열(924개 염기쌍)("CEE-FL") 또는; (ii) 서열번호 제1서열의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(355개 염기쌍)("CEE-T2"); (iii) 서열번호 제1서열의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(204개 염기쌍)("CEE-T3"); (iv) 서열번호 제1서열의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(117 염기쌍)("CEE-T3.1"); (v) 서열번호 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(95개 염기쌍)("CEE-T3.1.1"); (vi) 서열번호 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(73개 염기쌍)("CEE-T3.1.2"); (vii) 서열번호 제1서열의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(51개 염기쌍)("CEE-T3.2"); 및 (viii) 서열번호 제1서열의 896번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(29개 염기쌍)("CEE-T4")를 포함하였다. 상기 구축물 각각의 총 길이는 우측에 제공되어 있다. 도 4b는 5개의 서로 다른 세포주(HeLa, Hep3B, Huh-7, ARPE-19 및 RPE-1)에서 eGFP(즉, 외래 유전자) 발현에 대한 서로 다른 EF-1α 인트론 서열(전장 또는 결실됨)의 효과를 보여주고 있다. ARPE-19 및 RPE-1 세포는 망막으로부터 유래되었다. Huh-7 및 Hep3B 세포는 간으로부터 유래되었다. HeLa 세포는 자궁경부로부터 유래되었다. eGFP 발현은 CEE-FL 구축물을 사용하여 외래 유전자로 형질도입된 세포에서 관찰된 발현율(%)로서 나타내었다. "ns" = 유의성 없음. "**" = p<0.01 및 "***" = p<0.001.
도 5a, 5b, 5c 및 5d는 외래 유전자 발현을 증가시키는 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1(즉, 서열번호 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(95개 염기쌍) 및 T3.1.2(즉, 서열번호 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(73개 염기쌍)의 능력을 보여주고 있다. 도 5a는 다음과 같은 추가 성분과 함께 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 및 T3.1.2를 포함한 일련의 CAE 구축물을 개략적으로 보여주고 있다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) 치킨 β-액틴 프로모터(279개 염기쌍); (3) 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열(32개 염기쌍); (4) EF-1α 엑손 1(E1) 서열(29개 염기쌍); (5) 전장 EF-1α 인트론 서열(즉, 서열번호 제1서열)의 5'-말단으로부터 처음 19개의 염기쌍으로 이루어진 스플라이싱 공여체 서열; 및 (6) EF-1α 엑손 2(E2) 서열(9개 염기쌍). 대조군 "CA" 구축물은 CMV 인핸서, 치킨 β-액틴 프로모터 및 치킨 β-액틴 E1 서열만을 포함하였다. 대조군 "CAE-FL" 구축물은 전장 EF-1α 인트론 서열을 포함하였다. 상기 구축물의 총 길이는 좌측에 제공되어 있다. 도 5b는 CAE-T3.1.1 및 CAE-T3.1.2 구축물을 사용하여 형질도입된 HeLa(좌측 그래프) 및 ARPE-19(우측 그래프) 세포에서 eGFP(즉, 외래 유전자) 발현을 보여주고 있다. 유전자 발현은 CA 구축물(즉, EF-1α 인트론 서열 결여)을 사용하여 형질도입된 해당 세포에서의 발현율(%)로 나타내었다. 도 5c는 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 또는 T3.1.2 및 치킨 β-액틴 인트론 단편을 모두 포함하는 일련의 하이브리드 인트론 CA 구축물(즉, CA-T3.1.1 및 CA-T3.1.2 구축물)을 개략적으로 보여주고 있다. 상기 2개의 구축물은: (1) CMV 인핸서; (2) 치킨 β-액틴 프로모터; (3) 치킨 β-액틴 E1 서열; 및 (4) EF-1α E2 서열을 추가로 포함하였다. 대조군 "CAG-FL" 구축물은 다음을 포함하였다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) 치킨 β-액틴 프로모터(279개 염기쌍); (3) 치킨 β-액틴 E1 서열(93개 염기쌍); (4) 키메라 인트론(치킨 β-액틴 및 토끼 β-글로빈의 인트론 포함)(924개 염기쌍); 및 (5) 토끼 β-글로빈 엑손 3(E3) 서열(48개 염기쌍). "CA" 구축물은 도 5a에 기재된 것과 동일하다. 도 5d는 구축물 CA-T3.1.1 및 CA-T3.1.2를 사용하여 형질도입된 HeLa(좌측 그래프) 및 Hep3B(우측 그래프) 세포에서 eGFP 발현을 보여주고 있다. 유전자 발현은 CA 구축물(즉, EF-1α 인트론 서열 결여)을 사용하여 형질도입된 해당 세포에서 발현율(%)로 나타내었다.
도 6은 AAV8을 제조하기 위한 AAV 구축물의 개열지도로, 도 6a는 트랜스진(transgene)을 포함하지 않은 pAAV 구축물이고, 도 6b는 마우스 TAFA4 유전자를 transgene으로 포함하는 pAAV-mTAFA4 구축물이다.
도 7은 NaIO3 유도 망막 손상 모델에 대조군(control AAV8) 혹은 실험군(AAV8.mouse TAFA4)을 망막하 투여 시 망막 손상의 개선 효능을 형광안저혈관조영술(fluorescence angiography, FA)로 분석한 결과이다. OD(oculus dexter)는 오른쪽 눈, OS(oculus sinister)는 왼쪽 눈을 의미한다.
도 8은 대조군(control AAV8) 혹은 실험군(AAV8.mouse TAFA4) 간의 electroretinogram (ERG)의 A-wave 및 B-wave amplitude의 변화 폭을 측정한 결과이다.
도 9는 NaIO3 투여 전/후의 TAFA4 발현량 및 실험군 투여 후의 TAFA4 mRNA발현량을 상대적으로 비교한 결과이다.
도 10은 full length TAFA4 단백질의 종간 서열 동일성을 비교한 결과이다.
도 11은 NaIO3 유도 망막 손상 모델에 대조군(control AAV8) 혹은 실험군(AAV8.human TAFA4, AAV8.gecko TAFA4, AAV8.fish TAFA4)을 망막하 투여 시 망막 손상의 개선 효능을 형광안저혈관조영술(fluorescence angiography, FA)로 분석한 결과이다. OD(oculus dexter)는 오른쪽 눈, OS(oculus sinister)는 왼쪽 눈을 의미한다.
도 12는 대조군(control AAV8) 및 실험군(AAV8.human TAFA4, AAV8.gecko TAFA4, AAV8.fish TAFA4) 간의 electroretinogram (ERG)의 A-wave 및 B-wave amplitude의 변화 폭을 측정한 결과이다.
도 13은 신호 서열에 따른 TAFA4의 mRNA 와 단백질 발현을 비교한 결과이다.
도 14는 NaIO3 유도 망막 손상 모델에 대조군(control AAV8) 혹은 실험군(AAV8.TAFA1, AAV8.TAFA2, AAV8.TAFA3, AAV8.TAFA4)을 망막하 투여 시 망막 손상의 개선 효능을 형광안저혈관조영술(fluorescence angiography, FA)로 분석한 결과이다. OD(oculus dexter)는 오른쪽 눈, OS(oculus sinister)는 왼쪽 눈을 의미한다.
도 15는 대조군(control AAV8) 및 실험군(AAV8.TAFA1, AAV8.TAFA2, AAV8.TAFA3, AAV8.TAFA4) 간의 electroretinogram (ERG)의 A-wave 및 B-wave amplitude의 변화 폭을 측정한 결과이다.
도 16은 성숙(mature) TAFA1 단백질의 종간 서열 동일성을 비교한 결과이다.
도 17은 성숙(mature) TAFA2 단백질의 종간 서열 동일성을 비교한 결과이다.
도 18은 성숙(mature) TAFA3 단백질의 종간 서열 동일성을 비교한 결과이다.
도 19은 성숙(mature) TAFA4단백질의 종간 서열 동일성을 비교한 결과이다.
도 20는 full length TAFA1, TAFA2, TAFA3, TAFA4의 종간 아미노산 서열 동일성을 비교한 결과이다. 도 20a는 1~70번의 아미노산 서열, 도 20b는 71~140번의 아미노산 서열, 도 20c는 141~210번의 아미노산 서열, 도 20d는 211~244번의 아미노산 서열에 대한 비교이다.
도 21은 인간의 TAFA1, TAFA2, TAFA3, TAFA4의 성숙 단백질(mature protein)의 서열 동일성에 대한 비교 결과이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
재료 및 방법
실시예 1. 인핸서-프로모터-인트론 서열을 포함하지 않는 pAAV-eGFP 구축물 제조
실시예 1-1. bGH 폴리아데닐화 신호 서열의 삽입
pcDNA5/FRT/TO 구축물(Invitrogen, USA, Cat No. V6520-20)을 주형으로 하고 oligo #001, #002를 이용해서 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호 A 서열(poly A) 단편을 확보하였다. 다음으로 pAAV-MCS-무프로모터 플라스미드(Cellbiolabs, USA, Cat No. VPK-411)의 BglII/BstEII 부위를 사용하여 인간 성장 호르몬(hGH) poly A를 제거하고 bGH poly A를 삽입하였다.
실시예 1-2. eGFP의 삽입
pUCIDT-KAN-eGFP 구축물(GeneArt, Germany)에서 유래한 인간 코돈 최적화 eGFP 유전자를 확보하여 이를 실시예 1-1에서 제조한 pAAV-bGH 구축물의 BamHI/HindIII 부위에 클로닝하였다.
실시예 1-3. WPRE 서열의 삽입
pUC57-WPRE 구축물(GenScript, USA)에서 우드척 간염 바이러스 후전사 조절 요소(WPRE) 서열을 확보하여 이를 실시예 1-2에서 제조한 pAAV-eGFP-bGH 구축물의 HindIII/BglII 부위에 클로닝하였다.
실시예 1-4. 4 카피(copy)의 miRNA142-3p 타겟서열의 삽입
Oligo #003과 #004을, 그리고 #005과 #006를 각각 어닐링(annealing)하여 각각 2 카피의 miRNA142-3p 타겟서열을 포함하는 두 개의 DNA단편을 준비하였다. 두개의 짧은 DNA단편을 실시예 1-3에서 제조한 pAAV-eGFP-WPRE-bGH 구축물의 HindIII/SalI 부위에 클로닝하여 도합 4 카피의 miRNA142-3p 타겟서열이 삽입되도록 하였다. 이를 통해 인핸서-프로모터-인트론 서열을 포함하지 않는 pAAV-eGFP 구축물을 제조하였다(도 1).
실시예 2. 여러 종류의 인핸서-프로모터-인트론 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-1. CEE 시리즈(CEE-FL, CEE-T2, -T3, -T3, -T3.1, -T3.1.1, -T3.1.2, -T3.2, -T4) 및 CE 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-1-1. CEE-FL(전장) 염기 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ3_PEM 구축물(GeneArt, Germany)로부터 CEE-FL(CMV 인핸서(서열번호 4)-CMV 프로모터의 31 bp(서열번호 5)-EF-1α 프로모터(서열번호 7)-EF-1α 엑손 1의 29 bp(서열번호 13)-EF-1α 인트론(서열번호 1)-EF-1α 엑손 2의 9 bp(서열번호 11)) DNA 단편을 확보하였고 이를 실시예 1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-1-2. CEE-T2 염기 서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #007/008 조합과 #009/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly®(NEB, USA, Cat No. E2611)를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T2 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-3. CEE-T3 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #011/008 조합과 #012/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T3 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-4. CEE-T3.1 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #013/008, #014/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T3.1 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-5. CEE-T3.2 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #015/008, #016/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T3.2 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-6. CEE-T4 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #017/008, #018/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T4 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-7. CEE-T3.1.1 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
pUC57-T3.1.1 구축물(GenScript, USA)로부터의 CEE-T3.1.1 염기서열을 확보하여 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-1-8. CEE-T3.1.2 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
pUC57-T3.1.2 구축물(GenScript, USA)로부터의 CEE-T3.1.2 염기서열을 확보하여 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-1-9. CE 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #019, #020을 이용하여 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물로부터 PCR을 통해 CE단편을 확보하고 이를 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-2. CCE-FL, CC 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-2-1. CCE-FL 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ4_PME 구축물(GeneArt, Germany)로부터 CCE-FL(CMV 인핸서(서열번호 4)-CMV 프로모터(서열번호 6)-CMV 엑손 1의 30 bp(서열번호 12)-EF-1α 엑손 1의 29 bp(서열번호 13)-EF-1α 인트론(서열번호 1)-EF-1α 엑손 2의 9 bp(서열번호 11) 서열의 DNA 단편을 확보하여 실시예 1에서 확보한 pAAV-eGFP 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-2-2. CC서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #019, #021을 이용하여 실시예 2-2-1에서 제조한 구축물로부터 PCR을 통해 CC 단편을 확보하고 이를 실시예 2-2-1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-3. CAG-FL, CA-T3.1.1, CA-T3.1.2, CA 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-3-1. CAG-FL 서열을 포함하는 구축물의 제조
pCAG-Neo 구축물(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan, Cat No. 163-25601)로부터 CAG 단편을 확보하여 실시예 2-1에서 확보한 구축물의 SnaBI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-3-2. CA 서열을 포함하는 구축물의 제조
pUC57-CA 구축물(GenScript, USA)로부터 CA 단편을 확보하여 실시예 2-3-1로부터 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-3-3. CA-T3.1.1 서열을 포함하는 구축물의 제조
oligo #022, #023을 이용해 실시예 2-1-7에서 확보한 구축물로부터 PCR을 통해 T3.1.1 단편을 확보하여 이를 실시예 2-3-1로부터 제조한 구축물의 AfeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-3-4. CA-T3.1.2 서열을 포함하는 구축물의 제조
oligo #024와 #025을 어닐링하여 통해 확보한 T3.1.2 단편을 확보하여 이를 실시예 2-3-1로부터 제조한 구축물의 AfeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-4. CAE-FL, CAE-T3.1.1, CAE-T3.1.2 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-4-1. CAE-FL 서열을 포함하는 구축물의 제조
pUC57-CAE 구축물(GenScript, USA)로부터 CAE(CMV 인핸서(서열번호 4)-치킨 β액틴 프로모터(서열번호 8)-치킨 β액틴 엑손 1의 32 bp(서열번호 14)-EF-1α 엑손 1의 29 bp(서열번호 13)-EF-1α 인트론 924 bp(서열번호 1)-EF-1α 엑손 2의 9 bp(서열번호 11)) 단편을 확보하여 실시예 1로부터 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-4-2. CAE-T3.1.1 서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #026, #027를 이용하여 실시예 2-1-7에서 제조한 구축물로부터 CAE-T3.1.1 단편을 확보하여 실시예 2-1-7에서 제조한 구축물의 KpnI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-4-3. CAE-T3.1.2 서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #026, #027를 이용하여 실시예 2-1-8에서 제조한 구축물로부터 CAE-T3.1.2 단편을 확보하여 실시예 2-1-8에서 제조한 구축물의 KpnI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-5. 애플리버셉트 유전자를 포함하는 pAAV 구축물들의 제조
Oligo #028, #029을 이용하여 pcDNA3.1(+)-hIgG-애플리버셉트 구축물(GenScript, USA) 로부터 PCR로 확보한 애플리버셉트 유전자(서열번호 23) DNA 단편을 실시예 2-3-3으로부터 제조한 구축물의 BamHI/HindIII site에 각각 클로닝 하였다.
실시예 2-6. TAFA 1, 2, 3 및 4 서열을 포함하는 구축물의 제조
실시예 2-6-1. mouse TAFA4 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMA-RQ-mouse TAFA4 구축물(Geneart, Thermo Fisher Scientific, USA)로부터 제한효소 BamHⅠ/HindⅢ로 확보한 mouse TAFA4(mTAFA4)의 유전자 DNA 단편을 실시예 2-5에서 제조한 구축물(CA-T3.1.1 단편을 포함)의 BamHⅠ/HindⅢ 부위에 클로닝하였다. mouse TAFA4 유전자는 서열번호 305를 mouse에 대해 코돈 최적화하여 사용하였다.
실시예 2-6-2. human TAFA4 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMA-RQ-human TAFA4 구축물(Geneart, Thermo Fisher Scientific, USA)로부터 제한효소 BamHⅠ/HindⅢ로 확보한 human TAFA4(hTAFA4)의 유전자 DNA 단편을 실시예 2-5에서 제조한 구축물(CA-T3.1.1 단편을 포함)의 BamHⅠ/HindⅢ 부위에 클로닝하였다. human TAFA4 유전자는 서열번호 306을 인간에 대해 코돈 최적화하여 사용하였다.
실시예 2-6-3. gecko TAFA4 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ-gecko TAFA4 구축물(Geneart, Thermo Fisher Scientific, USA)로부터 제한효소 BamHⅠ/HindⅢ로 확보한 gecko TAFA4(gTAFA4)의 유전자 DNA 단편을 실시예 2-6-2에서 제조한 구축물(CA-T3.1.1 단편을 포함)의 BamHⅠ/HindⅢ 부위에 클로닝하였다. gecko TAFA4 유전자는 서열번호 307을 mouse에 대해 코돈 최적화하여 사용하였다.
실시예 2-6-4. fish TAFA4 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ-fish TAFA4 구축물(Geneart, Thermo Fisher Scientific, USA)로부터 제한효소 BamHⅠ/HindⅢ로 확보한 fish TAFA4의 유전자 DNA 단편을 실시예 2-6-2에서 제조한 구축물(CA-T3.1.1 단편을 포함)의 BamHⅠ/HindⅢ 부위에 클로닝하였다. fish TAFA4 유전자는 서열번호 308을 mouse에 대해 코돈 최적화하여 사용하였다.
실시예 2-6-5. human TAFA1 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ-human TAFA1 구축물(GeneArt, Germany)로부터 제한효소 BamHⅠ/HindⅢ로 확보한 human TAFA1의 유전자 DNA 단편을 실시예 2-6-2에서 제조한 구축물(CA-T3.1.1 단편을 포함)의 BamHⅠ/HindⅢ 부위에 클로닝하였다. human TAFA1 유전자는 서열번호 309를 인간에 대해 코돈 최적화하여 사용하였다.
실시예 2-6-6. human TAFA2 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ-human TAFA2 구축물(GeneArt, Germany)로부터 제한효소 BamHⅠ/HindⅢ로 확보한 human TAFA2의 유전자 DNA 단편을 실시예 2-6-2에서 제조한 구축물(CA-T3.1.1 단편을 포함)의 BamHⅠ/HindⅢ 부위에 클로닝하였다. human TAFA2 유전자는 서열번호 310을 인간에 대해 코돈 최적화하여 사용하였다.
실시예 2-6-7. human TAFA3 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ-human TAFA3 구축물(GeneArt, Germany)로부터 BamHⅠ/HindⅢ로 확보한 human TAFA3의 유전자 DNA 단편을 실시예 2-6-2에서 제조한 구축물(CA-T3.1.1 단편을 포함)의 BamHⅠ/HindⅢ 부위에 클로닝하였다. human TAFA3 유전자는 서열번호 311을 인간에 대해 코돈 최적화하여 사용하였다.
실시예 2-7. 염기서열의 확인
클로닝을 이용하여 확보한 모든 구축물들은 염기서열 분석(DNA sequencing)(마크로젠, Korea, 또는 바이오닉스, Korea)을 통하여 염기 서열을 확인하였다.
실시예 3. 세포배양
HEK293과 HeLa 세포주는 MEM 배지(Gibco, USA, Cat No. 42360-032), ARPE-19 세포주는 DMERM/F12 배지(Gibco, USA, Cat No. 11330-032), RPE-1과 Hep3B 세포주는 DMEM 배지(Gibco, USA, Cat. No. 10569-010)를 이용하여 5% CO2, 37℃조건으로 습윤 배양하였으며, 모든 배지에 10% 우태아혈청(FBS, Gibco, USA, Cat No. 16000-044), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gioco, USA, Cat No. 15140-163)을 첨가하였다. Expi293 세포주는 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 Expi293 배지(Gibco, USA, Cat. No. A14351-01)를 이용하여 8% CO2, 37℃조건으로 250 rpm으로 흔들며 습윤 배양하였다.
실시예 4. 형질도입(transduction)
실시예 4-1. 부착세포의 형질도입
형질도입을 위해, 각 세포주들을 DPBS(Gibco, USA, Cat No. 14190-250)를 이용해 2회 세척 후 트립신-EDTA(Gibco, USA, Cat No. 25200-114)를 처리하여 배양 접시에서 떼어내어 확보한 뒤 12-웰 플레이트에 80% 포화도로 접종하였다. 24시간 배양 후, Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific, USA, Cat No. L300075)을 이용하여 각각의 플라스미드(plasmid) DNA를 이용해 형질도입하였다.
실시예 4-2. AAV 생산을 위한 부유세포의 형질도입
AAV 생산을 위하여, 1 L 엘렌마이어 배양 플라스크에 6×108 세포를 220 ml의 expi293 배지에 접종하였다. 안정화를 위해 약 3~4시간 배양 후, 각각 3.73 pmole의 pHelper 플라스미드 DNA, pUC-RC2 플라스미드 DNA 또는 pUC-RC8 플라스미드 DNA, 외부 유전자를 포함한 AAV 구축물 플라스미드 DNA를 10 ml의 Opti-MEM(Gibco, USA, Cat No. 51985-034)에 각각 녹여주었다. 그리고 DNA 총량의 두배에 해당하는 폴리에틸렌아민(PEI, Polyscience, USA, Cat No. 23966-1)를 10 ml의 Opti-MEM에 희석시킨 후, 즉시 두 개의 용액을 섞어 형질도입 용액을 제조하였다. 상온에서 30분간 반응시킨 후 배양 플라스크로 총 20 ml의 형질도입 용액을 넣어주었다.
실시예 5. AAV의 정제
실시예 5-1. AAV2 정제
실시예 4-2의 형질도입 72시간 후, 세포배양액을 수거하여 원심분리로 배지를 제거하고 세포를 확보하였다. DPBS로 세포 침전물을 씻어주고 16 ml의 DPBS로 세포를 재현탁하였다. 이를 3회에 걸쳐 동결/해동 사이클(freezing/thawing cycle)을 수행하여 세포들을 용해하고 이를 원심분리하여 AAV2를 포함하는 상층액을 확보하였다. 상층액과 AAVancedTM Concentration Reagent(System Bioscience, USA, Cat No. AAV110A-1)를 4:1로 혼합한 뒤 4℃에서 16시간동안 섞어준 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 AAV2를 포함하는 침전물을 확보하였다. Opti-MEM 500 ㎕로 침전물을 씻어주고 모든 상층액을 제거한 뒤, 최종적으로 얼음 냉각 DPBS 400 ㎕로 재현탁하여 AAV를 얻었다.
실시예 5-2. AAV8 정제
실시예 4-2의 형질도입 72시간 후, 세포배양액을 수거하였다. 0.45 ㎛의 필터로 세포의 잔해(cell debris)를 제거하고 음이온 교환법(anion exchange) 및 친화성 크로마토그라피법(affinity chromatography)을 사용하여 AAV를 얻었다.
실시예 6. AAV의 역가 결정
실시예 5에서 정제한 AAV2의 역가를 결정하기 위하여 qPCR(Bio-Rad, USA, CFX96)을 수행하였다. DNase I 반응 완충액(New England Biolab, USA, M0303S)에서 1시간 동안 37℃로 AAV에 DNase I을 처리하였다. 이후 DNase I이 처리된 시료에 proteinase K(Invitrogen, USA, Cat No. AM2548)를 55℃에서 30분간 처리하고, 95℃에서 15분간 반응시켜 proteinase K 불활성화시켰다. 준비된 시료들을 qPCR의 주형으로 사용하고, 표준곡선을 구하기 위하여 AAV 구축물 사용하며(7.4×108-7.4×104, 10-배 희석), Recombinant Adeno-associated Virus 2 Reference Standard Stock(rAAV2-RSS, ATCC, USA, Cat No. VR-1616) 혹은 Recombinant Adeno-associated Virus 8 Reference Standard Stock(rAAV8-RSS, ATCC, USA, Cat No. VR-1816)을 양성 대조군으로 사용하였다. 역가 결정을 위한 qPCR은 2×SsoAdvanced Universal Probe Supermix(Bio-Rad, USA, Cat No. 172-5282)와 AAV2-ITR 특이적 프라이머(#030, #031) 및 프로브(#032, FAM-CACT CCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1)를 사용하였다. 95℃에서 10분 동안 변성, 95℃에서 30초 동안 반응, 60℃에서 1분 동안 반응으로 이루어진 각 qPCR cycle을 40회 반복하였다. 표준곡선과 정량은 Bio-Rad CFX Maestro 1.1 software(Bio-Rad, USA)를 이용하여 분석하였다.
실시예 7. 유세포 분석을 통한 GFP 유전자의 발현 강도 측정
eGFP의 발현은 유세포분석(Beckman Coulter, USA, CytoFlex)을 통해 측정하였다. eGFP의 측정값은 함께 형질도입한 pCMV-dsRed(Clontech, Japan, Cat No.632416) 구축물에 의한 붉은색 형광의 측정으로 형질도입의 효율을 보정하여 계산하였다. 형질도입 72시간 후 DPBS로 세포를 세척하고 트립신으로 떼어내었다. 1500 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 확보하고 2% FBS가 첨가된 DPBS를 500㎕ 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 유세포분석에 있어서, FSC vs SSC plot을 통하여 단일 세포 영역을 구분지었고, 그 중에서 FL1-A(녹색) 및 FL2-A(적색)를 측정하였다. 단일 형광 벡터가 각각 형질도입된 시료들을 이용하여 (pEGFP-C1, Clontech, Japan, Cat No. PT3286-1 and pCMV-DsRed-Expression2) 보완을 진행 후 측정 결과에 반영하였다. 모든 유세포분석 결과는 FlowJo software 10.5.3(Becton Dickinson & Company, USA)를 이용하여 분석하였다.
Oligo 번호 서열번호 서열(5'→3')
001 24 GGAAGATCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGC
002 25 CACGTGGTTACCCCATAGAGCCCACCGCATC
003 26 AGCTTTCCATAAAGTAGGAAACACTACACGATTCCATAAAGTAGGAAACACTACAACGTTC
004 27 TAGTGTTTCCTACTTTATGGAATCGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA
005 28 CATAAAGTAGGAAACACTACATCACTCCATAAAGTAGGAAACACTACAG
006 29 TCGACTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAGTGATGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAACGTTG
007 30 GTGTGTGGTTTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG
008 31 CGGTGATGACGGTGAAAACC
009 32 CCCTGCAGCAAACCACACACGGCACTTACC
010 33 GGTTTTCACCGTCATCACCG
011 34 GTGTGTGGTTTCGAGCTTTTGGAGTACGTCG
012 35 AAAAGCTCGAAACCACACACGGCACTTACC
013 36 GTGTGTGGTTGTTAGGCCAGCTTGGCAC
014 37 CTGGCCTAACAACCACACACGGCACTTACC
015 38 GTGTGTGGTTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTG
016 39 TTGAGAATGAAACCACACACGGCACTTACC
017 40 GTGTGTGGTTTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGG
018 41 CTTTGAACCAAACCACACACGGCACTTACC
019 42 CCGGAATTCTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG
020 43 CGCGGATCCCTGTGTTCTGGCGGCAAAC
021 44 CGCGGATCCCGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAG
022 45 TGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTG
023 46 CCCAAGCTTGGATCCTCACGACACCTGAAATG
024 47 CCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGATCCA
025 48 AGCTTGGATCCTCACGACACCTGAAATGGAAGAAAAAAACTTTGAACCACTGTCTGAGGCTTGAGAATGAACCAAGATCCAAACTCAAAAAGG
026 49 CGGGGTACCTTCGCAACGGGTTTGCCG
027 50 CGCGGATCCTCACGACACCTG
028 51 TGAGGATCCGCCACCATGGAGTTTGG
029 52 CGCAAGCTTCAGTAGCGCTTTAGCCAGGAGACAAGCTCAGAGACTTCTG
030 53 GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
031 54 CGGCCTCAGTGAGCGA
032 55 FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1
본 개시 내용에서 사용한 올리고뉴클레오타이드 서열
실험결과
1. EF-1α 프로모터와의 조합에서 EF-1α 인트론에 의한 eGFP 유전자의 발현 증가
사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서와 인간 신장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터의 조합에 의해 조절되는 eGFP 유전자 발현에 있어서 EF-1α 인트론이 미치는 영향을 테스트하였다. 먼저 ITR을 포함하지 않는 동물세포 발현 구축물에서 비교해 본 결과, 사용한 모든 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B)에서 EF-1α 인트론에 의해 eGFP의 발현이 증가(459.6%, 276.3%, 181.8%, 163.4%, 471.1%, 494.3%)하였다(도 2a). 마찬가지로 ITR을 포함하는 pAAV 구축물에서도 EF-1α 인트론에 의해 eGFP의 발현이 증가(224.0%, 167.7%, 218.7%, 229.5%, 202.5%, 260.5%)하였다(도 2b). 이 결과는 EF-1α 프로모터와 조합한 EF-1α 인트론이 여러 형태의 외부 유전자 발현 구축물에서 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
2. 다양한 프로모터들과의 조합에서 EF-1α 인트론에 의한 eGFP 유전자의 발현 증가
EF-1α 프로모터 이외에 다른 프로모터들과의 조합을 통해서도 EF-1α 인트론에 의한 유전자 발현 증가가 관찰되는지 시험하였다. 먼저 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서와 CMV 프로모터의 조합에 의해 유도되는 eGFP 유전자의 발현에 있어서 EF-1α 인트론이 미치는 영향을 테스트하였다. 먼저 ITR을 포함하지 않는 동물세포 발현 구축물에서 비교해 본 결과, eGFP의 발현은 사용한 모든 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B)에서 EF-1α 인트론에 의해 증가함(284.3%, 464.0%, 217.5%, 180.4%, 405.7%, 370.6%)을 확인하였다(도 3a).
유사하게 ITR을 포함하는 pAAV 구축물에서도 EF-1α 인트론은 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서와 CMV 프로모터의 조합에 의해 조절되는 eGFP의 발현을 증가시킴(241.4%, 494.8%, 266.8%, 185.5%, 415.5%, 367.8%)을 확인하였다(도 3b).
다음으로는 CMV 인핸서와 치킨 β액틴 프로모터의 조합에 의해 조절되는 eGFP 유전자의 발현에 EF-1α 인트론이 미치는 영향을 확인하였다. 동물세포 발현 구축물에서 비교해 본 결과, 사용한 모든 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B)에서 EF-1α 인트론이 eGFP의 발현을 증가시킴(415.2%, 396.7%, 233.9%, 217.9%, 353.7%, 297.7%)을 확인하였다(도 3c). 이러한 결과들은 EF-1α 프로모터 이외에 다양한 프로모터들과 조합된 상태에서도 EF-1α 인트론에 의해 유전자 발현이 증가됨을 제시한다.
3. 유전자 발현 증가 효과를 보이는 최소 길이의 EF-1α 인트론 단편 결정
3-A. EF-1α 인트론의 서열이 순차적으로 결실된 일련의 CEE 구축물들 제작
CEE-FL 구축물은 CMV 인핸서 및 CMV 프로모터 일부(5' 말단 31 bp)와 EF-1α 프로모터, EF-1α 엑손 1의 29 bp, EF-1α 인트론 924 bp, EF-1α 엑손 2의 9 bp를 포함하도록 설계되었다. 인트론의 스플라이싱 기능과 관련되는 핵심서열에는 5' 말단 쪽 스플라이싱 공여체와 분기점 부위(branch point site, BPS)를 포함하는 3' 말단쪽 스플라이싱 수용체가 위치하였다. 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 최소 길이의 EF-1α 인트론 서열을 찾기 위해서 인트론 5' 말단 쪽의 스플라이싱 공여체 서열은 보존하되 그 이후로는 순차적으로 인트론 서열이 결실되도록 하였다. 즉, EF-1α 인트론의 스플라이싱 공여체 공통(consensus) 서열로 추정되는 EF- 1α 인트론 5' 말단의 19 bp까지를 공통으로 포함하되 이후 659 bp(T2), 720 bp(T3), 807 bp(T3.1), 829 bp(T3.1.1), 851 bp(T3.1.2), 873 bp(T3.2), 895 bp(T4)가 결실된 CEE 구축물들을 실시예 2-1에서와 같이 제조하였다(도 4a).
3-B. EF-1α 인트론 서열의 순차적 결실에 따른 유전자 발현 증가 또는 감소 효과
다섯 종류의 동물세포주에서 EF-1α 인트론 서열이 전장인 것(CEE-FL)과 순차적으로 결실된 것까지 총 8종류의 구축물들로부터의 eGFP 발현을 비교하였다. 먼저 HeLa, Hep3B, Huh-7 세포주들에서는 전장 EF-1α 인트론 A와 비교하여 볼 때, CEE-T2로부터 CEE-T3.1.2까지는 eGFP 유전자 발현이 유지됨을 확인하였다. 그러나 CEE-T3.2 및 CEE-T4의 경우 유전자 발현이 급격하게 감소하였다. 다음으로 ARPE-19와 RPE-1 세포주에서는 CEE-T2의 경우에 CEE-FL에 비해 eGFP 발현이 약 50% 수준으로 감소하였지만, CEE-T3부터 CEE-T3.1.2까지는 CEE-FL과 비슷하거나 좀 더 높은 eGFP의 발현을 보여주었다. 그러나 앞의 세포주들에서와 동일하게 CEE-T3.2 및 CEE-T4에서는 발현이 급격히 감소하였다. 이상의 결과들은 EF-1α 인트론 A에서 유전자 발현 증가 기능을 보유한 인트론 A 단편은 T2부터 T3.2까지이며, 바람직하게는 T3(117개의 뉴클레오타이드 길이) 길이 이하 단편으로서 T3.2(51개의 뉴클레오타이드 길이) 길이 이상 단편을 유전자 발현 증가용으로 단편으로 제시한다(도 4b).
4. EF-1α 인트론 단편인 T3.1.1 및 T3.1.2에 의한 유전자 발현 증가
4-A. 치킨 β액틴 프로모터와 조합된 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 및 T3.1.2의 제작
CAE-FL 구축물은 CMV 인핸서 및 치킨 β액틴 프로모터, 치킨 β액틴 엑손 1의 32 bp와, EF-1α 엑손 1의 29 bp, EF-1α 인트론 A 924 bp, EF-1α 엑손 2의 9 bp를 포함하도록 설계되었다. CA는 EF-1α 인트론 전체가 결실된 구축물이다. CAE-T3.1.1 구축물은 EF-1α 인트론 5' 말단의 19 bp와 3' 말단의 T3.1.1 서열을 포함하고 그 사이의 829 bp가 결실되어 있는 점 이외에는 CAE-FL과 동일하다. CAE-T3.1.2 구축물은 EF-1α 인트론 A 5' 말단의 19 bp와 3' 말단의 T3.1.2 서열을 포함하고 그 사이의 851 bp가 결실되어 있는 점 이외에는 CAE-FL과 동일하다(도 5a).
4-B. 치킨 β액틴 프로모터와 조합된 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 또는 T3.1.2에 의한 유전자 발현 증가
EF-1α 인트론의 모든 뉴클레오타이드가 완전 결실된 CA와, 부분 결실된 EF-1α 인트론을 포함한 CAE-T3.1.1과 CAE-T3.1.2 등 3종류의 구축물을 이용하여 두 종류의 동물세포주(HeLa, ARPE-19)에서 eGFP 발현을 비교하였다. CAE-T3.1.1 및 CAE-T3.1.2 군에서는 CA 구축물 군과 비교할 때 HeLa에서는 330.5%, 243.9%, ARPE-19에서는 170.8%, 165.9% 수준의 eGFP 발현이 관찰되었다(도 5b). 이러한 결과는 EF-1α 인트론의 단편인 T3.1.1과 T3.1.2가 치킨 β액틴 프로모터와의 조합에서도 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
4-C. EF-1α 인트론 단편인 T3.1.1 및 T3.1.2와 치킨 β액틴의 스플라이싱 공여체가 조합된 구축물의 제작
CMV 인핸서, 치킨 β액틴 프로모터, 치킨 β액틴 엑손 1의 93 bp와 인트론 43 bp를 유지한 상태에서 EF-1α 인트론의 3' 말단 단편 95 bp(T3.1.1) 혹은 73 bp(T3.1.2)와 EF-1α 엑손 2의 9 bp를 포함하는 하이브리드 인트론 구조를 갖는 CA-T3.1.1, CA-T3.1.2 구축물을 제작하였다. 치킨 β액틴 엑손 1 및 치킨 β액틴 인트론 일부는 스플라이싱 공여체의 기능을 제공해 주며, EF-1α 인트론 A 단편은 스플라이싱 수용체 기능을 할 것으로 기대하였다. 대조군으로 인트론 서열이 없는 CA 구축물을 함께 테스트하였다(도 5c).
4-D. 치킨 β액틴의 스플라이싱 공여체 단편과 EF-1α 인트론 A의 3' 말단 단편인 T3.1.1 및 T3.1.2가 하이브리드된 인트론에 의한 유전자 발현 증가
CA, CA-T3.1.1, CA-T3.1.2 구축물을 각각 HeLa 및 Hep3B 세포주에 형질도입을 한 뒤 유전자 발현정도를 비교한 결과, 인트론이 없는 CA에 대비하여 CA-T3.1.1, CA-T3.1.2에서 유전자 발현이 증가 (HeLa : 215.7%, 211.0%, Hep3B : 155.0%, 167.5%)됨을 확인하였다. 이러한 결과는 EF-1α 인트론 단편인 T3.1.1과 T3.1.2가 다른 유전자의 스플라이싱 공여체와 함께 조합된 경우에도 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 제시한다(도 5d).
5. AAV를 이용한 TAFA4 유전자의 전달
5-A. NaIO 3 (sodium iodate) 유도 망막 손상 모델에서 TAFA4의 효능 평가
TAFA4의 망막 손상 개선 효능을 평가하고자, NaIO3를 투여하여 망막 손상이 유도된 마우스 모델에 AAV8.mouse TAFA4 투여에 따른 형광안저혈관조영술(fluorescence angiography, FA) 및 망막전위도(electoretinogram, ERG) 변화를 평가하였다.
C57BL/6 마우스(오리엔트바이오)에 control AAV8 혹은 AAV8.mouse TAFA4을 망막하 투여(subretinal injection, SRI) 하였다. control AAV8는 도 6a의 pAAV 구축물을, AAV8.mouse TAFA4는 도 6b의 pAAV-mTAFA4 구축물(실시예 2-6-1)을 이용하여 제조하였다.
Mouse TAFA4가 충분히 발현될 수 있도록 5×108 vg의 AAV8를 마우스 양쪽 안구에 망막하 투여(subretinal injection, SRI) 후 56 일까지 기다린 후, NaIO3를 20 mg/kg의 용량으로 미정맥 투여하여 AMD 모델을 유도하였다. 모델 유도 후 10일 (SRI 투여 후 66일)에 형광 조영제를 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 이 후 Micron-IV의 imaging camera(Phoenix)로 fundus에 영상을 맞춘 후, fluorescence angiography(FA)이미지를 촬영하였다. 모델 유도 후 11 일 (SRI 투여 후 67일)에는 암순응 (scotopic) ERG 평가를 진행하였다. 마우스를 ERG 재물대 위에 올려놓고 ERG의 probe를 각각 꼬리, 머리 및 각막에 접촉시킨 후, A-wave 및 B-wave의 amplitude를 측정하였다. ERG에 대한 분석은 'LabScribeERG (iWorx DataAcquisition Software)' 프로그램을 이용하여 실시하였다.
모델 유도 후 10일차에 촬영된 FA 이미지 상에서 건강한(AMD가 유도되지 않은) 동물(나이브, control AAV8 투여) 군에 비해 NaIO3 투여군(대조군, control-AAV8 투여)의 망막에서 Outer retina의 손상으로 인한 형광 조영제의 유출을 확인할 수 있었다. 그에 반해 AAV8.mouse TAFA4를 투여한 군(실험군)은 나이브(Naive) 군과 유사하게 거의 정상에 가까운 망막 소견을 보였다(도 7). 모델 유도 후 11일 차에 평가한 암순응(scotopic) ERG 결과에서도 FA와 유사하게 NaIO3에 의해 망막의 이상 소견을 보이고 있으며 A-wave 및 B-wave amplitude의 전위 유발 폭이 모두 크게 감소하였다. 그에 반해 AAV8.mouse TAFA4를 투여한 군(실험군)은 A-wave 및 B-wave amplitude 모두 회복하였으며 특히 B-wave amplitude는 거의 정상에 가까운 수준으로 회복되었다(도 8).
5-B. NaIO 3 (sodium iodate) 유도 망막 손상 모델에서 TAFA4의 mRNA 발현 분석
C57BL/6 마우스에 control AAV8 혹은 AAV8.mouse TAFA4를 망막하 투여한 후 56일째에 NaIO3를 20 mg/kg의 용량으로 미정맥 투여하여 망막 손상 모델을 유도하였다. 모델 유도 후 14일 (SRI 투여 후 70일)에 안구를 적출하였다. 적출된 안구에서 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit (Takara)를 이용해 cDNA로 합성한 후, cDNA를 주형으로 qPCR을 수행하여 TAFA4의 mRNA 수준을 확인하였다. TAFA4 mRNA 수준은 GAPDH mRNA와의 상대적인 양으로, ΔΔCq값을 이용하여 나타내었다.
Naive 군과 비교해 NaIO3를 처리한 군(대조군, control-AAV8)에서는 망막의 손상과는 별개로 mouse TAFA4 mRNA 수준(level)이 거의 변하지 않았다. 하지만 AAV8.mouse TAFA4를 투여한 군(실험군)에서는 mouse TAFA4 mRNA 수준이 투여되지 않은 군에 비해 현저하게 높은 수준임을 확인하였으며 이렇게 발현된 mouse TAFA4에 의해 망막 손상이 개선됨을 알 수 있었다(도 9).
5-C. TAFA4의 종간 서열 동일성 비교
포유류(Human, Monkey, Pig, Rabbit, Rat, Mouse), 조류(Chicken), 파충류(Komodo dragon, Wall lizard, Fence lizard, Gecko), 양서류(Frog), 어류(Fish)의 full length TAFA4 단백질의 서열 동일성을 비교하고 각 종간의 공통서열(Consensus sequence)을 확인하였다(도 10). 성숙한(mature) 인간(Human)의 TAFA4 단백질(95 a.a.) 아미노산 서열은 포유류 및 양서류와 비교하여 90% 이상, 조류와 비교하여 95% 이상, 파충류 및 어류와 비교하여 85% 이상 서열 동일성을 나타내며 종에 상관없이 매우 높은 서열 동일성을 나타냄을 확인할 수 있다(도 19).
5-D. NaIO 3 (sodium iodate) 유도 망막 손상 모델에서 TAFA4 서열 동일성에 따른 망막 손상 보호 효과
NaIO3(sodium iodate) 유도 망막 손상 모델에서 AAV8.mouse TAFA4의 망막 손상 보호 효과를 확인하였기 때문에 다른 종의 TAFA4도 망막 손상 보호 효과를 갖는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 인간(Human)의 TAFA4 및 인간의 TAFA4와 서열 동일성이 가장 떨어지는 파충류(Gecko TAFA4; 서열 동일성 87.4%) 및 어류(fish TAFA4; 서열 동일성 86.3%)의 TAFA4의 효능을 확인하는 실험을 진행하였다. NaIO3를 투여하여 AMD가 유도된 마우스 모델에 AAV8.human TAFA4, AAV8.gecko TAFA4, AAV8.fish TAFA4 투여에 따른 형광안저혈관조영술(fluorescence angiography, FA) 및 망막전위도(electoretinogram, ERG) 변화를 평가하였다.
C57BL/6 마우스(오리엔트바이오)에 control AAV8 혹은 각 종의 AAV8.TAFA4을 망막하 투여(subretinal injection, SRI) 하였다. 실험에 사용한 AAV8과 각 종의 AAV8.TAFA4는 상기 5-A에 서술한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
AAV8.human TAFA4는 pAAV- human TAFA4 구축물(실시예 2-6-2), AAV8.gecko TAFA4는 pAAV- gecko TAFA4 구축물(실시예 2-6-3), AAV8.fish TAFA4는 pAAV- fish TAFA4 구축물(실시예 2-6-4)을 이용하여 제조하였다.
TAFA4가 충분히 발현될 수 있도록 1×109 vg의 AAV8를 마우스 양쪽 안구에 망막하 투여(subretinal injection, SRI) 후 42 일까지 기다린 후, NaIO3를 20 mg/kg의 용량으로 미정맥 투여하여 AMD 모델을 유도하였다. 모델 유도 후 9일 (SRI 투여 후 51일)에 형광 조영제를 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 이 후 Micron-IV의 imaging camera(Phoenix)로 fundus에 영상을 맞춘 후, fluorescence angiography(FA)이미지를 촬영하였다. 모델 유도 후 7 일 (SRI 투여 후 49일)에는 암순응 (scotopic) ERG 평가를 진행하였다. 마우스를 ERG 재물대 위에 올려놓고 ERG의 probe를 각각 꼬리, 머리 및 각막에 접촉시킨 후, A-wave 및 B-wave의 amplitude를 측정하였다. ERG에 대한 분석은 'LabScribeERG (iWorx DataAcquisition Software)' 프로그램을 이용하여 실시하였다.
모델 유도 후 9일차에 촬영된 FA 이미지 상에서 건강한 동물(나이브, control AAV8 투여) 군에 비해 NaIO3 투여군(대조군, control-AAV8 투여)의 망막에서 Outer retina의 손상으로 인한 형광 조영제의 유출을 확인할 수 있었다. 반면, AAV8.human TAFA4, AAV8.gecko TAFA4, AAV8.fish TAFA4를 투여한 군(실험군)은 나이브(Naive) 군과 유사하게 거의 정상에 가까운 망막 소견을 보였다(도 11). 모델 유도 후 11일 차에 평가한 암순응(scotopic) ERG 결과에서도 NaIO3에 의해 A-wave 및 B-wave amplitude의 전위 유발 폭이 모두 크게 감소한 망막의 이상소견을 확인할 수 있었다. 그에 반해 AAV8.human TAFA4, AAV8.gecko TAFA4, AAV8.fish TAFA4를 투여한 군(실험군)은 NaIO3에 의한 A-wave 및 B-wave amplitude 전위 유발 변화가 회복되었다(도 12).
5-F. signal peptide 차이에 따른 TAFA4 발현 비교
성숙 단백질로 예상되는 95개의 아미노산 서열의 정상적인 발현 여부를 확인하기 위하여 신호 서열을 치환하여 인간의 TAFA4 단백질의 발현여부를 확인하였다. 이를 위해 pcDNA3.1(-)벡터에 full length TAFA4 구축물, N 말단의 45개의 아미노산 서열을 mIgG 중쇄 가변영역 3의 신호 서열(MGWSCIILFLVATATGVHS, 서열번호 312) 로 치환한 구축물, 말단의 45개의 아미노산 서열을 인간의 Interleukin 2 (IL2)의 신호 서열(MYRMQLLSCIALSLALVTNS, 서열번호 313)로 치환한 구축물을 제조하였다. HEK293 세포를 12 well plate에 6×105 세포/well 로 부착시켜 18시간 배양한 후 상기의 구축물을 pCMV DsRED-Express2 (TAKARA) 와 함께 Lipofectamin 3000(Invitrogen)을 이용하여 형질 도입하였다. 72시간 배양 후 세포를 수확하여 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit (Takara)를 이용해 cDNA로 합성한 후, cDNA를 주형으로 qPCR을 수행하여 TAFA4의 mRNA 수준을 확인하였다. TAFA4 mRNA 수준은 GAPDH mRNA와의 상대적인 양으로 ΔΔCq값을 이용하여 계산한 후 DsRed를 발현하는 세포의 비율로 나누어 비교하였다. TAFA4 단백질의 양을 확인하기 위해 배양액을 수거한 뒤 12000 rpm으로 원심 분리하여 상층액을 분리한 뒤, 인간(human) TAFA4 ELISA kit (Abbexa)를 이용하여 제조사가 제공한 방법에 따라 분석하였다. 계산된 값을 DsRed를 발현하는 세포의 비율로 나누어 비교하였다.
확인 결과 mRNA 발현과 단백질 발현 모두 신호 서열에 의한 유의미한 발현 변화를 보이지 않았다(p>0.05)(도 13).
6. AAV를 이용한 TAFA1-3 유전자의 전달
6-A. NaIO 3 (sodium iodate) 유도 망막 손상 모델에서 TAFA4 paralogs의 서열 동일성에 따른 망막 손상 보호 효과
TAFA4 와 TAFA 단백질군 간에는 높은 서열 동일성이 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서, NaIO3로 유도된 망막 손상에 마우스 모델에서 인간 TAFA1, TAFA2, TAFA3 역시 망막 보호 효과를 보이는지 확인하였다. NaIO3를 투여하여 AMD가 유도된 마우스 모델에 AAV8.TAFA1, AAV8.TAFA2, AAV8.TAFA3, AAV8.TAFA4 투여에 따른 형광안저혈관조영술(fluorescence angiography, FA) 및 망막전위도(electoretinogram, ERG) 변화를 평가하였다.
C57BL/6 마우스(오리엔트바이오)에 control AAV8 또는 AAV8.TAFA1 또는 AAV8.TAFA2 또는 AAV8.TAFA3 또는 AAV8.TAFA4를 망막하 투여(subretinal injection, SRI) 하였다. 실험에 사용한 AAV8과 AAV8.TAFA1, AAV8.TAFA2, AAV8.TAFA3, AAV8.TAFA4는 상기 5-A에서 서술한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
AAV8.human TAFA1는 pAAV- human TAFA1 구축물(실시예 2-6-5), AAV8.human TAFA2는 pAAV- human TAFA2 구축물(실시예 2-6-6), AAV8.human TAFA3는 human TAFA1 구축물(실시예 2-6-7), AAV8.human TAFA4는 human TAFA1 구축물(실시예 2-6-2)을 이용하여 제조하였다.
TAFA1, TAFA3, TAFA4의 망막 보호 효과를 확인하기 위해 1×109 vg의 AAV8를 마우스 양쪽 안구에 망막하 투여(subretinal injection, SRI) 후 42일까지 기다린 후, NaIO3를 20 mg/kg의 용량으로 미정맥 투여하여 AMD 모델을 유도하였다. 모델 유도 후 9일 (SRI 투여 후 51일)에 형광 조영제를 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 이 후 Micron-IV의 imaging camera(Phoenix)로 fundus에 영상을 맞춘 후, fluorescence angiography(FA)이미지를 촬영하였다. 모델 유도 후 7 일 (SRI 투여 후 49일)에는 암순응 (scotopic) ERG 평가를 진행하였다. 마우스를 ERG 재물대 위에 올려놓고 ERG의 probe를 각각 꼬리, 머리 및 각막에 접촉시킨 후, A-wave 및 B-wave의 amplitude를 측정하였다. ERG에 대한 분석은 'LabScribeERG (iWorx DataAcquisition Software)' 프로그램을 이용하여 실시하였다.
TAFA2의 망막 보호 효과를 확인하기 위해 1×109 vg의 AAV8를 마우스 양쪽 안구에 망막하 투여(subretinal injection, SRI) 후 56 일까지 기다린 후, NaIO3를 20 mg/kg의 용량으로 미정맥 투여하여 AMD 모델을 유도하였다. 모델 유도 후 9일 (SRI 투여 후 65일)에 형광 조영제를 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 이 후 Micron-IV의 imaging camera(Phoenix)로 fundus에 영상을 맞춘 후, fluorescence angiography(FA)이미지를 촬영하였다. 모델 유도 후 7 일 (SRI 투여 후 63일)에는 암순응 (scotopic) ERG 평가를 진행하였다. 마우스를 ERG 재물대 위에 올려놓고 ERG의 probe를 각각 꼬리, 머리 및 각막에 접촉시킨 후, A-wave 및 B-wave의 amplitude를 측정하였다. ERG에 대한 분석은 'LabScribeERG (iWorx DataAcquisition Software)' 프로그램을 이용하여 실시하였다.
FA 이미지 상에서 건강한 동물(나이브, control AAV8 투여) 군에 비해 NaIO3 투여군(대조군, control-AAV8 투여)의 망막에서 Outer retina의 손상으로 인한 형광 조영제의 유출을 확인할 수 있었다. 반면, AAV8.TAFA1 또는 AAV8.TAFA2 또는 AAV8.TAFA3 또는 AAV8.TAFA4를 투여한 군(실험군)은 나이브(Naive) 군과 유사하게 거의 정상에 가까운 망막 소견을 보였다(도 14). 암순응(scotopic) ERG 결과에서도 NaIO3에 의해 A-wave 및 B-wave amplitude의 전위 유발 폭이 모두 크게 감소한 망막의 이상소견을 확인할 수 있었다. 그에 반해 AAV8.TAFA1 또는 AAV8.TAFA2 또는 AAV8.TAFA3 또는 AAV8.TAFA4를 투여한 군(실험군)은 NaIO3에 의한 A-wave 및 B-wave amplitude 전위 유발 변화가 회복되었다(도 15).
6-B. human TAFA4와 다양한 종의 TAFA paralogs 간의 서열 동일성 비교
NaIO3에 의한 망막 손상 모델에서 Human TAFA1, human TAFA2, human TAFA3, human TAFA4 뿐만 아니라 gecko TAFA4 와 fish TAFA4의 망막 보호 효과를 확인하였다. 따라서, 다양한 TAFA 단백질들의 공통된 서열이 망막 보호 효과가 있을 것이라 생각하였고, 공통된 서열을 확인하기 위해 포유류(Human, Monkey, Pig, Rabbit, Rat, Mouse), 조류(Chicken), 파충류(Komodo dragon, Wall lizard, Fence lizard, Gecko), 양서류(Frog), 어류(Fish)의 full length TAFA1, full length TAFA2, full length TAFA3, full length TAFA4 단백질의 서열 동일성을 비교하였다. 척추동물들에서 full length TAFA1 내지 TAFA4 간의 아미노산 서열은 도 20a 내지 도 20d에 나타내었다. 도 16는 성숙 TAFA1 단백질의 종간 서열 동일성 비교, 도 17은 성숙 TAFA2 단백질의 종간 서열 동일성 비교, 도 18은 성숙 TAFA3 단백질의 종간 서열 동일성 비교, 및 도 19은 성숙 TAFA4 단백질의 종간 서열 동일성 비교 결과를 나타낸다.
인간의 TAFA4의 93개 서열 (IKQGTCEVVAVHRCCNKNRIEERSQTVKCSCFPGQVAGTTRAQPSCVEASIVIQKWWCHMNPCLEGEDCKVLPDYSGWSCSSGNKVKTTKVTR, 서열번호 75)은 다른 종의 TAFA4 서열과 TAFA1 내지 TAFA3의 인간 내지 fish의 공통 서열에서 매우 높은 서열 동일성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 공통 서열 내의 서열 동일성은 표 2와 같다.
TAFA1, TAFA2, TAFA3, 및 TAFA4의 각 종과 human TAFA4의 공통 서열(93 a.a.)의 서열 동일성
TAFA 패밀리 종 학명 길이 서열번호 서열동일성
TAFA4 Human Homo sapiens 93 75 100.0%
TAFA1 Human Homo sapiens 91 76 75.8%
TAFA1 Monkey Macaca fascicularis_isoform1 91 77 75.8%
TAFA1 Pig Sus scrofa_isoform2 91 78 75.8%
TAFA1 Rabbit Oryctolagus cuniculus_isoform1 91 79 75.8%
TAFA1 Rat Rattus norvegicus_isoform1 91 80 75.8%
TAFA1 Mouse Mus musculus 91 81 75.8%
TAFA1 Chicken Gallus gallus_isoform2 91 82 75.8%
TAFA1 Komodo dragon Varanus komodoensis 91 83 76.9%
TAFA1 Wall lizard Podarcis muralis_isoform1 91 84 76.9%
TAFA1 Fence lizard Sceloporus undulatus_isoform1 91 85 76.9%
TAFA1 Frog Xenopus tropicalis_isoform1 92 86 76.1%
TAFA1 Frog Xenopus tropicalis_isoform2 92 87 76.1%
TAFA1 Fish Danio rerio_isoform1 93 88 74.2%
TAFA1 Fish Danio rerio_isoform2 93 89 75.3%
TAFA2 Human Homo sapiens 93 90 86.0%
TAFA2 Monkey Macaca fascicularis 93 91 86.0%
TAFA2 Pig Sus scrofa 93 92 86.0%
TAFA2 Rabbit Oryctolagus cuniculus 93 93 86.0%
TAFA2 Rat Rattus norvegicus_isoform1 93 94 82.8%
TAFA2 Rat Rattus norvegicus_isoform2 93 95 84.9%
TAFA2 Mouse Mus musculus_isoform1 93 96 84.9%
TAFA2 Chicken Gallus gallus_isoform1 93 97 83.9%
TAFA2 Chicken Gallus gallus_isoform2 93 98 87.1%
TAFA2 Komodo dragon Varanus komodoensis 93 99 84.9%
TAFA2 Wall lizard Podarcis muralis 91 100 85.7%
TAFA2 Wall lizard Podarcis muralis 2 93 101 87.1%
TAFA2 Fence lizard Sceloporus undulatus 93 102 87.1%
TAFA2 Gecko Gekko japonicus 92 103 83.7%
TAFA2 Frog Xenopus tropicalis 93 104 84.9%
TAFA2 Fish Danio rerio 93 105 82.8%
TAFA3 Human Homo sapiens_isoform1 93 106 82.8%
TAFA3 Monkey Macaca fascicularis_isoform3 93 107 82.8%
TAFA3 Pig Sus scrofa_isoform2 93 108 84.9%
TAFA3 Rabbit Oryctolagus cuniculus_isoform2 93 109 82.8%
TAFA3 Rat Rattus norvegicus 93 110 82.8%
TAFA3 Mouse Mus musculus_isoform1 93 111 83.9%
TAFA3 Chicken Gallus gallus 93 112 84.9%
TAFA3 Komodo dragon Varanus komodoensis_isoform2 93 113 86.0%
TAFA3 Wall lizard Podarcis muralis 93 114 83.9%
TAFA3 Fencee lizard Sceloporus undulatus 93 115 86.0%
TAFA3 Frog Xenopus tropicalis_isoform2 93 116 87.1%
TAFA3 Fish Danio rerio 93 117 81.7%
TAFA4 Monkey Macaca fascicularis_isoform2 93 118 100.0%
TAFA4 Pig Sus scrofa_isoform2 93 119 100.0%
TAFA4 Rabbit Oryctolagus cuniculus_isoform4 93 120 96.8%
TAFA4 Rat Rattus norvegicus 93 121 96.8%
TAFA4 Mouse Mus musculus 93 122 95.7%
TAFA4 Chicken Gallus gallus 93 123 96.8%
TAFA4 Komodo dragon Varanus komodoensis_isoform2 93 124 94.6%
TAFA4 Wall lizard Podarcis muralis 93 125 96.8%
TAFA4 Fence lizard Sceloporus undulatus 93 126 95.7%
TAFA4 Gecko Gekko japonicus 93 127 87.1%
TAFA4 Frog Xenopus tropicalis 93 128 92.5%
TAFA4 Fish Danio rerio 93 129 87.1%
Clustal Omega를 이용하여 서열 동일성을 확인하였다.
본 출원에서 인용된 모든 공보, 특허, 특허출원 및 그 밖의 다른 문헌들을 각각의 개별 공보, 특허, 특허출원 또는 그 밖의 다른 문헌이 모든 목적을 위해 개별적으로 참고로서 포함되는 것으로 나타내었더라도 동일하게 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참고로서 포함된다.
이상, 상술한 양태를 참조하여 본 개시 내용을 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 개시 내용의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 삽입에 의해 다양한 수정 및 변경이 가능함을 이해할 것이다. 이러한 수정 및 변경은 본 개시 내용의 범위 내에 있음을 이해할 것이다.

Claims (55)

  1. 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 바이러스 입자, 또는 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 일반식 1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
    <일반식 1>
    X1-X2-X3-G-T-C-E-V-X4-A-X5-H-X6-C-C-N-X7-N-X8-I-E-E-X9-S-Q-T-X10-X11-C-S-C-X12-X13-G-X14-V-A-G-T-T-X15-X16-X17-P-S-C-V-X18-A-X19-I-V-X20-X21-X22-W-W-C-X23-M-X24-P-C-X25-X26-G-E-X27-C-K-X28-L-P-D-X29-X30-G-W-X31-C-X32-X33-G-X34-K-X35-K-T-T-X36-X37-X38-X39
    상기 일반식 1에서,
    X1은 존재하지 않거나, V, I 또는 L이고,
    X2는 K, E, R 또는 Q이고,
    X3은 G, T, Q, P 또는 A이고,
    X4는 V 또는 I이고,
    X5는 A, L, V 또는 I이고,
    X6은 R 또는 L이고,
    X7은 K, R 또는 Q이고,
    X8은 R 또는 K이고,
    X9는 R 또는 L이고,
    X10은 V 또는 G이고,
    X11은 K 또는 N이고,
    X12는 F 또는 L이고,
    X13은 P 또는 S이고,
    X14는 Q 또는 K이고,
    X15는 R, H 또는 Q이고,
    X16은 A, N, S 또는 T이고,
    X17은 A, Q, R, K 또는 T이고,
    X18은 D 또는 E이고,
    X19는 S 또는 A이고,
    X20은 I, E, L, A 또는 V이고,
    X21은 Q, G 또는 E이고,
    X22는 K 또는 R이고,
    X23은 H, Q 또는 E이고,
    X24는 E, Q, N, D, S 또는 H이고,
    X25는 L, V 또는 M이고,
    X26은 E, D, P, L 또는 A이고,
    X27은 E 또는 D이고,
    X28은 V, T, A 또는 I이고,
    X29는 L, N, R, Y, S 또는 Q이고,
    X30은 S, K 또는 T이고,
    X31은 S 또는 M이고,
    X32는 S, A 또는 Y이고,
    X33은 S, T 또는 R이고,
    X34는 N 또는 H이고,
    X35는 V 또는 I이고,
    X36은 R 또는 K이고,
    X37은 존재하지 않거나 V, A, G, M 또는 N이고,
    X38은 존재하지 않거나 T, I, N, F 또는 S이고, 및
    X39는 존재하지 않거나 R, H, V, K, I 또는 Q이다.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 2의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
    <일반식 2>
    X1-X2-H-H-K-A-X3-H
    상기 일반식 2에서,
    X1은 A 또는 V이고,
    X2는 N 또는 I이고, 및
    X3은 H 또는 Q이다.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 3의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
    <일반식 3>
    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
    상기 일반식 3에서,
    X1은 A 또는 S이고,
    X2는 L, T 또는 S이고,
    X3은 Q, E 또는 H이고,
    X4는 존재하지 않거나, P, L 또는 H이고,
    X5는 P 또는 R이고,
    X6은 T, S 또는 I이고,
    X7은 A, P, T, S 또는 H이고,
    X8은 T, A, S 또는 I이고,
    X9는 V 또는 A이고, 및
    X10은 L 또는 H이다.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 4의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
    <일반식 4>
    X1-X2
    상기 일반식 4에서,
    X1은 H 또는 Y이고, 및
    X2는 Q, V 또는 L이다.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열 (N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
    LHRP(서열번호 293);
    LHQSGFTSGHFPHHRKLGE(서열번호 294); 또는
    LAPPGTNIQI(서열번호 295)
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 5의 아미노산 서열 (N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
    <일반식 5>
    X1-X2-X3
    상기 일반식 5에서,
    X1은 P 또는 G이고,
    X2는 R 또는 H이고, 및
    X3는 T, S 또는 L이다.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열 (N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
    PYTSL(서열번호 296); 또는
    QEDKLK(서열번호 297).
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 75 내지 129에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 184 내지 238에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 130 내지 183에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 239 내지 292에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  14. 제 1 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노-연관 바이러스(AAV)인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 AAV는 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh10인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 망막 또는 황반 질환은 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반병증, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리, 유전성 망막질환 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 연령-관련 황반변성은 습성 또는 건성인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  19. 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 벡터는 프로모터 서열, 인핸서 서열, 엑손 서열, 인트론 서열, 신호 서열 코딩 서열, 스플라이싱 공여체 서열 및 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 역전된 말단 반복(ITR) 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 인트론은 51개 내지 117개의 뉴클레오타이드로 구성되며, 서열번호 57에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 인트론은 (i) 서열번호 1의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 58), (ii) 서열번호 1의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 59), (iii) 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 3), (iv) 서열번호 1의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 61), (v) 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 2), (vi) 서열번호 1의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 63), (vii) 서열번호 1의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 64), 또는 (viii) 서열번호 1의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 65)와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 인트론은 (i) 서열번호 1의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 58), (ii) 서열번호 1의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 59), (iii) 서열번호 1의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 3), (iv) 서열번호 1의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 61), (v) 서열번호 1의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 2), (vi) 서열번호 1의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 63), (vii) 서열번호 1의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 64), 또는 (viii) 서열번호 1의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(서열번호 65)를 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  24. 제 20 항에 있어서, 상기 벡터는 하기의 구성을 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터:
    (1) 서열번호 4에 나타낸 CMV 인핸서 서열;
    (2) 서열번호 5 또는 6에 나타낸 CMV 프로모터 서열, 서열번호 7에 나타낸 EF-1α 프로모터 서열 또는 서열번호 8에 나타낸 치킨 β액틴 프로모터 서열로부터 선택되는 프로모터 서열;
    (3) 서열번호 12에 나타낸 CMV E1 서열, 서열번호 13에 나타낸 EF-1α E1 서열 또는 서열번호 14 또는 15에 나타낸 치킨 β액틴 E1 서열로부터 선택되는 엑손 1(E1) 서열;
    (4) 서열번호 9 또는 10에 나타낸 스플라이싱 공여체 서열; 및/또는
    (5) 서열번호 11에 나타낸 EF-1α E2 서열.
  25. 제 19 항에 있어서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하기의 일반식 1의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터:
    <일반식 1>
    X1-X2-X3-G-T-C-E-V-X4-A-X5-H-X6-C-C-N-X7-N-X8-I-E-E-X9-S-Q-T-X10-X11-C-S-C-X12-X13-G-X14-V-A-G-T-T-X15-X16-X17-P-S-C-V-X18-A-X19-I-V-X20-X21-X22-W-W-C-X23-M-X24-P-C-X25-X26-G-E-X27-C-K-X28-L-P-D-X29-X30-G-W-X31-C-X32-X33-G-X34-K-X35-K-T-T-X36-X37-X38-X39
    상기 일반식 1에서,
    X1은 존재하지 않거나, V, I 또는 L이고,
    X2는 K, E, R 또는 Q이고,
    X3은 G, T, Q, P 또는 A이고,
    X4는 V 또는 I이고,
    X5는 A, L, V 또는 I이고,
    X6은 R 또는 L이고,
    X7은 K, R 또는 Q이고,
    X8은 R 또는 K이고,
    X9는 R 또는 L이고,
    X10은 V 또는 G이고,
    X11은 K 또는 N이고,
    X12는 F 또는 L이고,
    X13은 P 또는 S이고,
    X14는 Q 또는 K이고,
    X15는 R, H 또는 Q이고,
    X16은 A, N, S 또는 T이고,
    X17은 A, Q, R, K 또는 T이고,
    X18은 D 또는 E이고,
    X19는 S 또는 A이고,
    X20은 I, E, L, A 또는 V이고,
    X21은 Q, G 또는 E이고,
    X22는 K 또는 R이고,
    X23은 H, Q 또는 E이고,
    X24는 E, Q, N, D, S 또는 H이고,
    X25는 L, V 또는 M이고,
    X26은 E, D, P, L 또는 A이고,
    X27은 E 또는 D이고,
    X28은 V, T, A 또는 I이고,
    X29는 L, N, R, Y, S 또는 Q이고,
    X30은 S, K 또는 T이고,
    X31은 S 또는 M이고,
    X32는 S, A 또는 Y이고,
    X33은 S, T 또는 R이고,
    X34는 N 또는 H이고,
    X35는 V 또는 I이고,
    X36은 R 또는 K이고,
    X37은 존재하지 않거나 V, A, G, M 또는 N이고,
    X38은 존재하지 않거나 T, I, N, F 또는 S이고, 및
    X39는 존재하지 않거나 R, H, V, K, I 또는 Q이다.
  26. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 2의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터:
    <일반식 2>
    X1-X2-H-H-K-A-X3-H
    상기 일반식 2에서,
    X1은 A 또는 V이고,
    X2는 N 또는 I이고, 및
    X3은 H 또는 Q이다.
  27. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 3의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터:
    <일반식 3>
    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
    상기 일반식 3에서,
    X1은 A 또는 S이고,
    X2는 L, T 또는 S이고,
    X3은 Q, E 또는 H이고,
    X4는 존재하지 않거나, P, L 또는 H이고,
    X5는 P 또는 R이고,
    X6은 T, S 또는 H이고,
    X7은 A, P, T, S 또는 I이고,
    X8은 T, A, S 또는 I이고,
    X9는 V 또는 A이고, 및
    X10은 L 또는 H이다.
  28. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 4의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터:
    <일반식 4>
    X1-X2
    상기 일반식 4에서,
    X1은 H 또는 Y이고, 및
    X2는 Q, V 또는 L이다.
  29. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터:
    LHRP(서열번호 293);
    LHQSGFTSGHFPHHRKLGE(서열번호 294); 또는
    LAPPGTNIQI(서열번호 295).
  30. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 일반식 5의 아미노산 서열 (N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터:
    <일반식 5>
    X1-X2-X3
    상기 일반식 5에서,
    X1은 P 또는 G이고,
    X2는 R 또는 H이고, 및
    X3는 T, S 또는 L이다.
  31. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 아미노산 서열(N-말단부터 C-말단까지)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터:
    PYTSL(서열번호 296); 또는
    QEDKLK(서열번호 297).
  32. 제 19 항에 있어서, 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 91개 내지 119개의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  33. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 75 내지 129에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  34. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 184 내지 238에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  35. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 130 내지 183에 제시된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  36. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 239 내지 292에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  37. 제 19 항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 유전자 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  38. 제 19 항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 상기 서열번호 75로 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, AAV 벡터.
  39. 제 19 항의 AAV 벡터를 포함하는 단리된 숙주세포.
  40. 제 19 항의 AAV 벡터로 형질전환된 단리된 숙주세포.
  41. 제 19 항의 AAV 벡터 또는 상기 AAV 벡터를 포함하거나 상기 AAV 벡터로 형질전환된 숙주세포를 포함하는 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 조성물은 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  44. 제 19 항의 AAV 벡터 또는 상기 AAV 벡터를 포함하거나 상기 AAV 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 사용설명서를 포함하는 키트.
  45. 제 19 항의 AAV 벡터, 및 rep 및 cap 유전자를 함유한 구축물로 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 방법은 생산된 재조합 바이러스 입자를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  47. 제 45 항의 방법에 의해 생산된 재조합 바이러스 입자.
  48. (a) 캡시드 단백질 및 (b) 제 19 항의 AAV 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자.
  49. 필요로 하는 대상에서 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 제 19 항에 따른 AAV 벡터 또는 제 48 항에 따른 재조합 바이러스 입자를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 망막 또는 황반 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 망막 또는 황반 질환이 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반병증, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리, 유전성 망막질환 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 황반변성이 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 연령-관련 황반변성은 습성 또는 건성인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  54. 제 51 항에 있어서, 상기 망막병증은 당뇨병성 망막병증인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  55. 제 51 항에 있어서, 추가 치료제를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
KR1020230068976A 2022-05-31 2023-05-30 망막 또는 황반 질환 치료용 조성물 KR20230167312A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2023/007442 WO2023234701A1 (ko) 2022-05-31 2023-05-31 망막 또는 황반 질환 치료용 조성물

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220066635 2022-05-31
KR20220066635 2022-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230167312A true KR20230167312A (ko) 2023-12-08

Family

ID=89166822

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230068976A KR20230167312A (ko) 2022-05-31 2023-05-30 망막 또는 황반 질환 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230167312A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3717636B1 (en) Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
US11419949B2 (en) Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
JP7257377B2 (ja) Ｃｎｇｂ１連鎖性網膜色素変性症の治療のための遺伝子療法
JP2023539368A (ja) コドン最適化したｒｐｇｒｏｒｆ１５遺伝子およびその使用
CN111926021A (zh) 重组人norrin胱氨酸结生长因子表达载体及其应用
KR20230167312A (ko) 망막 또는 황반 질환 치료용 조성물
KR102599534B1 (ko) 신규한 인트론 단편
CN111909935B (zh) 重组人卷曲蛋白受体4(fzd4)的表达载体及其应用
RU2773756C2 (ru) Варианты капсидов аденоассоциированного вируса и их применение для ингибирования ангиогенеза