図面の簡単な説明
図面において
図1は発達中のマウス網膜の略図である。(a)一次叢の発達、(b)網膜血管形成の第二相。GCL、神経節細胞層;IPL、内叢状層;INL、内顆粒層;OPL、外叢状層;ONL、外顆粒層;RPE、網膜色素上皮;ON、視神経;P、末梢。パネル(c)は、骨髄由来のLin+HSC及びLin−HSC分離細胞のフローサイトメトリー分析結果である。上列:非抗体標識細胞のドットプロット分布(R1は、陽性PE染色の定量可能なゲート領域であり、R2はGFP陽性である。);中間列:Lin−HSC(C57B/6)及び下列:Lin+HSC(C57B/6)細胞。各細胞系は、Sca−1、c−kit、Flk−1/KDR、CD31に対するPE複合抗体で標識されている。Tie−2データをTie−2−GFPマウスから得た。割合は、全Lin−HSC又はLin+HSC集団に対する陽性標識細胞のパーセントである。
図2は、発達中のマウス網膜中へのLin−HSCの移植を示す。(a)注射後4日目(P6)に、硝子体内注射したeGFP+Lin−HSC細胞は、網膜に付着し、分化する。(b)Lin−HSC(β−gal抗体で染色されたB6.129S7−Gtrosa26マウス)は、コラーゲンIV抗体で染色された血管構造の前方に定着する(アステリスクは血管構造の先端を示す。)。(c)注射後4日目(P6)におけるLin+HSC細胞(eGFP+)の大部分は分化できなかった。(d)腸間膜eGFP+ネズミEC 注射後4日(P6)。(e)成体マウスの眼に注射されたLin−HSC(eGFP+)。(f)GFAP−GFPトランスジェニックマウスにおいて既存の星状細胞テンプレートに向かい、それに沿って分化するeGFP+Lin−HSC(矢印)の低倍率。(g)Lin−細胞(eGFP)と下にある星状細胞(矢印)との会合の高倍率。(h)注射されなかったGFAP−GFPトランスジェニック対照。(I)注射後4日(P6)、eGFP+Lin−HSCは、将来の深部叢の領域に移動し、分化する。左図は全載網膜中のLin−HSC活性を表現したものであり、右図は網膜中のLin−細胞の位置である(矢印)(上が硝子体側であり、下が強膜側である。)。(j)α−CD31−PE抗体とα−GFP−alexa 488抗体による二重標識。注射後7日、注射されたLin−HSC(eGFP、赤)は血管構造(CD31)に取り込まれた。矢じりは、取り込まれた領域を示す。(k)eGFP+Lin−HSC細胞は、注射後14日(P17)に血管を形成する。(l及びm)ローダミン−デキストランの心臓内注射によれば、血管は無傷であり、一次叢(primary plexus)(l)と深部叢(m)の両方において機能する。
図3は、eGFP+Lin−HSC細胞は、成体網膜において、レーザー(a)によって誘発された神経こう症(GFAP発現星状細胞、左端の画像によって示される。)と機械的(b)に誘発された傷害(アステリスクは傷害部位を示す。)の両方に向かうことを示す。右端の画像は、高倍率であり、Lin−HSCと星状細胞の密接な会合を示す。較正バー=20μM。
図4は、Lin−HSC細胞が網膜変性マウスの血管構造を救済することを示す。(a−d)注射後27日目(P33)のコラーゲンIV染色された網膜。(a)及び(b)、Lin+HSC細胞を注射した網膜(Balb/c)は、血管構造が正常FVBマウスと同じであった。(c)及び(d)Lin−HSCを注射した網膜(Balb/c)は、野生型マウスと類似した豊富な血管網を示した。(a)及び(c)、DAPI染色された網膜全体の凍結切片(上は硝子体側であり、下は強膜側である。)。(b)及び(d)、網膜全量の深部叢。(e)Lin−HSC細胞を注射した網膜中で形成された深部血管叢の血管分布の増加を示す棒グラフ(n=6)。深部網膜血管新生(deep retinal vascularization)の程度は、各画像内の血管の全長を計算することによって定量した。Lin−HSC、Lin+HSC又は対照網膜の血管平均全長/強拡大視野(単位ミクロン)を比較した。(f)rd/rdマウス由来のLin−HSC(R、右眼)又はLin+HSC(L、左眼)細胞を注射した後の深部血管叢の長さの比較。6匹の別個のマウスの結果を示す(各色は別々のマウスを表す。)。(g)及び(h)Lin−HSC細胞(Balb/c)は、P15の眼に注射するとrd/rd血管構造も救済した。Lin−HSC(G)又はLin+HSC(H)細胞を注射した網膜の中間部及び深部血管叢(注射後1ヵ月)を示す。
図5は、マウス網膜組織の顕微鏡写真である。(a)eGFP+Lin−HSCを可視化した(灰色)、注射後5日(P11)の網膜全組織標本の深層(rd/rdマウス)。(b)及び(c)Balb/c Lin−細胞(b)又はLin+HSC細胞(c)をP6で注射したTie−2−GFP(rd/rd)マウスのP60網膜血管構造。内因性内皮細胞(GFP染色)のみが(b)及び(c)の左パネルでは見える。(b)及び(c)の中間のパネルは、CD31抗体で染色された。矢印は、CD31で染色されたが、GFPでは染色されない血管を示す。(b)及び(c)の右パネルは、GFPとCD31の両方で染色された。(d)Lin−HSC注射網膜(左パネル)及び対照網膜(右パネル)のα−SMA染色。
図6は、T2−TrpRSを移入されたLin−HSCがマウス網膜血管構造の発生を阻害することを示す。(a)ヒトTrpRS、T2−TrpRS、及びアミノ末端にIgkシグナル配列を有するT2−TrpRSの略図。(b)T2−TrpRSが移入されたLin−HSCを注射した網膜は、T2−TrpRSタンパク質を生体内で発現する。(1)E.コリ(E. coli)中で産生された組換えT2−TrpRS、(2)E.コリ中で産生された組換えT2−TrpRS、(3)E.コリ中で産生された組換えT2−TrpRS、(4)対照網膜、(5)Lin−HSC+pSecTag2A(ベクターのみ)を注射した網膜、(6)Lin−HSC+pKLe135(pSecTag中のIgk−T2−TrpRS)を注射した網膜。(a)内因性TrpRS。(b)組換えT2−TrpRS。(c)Lin−HSCを注射した網膜のT2−TrpRS。(c−f)注射した網膜の代表的な一次(表面)及び二次(深部)叢、注射後7日。(c)及び(d)空のプラスミドが移入されたLin−HSCを注射した眼は正常に発達した。(e)及び(f)T2−TrpRSが移入されたLin−HSCを注射した眼の大多数は、深部叢が阻害された。(c)及び(e)一次(表面)叢。(d)及び(f)二次(深部)叢)。(f)において観察される血管のかすかな輪郭は、(e)で見られる一次ネットワーク血管の「にじみ(bleed−through)」画像である。
図7は、His6タグ付きT2−TrpRSをコードするDNA配列、配列番号1を示す。
図8は、His6タグ付きT2−TrpRSのアミノ酸配列、配列番号2を示す。
図9は、Lin−HSC及びLin+HSC(対照)を眼に注射したマウスから得られた網膜の顕微鏡写真及び網膜電図(ERG)である。
図10は、Lin−HSCで処理したrd/rdマウスの眼の中間部(Int.)と深部の両方の血管層についての、ニューロンの救済(y軸)と血管の救済(x軸)との相関を示す統計プロットである。
図11は、Lin+HSCで処理したrd/rdマウスの眼について、ニューロンの救済(y軸)と血管の救済(x軸)との相関がないことを示す統計プロットである。
図12は、Lin−HSCで処置したrd/rdマウスの眼(黒棒)及び無処置の(白棒)rd/rdマウスの眼についての、注射後1ヵ月(1M)、2ヵ月(2M)及び6ヵ月(6M)の時点における、任意の相対単位の血管長さ(y軸)の棒グラフである。
図13は、注射後1ヵ月(1M)、2ヵ月(2M)及び6ヵ月(6M)における、rd/rdマウスの外部神経層(ONR)中の核数の3つの棒グラフである。Lin+HSCで処置した対照の眼(白棒)よりもLin−HSC(黒棒)で処置した眼の核数がかなり増加する。
図14は、(注射後)1ヵ月(1M)、2ヵ月(2M)及び6ヵ月(6M)の時点において、(Lin−HSCで処置した)右眼(R)と左眼(L、Lin+HSCで処置した対照の眼)とを比較した、個々のrd/rdマウスについての外部神経層中の核数のプロットである。プロット中の各線は、個々のマウスの眼を比較したものである。
図15は、rd1/rd1(C3H/HeJ、左パネル)又は野生型マウス(C57BL/6、右パネル)における網膜血管構造及び神経細胞の変化を示す写真である。全載網膜中の中間部(上のパネル)又は深部(中間のパネル)の血管叢(赤:コラーゲンIV、緑:CD31)、及び同じ網膜の切断面(赤:DAPI、緑:CD31、下のパネル)の網膜血管構造を示す(P:出生後日数)。(GCL:神経節細胞層、INL:核間(inter nuclear)層、ONL:外顆粒層)。
図16は、Lin−HSC注射がrd1/rd1マウスにおける神経細胞の変性を救済することを示す図である。(A、B及びC)、P30(A)、P60(B)及びP180(C)において、Lin−HSCを注射した眼(右パネル)及び対照細胞(CD31−)を注射した反対側の眼(左パネル)の中間部(Int.)又は深部の叢及び切断面の網膜血管構造。(D)、P30(左、n=10)、P60(中間、n=10)及びP180(右、n=6)における、Lin−HSCを注射した網膜又は対照細胞(CD31−)を注射した網膜中の血管構造の平均全長(平均値の+又は−標準誤差)。中間部(Int.)と深部の血管叢のデータを別々に示す(Y軸:血管構造の相対長さ)。(E)、対照細胞(CD31−)又はLin−HSCを注射した網膜のP30(左、n=10)、P60(中間、n=10)又はP180(右、n=6)におけるONL中の細胞核の平均数(Y軸:ONL中の細胞核の相対数)。(F)、Lin−HSC又は対照細胞を注射した網膜のP30(左)、P60(中間)及びP180(右)における血管構造の長さ(X軸)とONL中の細胞核数(Y軸)との線形相関。
図17は、網膜機能がLin−HSC注射によって救済されることを示す図である。網膜電図検査(ERG)記録を使用して、Lin−HSC又は対照細胞(CD31−)を注射した網膜の機能を測定した。(A及びB)、救済された網膜及び救済されなかった網膜の注射後2ヵ月の代表例。同じ動物のLin−HSCを注射した右眼(A)及びCD31−対照細胞を注射した左眼(B)の網膜切片を示す(緑:CD31で染色した血管構造、赤:DAPIで染色した核)。(C)、(A)及び(B)に示した同じ動物から得られたERG結果。
図18は、ヒト骨髄細胞集団がrd1マウスにおける変性網膜を救済できることを示す写真である(A−C)。救済は、網膜変性の別のモデルrd10(D−K)においても認められる。A、緑色色素で標識されたヒトLin−HSC(hLin−HSC)は、C3SnSmn.CB17−Prkdc SCIDマウスの硝子体内に注射後、網膜血管細胞に分化し得る。(B及びC)、hLin−HSCを注射した眼(B)又は反対側の対照の眼(C)における注射後1.5ヵ月の網膜血管構造(左パネル;上:中間部叢、下:深部叢)及び神経細胞(右パネル)。(D−K)、(P6に注射した)Lin−HSCによるrd10マウスの救済。P21(D:Lin−HSC、H:対照細胞)、P30(E:Lin−HSC、I:対照細胞)、P60(F:Lin−HSC、J:対照細胞)及びP105(G:Lin−HSC、K:対照細胞)における代表的な網膜を示す(処置した眼及び対照の眼は、各時点において同じ動物から得た。)。網膜血管構造(各パネルの上の画像は中間部叢であり、各パネルの中間の画像は深部叢である。)をCD31(緑)及びコラーゲンIV(赤)で染色した。各パネルの下の画像は、同じ網膜でできた断面を示す(赤:DAPI、緑:CD31)。
図19は、クリスタリンαAが、救済された外顆粒層細胞ではLin−HSC処置後に上方制御されるが、対照細胞で処置した反対側の眼では上方制御されないことを示す写真である。左パネル;救済された網膜におけるIgG対照、中間のパネル;救済された網膜におけるクリスタリンαA、右パネル;救済されなかった網膜におけるクリスタリンαA。
図20は、本発明のLin−HSCで処置したネズミ網膜中で上方制御される遺伝子の表である。(A)ネズミLin−HSCで処置したマウス網膜において発現が3倍になる遺伝子。(B)ネズミLin−HSCで処置したマウス網膜において上方制御されるクリスタリン遺伝子。(C)ヒトLin−HSCで処置したマウス網膜において発現が2倍になる遺伝子。(D)ヒトLin−HSCで処置したマウス網膜において発現が上方制御される神経栄養因子又は成長因子の遺伝子。
図21は、CD133陽性(DC133+)及びCD133陰性(CD133−)ヒトLin−HSC集団のCD31及びインテグリンα6表面抗原の分布を示すグラフである。左パネルはフローサイトメトリー散布図を示す。中央及び右パネルは、細胞集団の特異抗体発現レベルを示すヒストグラムである。Y軸は現象数であり、X軸はシグナル強度である。白抜きの(対照)ヒストグラムの右側に移動した、塗り潰されたヒストグラムは、バックグラウンドレベルよりも抗体の蛍光シグナル及び発現が増加したことを表す。
図22は、出生後日数P0からP30における、正常酸素レベル(酸素正常状態)で飼育された野生型C57/B16マウスの出生後の網膜の発達を示す。
図23は、P7からP12において高酸素レベル(酸素過剰、酸素75%)で飼育され、続いてP12−P17において酸素正常状態で飼育されたC57/B16マウスの酸素誘発性網膜症モデルを示す。
図24は、酸素誘発性網膜症(OIR)モデルにおいてLin−HSC集団を用いた処置による血管の救済を示す。
図25は、Lin−HSCの硝子体内注射後のrd1マウスの外顆粒層(ONL)において救済される光受容器が、主に錐体であることを示す。野生型マウス網膜(上のパネル)中の光受容器の少数は、錐体の赤/緑オプシンの発現によって明らかなように錐体であった(A)。一方、ONLの大部分の細胞は、かん体に特異的なロドプシンについて陽性であった(B)。網膜血管構造は、免疫前血清(C)によって自己蛍光する(autofluoresce)が、顆粒層は、かん体又は錐体に特異的なオプシンによる染色に対して完全に陰性であった。rd/rdマウス網膜(下のパネル)は、縮小した内顆粒層及びほぼ完全に萎縮したONLを有し、そのどちらも錐体(D)又はかん体(パネルG)のオプシンについて陰性であった。対照のCD31−HSCで処置された眼は、注射されなかったrd/rd網膜と同じであり、錐体(E)又はかん体(H)のオプシンに対して染色されない。Lin−HSCで処置された反対側の眼は、錐体の赤/緑オプシンに対する陽性の免疫反応性によって明らかなように、著しく減少したが、明らかに存在する、主に錐体からなるONLを示した(F)。少数のかん体も観察された(I)。
図26は、CD44抗原を発現する細胞(赤いデータポイント)の割合を示す、系統陰性及び系統陽性の幹細胞集団のフローサイトメトリー分析から得られた散布図(それぞれ、左上及び左下のプロット)、並びにCD44抗原を発現する細胞(赤いデータポイント)の割合を示す、CD31陰性及びCD31陽性細胞集団のプロット(それぞれ、右上及び右下のプロット)である。
図27は、かなりのレベルのCD44抗原を発現する系統陰性細胞集団(左側のプロットセット)及びCD44抗原をさほど発現しない骨髄細胞の亜集団(右側のプロットセット)のフローサイトメトリー分析から得られた散布図であり、種々の他の細胞表面抗原を発現する細胞の相対割合を示す。
図28は、CD44LO細胞を硝子体内注射したマウスから得られた網膜と比較した、本発明のMLBM細胞集団由来の細胞を硝子体内注射したマウスから得られた網膜の顕微鏡写真画像(左パネル)である。
図29は、MLBM細胞集団由来の細胞(CD44HI)及びCD44LO細胞を注射した眼から得られた網膜の顕微鏡写真画像である。
図30は、未熟児網膜症の酸素誘発性網膜症モデルにおいて、マウス網膜の病原性血管新生を改善し、有益な生理的血管再生を促進する、MLBM細胞集団の有益な効果を示す棒グラフである。上のグラフは、対照網膜(第1の棒)、CD44LO細胞で処置した網膜(中間の棒)及びMLBM細胞集団由来の細胞で処置した網膜(右の棒)について網膜前方の新生血管叢面積を比較した。下のグラフは、対照網膜(第1の棒)、CD44LO細胞で処置した網膜(中間の棒)及びMLBM細胞集団由来の細胞で処置した網膜(右の棒)について血管閉塞面積を比較した。
図31は、MLBM細胞集団由来の細胞が網膜の血管構造に取り込まれると、画像下部における細胞の緑色染色によって示されるように、細胞が血管内皮増殖因子(VEGF)を発現することを示す顕微鏡写真画像である。
図32は、本発明のCD11b+MLBM細胞集団由来の細胞が、網膜の血管構造を選択的に標的にすることを示す顕微鏡写真画像である。
図33は、CD44−CD11b−骨髄細胞が網膜の血管構造を選択的に標的にしないことを示す顕微鏡写真画像である。
図34は、TrpRSのT2断片(配列番号3)及びそのT2−TrpRS−GD変異体(配列番号4)のアミノ酸残基配列である。
図35は、mini−TrpRSのアミノ酸残基配列(配列番号5)である。
図36は、T1−TrpRSのアミノ酸残基配列(配列番号6)である。
図37は、マウスの酸素誘発性網膜症(OIR)モデルにおける正常な網膜血管の発達、及びLin−骨髄由来細胞の硝子体内移植後の救済効果を示す。マウスは、生後2日目(P2)に示されるように(パネルa、網膜全組織標本)、主として無血管の網膜を有し、血管は、bに示す単一面を占める表面の網膜に存在する。パネルb、d及びfは、90度回転した正面共焦点zシリーズデータセットの3Dレンダリングから得られた画像である。生後第1週中に、表面の網膜血管構造は、視神経乳頭から放射状に成長し、P10までに末梢にほぼ到達する(c)。次いで、深部網膜血管構造が、第2週中に表面層の分枝から形成される(d)。最後に、第3の血管叢が最初の2つの血管叢の間に形成され、ほぼP30で成熟網膜血管構造が形成される(e、f)。パネルgによれば、OIRモデルにおいて過剰の酸素に曝露すると、ここに示すようにP10において中央の血管が閉塞する。パネルhによれば、P12において酸素正常状態に移行後、中心網膜が血管を再生し始め、網膜前方の特徴的な新生血管叢が、血管が新生した網膜(末梢)と無血管網膜(中央)の界面に形成される。これらの血管叢はイソレクチンで強く染色される。パネルI−nによれば、Lin−造血性前駆細胞は、OIRモデルにおいて血管修復を促進する。高濃度酸素曝露前に硝子体内注射されたLin−細胞は、P17において、ビヒクルで処置した他眼よりも中心網膜の血管再生を劇的に加速する。ビヒクルで処置された網膜は、表面の血管構造が一部欠如し(I)、深部網膜血管構造が完全に欠如しているが(k、m)、Lin−細胞で処置した他眼は、全3個の叢が存在し(k、m)、比較的正常な網膜血管構造(j)を示す。パネルoによれば、P17において、Lin−細胞で処置されたOIRの眼は、注射しなかった眼又はビヒクルを注射した眼よりもかなりの頻度で血管が完全に再生する。血管を、パネルa−f、i、jに示すようにフルオレセイン−デキストランの心臓潅流によって、また、パネルg、h、k−nにおけるGSレクチンによって、可視化した。パネルk−nの核は、DAPIで標識した。
図38は、Lin−細胞が、OIRにおいて、網膜血管再生を加速し、網膜前方の新生血管叢形成を減少させることを示す。パネルa−dは、コンピュータ画像解析方法によって、生後17日目に、OIRの眼から得られた網膜全組織標本中の網膜血管閉塞、及び網膜前方の新生血管叢形成(赤)の面積が計算されたことを示す。パネルeによれば、酸素過剰前にLin−細胞で処置した網膜は、閉塞面積が、注射しなかった対照のほぼ1/6、ビヒクルのみで処置した眼の約1/5になった。パネルfによれば、Lin−細胞による処置によって、注射しなかった眼及びビヒクルで処置した眼よりも、新生血管叢の二次元面積がかなり減少した。パネルgによれば、Lin−細胞移植は、酸素過剰前に投与したときだけでなく、酸素過剰中のP9−P12でも、また、酸素正常状態に戻した直後でも、閉塞面積の減少に有効である。(グラフは平均±SEMを示す。*p<0.001)。
図39は、骨髄細胞処置がほとんど又は全く長期毒性作用を持たないことを示す。Lin−細胞処置後5又は6ヵ月において評価した網膜は、正常な外見の網膜血管構造を有し、神経網膜は、断面上で組織学的に保存されていると考えられる(a−f、注射しなかった網膜とLin−細胞を注射した、移植後6ヵ月の網膜)。腫ようは認められず、唯一の異常は神経網膜中の散在的な「ロゼット」であり、ロゼットは対照の注射しなかった眼においても見られた(g、h)。
図40は、CD44HI細胞が、Lin−集団中で優勢であり、OIRモデルにおいて血管修復を効果的に促進することを示す。パネルaによれば、骨髄はCD44HI及びCD44LO画分を含み、Lin−集団は対照CD細胞よりもCD44HI細胞が豊富である。挿入図は、単球及び顆粒球に特有のものである、CD44HI細胞の光散乱特性を示しており、一方、CD44LO細胞の光散乱特性はリンパ球に特有のものである。パネルbは、酸素曝露前にCD44LO及びCD44HI骨髄細胞で処置した眼から得られた代表的なP17網膜を示す。下のパネルは、パネルcに示すデータを作成するために使用した、P17における閉塞及び新血管新生の数量化された領域を例示する。パネルcによれば、血管閉塞及び網膜前方の新血管新生は、CD44HI細胞で処置した眼において、Lin−細胞で処置した眼と類似した効率で減少する。血管閉塞(*)及び網膜前方の新血管新生(**)の面積は、CD44HI及びLin−眼において、ビヒクル注射又は注射なしと比較してかなり小さい(いずれの場合においてもp<10−5)。また、Lin−細胞で処置した眼における閉塞面積は、CD44HIよりも減少したが(p=0.03)、その程度ははるかに小さかった。網膜前方の新血管新生の面積は、Lin−で処置した眼とCD44HIで処置した眼とでは大差なかった(p=0.25)。
図41は、CD44HI亜集団が骨髄球性マーカーを発現することを示す。パネルaにおいては、2カラーフローサイトメトリーを用いて、CD44集団の特性を更に明らかにした。全細胞をCD44に対する抗体で標識し、示した種々の抗体で共標識(co−label)した。CD44HI集団は、CD11a、CD11b及びLy6GCで強く標識された。CD44hi細胞画分は、CD14、F4/80、cKit及びCD115に対して陽性であった。これらの抗原の大部分は、骨髄系細胞上に存在する。CD44LO細胞は、それぞれ赤芽球及びB細胞のマーカーである、Ter119及びCD45R B220で強く標識された。
図42は、CD44HI細胞が網膜中の血管周囲に局在化することを示す。共焦点画像解析によってz次元の一連の画像を作成し、次いでそれを3Dに描画した。パネルaにおいては、その投写像が示され、導入した骨髄細胞からのCD31標識血管内皮及びGFP発現が見られる。骨髄細胞は、血管周囲の位置を取ったと考えられる。3Dデータは、血管の管腔、及びGFP+骨髄細胞の相対位置が可視化されることを示している。(b)に示す番号は、(a)に示した断面位置に対応する。GFPシグナルは、シグナルのにじみ(bleed−through)が明らかである強い蛍光を有する細胞体の断面であるパネルb、No.3を除いて、いずれの場合においても管腔の外側で検出された。
図43は、OIRモデルにおいて注射されたCD44HI骨髄細胞のin situ分析結果を示す。細胞処置を受けていない対照網膜の標識は、内因性F4/80+血管周囲細胞の存在を示す(a−c)。注射されたCD44HI細胞は、網膜血管構造を標的にし、内因性細胞に類似した局在化、形態及びF4/80発現パターンを有する(d−i)。血管周囲の移植された骨髄細胞はCD44を発現せず、一方、網膜血管構造と関連しない細胞はCD44発現を保持する(j−o)。
図44は、発現アレイ分析結果を示し、それによれば、CD44HI集団では骨髄関連遺伝子が高度に発現したのに対して、CD44LO細胞はリンパ球関連遺伝子を発現した。AFFYMETRIX(登録商標)アレイを用いて、これら2つの骨髄細胞集団の遺伝子発現プロファイルを比較した。示した遺伝子は、発現が5倍以上違った。CD44HI集団では、CD44LO細胞よりもかなり高レベルのCD44発現が観測された。
図45は、CD44HI細胞が小こう細胞の諸特性を有する細胞に分化し得ることを示す。パネルA及びBによれば、注射されたCD44HI細胞は、CD11b及びF4/80を発現し、内因性小こう細胞と類似した形態及び血管周囲局在化を示す。パネルCは、注射されたCD44HI細胞の血管周囲局在化の3d画像である。パネルDは、注射されたCD44HI細胞の形態の高倍率画像である。
図46は、CD44HI細胞がネガティブ選択によって単離され得ることを示す。パネルAによれば、CD45R/B220、TER119及びCD3eに対して選択的な抗体を用いたMACSによってマウス骨髄を枯渇させると、90パーセントを超えるCD44HI細胞である細胞集団が生成する。パネルBによれば、ネガティブ画分(CD44HI集団)は、CD45R/B220、TER119及びCD3e細胞を本質的に含まない。パネルCによれば、ネガティブ選択されたCD44HI細胞は、網膜のターゲティング及び分化能力を保持する。
図47は、HIF−1発現が骨髄系前駆細胞にとってOIRモデルにおいて修復を媒介するのに重要であることを示す。パネル(a及びb)は、骨髄球特異的HIF−1αノックアウトマウス由来のCD44HI細胞(a)又は野生型マウス由来のCD44HI細胞(b)で処置された眼から得られる、GSレクチンで染色された代表的な網膜全組織標本を示す。パネル(c及びd)は、血管閉塞(明領域)及び新生血管叢(暗領域)の数量化された領域を示す、パネルa及びbからの網膜画像である。パネル(e)は、HIF−1αノックアウト由来のCD44HI細胞で処置された眼における修復活性の有意な低下を示す、編集されたデータである。*p≦0.0003、**p=0.024、n=15。値は平均±SEMである。両眼(paired eyes)を用いて作成された統計。
図48は、OIRモデルの虚血期中のCD11b+小こう細胞の数の測定可能な差を示す、C57BL/6JとBALB/cByJ系統との比較を示す。パネル(a)は網膜全組織標本であり、両方の系統は、生後12日目(P12)に中心網膜において同程度の血管閉塞を示し、P17には網膜血管構造に劇的な差が存在し、C57BL/6J網膜は、多量の新生血管叢を示し、中心網膜の血管再生をほとんど示さない。対照的に、BALB/cByJ網膜は、網膜前方の血管新生をほとんど又は全く示さず、この時期までに本質的に完全に血管を再生する。パネル(b)によれば、C57BL/6J網膜(左)は、虚血の48時間の過程において、BALB/cByJ網膜(右)よりも少ないCD11b+小こう細胞を含む。視神経乳頭は、すべての画像において右下に位置する。パネル(c)は、2つの系統におけるCD11b+小こう細胞の経時的定量化であり、それによれば、C57BL/6J網膜は、P12(虚血0時間)において酸素正常状態に戻ると、小こう細胞が減少し、P14(虚血48時間)においてBALB/cByJマウスの網膜中に存在する小こう細胞の数が半数未満になる。すべての時点において、BALB/cByJ対C57BL/6Jについてp≦0.02、n=8−11。パネル(d)によれば、C57BL/6Jにおける小こう細胞の欠乏は、網膜の発達中に既存の微小血管系の劇的な減少を引き起こす。P5にクロドロナートリポソームを注射すると、CD11b+小こう細胞がかなり減少し、P8において毛細血管が脱落(capillary dropout)する。示した画像は、中心網膜中の類似の場所からのものであり、視神経乳頭は右下に位置する。パネル(e)によれば、P2においてクロドロナートリポソームをC57BL/6Jに注射すると、PBSリポソームで処置された対照の他眼と比較して、CD11b+小こう細胞がかなり欠乏し、P6において網膜血管構造を劇的に阻害し、破壊する。挿入図によれば、標識されたリポソーム調製物(赤)は、CD11b+小こう細胞(緑)によって特異的に吸収され、GSレクチン標識された血管細胞(青)にも、他のCD11b−細胞にも吸収されない。
図49は、ヒト骨髄から単離された細胞のFACS分析データプロットを示し、細胞上で発現される幾つかの細胞マーカーが確認される。
図50は、ヒト骨髄から単離されたCD44HI細胞のFACS分析データプロットを示す。
図51は、ヒト骨髄から単離された細胞のFACS分析データプロットを示し、細胞マーカーCD11a、CD11b、CD33及びCD114が確認される。
図52は、叢面積及び閉塞面積のプロットを示し、ヒト及びマウスCD44HI細胞で処置されたマウス、並びにPBS対照処置マウスから得られた網膜を比較した。
図53は、ヒト末梢血から単離された細胞のFACS分析データプロットであり、種々の細胞マーカーが確認される。
図54は、叢面積及び閉塞面積のプロットであり、CD14及びCD33を用いたポジティブ選択によって得られたCD44HI細胞で処置されたマウスから得られた網膜を比較し、CD14−細胞、及びPBS(対照)で処置された細胞と比較した。
図55は、ヒト末梢血から単離された細胞のFACS分析データプロットである。
図56は、叢面積及び閉塞面積のプロットであり、本発明の種々の細胞集団で処置されたマウスから得られた網膜を比較し、PBS対照処置と比較した。
図57は、内皮細胞へのヒトさい帯血単核球の分化を示す。
図58は、KDR(VEGFR2)に対する抗体を用いたヒトさい帯血単核球の免疫染色を示す。
図59は、PECAM(CD31)に対する抗体を用いたヒトさい帯血単核球の免疫染色を示す。
図60は、PBS単独で処置された網膜と比較した、本発明のヒトさい帯骨髄球様細胞で処置されたマウスの網膜の叢面積及び閉塞面積のプロットである。
図61は、PBS単独で処置された網膜と比較した、本発明のヒトさい帯骨髄球様細胞で処置されたマウスの網膜の叢面積及び閉塞面積のプロットである。
図62は、eGFPレンチウイルスの発現によって確認される新しいさい帯血単核球の顕微鏡写真である。
図63は、PBS単独又はCD14−細胞で処置された網膜と比較した、CD14を用いたポジティブ選択によって単離されたヒトさい帯骨髄球様細胞で処置されたマウスの網膜の叢面積及び閉塞面積のプロットを示す(上)FACSデータ及び(下)プロットである。
好ましい形態の詳細な説明
骨髄、末梢血及びさい帯血は、CD44抗原(すなわち、ヒアルロン酸受容体)及びCD11b(インテグリンαM)を発現する骨髄球様細胞の亜集団を各々含む。CD44及びCD11b発現細胞が豊富な骨髄細胞の骨髄球様集団は、CD44抗原に対する抗体(抗CD44)及び/又はCD11b抗原に対する抗体(抗CD11b)で骨髄細胞を処理し、次いで抗体と免疫反応する細胞を選択することによって、骨髄から単離することができる。次いで、当分野で周知の方法によって抗体を細胞から除去することができる。細胞は、例えば、フローサイトメトリーによって、ビーズに結合した抗体又はビーズに塗布された抗体を用い、続いてろ過することによって、又は当分野で周知の他の分離方法によって、選択することができる。選択された細胞の大多数は系統陰性であり、単離に用いた抗体の種類にかかわらず、CD44抗原とCD11b抗原の両方を発現する。
CD44とCD11bを発現する骨髄球様細胞集団は、骨髄に加えて、末梢血及びさい帯血から単離することもできる。好ましくは、骨髄球様細胞集団は、ヒト骨髄、ヒト末梢血又はヒトさい帯血から単離される。
骨髄は幹細胞を含む。幹細胞は、典型的には、細胞表面の抗原分布によって同定される(詳細な考察については、参照により本明細書に組み入れる、the National Institutes of Health, Office of Science Policyによって用意された報告書であるStem Cells: Scientific Progress and Future Directions, June 2001, Appendix E: Stem Cell Markersを参照されたい。)。骨髄から単離された系統陰性造血幹細胞の約75%もCD44陽性である。好ましい一実施形態においては、MLBM細胞集団由来の細胞の大多数は、系統陰性造血幹細胞(すなわち、CD44+Lin−HSC)である。
本発明は、眼球疾患に罹患した哺乳動物の網膜における血管及びニューロンの変性を改善する方法を提供する。本発明の単離骨髄球様細胞集団は、哺乳動物の網膜に、好ましくは硝子体内注射によって、投与される。細胞は、網膜中の血管及び/又はニューロンの変性を改善するのに十分な量で投与される。好ましくは、単離骨髄球様細胞集団は、治療を受ける哺乳動物の自家細胞である。好ましくは、骨髄球様細胞集団由来の細胞は、リン酸緩衝食塩水(PBS)などの生理的に容認できる媒体中で投与される。
好ましい方法は、治療を受ける哺乳動物の骨髄から骨髄球様細胞集団を単離すること、次いで網膜の血管及び/又はニューロンの変性を改善するのに十分な数の細胞を哺乳動物に投与することを含む。骨髄球様細胞は、眼球変性疾患に罹患した哺乳動物から、好ましくは眼球疾患の早期において、又は眼球変性疾患に罹りやすいことが(すなわち、遺伝的素因によって)知られている健康な哺乳動物から、単離することができる。後者の場合、単離骨髄球様細胞集団を単離後保存することができ、次いで将来発症する眼球疾患の早期に予防的に注射することができる。好ましくは、患部網膜は、骨髄球様細胞集団由来の細胞が標的にする活性化された星状細胞を含む。したがって、付随する神経こう症があるときには眼の早期治療は有益である。或いは、自家骨髄球様細胞集団を投与する前に、網膜をレーザーで処置して、網膜中の活性化星状細胞の局所的増殖を刺激することができる。
造血幹細胞は、種々の血球タイプ、例えば、B細胞、T細胞、顆粒球、血小板及び赤血球に成長し得る幹細胞である。これらの系統表面抗原は、CD2、CD3、CD11、CD11a、Mac−1(CD11b:CD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、ネズミLy−6G、ネズミTER−119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、ヒト白血球抗原DR(HLA−DR)及びCD235a(グリコホリンA)を含めて、成熟血液細胞系統のマーカーである細胞表面タンパク質の一群である。これらの抗原をさほど発現しない造血幹細胞は、系統陰性(Lin−)と一般に称される。ヒト造血幹細胞は、一般に、CD31、CD34、CD117(c−kit)及び/又はCD133などの他の表面抗原を発現する。ネズミ造血幹細胞は、一般に、CD34、CD117(c−kit)、Thy−1及び/又はSca−1などの他の表面抗原を発現する。
本発明のこれらのCD44+ CD11b骨髄球様細胞は、発達中の血管構造に取り込まれ、次いで分化して血管内皮細胞になる能力がある。
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、骨髄及び骨髄細胞に関連した「成体」という句は、胎仔に相対して、出生後に、すなわち、若年及び成体の個体から単離された骨髄を含む。したがって、「成体哺乳動物」という用語は、胎仔又は出生前の個体に対して、若年(出生後)の哺乳動物と完全に成長した哺乳動物の両方を指す。
本発明の単離骨髄球様細胞集団は、星状細胞を選択的に標的にし、細胞が単離されたマウス、ヒトなどの哺乳動物種の眼の硝子体内に注射したときに網膜の新血管構造に取り込まれる。
本発明の単離骨髄球様細胞集団は、網膜の血管構造に取り込まれる細胞を含み、網膜新生血管及び網膜血管の変性疾患の治療、並びに網膜血管外傷の修復に有用である。本発明の骨髄球様細胞集団は、網膜中のニューロンの救済も促進し、抗アポトーシス遺伝子の上方制御も促進する。さらに、本発明の骨髄球様細胞集団を利用して、酸素誘発性網膜症又は未熟児網膜症に罹患した哺乳動物などの哺乳動物新生仔の眼における網膜の欠陥を治療することができる。
CD44を発現しない骨髄細胞(CD44LO細胞)は、一般に、以下の細胞マーカー、すなわち、Ter119、CD45RB220及びCD3eの1種類以上を発現することが判明した。このことを利用して、本発明のCD44HI骨髄球様細胞をネガティブ細胞マーカー選択を含む方法によって単離することができる。この方法は、複数の骨髄細胞、末梢血細胞又はさい帯細胞をTer119、CD45RB220及びCD3eに特異的である抗体と接触させること、Ter119、CD45RB220及びCD3e抗体と免疫反応する細胞を複数の骨髄細胞から除去すること、並びにTer119、CD45RB220及びCD3e発現細胞において欠落した骨髄球様骨髄細胞を収集することを含む。この方法を用いて、90パーセントを超える細胞がCD44を発現する骨髄球様細胞集団を回収することができる。
本発明は、哺乳動物の骨髄から骨髄球様細胞集団を単離すること、及び疾患を阻止するのに十分な数の骨髄球様細胞集団由来の細胞を哺乳動物の眼の硝子体内に注射することを含む、哺乳動物における眼球疾患を治療する方法も提供する。本方法を利用して、新生仔、若年又は完全に成長した哺乳動物における、網膜変性疾患、網膜血管変性疾患、虚血性網膜症、血管からの出血、血管からの漏出、脈絡膜症などの眼球疾患を治療することができる。かかる疾患の例としては、加齢黄斑変性症(ARMD)、糖尿病性網膜症(DR)、推定眼ヒストプラスマ症(POHS)、未熟児網膜症(ROP)、鎌状赤血球貧血及び網膜色素変性症並びに網膜の傷害が挙げられる。
眼に注射した骨髄球様細胞集団由来の細胞の数は、眼の病態を阻止するのに十分である。例えば、注射した細胞の量は、眼の網膜損傷の修復、網膜の新血管構造の安定化、網膜の新血管構造の成熟化、並びに血管からの漏出及び出血の防止又は修復に有効であり得る。
本発明の骨髄球様細胞集団由来の細胞は、細胞を用いた眼球の遺伝子療法に使用される抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子、ニューロンの救済効果を高める神経栄養物質をコードする遺伝子などの治療上有用な遺伝子を移入することができる。
形質移入された細胞は、網膜の障害の治療に有用である任意の遺伝子を含み得る。好ましい一実施形態においては、本発明の骨髄球様細胞集団由来の形質移入細胞は、タンパク質、TrpRSなどのタンパク質断片、又はその抗血管新生(すなわち、血管新生抑制(angiostatic))断片、例えば、T2−TrpRS(図34の配列番号3)、T2−TrpRS−GD(図34の配列番号4)(どちらも好ましい血管新生抑制ペプチドである。)、並びにmini−TrpRS(図35の配列番号5)及びT1−TrpRS(図36の配列番号6)と命名されたTrpRS断片を含めて、抗血管新生ペプチドを作動可能にコードする遺伝子を含む。本発明の抗血管新生ペプチドをコードする、骨髄球様細胞集団由来の形質移入細胞は、糖尿病性網膜症、同様の疾患などの異常血管の発生を含む網膜疾患の治療に有用である。好ましくは、骨髄球様細胞集団由来の細胞はヒト細胞である。
別の好ましい一実施形態においては、本発明のMLBM細胞集団由来の形質移入細胞は、神経成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、ニューロトロフィン5、毛様体神経栄養因子、網膜色素上皮由来神経栄養因子、インスリン様成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子などの神経栄養物質を作動可能にコードする遺伝子を含む。骨髄球様細胞集団由来のかかる神経栄養性細胞は、網膜神経などに対する傷害の治療において、緑内障、網膜色素変性症などの網膜ニューロン変性疾患におけるニューロンの救済を促進するのに有用である。毛様体神経栄養因子の移植は、網膜色素変性症の治療に有用であると報告された(Kirby et al. 2001, Mol Ther. 3(2): 241−8; Farrar et al. 2002, EMBO Journal 21: 857−864参照)。脳由来神経栄養因子は、傷害を受けた網膜神経節において、成長に関連する遺伝子を調節すると報告された(Fournier, et al., 1997, J. Neurosci. Res. 47: 561−572参照)。グリア細胞由来神経栄養因子は、網膜色素変性症において、光受容器の変性を遅延させると報告された(McGee et al. 2001, Mol Ther. 4(6): 622−9参照)。
本発明は、本発明の骨髄球様細胞集団由来の形質移入細胞を眼の硝子体内に注射投与することによって、眼球の血管由来の疾患を治療する方法も提供する。骨髄球様細胞集団由来のかかる形質移入細胞は、抗血管新生遺伝子産物又は神経栄養性遺伝子産物をコードする遺伝子など、治療上有用である遺伝子を移入された、MLBM細胞集団由来の細胞を含む。好ましくは、骨髄球様細胞集団由来の形質移入細胞はヒト細胞である。
好ましくは、少なくとも約1×105個の、MLBM細胞集団由来の細胞、又は骨髄球様細胞集団由来の形質移入細胞を、網膜変性疾患に罹患した哺乳動物の眼の硝子体内に注射することによって投与する。注射すべき細胞数は、網膜変性の重症度、哺乳動物の年齢、及び網膜疾患を治療する当業者には容易に明らかである他の因子に応じて決まり得る。骨髄球様細胞集団由来の細胞は、治療を担当する臨床家によって決定されるように、単回投与することができ、又はある期間にわたって複数回投与することができる。
本発明の骨髄球様細胞集団は、網膜血管構造の中断若しくは劣化又は網膜ニューロン変性を含む、網膜の傷害及び欠陥の治療に有用である。ヒト骨髄球様細胞集団を使用して、網膜血管構造の再生又は修復治療における使用のための、また、網膜ニューロン変性の治療又は改善のための、一連の遺伝的に同一な細胞、すなわち、クローンを作製することもできる。また、本発明の骨髄球様細胞集団は、網膜血管の発達を研究する研究ツールとして、また、星状細胞などの選択された細胞標的に遺伝子を送達する研究ツールとして、有用である。
ネズミ網膜血管の発達
眼球血管新生モデル。マウスの眼は、ヒトの網膜血管の発達など、哺乳動物の網膜血管の発達を研究するために一般に認められたモデルである。ネズミの網膜血管構造の発達中に、虚血によって誘導される網膜血管は、星状細胞と密接に関連して発達する。このこう細胞要素は、視神経乳頭から神経節細胞層に沿って、第3三半期のヒト胎児又はげっ歯類新生仔の網膜に移動し、放射状に広がる。ネズミの網膜血管構造が発達するにつれ、内皮細胞は、この既に形成された星状細胞のテンプレートを利用して、網膜血管パターンを決定する(図1(a及びb)参照)。図1(a及びb)は、発達中のマウス網膜の略図である。パネル(a)は、星状細胞テンプレート(明線)上に重なった一次叢(図左上の暗線)の発達を示し、(b)は網膜血管形成の第二相である。図1において、GCLは神経節細胞層を表し、IPLは内叢状(plexus)層を表し、INLは内顆粒層を表し、OPLは外叢状層を表し、ONLは外顆粒層を表し、RPEは網膜色素上皮を表し、ONは視神経を表し、Pは末梢を表す。
出生時、網膜血管構造は実質的に存在しない。生後14日目(P14)までに、網膜は、視覚の発生と同時に、網膜血管の複雑な一次(表面)層及び二次(深部)層を発達させる。最初に、既存の星状細胞ネットワーク上をスポーク状の乳頭周囲血管が末梢に向かって放射状に成長し、毛管網の形成によって次第に相互接続される。これらの血管は、神経線維内で単層としてP10まで成長する(図1(a))。P7−P8で、側副枝がこの一次叢から伸び始め、網膜から外網状層に貫入し、そこで二次又は深部網膜叢を形成する。P21までに、ネットワーク全体が大規模な再構築を行い、三次又は中間部叢が内顆粒層の内面に形成される(図1(b))。
新生仔マウスの網膜血管新生モデルは、幾つかの理由によって、眼球血管新生中のHSCの役割を研究するのに有用である。この生理的に関連したモデルにおいては、大きい星状細胞テンプレートが、内因性血管が出現する前に存在し、血管新生過程中の細胞−細胞ターゲティングの役割を評価することが可能である。また、この一貫して再現性のある新生仔網膜血管過程は、低酸素誘導性であることが知られており、この点で、虚血がある役割を果たすことが知られている多数の網膜疾患に類似している。
骨髄からの内皮前駆細胞(EPC)の濃縮
細胞表面マーカーの発現は、HSC調製物中に存在するEPC集団について広範に評価されたが、EPCを一義的に特定するマーカーはまだ十分に明らかにされていない。EPCを濃縮するために、造血系マーカー陽性細胞(Lin+)、すなわち、Bリンパ球(CD45)、Tリンパ球(CD3)、顆粒球(Ly−6G)、単球(CD11)及び赤血球(TER−119)をマウスの骨髄単核球から枯渇させた。Sca−1抗原を用いてEPCを更に濃縮した。同数のLin−Sca−1+細胞又はLin−細胞の硝子体内注射後に得られた結果を比較すると、2グループ間で違いは認められなかった。実際、Lin−Sca−1−細胞のみを注射したときには、発達中の血管へのはるかに多量の取り込みが観察された。
機能アッセイに基づくと、Lin−HSC集団はEPCと一緒に濃縮される。また、Lin+HSC集団は、Lin−HSC集団とは機能的に全く異なる挙動を示す。(既報のインビトロでの特性分析試験に基づいて)各画分のEPCを特定するのに一般に使用されるエピトープも評価した。これらのマーカーのいずれもLin−画分と独占的に関連してはいないが、いずれのマーカーもLin−HSCがLin+HSC画分よりも約70から約1800%増加した(図1(c))。図1、パネル(c)は、骨髄由来のLin+HSC及びLin−HSC分離細胞のフローサイトメトリー分析結果である。パネル(c)の上列は、非抗体標識細胞の造血幹細胞ドットプロット分布である。R1は、陽性PE染色の定量可能なゲート領域であり、R2はGFP陽性である。Lin−HSCのドットプロットを中間列に示し、Lin+HSCのドットプロットを下列に示す。C57B/6細胞をSca−1、c−kit、Flk−1/KDR、CD31に対するPE複合抗体で標識した。Tie−2データをTie−2−GFPマウスから得た。ドットプロットの各コーナーの割合は、全Lin−又はLin+HSC集団に対する陽性標識細胞のパーセントである。興味深いことに、Flk−1/KDR、Tie−2及びSca−1のような一般に容認されたEPCマーカーは発現が不十分であり、したがって、更なる分画には使用しなかった。
Lin−HSCは、(a)成体哺乳動物から骨髄を抽出し、(b)骨髄から複数の単球を分離し、(c)1種類以上の系統表面抗原に対する、好ましくはCD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac−1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly−6G(ネズミ)、TER−119(ネズミ)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、ヒト白血球抗原DR(HLA−DR)及びCD235a(グリコホリンA)からなる群から選択される系統表面抗原に対する、ビオチン複合系統パネル抗体で単球を標識し、(d)1種類以上の前記系統表面抗原に対して陽性である単球を複数の単球から除去し、(e)系統陰性造血幹細胞集団をそこから回収することによって単離することができる。
Lin−HSCを成体ヒト骨髄から単離するときには、系統表面抗原CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac−1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)及びCD235aに対するビオチン複合系統パネル抗体で単球を標識することが好ましい。Lin−HSCを成体ネズミ骨髄から単離するときには、系統表面抗原CD3、CD11、CD45、Ly−6G及びTER−119に対するビオチン複合系統パネル抗体で単球を標識することが好ましい。
硝子体内注射されたHSC Lin−細胞は、星状細胞を標的にするEPCを含み、発達中の網膜血管構造に取り込まれる。
硝子体内注射されたLin−HSCが、網膜の特定の細胞タイプを標的にし、星状細胞のテンプレートを利用し、網膜血管新生に関与することができるかどうかを判定するために、本発明のLin−HSC組成物由来の約105個の細胞、又は成体(GFP又はLacZトランスジェニック)マウスの骨髄から単離されたLin+HSC細胞(対照、約105個の細胞)を、生後2日目(P2)のマウスの眼に注射した。注射後4日(P6)で、GFP又はLacZトランスジェニックマウスから得られた本発明のLin−HSC組成物由来の多数の細胞は、網膜に付着し、内皮細胞の特徴的な細長い外観を呈した(図2(a))。図2は、発達中のマウス網膜中へのLin−細胞の移植を示す。図2、パネル(a)に示すように、注射後4日(P6)で、硝子体内注射されたeGFP+Lin−HSCは網膜上に付着し、分化する。
網膜の多数の領域において、GFP発現細胞は、下にある星状細胞と一致したパターンで整列し、血管に類似した。これらの蛍光性細胞は、発達中の内因性血管網の前方に観察される(図2(b))。逆に、Lin+HSC(図2(c))又は成体マウス腸間膜内皮細胞(図2(d))はわずかしか網膜表面に付着しなかった。注射されたLin−HSC集団由来の細胞が、既に形成された血管を有する網膜にも付着することができるかどうかを判定するために、Lin−HSC組成物を成体の眼に注射した。興味深いことに、網膜に付着する細胞も、形成された正常な網膜血管に取り込まれる細胞もなかった(図2(e))。これは、本発明のLin−HSC組成物が、正常に発達した血管構造を乱さず、正常に発達した網膜において異常な血管新生を惹起しないことを示している。
注射された本発明のLin−HSC組成物と網膜の星状細胞との関係を明らかにするために、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP、星状細胞のマーカー)及びプロモーター誘導性緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するトランスジェニックマウスを使用した。eGFPトランスジェニックマウスから得られたLin−HSCを注射したこれらのGFAP−GFPトランスジェニックマウスの網膜を検査すると、注射されたeGFP EPCと既存の星状細胞が共存した(図2(f−h)、矢印)。eGFP+Lin−HSCの過程は、下にある星状細胞のネットワークに従うことが認められた(矢印、図2(g))。これらの眼を検査すると、注射した標識細胞のみが星状細胞に付着し、網膜の末梢がまだ内因性血管を持たないP6のマウス網膜においては、注射した細胞が、これらのまだ血管新生されていない領域において星状細胞に付着して観察された。驚くべきことに、注射された標識細胞は、網膜のより深い層の、正常な網膜血管が続いて発生する正確な場所において観察された(図2(I)、矢印)。
注射したLin−HSCが、発達中の網膜血管構造に安定に取り込まれるかどうかを明らかにするために、その後の幾つかの時点において網膜血管を調べた。早くもP9(注射後7日目)でLin−HSCはCD31+構造に取り込まれた(図2(j))。P16(注射後14日目)までに、細胞は網膜血管様構造に既に広範に取り込まれた(図2(k))。動物を屠殺する前に(機能的な網膜血管を確認するために)ローダミン−デキストランを血管内に注射すると、Lin−HSCの大多数が開存血管(patent vessel)と並列した(図2(l))。2つの標識細胞分布パターンが観察され、(1)一方のパターンでは、細胞が非標識内皮細胞間の血管に沿って散在し、(2)他方のパターンでは、血管は全体的に標識細胞からなった。注射された細胞は、深部血管叢(deep vascular plexus)の血管にも取り込まれた(図2(m))。Lin−HSC由来のEPCが新血管構造に散発的に取り込まれることは以前に報告されているが、本発明は、Lin−HSC由来のEPCで全体的に構成される血管網の第1報である。これは、硝子体内注射された骨髄由来Lin−HSC集団由来の細胞が、網膜血管叢を形成する任意の層に効率的に取り込まれ得ることを示している。
非網膜組織(例えば、脳、肝臓、心臓、肺、骨髄)の組織検査は、硝子体内注射後5又は10日まで調べても、GFP陽性細胞の存在を示さなかった。これは、Lin−HSC画分内の細胞亜集団が、網膜星状細胞を選択的に標的にし、発達中の網膜血管構造に安定に取り込まれることを示している。これらの細胞は、内皮細胞の多数の特性(網膜星状細胞との会合、細長い形態、開存血管への安定な取り込み、及び血管外の場所に存在しないこと)を有するので、Lin−HSC集団中に存在するEPCである。標的星状細胞は、低酸素性網膜症の多くで観察されるのと同じタイプである。グリア細胞が、DR及び他の網膜傷害形態で観察される血管叢の新生血管の葉状態(frond)の顕著な成分であることはよく知られている。反応性神経こう症及び虚血誘導性新血管新生の条件下で、活性化星状細胞は、ヒトを含めた多数の哺乳動物種において新生仔の網膜血管テンプレート形成中に観察されるのと同様に、増殖し、サイトカインを産生し、GFAPを上方制御する。
Lin−HSC集団は、新生仔の眼の場合と同様に、成体マウスの眼の活性化星状細胞を標的にする。Lin−HSC細胞を、光凝固(図3(a))又は針の先端部(図3(b))によって傷つけた網膜を有する成体の眼に注射した。両方のモデルにおいて、顕著にGFAP染色される細胞集団が、傷害部位の周囲にのみ観察された(図3(a及びb))。注射されたLin−HSC組成物由来の細胞は、傷害部位に局在し、GFAP陽性星状細胞と特異的に会合したままであった(図3(a及びb))。これらの部位において、Lin−HSC細胞は、新生仔の深部網膜血管構造の形成中に観察されるのと類似したレベルで、網膜のより深い層に移動することも観察された。網膜の傷ついていない部分はLin−HSC細胞を含まず、傷ついていない正常成体網膜にLin−HSCを注射したときに観察されたのと同じであった(図2(e))。これらのデータによれば、Lin−HSC組成物は、傷害を受けた神経こう症の成体網膜、及び血管新生が進む新生仔網膜において、活性化グリア細胞を選択的に標的にすることができる。
硝子体内注射されたLin−HSCは、変性血管構造を救済し、安定化することができる。
硝子体内注射されたLin−HSC組成物は、星状細胞を標的にし、正常な網膜血管構造に取り込まれるので、Lin−HSCは、神経こう症及び血管変性に関連する虚血性又は変性網膜疾患における変性血管構造も安定化する。rd/rdマウスは、生後1ヵ月までに光受容器及び網膜血管層の深刻な変性を示す網膜変性モデルである。これらのマウスにおける網膜血管構造は、P16まで正常に発達し、P16でより深部の血管叢が退行する。大部分のマウスでは、深部及び中間部の叢がP30までにほぼ完全に変性した。
HSCが、退行する血管を救済することができるかどうかを明らかにするために、(BALB/cマウス由来の)Lin+又はLin−HSCをP6にrd/rdマウスの硝子体内に注射した。Lin+細胞注射後、P33までに、最深部の網膜層の血管はほぼ完全に消失した(図4(a及びb))。それに対して、Lin−HSCを注射した大部分の網膜は、P33まで、3層の平行で形のよい血管層を含むほぼ正常な網膜血管構造を有した(図4(a及びd))。この効果を定量化すると、Lin−を注射したrd/rd眼の深部血管叢中の血管の平均長さは、無処置の眼又はLin+細胞で処置した眼のほぼ3倍であった(図4(e))。驚くべきことに、rd/rd成体マウス(FVB/N)骨髄由来のLin−HSC組成物の注射によっても、rd/rd新生仔マウスの変性網膜血管構造が救済された(図4(f))。rd/rdマウスの眼における血管構造の変性は、早くも生後2−3週で観察された。P15と遅いLin−HSCの注射も、rd/rdマウスにおける変性血管構造を少なくとも1ヵ月間ある程度安定化した(図4(g及びh))。
より若年の(例えば、P2)rd/rdマウスに注射されたLin−HSC組成物も、発達中の表面血管構造に取り込まれた。P11までに、Lin−HSCは、深部血管叢のレベルに移動し、野生型外網膜血管層において認められたのと同一のパターンを形成することが観察された(図5(a))。注射されたLin−HSC組成物由来の細胞が、rd/rdマウスにおいて、変性網膜血管構造に取り込まれ、それを安定化した様式をより明確にするために、BALB/cマウス由来のLin−HSC組成物をTie−2−GFP FVBマウスの眼に注射した。FVBマウスは、rd/rd遺伝子型を有し、融合タンパク質Tie−2−GFPを発現するので、すべての内因性血管は蛍光性である。
Lin−HSC組成物由来の非標識細胞が新生仔のTie−2−GFP FVB眼に注射され、続いて発達中の血管構造に取り込まれると、注射され、取り込まれた非標識Lin−HSCに対応する非標識の空隙(gap)が内因性Tie−2−GFP標識血管中に存在するはずである。続いて別の血管マーカー(例えば、CD−31)で染色すると血管全体が描出され、非内因性内皮細胞が血管構造の一部であるかどうかを決定することができる。注射後2ヵ月で、CD31陽性、Tie−2−GFP陰性血管が、Lin−HSC組成物を注射した眼の網膜中に観察された(図5(b))。興味深いことに、救済された血管の大多数がTie−2−GFP陽性細胞を含んだ(図5(c))。平滑筋アクチンの染色によって求めた周細胞分布は、血管救済の有無にかかわらず、Lin−HSC注射によって変化しなかった(図5(d))。これらのデータは、遺伝的に欠陥のあるマウスにおいて、硝子体内注射されたLin−HSC細胞が網膜に移動し、正常な網膜血管の形成に関与し、内因性変性血管構造を安定化することを明確に示している。
Lin−HSC由来の形質移入細胞による網膜血管新生の阻害
網膜血管疾患の大多数は、変性ではなく、異常な血管増殖を含む。星状細胞を標的にするトランスジェニック細胞を使用して、抗血管新生タンパク質を送達し、血管新生を阻害することができる。Lin−HSC組成物由来の細胞にT2−トリプトファニル−tRNAシンセターゼ(T2−TrpRS)を移入した。T2−TrpRSは、網膜血管新生を強力に阻害するTrpRSの43kD断片である(図6(a))。プラスミドによって移入された対照Lin−HSC組成物(T2−TrpRS遺伝子なし)をP2に注射した眼の網膜は、P12において、正常な一次(図6(c))及び二次(図6(d))網膜血管叢を有した。T2−TrpRSを移入した本発明のLin−HSC組成物をP2の眼に注射し、10日後に評価すると、一次ネットワークがかなり異常であり(図6(e))、深部網膜血管構造の形成がほぼ完全に阻害された(図6(f))。これらの眼において観察された数本の血管は、著しく減衰して、各血管の間に大きな空隙が存在した。T2−TrpRSを分泌するLin−HSCによる阻害の程度を表1に詳細に示す。
T2−TrpRSは、Lin−HSC組成物中の細胞によってインビトロで産生され、分泌される。この形質移入細胞を硝子体に注射すると、網膜中にT2−TrpRSの30kD断片(図6(b))が観察された。この30kD断片は、形質移入Lin−HSCを注射した網膜においてのみ特異的に観察された。組換えタンパク質又はインビトロで合成されたタンパク質と比較した見掛け分子量のこの減少は、T2−TrpRSの生体内でのプロセシング又は分解によるものであり得る。これらのデータによれば、Lin−HSC組成物を使用して、活性化星状細胞を標的にすることによって、血管新生抑制分子を発現する遺伝子などの機能的に活性な遺伝子を網膜血管構造に送達することができる。観察された血管新生抑制効果は細胞媒介性活性によるものであり得るが、同一であるがT2が移入されていないLin−HSC組成物で処置された眼は正常網膜血管構造を持たないので、この可能性は極めて低い。
硝子体内注射されたLin−HSC集団は、網膜星状細胞に局在し、血管に取り込まれ、多数の網膜疾患の治療に有用であり得る。注射されたHSC組成物由来の大部分の細胞は、星状細胞のテンプレートに付着するが、少数は深部の網膜に移動し、深部血管網が続いて発生する領域に向かう。GFAP陽性星状細胞は、生後42日前にはこの領域に観察されないが、これは、GFAP陰性グリア細胞が既に存在して、Lin−HSC局在化の信号を送っている可能性を排除するものではない。以前の研究によれば、多数の疾患が反応性神経こう症に関連する。特に、DRにおいては、グリア細胞及びその細胞外基質が病的血管新生を伴う。
注射されたLin−HSC組成物由来の細胞は、傷害のタイプにかかわらず、GFAPを発現するグリア細胞に特異的に付着するので、本発明のLin−HSC組成物を使用して、網膜中の血管形成前の病変部を標的にすることができる。例えば、糖尿病などの虚血性網膜症においては、新血管新生は、低酸素に対する応答である。Lin−HSC組成物を病的新血管新生部位に向けることによって、発達中の新血管構造を安定化して、出血、浮腫などの新血管構造の異常(DRに付随する失明の原因)を防止することができ、新血管新生を最初に刺激する低酸素を場合によっては軽減することができる。異常な血管を正常な状態に回復させることができる。また、T2−TrpRSなどの血管新生抑制タンパク質は、形質移入Lin−HSC組成物及びレーザーによる星状細胞の活性化を利用することによって、病的血管新生部位に送達することができる。レーザー光凝固は、臨床の眼科において一般に使用されるので、この手法は多数の網膜疾患に適用される。細胞を用いたかかる手法は癌治療において探究されてきたが、それを眼疾患に使用することは、眼内注射によって多数の細胞を患部に直接送達することができるので、更に有利である。
Lin−HSCによる神経栄養性及び血管栄養性救済
MACSを使用して、高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)、C3H(rd/rd)、FVB(rd/rd)マウスの骨髄から、上述したように、Lin−HSCを分離した。これらのマウスから得られたEPCを含むLin−HSCをP6のC3H又はFVBマウスの眼の硝子体内に注射した。注射後種々の時点(1ヵ月、2ヵ月及び6ヵ月)で網膜を収集した。CD31に対する抗体で染色した後の走査レーザー共焦点顕微鏡によって、また、DAPIで核染色した後の網膜組織像によって、血管構造を分析した。異なる時点において網膜から得られたmRNAのマイクロアレイ遺伝子発現解析によって、上記効果に場合によっては関与する遺伝子を特定した。
rd/rdマウスの眼は、神経感覚網膜と網膜血管構造の両方の深刻な変性をP21までに起こした。P6にLin−HSCで処置したrd/rdマウスの眼は、正常な網膜血管構造を6ヵ月間も維持し、深部と中間部の両方の層は、すべての時点(1M、2M及び6M)において対照よりもかなり改善された(図12参照)。また、本発明者らは、Lin−HSCで処置した網膜が、対照としてのLin+HSCで処置した眼よりも厚く(1M;1.2倍、2M;1.3倍、6M;1.4倍)、外顆粒層においてより多数の細胞を有する(1M;2.2倍、2M;3.7倍、6M;5.7倍)ことを認めた。対照(無処置又は非Lin−処置)のrd/rd網膜と比較して「救済された網膜」(例えば、Lin−HSC)の大規模ゲノム解析によれば、図20、パネルA及びBに記載のタンパク質をコードする遺伝子を含めて、血管及び神経の救済と相関があるsHSP(低分子量熱ショックタンパク質)及び特定の成長因子をコードする遺伝子がかなり上方制御された。
骨髄由来のLin−HSC集団は、rd/rdマウスにおいて、正常な血管構造を有意に再現性よく維持し、光受容器及び他の神経細胞層を劇的に増加させた。この神経栄養性救済効果は、低分子量熱ショックタンパク質及び成長因子のかなりの上方制御と相関があり、現在治療不能な網膜変性疾患に対する治療手法についての見通しを与えるものである。
rd1/rd1マウス網膜は、深刻な血管及びニューロンの変性を示す。
マウスにおける出生後の網膜血管及びニューロンの正常な発達は、詳細に記述されており、第3三半期のヒト胎児において認められる変化と類似している(Dorrell et al., 2002, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43: 3500−3510)。rd1遺伝子に対して同型接合であるマウスは、ヒト網膜変性の多数の特性を共有し(Frasson et al., 1999, Nat. Med. 5: 1183−1187)、PR cGMPホスホジエステラーゼをコードする遺伝子の変異の結果として、重度の血管萎縮症を伴う光受容器(PR)の急速な損失を示す(Bowes et al. 1990, Nature 347: 677−680)。網膜の発達とそれに続くその変性中の血管構造を調べるために、コラーゲンIV(CIV)、成熟血管構造の細胞外基質(ECM)タンパク質、及び内皮細胞のマーカーであるCD31(PECAM−1)に対する抗体を使用した(図15)。rd1/rd1(C3H/HeJ)の網膜は、生後(P)約8日まで正常に発達したが、その後、光受容器を含む外顆粒層(ONL)の変性が始まった。ONLは急速に変性し、細胞はアポトーシスによって死滅し、核の単一層のみがP20まで残った。CIVとCD31の両方に対する抗体で全載網膜を二重染色すると、他者(Blanks et al., 1986, J. Comp. Neurol. 254: 543−553)によって記述された詳細と類似した、rd1/rd1マウスにおける血管変性の詳細が明らかになった。一次及び深部網膜血管層は、P12まで正常に発達したと考えられたが、その後、CD31染色の欠如によって示されるように、内皮細胞が急速に消失する。CD31陽性内皮細胞は、P12まで正常な分布で存在したが、その後急速に消失した。興味深いことに、CIV陽性染色は検査時点を通して存在したままであり、血管及び付随するECMが正常に形成されたことを示唆したが、CD31陽性細胞が観察されないP13後には、マトリックスのみが残存した。(図15、中間のパネル)。中間部血管叢もP21後に変性するが、その進行は、深部叢において観察される進行よりも遅い(図15、上のパネル)。正常なマウスの網膜血管及び神経細胞層をrd1/rd1マウスとの比較のために示す(右パネル、図15)。
rd1/rd1マウスにおける骨髄由来細胞の神経保護作用
硝子体内注射されたLin−HSCは、全3つの血管叢中の内因性網膜血管構造に取り込まれ、血管の変性を防止する。興味深いことに、注射された細胞は、外顆粒層では実質的に観察されない。これらの細胞は、形成中の網膜血管に取り込まれるか、又はこれらの血管の近傍で観察される。(C3H/HeJ由来の)ネズミLin−HSCを、変性が始まる直前のP6にC3H/HeJ(rd1/rd1)マウスの眼の硝子体内に注射した。対照細胞(CD31−)を注射した眼は、P30までに、典型的なrd1/rd1表現型を示し、すなわち、深部血管叢がほぼ完全に変性し、ONLは、検査した全網膜で観察された。Lin−HSCが注射された眼は、正常な外観の中間部及び深部血管叢を維持した。驚くべきことに、対照細胞を注射した眼よりもかなり多くの細胞が、Lin−HSCを注射した眼の核間層(INL)及びONLで観察された(図16(A))。Lin−HSCのこの救済効果は、注射後2ヵ月(図16(B))で観察することができ、6ヵ月間も観察することができた(図16(C))。Lin−HSCを注射した眼の中間部叢と深部叢の血管構造の違い、並びに神経細胞を含むINLとONLの血管構造の違いは、救済された眼と救済されなかった眼を比較すると全測定時点で大きかった(図16(B及びC))。この効果を、血管構造の全長を測定することによって(図16(D))、また、ONL中で観察されるDAPI陽性細胞核の数を数えることによって(図16(E))、数量化した。単純線形回帰分析を全時点におけるデータに適用した。
Lin−HSCを注射した眼において、血管救済とニューロン(例えば、ONL厚さ)救済との統計的に有意な相関がP30(p<0.024)及びP60(p<0.034)で認められた(図16(F))。Lin−HSCを注射した網膜を対照細胞を注射した網膜と比較すると、相関は、統計的に有意ではないが(p<0.14)、P180においても高いままであった(図16(F))。それに対して、対照細胞を注射した網膜は、血管構造とONLの保存の有意な相関をどの時点でも示さなかった(図16(F))。これらのデータによれば、Lin−HSCの硝子体内注射は、rd1/rd1マウスの網膜において網膜血管とニューロンを同時に救済する。注射された細胞は、ONLでは観測されず、網膜血管内以外、網膜血管近傍以外のどの場所でも観測されなかった。
Lin−HSCを注射したrd/rd網膜の機能の救済
網膜電図(ERG)を、対照細胞又はネズミLin−HSCの注射後2ヵ月のマウスで実施した(図17)。血管及びニューロンが救済されたことを確認するために、ERG記録後に各眼の免疫組織化学分析及び顕微鏡分析を実施した。処置され、救済された眼及び対照の救済されなかった眼の代表的なERG記録によれば、救済された眼において、減算された信号(処置の眼−無処置の眼)から8−10マイクロボルトの振幅を有する明確に検出可能な信号が生成した(図17)。両眼からの信号が極度に異常であることは明らかである。しかし、Lin−HSCで処置した眼からは、一貫して検出可能なERGを記録することができた。いずれの場合においても、対照の眼からのERGは検出不能であった。救済された眼における信号の振幅は通常よりもかなり小さかったが、信号は、組織が救済されるときはいつでも一貫して観測され、遺伝子に基づく他の救済試験によって報告された信号の桁であった。全体的に、これらの結果は、Lin−HSCで処置した眼におけるある程度の機能救済を実証している。
救済されたrd/rd網膜細胞タイプは、主に錐体である。
救済された網膜及び救済されなかった網膜を、かん体又は錐体のオプシンに特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に分析した。図17に示すERG記録に用いたのと同じ眼をかん体又は錐体オプシンについて分析した。野生型マウス網膜においては、存在する光受容器の約5%未満が錐体である(Soucy et al. 1998, Neuron 21: 481−493)。図25(A)に示す錐体の赤/緑オプシン、又は図25(B)に示すかん体ロドプシンを用いて観察された免疫組織化学的染色パターンは、錐体細胞のこの割合と一致した。野生型網膜を免疫前IgGで染色すると、染色は、血管の自己蛍光を除いて、神経感覚網膜中のどこにも観察されなかった(図25(C))。生後2ヵ月、注射しなかったrd/rdマウスの網膜は、赤緑錐体オプシン(図25(D))又はロドプシン(図25(G))に対する抗体で染色されない、本質的に萎縮性の外顆粒層を有した。対照のCD31−HSCを注射した眼も、錐体(図25(E)))又はかん体(図25(H))のオプシンの有無では陽性染色されなかった。それに対して、Lin−HSCを注射した反対側の眼は、維持された外顆粒層中の約3から約8列の核を有し、Lin−HSCの大部分は、錐体のオプシンに対して陽性であり(図25(F))、かん体のオプシンに対して約1−3%陽性であった(図25(I))。意外なことに、これは、かん体が支配的である正常なマウス網膜において通常観察されるものとほぼ逆である。これらのデータによれば、Lin−HSCの注射によって、通常であれば錐体が変性する長期間、錐体が維持される。
ヒト骨髄(hBM)由来のLin−HSCは変性網膜も救済する。
ヒト骨髄から単離されたLin−HSCは、ネズミLin−HSCと同様に挙動する。骨髄をヒトドナーから収集し、Lin+HSCを枯渇させると、ヒトLin−HSC(hLin−HSC)集団が生成した。これらの細胞を生体外で蛍光色素で標識し、C3SnSmn.CB17−Prkdc SCIDマウスの眼に注射した。注射されたhLin−HSCは、ネズミLin−HSCを注射したときに観察されるのと同様にして、網膜血管新生部位を標的にして移動した(図18(A))。血管ターゲティングに加えて、ヒトLin−HSCは、rd1/rd1マウスの血管層と神経細胞層の両方に対する堅牢な救済効果ももたらす(図18(B及びC))。この観察は、網膜血管構造を標的にし、網膜変性症を防止することができる、ヒト骨髄中の細胞の存在を立証するものである。
Lin−HSCは、rd10/rd10マウスにおいて血管及び神経栄養性効果を有する。
rd1/rd1マウスは、網膜変性症に対して最も広く用いられ、最も特徴づけられたモデルであるが(Chang et al. 2002, Vision Res. 42: 517−525)、変性が極めて速く、この点で、ヒト疾患において観察される通常の遅い進行とは異なる。この系統においては、光受容器細胞の変性は、網膜血管構造がまだ急速に拡大しつつあるP8頃に始まる(図15)。中間部叢がまだ形成中ではあるが、深部網膜血管構造の変性がそれに続いて起こり、したがって、この疾患を有する大部分のヒトにおいて観察されるのとは異なり、rd1/rd1マウスの網膜は完全には発達しない。変性の進行が遅く、ヒト網膜の変性条件により近似したrd10マウスモデルを用いて、Lin−HSCによって媒介される血管の救済を検討した。rd10マウスにおいては、光受容器細胞の変性はP21頃に始まり、その後間もなく血管の変性が始まる。
正常な神経感覚網膜の発達はP21までにほぼ完了するので、変性は、網膜が分化し終えた後に始まることが観測され、したがってrd1/rd1マウスモデルよりもヒト網膜変性症に類似している。rd10マウス由来のLin−HSC又は対照細胞をP6の眼に注射し、網膜を異なる時点で評価した。P21において、Lin−HSCと対照細胞の両方を注射した眼から得られた網膜は正常と考えられ、全血管層が完全に発達し、INL及びONLが正常に発達した(図18(D及びH))。約P21において、網膜変性が始まり、加齢とともに進行した。対照細胞を注射した網膜は、P30までに、重度の血管及びニューロンの変性を示し(図18(I))、一方、Lin−HSCを注射した網膜は、ほぼ正常な血管層及び光受容器細胞を維持した(図18(E))。救済された眼と救済されなかった眼の差は、時間が遅いほどより明白であった(図18(F及びG)と18(J及びK)を比較されたい。)。対照で処理された眼においては、血管変性の進行は、CD31及びコラーゲンIVに対する免疫組織化学的染色によって極めて明確に観察された(図18(I−K))。対照で処置された眼はCD31に対してほぼ完全に陰性であったのに対して、コラーゲンIV陽性血管「跡(track)」は明白なままであり、不完全な血管形成ではなく、血管の退行が起こったことを示している。それに対して、Lin−HSCで処置された眼は、正常な野生型の眼に極めて類似しているようにみえる、CD31とコラーゲンIVの両方の陽性血管を有した(図18(FとI)を比較されたい。)。
Lin−HSC処置後のrd/rdマウス網膜の遺伝子発現解析
大規模ゲノム科学(マイクロアレイ分析)を用いて、救済された網膜及び救済されなかった網膜を分析して、神経栄養性救済の推定媒介物質を特定した。Lin−HSCで処置したrd1/rd1マウスの網膜における遺伝子発現を、注射しなかった網膜及び対照細胞(CD31−)を注射した網膜と比較した。これらの比較を各々3回実施した。存在するとみなすには、遺伝子は、各々3回のすべてにおいてバックグラウンドレベルの少なくとも2倍の発現レベルを有する必要があった。Lin−HSCで保護された網膜において、対照細胞を注射したrd/rdマウス網膜及び注射しなかったrd/rdマウス網膜に比べて3倍上方制御された遺伝子を図20、パネルA及びBに示す。発現した遺伝子について、標準偏差を各cRNA複製の平均発現レベルで除算して、変動係数(COV)レベルを計算した。また、発現レベルと雑音分散の相関を、平均と標準偏差(SD)の相関を取ることによって計算した。各遺伝子に対する遺伝子発現レベルと標準偏差の相関を得た。これによって、バックグラウンドレベル及び信頼できる発現レベルしきい値を決定することができた。全体として、データは十分許容限度内であった(Tu et al. 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 14031−14036)。以下で個々に考察する遺伝子は、これらの臨界発現レベルを超える発現レベルを示した。考察した遺伝子に対する対応のある「t検定」値も求めた。各場合において、p値は妥当であり(約0.05以下)、複製間に類似性があること、及び異なる試験群間に考えられる有意差があることを示している。MAD及びYing Yang−1(YY−1)(Austen et al. 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224: 123−130)を含めて、かなり上方制御された遺伝子の多くは、アポトーシスからの細胞の保護を含む機能を有するタンパク質をコードする。配列相同性を有し、ストレスからの細胞の保護を含む、公知の熱ショックタンパク質と類似の機能を有する、幾つかのクリスタリン遺伝子も、Lin−HSC処置によって上方制御された。α−クリスタリンの発現は、免疫組織化学分析によればONLに局在した(図19)。図19によれば、クリスタリンαAは、Lin−HSCで処置した後に、救済された外顆粒層細胞において上方制御されるが、対照細胞で処置した反対側の眼では上方制御されない。左のパネルは、救済された網膜におけるIgG染色(対照)を示す。中間のパネルは、救済された網膜におけるクリスタリンαAを示す。右のパネルは、救済されなかった網膜におけるクリスタリンαAを示す。
ヒトLin−HSCを用いて救済されたrd1/rd1マウス網膜から得られたメッセンジャーRNAを、ヒト特異的Affymetrix U133Aマイクロアレイチップとハイブリッド形成させた。厳密な分析の後、そのmRNA発現が、ヒト特異的であり、バックグラウンド以上であり、ネズミLin−HSCによって救済された網膜及びヒト対照細胞を注射して救済されなかった網膜よりもヒトLin−HSCによって救済された網膜においてかなり高い、幾つかの遺伝子を見いだした(図20、パネルC)。初期の新たに分化したCD34+造血幹細胞の表面で発現される細胞接着分子であるCD6と、造血幹細胞によって発現される別の遺伝子であるインターフェロンアルファ13は、どちらもマイクロアレイバイオインフォマティクス技術によって見いだされ、評価プロトコルの正しいことが証明された。また、幾つかの成長因子及び神経栄養因子は、ヒトLin−HSCによって救済されたマウス網膜試料によって、バックグラウンド以上に発現された(図20、パネルD)。
分化系列が決定した造血細胞のマーカーを用いて、EPCを含む骨髄由来Lin−HSC集団をネガティブ選択した。EPCとして役立ち得る骨髄由来Lin−HSCの亜集団は、一般に使用される細胞表面マーカーによって特徴づけられないが、発達中の又は傷害を受けた網膜血管構造における骨髄由来Lin−HSCの挙動は、Lin+又は成体内皮細胞集団の場合に観察される挙動とは全く異なる。骨髄由来Lin−HSCは、網膜の血管新生部位を選択的に標的にし、開存血管の形成に関与する。
遺伝性網膜変性疾患は、網膜血管構造の損失を伴うことが多い。かかる疾患の有効な治療には、機能を回復し、複雑な組織構造を維持する必要がある。幾つかの最近の研究は、細胞を用いた栄養性因子の送達の使用、又は幹細胞自体の使用を探究しているが、両方の組合せが必要な場合もある。例えば、網膜変性疾患を治療する成長因子療法を使用すると、血管が無秩序に過形成し、正常な網膜組織構造が極度に破壊される。神経又は網膜の幹細胞を網膜変性疾患の治療に使用すると、ニューロンの機能が復元し得るが、網膜機能の完全性を維持するには機能的血管構造も必要である。Lin−HSC集団由来の細胞をrd/rdマウスの網膜血管に組み込むと、網膜構造を乱すことなく変性血管構造を安定化した。この救済効果は、Lin−HSC集団由来の細胞をP15のrd/rdマウスに注射したときにも認められた。血管変性はrd/rdマウスにおいてP16に始まるので、この知見は、有効なLin−HSC処置の治療窓を拡大するものである。Lin−HSC細胞を注射した眼においては、網膜のニューロン及び光受容器が保存され、視覚機能が維持される。
成体骨髄由来Lin−HSCは、網膜変性疾患を有するマウスの硝子体内に注射すると、大きな血管及び神経栄養性効果を発揮する。この救済効果は、治療後最高6ヵ月持続し、網膜変性を完了する前(生後30日までに完全な網膜変性を通常示すマウスにおいて生後16日まで)にLin−HSCを注射したときに最も効果的である。この救済は、網膜変性症の2つのマウスモデルにおいて観察され、レシピエントが網膜変性症を有する免疫不全のげっ歯類(例えば、SCIDマウス)であるときに、又はドナーが網膜変性症を有するマウスであるときに、意外なことに、成体ヒト骨髄由来のHSCを用いて実施することができる。幾つかの最近の報告は、野生型遺伝子を用いた、ウイルスによる遺伝子救済後の、網膜変性を有するマウス又はイヌにおける部分的表現型救済(partial phenotypic rescue)を記述しているが(Ali, et al. 2000, Nat Genet 25: 306−310; Takahashi et al. 1999, J. Virol. 73: 7812−7816; Acland et al. 2001, Nat. Genet. 28: 92−95)、本発明は、血管の救済によって達成された、最初の一般的な細胞療法効果である。したがって、100を超える既知の関連する変異を含む疾患(例えば、網膜色素変性症)群を治療する際のかかる手法の潜在的有用性は、既知の各変異を処置する個々の遺伝子療法を作成することよりも実際的である。
神経栄養性救済効果の正確な分子基盤は、未知のままであるが、血管の安定化と救済が同時であるときにのみ認められる。注射した幹細胞の存在それ自体では、神経栄養性救済を生じるのに十分ではなく、外顆粒層中に幹細胞由来のニューロンが明らかに欠如している場合には、注射した細胞が光受容器に変換される可能性がなくなる。マイクロアレイ遺伝子発現解析によって得られたデータによれば、抗アポトーシス効果を有することが知られている遺伝子がかなり上方制御された。網膜変性症において認められる大部分のニューロン死はアポトーシスによるものなので、かかる保護は、これらの疾患において光受容器及び視覚機能に重要な他のニューロンの寿命を延長するのに治療上極めて有益となり得る。c−mycは、下流の種々のアポトーシス誘発因子の上方制御によって、アポトーシスに関与する転写因子である。c−mycの発現は、rd/rdマウスにおいて野生型の4.5倍であり、rd1/rd1マウスにおいて観察される光受容器の変性に関与し得ることを示している。Lin−HSCで保護された網膜において劇的に上方制御される2つの遺伝子Mad1及びYY−1は(図20、パネルA)、c−mycの活性を抑制し、したがってc−mycによって誘発されるアポトーシスを阻害することが知られている。Mad1の過剰発現は、Fasによって誘導されるカスパーゼ8の活性化を抑制することも示された。カスパーゼ8は、アポトーシス経路の別の重要な成分である。これら2種類の分子の上方制御は、rd/rdマウスにおける変性を一般にもたらすアポトーシスの開始を防止することによって、血管及び神経の変性から網膜を保護するのにある役割を果たし得る。
Lin−HSCで保護された網膜において大きく上方制御される別の遺伝子セットとしては、クリスタリンファミリーのメンバーが挙げられる(図20、パネルB)。熱ショック及び他のストレス誘発性タンパク質と同様に、クリスタリンは、網膜のストレスによって活性化され、アポトーシスに対して保護作用を及ぼし得る。クリスタリンαAの異常に低い発現は、網膜ジストロフィーのラットモデルにおける光受容器の損失と相関があり、rd/rdマウスにおける網膜の最近のプロテオミクス分析によって、網膜変性に応じてクリスタリンが上方制御されることが証明された。EPCによって救済されたrd/rdマウス網膜の本発明者らのマイクロアレイデータに基づいて、クリスタリンの上方制御は、EPCによって媒介される網膜神経保護において鍵となる役割を果たすと考えられる。
c−myc、Mad1、Yx−1、クリスタリンなどの遺伝子は、ニューロン救済の下流媒介物質である可能性がある。神経栄養物質は、抗アポトーシス遺伝子の発現を調節し得るが、マウス幹細胞を用いて救済された網膜の本発明者らのマイクロアレイ分析によれば、公知の神経栄養因子のレベルは増加しなかった。一方、ヒト特異的チップを用いた、ヒト骨髄由来の幹細胞によって媒介される救済の分析によれば、複数の成長因子遺伝子の発現は低いが、かなり増加する。
上方制御された遺伝子としては、線維芽細胞成長因子ファミリーの幾つかのメンバー、オトフェリンなどが挙げられる。オトフェリン遺伝子の変異は、聴神経障害による難聴をもたらす遺伝性疾患と関連がある。注射されたLin−HSCによるオトフェリン産生は、網膜神経障害の予防にも寄与し得る。歴史的に、網膜変性症の患者及び動物において観察される血管の変化は、光受容器が消滅したときの代謝要求の減少に続発すると長い間考えられてきた。本データによれば、少なくとも遺伝性網膜変性症のマウスでは、正常な血管構造を維持することは、外顆粒層の成分の維持にも役立ち得る。最近の文献報告は、組織特異的血管構造が、単なる血管「栄養」の供給から予想される以上の栄養効果を有するという概念を支持している。例えば、肝臓内皮細胞は、肝傷害に直面して、VEGFR1活性化後に、肝細胞の再生及び維持に重要な成長因子を産生するように誘導され得る(LeCouter et al. 2003, Science 299: 890−893)。
血管内皮細胞と隣接する肝実質細胞との類似の暗示的な相互作用は、機能的血管が形成されるかなり前に、肝臓の器官形成に関与するとされている。網膜変性症を有する個体における内因性網膜血管構造は、救済を劇的に促進するわけではないかもしれないが、この血管構造が骨髄造血幹細胞集団に由来する内皮前駆体で強化される場合には、内皮前駆体は、変性に対して血管構造をより抵抗性にし、同時に網膜のニューロン及び血管の生存を容易にし得る。網膜変性症を有するヒトにおいては、完全な網膜変性症の発症を遅延させることによって、視力を数年間延長することができる。Lin−HSCで処置された動物は、視力の維持には十分であり得るかなりのERGを保持する。
臨床的に、視力機能を依然として維持しながら、光受容器及び他のニューロンが実質的に失われ得ることは広く認識されている。ある時点において、臨界のしきい値を超え、視力が失われる。ヒト遺伝性網膜変性症のほぼすべては、早期ではあるが、緩慢に発症するので、網膜変性症を有する個体を確認することができ、本発明の自家骨髄幹細胞の移植片で硝子体内処置して、網膜変性症及び同時に起こる視力喪失を遅延させることができる。本発明の幹細胞のターゲティング及び取り込みを促進するためには、活性化星状細胞が存在することが望ましい(Otani et al. 2002, Nat. Med. 8: 1004−1010)。これは、神経こう症が付随するときには早期治療によって、又はレーザーを用いて活性化星状細胞の局所的増殖を刺激することによって、実施することができる。場合によっては、眼内注射前に1種類以上の神経栄養物質を幹細胞に生体外で移入して、救済効果を強化してもよい。この手法は、網膜神経節細胞変性が存在する、緑内障などの他の視覚ニューロンの変性障害の治療に適用することができる。
成体骨髄由来のLin−HSC集団は、反応性星状細胞を標的にすることによって血管新生を促進することができるEPC集団を含み、形成されたテンプレートに、網膜構造を乱さずに取り込まれる。Lin−HSCは、網膜変性症に罹患した眼において、長期の神経栄養性救済効果ももたらす。また、遺伝子改変された、EPCを含む自家Lin−HSC組成物は、虚血性の眼又は異常に血管新生した眼に移植することができ、新しい血管及びニューロン層に安定に取り込むことができ、治療分子を局所的に長期間連続送達することができる。生理的に意味のある用量の薬物を発現する遺伝子のかかる局所送達は、現在治療不能な眼球疾患を治療する新しいパラダイムである。
例えば、正常なマウス網膜中の光受容器は主にかん体であるが、本発明のLin−HSCによる救済後に観察される外顆粒層は主に錐体を含んだ。大部分の遺伝性ヒト網膜変性症は、初期のかん体特異的欠陥の結果として起こり、錐体の損失は、かん体によって発現されるある種の栄養性因子の損失に関係している可能性があるかん体の機能不全に続発すると考えられる。
実施例
細胞の単離及び濃縮;ネズミLin−HSC集団A及びBの調製。
一般的手順。生体内での全評価をNIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って実施した。全評価手順は、The Scripps Research Institute(TSRI、La Jolla、CA) Animal Care and Use Committeeによって認可された。骨髄細胞をB6.129S7−Gtrosa26、Tie−2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rdマウス)又はBalb/cBYJ成体マウス(The Jackson Laboratory、ME)から抽出した。
次いで、単球を、HISTOPAQUE(登録商標)ポリスクロース勾配(Sigma、St.Louis、MO)を用いた密度勾配分離によって分離し、マウスにおいてLin−選択用のビオチン複合系統パネル抗体(CD45、CD3、Ly−6G、CD11、TER−119、Pharmingen、San Diego、CA)で標識した。系統陽性(Lin+)細胞を、磁気分離装置(AUTOMACS(商標)選別機、Miltenyi Biotech、Auburn、CA)を用いてLin−HSCから分離し、除去した。内皮前駆細胞を含む生成Lin−HSC集団を、以下の抗体、すなわち、PE複合Sca−1、c−kit、KDR及びCD31(Pharmingen、San Diego、CA)を用いたFACS(商標)Caliburフローサイトメーター(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)によって更に分析した。Tie−2−GFP骨髄細胞をTie−2の特性分析に使用した。
成体マウス内皮細胞を収集するために、腸間膜組織をACTbEGFPマウスから外科的に取り出し、コラゲナーゼ(Worthington、Lakewood、NJ)中に置いて組織を消化し、続いて45μmフィルターによってろ過した。ろ液(Flow−through)を収集し、Endothelial Growth Media(Clonetics、San Diego、CA)と一緒に温置した。形態的に玉石状の外観を観察し、CD31 mAb(Pharmingen)で染色し、MATRIGEL(商標)マトリックス(Beckton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)中の管状構造の形成について培養物を検査することによって、内皮の特性を確認した。
ネズミLin−HSC集団A。骨髄細胞を上記一般的手順によってACTbEGFPマウスから抽出した。Lin−HSC細胞をFACSフローサイトメトリーによってCD31、c−kit、Sca−1、Flk−1及びTie−2細胞表面抗原マーカーについて分析した。結果を図1(c)に示す。Lin−HSCの約81%がCD31マーカーを提示し、Lin−HSCの約70.5%がc−kitマーカーを提示し、Lin−HSCの約4%がSca−1マーカーを提示し、Lin−HSCの約2.2%がFlk−1マーカーを提示し、Lin−HSC細胞の約0.91%がTie−2マーカーを提示した。それに対して、これらの骨髄細胞から単離されたLin+HSCは、かなり異なる細胞マーカープロファイルを示した(すなわち、CD31:37.4%、c−kit:20%、Sca−1:2.8%、Flk−:0.05%)。
ネズミLin−HSC集団B。骨髄細胞を上記一般的手順によってBalb/C、ACTbEGFP及びC3Hマウスから抽出した。Lin−HSC細胞を細胞表面マーカー(Sca−1、Flk−1/KDR、c−kit(CD117)、CD34、CD31及び種々のインテグリン:α1、α2、α3、α4、α5、α6、αL、αM αV、αX、αIIb、β1、β2、β3、β4、β5及びβ7)の有無について分析した。結果を表2に示す。
ネズミモデルにおける細胞の硝子体内投与
マウスの眼けんに細いブレードで亀裂を入れて、P2からP6の眼球を露出させた。次いで、本発明の系統陰性HSC集団A(細胞培地約0.5μlから約1μl中約105個の細胞)を、33番ゲージ(Hamilton、Reno、NV)ニードルシリンジを用いて硝子体内注射した。
EPC形質移入
ネズミLin−HSC(集団A)に、FuGENE(商標)6 Transfection Reagent(Roche、Indianapolis、IN)を用いて製造者の手順に従って、TrpRSのT2断片をコードし、His6タグも含むDNA(配列番号1、図7)を移入した。Lin−HSC細胞(約106細胞/ml)を、幹細胞因子(PeproTech、Rocky Hill、NJ)を含むOPTI−MEM(登録商標)培地(Invitrogen、Carlsbad、CA)に懸濁させた。次いで、DNA(約1μg)とFuGENE試薬(約3μl)の混合物を添加し、混合物を約37℃で約18時間温置した。温置後、細胞を洗浄し、収集した。この系の移入率は、FACS分析によって確認して約17%であった。T2−TrpRSの産生をウエスタンブロット法によって確認した。His6タグ付きT2−TrpRSのアミノ酸配列を配列番号2、図8に示す。
免疫組織化学及び共焦点分析
マウス網膜を種々の時点において収集し、全載又は凍結切片用に調製した。全載の場合、網膜を4%パラホルムアルデヒドで固定し、50%ウシ胎児血清(FBS)及び20%正常ヤギ血清中で室温で1時間ブロックした。網膜を一次抗体に対して加工し、二次抗体を用いて検出した。使用した一次抗体は、抗コラーゲンIV(Chemicon、Temecula、CA、抗β−gal(Promega、Madison、WI)、抗GFAP(Dako Cytomation、Carpenteria、CA)、抗α平滑筋アクチン(α−SMA、Dako Cytomation)であった。使用した二次抗体は、Alexa 488又は594蛍光マーカー(Molecular Probes、Eugene、OR)との複合型であった。画像をMRC 1024共焦点顕微鏡(Bio−Rad、Hercules、CA)によって撮影した。全載網膜中の3つの異なる血管層の発生を調べるために、3次元画像をLASERSHARP(登録商標)ソフトウェア(Bio−Rad)を用いて作成した。共焦点顕微鏡法によって識別される、高感度GFP(eGFP)マウスとGFAP/wtGFPマウスのGFP画素強度の差を利用して、3次元画像を作成した。
マウスにおける生体内での網膜血管新生定量アッセイ
T2−TrpRS分析のために、一次及び深部叢をマウス網膜の3次元画像から再構築した。一次叢を2つのカテゴリー、すなわち、正常発達又は血管進行停止に分類した。深部血管発達阻害のカテゴリーを、以下の判定基準を含めた血管阻害割合に基づいて解釈した。すなわち、深部叢形成の完全阻害を「完全」、(25%未満の阻害を含めて)正常な血管発達を「正常」、残りを「部分」と表示した。rd/rdマウス救済データの場合、各全載網膜中のより深部の叢の4つの別々の領域を10倍レンズによって記録した。血管構造の全長を各画像について計算し、まとめ、グループ間で比較した。正確な情報を得るために、Lin−HSCを一方の眼に注射し、Lin+HSCを同じマウスの別の眼に注射した。注射しなかった対照網膜を同腹仔から採取した。
成体網膜傷害ネズミモデル
レーザー及びはん痕モデルを、ダイオードレーザー(150mW、1秒、50mm)を用いて、又はマウス網膜を27番ゲージニードルで穿刺することによって機械的に、作製した。傷害から5日後、細胞を硝子体内方法によって注射した。その5日後に眼をマウスから採取した。
網膜再生の神経栄養性救済
成体ネズミ骨髄由来の系統陰性造血幹細胞(Lin−HSC)は、網膜変性症のマウスモデルにおいて血管栄養性及び神経栄養性の救済効果を有する。10日齢のマウスの右眼の硝子体内に本発明のLin−HSC約105個を含む約0.5マイクロリットルを注射し、網膜血管構造の有無及びニューロンの層の核数について2ヵ月後に評価した。同じマウスの左眼にほぼ同数のLin+HSCを対照として注射し、同様に評価した。図9に示すように、Lin−HSCで処置した眼では、網膜血管構造はほぼ正常と考えられ、内顆粒層はほぼ正常であり、外顆粒層(ONL)は約3から約4層の核を有した。それに対して、Lin+HSCで処理した反対側の眼は、中間の網膜血管層が著しく萎縮し、外網膜血管層が完全に萎縮し、内顆粒層が著しく萎縮し、外顆粒層が完全に消失した。これは、マウス3及びマウス5で劇的であった。マウス1では救済効果はなく、これは、注射したマウスの約15%に当てはまる。
視覚機能を網膜電図(ERG)によって評価すると、血管とニューロンの両方の救済が観察されたときに陽性ERGの回復が認められた(マウス3及び5)。陽性ERGは、血管又はニューロンの救済がないときには認められなかった(マウス1)。本発明のLin−HSCによるrd/rdマウスの眼の血管栄養性救済と神経栄養性救済のこの相関を、図10に示す回帰分析プロットによって示す。ニューロン(y軸)と血管(x軸)の回復の相関が、中間部血管構造タイプ(r=0.45)及び深部血管構造(r=0.67)で認められた。
図11は、Lin+HSCによる血管救済とニューロン救済の間に統計的に有意な相関がないことを示している。血管救済を定量し、そのデータを図12に示した。図12に示す注射後1ヵ月(1M)、2ヵ月(2M)及び6ヵ月(6M)におけるマウスのデータによれば、血管長は、特に注射後1ヵ月及び2ヵ月において、同じマウスの無処置の眼における血管長(白棒)よりも、本発明のLin−HSCで処置した眼においてかなり増加した(黒棒)。神経栄養性救済効果を、Lin−HSC又はLin+HSCの注射から約2ヵ月後に、内及び外顆粒層中の核を数えることによって定量した。結果を図13及び14に示す。
ヒトLin−HSC集団
骨髄細胞を上記一般的手順によって健康な成体ヒトボランティアから抽出した。次いで、単球を、HISTOPAQUE(登録商標)ポリスクロース勾配(Sigma、St.Louis、MO)を用いた密度勾配分離によって分離した。Lin−HSC集団をヒト骨髄単核球から単離するために、以下のビオチン複合系統パネル抗体を磁気分離システム(AUTOMACS(商標)選別機、Miltenyi Biotech、Auburn、CA):CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac−1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)と併用した。
ヒトLin−HSC集団をCD133発現に基づいて更に2つの亜集団に分けた。細胞をビオチン複合CD133抗体で標識し、CD133陽性亜集団とCD133陰性亜集団に分けた。
網膜変性のネズミモデルにおけるヒト及びネズミ細胞の硝子体内投与
C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17−Prkdc SCID及びrd10マウス系統を網膜変性モデルとして使用した。C3H/HeJ及びC3SnSmn.CB17−Prkdc SCIDマウス(The Jackson Laboratory、Maine)は、重度の早発性網膜変性症を起こす変異である網膜変性1(rd1)変異に対して同型接合であった。変異は、かん体光受容器cGMPホスホジエステラーゼβサブユニットをコードするPde6b遺伝子のエキソン7に位置する。この遺伝子の変異は、常染色体劣性網膜色素変性症(RP)のヒト患者において見いだされた。C3SnSmn.CB17−Prkdc SCIDマウスは、重症複合免疫不全自然変異(Prkdc SCID)に対しても同型接合であり、ヒト細胞移入実験に使用された。rd10マウスにおける網膜変性は、Pde6b遺伝子のエキソン13の変異によって引き起こされる。これは、rd1/rd1よりも発症が遅く、網膜変性症がより軽度である臨床的に関連するRPモデルでもある。全評価をNIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って実施した。全手順は、The Scripps Research Institute Animal Care and Use Committeeによって認可された。
マウスの眼けんに細いブレードで亀裂を入れて、P2からP6の眼球を露出させた。次いで、ネズミ集団A又はヒト集団Cの系統陰性HSC細胞(細胞培地約0.5μlから約1μl中約105個の細胞)を、33番ゲージ(Hamilton、Reno、NV)ニードルシリンジを用いてマウスの眼の硝子体内に注射した。注射されたヒト細胞を可視化するために、注射前に細胞を色素(Cell tracker green CMFDA、Molecular Probes)で標識した。
網膜を種々の時点で収集し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)及びメタノールで固定し、続いて50%FBS/20%NGS中で室温で1時間ブロックした。網膜血管構造を染色するために、網膜を抗CD31(Pharmingen)及び抗コラーゲンIV(Chemicon)抗体、続いてAlexa 488又は594複合二次抗体(Molecular Probes、Eugene、Oregon)と一緒に温置した。網膜に4本の放射状の減張切開(relaxing incision)を施して平面状にして、全載標本を得た。中間部又は深部網膜血管叢の血管構造の画像(Dorrell et al. 2002 Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 43: 3500−3510参照)を、Radiance MP2100共焦点顕微鏡及びLASERSHARP(登録商標)ソフトウェア(Biorad、Hercules、California)を用いて得た。血管構造を定量するために、4つの独立した視野(900μm×900μm)を中間部又は深部血管層の中間部分から無作為に選択し、血管構造の全長をLASERPIX(登録商標)解析ソフトウェア(Biorad)を用いて測定した。同じ叢中のこれら4視野の全長を更なる分析に使用した。
平面状に装着した網膜をクリオスタット切片用に再包埋した。網膜を4%PFA中に終夜放置し、続いて20%スクロースと一緒に温置した。網膜を最適切断温度の化合物(OCT: Tissue−Tek; Sakura FineTech、Torrance、CA)に包埋した。クリオスタット切片(10μm)を、核色素DAPI(Sigma−Aldrich、St.Louis、Missouri)を含むPBS中で再水和させた。視神経乳頭及び周辺部網膜全体を含む単一切片中の3つの異なる領域(幅280μm、偏りのない試料採取)のDAPI標識核の画像を共焦点顕微鏡で撮影した。1個の切片中の3つの独立した視野のONL中にある核の数を数え、分析のために合計した。単純線形回帰分析を実施して、深部叢中の血管構造の長さとONL中の細胞核の数との関係を調べた。
終夜暗順応させた後、マウスにケタミン15μg/gm及びキシラジン7μg/gmを腹腔内注射して麻酔した。瞳孔散大(1%硫酸アトロピン)後の各眼の角膜表面の網膜電図(ERG)を、口の参照電極及び尾部の接地電極と一緒に角膜の環状金電極を用いて記録した。高反射性Ganzfeldドームの外側に取り付けられたGrass Photic Stimulator(PS33 Plus、Grass Instruments、Quincy、MA)を用いて刺激した。かん体の応答を、光刺激装置によって許容される最大値(0.668cd−s/m2)までの強度範囲にわたる短波長(Wratten 47A:λmax=470nm)フラッシュに対して記録した。応答信号を増幅し(CP511 AC増幅器、Grass Instruments)、デジタル化し(PCI−1200、National Instruments、Austin、TX)、コンピュータ解析した。各マウスは、それ自身の内部標準として役立ち、処置した眼と無処置の眼の両方のERGを記録した。最も弱い信号に対する最高100回の掃引を平均した。無処置の眼の平均応答を、処置した眼の応答から減算し、この信号差を用いて機能救済の指標とした。
マイクロアレイ分析を用いて、Lin−HSCを標的にした網膜遺伝子発現を評価した。P6のrd/rdマウスにLin−又はCD31−HSCを注射した。これらのマウスの網膜を、注射後40日にRNaseを含まない培地中で解剖した(網膜血管構造及び光受容器層の救済は、注射後のこの時点で明らかである。)。各網膜の4分の1を全載によって分析して、正常なHSC標的並びに血管構造及び神経保護が得られたことを確認した。首尾良く注射された網膜から得られたRNAを、TRIzol(Life Technologies、Rockville、MD)、フェノール/クロロホルムRNA単離プロトコルによって精製した。RNAをAffymetrix Mu74Av2チップとハイブリッド形成させ、遺伝子発現をGENESPRING(登録商標)ソフトウェア(SiliconGenetics、Redwood City、CA)を用いて分析した。精製ヒト又はマウスHSCをP6のマウスの硝子体内に注射した。P45において、網膜を解剖し、RNAの精製及びヒト特異的U133A Affymetrixチップとのハイブリダイゼーション用に、1)ヒトHSCを注射して、救済されたマウス網膜、2)ヒトHSCを注射して、救済されなかったマウス網膜、及び3)マウスHSCを注射して、救済されたマウス網膜の各画分をプールした。GENESPRING(登録商標)ソフトウェアを使用して、バックグラウンドよりも発現され、ヒトHSCによって救済された網膜においてより高度に発現される遺伝子を特定した。次いで、これらの遺伝子の各々のプローブペア発現プロファイルを個々に分析し、dChipを用いて正常ヒトU133Aマイクロアレイ実験のモデルと比較して、ヒト種特異的ハイブリダイゼーションを求め、異種間ハイブリダイゼーションによる偽陽性を排除した。
図21は、本発明のCD133陽性(DC133+)及びCD133陰性(CD133−)ヒトLin−HSC集団についてのCD31及びインテグリンアルファ6表面抗原の発現を比較したフローサイトメトリーデータである。左のパネルはフローサイトメトリー散布図を示す。中央及び右のパネルは、細胞集団上の特異抗体発現レベルを示すヒストグラムである。Y軸は現象数であり、X軸はシグナル強度である。白抜きのヒストグラムは、非特異的バックグラウンド染色レベルを示すアイソタイプIgG対照抗体である。塗り潰したヒストグラムは、細胞集団上の特異抗体発現レベルである。白抜きの(対照)ヒストグラムの右側に移動した、塗り潰したヒストグラムは、バックグラウンドレベルよりも抗体の蛍光シグナル及び発現が増加したことを表す。2つの細胞集団間の塗り潰したヒストグラムのピーク位置を比較すると、細胞上のタンパク質発現の差がわかる。例えば、CD31は、本発明のCD133+とCD133−の両方の細胞上でバックグラウンドよりも発現されるが、低レベルのCD31を発現する細胞は、CD133+細胞集団がCD133−集団よりも多い。このデータから、CD31発現は2つの集団間で異なり、アルファ6インテグリン発現は、主としてLin−集団中の細胞に限られ、したがって血管及び神経栄養性救済機能を有する細胞のマーカーとして役立ち得ることが明らかである。
CD133陽性及びCD133陰性Lin−HSC亜集団を新生仔SCIDマウスの眼の硝子体内に注射すると、発達中の血管構造への最大の取り込みは、CD31とインテグリンα6の両方の表面抗原を発現するCD133陰性亜集団で観察された(図21、下参照)。CD31もインテグリンα6も発現しないCD133陽性亜集団は(図21、上)、虚血によって誘導される末梢の新血管新生部位を標的にすると考えられるが、血管新生を起こす眼に注射したときには標的にしない。
救済された網膜及び救済されなかった網膜を、かん体又は錐体のオプシンに特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に分析した。図17に示すERG記録に用いたのと同じ眼をかん体又は錐体オプシンについて分析した。野生型マウス網膜においては、存在する光受容器の5%未満が錐体であり(Soucy et al. 1998, Neuron 21: 481−493)、図25(A)に示す赤/緑錐体オプシン、又は図25(B)に示すかん体ロドプシンを用いて観察された免疫組織化学的染色パターンは、錐体細胞のこの割合と一致した。かん体ロドプシンに特異的な抗体(rho4D2)は、ブリティッシュコロンビア大学のDr. Robert Moldayによって提供され、それを既報のように使用した(Hicks et al. 1986, Exp. Eye Res. 42: 55−71)。錐体の赤/緑オプシンに特異的なウサギ抗体をChemicon(AB5405)から購入し、製造者の指示に従って使用した。
酸素誘発性網膜変性症のネズミモデルにおけるネズミ細胞の硝子体内投与
新生野生型C57B16マウスを、酸素誘発性網膜変性(OIR)モデルにおいて、生後P7からP12まで酸素過剰(75%酸素)に曝露した。図22は、C57B16マウスにおけるP0からP30までの出生後の正常な血管発達である。P0では、発達し始めた表面血管のみを視神経乳頭付近に観察することができる。それに続く数日間、初期の表面ネットワークが末梢に向かって拡大し、P10までに遠位の末梢に達する。P7からP12までに二次(深部)叢が発達する。P17までに、広範な表面及び深部の血管ネットワークが出現する(図22、挿入図)。その後数日間、およそP21に成体構造に達するまで、再構築が血管の三次(中間)層の発達と一緒に起こる。
それに対して、本明細書に記載のOIRモデルにおいては、P7−P12における75%酸素曝露後に、正常な一連の現象が極度に乱れる(図23)。本発明の成体ネズミLin−HSC集団を、その後OIRを受けるマウスの片眼の硝子体内にP3で注射し、他方の眼にPBS又はCD31陰性細胞を対照として注射した。図24は、Lin−HSC集団が、発達中のマウス網膜において、高酸素レベルの変性効果を逆転できることを示す。処置された眼においては、完全に発達した表面及び深部の網膜血管構造がP17で観察されたのに対して、対照の眼は、実質的に深部血管のない大きな無血管領域を示した(図24)。OIRモデルのマウスの約100個の眼を観察した。Lin−HSC集団で処置した眼の58%において正常な血管新生が観察されたのに対し、CD31−細胞で処置した対照の眼では12%、PBSで処置した対照の眼では3%であった。
CD44選択によるネズミ骨髄からの骨髄球様骨髄細胞の単離
骨髄細胞を成体マウス(The Jackson Laboratory、ME)から抽出した。骨髄全体をネズミCD44抗体で処置し、フローサイトメトリーを用いて、CD44発現細胞を骨髄から単離した。細胞を抗体から分離し、将来の使用に備えて緩衝液中に保存した。CD44をさほど発現しない細胞集団も単離した(CD44LOBM)。
CD44選択によるネズミ骨髄からの骨髄球様骨髄細胞の単離
骨髄細胞を、CD44の代わりにCD11bに対する抗体を用いて、実施例11に記載のように、ポジティブ選択した。CD44HI及びCD11b+である骨髄球様骨髄細胞集団を単離した。この集団は、実施例11においてCD44を用いて単離されたCD44HI集団と類似の活性特性を有した。CD44LOCD11b−集団も単離した。この集団は不活性であることが判明した。
MLBM細胞集団の特性分析
本発明におけるCD44の役割は不明であるが、この受容体は、細胞を眼に注射した後に、ヒアルロン酸が豊富な硝子体中で細胞生存、細胞遊走及び/又は細胞分化を媒介する可能性がある。CD44HI(すなわち、MLBM)及びCD44LO細胞の別個の集団が、未分画のマウス骨髄中に存在した。MLBM細胞集団は、上記実施例に使用したLin−集団の76%であるのに対して、骨髄由来のLin+及びCD31−/CD34−/CD11b−細胞集団のそれぞれわずか約37%及び4%しかCD44を発現しなかった(図26)。したがって、CD44発現とこれら3つの集団において観察される血管栄養性及び神経栄養性活性との間には高い相関があり、すなわち、Lin−細胞は最も有効であったのに対して、CD31−/CD34−/CD11b−細胞は一貫して有効性が最も低かった。系統特異抗体のパネルを用いて、CD44HI細胞の大多数は、骨髄球性特性を強く有すると判定された(図27)。同様に、CD44HI骨髄細胞のほぼすべてがCD11b+でもある(図27)。
実施例12においてCD11b抗体を用いてポジティブ選択されたMLBM(CD44HICD11b+)は、血管ターゲティング実験においてCD44抗体選択によって単離されたMLBMで得られた結果と類似した活性結果を示した。
実施例12のMLBM細胞集団及び実施例12において単離されたCD44LOCD11b+細胞の各細胞表面抗原特性を下記表3に示す。表3ではプラス記号(+)の数が多いほど、抗原の発現は比較的高い。マイナス記号(−)は、発現が検出されなかったことを示す。
MLBM細胞集団の血管栄養性及び神経栄養性効果
実施例11のMLBM細胞集団は血管ターゲティング並びに血管及び神経栄養性効果の点でLin−細胞の諸性質を保持したが、CD44LOBM細胞はほとんど又は全く活性を示さなかった。血管ターゲティング活性は、GFP+MLBM細胞集団由来の細胞を生後7日(P7)のマウスの硝子体内に注射し、網膜をP14において分析することによって、実証された。血管をGSイソレクチンで標識した後、GFP+細胞は、網膜血管構造を標的にし、血管周囲に局在化することが認められたが、取り込まれた証拠はなかった。これらの現象は、MLBMを用いたときには一般的であったが、CD44LOBMで処置された眼では稀であり、又は存在しなかった(図28)。
実施例11のMLBM細胞集団の血管及び神経栄養性活性を、上述したように網膜変性マウスモデルを用いて、Lin−HSCについて評価した。rd1/rd1マウスは、光受容器の消滅及び深部網膜血管構造の萎縮を含めて、網膜変性疾患の特徴を示す。上述したように、Lin−HSC骨髄細胞は、深部網膜血管構造及び部分的に救済された光受容器を維持する。本発明のMLBM細胞集団も同じ機能を果たす(図29)。
酸素誘発性網膜症モデルは、未熟児網膜症と特徴を共有する。このモデルに付随する病状は、MLBM細胞集団由来の細胞で眼を処置するとかなり軽減される。このモデルにおけるMLBM細胞集団由来の細胞の効果は、上記Lin−HSCを用いて認められる効果に類似した。MLBM細胞集団由来の細胞で処置した眼は、このモデルにおいて病状の程度を数量化するのに使用される2つのパラメータ、すなわち、血管閉塞面積と新生血管叢面積がかなり減少した。それに対して、CD44LOBM細胞で処置した眼は、ビヒクル対照で処置した眼よりも改善されなかった(図30)。
MLBM細胞集団由来の細胞は、網膜血管構造を標的にすることに加えて、マクロファージ様(F4/80+)細胞に分化し、網膜に侵入し、網膜色素上皮(RPE)にほぼ対向する位置を占める。この局在化によって、MLBM細胞集団由来の細胞の観察される血管及び光受容器の救済効果が促進される。また、RPE近くの位置を占めると、MLBM細胞集団由来の細胞は、VEGF−GFPマウスから得られたMLBM細胞集団由来の細胞の注射によって実証されるように、血管内皮増殖因子(VEGF)を産生する。VEGF−GFPマウスにおいては、緑色蛍光タンパク質(GFP)がVEGF遺伝子の活性化によって発現される(図31)。したがって、MLBM細胞集団由来の細胞は、VEGF「活性化」状態にあると考えられる。MLBM細胞集団から導入された細胞は、同タイプの内因性細胞を動員すると考えられる。というのは、(導入された)GFP+と(内因性)GFP−の両方の細胞がRPE領域に観察されるからである。この局在化は、正常な網膜血管発達中の野生型マウスにおいて、rd1/rd1マウスの救済された網膜において、また、酸素誘発性網膜症モデルにおいて、認められた。
類似の血管ターゲティング結果は、実施例12のMLBM細胞集団でも認められた。図32によれば、実施例12のCD44HICD11b+細胞(緑)は、実施例11のCD44−high集団と同様に、P2で注射すると、P20まで血管構造(赤)を特異的に標的にした。図33によれば、実施例12のCD44LOCD11b−は、血管構造を特異的に標的にしなかった。
本発明のMLBM細胞集団は、眼球疾患に対して有効で汎用的な治療を提供する。MLBM細胞は、自家骨髄から容易に単離され、したがって細胞療法においてしばしば認められる潜在的免疫原性が最小限に抑えられる。また、本発明のMLBM細胞集団は、機能遺伝子を網膜に送達するために有用な遺伝子を移入することができる。
骨髄細胞亜集団の更なる特性分析
上記実施例に記載のように、全実験をNIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って実施し、全実験手順は、TSRI Animal Care and Use Committeeによって認可された。OIRをC57B16マウスにおいて上記プロトコルに従って誘起した。生後7日の仔及びその母親を室内気から75%酸素の環境に5日間移し、その後室内気に戻した。酸素レベルをFDA認定の酸素分析計(AX−300、Teledyne Analytical Instruments、CA、USA)を用いてモニターした。これらの条件下で、大きな血管過少域が酸素過剰中に中心網膜に形成され、酸素正常状態に戻した後、網膜前方の異常な新血管新生が起こり、およそP17にピークに達し、最終的に消散する(図37、パネルg−i 図2、パネルa、c)。
細胞調製物:マウス骨髄細胞抽出を実質的に以下のように実施した。すなわち、骨髄細胞をactGFPマウスの大腿骨及びけい骨から収集し、2つの異なる方法によって処理した。第1の方法では、単核球を、FICO/LITE LM(登録商標)(Atlanta Biologicals、Norcross、Georgia)を用いて密度勾配によって分離し、ビオチン複合系統抗体(CD45R/B220、CD3e、Ly−6G/C、CD11b、TER119、Pharmingen、San Diego、CA)で標識した。続いて、単核球をストレプトアビジン又は抗ビオチン磁気ビーズと一緒に温置し、MACS細胞選別システム(Miltenyi Biotech、Auburn、CA)を用いて選別して、Lin−HSC集団を得た。第2の方法では、蛍光性標識と複合化されたCD44に対する抗体と一緒に骨髄全体を温置した。次いで、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって、CD44HI細胞(すなわち、細胞の大多数がCD44を発現するMLBM細胞集団細胞集団)及びCD44LO細胞(すなわち、細胞の少数がCD44を発現する細胞集団)を単離した。
骨髄細胞特性分析:上記方法によって得られた細胞亜集団の更なる分析を以下の2つの手順によって実施した:(1)CD11a、CD11b、Ly6G/C、CD43、F4/80、CD14、cKit、CD34、α6インテグリン及びCD115(すべてPharmingen、San Diego、CA)を含めて、種々の系統及び前駆細胞表面マーカーに対する抗体と組み合わせた2カラーフローサイトメトリー、及び(2)AFFYMETRIX(登録商標)Mu430 Chips(Affymetrix、Santa Clara、CA)を用いた当分野で公知の標準方法による遺伝子発現解析。遺伝子発現をGENESPRING(登録商標)ソフトウェア(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)によって解析した。
硝子体内注射:P2−P7(酸素過剰前)のマウスの眼けんを軽く切開して亀裂を入れて、眼球を露出させた。各動物の一方の眼に、ビヒクル(0.5%BSA及び2mM EDTAを含有するPBS)0.5μl中の約150,000から250,000個の骨髄由来細胞を、Hamiltonシリンジ及び33番ゲージニードル(Hamilton、Reno、Nevada)を用いて、硝子体に注射した。反対側の対照の眼にほぼ同数の対照細胞又はビヒクルのみを注射した。注射をせずに、疾患の自然経過を観察する場合もあった。実験の一部では、細胞移植をP9からP12までのより遅い日齢で実施した。
網膜血管構造の染色:網膜をP17で収集し、血管構造を画像化し、注射した細胞の場所を特定し、特徴づけた。網膜を切開する前に、動物に麻酔をし、心臓内フルオレセイン標識高分子量デキストラン(FITC Dextran、Sigma)を注射して、開存血管を可視化する場合もあった。或いは、血管及びGFP発現細胞を染色する免疫組織学的技術を用いた場合もあった。網膜を4%パーフルオロ酢酸(PFA)及びメタノールで固定し、続いて20%FBS/20%NGSで室温で1時間ブロックした。続いて、ALEXA(登録商標)594と複合化されたイソレクチンGS−IB4と一緒に終夜温置して、血管を特定した(Molecular Probes、Eugene、Oregon)。網膜に放射状の減張切開を施して平面状にして、全載標本を得た。或いは、網膜をOCTに包埋し、凍結切断して、網膜の断面を得、装着前にDAPIで対比染色した。
移植細胞を特徴づけるために、免疫組織学的技術を用いて、眼のサブセット中の以下の細胞マーカー、すなわち、F4/80(Caltag、Burlingame、CA)、CD44、CD31(Pharmingen、San Diego、CA)及びNG2(Chemicon、Temecula、CA)を特定した。全網膜をレクチン、抗GFP及び上記マーカーの1種類で三重染色した。
画像化及び画像解析:網膜血管構造の画像を、RADIANCE(登録商標)2100MPレーザー走査共焦点顕微鏡(Biorad、Hercules、CA)を用いて得た。血管閉塞及び新血管新生を以下のように定量化した。すなわち、血管閉塞面積は、GSレクチン染色網膜の中心網膜において無血管帯域の輪郭を慎重に描き、総面積をPHOTOSHOP(登録商標)(Adobe)又はVOLOCITY(登録商標)ソフトウェア(Improvision、Lexington MA)を用いて計算することによって測定した。同様に、網膜前方の新血管新生(「血管叢」)の面積は、網膜前方の平面に焦点を合わせた共焦点画像を用い、画素強度に基づいて血管叢を選択することによって(血管叢は、正常な血管構造よりも明るく標識される。)計算した。次いで、選択領域を合計して、新血管新生の総面積を求めた。T検定によって異なる実験群を統計的に比較した。
網膜血管構造及び血管周囲骨髄細胞の3次元画像を、共焦点画像のzシリーズを収集し、それらをVOLOCITY(登録商標)ソフトウェアを用いて立体(volume)にレンダリングすることによって、作製した。したがって、網膜血管の断面を見ることができ、血管管腔に対する移植骨髄細胞の位置を決定することができた。
網膜血管の発達、及び酸素誘発性網膜症のマウスモデル正常酸素圧状態下で成長した出生後のマウスにおける正常な網膜血管の発達を図37、パネルa−fに示す。生後2日(P2)で、発達し始めた表面血管のみが視神経乳頭周囲の単一面を占めているのが観察される(図37、パネルa、b)。次週の間、初期の表面ネットワークが末梢に向かって拡大し、およそP12に遠位の末梢に達する(図37、パネルc)。P7−P12に二次(深部)叢が発達する(図37、パネルd)。1ヵ月の終わりまでに、三次(中間部)血管層の発達とともに、完全に血管が新生した網膜中で再構築が起こり(図37、パネルe)、成体構造に達する(図37、パネルf)。
それに対して、OIRモデルでは、P7−P12に75%酸素に曝露すると、現象の正常な配列が極度に乱れ、中心網膜中に既に形成された血管の表面ネットワークが、特に動脈に沿って、著しく退行し(図37、パネルg(P10)及びパネルh、i(P17))、深部叢の発達が極度に遅れる(図37、パネルk、m、P17における網膜断面)。P12で正常酸素圧状態に戻した後にのみ、異常な血管成長が再開する。要するに、正常酸素圧状態は、極度の血管過少網膜にとって今では比較的低酸素状態になる。P17において、一部の深部血管を末梢に確認することができるが、血管内色素の漏洩に伴う、網膜前方の異常な新生血管叢を、末梢中央部の、血管過少中心網膜とより多くの血管が新生した末梢との境界に見ることができる(図37、パネルh)。その後数日間にわたって、表面及び深部の血管が無血管領域中で徐々に発達するが、網膜の内境界膜(ILM)上で硝子体中に突出した新生血管叢がP21まで、さらにはその後も持続することが多い。P25−P30までに、網膜血管構造が再構築され、この時点で正常な血管構造に類似する。
酸素過剰前に造血性前駆細胞を注射すると、酸素誘発性血管閉塞後の網膜における血管修復が促進される。本発明のLin−HSCをP2−P7に注射すると、酸素過剰曝露後の網膜血管構造の回復能力が劇的に変化した(図37、パネルj、l、n、o及び図38、パネルb、d、e、f、g)。ビヒクルのみの注射では、かかる変化を誘発しなかった。50%を超える症例において、完全に発達した表面及び深部の網膜血管構造が、P17のLin−HSCを注射した眼において見られたが、反対側のビヒクルを注射した眼は、大きい無血管領域を示し、実際に深部血管を示さなかった(図37、パネルh、i、k、m及びパネルoと比較したパネルl、n)。特に、反対側の対照の眼が極めて重傷であるときには、Lin−細胞を注射した眼がP17までに回復しない場合もあったが、大多数の症例においてはかなり改善した。同じ動物における他眼のこの比較は、大部分の他の遺伝及び環境要因を効果的に均等化して、Lin−HSCの効力を更に裏付けるものである。
大部分の研究は、連続的な網膜切片における網膜前方の新生血管叢形成を分析するだけなので、血管閉塞は、このモデルにおいて正当に評価されていない特徴である。同じ網膜における血管閉塞及び血管叢形成を共焦点顕微鏡法及びデジタル画像解析によって評価することができる(例えば、図38、パネルa−d参照)。P17を主要な分析時点として選択した。というのは、かなりの血管閉塞が対照の眼にまだ存在するものの、血管叢形成がこの時点で最大であることが多いからである。新規複合分析方法を用いて、処置した眼と対照の眼との実質的な差を確認した。P17で測定された血管閉塞は、ビヒクルのみを注射した眼、又は注射しなかった眼と比較して、Lin−で処置した網膜においてかなり減少した(75%を超える閉塞面積の減少)(図38、パネルe)。この点でビヒクル注射と注射なしでは有意差は認められなかった。同様に、Lin−細胞で処置した眼は、ビヒクルを注射した眼よりも新生血管叢面積が約70%減少し、注射しなかった対照に対しては80%を超える減少であった(図38、パネルf)。したがって、Lin−HSCによる眼の処置は、マウスOIRモデルの2つの主要な血管外傷及び修復パラメータ、すなわち、網膜内部の「生理的」血管再生を加速すると同時に新生血管叢の形成を減少させることに対して劇的な効果があった。
修復の加速は、処置を酸素過剰中及び酸素正常状態に戻した後に実施したときにも認められたが、効果は低下した。これまでに述べた実験では、酸素過剰に曝露する前のP2−P7で注射を行った。サイクルの酸素過剰時期中、酸素正常状態に戻した後など、後で注射した場合にもLin−細胞が血管修復に影響を及ぼし得るかどうかを判定するために、注射をP9、P11又はP12で実施し、網膜を種々の遅い時点で評価した。結果を図38、パネルgに示す。この結果によれば、Lin−HSCの注射は、酸素過剰中及びP12で投与したときでも、血管修復を加速し、閉塞面積を減少させるのに有効であった。しかし、効果は幾らか低下したと考えられ、高濃度酸素曝露前に処置したときに最大の効力が得られることが示唆された。
Lin−造血性前駆細胞で治療後、長期の網膜構造及び機能は十分に維持された。Lin−HSC処置による長期効果及び起こり得る副作用も試験した。このために、確立されたモデルに従って、Lin−細胞注射を行い、酸素過剰に曝露した3−6ヵ月齢のマウスから12個の網膜を採取した(図39)。腫ようは認められず、神経網膜は、いずれの場合においても組織学的に維持されると考えられた。唯一の注目すべき異常は、対照の眼においても見られる、網膜内の散在的な「ロゼット」の形成であった(図39、パネルg、h)。Lin−HSCを注射した眼の網膜血管構造は正常な外観を有し、注射しなかった対照の網膜と明らかな差は見いだされなかった(図39、パネルa−f)。
移植細胞の長期持続性についても試験した。GFP+細胞は、ほんの少数の眼(10%)でしか認められず、注射した細胞の大多数が数ヵ月以上生存しないことを示している。存在するときには、残存細胞は、網膜血管構造の近傍に位置することが多かった。移植後17日から6ヵ月まで実施した網膜電図記録によって測定して、網膜機能は、Lin−HSCを移植した眼と正常な非OIR同齢対照とでは差がなかった。移植細胞が眼から退出し、全身に広がる可能性を検討するために、15匹のマウスから得たひ臓及び/又は肝臓を、注射後約7から10日にGFP+細胞の有無について分析した。眼球外細胞は観察されなかった。
活性細胞タイプの検証:Lin−集団をCD44HI細胞について濃縮した。これらの過程中に有効であり得る機序をより良く理解し、細胞選択手順を単純化する試みとして、活性HSCを骨髄から単離するのに使用することができる単一マーカーの特定を試みた。細胞遊走及び分化への関与などの諸特性に基づいて、骨髄前駆体マーカー候補の大きいパネルを組み立てた。フローサイトメトリーを用いて、これらのマーカーをスクリーニングし、活性なLin−細胞における発現と、幾つかの実験系において不活性であることが以前に示された対照BM細胞における発現とを比較した。CD44は、これら2つの集団において異なって発現されることが判明した。すなわち、CD44HI細胞は、対照BM細胞集団中(4%)よりもLin−細胞のかなり高い割合(76%)で存在した(図40、パネルa)。上述したように、CD44は、ヒアルロン酸の細胞表面受容体であり、生存、遊走及び分化を含めて、救済効果を媒介するのに重要であると考えられる幾つかの細胞機能の調節に関与することが判明した。活性細胞集団中に多く、活性の低い対照細胞中に極めて稀であるCD44HI細胞の分布は、CD44が、実際に、活性の有効な指標であることを示している。
例えば、CD44HI細胞は、OIRモデルにおける血管修復を促進するが、CD44LO細胞は促進しない。CD44HI細胞の効力を血管修復促進能力についてOIRモデルで検証した。Lin−細胞注射の場合と同じ実験計画を用いて、CD44HI細胞が、このモデルにおいて、Lin−細胞を用いて認められる効力と類似した効力で、網膜血管修復を促進することが実証された(図40、パネルb、c)。それに対して、CD44LO細胞は修復に対して正の効果を示さなかった。CD44LOで処置した動物の網膜内で、注射した細胞はほとんど又は全く観察されないことが多いことは指摘する価値がある。これは、これらの細胞が硝子体中で生存する能力が乏しく、及び/又は網膜に移動することを示唆している。CD44HI細胞が、唯一の活性骨髄亜集団であるか、又はこの活性を有する他の亜集団の1つであるかどうかは不明である。
CD44HI細胞は、骨髄起源であることを示唆する遺伝子及びマーカーを発現する。CD44HI集団の更なる特性分析を、大規模発現解析によって、また、Lin−及び前駆体特異的マーカーの抗体標識とそれに続くフローサイトメトリーによって、実施した(図41及び図44)。どちらの方法でも、CD44HI細胞が、骨髄起源であることを示唆する発現プロファイルを有することが明らかになった。CD11a、CD11b及びLy6G/Cの強い発現がこれらの細胞上でタンパク質レベルで観察され、一方、強度の小さい陽性標識がフローサイトメトリーによってF4/80、CD14、cKit及びCD115に対して検出された。CD204、CD114、CD33及びCD115を含めた幾つかの骨髄球特異的遺伝子が、発現解析でCD44LO細胞よりも高度に発現された(図44)。それに対して、タンパク質レベルでは、CD44LO集団は、それぞれ赤芽球/赤血球及びB細胞のマーカーであるTer119及びCD45R B220がかなり発現した。発現アレイ上では、リンパ球に関連する幾つかの遺伝子は、CD19、CD79a及びCD22を含めて、CD44HI細胞よりもCD44LOにおいて高度に発現された(図44)。したがって、転写レベル及びタンパク質レベルでの解析によって、活性CD44HI集団が主に骨髄起源であり、一方、不活性CD44LO細胞が主としてリンパ起源であることが確認された。
移植細胞のin situ分析 − 分化の証拠:骨髄由来の活性細胞の集団をより明確に定義したので、眼に導入された後のこれらの細胞の運命を調べた。このため、CD44HIを注射した、OIRモデルの網膜を、種々のマーカーを用いた免疫組織化学によって分析した。導入された細胞の大多数は、網膜血管構造を選択的に標的にし、血管周囲に局在化し、宿主の血管と堅固に結合した細長い構造をしばしば形成した(図42、パネルa)。CD31及びNG2に対する抗体を用いて、GFPを発現する血管周囲骨髄細胞上でこれらのマーカーが検出されず、骨髄細胞がそれぞれ内皮細胞又は周細胞に分化しないことが示唆された。また、移植細胞は血管管腔の部分を形成しないと考えられ(図42、パネルb)、移植細胞が内皮細胞に分化する可能性がないことが示された。それに対して、マクロファージ/小こう細胞マーカーF4/80は、CD44HIで処置した眼において全部ではないが多数の血管周囲GFP+細胞を標識した(図43、パネルd−I)。導入されたこれらのF4/80+細胞は、F4/80でやはり標識された内因性血管周囲細胞と極めて類似した外観を有し(図43、パネルa−c)、移植細胞がOIRモデルにおいて未変性細胞に類似したアイデンティティを有することが示唆された。
特に従来の薬物治療と比較して、細胞治療の考えられる利点の1つは、細胞が局所的合図に応答し、変化しつつある環境において改変し得る能力である。網膜血管構造を標的にし、血管周囲の位置を占めるP17(注射後10日)の移植細胞は、CD44を検出不可能なレベルに下方制御することが認められた(図43、パネルj−o)。しかし、血管構造と関連しない細胞は、CD44の発現を維持した。すなわち、FACSによって高度のCD44発現に基づいて最初に選択された移植細胞の亜集団は、この受容体を生体内で下方制御した。これは、網膜中の細胞の場所と相関があった。これは、導入された細胞が、実際に、眼の環境内で選択的に変化(分化)することを示唆する。
上で詳述した結果によれば、細胞療法によってROP及び他の虚血性網膜症を治療することができる。マウスモデルにおいて観察された結果によれば、この手法は、高濃度酸素曝露に付随する血管の病状の緩和に効果的であり、ほとんど又は全く毒性を示さない。細胞治療を用いる利点は、単一因子療法(single factor therapy)に対して、変化しつつある環境に順応し、応答する細胞の能力に依拠し得る。単一因子療法から、薬物と介入の組合せ、宿主組織と相互作用しながら、複雑な応答シークエンスを組織化し、実行することができる、精巧で順応性のある細胞の選択及び送達までの進化は、刺激的な新しい概念である。この点で、本発明は、虚血性網膜症/血管症に対する手法の「パラダイムシフト」を提供し、すなわち、阻害及び閉塞の代わりに治癒及び安定化を強調する。
本発明の単離骨髄球様細胞集団は、網膜変性モデルにおいて、網膜血管構造を標的にし、血管新生抑制剤の送達に使用することができ、血管及び神経栄養性効果を有する。本研究では、MLBM細胞集団の特定の亜集団は、OIRの修復を加速するのに極めて有効である。興味深いことに、活性細胞は、骨髄起源であることを示唆するマーカーを発現し、移植後に恐らく分化及び改変する。
血管新生を促進する細胞治療の使用は、梗塞性動脈の側枝を形成する目的で、心臓病学分野が先頭に立っている。かなりの量の証拠によって、ある種の骨髄細胞が潅流及び心機能の改善に有効であることが示されている。しかし、どの細胞タイプが、観察された効果の原因であるかはまだ不明である。骨髄由来内皮前駆細胞(EPC)の潜在的役割を検討する多数の研究は、骨髄由来内皮前駆細胞が新しい血管又は側枝血管中に存在すると結論したが、これらの研究の一部において報告された、取り込まれた細胞が少数であることがその重要性に関して疑問を投じている。さらに、極めて少数の幹細胞及び/又はEPCを含む、単核球、未分画細胞などの不均一な骨髄集団も、側枝の発達をかなり促進し得、血管への直接取り込み以外の機序が作用していることを示唆する。理論に拘泥するつもりはないが、これらの細胞が支持的なパラクリンの役割を果たし、それによって、これらの細胞から分泌された因子が、宿主血管構造に対する条件を最適化するように作用する可能性がある。多数の骨髄亜集団は、血管形成因子源であることが示されたが、単球細胞は、種々のかかる因子を分泌することが知られている。したがって、骨髄細胞がパラクリン様式で働き、側枝血管形成においてEPCの役割を補完し、宿主免疫系と相互作用する可能性がある。
この系において作用する正確な機序はまだ不明であるが、機能的な骨髄細胞の本質を理解する上で重要な進展がなされた。本発明の細胞によって提供されるように、骨髄内の活性骨髄系集団を特定することによって、機序に関する幾つかの示唆がなされ得る。骨髄細胞、特に単球及びマクロファージは、血管新生増殖因子の分泌によって血管成長に影響を及ぼす、確立された能力を有する。また、マクロファージは、他の細胞タイプよりも低酸素に耐性があり、血管形成因子を分泌することによって低酸素状態に応答することが判明した。したがって、骨髄系前駆体を虚血性網膜に導入することによって、低酸素状態に耐えることができ、パラクリン方式で血管修復を促進することができる細胞を提供することができる。OIR網膜における宿主由来のF4/80+血管周囲細胞の存在は、このタイプの細胞がその過程においてある役割を果たし、多量の類似の細胞(又はその前駆体)を眼に直接移植して送達することによって恐らくこの効果が増強されることを示唆する。このシナリオは、本研究において観察されるように、本発明の細胞集団の注射によって、網膜の血管再生が促進される一方で、網膜前方の新血管新生が抑制される奇異な観察結果を際立たせるものである。その根拠はまだ十分にわかっていないが、加速された「生理的」血管再生によって、網膜が受ける低酸素が緩和され、虚血によって刺激される新生血管叢が同じ程度には形成されない可能性がある。
血管成長の骨髄球様細胞支援の考えは、網膜変性症のrd1及びrd10マウスモデルに関する初期の一部の研究と関連し得る。注射された骨髄系前駆体は、分泌された因子を介して深部網膜血管構造を維持し、これらのモデルで認められる血管変性を防止するように作用することができる。bFGFなどのマクロファージによって分泌された血管形成因子は、神経栄養性活性を同様に示した。したがって、rdマウスにおいて本発明の細胞集団を注射した後の観察される光受容器の消滅の減少は、神経栄養因子が移植骨髄由来骨髄細胞によって産生されるパラクリン機序によって媒介され得る。本研究は、この機構を支持して、本発明の単離MLBM細胞集団が、rdモデルにおいて、単離MLBM細胞の注射後に認められた効力と類似した効力で、血管及びニューロンを救済できることを示す。
ROPの臨床治療では、胎児さい帯血細胞をハイリスクな早産児の誕生中に収集し、次いで、細胞を選別して、救済効果を媒介する特定の亜集団を豊富にし、次いで、これらの自家前駆細胞を乳児の眼に注射することができる。
細胞治療の使用に対する現時点での主要な制約の1つは、多くの場合において正確な分子作用機序がまだ不明であり、実際にはこれらの機序が各モデル間で異なり得ることである。しかし、これは、実際には、細胞療法の最大の利点、すなわち、変化しつつある条件及び合図に対して異なる方法で、かつ、広範に応答する能力になり得る。これは、異なる実験系と曝露(challenge)の間だけでなく、時間的に1つの系内でも当てはまる。換言すれば、かかる細胞は、ある種の因子をある時点で分泌し、異なる因子を別の時点で分泌し、最終的に、これらの因子の必要性が薄らいだ場合に、一斉に作用しなくなり得る。これは、現在の化学薬物療法で行うことのできないものであり、細胞がフィードバックを基本的に利用し、それに応答することに基づく。本研究で認められる生体内での移植細胞中の細胞マーカーの改変は、この概念を支持する。
MLBM細胞は、小こう細胞特性を有する細胞に分化する。
CD44HI細胞注射後の網膜の分析によれば、骨髄細胞のCD44HI集団は、眼への注射後に小こう細胞に分化する。小こう細胞は、網膜中の常在性骨髄系集団であり、CD11b及びF4/80を含めて、特徴的なマーカーを発現する。これらの細胞は、その分岐(分枝)した形態によっても識別され、血管周囲に局在する。眼への注射後の種々のポイントにおけるCD44HI細胞の局在化、形態及び表面マーカー発現を解析した。注射されたCD44HIGFP+細胞は、内因性網膜小こう細胞の上記特性のすべてを示すことが認められた(図45)。図45のパネルA及びBによれば、注射されたCD44HI細胞はCD11b及びF4/80を発現し、内因性小こう細胞に類似した形態及び血管周囲局在化を示す。パネルCは、3D画像解析であり、注射されたCD44HI細胞が血管周囲領域に局在することを示す。パネルDは、注射されたCD44HI細胞の形態の高倍率画像である。
ネガティブ選択によるMLBM細胞の単離
抗体及び/又は磁気ビーズなど、表面に結合した選択剤を含まない細胞を注射することは、実験及び臨床応用の目的上望ましい。この目標を達成する一方法は、ネガティブ選択戦略を利用してCD44HI細胞を単離することである。本明細書に記載のCD44HI及びCD44LO細胞集団の表面マーカー発現プロファイルの特性分析によって、CD44LO細胞がそれぞれ赤血球系細胞及びB細胞のマーカーであるTer119及びCD45RB220を高度に発現することを発見した。これらのマーカーに対する抗体は、T細胞マーカーCD3eの添加と合わせて、CD44LO集団を効率的に標識して、磁気又はFACS分離によるその除去を可能にし、「初期状態の(untouched)」CD44HI細胞を生成物として残すことができる。この戦略を用いてFACSによって分離された細胞は、本発明のMLBM細胞集団の典型的な機能的特性を示す(図46)。
図46、パネルAによれば、CD45R/B220、TER119及びCD3eに対して選択的な抗体を用いたMACSによってマウス骨髄を枯渇させると、90パーセントを超えるCD44HI細胞である細胞集団が生成する。パネルBによれば、ネガティブ画分(CD44HI集団)は、CD45R/B220、TER119及びCD3e細胞を本質的に含まない。パネルCによれば、ネガティブ選択されたCD44HI細胞は、網膜のターゲティング及び分化能力を保持する。
低酸素誘導因子1α(HIF−1α)の発現は、低酸素誘導性血管損傷の修復に重要である。
HIF−1αは、低酸素条件に対する細胞応答の十分研究された調節因子であり、血管形成遺伝子発現の制御因子であって、VEGF、IGF、TGF−αなどを含めて、血管修復において潜在的役割を有する多数の遺伝子の転写を調節する。C57BL/6JマウスにおけるHIF−1α転写因子を標的とした欠損は、リゾチームMプロモーターによって駆動されるcre発現(lysMcre)のバックグラウンド中に交雑によって作製され、それによって骨髄系におけるHIF−1α転写因子の特異的欠損が可能になる。本発明者らは、本明細書に記載するように、CD44HI骨髄系前駆細胞をこれらのマウスの骨髄から単離し、P7で移植したときに野生型マウスから得られたCD44HI細胞と比較して、OIRモデルにおける血管修復を促進するその能力を評価した。重要なことには、骨髄球特異的HIF−1αノックアウト系統と野生株から単離されたCD44HI細胞間には、表面マーカー発現又は光散乱性の点で差がなかった。しかし、HIF−1α欠損細胞は、修復を促進せず、野生型細胞は血管修復を劇的に加速した(図47)。このノックアウトにおけるHIF−1α遺伝子発現の抑制は骨髄系細胞に特異的であるので、この知見は、骨髄細胞が、血管修復を媒介する活性集団を構成することを更に示している。別の骨髄由来の細胞はすべて正常な活性を保持すると予想される。
小こう細胞は網膜血管再生に関与する。
網膜小こう細胞は、歴史的に、炎症及び感染に応答する免疫担当細胞とみなされ、正常な発達的再構築(developmental remodeling)又は変性疾患中に生成する組織片を貪食する。網膜血管新生を促進する小こう細胞の役割は明確に記述されていない。本研究は、骨髄系前駆細胞の表面マーカーを発現する成体骨髄由来の細胞が、小こう細胞に分化し、低酸素傷害後の血管構造の高度な回復を促進できることを実証する。この過程は、HIF−1αに依存し、血管新生の調節における骨髄系前駆細胞の新規役割を記述する。
移植された骨髄由来の骨髄系前駆細胞がOIRモデルにおいて小こう細胞に分化し、中心網膜の血管再生及び修復を促進するという知見に基づいて、小こう細胞が、正常な発達中の網膜血管新生の促進及び維持に重要な役割を果たすことは明らかである。OIRのマウスモデルでは、C57BL/6Jマウスは、かなりの血管閉塞及び網膜前方の血管叢形成を確実にもたらすので、最も広く用いられる系統である。対照的に、BALB/cByJ系統は、同じ条件下で、網膜前方の血管叢をさほど形成せず、酸素過剰中に認められた中心血管閉塞は、酸素正常状態に戻った後に極めて急速に血管が再生される(図48、パネルa)。これらの相違の根本的原因は不明であるので、網膜小こう細胞の相違について2つの系統を検討した。小こう細胞は、BALB/cByJマウスにおける血管閉塞した中心網膜内で48時間の虚血/低酸素にわたって、C57BL/6Jマウスよりも多数存続することが判明した(図48、パネルb、c)。この結果は、修復期中に内在性網膜小こう細胞の存在が増加することによって、BALB/cByJ系統が網膜症からある程度保護されることを示す。理論に拘泥するつもりはないが、C57BL/6Jマウスへの骨髄由来骨髄系前駆細胞の移植は、この系統に存在するより少ない内在性小こう細胞の機能を置換及び/又は増大させ、注射しないBALB/cByJマウスで認められた修復効果に類似した修復効果をもたらし得る。
OIRモデルにおける血管修復に関与する機序を更に検討するために、正常な網膜血管発達における小こう細胞の役割を検討した。これは、クロドロナートを含むリポソームを用いて小こう細胞数を操作することによって実施された。クロドロナートを含むリポソームは、マクロファージ、小こう細胞などの食細胞によって選択的に摂取され、食細胞におけるアポトーシスを誘発する。これらの実験における小こう細胞の摂取の特異性は、標識リポソームを用いて実証され、標識リポソームは注射後4日間CD11b+小こう細胞内に専ら共存してみられた(図48、パネルe、挿入図)。標識された材料は、血管細胞又は別のCD11b−細胞中には存在しなかった。クロドロナートを含むリポソームをP5に硝子体内注射すると、P8に評価して、小こう細胞数がかなり減少し、網膜血管構造が劇的に破壊された。多量の毛細血管の脱落は、クロドロナートによって媒介される小こう細胞の細胞死面積と解剖学的に相関することが認められ、小こう細胞が新しい血管の発達及び/又は維持に必要であることが示された(図48、パネルd)。
同様に、クロドロナートを含むリポソームをP2に注射すると、P6において血管新生した網膜(n=6)の面積が、対照のPBSを含むリポソームを注射した他眼よりも28%減少した(図48、パネルe)。血管網の密度が明らかに異なるため、総血管面積も比較した。総血管面積は、クロドロナートリポソーム処理によって41%減少した。これらの結果は、小こう細胞が未成熟血管の維持、及び網膜の発達中の新しい血管の成長に重要であることを示す。
ヒトMLBM CD44HI細胞
マウス骨髄球様骨髄細胞集団に関する知見は、ヒト細胞にも拡張することができる。
骨髄細胞集団をヒト骨髄から単離した。単離細胞は、CD44HI発現細胞であり、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD33及びCD46も発現した(図49及び51)。ヒトCD44HI細胞は、フローサイトメトリーの光散乱の点で、マウスCD44HI細胞に類似した物性を有する(図50)。例えば、ヒトCD44HI細胞は、CD44とCD11bの両方を発現する。ヒトCD44HI集団は、CD44HI細胞画分がリンパ球であるように見える点でマウスCD44HI集団とは異なり、マウス骨髄では、CD44HI細胞は専ら骨髄球性である。以前に試験したマウス細胞にできるだけ類似したヒト細胞集団を得るために、リンパ球の欠乏したヒト骨髄からCD44HI集団を単離した。これらのヒト骨髄細胞は、マウスOIRモデルにおける血管病変の軽減に効果的であった(図52)。
次いで、活性細胞が末梢血中に存在するかどうかの問題に取り組んだ。まず、CD14に対する抗体を用いて、単球を末梢血から単離した。骨髄由来のCD44HI細胞は主成分として単球を含むので、単球が選択された。CD33に対する抗体を用いて、末梢血由来の骨髄細胞を選択した。CD44と同時発現される抗原の分析を、赤血球(rbc)溶解後に、ヒト末梢血に対して実施した(図53)。CD14に対してポジティブ選択されたCD44HI細胞集団と、CD33に対してポジティブ選択されたCD44HI細胞集団はどちらも、マウスOIRモデルにおいて効力を示した(図54)。これらの細胞はCD11bも発現する。
細胞選択方法を、細胞の異なる物性に基づいて用いた。フローサイトメトリーは、特定の細胞集団を選択する手段として利用することができる細胞サイズ及び細胞粒度(granularity)を測定することができる。この場合、赤血球を塩化アンモニウムで溶解後、単球及び顆粒球を、選択薬剤(すなわち抗体)を使用せずに光散乱のみで選択した。(単球及び顆粒球を主成分として含む)CD44HI細胞に類似した集団は、この様式で末梢血から生成させることができる(図55)。CD44HI細胞は、マウスOIRモデルにおいて、血管閉塞及び血管新生を減少させることが判明した。別々に単離された単球と顆粒球も、OIRモデルにおいて効力を有することが判明した(図56)。
CD14+ヒトさい帯血細胞
ヒトさい帯血は、造血性コロニー形成細胞又は幹細胞(HCFC又はHSC)の豊富な資源である。幾つかの臨床試験によれば、さい帯及び胎盤から得られる血液は、照射によって除去された骨髄を再構成するのに十分な量の幹細胞を含む。
骨髄から生ずる内皮前駆細胞(EPC)は、虚血性組織の血管新生、及び傷害を受けた血管の再内皮化に重要な役割を果たす。
本発明者らは、ヒトさい帯血造血性前駆細胞が、虚血及び/又は変性の部位における網膜血管構造に取り込むことができる1つ以上の集団であって、機能的血管の救済に寄与することができる1つ以上の集団を含むことを見いだした。造血性前駆細胞の大多数はCD44を発現し、細胞の約97%はCD11bを発現する。造血性前駆細胞、及びインビトロで拡大されたその内皮子孫(progeny)を、酸素誘発性虚血を起こした免疫不全SCIDマウスの硝子体内に注射した。ヒトさい帯血単核球(monuclear cell)をフィコール密度遠心分離によって得た。ヒトさい帯血由来の非選択の単核球をフィブロネクチンで被覆された培養物上に蒔いた。
内皮細胞(EC)の形態のコロニーがインビトロで4日後に出現した。内皮前駆細胞のコロニーは、円形細胞の中心のクラスターから生ずる複数の薄い扁平な細胞として出現した。
7日目に、対照培地中で培養されたEPCは、円形/多角形細胞のクラスターから生ずる薄い扁平な紡錘状の細胞からなる内皮細胞コロニーの形態を示した。細長い内皮細胞は、散在するコロニー又は高密度の束を形成した。13日目に、培養EPCは、同様にECに分化した(図57)。
内皮プロファイルを確認するために、血管内皮増殖因子(VEGF)受容体2(VEGFR2)及びCD31に対する抗体を用いて間接的免疫染色を実施した。核を4’−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール−2HClで染色した(図58、59)。
新しく得られたさい帯血、又は7日間培養して分化させたヒトさい帯血細胞を、OIRモデルのマウスの硝子体内に注射した。血管閉塞領域(黄色)及び新生血管叢形成領域を、新しいさい帯血単核(CBMN)細胞又は7日間培養して分化させた細胞の両方の注射後に分析し、血管救済をPBS注射と比較した(図60及び61)。新しいCBMN細胞をeGFPレンチウイルスの発現によって確認した(図62)。
CD14を発現する単球集団をヒトさい帯血単核球中で確認した。MACSによって単離された新しいCD14陽性細胞(純度98%)を、OIRモデルのマウスの硝子体内に注射した。本発明者らは、血管閉塞領域及び血管叢形成領域を分析した。図63に示すように、注射された細胞は、PBS注射と比較して、血管救済を明瞭に誘起した。
上記実施形態の多数の変更及び改変を、本発明の精神及び新規特徴の範囲から逸脱することなく実施することができる。本明細書に記載する具体的実施形態は限定的なものではなく、限定的なものと考えるべきでもない。