JP4714682B2 - 造血幹細胞及び該細胞による眼の血管新生性疾患の治療方法 - Google Patents

Description

本出願は、２００２年７月２５日に出願された仮特許出願第６０／３９８，５２２号及び２００３年５月２日に出願された仮特許出願第６０／４６７，０５１号の利益を主張する、２００３年７月２５日出願の、米国特許出願番号第１０／６２８，７８３に対する出願の一部継続出願であり、これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載されている研究の一部は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（国立がん研究所）からのグラント第ＣＡ９２５７７号及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（国立衛生研究所）からのグラント第ＥＹ１１２５４号、ＥＹ１２５９８号、ＥＹ１２５９９８号による補助を受けて為されたものである。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

本発明は、単離された、哺乳動物の、骨髄由来の系統陰性の造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）集団及びその使用に関する。本発明は、とりわけ、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含有する、単離された、哺乳動物の系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）集団に関し、前記細胞はＣＤ１３３陰性又は陽性であって、前記細胞がインテグリンα６に関する表面抗原を発現し、表面抗原ＣＤ３１を発現する造血幹細胞集団である。本発明は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ及び形質移入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の眼への投与による眼の血管疾患の治療にも関する。

網膜の遺伝性変性は、３５００人に１人が影響を受け、完全な失明に進行することが多い、進行性の夜盲症、視野欠損、視神経萎縮、細動脈減弱、血管透過性の変化及び中央部の視力喪失を特徴とする（Ｈｅｃｋｅｎｌｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｒ．，ｅｄｉｔｏｒ，１９８８；Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＪＢ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．）。これらの疾患の分子遺伝学的解析により１１０種類以上の様々な遺伝子における突然変異が同定されたが、既知の罹患者においてこれらが占める割合は比較的少ない（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０４−８０８；Ｆａｒｒａｒら、２００２，ＥＭＢＯ Ｊ．２１：８５７−８６４）。これらの突然変異の多くは、ロドプシン、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、ｒｄｓぺリフェリン及びＲＰＥ６５を含む、光情報伝達機構の酵素的及び構造的成分に関連する。これらの観察にもかかわらず、これらの網膜変性疾患の進行を遅らせる、又は改善させる効果的な治療は依然として存在しない。遺伝子治療の最近の進展により、特異的な突然変異のある動物において、野生型の導入遺伝子を光受容体又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）に送達させることで、マウスにおけるｒｄｓ（Ａｌｉら、２０００、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：３０６−３１０）及びｒｄ（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７８１２−７８１６）表現型、及びイヌにおけるＲＰＥ６５表現型（Ａｃｌａｎｄら、２００１、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２−９５）を首尾よく改善できるようになった。

加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）と糖尿病網膜症（ＤＲ）は先進国における主要な失明の原因であり、網膜での異常な新生血管形成の結果として発生する。網膜は、明瞭に区切られた神経細胞、グリア及び血管要素の層からなり、血管増殖や浮腫に見られるような比較的小さな障害が視覚機能の著しい損失を起こし得る。色素性網膜炎（ＲＰ）等の遺伝性の網膜変性もまた、細動脈の狭窄や血管の萎縮などの血管の異常に関連している。血管新生を促進及び阻害する因子の同定には著しい進歩があったが、眼の血管の疾患を特異的に治療する方法は現在のところ得られていない。

以前から、幹細胞の集団が正常な成体の循環系及び骨髄に存在することが知られていた。これらの細胞の様々なサブ集団は、造血性の系統陽性（Ｌｉｎ^＋）又は系統陰性（Ｌｉｎ⁻）の系列に沿って分化することができる。さらに、近年では、系統陰性の造血幹細胞（ＨＳＣ）集団が、インビトロ及びインビボで血管を形成することができる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含有することが示されている（Ａｓａｈａｒａら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５， ９６４−７）。これらの細胞は、肝細胞（Ｌａｇａｓｓｅら、２０００，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，１２２９−３４を参照。）、ミクログリア（Ｐｒｉｌｌｅｒら、２００２，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，１３５６−６１を参照）、心筋細胞（Ｏｒｌｉｃら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９８，１０３４４−９を参照。）及び上皮細胞（Ｌｙｄｅｎら、２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，１１９４−１２０１を参照。）を含む内皮細胞以外の多様な細胞に分化するとともに、出生後の正常及び病的な血管新生に関与し得る（Ｌｙｄｅｎら、２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，１１９４−２０１、Ｋａｌｋａら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，３４２２−７；及びＫｏｃｈｅｒら、２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，４３０−６を参照。）。これらの細胞は血管新生のいくつかの実験的モデルにおいて使用されてきたが、ＥＰＣが新生血管を標的とするメカニズムは不明であり、特定の血管構造に寄与する細胞の数を効果的に増加させる戦略は明らかとはなっていない。

骨髄由来の造血幹細胞は現在、治療用途に一般に使用される唯一のタイプの幹細胞である。骨髄ＨＳＣは、４０年以上にわたり移植に使用されてきた。現在のところ、白血病、リンパ腫及び遺伝性血液疾患の処置のための療法を開発するために、精製した幹細胞を回収する先進的な方法が研究途上にある。限られた数のヒト患者において、糖尿病及び進行性の腎臓癌の治療に対するヒトにおける幹細胞の臨床適用が研究されている。

本発明は、その細胞表面で系統表面抗原（Ｌｉｎ）を発現しない、つまり系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）の、単離された、哺乳動物の造血幹細胞集団（ＨＳＣ）を提供する。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、眼に硝子体内注入された場合に、活性化された網膜星状細胞を選択的に標的とする、内皮プレカーサー細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）としても知られている、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣは、好ましくは成体哺乳動物の骨髄由来であるが、成人ヒト骨髄由来であることがより好ましい。

好ましい実施形態において、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、成体哺乳動物から骨髄を抽出することと；前記骨髄から複数の単球を分離することと；１つ又は複数の系統表面抗原に対するビオチン結合系統パネル抗体で前記単球を標識することと、前記系統表面抗原に対して陽性である単球を除去して、次にＥＰＣを含有するＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を回収することにより単離される。好ましくは、その単球は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ、ＴＥＲ−１１９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ６６ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）からなる群より選択される１つ又は複数の系統表面抗原に対するビオチン結合系統パネル抗体で標識される。好ましくは、単離された、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の細胞の少なくとも約２０％が表面抗原ＣＤ３１を発現する。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団内のＥＰＣは発生過程にある網膜の血管に広く取り込まれ、眼の新生脈管構造に安定に取り込まれた状態となる。本発明の、単離された、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、哺乳動物の変性した網膜脈管構造を救出し安定化させるために、神経ネットワークを救出するために、及び虚血組織の修復を促進するために使用することができる。

ある好ましい実施形態において、本単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団の細胞は、治療上有用な遺伝子を用いてトランスフェクションされる。例えば、神経栄養性物質又は抗−血管形成剤を操作可能にコードするポリヌクレオチドを形質移入された細胞は、選択的に新生血管を標的とすることができ、細胞を用いた遺伝子治療の形式によって、すでに構築されている血管に影響を与えることなく新たな血管形成を阻害できる。ある実施形態において、本発明の、単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、血管形成阻害ペプチドをコードする遺伝子を含む。血管形成阻害Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、ＡＲＭＤ、ＤＲ及び異常な脈管構造に関連するある網膜変性等の疾患における異常な血管成長を調節するのに有用である。別の好ましい実施形態において、単離された、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣは、神経栄養性ペプチドをコードする遺伝子を含む。その神経栄養性Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、緑内障、網膜色素変性症等の網膜神経変性に関連する眼疾患における神経救出を促進するために有用である。

本発明の、単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団で眼を治療することの特別な利点は、眼の硝子体内にＬｉｎ⁻ＨＳＣ処理を行った際に観察される血管栄養性及び神経栄養性の救出効果である。本発明の単離された治療した眼において、網膜のニューロン及び光受容体が保存され、視覚機能が維持される。本発明は、活性化網膜星状細胞を選択的に標的とする内皮前駆細胞を含有し、該単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣのうち少なくとも約５０％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、該単離Ｌｉｎ⁻ＨＳＣのうち少なくとも約５０％が表面抗原ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）を発現する、骨髄由来の単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を投与することを含む、網膜変性を治療するための方法を提供する。

本発明はまた、成体の哺乳動物骨髄、好ましくは成人ヒト骨髄から得られる内皮前駆細胞を含有する系統陰性の造血幹細胞集団を単離する方法も提供する。さらに、網膜の脈管構造の再生又は回復のための治療、ならびに網膜神経組織変性の治療又は改善に有用なヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣから、遺伝的に同一の細胞株（つまりクローン）を作り出すことができる。

幹細胞は、典型的に、細胞表面の抗原の分布により同定される（詳細は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｏｌｉｃｙにより用意されたレポート。）、２００１年６月、ＡｐｐｅｎｄｉｘＥ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍａｒｋｅｒｓ（本明細書中に、参照により、適宜に組み込まれる。）を参照。）
造血幹細胞は、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、血小板及び赤血球といった様々な血液細胞型に分化することができる幹細胞である。系統表面抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ：ＣＤ１８）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、マウスＬｙ−６Ｇ、マウスＴＥＲ−１１９、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ６６ｂ、ヒト白血球抗原 ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）を含む、成熟血液細胞系列のマーカーである細胞表面タンパク質のグループである。これらの抗原を著しいレベルで発現しない造血幹細胞は、一般に系統陰性（Ｌｉｎ⁻）と呼ばれる。ヒト造血幹細胞は、一般に、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）及び／又はＣＤ１３３等の他の表面抗原を発現する。マウス造血幹細胞は、一般に、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、Ｔｈｙ−１及び／又はＳｃａ−１等の他の表面抗原を発現する。

本発明は、その細胞表面で「系統表面抗原」（Ｌｉｎ）を著しいレベルで発現しない、単離された造血幹細胞を提供する。本明細書中において、このような細胞を「系統陰性」又は「Ｌｉｎ⁻」造血幹細胞と呼ぶ。とりわけ、本発明は、発生中の脈管構造に取り込まれることができ、その後血管内皮細胞になるように分化できる、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、Ｌｉｎ⁻造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）の集団を提供する。好ましくは、単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の、培養培地中に存在する。

本明細書中及び付属の請求項で使用される場合、骨髄に対する「成体」という用語は、胚とは対立するものとして、出生後に、つまり、若年及び成体個体から単離された骨髄を含む。「成体の哺乳動物」という用語は、若年及び完全に成熟した哺乳動物の両方を意味する。

本発明は、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含有する、単離された、哺乳動物の系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）集団を提供する。本発明の単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、好ましくは、その細胞の少なくとも約２０％が、一般に内皮細胞に存在する表面抗原ＣＤ３１を発現する哺乳動物細胞を含有する。他の実施形態において、その細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１を発現し、より好ましくは、少なくとも約６５％が、最も好ましくは、少なくとも約７５％がＣＤ３１を発現する。好ましくは、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の細胞の少なくとも約５０％が、インテグリンα６抗原を発現する。

ある好ましいマウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の実施形態において、細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１抗原を発現し、前記細胞の少なくとも約５０％がＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）抗原を発現する。好ましくは、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞の少なくとも約７５％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、より好ましくは、その細胞の約８１％が表面抗原ＣＤ３１を発現する。別の好ましいマウスの実施形態において、前記細胞の少なくとも約６５％が表面抗原ＣＤ１１７を発現し、より好ましくは、それらの細胞の約７０％が表面抗原ＣＤ１１７を発現する。特に好ましい本発明の実施形態は、その細胞の約５０％から約８５％が表面抗原ＣＤ３１を発現し、その細胞の約７０％から約７５％が表面抗原ＣＤ１１７を発現する、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団である。

別の好ましい実施形態は、その細胞がＣＤ１３３陰性であり、その細胞の少なくとも約５０％がＣＤ３１表面抗原を発現し、その細胞の少なくとも約５０％がインテグリンα６抗原を発現する、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団である。さらに別の好ましい実施形態は、その細胞がＣＤ１３３陽性であり、その細胞の約３０％未満がＣＤ３１表面抗原を発現し、その細胞の約３０％未満がインテグリンα６抗原を発現するヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団である。

本発明の単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、それらの細胞を単離したマウス又はヒト等の哺乳動物種の眼に硝子体内注入された場合、星状細胞を選択的に標的とし、網膜新生血管に取り込まれる。

本発明の単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、内皮細胞に分化し、網膜内で血管構造を生じさせる内皮前駆細胞を含有する。とりわけ、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、網膜血管新生及び網膜血管変性疾患の治療及び網膜血管損傷の修復に有用である。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞は、網膜における神経救出を促進し、抗アポトーシス遺伝子の上方制御を促進する。驚くべきことに、本発明の成人ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が、網膜変性のある、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいてでさえも、網膜変性を抑制できることが分かった。従って、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、新生仔哺乳動物の、例えば酸素誘発性網膜症又は未熟児網膜症に罹患している哺乳動物等の、眼における網膜障害を治療するために利用し得る。

本発明はまた、哺乳動物の骨髄から内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を単離すること、及び、疾患を阻止するのに十分な数の単離された幹細胞を前記哺乳動物の眼の硝子体内に注入することを含む、哺乳動物における眼疾患を治療する方法を提供する。本方法は、新生、若年又は完全成熟哺乳動物における網膜変性疾患、網膜血管変性疾患、虚血性網膜症、血管からの出血、血管からの漏出及び脈絡膜症等の眼疾患を治療するために利用することができる。これらの疾患の例には、網膜傷害の他、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、糖尿病網膜症（ＤＲ）、推定眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、鎌状赤血球貧血及び色素性網膜炎が含まれる。

眼に注入される幹細胞数は、患者の眼の病状を抑止するのに十分な数である。例えば、細胞の数は、眼における網膜の損傷を修復し、網膜の新生脈管構造を安定化し、網膜の新生脈管構造を成熟させ、血管からの漏出や出血を防止又は修復するのに効果的な数であり得る。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の細胞は、細胞を利用した眼の遺伝子治療で用いられる抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子及び、神経救出効果を促進する神経栄養性物質をコードする遺伝子など、治療上有用な遺伝子を形質移入することができる。

形質移入された細胞には、網膜障害の治療に対して治療上有用であるあらゆる遺伝子を包含させることができる。ある好ましい実施形態において、形質移入された本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣは、ＴｒｐＲＳ等のタンパク質若しくはタンパク質断片を含む抗血管新生ペプチド又は、例えばＴｒｐＲＳのＴ１及びＴ２断片等のＴｒｐＲＳの抗血管新生断片を操作可能にコードする遺伝子を含む。これらは共同で所有された同時係属している米国特許出願第１０／０８０，８３９号に詳細に記載されており、その開示内容は、参照により、本願に組み込まれる。本発明の、抗血管形成ペプチドをコードする、形質移入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、糖尿病性網膜症等の疾患など、異常な血管発生を含む網膜疾患の治療に有用である。好ましくは、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、ヒト細胞である。

別の好ましい実施形態において、本発明の、形質移入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、神経成長因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、毛様体神経栄養因子、網膜色素上皮由来神経栄養因子、インスリン様成長因子、グリア細胞系列由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子等の神経栄養性物質を操作可能にコードする遺伝子を含む。このような神経栄養性Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、網膜神経に対する傷害等の治療において、緑内障及び網膜色素変性症等の網膜神経変性疾患における神経救出を促進するために有用である。網膜色素変性症の治療に有用であるとして、毛様体神経栄養因子の移植が報告されている（Ｋｉｒｂｙら、２００１、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．３（２）：２４１−８；Ｆａｒｒａｒら、２００２、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２１：８５７−８６４参照）。報告によると、脳由来神経栄養因子は、損傷を受けた網膜神経節において成長関連遺伝子を調節する（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４７：５６１−５７２参照。）。グリア細胞系列由来神経栄養因子は、報告によると、網膜色素変性症における光受容体の変性を遅らせる（ＭｃＧｅｅら、２００１、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．４（６）：６２２−９参照。）
本発明はまた、内皮前駆細胞を含む、哺乳動物の骨髄由来である、系統陰性の造血幹細胞を単離する方法も提供する。この方法は、（ａ）成体哺乳動物から骨髄を抽出する段階と、；（ｂ）前記骨髄から複数の単球を分離する段階と、；（ｃ）１つ又は複数の系統表面抗原、好ましくは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ（マウス）、ＴＥＲ−１１９（マウス）、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ６６ｂ、ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）からなる群より選択される系統表面抗原に対するビオチン結合系統パネル抗体で前記単球を標識し；（ｄ）前記複数の単球から前記１つ又は複数の系統表面抗原に対して陽性である単球を除去して、内皮前駆細胞を含む系統陰性の造血幹細胞集団を回収する段階と、を伴い、好ましくはその細胞の少なくとも約２０％がＣＤ３１を発現する。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが成人ヒト骨髄から単離される場合、好ましくは、単球は、系統表面抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６（Ｂ７．２）及びＣＤ２３５ａに対するビオチン結合系統パネル抗体で標識される。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣがマウス成体骨髄から単離される場合、好ましくは、単球は、系統表面抗原ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ４５、Ｌｙ−６Ｇ及びＴＥＲ−１１９に対するビオチン結合系統パネル抗体で標識される。

好ましい方法において、細胞は成人ヒト骨髄から単離され、さらにＣＤ１３３系統により分離される。ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを単離する、ある好ましい方法は、単球をビオチン結合ＣＤ１３３抗体で標識し、ＣＤ１３３陽性のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を回収する、さらなる段階を含む。典型的に、そのような細胞のうち約３０％未満がＣＤ３１を発現し、そのような細胞のうち約３０％未満がインテグリンα６を発現する。本発明の、ヒトＣｄ１３３陽性、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、血管形成が起こっていない眼に注入された場合、末梢の虚血主導の血管新生部位を標的とすることができる。

ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣを単離する、別の好ましい方法は、単球をビオチン結合ＣＤ１３３抗体で標識し、ＣＤ１３３陽性細胞を除去し、ＣＤ１３３陰性のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を回収する、さらなる段階を含む。典型的に、そのような細胞のうち少なくとも約５０％がＣＤ３１を発現し、そのような細胞のうち少なくとも約５０％がインテグリンα６を発現する。本発明の、ヒトＣＤ１３３陰性、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、血管新生が起こっている眼に注入された場合、発生中の脈管構造に取り込まれ得る。

本発明はまた、トランスフェクションした本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を、その細胞の眼への硝子体内注入により投与することによる、眼の血管形成性疾患を治療するための方法を提供する。形質移入されたそのようなＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞には、治療上有用な遺伝子、例えば抗血管形成又は神経栄養性遺伝子産物をコードする遺伝子等を形質移入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣが含まれる。好ましくは、形質移入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞は、ヒト細胞である。

好ましくは、網膜変性疾患に罹患している哺乳動物の眼に硝子体内注入することにより、少なくとも約１ｘ１０^５個のＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞又は形質移入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を投与する。注入されるべき細胞数は、網膜変性の重症度、哺乳動物の年齢及び網膜疾患を治療する当業者にとって容易に考えられる他の因子に依存し得る。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、治療を担当する臨床医により決定されるように、ある期間にわたり、単回投与又は複数回投与で投与し得る。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣは、網膜脈管構造の阻害もしくは変性、又は網膜神経変性などを含む網膜損傷及び網膜障害の治療に有用である。ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣはまた、網膜脈管構造の再生又は修復治療における使用、ならびに網膜神経変性の治療又は改善のための、遺伝的に同一の細胞株、つまりクローンを作り出すためにも使用され得る。

方法

細胞の単離と濃縮、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団Ａ及びＢの調製。

一般的な手順。インビボでの評価は全て、ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（実験動物の飼育と使用についてのＮＩＨの指針）に従って行い、評価手順は全て、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＴＳＲＩ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物の飼育及び使用に関する委員会）から承認を受けた。骨髄細胞をＢ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６、Ｔｉｅ−２ＧＦＰ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ、ＦＶＢ／ＮＪ（ｒｄ／ｒｄマウス）又はＢａｌｂ／ｃＢＹＪ成体マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＭＥ）から抽出した。

次いで、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた密度勾配分離によって単球を分離し、マウスにおいてＬｉｎ⁻を選択するためにビオチン結合系統パネル抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１、ＴＥＲ−１１９（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で標識した。磁気分離装置（ＡＵＴＯＭＡＣＳ^ＴＭソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）を用いて系統陽性（Ｌｉｎ^＋）細胞をＬｉｎ⁻ＨＳＣから分離し除去した。さらにＦＡＣＳ^ＴＭ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用し、以下の抗体、すなわちＰＥ結合Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、ＫＤＲ及びＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、内皮前駆細胞を含有する得られたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団の性質決定を行った。Ｔｉｅ−２の性質決定には、Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ骨髄細胞を用いた。

成体マウス内皮細胞を採取するために、腸間膜組織をＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから外科的に取り除き、組織を消化するためにコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ， Ｌａｋｅｗｏｏｄ， ＮＪ）中に置いた後、４５μｍフィルターを用いてろ過した。ろ液を集めＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ（内皮細胞成長培地）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともにインキュベートした。形態学的に敷石上の外見が観察されること、ＣＤ３１ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色されること及びＭＡＴＲＩＧＥＬ^ＴＭマトリックス（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で培養物が管状構造を形成するか否かを試験することによって、内皮細胞の特徴を確認した。

マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団Ａ。骨髄細胞をＡＣＴｂＥＧＦＰマウスから上記の一般的手順により抽出した。ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ｆｌｋ−１及びＴｉｅ−２細胞表面抗原マーカーに対するＦＡＣＳフローサイトメトリーによって、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞の性質決定を行った。結果を図１ｃに示す。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約８１％はＣＤ３１マーカーを、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約７０．５％はｃ−ｋｉｔマーカーを、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約４％はＳｃａ−１マーカーを、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの約２．２％はＦｌｋ−１マーカーを、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞の約０．９１％はＴｉｅ−２マーカーを提示した。これに対して、これらの骨髄細胞から単離されたＬｉｎ^＋ＨＳＣは著しく異なる細胞マーカー特性（すなわちＣＤ３１は３７．４％、ｃ−ｋｉｔは２０％、Ｓｃａ−１は２．８％、Ｆｌｋ−は０．０５％）を有していた。

マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団Ｂ。Ｂａｌｂ／Ｃ、ＡＣＴｂＥＧＦＰ及びＣ３Ｈマウスから、上記の一般的手順によって骨髄細胞を抽出した。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を細胞表面マーカー（Ｓｃａ−１、ＫＤＲ、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ３４、ＣＤ３１及び様々なインテグリン：α１、α２、α３、α４、α５、α６、α_Ｍ、α_Ｖ、α_Ｘ、α_ＩＩｂ、β_１、β_４、β_３、β_４、β_５及びβ_７）の存在について解析した。結果を表１に示す。

マウスモデルにおける細胞の硝子体内投与
Ｐ２からＰ６の眼球を露出するために、鋭利な刃によって、マウスのまぶたに裂け目を入れた。次に本発明の系統陰性ＨＳＣ集団Ａ（細胞培養培地約０．５μｌから約１μｌ中におよそ１０^５細胞）を３３ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ， ＮＶ）の針の付いたシリンジで硝子体内に注入した。

ＥＰＣトランスフェクション
製造業者のプロトコールに従い、ＦｕＧＥＮＥ^ＴＭ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、ＴｒｐＲＳのＴ２断片をコードしＨｉｓ_６タグも封入するＤＮＡ（配列番号１、図７）をマウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ（集団Ａ）にトランスフェクションした。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞（１ｍｌあたり約１０^６細胞）を幹細胞因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含有するｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に懸濁した。次いで、ＤＮＡ（約１μｇ）及びＦｕＧＥＮＥ試薬（約３μｌ）の混合物を添加し、混合物を約３７℃で約１８時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を洗浄し回収した。このシステムのトランスフェクション効率は、ＦＡＣＳ解析で確認したところ、およそ１７％であった。Ｔ２の産生をウエスタンブロッティングにより確認した。Ｈｉｓ_６タグ付加Ｔ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列を配列番号２、図８に示す。

免疫組織化学及び共焦点解析
マウス網膜をさまざまな時点で採取し、ホールマウント用又は凍結切片作製用に調製した。ホールマウント用には、網膜を４％パラホルムアルデヒドで固定し、５０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び２０％正常ヤギ血清中において１時間周囲の室温でブロッキングした。網膜を一次抗体で処理し、二次抗体で検出した。使用した一次抗体は、抗コラーゲンＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、抗β−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、抗α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ，Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）であった。使用した二次抗体をＡｌｅｘａ４８８又は５９４蛍光マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に結合させた。画像はＭＲＣ１０２４共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で撮影した。ホールマウント網膜中での血管の発生について３つの異なる層を調べるために、ＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて三次元画像を作製した。共焦点顕微鏡によって識別される、増強ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マウスとＧＦＡＰ／ｗｔＧＦＰマウスとの間のＧＦＰ画素強度の相違を利用して３Ｄ画像を作製した。

マウスにおけるインビボでの網膜の血管新生定量アッセイ
Ｔ２−ＴｒｐＲＳ解析のために、第一及び深層の叢をマウス網膜の三次元画像から再構築した。第一叢を二つのカテゴリー、正常発生又は血管発生停止に分けた。深層での血管発生阻害についてのカテゴリーは、以下の基準を含む血管阻害の百分率に基づいて解釈した。深層叢形成の完全阻害を“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（完全）”と、正常血管発生（２５％未満の阻害を含む）を“Ｎｏｒｍａｌ（正常）”と、残りを“Ｐａｒｔｉａｌ（部分的）”とに分類した。ｒｄ／ｒｄマウスの救出データを得るために、ホールマウント網膜それぞれについて、さらに深層の叢の４つの独立した領域を１０Ｘレンズで捉えた。脈管構造の全長を各画像について計算し、まとめ、グループ間で比較した。正確な情報を得るために、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを一方の眼に、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣを同じマウスのもう一方の眼に注入した。注入しない対照網膜は同じ親から生まれたマウスより得た。

成体網膜傷害マウスモデル
ダイオードレーザー（１５０ｍＷ、１秒、５０ｍｍ）を用いて、又は２７ゲージ針で機械的にマウス網膜に穴を開けることによって、レーザー及び傷跡のモデルを作製した。傷を与えてから５日後、硝子体内法を用いて細胞を注入した。更にその５日後にマウスから眼を採取した。

網膜再生の神経栄養性救出
成体のマウス骨髄由来の系統陰性造血幹細胞（Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）は網膜変性のマウスモデルにおいて血管栄養及び神経栄養性の救出効果を有している。１０日齢マウスの右眼に本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣを約１０^５個含有する約０．５μｌを硝子体内注入し、２ヶ月後、網膜の脈管構造の存在及び神経層の核数について評価した。同じマウスの左眼にほぼ同じ数のＬｉｎ^＋ＨＳＣを対照として注入し、同様に評価した。図９に示すように、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣで処理した眼では、網膜の脈管構造はほぼ正常なようであり、内顆粒層はほぼ正常、外顆粒層（ＯＮＬ）は約３から約４の核層を有していた。対照的に、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣで処理した反対側の眼では、網膜血管の中間層が著しく萎縮し、網膜血管の外層は完全に萎縮し、内顆粒層は著しく萎縮し、外顆粒層は完全に消失していた。これはマウス３及びマウス５で顕著に示された。マウス１では、救出効果はなく、これは注入を行ったマウスのおよそ１５％で当てはまった。

視覚機能を網膜電図（ＥＲＧ）で評価すると、血管及び神経の両者が救出された場合（マウス３及び５）に陽性ＥＲＧの回復が観察された。陽性ＥＲＧは、血管又は神経の救出がない場合（マウス１）には観察されなかった。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣによる、ｒｄ／ｒｄマウスの眼における血管性と神経栄養性の救出との間の相関は、図１０の回帰分析プロットによって示される。神経（ｙ軸）回復と血管（ｘ軸）回復との間に見られる相関は中間の脈管型（ｒ＝０．４５）及び深層の脈管型（ｒ＝０．６７）で観察された。

図１１に示すように、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣによる血管救出と神経救出との間にはいかなる統計的に有意な相関も存在しない。血管の救出を定量化し、そのデータを図１２に示す。図１２に示す注入後１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）及び６ヶ月（６Ｍ）のマウスのデータによれば、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣで処理した眼（黒い棒）では、同じマウスの非処理の眼（白い棒）の血管長と比べて、特に注入後１ヶ月及び２ヶ月で、血管長が顕著に伸びたことが明らかである。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又はＬｉｎ^＋ＨＳＣの注入後約２ヶ月に内顆粒層及び外顆粒層の核を数えることにより、神経栄養性の救出効果を定量化した。結果を図１３及び１４に示す。

ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団
上述した一般プロトコールにより、健康な成人ヒトボランティアから骨髄細胞を抽出した。次いで、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）ポリスクロース勾配（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた密度勾配分離によって単球を分離した。以下のビオチン結合系統パネル抗体（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ２３５ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、磁気分離装置（ＡＵＴＯＭＡＣＳ^ＴＭソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によりヒト骨髄単球細胞からＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を単離した。

ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を、ＣＤ１３３発現により、２つのサブ集団にさらに分離した。ビオチン結合ＣＤ１３３抗体でそれらの細胞を標識し、ＣＤ１３３陽性及びＣＤ１３３陰性のサブ集団に分離した。

網膜変性に対するマウスモデルにおける、ヒト及びマウス細胞の硝子体内投与。

網膜変性モデルとして、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤ及びｒｄ１０マウス系列を使用した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ及びＣ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｉｎｅ）は、ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ１（ｒｄ１）突然変異に関してホモ接合性であり、早期に重度の網膜変性を起こす突然変異体である。突然変異は、桿状体光受容体 ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ βサブユニットをコードするＰｄｅ６ｂ遺伝子のエクソン７に位置する。この遺伝子における突然変異は、常染色体劣性の網膜色素変性症（ＲＰ）のヒト患者において見つかっている。Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤマウスもまた、重症複合免疫不全症自然突然変異（Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤ）についてホモ接合であり、ヒト細胞移入実験において使用した。ｒｄ１０マウスにおける網膜変性は、Ｐｄｅ６ｂ遺伝子のエクソン１３における突然変異により生じる。これもまた、臨床的に意義のあるＲＰモデルであり、発症が遅く、網膜変性の程度がｒｄ１／ｒｄ１）よりも穏やかである。評価は全て、ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（実験動物の飼育と使用についてのＮＩＨの指針）に従って行い、手順は全て、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物の飼育及び使用に関する委員会）から承認を受けた。

Ｐ２からＰ６の眼球を露出するために、鋭利な刃によって、マウスの瞼に裂け目を入れた。次に、マウス集団Ａ又はヒト集団Ｃに対する系統陰性ＨＳＣ細胞（細胞培養培地 約０．５μｌから約１μｌ中におよそ１０^５細胞）を３３ゲージ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）の針の付いたシリンジでマウスの眼に硝子体内注入した。注入されたヒト細胞を見えるようにするために、色素（Ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎ、ＣＭＦＤＡ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で注入前に細胞を標識した。

様々な時点で網膜を回収し、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及びメタノールで固定し、次に、５０％ ＦＢＳ／２０％ ＮＧＳ中で室温にて１時間ブロッキングした。網膜脈管構造を染色するために、抗−ＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗−コラーゲンＩＶ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗体とともに網膜をインキュベーションし、その後、Ａｌｅｘａ ４８８又は５９４結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）とともにインキュベーションした。ホールマウント標本を得るために、４方向に放射状に減張切開してその網膜を平らに置いた。Ｒａｄｉａｎｃｅ ＭＰ２１００共焦点顕微鏡及びＬＡＳＥＲＳＨＡＲＰ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、中間又は深層網膜血管叢における脈管構造の像（Ｄｏｒｒｅｌｌら、２００２ Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３：３５００−３５１０を参照。）を得た。脈管構造の定量のために、中間及び深層血管層の中央部分から４つの別個の視野（９００μｍｘ９００μｍ）を無作為に選択し、ＬＡＳＥＲＰＩＸ（登録商標）解析ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、脈管構造の全長を測定した。同一叢におけるこれらの４視野の全長をさらなる解析に使用した。

凍結切片用に、平らに置いた網膜を再包埋した。網膜を４％ＰＦＡ中に一晩置き、その後、２０％スクロースとともにインキュベーションした。最適切削温度コンパウンド（ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＣＴ：Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；Ｓａｋｕｒａ ＦｉｎｅＴｅｃｈ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）にその網膜を包埋した。核色素 ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含有するＰＢＳ中で凍結切片（１０μｍ）を再水和した。視神経頭及び周辺部網膜全体を含む１つの切片の３つの異なる領域（２８０μｍ幅、無作為サンプリング）において、ＤＡＰＩ標識された核の像を共焦点顕微鏡で撮影した。１つの切片中の３つの独立した視野のＯＮＬに位置する核の数を数え、解析のために合計した。単純線形回帰分析を行い、深層叢における脈管構造の長さとＯＮＬにおける細胞核の数との間の関係を調べた。

一晩暗順応を行った後、１５μｇ／ｇｍ ケタミン及び７μｇ／ｇｍキシラジンの腹腔内注射によりマウスを麻酔した。マウスリファレンス（ｍｏｕｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）及び尾部接地電極とともに金ループ角膜電極を用いて、瞳孔拡張（１％ 硫酸アトロピン）後に、各眼の角膜表面から網膜電図（ＥＲＧ）を記録した。反射率の高いＧａｎｚｆｅｌｄドームの外側に取り付けられたＧｒａｓｓ Ｐｈｏｔｉｃ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＰＳ３３ Ｐｌｕｓ，Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ）により刺激を生じさせた。光刺激発生装置に許容される最大強度（０．６６８ｃｄ−ｓ／ｍ^２）までの強度範囲にわたる短波長（Ｗｒａｔｔｅｎ ４７Ａ：λｍａｘ＝４７０ｎｍ）の光のフラッシュに対して、桿状体の反応を記録した。反応シグナルを増幅し（ＣＰ５１１ ＡＣ 増幅器、Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、デジタル化し（ＰＣＩ−１２００，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、コンピューター解析を行った。各マウスを、ＥＲＧを処理及び非処理の眼の両方から記録して、それ自身の内部対照とした。最も弱いシグナルに対して、１００スイープまでを平均した。非処理の眼の平均反応を処理した眼の反応からデジタル処理で差し引き、シグナルにおけるこの差を機能的救出の指標とするために使用した。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ標的網膜遺伝子発現を評価するために、マイクロアレイ解析を使用した。Ｐ６ ｒｄ／ｒｄマウスに、Ｌｉｎ⁻又はＣＤ３１⁻ＨＳＣのいずれかを注入した。注入後４０日に、ＲＮａｓｅフリー培地中でこれらのマウスの網膜を切り出した（網膜脈管構造及び光受容体層の救出は、注入後この時点で明らかである。）。正常なＨＳＣ標的ならびに脈管構造及び神経保護が達成されたことを確認するために、ホールマウントにより各網膜の４分の１の部分を分析した。ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、フェノール／クロロホルムＲＮＡ単離プロトコールを用いて、注入に成功した網膜由来のＲＮＡを精製した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｕ７４Ａｖ２チップにＲＮＡをハイブリダイズさせ、ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）ソフトウェア（ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて遺伝子発現を解析した。精製したヒト又はマウスＨＳＣをＰ６マウスに硝子体内注入した。ＲＮＡの精製及びヒト特異的Ｕ１３３Ａ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ チップへのハイブリダイゼーション用に、Ｐ４５に、その網膜を切り出し、１）ヒトＨＳＣ注入、救出マウス網膜、２）ヒトＨＳＣ注入、非救出マウス網膜、３）マウスＨＳＣ注入、救出マウス網膜のフラクションに分けて集めた。ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）ソフトウェアを使用して、バックグラウンドより高く、ヒトＨＳＣ救出網膜においてより高く発現される遺伝子を同定した。次に、これらの遺伝子のそれぞれに対するプローブペアの発現特性を個々に解析し、ｄＣｈｉｐを用いて正常ヒトＵ１３３Ａ マイクロアレイ実験のモデルと比較し、ヒト種特異的ハイブリダイゼーションを特定し、異種間のハイブリダイゼーションによる偽陽性を除いた。

ＣＤ１３３陽性及びＣＤ１３３陰性のＬｉｎ⁻ＨＳＣサブ集団を、新生仔ＳＣＩＤマウスの眼に硝子体内注入した場合、ＣＤ３１及びインテグリンα６表面抗原の両方を発現するＣＤ１３３陰性サブ集団の場合に発生中の脈管構造へ最も多く取り込まれたことが観察された（図２１、下参照）。ＣＤ１３３陽性サブ集団は、ＣＤ３１又はインテグリンα６を発現せず（図２１、上）、周辺部の虚血主導の血管新生の部位を標的とすると思われるが、血管形成が起こっている最中の眼に注入した場合、そのような部位を標的としないと思われる。

酸素誘発性網膜変性に対するマウスモデルにおけるマウス細胞の硝子体内投与。

酸素誘発性網膜変性（ＯＩＲ）モデルにおいて、新生仔野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスを、出生後Ｐ７からＰ１２の間、酸素過剰状態（７５％酸素）に曝露した。図２２は、Ｐ０からＰ３０における、Ｃ５７Ｂ１６マウスの正常な出生後の血管発生を説明する。Ｐ０において、視神経円板周囲で発芽状態の表面血管のみが観察できる。次の数日にわたり、最初の表面ネットワークが周辺部に広がり、Ｐ１０までに遠く離れた周辺部に到達する。Ｐ７からＰ１２の間に、二次（深層）叢が発生する。Ｐ１７までに、広域に及ぶ表面及び深層の血管ネットワークが現れる（図２２、挿入図）。その後の数日間、成体の構造がおよそＰ２１にできるまで、血管の三次（中間）層の発生に伴い、再構築が起こる。

一方で、ＯＩＲモデルにおいて、Ｐ７からＰ１２に７５％酸素に曝露した後、正常な一連の段階が大幅に障害される（図２３）。Ｐ３に、本発明の成体マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を、その後ＯＩＲを起こすマウスの片方の眼に硝子体内注入し、他方の眼にＰＢＳ又はＣＤ３１陰性細胞を対照として注入した。図２４は、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団が、発生中のマウス網膜において、変性を引き起こす高酸素状態による影響に拮抗することができることを説明する。処理した眼において、Ｐ１７に、完全に発生が進んだ表面及び深層の網膜脈管構造が観察されたが、一方で、対照の眼では、実質的に深層血管がない無血管エリアが広く見られた（図２４）。ＯＩＲモデルにおけるマウスのおよそ１００個の眼を観察した。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団で処理した眼の５８％において正常な脈管化が観察されたが、一方、対照の眼では、正常な脈管化が観察されたのは、ＣＤ⁻３１細胞で処理した眼のうち１２％であり、ＰＢＳで処理した眼のうち３％であった。

結果
マウス網膜血管の発生；眼の血管形成についてのモデル
マウスの眼は、ヒト等の哺乳動物の網膜血管の発生に関する研究に対する認識されたモデルを与える。マウスの網膜脈管構造が発生する時期において、虚血が引き起こした網膜血管は星状細胞と密接に関係して発生する。これらグリアの要素は、妊娠三半期のうちの最後のヒト胎児又は新生期のげっ歯類の網膜上へ視神経円板から神経節細胞層に沿って移動し、放射状に広がる。マウスの網膜脈管構造が発生するにつれて、内皮細胞は既に確立されたこの星状細胞の鋳型を利用し、網膜の血管パターンを決定する（図１ａ及びｂ参照）。図１（ａ及びｂ）は、発生過程にあるマウス網膜の概略図を表している。図１ａは星状細胞の鋳型（明るい線）上に重なっている第一叢（図の左上の暗い線）の発生を表しており、図１ｂは網膜の血管形成の第二段階を表している。図中、ＧＣＬは神経節細胞層、ＩＰＬは内網状層、ＩＮＬは内顆粒層、ＯＰＬは外網状層、ＯＮＬは外顆粒層、ＲＰＥは網膜色素上皮、ＯＮは視神経及びＰは末梢を意味する。

出生時、網膜の脈管構造は実質的に存在しない。出生後１４日（Ｐ１４）までに物が見え始めるようになるのと一致して、網膜は、網膜血管の複雑な第一（表面）及び第二（深部）層を発達させる。初めに、スポーク状の乳頭周囲の血管が、末梢に向かって、すでに存在している星状細胞のネットワーク上を放射状に成長し、続いて毛細管状の叢を形成することで次第に相互に連結するようになる。これらの血管はＰ１０まで神経線維内で単層として成長する（図１ａ）。Ｐ７からＰ８の間に側副枝がこの第一叢から出芽し始め、網膜を通り外網状層へと貫通し、そこで第二のあるいは深層の網膜叢を形成する。Ｐ２１までにネットワーク全体が広範囲の再構築を行い、第三又は中間の叢が内顆粒層の内側表面に形成される（図１ｂ）。

新生期のマウス網膜の血管新生モデルはいくつかの理由から眼の血管新生におけるＨＳＣの役割の研究に有用である。この生理学上意義のあるモデルにおいて、内在性の血管の出現前に大きな星状細胞の鋳型が存在し、それにより新生血管の形成過程における細胞−細胞間の標的化の役割を評価することが可能になっている。さらに、この新生期の網膜血管の一貫した再現性のある形成過程は低酸素により起こることが知られており、この点において虚血が関与することが知られる多くの網膜疾患と類似点がある。

骨髄からの内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の濃縮
細胞表面マーカーの発現はＨＳＣの調製物に見られるＥＰＣ集団について広く評価されてきたが、ＥＰＣを一意的に同定するマーカーはいまだ十分に定義されていない。ＥＰＣを濃縮するために、造血性の系統マーカー陽性細胞（Ｌｉｎ^＋）、すなわちＢリンパ球（ＣＤ４５）、Ｔリンパ球（ＣＤ３）、顆粒球（Ｌｙ−６Ｇ）、単球（ＣＤ１１）及び赤血球（ＴＥＲ−１１９）をマウスの骨髄単核細胞から除いた。ＥＰＣをさらに濃縮するためにＳｃａ−１抗原を使用した。同数のＬｉｎ⁻Ｓｃａ−１^＋細胞又はＬｉｎ⁻細胞を硝子体内に注入した後に得られた結果を比較したところ、２つのグループ間で違いは検出されなかった。実際に、Ｌｉｎ⁻Ｓｃａ−１⁻細胞のみを注入した場合、発生過程の血管への取り込みがはるかに多いことが観察された。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は機能アッセイに基づきＥＰＣについて濃縮される。その上、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ集団はＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団とは機能的に全く異なる振る舞いをする。各画分（以前に報告されたインビトロにおける性質決定の研究に基づく。）について、ＥＰＣを同定するのに広く用いられるエピトープも評価した。Ｌｉｎ⁻画分のみに見られるマーカーはなかったが、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ画分と比較して、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣでは、全てのマーカーが約７０から約１８００％上昇していた（図１ｃ）。図１ｃは骨髄由来の分離されたＬｉｎ^＋ＨＳＣ及びＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞に対して行ったフローサイトメトリーによる性質決定を示している。図１ｃ上列は抗体でラベルされていない造血幹細胞のドットプロット分布を示している。Ｒ１はＰＥ染色陽性が定量可能なようにゲーティングされた領域を表し、Ｒ２はＧＦＰ陽性を表している。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣのドットプロットを中列に示し、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣのドットプロットを下列に示す。Ｃ５７Ｂ／６細胞をＳｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対するＰＥに結合した抗体で標識した。Ｔｉｅ−２のデータをＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスから得た。ドットプロットの角に記載されている百分率は全Ｌｉｎ⁻又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ集団のうち陽性に標識された細胞のパーセントを示す。興味深いことに、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｔｉｅ−２及びＳｃａ−１のような一般に容認されているＥＰＣマーカーはほとんど発現しておらず、このため、さらなる分画化には使用しなかった。

硝子体内に注入されたＨＳＣ Ｌｉｎ⁻細胞は、星状細胞を標的とし、発生過程にある網膜脈管構造に取り込まれる、ＥＰＣを含有する。

硝子体内に注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣが網膜の特異的な細胞種を標的とし、星状細胞の鋳型を利用して網膜の血管新生に関与しうるか否かを調べるために、成体（ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニック）マウスの骨髄から単離された本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物から得たおよそ１０^５個の細胞、又は成体（ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニック）マウスの骨髄から単離したＬｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（対照、約１０^５細胞）を出生後２日（Ｐ２）のマウスの眼に注入した。注入から４日後（Ｐ６）、ＧＦＰ又はＬａｃＺトランスジェニックマウスから採取された、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物から得た多くの細胞は網膜に付着し、内皮細胞が示す、特徴的な伸張した外観を有した（図２ａ）。図２は発生過程にあるマウス網膜へのＬｉｎ⁻細胞の移植を表している。図２ａに示すように、注入後４日（Ｐ６）で硝子体内に注入されたｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは網膜上に接着し分化する。

網膜の多くの領域で、ＧＦＰ発現細胞はその下部に存在する星状細胞に適合するパターンで配置され、血管に類似していた。これらの蛍光細胞は内在性の発生過程にある血管ネットワークの先端に観察された（図２ｂ）。反対に、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ（図２ｃ）又は成体マウスの腸管膜内皮細胞（図２ｄ）は少数が網膜表面に接着しているにすぎなかった。注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団由来の細胞が網膜のすでに確立している管にも接着できるか否かを調べるために、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を成体の眼に注入した。興味深いことに、細胞は網膜に付着しておらず、確立している正常な網膜血管中に取り込まれていないことが観察された（図２ｅ）。このことは、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物が正常に発生した血管構造を妨害しないので、正常に発生した網膜で異常な血管新生を起こさないであろうことを示している。

注入された本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物と網膜星状細胞との関係を調べるために、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、星状細胞のマーカー）及びプロモーター誘導緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウスを使用した。ｅＧＦＰトランスジェニックマウスから得たＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した、これらのＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの網膜を調べたところ、注入されたｅＧＦＰ ＥＰＣと既存の星状細胞とが同じ場所に局在していた（図２ｆ−ｈ、矢印）。ｅＧＦＰ＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの突起は、その下に位置する星状細胞ネットワークに一致していることが観察された（矢印、図２ｇ）。これらの眼の試験から、注入された標識細胞のみが星状細胞に接着することが示された。Ｐ６マウスの網膜では、網膜の末梢はまだ内因性の血管を有さないが、注入された細胞はこれらのまだ血管形成されていない領域の星状細胞に付着することが観察された。驚くべきことに、注入された標識細胞は網膜のさらに深い層の正しい場所（そこには後に正常な網膜の管が形成される）で観察された（図２ｉ、矢印）。

注入された本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣが発生過程にある網膜脈管構造中に安定に取り込まれるか否かを調べるために、その後、複数の時点で網膜の血管を調べた。早くもＰ９（注入後７日）には、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣはＣＤ３１^＋構造中に取り込まれた（図２ｊ）。Ｐ１６（注入後１４日）までには、既に細胞は網膜の血管様構造中に広く取り込まれていた（図２ｋ）。動物を屠殺する前に（機能的な網膜血管を同定するため）ローダミン−デキストランを硝子体内に注入すると、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの大部分は開通した血管に沿って整列していた（図２ｌ）。標識細胞の分布には２つのパターンが観察された。（１）一方のパターンでは、細胞は標識されていない内皮細胞の間を血管に沿って点在していた。（２）もう一方のパターンでは血管は専ら標識細胞で構成されていた。注入された細胞はまた深層の血管叢の管にも取り込まれていた（図２ｍ）。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ由来のＥＰＣが新生血管へ散在するように取り込まれることは以前より報告されていたが、血管ネットワークが専らこれらの細胞で構成されることについてはこれが初めての報告である。このことは、硝子体内に注入された本発明の骨髄由来のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団由来の細胞が形成過程にある網膜血管叢のいずれの層にも効率よく取り込まれ得ることを示している。

網膜以外の組織（例えば、脳、肝臓、心臓、肺、骨髄）の組織学的な試験からは、硝子体内注入から５日後又は１０日後まではＧＦＰ陽性細胞の存在は示されなかった。このことは、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ画分内の細胞のサブ集団が網膜星状細胞を選択的に標的とし、発生過程にある網膜脈管構造中に安定に取り込まれることを示している。これらの細胞は内皮細胞の多くの特徴を有している（網膜星状細胞との結合、伸張した形態、開通した管への安定した取り込み及び血管外に存在しないこと）ので、これらの細胞はＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団に存在するＥＰＣであることを意味している。標的とされた星状細胞は、多くの低酸素網膜症で観察されるものと同じタイプである。グリア細胞が、ＤＲや他の形式の網膜損傷で観察される、葉状の新生血管の主な構成要素であることはよく知られている。反応性グリオーシス及び虚血により誘導される新生血管形成時には、ヒトを含む多くの哺乳動物種で新生期に網膜血管の鋳型が形成される際に観察されるものと同様に、活性化された星状細胞が増殖し、サイトカインを産生し、ＧＦＡＰを上方制御する。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団が新生期の眼におけるのと同様に成体マウスの眼でも活性化された星状細胞を標的とするか否かを調べるために、光凝固（図３ａ）又は針先（図３ｂ）で網膜に損傷を与えた成体の眼に、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を注入した。両モデルにおいて、顕著にＧＦＡＰ染色された細胞集団が損傷部位周辺でのみ観察された（図３ａ及びｂ）。注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物由来の細胞は損傷部位に局在し、ＧＦＡＰ陽性星状細胞と特異的に結合したままであった（図３ａ及びｂ）。これらの部位では、新生期における深層の網膜脈管構造の形成時に見られるのと同様のレベルまで、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が網膜のより深い層に移動するのも観察された。損傷を与えなかった網膜部分には、正常で損傷のない成体網膜にＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入したときに観察されるのと同様に、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞は含有されていなかった（図２ｅ）。これらのデータは、血管形成している新生期の網膜と同様に、損傷を与えた成体網膜においてもグリオーシスにより活性化したグリア細胞を、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物が選択的に標的としうることを示している。

硝子体内に注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣは変性している脈管構造を救出し安定化できる
硝子体内に注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物は星状細胞を標的とし正常な網膜脈管構造中に取り込まれるから、これらの細胞はグリオーシス及び血管の変性を伴う虚血性又は変性網膜疾患に見られる変性した脈管構造も安定化する。ｒｄ／ｒｄマウスは、出生後１ヶ月までに光受容体及び網膜血管層に甚大な変性を示す網膜変性のモデルである。これらマウスの網膜脈管構造は、より深部の血管叢が退行するＰ１６までは正常に発生し、ほとんどのマウスでＰ３０までに深層及び中間の叢がほぼ完全に変性する。

ＨＳＣが退行した血管を救出できるか否かを調べるために、Ｌｉｎ^＋又はＬｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｂａｌｂ／ｃマウスから得た。）をＰ６にｒｄ／ｒｄマウスの硝子体内に注入した。Ｌｉｎ^＋細胞注入後、Ｐ３３までに、網膜の最も深い層の血管はほぼ完全に消失した（図４ａ及びｂ）。対照的に、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを注入したほとんどの網膜はＰ３３までにきちんと形成された３層の平行した血管層を備えたほぼ正常な網膜脈管構造を有するようになった（図４ａ及び４ｄ）。この効果を定量化したところ、Ｌｉｎ⁻を注入されたｒｄ／ｒｄの眼の深層血管叢における血管の平均の長さは、未処理又はＬｉｎ^＋細胞処理の眼に比べてほぼ３倍長いことが明らかとなった（図４ｅ）。驚くべきことに、ｒｄ／ｒｄ成体マウス（ＦＶＢ／Ｎ）の骨髄に由来するＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物の注入も、ｒｄ／ｒｄ新生期マウスの変性している網膜脈管構造を救出した（図４ｆ）。ｒｄ／ｒｄマウスの眼における脈管構造の変性は、早くも出生後２−３週には観察された。Ｐ１５という遅い時期にＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入しても、少なくとも１ヶ月間はｒｄ／ｒｄマウスの変性している脈管構造は部分的に安定化された（図４ｇ及び４ｈ）。

さらに若い（例えば、Ｐ２）ｒｄ／ｒｄマウスに注入したＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物も、発生している表面の脈管構造中に取り込まれた。Ｐ１１までに、これらの細胞が血管叢の深層レベルに移動し、野生型の外網膜血管層で見られるものと同じパターンを形成することが観察された（図５ａ）。注入したＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物由来の細胞がｒｄ／ｒｄマウスの変性している網膜脈管構造に取り込まれ、これを安定化する様子をより明確に説明するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物をＴｉｅ−２−ＧＦＰ ＦＶＢマウスの眼に注入した。ＦＶＢマウスはｒｄ／ｒｄ遺伝型を有しており、Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ融合タンパク質を発現しているのですべての内因性の血管は蛍光を有している。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物由来の未標識細胞が新生期のＴｉｅ−２−ＧＦＰ ＦＶＢの眼に注入され、続いて発生過程にある脈管構造に取り込まれる場合、注入され、組み込まれた非標識Ｌｉｎ⁻ＨＳＣに対応する非標識の間隙が内因性のＴｉｅ−２−ＧＦＰ標識された血管に存在するはずである。続いて他の血管マーカー（例えば、ＣＤ−３１）で染色することにより血管全体の輪郭を描けば、非内因性の内皮細胞が脈管構造の一部であるか否かを明らかにすることができる。注入から２ヵ月後、ＣＤ３１陽性Ｔｉｅ−２−ＧＦＰ陰性の血管がＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を注入された眼の網膜で観察された（図５ｂ）。興味深いことに、救出された血管の大部分はＴｉｅ−２−ＧＦＰ陽性細胞を含んでいた（図５ｃ）。平滑筋アクチンの染色によって調べたところ、周皮細胞の分布は、血管の救出があるか否かにかかわらず、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの注入によっては変化しなかった（図５ｄ）。これらのデータは明らかに、硝子体内に注入された本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物が、網膜へと移動し、正常な網膜血管の形成に関与し、遺伝的に欠損のあるマウスにおいて内因性の変性した脈管構造を安定化することを示している。

トランスフェクションしたＬｉｎ⁻ＨＳＣ由来の細胞による網膜血管新生の阻害
網膜血管の疾患の大部分は変性よりもむしろ異常な血管増殖を伴う。星状細胞を標的とするトランスジェニック細胞は抗血管新生タンパク質を輸送し血管新生を阻害するのに使用することができる。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物由来の細胞にＴ２−トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ）をトランスフェクションした。Ｔ２−ＴｒｐＲＳは、網膜の血管新生を強く阻害するＴｒｐＲＳの４３ｋＤ断片である（図６ａ）。対照プラスミドをトランスフェクションしたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物（Ｔ２−ＴｒｐＲＳ遺伝子を有さない。）をＰ２に注入した眼の網膜は、Ｐ１２において正常な第一（図６ｃ）及び第二（図６ｄ）の網膜血管叢を有していた。Ｔ２−ＴｒｐＲＳをトランスフェクションした本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物をＰ２の眼に注入し１０日後に評価すると、第一ネットワークは著しい異常を有し（図６ｅ）、深層の網膜脈管構造の形成はほぼ完全に阻害された（図６ｆ）。これらの眼で観察された少数の血管は、血管の間に大きな間隙を伴い、著しく減衰していた。Ｔ２−ＴｒｐＲＳを分泌しているＬｉｎ⁻ＨＳＣによって阻害される程度を表２に詳述する。

Ｔ２−ＴｒｐＲＳはＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物中の細胞によってインビトロで産生されて分泌されるが、これらのトランスフェクションを行った細胞を硝子体内に注入したところ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳの３０ｋＤ断片が網膜で観察された（図６ｂ）。この３０ｋＤ断片は本発明のトランスフェクションを行ったＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した網膜でのみ特異的に観察され、組換体又はインビトロ合成されたタンパク質と比較してこのように明らかに分子量が低いのは、インビボでのＴ２−ＴｒｐＲＳのプロセシング又は分解によるものであり得る。これらのデータは、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物が、活性化された星状細胞を標的とすることにより網膜脈管構造へと、血管新生抑制分子を発現する遺伝子のような機能的に活性のある遺伝子を輸送するのに使用できることを示している。観察された血管新生抑制効果は、細胞が介在する活性によるものである可能性もあるが、Ｔ２トランスフェクションを行っていない同一のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物で処理した眼は正常な網膜血管構造を有していることから、この可能性は非常に低い。

硝子体内に注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は網膜の星状細胞に局在し、血管に組み込まれ、多くの網膜疾患の治療に有用であり得る。注入されたＨＳＣ組成物由来のほとんどの細胞が星状細胞の鋳型に付着する一方、少数の細胞は網膜の深層へと移動し、後に深層血管ネットワークが発生する領域に定着する。出生後４２日より前にこの領域にＧＦＡＰ陽性星状細胞が観察されなかったとしても、ＧＦＡＰ陰性のグリア細胞がすでに存在しＬｉｎ⁻ＨＳＣの局在のためのシグナルを提供している可能性は排除されない。以前の研究により多くの疾患が反応性グリオーシスと関連があることが明らかとなっている。特にＤＲでは、グリア細胞とその細胞外マトリックスが病的な血管新生と関連している。

損傷の種類に関わらず、注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物由来の細胞は特異的にＧＦＡＰ発現グリア細胞に接着したので、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物は網膜に血管新生が起こる前の損傷部位を標的とするために使用することができる。例えば糖尿病のような虚血性網膜症では、新生血管は低酸素への応答によるものである。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ組成物を病的な新生血管部位へ誘導することにより、発生過程にある新生脈管構造を安定化することができ、（ＤＲに関連する失明の原因である）出血又は浮腫などの新生血管の異常を防止し、新生血管生成を本来刺激していた低酸素状態を緩和できる可能性がある。異常な血管を正常な状態に回復することができる。さらに、トランスフェクションを行ったＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物の使用及びレーザーで誘発される星状細胞の活性化により、Ｔ２−ＴｒｐＲＳのような血管新生抑制タンパク質を病的な血管新生部位へと輸送することができる。レーザー光凝固は臨床眼科学で広く使用されており、このアプローチは多くの網膜疾患に適用がある。細胞を利用したこのようなアプローチは癌治療において探求されてきたが、眼内注入によれば多数の細胞を直接疾患部位に輸送することが可能であることから、目の疾患にこれらを使用することはより多くの利点を有している。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣによる神経栄養及び血管栄養性の救出
上述のように、増強緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｅＧＦＰ）、Ｃ３Ｈ（ｒｄ／ｒｄ）、ＦＶＢ（ｒｄ／ｒｄ）マウスの骨髄からＬｉｎ⁻ＨＳＣを分離するためにＭＡＣＳを用いた。これらのマウス由来のＥＰＣを含有するＬｉｎ⁻ＨＳＣをＰ６のＣ３Ｈ又はＦＶＢマウスの眼の硝子体内に注入した。注入後の様々な時点（１ヶ月、２ヶ月及び６ヶ月）で網膜を回収した。ＣＤ３１に対する抗体で染色した後、走査型レーザー共焦点顕微鏡で、また、ＤＡＰＩによる核染色後に網膜を組織学的に脈管構造を解析した。様々な時点における網膜由来のｍＲＮＡのマイクロアレイ遺伝子発現解析を、この効果に関与している可能性のある遺伝子を同定するためにも用いた。

ｒｄ／ｒｄマウスの眼はＰ２１までに神経感覚の網膜及び網膜脈管構造の両者に甚大な変性を有するようになった。Ｐ６にＬｉｎ⁻ＨＳＣで処理したｒｄ／ｒｄマウスの眼は、６ヶ月間にわたり正常な網膜脈管構造を維持した。全ての時点（１Ｍ、２Ｍ及び６Ｍ）において、対照と比較すると、深層及び中間層の両者が著しく改善していた（図１２参照）。さらに、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣで処理した網膜は、対照としてＬｉｎ^＋ＨＳＣで処理した眼と比較して、より厚くもなり（１Ｍで１．２倍、２Ｍで１．３倍、６Ｍで１．４倍）、外顆粒層により多くの細胞を有していた（１Ｍで２．２倍、２Ｍで３．７倍、６Ｍで５．７倍）ことが観察された。対照（未処理又は非Ｌｉｎ⁻処理）と比較して「救出された」（例えば、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ）ｒｄ／ｒｄ網膜について大規模なゲノム解析をしたところ、図２０のパネルＡ及びＢに列挙されたタンパク質をコードする遺伝子を含む、ｓＨＳＰｓ（小分子熱ショックタンパク質）及び血管及び神経の救出に相関する特異的な成長因子をコードする遺伝子の顕著な上方制御が明らかとなった。

本発明の骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて、顕著にかつ再現性よく正常な脈管構造の維持を誘導し、劇的に光受容体及び他の神経細胞層を増加させた。この神経栄養の救出効果は小分子熱ショックタンパク質及び成長因子の著しい上方制御に相関しており、現在治療できない網膜変性疾患に対する治療上のアプローチに対する手がかりを与える。

ｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜は、重度の血管及び神経変性を示す。

マウスにおける正常の出生後網膜血管及び神経発生は、詳しく記載されており、妊娠第三期のヒト胎児において見られる変化と類似している（Ｄｏｒｒｅｌｌら、２００２、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３：３５００−３５１０）。ｒｄ１遺伝子に対するマウスホモ接合体は、ヒト網膜変性の特徴と共通する特徴が多く（Ｆｒａｓｓｏｎら、１９９９、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１１８３−１１８７）、ＰＲ ｃＧＭＰホスホジエステラーゼをコードする遺伝子における突然変異の結果としての重度の血管萎縮を伴う、急速な光受容体（ＰＲ）の損失を示す（Ｂｏｗｅｓら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４７：６７７−６８０）。網膜発生及びその後の変性中の脈管構造を調べるために、コラーゲンＩＶ（ＣＩＶ）抗体、成熟脈管構造の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質に対する抗体及び内皮細胞に対するマーカーであるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）に対する抗体を使用した（図１５）。ｒｄ１／ｒｄ１（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）の網膜は、光受容体含有外顆粒層（ＯＮＬ）の変性が始まる、ほぼ出生後（Ｐ）８日まで正常に発生した。ＯＮＬは、急速に変性し、アポトーシスにより細胞死が起こり、Ｐ２０までには、核の単層のみが残った状態となった。ＣＩＶ及びＣＤ３１両者に対する抗体を用いたホールマウント網膜の二重染色により、他の研究者により述べられているものと同様のｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける血管変性の詳細が明らかになった（Ｂｌａｎｋｓら、１９８６，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５４：５４３−５５３）。第一の及び深部網膜血管層は、Ｐ１２まで正常に発生すると思われるが、この後、ＣＤ３１染色がなくなることにより分かるように、内皮細胞が急速に失われる。ＣＤ３１陽性内皮細胞は、Ｐ１２まで正常な分布を示すが、その後急速に消失した。興味深いことに、ＣＩＶ陽性染色は、調べた時点全てで残っており、このことから、血管及び関連するＥＣＭは正常に形成されることが示唆されるが、Ｐ１３までにＣＤ３１陽性細胞は見られなくなり、Ｐ１３の後にはマトリックスのみが残ることが観察された。（図１５、中央パネル）。Ｐ２１の後、中間血管叢も変性するが、その進行は深層叢で見られた速度よりも遅かった（図１５、上部パネル）。ｒｄ１／ｒｄ１マウスと比較するために、正常マウスの網膜血管及び神経細胞層を示す（右パネル、図１５）。

ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおける骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの神経保護効果。

硝子体内注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、３つの血管叢全ての内部網膜脈管構造に取り入れられ、血管の変性を防御する。興味深いことに、注入された細胞は、外顆粒層では実質的に観察されない。これらの細胞は、形成中の網膜血管に取り入れられるか、又はこれらの血管の近接近部で観察される。変性の発症直前であるＰ６に、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ由来）をＣ３Ｈ／ＨｅＪ（ｒｄ１／ｒｄ１）マウスの眼に硝子体内注入した。Ｐ３０までに、対照細胞（ＣＤ３１⁻）を注入した眼は、典型的なｒｄ１／ｒｄ１表現型を示し、つまり、調べた網膜全てにおいて深層血管叢及びＯＮＬがほぼ完全に変性していることが観察された。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼は、正常と思われる中間及び深層血管叢を維持した。驚くべきことに、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼の核間層（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅａｒ ｌａｙｅｒ）（ＩＮＬ）及びＯＮＬにおいて、対照細胞を注入した眼よりも顕著に多くの細胞が見られた（図１６Ａ）。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣのこの救出効果は、注入後２ヶ月において（図１６Ｂ）観察することができ、注入後６ヶ月という長い期間にわたり観察された（図１６Ｃ）。救出された眼と非救出の眼を比較した場合、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入した眼の中間及び深層叢の脈管構造、ならびに神経細胞含有ＩＮＬ及びＯＮＬにおける差は、測定した全ての時点で有意であった（図１６Ｂ及びＣ）。脈管構造の全長を測定し（図１６Ｄ）、ＯＮＬで見られるＤＡＰＩ−陽性細胞核の数を数える（図１６Ｅ）ことにより、これらの効果を定量した。全ての時点のデータに対して単純線形回帰分析を行った。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入した眼において、Ｐ３０（ｐ＜０．０２４）及びＰ６０（Ｐ＜０．０３４）で、血管救出と神経（例えば、ＯＮＬの厚さ）救出との間に統計学的に有意な相関が見られた（図１６Ｆ）。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入した網膜を対照細胞を注入した網膜と比較した場合、Ｐ１８０において、相関性は依然として高かったが、統計学的に有意ではなかった（ｐ＜０．１４）（図１６Ｆ）。一方、対照細胞を注入した網膜は、あらゆる時点において、脈管構造とＯＮＬの保存との間に有意な相関がなかった（図１６Ｆ）。これらのデータから、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣの硝子体内注入の結果、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜において、網膜血管及び神経の両方が共に救出されることが示される。注入した細胞は、ＯＮＬにおいて、又は網膜血管内もしくはその非常に近い部分以外のあらゆる箇所において観察されなかった。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入ｒｄ／ｒｄ網膜の機能的救出
対照細胞又はマウスＬｉｎ⁻ＨＳＣの注入から２ヶ月後のマウスにおいて、網膜電図（ＥＲＧ）を調べた（図１７）。ＥＲＧ記録後、血管及び神経救出が起こったことを確認するために、各眼について、免疫組織的及び顕微鏡分析を行った。処置を行い救出された眼、及び対照、非救出の眼からの代表的なＥＲＧ記録から、救出された眼において、デジタル処理で差し引いたシグナル（処置−非処置の眼）が、８マイクロボルトから１０マイクロボルトのオーダーの振幅で明瞭に検出可能なシグナルを生じたことが示される（図１７）。明らかに、両方の眼からのシグナルは著しく異常である。しかし、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処理した眼から、一貫した検出可能なＥＲＧが記録可能であった。全ての場合において、対照眼からのＥＲＧは検出不可能であった。救出された眼におけるシグナルの振幅が正常よりも著しく低い一方で、組織学的な救出があり、それが遺伝子を利用した他の救出実験により報告されたものの規模のオーダーである場合は必ず、シグナルが一貫して観察された。全体的なこれらの結果から、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置した眼において機能的な救出がある程度起こることが示される。

ヒト骨髄（ｈＢＭ）由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣも変性網膜を救出する。

ヒト骨髄から単離されたＬｉｎ⁻ＨＳＣは、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣと同様に作用する。ヒト提供者から骨髄を回収し、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣを消耗させ、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｈＬｉｎ⁻ＨＳＣ）の集団を調製した。エクスビボにおいて、蛍光色素でこれらの細胞を標識し、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤマウスの眼に注入した。注入したｈＬｉｎ⁻ＨＳＣは、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した場合に観察されたものと同一のようにして網膜血管形成部位に移動し、この部位を標的とした（図１８Ａ）。血管標的化に加えて、ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣはまた、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの血管及び神経細胞層両方に強力な救出効果を与えた（図１８Ｂ及び１８Ｃ）。この観察から、ヒト骨髄において、網膜脈管構造を標的とし、網膜変性を防ぐことができる細胞の存在が確認される。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、ｒｄ１０／ｒｄ１０マウスにおいて血管栄養及び神経栄養性効果を有する。

ｒｄ１／ｒｄ１マウスは、最も広く使用され、特性が最も良く分かっている網膜変性のモデルである（Ｃｈａｎｇら、２００２、Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．４２：５１７−５２５）一方、その変性は非常に速く、この点で、ヒトの疾患で見られる、通常の、もっと速度の遅い経時変化とは異なっている。この系列において、光受容体細胞変性は、網膜脈管構造がまだ急速に広がっているＰ８の前後で始まる（図１５）。中間叢が依然として形成中である間にも、次の深層網膜脈管構造の変性が起こり、従って、この疾患に罹患しているヒトの大多数で観察されるものとは異なり、ｒｄ１／ｒｄ１マウスの網膜は、完全に発生が完了することはない。変性が比較的ゆっくりと進行し、ヒトの網膜変性条件とより近い、ｒｄ１０マウスモデルを使用して、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣが介在する血管救出を調べた。ｒｄ１０マウスにおいて、光受容体細胞変性はＰ２１前後で始まり、血管変性がその少し後から始まる。

正常な神経感覚の網膜発生はＰ２１までにほぼ完了するので、網膜が分化を完了した後、変性の開始が観察されるが、これは、ｒｄ１／ｒｄ１マウスモデルよりも、ヒト網膜変性により近い。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又はｒｄ１０マウス由来の対照細胞をＰ６の眼に注入し、様々な時点でその網膜を評価した。Ｐ２１において、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ及び対照細胞注入した眼由来の網膜は両者とも、全血管層が完全に発達し、ＩＮＬ及びＯＮＬが正常に発達しており、正常であると思われた（図１８Ｄ及び１８Ｈ）。Ｐ２１前後において網膜変性が始まり、時間とともに進行した。Ｐ３０までに、対照細胞注入網膜は、重度の血管及び神経変性を示し（図１８Ｉ）、一方で、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜は、ほぼ正常な血管層及び光受容体細胞を維持した（図１８Ｅ）。救出された眼と非救出の眼との間の差は、さらに後の時点でさらに顕著となった（図１８Ｆと１８Ｇを１８Ｊ及び１８Ｋと比較。）。対照処置した眼において、ＣＤ３１及びコラーゲンＩＶに対する免疫組織化学染色により血管変性の進行が非常に明らかに観察された（図１８Ｉ−Ｋ）。対照処置した眼は、ＣＤ３１についてはほぼ完全に陰性であり、一方コラーゲンＩＶ陽性血管の「痕跡」がまだ明らかに残っており、このことから、不完全な血管形成というよりむしろ血管退化が起こったことが示される。一方、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置眼には、正常な野生型の眼と非常に近いと思われるＣＤ３１及びコラーゲンＩＶ陽性血管の両方があった（図１８Ｆ及び１８Ｉを比較）。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置後のｒｄ／ｒｄマウス網膜の遺伝子発現解析
大規模ゲノミクス（マイクロアレイ分析）を使用して、神経栄養性救出を介在すると推定される介在物を同定するために、救出及び非救出網膜を分析した。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣで処置したｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜における遺伝子発現を、非注入網膜ならびに対照細胞（ＣＤ３１⁻）を注入した網膜と比較した。これらの比較は、それぞれについて３回繰り返して行った。存在するとみなすためには、遺伝子が３回の測定全てにおいてバックグラウンドレベルよりも少なくとも２倍高い発現レベルを有することを必要とした。対照細胞注入及び非注入ｒｄ／ｒｄマウス網膜と比較して、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ保護網膜において３倍上方制御された遺伝子を図２０のパネルＡ及びＢに示す。ＭＡＤ及びＹｉｎｇ Ｙａｎｇ−１（ＹＹ−１）を含む、著しく上方制御された遺伝子の多くは、アポトーシスからの細胞保護に関連する機能を有するタンパク質をコードする。ストレスから細胞を保護することに関連する既知の熱ショックタンパク質と配列ホモロジー及び同様の機能を有するクリスタリン遺伝子の多くも、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処置網膜により上方制御されていた。α−クリスタリンの発現は、免疫組織化学解析によると、ＯＮＬに局在していた（図１９）。

ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣで救出したｒｄ１／ｒｄ１マウス網膜由来のメッセンジャーＲＮＡをヒト特異的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａマイクロアレイチップにハイブリダイズさせた。ストリンジェンシーの高い解析の後、多くの遺伝子が、そのｍＲＮＡ発現がヒト特異的であり、バックグラウンドより強く、マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣ救出網膜及びヒト対照細胞を注入した非救出網膜と比較してヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ救出網膜において著しく高いことが分かった（図２０、パネルＣ）。未発達の、及び新しく分化したＣＤ３４＋造血幹細胞の表面で発現する細胞接着分子であるＣＤ６及び、造血幹細胞により発現されるまた別の遺伝子であるインターフェロンα１３共々、マイクロアレイバイオインフォマティクスにより見出され、このことから評価プロトコールが有効であることが分かる。さらに、いくつかの成長因子及び神経栄養因子がヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ救出マウス網膜試料により、バックグラウンドよりも強く発現されていた（図２０、パネルＤ）。

考察
系統に関連する造血細胞に対するマーカーを使用して、陰性であるものをＥＰＣを含有する骨髄由来のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団として選択した。ＥＰＣとして働くことができる骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣのサブ集団は、一般に用いられる細胞表面マーカーよって特徴づけることができないが、発生過程の、又は損傷を受けた網膜脈管構造におけるこれらの細胞の挙動は、Ｌｉｎ^＋又は成体の内皮細胞集団で観察される挙動とは全く異なっている。これらの細胞は、網膜の血管新生部位を選択的に標的とし、開通血管の形成に寄与する。

遺伝性の網膜変性疾患は網膜の脈管構造の消失を伴って起こることが多い。これらの疾患の効果的な治療では、複雑な組織の構造を維持することと同様に、機能の回復が必要とされる。最近のいくつかの研究では、栄養性因子を細胞を利用して輸送すること、又は幹細胞それ自身を使用することについて研究が行われてきたが、両者を何らかの形で組み合わせる必要があろう。例えば、網膜変性疾患を治療するために成長因子療法を使用した場合、結果として血管の無秩序な過剰増殖を引き起こし、正常な網膜組織の構造を著しく破壊することとなった。網膜変性疾患を治療するために神経又は網膜幹細胞を使用すると、神経機能を再構成し得るが、網膜機能を完全な状態に保つためには、機能的な脈管構造も必要となるであろう。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ由来の細胞がｒｄ／ｒｄマウス網膜の血管に取り込まれると、網膜の構造を破壊することなく、変性した脈管構造が安定化された。この救出効果は細胞をＰ１５のｒｄ／ｒｄマウスに注入した場合にも観察された。血管の変性はｒｄ／ｒｄマウスにおいてＰ１６から始まるので、この観察結果により、効果的なＬｉｎ⁻ＨＳＣ処理による治療時機が広がる。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼において、網膜のニューロン及び光受容体が保護され、視覚機能が維持される。

成体骨髄由来Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、網膜変性疾患マウスに硝子体内注入されると、顕著な血管及び神経栄養性効果をもたらす。この救出効果は、最高で処置後６ヶ月続き、完全に網膜が変性する前にＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した場合に最大の効果が得られる（通常、生後３０日までに完全な網膜変性を示すマウスの場合、生後１６日まで。）。この救出は、２種類の網膜変性マウスモデルにおいて観察され、レシピエントが網膜変性のある免疫不全げっ歯類（例えば、ＳＣＩＤマウス）である場合、又は、ドナーが網膜変性マウスである場合、成人ヒト骨髄由来ＨＳＣで顕著に達成され得る。いくつかの最近の報告によれば、網膜変性のあるマウス又はイヌにおいて、野生型遺伝子によるウイルスを利用した遺伝子レスキュー後に、ある程度の表現型救出が起こる（Ａｌｉら、２０００、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５：３０６−３１０；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７８１２−７８１６；Ａｃｌａｎｄら、２００１、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２−９５）という一方、本発明は、血管救出により達成された、一般的な細胞を利用した治療効果を示す最初のものである。従って、１００以上の既知の関連突然変異による疾患（例えば網膜色素変性症）群の治療において、このような潜在能力のあるアプローチを利用することは、既知の突然変異それぞれに対する個々の遺伝子治療を行うよりも現実的である。

神経栄養性救出効果の分子レベルの正確な原理は分かっていないが、血管安定／救出が相伴う場合のみ観察される。注入した幹細胞の存在それ自体は、神経栄養的な救出を行うには十分ではなく、外顆粒層に幹細胞由来のニューロンが明らかに存在しないことにより、注入された細胞が光受容体に形質転換されるという可能性は除外される。マイクロアレイ遺伝子発現分析により得られたデータから、抗アポトーシス効果を有することが知られている遺伝子が顕著に上方制御されることが示された。網膜変性において見られる神経細胞死のほとんどがアポトーシスによるものであるため、これらの疾患において、そのような保護効果は、視覚機能に重要な光受容体及び他のニューロンの寿命を延長する上で大きな治療的有用性を与え得る。Ｃ−ｍｙｃは、様々な下流のアポトーシス誘発因子を上方制御することによりアポトーシスに関与する転写因子である。ｒｄ／ｒｄマウスにおいて、Ｃ−ｍｙｃ発現が野生型よりも４．５倍増加していることから、ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおいて見られる光受容体変性における関与の可能性が示される。Ｌｉｎ−ＨＳＣで保護された網膜において顕著に上方制御される（図２０、パネルＡ）Ｍａｄ１及びＹＹ−１の２つの遺伝子は、ｃ−ｍｙｃの活性を抑制し、従ってｃ−ｍｙｃ誘発性アポトーシスを抑制することが知られている。Ｍａｄ１の過剰発現により、また、別の不可欠なアポトーシス経路のコンポーネントであるカスパーゼ８のＦａｓ誘発性活性が抑制されることも示されている。これらの２種類の分子の上方制御は、ｒｄ／ｒｄマウスにおいて通常変性へと導くアポトーシスの開始を防御することにより、血管及び神経変性から網膜を保護することに関与し得る。

Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ保護された網膜において著しく上方制御される他の一連の遺伝子には、クリスタリンファミリーのメンバーが含まれる（図２０、パネルＢ）。熱ショックタンパク質及び他のストレスにより誘発されるタンパク質と同様に、クリスタリンは、網膜ストレスにより活性化され、アポトーシスに対する保護効果を与え得る。αＡ−クリスタリンの発現が異常に低いことは、網膜萎縮のラットモデルにおける光受容体の損失と相関しており、ｒｄ／ｒｄマウスにおける網膜の最近のプロテオミクス分析から、網膜変性に反応してクリスタリンの上方制御が誘発されることが示された。発明者らのＥＰＣ−救出ｒｄ／ｒｄマウス網膜のマイクロアレイデータに基づくと、クリスタリンの上方制御は、ＥＰＣ介在網膜神経保護において重要な役割を果たすと考えられる。

ｃ−ｍｙｃ、Ｍａｄ１、Ｙｘ−１及びクリスタリンなどの遺伝子は、神経救出の下流の介在因子であると思われる。発明者らの、マウス幹細胞により救出された網膜のマイクロアレイ分析では、既知の神経栄養因子のレベル上昇の誘導が示されなかったが、神経栄養性物質は、抗アポトーシス遺伝子発現を調節することができる。一方、ヒト特異的なチップを用いたヒト骨髄由来幹細胞介在救出の分析から、複数の成長因子遺伝子の発現が、低いが顕著に上昇することが示される。

上方制御される遺伝子には、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのいくつかのメンバー及びオトフェリン（Ｏｔｏｆｅｒｌｉｎ）が含まれる。オトフェリン遺伝子における突然変異は、聴覚神経障害による難聴を引き起こす遺伝性疾患に関与する。注入したＬｉｎ⁻ＨＳＣによるオトフェリン産生が、同様に網膜神経障害の予防にも寄与する可能性がある。組織学的に、網膜変性のある患者及び動物における血管の変化が、光受容体が死んだ際の代謝要求低下後の二次的なものであると長い間推測されてきた。今回のデータから、少なくとも遺伝性網膜変性のマウスに関しては、正常な脈管構造を保持することにより、同様に外顆粒層のコンポーネントの維持が促進され得ることが示される。最近の文献における報告により、組織特異的脈管構造が血管「栄養」を単純に与えることから予想されるものを超える栄養作用を有するという概念が支持されるであろう。例えば、生きている内皮細胞が、肝臓の損傷に際して、ＶＥＧＦＲ１活性化後に、肝細胞の再生及び維持に不可欠な成長因子を産生するように誘導され得る（ＬｅＣｏｕｔｅｒら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：８９０−８９３）。

血管内皮細胞と近接した肝実質細胞との間で起こり得る同様の相互作用は、報告によると、機能的な血管形成のかなり前に肝臓器官形成に関与する。網膜変性のある個体の内因性の網膜脈管構造は救出をそれ程劇的に促進しないが、骨髄造血幹細胞集団由来の内皮前駆細胞によりこの脈管構造が強化される場合、それらにより、脈管構造が変性に対してより耐性を持つようになり、同時に、網膜神経細胞、ならびに血管の生き残りが促進され得る。網膜変性を有するヒトにおいて、完全な網膜変性の開始を遅らせることにより、失明に至るまでの時間を遅らせ得る。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置した動物は、顕著にＥＲＧを維持し、それは、視力をサポートするのに十分であり得る。

臨床的に、依然として機能的な視力を維持していながらも、光受容体及び他のニューロンがかなり失われているということが広く認められている。いくつかのポイントにおいて、重要な閾値が妨害され、視力が失われる。ヒト遺伝性網膜変性のほぼ全てが早期に始まるが、速度は遅いので、網膜変性を有する個人を同定し、自家骨髄幹細胞移植物を硝子体内注入して治療し、視力喪失を伴う網膜変性を遅らせることが可能であり得る。これらの幹細胞の標的化及び取り込みを促進するために、活性化された星状細胞が存在することが望ましい。関連するグリオーシスがある場合の早期治療により、又は、活性化星状細胞の局所的な増殖を刺激するためのレーザーの使用により、これを達成することができる。

本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団は、反応性星状細胞を標的とすることによって血管新生を促進でき、網膜構造を破壊することなく確立された鋳型に取り込まれ得るＥＰＣ集団を含有する。本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣはまた網膜変性に罹患している眼において驚くべき長期間にわたり神経栄養性の救出効果を与える。さらに、遺伝的に修飾された、ＥＰＣを含有する自己由来のＬｉｎ⁻ＨＳＣ組成物は、虚血性の眼又は異常な血管形成が起きた眼に移植することが可能であり、新たな血管に安定に取り込まれて、局所的に長期間にわたり継続して治療のための分子を送達することができる。このように、生理学的に意味のある用量で薬理活性を示す物質を発現する遺伝子の局所的送達により、現在治療できない眼の疾患を治療するための新たな理論的枠組が得られる。

本発明の新規特性の精神及び範囲から逸脱することなく、上述した実施形態の数多くの変更及び変形がなされ得る。本明細書中で説明した特定の実施形態は、非限定的なものであり、非限定的であると解釈されるべきものである。

図１（ａ及びｂ）は発生過程にあるマウス網膜の概略図を示す。（ａ）第一叢の発生。（ｂ）網膜での血管形成の第２段階。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内網状層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＰＬ、外網状層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、末梢。図１ｃは骨髄に由来するＬｉｎ^＋ＨＳＣ及びＬｉｎ⁻ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリーによる性質決定を表す。上列：抗体で標識されていない細胞のドットプロット分布。その中で、Ｒ１はＰＥ染色陽性の定量可能なゲート領域を表しており、Ｒ２はＧＦＰ陽性を示している。中列：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）及び下列：Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）細胞、それぞれの細胞系列は、ＰＥ結合した、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対する抗体で標識した。Ｔｉｅ−２のデータはＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスより得た。百分率は全Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ集団中における標識された陽性細胞の割合を示す。 図１（ａ及びｂ）は発生過程にあるマウス網膜の概略図を示す。（ａ）第一叢の発生。（ｂ）網膜での血管形成の第２段階。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内網状層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＰＬ、外網状層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＯＮ、視神経；Ｐ、末梢。図１ｃは骨髄に由来するＬｉｎ^＋ＨＳＣ及びＬｉｎ⁻ＨＳＣ分離細胞のフローサイトメトリーによる性質決定を表す。上列：抗体で標識されていない細胞のドットプロット分布。その中で、Ｒ１はＰＥ染色陽性の定量可能なゲート領域を表しており、Ｒ２はＧＦＰ陽性を示している。中列：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）及び下列：Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ（Ｃ５７Ｂ／６）細胞、それぞれの細胞系列は、ＰＥ結合した、Ｓｃａ−１、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＣＤ３１に対する抗体で標識した。Ｔｉｅ−２のデータはＴｉｅ−２−ＧＦＰマウスより得た。百分率は全Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ集団中でにおける標識された陽性細胞の割合を示す。 図２は発生過程にあるマウス網膜へのＬｉｎ⁻ＨＳＣの移植を表す。（ａ）注入４日後（Ｐ６）において、硝子体内に注入されたｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞は網膜上に接着し分化する。（ｂ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６マウス、β−ｇａｌ抗体で染色。）はコラーゲンＩＶ抗体で染色される脈管構造の先端に定着する（星印は脈管構造の先端を示す）。（ｃ）Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ^＋）の大部分は注入４日後（Ｐ６）の時点では分化できなかった。（ｄ）注入４日後（Ｐ６）のｅＧＦＰ^＋マウス腸間膜ＥＣ。（ｅ）成体マウスの眼に注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｅＧＦＰ^＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいて、すでに存在している星状細胞の鋳型に定着しそれに沿って分化しているｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（矢印）を低倍率で示す。（ｇ）Ｌｉｎ⁻細胞（ｅＧＦＰ）とその下に存在する星状細胞（矢印）の関係を高倍率で示す。（ｈ）対照となる非注入ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウス。（ｉ）注入４日後（Ｐ６）、ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、将来の深層叢となる領域に移動し分化する。左図はホールマウントの網膜におけるＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞の動きを捕らえている。右図は網膜（上は硝子体側、下は強膜側）内でのＬｉｎ⁻細胞（矢印）の局在を示す。（ｊ）αＣＤ３１−ＰＥ及びαＧＦＰ−ａｌｅｘａ４８８抗体による二重染色。注入から７日後、注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｅＧＦＰ、赤）は血管構造（ＣＤ３１）中に取り込まれた。矢印は取り込まれた領域を示している。（ｋ）ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞は注入１４日後（Ｐ１７）に血管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心腔内注入により、第一叢（ｌ）及び深層叢（ｍ）の両者で血管が完全であり機能的であることが示される。 図２は発生過程にあるマウス網膜へのＬｉｎ⁻ＨＳＣの移植を表す。（ａ）注入４日後（Ｐ６）において、硝子体内に注入されたｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞は網膜上に接着し分化する。（ｂ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｇｔｒｏｓａ２６マウス、β−ｇａｌ抗体で染色。）はコラーゲンＩＶ抗体で染色される脈管構造の先端に定着する（星印は脈管構造の先端を示す）。（ｃ）Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（ｅＧＦＰ^＋）の大部分は注入４日後（Ｐ６）の時点では分化できなかった。（ｄ）注入４日後（Ｐ６）のｅＧＦＰ^＋マウス腸間膜ＥＣ。（ｅ）成体マウスの眼に注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｅＧＦＰ^＋）。（ｆ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいて、すでに存在している星状細胞の鋳型に定着しそれに沿って分化しているｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（矢印）を低倍率で示す。（ｇ）Ｌｉｎ⁻細胞（ｅＧＦＰ）とその下に存在する星状細胞（矢印）の関係を高倍率で示す。（ｈ）対照となる非注入ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウス。（ｉ）注入４日後（Ｐ６）、ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣは、将来の深層叢となる領域に移動し分化する。左図はホールマウントの網膜におけるＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞の動きを捕らえている。右図は網膜（上は硝子体側、下は強膜側）内でのＬｉｎ⁻細胞（矢印）の局在を示す。（ｊ）αＣＤ３１−ＰＥ及びαＧＦＰ−ａｌｅｘａ４８８抗体による二重染色。注入から７日後、注入されたＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｅＧＦＰ、赤）は血管構造（ＣＤ３１）中に取り込まれた。矢印は取り込まれた領域を示している。（ｋ）ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞は注入１４日後（Ｐ１７）に血管を形成する。（ｌ及びｍ）ローダミン−デキストランの心腔内注入により、第一叢（ｌ）及び深層叢（ｍ）の両者で血管が完全であり機能的であることが示される。 図３（ａ及びｂ）は、レーザー（ａ）及び機械的方法（ｂ）で成体網膜に誘発した傷害（＊は傷害部位を示している。）によって誘導されるグリオーシス（ＧＦＡＰ発現星状細胞によって示される、最も左の像）にｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が定着することを示す。最も右の画像はさらに高倍率であり、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣと星状細胞との密接な関係を示している。目盛は２０μＭを示す。 図４は、網膜変性マウスにおいてＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞が脈管構造を救出することを示している。（ａ−ｄ）コラーゲンＩＶ染色した、注入から２７日後（Ｐ３３）の網膜。（ａ）及び（ｂ）、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（Ｂａｌｂ／ｃ）を注入された網膜の血管構造は正常ＦＶＢマウスと比較して相違がなかった；（ｃ）及び（ｄ）、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｂａｌｂ／ｃ）を注入した網膜は野生型マウスに類似する密な血管ネットワークを示した；（ａ）及び（ｃ）、ＤＡＰＩ染色したホールマウントの網膜（上は硝子体側、下は強膜側）の凍結切片；（ｂ）及び（ｄ）、ホールマウントの網膜の深層叢；（ｅ）棒グラフは、深層の血管叢における血管分布の増加がＬｉｎ⁻ＨＳＣ細胞を注入された網膜（ｎ＝６）で起きたことを示している。深層網膜血管新生の程度はそれぞれの画像内での血管の全長を計算することにより定量化した。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ又は対照の網膜について、高倍率の視野（μ単位）での血管の全長の平均を比較した。（ｆ）ｒｄ／ｒｄマウスから得たＬｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｒ、右眼）又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ（Ｌ、左眼）細胞を注入した後の深層血管叢の長さの比較。別個の６匹のマウスの結果を示す（各マウスごとに異なる色で表している）。（ｇ）及び（ｈ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ細胞（Ｂａｌｂ／ｃ）は、Ｐ１５の眼に注入した場合でもｒｄ／ｒｄの脈管構造を救出した。Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｇ）又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ（Ｈ）細胞を注入した網膜（注入後１ヶ月）の中間及び深層血管叢を示す。 図５はマウス網膜組織の顕微鏡写真を示す。（ａ）ｅＧＦＰ^＋Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（灰色）を注入してから５日後（Ｐ１１）の、ホールマウント試料の網膜（ｒｄ／ｒｄマウス）の深層。（ｂ）及び（ｃ）Ｐ６にＢａｌｂ／ｃ Ｌｉｎ⁻細胞（ｂ）又はＬｉｎ^＋ＨＳＣ細胞（ｃ）を注入したＴｉｅ−２−ＧＦＰ（ｒｄ／ｒｄ）マウスのＰ６０における網膜脈管構造。（ｂ）及び（ｃ）の左パネルにおいて、内因性の内皮細胞（ＧＦＰ染色）のみが見られる。（ｂ）及び（ｃ）の中央のパネルは、ＣＤ３１抗体で染色されており；矢印はＣＤ３１で染色されたがＧＦＰでは染色されなかった血管を示し、（ｂ）及び（ｃ）の右パネルは、ＧＦＰ及びＣＤ３１の両方による染色を示す。（ｄ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを注入された網膜（左パネル）及び対照網膜（右パネル）のαＳＭＡ染色。 図６は、Ｔ２−ＴｒｐＲＳトランスフェクションされたＬｉｎ⁻ＨＳＣがマウス網膜脈管構造の発生を阻害することを示す。（ａ）ヒトＴｒｐＲＳ、Ｔ２−ＴｒｐＲＳ及びアミノ末端にＩｇｋシグナル配列を有するＴ２−ＴｒｐＲＳの概略図。（ｂ）Ｔ２−ＴｒｐＲＳをトランスフェクションしたＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜は、インビボでＴ２−ＴｒｐＲＳタンパク質を発現する。（１）Ｅ．コリで産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（２）Ｅ．コリで産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（３）Ｅ．コリで産生された組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ；（４）対照の網膜；（５）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ＋ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（ベクターのみ）を注入した網膜；（６）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ＋ｐＫＬｅ１３５（ｐＳｅｃＴａｇ内にＩｇｋ−Ｔ２−ＴｒｐＲＳを有する。）を注入した網膜。（ａ）内因性ＴｒｐＲＳ。（ｂ）組み換えＴ２−ＴｒｐＲＳ。（ｃ）Ｌｉｎ⁻ＨＳＣを注入された網膜のＴ２−ＴｒｐＲＳ。（ｃ−ｆ）注入７日後の注入網膜における、典型的な第一（表面上）及び第二（深層）叢。（ｃ）及び（ｄ）空のプラスミドをトランスフェクションしたＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼は正常に発生した；（ｅ）及び（ｆ）Ｔ２−ＴｒｐＲＳをトランスフェクションしたＬｉｎ⁻ＨＳＣを注入した眼の大部分では深層叢の阻害が見られた；（ｃ）及び（ｅ）第一（表面上）叢；（ｄ）及び（ｆ）第二（深層）叢。（ｆ）で観察されるぼやけた血管の輪郭は、（ｅ）で示される第一叢ネットワークの血管の「滲み出し（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」像である。 図７はＨｉｓ_６−タグ付加Ｔ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。 図７はＨｉｓ_６−タグ付加Ｔ２−ＴｒｐＲＳをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。 図８はＨｉｓ_６−タグ付加Ｔ２−ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図９は、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ及びＬｉｎ^＋ＨＳＣ（対照）を眼に注入したマウスから採取した網膜の顕微鏡写真及び網膜電図（ＥＲＧ）を示す。 図１０は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣで処理したｒｄ／ｒｄマウス眼の中間（Ｉｎｔ．）及び深層の血管層における、神経の救出（ｙ軸）と血管の救出（ｘ軸）との間の相関を示す、統計プロットである。 図１１は、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣで処理したｒｄ／ｒｄマウス眼の神経の救出（ｙ軸）と血管の救出（ｘ軸）の間には相関が見られないことを示す、統計プロットである。 図１２は、注入後１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）、６ヶ月（６Ｍ）時点における、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ処理（黒い棒）及び未処理（白い棒）のｒｄ／ｒｄマウスの眼について、血管長（ｙ軸）を任意の比較単位で表した棒グラフである。 図１３は、注入後１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）、６ヶ月（６Ｍ）におけるｒｄ／ｒｄマウス外脳層（ＯＮＲ）の核数を表す３つの棒グラフであり、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣ（白い棒）で処理した対照の眼と比較してＬｉｎ⁻ＨＳＣ（黒い棒）で処理した眼における核数が顕著に増加していることを示している。 図１４は、左眼（Ｌ、Ｌｉｎ^＋ＨＳＣで処理した対照の眼）に対して、右眼（Ｒ、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣで処理）を、（注入後）１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）、６ヶ月（６Ｍ）の時点で比較し、個々のｒｄ／ｒｄマウスについて外脳層の核数をプロットしたものである。プロット中のそれぞれの線は個々のマウスの眼に対するものである。 図１５は、ｒｄ１／ｒｄ１（ＣＨ３／ＨｅＪ、左パネル）又は野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、右パネル）における、網膜の脈管構造及び神経細胞の変化を示す。同じ網膜の、ホールマウント網膜（赤：コラーゲンＩＶ、緑：ＣＤ３１）及び切片（赤：ＤＡＰＩ、緑：ＣＤ３１、下方のパネル）における、中間（上方のパネル）又は深層（中央のパネル）血管叢の網膜脈管構造を示す（Ｐ：出生後日数）。（ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：核間層（ｉｎｔｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌａｙｅｒ）、ＯＮＬ：外顆粒層）。 図１６は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入が、ｒｄ１／ｒｄ１マウスにおいて神経細胞の変性を救出することを示す。Ａ、Ｂ及びＣ：中間（ｉｎｔ．）又は深層叢の網膜脈管構造及び、Ｐ３０（Ａ）、Ｐ６０（Ｂ）及びＰ１８０（Ｃ）における、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入した眼（右パネル）及び反対側の対照細胞を（ＣＤ３１⁻）注入した眼（左パネル）の切片。Ｄ：Ｐ３０（左、ｎ＝１０）、Ｐ６０（中央、ｎ＝１０）及びＰ１８０（右、ｎ＝６）での、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入又は対照細胞（ＣＤ３１⁻）注入網膜における、脈管構造の平均全長（＋又は−は平均の標準誤差）。中間（ｉｎｔ．）及び深層叢のデータは別々に示す（Ｙ軸：脈管構造の相対的長さ）。Ｅ、対照細胞（ＣＤ３１⁻）又はＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入網膜の、Ｐ３０（左、ｎ＝１０）、Ｐ６０（中央、ｎ＝１０）又はＰ１８０（右、ｎ＝６）におけるＯＮＬでの平均細胞核数（Ｙ軸：ＯＮＬにおける相対的細胞核数）。Ｆ、Ｐ３０（左）、Ｐ６０（中央）又はＰ１８０（右）におけるＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入又は対照細胞注入網膜の、脈管構造の長さ（Ｘ軸）とＯＮＬでの細胞核数（Ｙ軸）との間の線形相関。 図１７は、網膜機能がＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入により救出されることを示している。網膜電図検査（ＥＲＧ）記録を用いて、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ又は対照細胞（ＣＤ３１⁻）注入網膜の機能を測定した。Ａ及びＢ、注入から２ヶ月後の、網膜が救出された場合及び救出されなかった場合の代表例。同一動物での、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ注入した右目（Ａ）及びＣＤ３１⁻対照細胞を注入した左目（Ｂ）の網膜切片を示す（緑：ＣＤ３１染色脈管構造、赤：ＤＡＰＩ染色された核）。Ｃ、ＥＲＧは、Ａ及びＢで示された同一動物からの結果である。 図１８は、ヒト骨髄細胞集団が、ｒｄ１マウスにおいて変性網膜を救出できることを示す（Ａ−Ｃ）。網膜変性の別のモデル、ｒｄ１０においても救出が観察される（Ｄ−Ｋ）。Ａ、緑色の色素で標識したヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ（ｈＬｉｎ⁻ＨＳＣ）は、Ｃ３ＳｎＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ ＳＣＩＤマウスに硝子体注入された後、網膜の血管細胞に分化することができる。Ｂ及びＣ、注入から１．５ヶ月後の、ｈＬｉｎ⁻ＨＳＣ注入された眼（Ｂ）又は反対側の対照の眼（Ｃ）における、網膜脈管構造（左パネル；上部：中間叢、下方：深層叢）及び神経細胞（右パネル）。Ｄ−Ｋ、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ（Ｐ６に注入）によるｒｄ１０マウスの救出。Ｐ２１（Ｄ：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｈ：対照細胞）、Ｐ３０（Ｅ：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｉ：対照細胞）、Ｐ６０（Ｆ：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｊ：対照細胞）及びＰ１０５（Ｇ：Ｌｉｎ⁻ＨＳＣ、Ｋ：対照細胞）における代表的な網膜を示す（処理及び対照眼は、各時点の同一動物由来である。）。網膜脈管構造（各パネルの上方の像は、中間叢であり；各パネルの中央の像は、深層叢である。）を、ＣＤ３１（緑）及びコラーゲンＩＶ（赤）で染色した。各パネルの下方の像は、同じ網膜の横断面を示す（赤：ＤＡＰＩ、緑：ＣＤ３１）。 図１９は、Ｌｉｎ⁻ＨＳＣによる処置後、救出された外顆粒層細胞において、クリスタリンαＡが上方制御されるが、対照細胞で処置した反対側の眼では上方制御が見られないことを示す。左パネル；救出された網膜におけるＩｇＧ対照、中央のパネル；救出された網膜におけるクリスタリンαＡ、右パネル；非救出網膜におけるクリスタリンαＡ。 図２０は、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方制御される遺伝子の表を含む。（Ａ）マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が３倍上昇する遺伝子。（Ｂ）マウスＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置したマウス網膜において上方制御されるクリスタリン遺伝子。（Ｃ）ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が２倍上昇する遺伝子。（Ｄ）ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣで処置したマウス網膜において発現が上方制御される神経栄養因子又は成長因子の遺伝子。 図２１は、ＣＤ１３３陽性（ＤＣ１３３^＋）及びＣＤ１３３陰性（ＤＣ１３３⁻）の、本発明ヒトＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団における、ＣＤ３１及びインテグリンα６表面抗原の分布を説明する。 図２２は、正常酸素レベル（ｎｏｒｍｏｘｉａ）で飼育した野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスにおける、出生後Ｐ０からＰ３０までの、出生後の網膜発生を説明する。 図２３は、Ｐ７からＰ１２の間、高酸素レベル（ｈｙｐｅｒｏｘｉａ；７５％酸素）で飼育し、その後、Ｐ１２−Ｐ１７は正常酸素レベルで飼育したＣ５７／Ｂ１６マウスにおける、酸素誘発性網膜症モデルを説明する。 図２４は、酸素誘発性網膜症モデルにおける、本発明のＬｉｎ⁻ＨＳＣ集団を用いた治療による血管救出を示す。

Claims (2)

1. 造血幹細胞と内皮前駆細胞とを包含する、単離された、哺乳動物の、Ｌｉｎ ⁻ のヒトの造血幹細胞集団であって、前記細胞はＣＤ１３３陰性であり、前記細胞の少なくとも５０％がインテグリンα６に関する表面抗原を発現し、前記細胞の少なくとも５０％が表面抗原ＣＤ３１を発現する、造血幹細胞集団。
2. 造血幹細胞と内皮前駆細胞とを包含する、単離された、哺乳動物の、Ｌｉｎ ⁻ のヒトの造血幹細胞集団であって、前記細胞がＣＤ１３３陽性であり、前記細胞の３０％未満がインテグリンα６に関する表面抗原を発現し、前記細胞の５０％未満が表面抗原ＣＤ３１を発現する、造血幹細胞集団。

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