KR20230142576A - 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 벡터 스터퍼 폴리뉴클레오티드, 및 발현 작제물 및 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터를 비롯한 이의 조성물 및 포유동물에게 치료제 (예컨대, 억제성 핵산)를 전달하는 방법 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
Description
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신 텍스트 포맷으로 제공되며, 이는 본원에서 참조로 본 명세서에 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 파일명은 630264_402WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 163 KB이며, 2022년 2월 4일에 작성되었고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고 있다.
배경
아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터 게놈의 크기는 제한되는 것으로 알려져 있으며, 대략적으로 4.7 kb의 천연 크기의 벡터 크기가 성공적으로 패키징되지만, 훨씬 더 큰 벡터 게놈은 기능적 AAV 벡터의 생산을 감소시킬 수 있다 (문헌 [Wu et al., Molecular Therapy 2010 18(1): 80-86]). 다른 한편으로, 벡터 게놈 패키징 한계보다 실질적으로 더 작은 벡터 게놈을 통해서는 패키징이 차선적으로 이루어질 수 있다 (문헌 [Dong et al., Human gene therapy 1996 7:2101-2112]). 또한, 시스 플라스미드가 - 전형적으로, 예컨대, 박테리아에서 플라스미드를 전파하는 데 필요한 저항성 및 항생제 저항성의 박테리아 기원 요소를 코딩(encoding)하는 - 의도된 AAV 벡터 게놈 크기에 가까운 '백본' 서열을 가지고 있는 경우, 의도되지 않은 '역 패키징된' 서열의 양은 증가할 수 있다 (문헌 [Hauck et al., Molecular Therapy (2009) 17:144-152]). 이러한 이유로, 그 자체적으로는 패키징된 AAV에 바람직하지 않은 특성을 부여하지 않는 '스터퍼(stuffer) 서열'을 플라스미드 백본에서 물질로서, 및 의도된 AAV 페이로드가 천연 AAV 패키징 크기보다 상당히 더 짧은 상황에서 사용하는 것이 유리할 수 있다. 불활성 스터퍼 서열의 중요성은 문헌 [Keiser et al., Nature Medicine (2021) 27:1982-1989]에 의해 강조되었으며, 여기서 스터퍼 서열을 포함하는 '페이로드가 없는' AAV가 비-인간 영장류에서 상당한 독성을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
현재 패키징 특징이 개선된 AAV 벡터가 요구되고 있다.
도면의 여러 뷰에 관한 간단한 설명
도 1: 베이스 서열 내의 발현된 영역, 공지된 또는 예측된 조절 요소 및 반복 요소 (레트로바이러스 및 전이 요소 포함)를 확인하기 위해 UCSC 게놈 브라우저에서 선택된 트랙.
도 2a-2b는 비히클 또는 scAAV9 벡터를 정맥내로 투여받은 마우스의 프로세싱된 혈청 투여 13일 후 측정된 간 효소 기능 시험 (도 2a) 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST; U/L) 및 (도 2b) 알라닌 트랜스아미나제 (ALT; U/L)를 보여주는 것이다. 대조군 마우스와 비교하였을 때, 스터퍼 단독 벡터 중 어느 것도 ALT 또는 AST의 유의적인 상승을 보이지 않은 반면, 독성 양성 대조군 인공 miRNA에서 벡터 발현은 간 효소 ALT 및 AST의 상당한 유의적인 상승을 유도하였다 (일원 ANOVA, 던네트(Dunnett) 다중 비교 검정). 독성 양성 대조군 (N=3)을 제외한 모든 군은 N=5였다.
도 3a-3h는 칼럼 정제된 scAAV9 벡터 DNA의 단편 분석기 트레이스를 보여주는 것이다. 대표적인 벡터를 사용하였을 때, 도 3a는 표준 고분자량 이중 피크를 보여주는 것으로, 이는 mutITR (이중 피크 유지; 도 3b), 또는 wtITRs (이제 단일 피크; 도 3c)의 효소적 절단시, 이중 피크가 전장 집단을 나타낸다는 것을 입증한다. 도 3d는 정제된 scAAV9 벡터 DNA의 단편 분석기 트레이스의 3개 성분: 최고 분자량에서 2개 피크로 표시된 전장 벡터, 그 다음 피크, 또는 miR-중심 말단절단물, 및 마지막으로, 스터퍼 서열 내에 존재하는 말단절단물을 표지한 것이다. 도 3e에서, scAAV9 H1 MCS 작제물 PSG11_V1 및 PSG11_V2에 대한 트레이스는 각각 상단 트레이스 및 하단 트레이스에 있다. 도 3f에 제시된 트레이스에서, 오버랩핑시, PSG11_V2는 PSG11_V1과 비교하여 말단절단물의 농도가 더 높다. 도 3g에는 PSG11_V1 벡터 (상단) 및 인공 miRNA miR-1-1 XD-14792 (XD-14792는 또한 본원에서 1784로도 지칭된다)가 내장된 PSG11_V2 벡터 (하단)가 있다. 도 3h는 도 3g의 트레이스의 오버랩을 보여주는 것이다. miR-중심 피크 (화살표 표시) 크기로 입증되는 바와 같이, miR-중심 말단절단물은 PSG11_V2와 비교하여 PSG11_V1에서 감소되어 있다.
도 4a-4b는 Mfold 웹 서버를 사용하여 PSG11_V1 (도 4a) 및 PSG11_V2 (도 4b)의 인공 miRNA 및 종결인자에 인접한 200개의 뉴클레오티드의 예측된 2차 구조를 보여주는 것이다. 음의 깁스 자유 에너지 값이 더 적고, 2차 구조가 상대적으로 결여되어 있는 것으로 입증되는 바와 같이, PSG11_V2와 비교하여 PSG11_V1은 바람직한 예측된 DNA 2차 구조가 더 많이 존재한다.
도 5a-5b는 벡터 아키텍쳐 연구의 간 효소 값 (도 5a - AST; 도 5b - ALT)을 보여주는 것이다.
도 6은 H1 롱 프로모터(promoter), miR-100 백본 중 amiRNA 3330 및 PSG11_V5 스터퍼 (좌측) 및 H1 쇼트 프로모터, miR-1-1 백본 중 amRNA 1784 (또한 본원에서 14792로도 지칭) 및 PSG11_V5 스터퍼 (우측)를 갖는 대표적인 벡터로부터의 가닥 RNAseq 트레이스를 보여주는 것이다.
도 7은 벡터 아키텍쳐 연구에서 시험된 24개의 작제물의 역가를 보여주는 것이다. H1 롱 프로모터 (좌측 칼럼)를 함유하는 벡터는 H1 네이티브 프로모터 (중간) 및 H1 쇼트 프로모터 (우측), 이 둘 모두와 비교하여 일관되게 더 높은 역가를 보였다.
도 8a-8c는 단편 분석기 병렬 모세관 전기영동 시스템에 의해 측정된 AMELY_V3 및 PSG11_V5 스터퍼 서열을 갖는 scAAV9 벡터에 대한 miR 및 스터퍼 말단절단물을 보여주는 것이다. 도 8a에서, H1 롱 (좌측 패널), H1 네이티브 (중간 패널), 및 H1 쇼트 (우측 패널)에 걸쳐, 및 SV40 폴리아데닐화 서열의 부재 (동그라미 표시) 및 SV40 폴리아데닐화 서열 존재 (삼각형 표시)하에서, AMELY_V3 및 PSG11_V5 벡터, 둘 모두에서 miR1-1과 비교하여 더 적은 수의 miR 말단절단물을 가진다. 도 8b에서, H1 롱 프로모터를 갖는 벡터는 SV40 폴리아데닐화 서열 존재 및 부재, 둘 모두에서 H1 네이티브 프로모터 및 H1 쇼트 프로모터를 갖는 벡터와 비교하여 더 적은 수의 miR 말단절단물을 가진다. 도 8c에서, H1 롱 프로모터를 갖는 벡터는 SV40 폴리아데닐화 서열 존재 및 부재, 둘 모두에서 H1 네이티브 프로모터를 갖는 벡터 및 H1 쇼트 프로모터를 갖는 벡터와 비교하여 조합된 miR/스터퍼 말단절단물에서 더 적은 수의 miR 말단절단물을 가진다.
도 1: 베이스 서열 내의 발현된 영역, 공지된 또는 예측된 조절 요소 및 반복 요소 (레트로바이러스 및 전이 요소 포함)를 확인하기 위해 UCSC 게놈 브라우저에서 선택된 트랙.
도 2a-2b는 비히클 또는 scAAV9 벡터를 정맥내로 투여받은 마우스의 프로세싱된 혈청 투여 13일 후 측정된 간 효소 기능 시험 (도 2a) 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST; U/L) 및 (도 2b) 알라닌 트랜스아미나제 (ALT; U/L)를 보여주는 것이다. 대조군 마우스와 비교하였을 때, 스터퍼 단독 벡터 중 어느 것도 ALT 또는 AST의 유의적인 상승을 보이지 않은 반면, 독성 양성 대조군 인공 miRNA에서 벡터 발현은 간 효소 ALT 및 AST의 상당한 유의적인 상승을 유도하였다 (일원 ANOVA, 던네트(Dunnett) 다중 비교 검정). 독성 양성 대조군 (N=3)을 제외한 모든 군은 N=5였다.
도 3a-3h는 칼럼 정제된 scAAV9 벡터 DNA의 단편 분석기 트레이스를 보여주는 것이다. 대표적인 벡터를 사용하였을 때, 도 3a는 표준 고분자량 이중 피크를 보여주는 것으로, 이는 mutITR (이중 피크 유지; 도 3b), 또는 wtITRs (이제 단일 피크; 도 3c)의 효소적 절단시, 이중 피크가 전장 집단을 나타낸다는 것을 입증한다. 도 3d는 정제된 scAAV9 벡터 DNA의 단편 분석기 트레이스의 3개 성분: 최고 분자량에서 2개 피크로 표시된 전장 벡터, 그 다음 피크, 또는 miR-중심 말단절단물, 및 마지막으로, 스터퍼 서열 내에 존재하는 말단절단물을 표지한 것이다. 도 3e에서, scAAV9 H1 MCS 작제물 PSG11_V1 및 PSG11_V2에 대한 트레이스는 각각 상단 트레이스 및 하단 트레이스에 있다. 도 3f에 제시된 트레이스에서, 오버랩핑시, PSG11_V2는 PSG11_V1과 비교하여 말단절단물의 농도가 더 높다. 도 3g에는 PSG11_V1 벡터 (상단) 및 인공 miRNA miR-1-1 XD-14792 (XD-14792는 또한 본원에서 1784로도 지칭된다)가 내장된 PSG11_V2 벡터 (하단)가 있다. 도 3h는 도 3g의 트레이스의 오버랩을 보여주는 것이다. miR-중심 피크 (화살표 표시) 크기로 입증되는 바와 같이, miR-중심 말단절단물은 PSG11_V2와 비교하여 PSG11_V1에서 감소되어 있다.
도 4a-4b는 Mfold 웹 서버를 사용하여 PSG11_V1 (도 4a) 및 PSG11_V2 (도 4b)의 인공 miRNA 및 종결인자에 인접한 200개의 뉴클레오티드의 예측된 2차 구조를 보여주는 것이다. 음의 깁스 자유 에너지 값이 더 적고, 2차 구조가 상대적으로 결여되어 있는 것으로 입증되는 바와 같이, PSG11_V2와 비교하여 PSG11_V1은 바람직한 예측된 DNA 2차 구조가 더 많이 존재한다.
도 5a-5b는 벡터 아키텍쳐 연구의 간 효소 값 (도 5a - AST; 도 5b - ALT)을 보여주는 것이다.
도 6은 H1 롱 프로모터(promoter), miR-100 백본 중 amiRNA 3330 및 PSG11_V5 스터퍼 (좌측) 및 H1 쇼트 프로모터, miR-1-1 백본 중 amRNA 1784 (또한 본원에서 14792로도 지칭) 및 PSG11_V5 스터퍼 (우측)를 갖는 대표적인 벡터로부터의 가닥 RNAseq 트레이스를 보여주는 것이다.
도 7은 벡터 아키텍쳐 연구에서 시험된 24개의 작제물의 역가를 보여주는 것이다. H1 롱 프로모터 (좌측 칼럼)를 함유하는 벡터는 H1 네이티브 프로모터 (중간) 및 H1 쇼트 프로모터 (우측), 이 둘 모두와 비교하여 일관되게 더 높은 역가를 보였다.
도 8a-8c는 단편 분석기 병렬 모세관 전기영동 시스템에 의해 측정된 AMELY_V3 및 PSG11_V5 스터퍼 서열을 갖는 scAAV9 벡터에 대한 miR 및 스터퍼 말단절단물을 보여주는 것이다. 도 8a에서, H1 롱 (좌측 패널), H1 네이티브 (중간 패널), 및 H1 쇼트 (우측 패널)에 걸쳐, 및 SV40 폴리아데닐화 서열의 부재 (동그라미 표시) 및 SV40 폴리아데닐화 서열 존재 (삼각형 표시)하에서, AMELY_V3 및 PSG11_V5 벡터, 둘 모두에서 miR1-1과 비교하여 더 적은 수의 miR 말단절단물을 가진다. 도 8b에서, H1 롱 프로모터를 갖는 벡터는 SV40 폴리아데닐화 서열 존재 및 부재, 둘 모두에서 H1 네이티브 프로모터 및 H1 쇼트 프로모터를 갖는 벡터와 비교하여 더 적은 수의 miR 말단절단물을 가진다. 도 8c에서, H1 롱 프로모터를 갖는 벡터는 SV40 폴리아데닐화 서열 존재 및 부재, 둘 모두에서 H1 네이티브 프로모터를 갖는 벡터 및 H1 쇼트 프로모터를 갖는 벡터와 비교하여 조합된 miR/스터퍼 말단절단물에서 더 적은 수의 miR 말단절단물을 가진다.
상세한 설명
본 개시내용을 더 상세히 기술하기 전에, 본원에서 사용되는 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 이를 이해하는 데 도움이 될 수 있다. 추가의 정의는 본 개시내용 전역에 걸쳐 제시된다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 퍼센트 범위, 비 범위, 또는 정수 범위도, 달리 명시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우, 이의 분수 (예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 임의의 물리적 특징, 예컨대, 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에서 언급된 임의의 수치 범위도, 달리 명시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같은, "약"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 명시된 범위, 값, 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "하나"("a" 및 "an")라는 용어는 열거된 성분 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 대안 (예컨대, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나, 그 둘 모두, 또는 이의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은, "포함하다(include)," "갖다" 및 "포함하다(comprise)"라는 용어는 동의어로 사용되며, 상기 용어 및 이의 어미 변형도 비-제한적인 것으로 해석되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 예컨대, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 또는 폴리리보뉴클레오티드와 같이 공유결합으로 연결된 뉴클레오티드 서브유닛으로 구성된 임의의 핵산 중합체를 지칭한다. 핵산의 예로는 RNA 및 DNA를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "RNA"는 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 포함하는 분자를 지칭하고, 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 단리된 RNA, 합성 RNA, 재조합 RNA 뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 및/또는 변경에 의해 자연적으로 발생하는 RNA와는 상이한 변형된 RNA를 포함한다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 또는 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대, 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "DNA"는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 분자를 지칭하고, 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 단리된 DNA, 합성 DNA, 재조합 DNA 뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 및/또는 변경에 의해 자연적으로 발생하는 DNA와는 상이한 변형된 DNA를 포함한다. DNA 분자의 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 또는 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대, 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 화학작으로 합성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
"단리된"이란, 이의 천연 환경으로부터 단리되거나, 또는 인공적으로 제조된 물질을 지칭한다. 세포와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은, "단리된"은 이의 천연 환경으로부터 (예컨대, 대상체, 기관, 조직, 또는 체액으로부터) 단리된 세포를 지칭한다. 핵산과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은, "단리된"은 이의 천연 환경으로부터(예컨대, 세포, 세포 기관, 또는 세포질로부터) 단리되거나, 재조합적으로 제조되거나, 증폭되거나, 합성된 핵산을 지칭한다. 실시양태에서, 단리된 핵산은 벡터 내에 함유된 핵산을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 유전자의 "야생형" 또는 "비-돌연변이체" 형태라는 용어는 정상 또는 비-병원성 활성과 연관된 단백질 (예컨대, 예를 들면, 신경변성 질환의 발달(developing), 발병, 또는 진행 위험을 더 높이 증가시키는 반복 영역 확장부가 결여된 단백질)을 코딩하는 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "돌연변이"는 유전자의 변경된 형태를 생성하는, 유전자의 구조, 예컨대, 유전자 서열 내 임의의 변화를 지칭하며, 이는 후속 세대로 전달되거나 (유전적 돌연변이), 전달되지 않을 수 있는 (체세포 돌연변이), 유전자의 변경된 형태를 생성한다. 유전자 돌연변이는 DNA 내 단일 염기의 치환, 삽입, 또는 결실, 또는 유전자 또는 염색체의 다중 염기 또는 더 큰 섹션, 예를 들면, 반복 확장부의 치환, 삽입, 결실, 또는 재정렬을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "억제성 핵산"은 표적 핵산, 예컨대, 신경변성 질환 표적 RNA, mRNA, 프리-mRNA, 또는 성숙한 mRNA의 적어도 일부에 하이브리드화하고, 이의 발현 또는 활성을 억제하는 가이드 가닥 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. 억제성 핵산은 표적 핵산의 단백질 코딩 영역 (예컨대, 엑손) 또는 비-코딩 영역 (예컨대, 5'UTR, 3'UTR, 인트론 등)을 표적화(targeting)할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 분자이다. 억제성 핵산은 별개의 가닥 (예컨대, 이중 가닥 이중체) 또는 동일한 가닥 (예컨대, 단일 가닥, 자가-어닐링 이중체 구조 상의 패신저 가닥 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 RNA 분자, 예컨대, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 dsRNA이다.
본원에서 사용된 바와 같은, "마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 표적 mRNA의 절단, 표적 mRNA의 번역 억제, 표적 mRNA 분해, 또는 이의 조합에 의한 표적 유전자의 침묵화를 매개할 수 있는 작은 비-코딩 RNA 분자를 지칭한다. 전형적으로, miRNA는 (예컨대, Drosha, DGCR8, Pasha 등에 의해) 프레-miRNA로 효소적으로 프로세싱된, 1차 miRNA (프리-miRNA)로서 지칭되는, 헤어핀 또는 스템-루프 (예컨대, 자가-상보성(self-complementary)의 단일-가닥 백본을 갖는) 이중체 구조로서 전사된다. 프레-miRNA는 세포질로 배출되고, 여기서 이는 다이서(Dicer)에 의해 효소적으로 프로세싱되어 패신저 가닥 및 이후 단일-가닥의 성숙한 miRNA 분자와 miRNA 이중체를 생성하고, 이어서, 이는 RNA-유도된 침묵화 복합체 (RISC)로 로딩된다. miRNA에 대한 언급은 합성 또는 인공 miRNA를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "합성 miRNA" 또는 "인공 miRNA" 또는 "amiRNA"는 스템 서열 내의 내인성 miRNA 가이드 서열(guide sequence) 및 패신저 서열(passenger sequence)이 표적화된 유전자의 매우 효율적인 RNA 침묵화를 지시하는 miRNA 가이드 서열 및 miRNA 패신저 서열로 대체된, 내인성, 변형된, 또는 합성 프리-miRNA 또는 프레-miRNA (예컨대, miRNA 백본 또는 스캐폴드)를 지칭한다 (예컨대, 문헌 [Eamens et al., Methods Mol. Biol. (2014) 1062:211-224] 참조). 일부 실시양태에서, 가이드 및 패신저 서열의 상보성의 성질 (예컨대, 염기 개수, 미스매치 위치, 벌지 유형 등)은 합성 miRNA가 작제된 내인성 miRNA 백본 내 가이드 및 패신저 서열의 상보성의 성질과 유사하거나, 또는 상이할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "마이크로RNA 백본," "miR 백본," "마이크로RNA 스캐폴드," 또는 "miR 스캐폴드"는 스템 서열이 목적한 miRNA에 의해 대체되는 프리-miRNA 또는 프레-miRNA 스캐폴드를 지칭하고, 이는 목적한 miRNA에 의해 표적화되는 유전자에서 RNA 침묵화를 지시하는, 기능성의 성숙한 miRNA를 생산할 수 있다. miR 백본은 5' 플랭킹 영역 (또한 5' miR 컨텍스트로도 지칭, ≥ 9개의 뉴클레오티드), miRNA 이중체 (가이드 가닥 서열 및 패신저 가닥 서열) 및 기본 스템 (5' 및 3', 각각 약 4-13개의 뉴클레오티드)를 포함하는 스템 영역, 말단 루프를 포함하는 적어도 하나의 루프 모티프 영역 (말단 루프의 경우, ≥10개의 뉴클레오티드), 3' 플랭킹 영역 (또한 3' miR 컨텍스트로도 지칭, ≥ 9개의 뉴클레오티드), 및 임의적으로 스템 내 하나 이상의 벌지를 포함한다. miR 백본은 야생형 miRNA 스캐폴드로부터 완전히 또는 부분적으로 유래될 수 있거나, 또는 완전한 인공 서열일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 억제성 핵산의 "안티센스 가닥 서열" 또는 "가이드 가닥 서열"이라는 용어는 침묵화를 위해 표적화된 유전자의 mRNA 중 약 10-50개의 뉴클레오티드 (예컨대, 약 15-30, 16-25, 18-23, 또는 19-22개의 뉴클레오티드)로 이루어진 영역과 실질적으로 상보적인 (예컨대, 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 상보성인) 서열을 지칭한다. 안티센스 서열은 표적-특이적 침묵화를 지시하는, 예컨대, RNAi 기구 또는 프로세스에 의해 표적 mRNA의 파괴를 일으키는 표적 mRNA 서열에 대해 충분히 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 서열 또는 가이드 가닥 서열은 다이서에 의한 절단 후 남아있는 성숙한 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 억제성 핵산의 "센스 서열" 또는 "패신저 가닥 서열"이라는 용어는 표적 mRNA와 상동성이고, 억제성 핵산의 안티센스 가닥 서열 또는 가이드 가닥 서열과 부분적으로 또는 완전히 상보성인 서열을 지칭한다. 억제성 핵산의 안티센스 가닥 서열 및 센스 가닥 서열은 하이브리드화하여 이중체 구조를 형성한다 (예컨대, 이중-가닥 이중체 또는 단일-가닥 자가-어닐링 이중체 구조 형성). 일부 실시양태에서, 센스 서열 또는 패신저 가닥 서열은 다이서에 의한 절단 후 남아있는 성숙한 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 억제성 핵산에 관하여 사용될 때, "이중체"는 함께 하이브리드화하여 이중체 구조를 형성하는 두 핵산 가닥 (예컨대, 가이드 가닥 및 패신저 가닥)을 지칭한다. 이중체는 별개의 두 핵산 가닥에 의해 또는 자가-상보성 영역 (예컨대, 헤어핀 또는 스템-루프)을 갖는 단일 핵산 가닥에 의해 형성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "상보성"이라는 용어는 서로 함께 염기쌍을 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 염기쌍은 전형적으로 역평행 폴리뉴클레오티드 가닥 또는 단일의, 자가-어닐링 폴리뉴클레오티드 가닥 내 뉴클레오티드 서브유닛 사이의 수소 결합에 의해 형성된다. 상보성 폴리뉴클레오티드 가닥은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 방식으로 (예컨대, A 대 T, A 대 U, C 대 G), 또는 이중체 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 형성할 수 있다. 다업계의 숙련가에게 자명한 바와 같이, DNA가 아니라 RNA가 사용될 때에는 티민보다는 우라실이 아데노신에 대해 상보성인 것으로 간주되는 염기이다. 추가로, 본 발명의 맥락에서 "U"가 제시되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "T"를 치환시키는 능력이 이해된다. 상보성은 또한 비변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 포함한다 (예컨대, 사이토신의 경우, 치환된 5-메틸 사이토신). 두 폴리뉴클레오티드 가닥 사이의 전체 상보성, 완벽한 상보성 또는 100% 상보성은 하나의 폴리뉴클레오티드 가닥의 각각의 뉴클레오티드가 제2의 폴리뉴클레오티드 가닥의 뉴클레오티드 단위와 수소 결합을 형성할 수 있는 경우이다. 상보성(%)은 정렬된 참조 서열 (예컨대, 표적 mRNA, 패신저 가닥)에 대해 상보성인 핵산 분자내 인접한 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 개수를 뉴클레오티드의 총 개수로 나누고, 100을 곱한 것을 지칭한다. 상기 정렬에서, 염기쌍을 형성하지 않는 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치로 불린다. 삽입 및 결실은 인접한 뉴클레오티드 서열의 상보성(%)을 계산하는 데 있어서 허용되지 않는다. 당업계의 숙련가에 의해 상보성의 계산시, 핵염기에 대한 화학적 변형이 핵염기의 왓슨-크릭 염기쌍 형성 능력이 유지되는 한, 고려되지 않는 것으로 이해된다 (예컨대, 5-메틸 사이토신은 상보성(%)을 계산할 목적을 위해 사이토신과 동일한 것으로 간주된다).
2개 이상의 핵산 서열 사이의 "동일성(identity) 퍼센트(%)"은 참조 서열에 의해 공유된 핵산 분자내 인접한 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 비를 지칭한다 (즉, 동일성(%) = 정렬된 영역 (예컨대, 인접한 뉴클레오티드 서열)내 동일한 뉴클레오티드의 개수/뉴클레오티드의 총 개수 x 100). 삽입 및 결실은 인접한 뉴클레오티드 서열의 동일성(%)의 계산시 허용되지 않는다. 당업계의 숙련가에 의해 동일성의 계산시, 핵염기에 대한 화학적 변형이 핵염기의 왓슨-크릭 염기쌍 형성 능력이 유지되는 한, 고려되지 않는 것으로 이해된다 (예컨대, 5-메틸 사이토신은 동일성(%)을 계산할 목적을 위해 사이토신과 동일한 것으로 간주된다).
본원에 사용된 바와 같은, "하이브리드화하는" 또는 "하이브리드화하다"라는 용어는 역평행 가닥 상의 염기쌍들 사이에 수소 결합을 형성함으로써 이중체를 형성하는 2개의 핵산 가닥을 지칭한다. 두 핵산 가닥 사이의 하이브리드화 강도는 주어진 이온 강도 및 pH, 표적 서열의 50%가 상보성 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 온도로서 정의된 용융 온도 (Tm)로 기술될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "발현 작제물(expression construct)"은 핵산 코딩 서열의 일부 또는 그 모두가 전사될 수 있는 핵산 (예컨대, 트랜스진)을 함유하는 임의의 유형의 유전 작제물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 발현은 예를 들어, 전사된 유전자로부터 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 생성물 또는 억제성 RNA (예컨대, siRNA, shRNA, miRNA)를 생성하는 핵산의 전사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "트랜스진"은 자연적으로 또는 유전자 조작 수단에 의해 또 다른 세포로 전달되고, 전사될 수 있고, 임의적으로 번역될 수 있는 외인성 핵산을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 발현"은 그에 의해 핵산이 핵산 분자로부터 전사되고, 대개는 펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 프로세스는 전사, 전사 후 제어, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 제어, 번역 후 변형, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. "유전자 발현"의 측정에 대한 언급은 전사 생성물 (예컨대, RNA 또는 mRNA), 번역 생성물 (예컨대, 펩티드 또는 단백질)의 측정을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "유전자의 발현을 억제시킨다"라는 용어는 유전자의 발현을 감소시키거나, 하향조절하거나, 억제하거나, 차단하거나, 저하시키거나, 정지시키는 것을 의미한다. 유전자의 발현 생성물은 유전자로부터 전사된 RNA 분자 (예컨대, mRNA) 또는 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 전형적으로, mRNA의 수준 감소는 이로부터 번역되는 폴리펩티드의 수준을 감소시킨다. 발현 수준은 mRNA 또는 단백질을 측정하기 위한 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "벡터"는 세포 사이에 핵산 분자 (예컨대, 억제성 핵산을 코딩하는 트랜스진)를 수송할 수 있고, 적합한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 경우, 핵산 분자를 발현할 수 있는 유전자 작제물을 지칭한다. 발현 제어 서열은 전사 개시 서열, 종결 서열 (또한 본원에서 종결인자 서열로도 지칭), 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호, 예컨대, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호; 세포질성 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열 (즉, 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 원하는 경우, 코딩된 생성물의 분비를 증진시키는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 트랜스포존, 코스미드, 파지미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온일 수 있다. 일단 적합한 숙주 세포 내로 형질전환되고 나면, 벡터는 복제하여 숙주 게놈과는 독립적으로 작용할 수 있거나, 또는 일부 경우에서, 게놈 자체 내로 통합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "숙주 세포"는 목적한 조성물, 예컨대, 억제성 핵산을 함유하거나, 함유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대, 설치류 세포, (마우스 또는 래트) 또는 영장류 세포 (원숭이, 침팬지, 또는 인간)이다. 실시양태에서, 숙주 세포는 시험관내 또는 생체내의 것일 수 있다. 실시양태에서, 숙주 세포는 확립된 세포주 또는 1차 세포로부터의 것일 수 있다. 실시양태에서, 숙주 세포는 CNS의 세포, 예컨대, 뉴런, 교질 세포, 성상세포, 및 소교 세포이다.
본원에서 사용된 바와 같은, "신경변성 질환" 또는 "신경변성 장애"는 병리학적 상태로서 신경 세포 사멸을 보이는 질환 또는 장애를 지칭한다. 신경변성 질환은 만성 신경변성, 예컨대, 수년의 기간에 걸쳐 느린, 진행성 신경 세포 사멸, 또는 급성 신경변성, 예컨대, 급작스러운 발병 또는 신경 세포 사멸을 나타낼 수 있다. 만성 신경변성 질환의 예는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 척수소뇌실조증 타입 2(spinocerebellar ataxia type 2: SCA2), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia: FTD), 및 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS)을 포함한다. 만성 신경변성 질환은 TDP-43 단백병증을 특징으로 하는 질환을 포함하며, 이는 핵에서 세포질로의 불국재화, 유비퀴틴화 및 과인산화된 TDP-43의 봉입체 내로의 침착, 독성 C-말단 TDP-43 단편의 형성을 초래하는 단백질 말단절단, 및 단백질 응집을 특징으로 한다. TDP-43 단백병증 질환은 ALS, FTD, 원발성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 진행성 근위축증(progressive muscular atrophy), 변연계 우세 연령 관련 TDP-43 뇌병증(limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy), 만성 외상성 뇌병증, 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy: PSP), 괌의 치매 파킨슨병 ALS 복합증(dementia Parkinsonism ALS complex of guam: G-PDC), 피크병(Pick's disease), 해마 경화증(hippocampal sclerosis), 헌팅톤병, 파킨슨병, 및 알츠하이머병을 포함한다. 급성 신경변성은 허혈증(ischemia) (예컨대, 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌 손상), 탈수초화에 의한 축삭 절단 또는 외상 (예컨대, 척수 손상 또는 다발성 경화증(multiple sclerosis))에 의해 유발될 수 있다. 신경변성 질환은 한 유형의 뉴런 또는 여러 유형의 뉴런의 사멸을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, "대상체," "환자," 및 "개체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 치료 또는 요법을 위해 선택된 살아있는 유기체 (예컨대, 포유동물)을 지칭한다. 대상체의 예로는 인간 및 비-인간 포유동물, 예컨대, 영장류 (원숭이, 침팬지), 소, 말, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 기니아 피그, 돼지, 및 이의 트랜스제닉 종을 포함한다.
스터퍼
서열 및 발현 작제물
AAV는 전장 게놈, 즉, 천연 게놈과 크기가 거의 동일하고, 너무 크거나 작지 않은 게놈을 우선적으로 패키징한다. 그러나, 억제성 핵산 서열을 코딩하는 발현 카세트는 AAV 전장 게놈보다 실질적으로 더 작다. 단편화된 게놈의 패키징을 피하기 위해, 이종성 핵산 서열을 포함하고, 5' ITR 및 3' ITR이 측면에 있는(flanking) 발현 작제물에 스터퍼 서열을 연결하여 패키징가능한 게놈을 확장함으로써, 그 결과로 그 크기는 ITR 사이의 길이가 거의 정상에 가까운 게놈이 생성되었다. 일반적으로, AAV의 패키징 용량은 5' ITR과 3' ITR 사이에서 약 4.7 kb이다. 자가-상보성 AAV (scAAV) 벡터의 경우, 패키징 용량은 5' ITR과 3' ITR 사이에서 약 2.4 kb이다.
바람직하게, 벡터 스터퍼 서열(vector stuffer sequence)을 수득하기 위한 출발 서열은 포유동물 기원의 것, 예컨대, 인간 기원의 것이다. 스터퍼 서열의 길이는 벡터 게놈이 AAV 캡시드의 (천연) 패키징 한계에 있거나 이에 근접하도록 조정될 수 있다. 추가로, 벡터 스터퍼 서열은 생체내 유전자 요법과 관련하여 부작용을 최소화하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈의 영역은 게놈에서 통합이 발생하는 경우, 최소한의 영향을 미치는 서열, 및 예상 밖의 전사를 개시할 위험이 최소인 서열을 확인함으로써 벡터 스터퍼 서열을 위한 공급원으로서 확인될 수 있다. 따라서, i) 결실 및 중복이 집단에서 일반적이고, 질환 관련 표현형과 연관이 없는 (진화적 압력의 증거 없음) 게놈 영역, 및/또는 ii) 인간 조직 간에 걸친 RNA 발현이 낮거나, 또는 검출불가능한 (강력한 내인성 인핸서/프로모터 요소가 결여된) 게놈 영역을 조사할 수 있다. 추가로, 벡터 스터퍼 서열은 벡터 서열을 불활성 또는 안전하게 만들기 위해 하나 이상의 요소를 감소시키도록, 최소화하도록, 제거하도록, 또는 그가 결여되도록 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 발현된 영역 (예컨대, 엑손 + 양측 10 bp, 인간 EST)을 감소 또는 제거하도록; 조절 요소 (예컨대, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 리프레서 서열, 스플라이싱 공여자 또는 수용자, 또는 트랜스진의 전사에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는, 인간 게놈에서 발견되는 다른 시스-작용 요소)를 감소 또는 제거하도록; 반복 요소 (예컨대, 마이크로새틀라이트(microsatellite) 반복부, 디뉴클레오티드 반복부, 트리뉴클레오티드 반복부)를 감소 또는 제거하도록; ATG 코돈을 감소, 제거 또는 변형시켜 잠재 출발 코돈에 기인하여 필러 또는 스터퍼 서열로부터 펩티드가 생성될 가능성을 감소 또는 제거하도록; CpG 디뉴클레오티드를 감소 또는 제거하여 선천 면역 반응을 유도하는 (박테리아에서 생성된 시스 플라스미드로부터) 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드의 가능성을 저하시키도록; 또는 이의 임의의 조합을 위해 변형된다. 본 개시내용은 높은 역가; 낮은 독성; 및 miRNA 및/또는 스터퍼 서열 중 감소된 말단절단물 중 하나 이상인 추가의 이점과 함께, 상기 언급된 특징들 중 하나 이상을 갖는 벡터 스터퍼 서열을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 길이가 약 1300 내지 약 2300개의 뉴클레오티드 길이이고, 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51과 적어도 75%의 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 벡터 스터퍼 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 길이가 약 1500-2000개의 뉴클레오티드 길이이고, 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51과 적어도 75%의 동일성을 갖는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 길이가 약 1600 내지 1900개의 뉴클레오티드 길이이고, 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51과 적어도 75%의 동일성을 갖는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51과 적어도 80%의 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 길이가 약 1,300-2,300개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,500-2,000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1,600-1,900개의 길이인 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51과 적어도 85%의 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 길이가 약 1,300-2,300개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,500-2,000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1,600-1,900개의 길이인 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 길이가 약 1,300-2,300개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,500-2,000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1,600-1,900개의 길이인 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 길이가 약 1,300-2,300개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,500-2,000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1,600-1,900개의 길이인 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51과 적어도 97%의 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 길이가 약 1,300-2,300개의 뉴클레오티드 길이, 약 1,500-2,000개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1,600-1,900개의 길이인 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47; 서열 번호: 48; 서열 번호: 49, 서열 번호: 50; 또는 서열 번호: 51을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 서열 번호: 48 또는 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185를 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터이고, 임의적으로 여기서 AAV 벡터는 자가-상보성이다.
일부 실시양태에서, 벡터 스터퍼 서열은 이종성 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물에 인접하게 (예컨대, 5' 또는 3') 위치한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산 서열은 치료제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 치료 단백질을 코딩하는 핵산 또는 억제성 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 dsRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 신경변성 질환 관련 유전자를 표적화하는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 dsRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경변성 질환은 척수소뇌실조증-2, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽 치매, 원발성 측삭 경화증, 진행성 근위축증, 변연계 우세 연령 관련 TDP-43 뇌병증, 만성 외상성 뇌병증, 루이소체 치매, 피질기저 퇴행, 진행성 핵상 마비 (PSP), 괌의 치매 파킨슨병 ALS 복합증 (G-PDC), 피크병, 해마 경화증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 또는 알츠하이머병이다. 일부 실시양태에서, 신경변성 질환은 폴리글루타민 반복 질환(polyglutamine repeat disease)이다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산 (예컨대, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 dsRNA)은 ATXN2를 표적화한다. ATXN2는 폴리글루타민 (폴리Q, CAG 반복부) 트랙을 함유하는, ATXN2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. ATXN2 유전자 또는 전사체는 전형적으로 22 또는 23개의 반복부를 갖는 ATXN2의 정상 대립유전자, 또는 중간 (~24-32개의 반복부) 또는 더욱 긴 반복 확장부 (~33 내지 >100개의 반복부)를 갖는 돌연변이화된 대립유전자를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 작제물은 ATXN2를 표적화하는 인공 miRNA를 코딩되는 이종성 핵산을 포함한다. 가이드 서열 및 패신저 서열 및 ATXN2를 표적화하는 인공 miRNA를 코딩되는 이종성 핵산의 예는 표 5에 제공되어 있다. 코딩된 가이드, 패신저, 및 인공 miRNA 서열의 RNA 포맷 뿐만 아니라, 시스 플라스미드 및 rAAV 벡터 내로의 삽입을 위한 DNA 포맷 또한 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 ATXN2를 표적화하는 인공 miRNA를 코딩하고, 서열 번호: 1-4 및 71로부터 선택되는 가이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 1에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 5에 의해 제공된 패신저 서열을 포함하는 인공 miRNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 2에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 6에 의해 제공된 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 3에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 7에 의해 제공된 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 4에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 8에 의해 제공된 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 71에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 72에 의해 제공된 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 miRNA 백본 (또는 스캐폴드)에 내장된 가이드 서열 및 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA 백본은 miR-100 또는 miR-1-1이다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 9-12 및 73 중 어느 하나에 의해 제공된 인공 miRNA 서열을 코딩한다. ATXN2를 표적화하는 가이드 서열, 패신저 서열, miR 백본, 및 인공 miRNA 서열의 추가 예는 PCT 공개 WO2021/159008 (이는 그 전문이 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, 발현 작제물은 트랜스진 (예컨대, 인공 miRNA를 코딩하는 핵산)과 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열 (조절 서열)을 추가로 포함한다. "작동가능하게 연결된" 서열은 트랜스진과 인접하거나, 또는 트랜스로 또는 트랜스진으로부터 떨어져서 작용하여 이의 발현을 제어하는 발현 제어 서열을 포함한다. 발현 제어 서열의 예로는 전사 개시 서열, 종결 서열, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 리프레서 서열, 스플라이스 부위 서열, 폴리아데닐화 (폴리A) 신호 서열, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 내인성 프로모터, 합성 프로모터, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 (예컨대, CNS 특이적), 또는 세포 특이적 프로모터 (뉴런, 아교 세포, 또는 성상세포)이다. 구성적 프로모터의 예로는 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의적으로, RSV 인핸서와 함께), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의적으로, CMV 인핸서와 함께), SV40 프로모터, 및 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예로는 아연 유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex) 유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템, 엑다이손 곤충 프로모터, 테트라사이클린 억제성 시스템, 테트라사이클린 유도성 시스템, RU486 유도성 시스템, 및 라파마이신 유도성 시스템을 포함한다. 사용될 수 있는 프로모터의 추가의 예로는 예를 들면, 닭 베타-액틴 프로모터 (CBA 프로모터), CAG 프로모터, H1 프로모터, CD68 프로모터, JeT 프로모터, 시냅신 프로모터, RNA pol II 프로모터, 또는 RNA pol III 프로모터 (예컨대, U6, H1 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 조직 특이적 RNA pol II 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 조직 특이적 RNA pol II 프로모터는 뉴런 특이적 발현을 나타내는 유전자로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 뉴런 특이적 프로모터는 시냅신 1 프로모터 또는 시냅신 2 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 H1 프로모터이다. 일부 실시양태에서, H1 프로모터는 본원에서 "네이티브" H1 프로모터로서 지칭되는 프로모터, 예컨대, 서열 번호: 53에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 본원에서 "쇼트" H1 프로모터로서 지칭되는 프로모터, 예컨대, 서열 번호: 54에 제시된 서열, 또는 서열 번호: 17, 25-28, 및 37-44 중 어느 하나의 뉴클레오티드 113-203을 포함하거나 또는 이로 구성되는 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 본원에서 "롱" H1 프로모터로서 지칭되는 프로모터, 예컨대, 서열 번호: 52에 제시된 서열, 또는 서열 번호: 13-16 및 18-24 중 어느 하나의 뉴클레오티드 113-343을 포함하거나 또는 이로 구성되는 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 종결 서열은 SV40 종결 서열이다. SV40 종결 서열의 예는 서열 번호: 77; 서열 번호: 20, 21, 23, 및 24 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-710; 서열 번호: 31, 32, 35, 및 36 중 어느 하나의 뉴클레오티드 358-579; 서열 번호: 40, 41, 및 44 중 어느 하나의 뉴클레오티드 349-570에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 억제성 핵산을 코딩하는 서열은 발현 작제물의 비번역 영역에 위치한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 억제성 핵산을 코딩하는 서열은 발현 작제물의 인트론, 5' 비번역 영역 (5 'UTR), 또는 3' 비번역 영역 (3'UTR)에 위치한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 억제성 핵산을 코딩하는 서열은 프로모터의 하부 및 발현된 유전자의 상부의 인트론 내에 위치한다.
벡터 및 숙주 세포
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 벡터 스터퍼 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터의 예로는 헤르페스바이러스 (HSV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스 (예컨대, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 벡터), 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스 또는 조류 세망내피증 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV (HIV 타입 1 및 HIV 타입 2를 포함하는 인간 면역결핍증 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스, 고양이 면역결핍증 바이러스 (FIV), 소 면역결핍증 바이러스 (BIV) 및 원숭이 면역결핍증 바이러스 (SIV), 말 감염성 빈혈 바이러스, 또는 매디-비스나 바이러스 벡터(Maedi-Visna viral vector)이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터, 예컨대, 재조합 방법에 의해 제조된, 재조합 AAV (rAAV) 벡터이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 본 개시내용의 벡터 스터퍼 서열 및 이종성 핵산 서열 (예컨대, 억제성 핵산을 코딩하는 것)을 포함하는 발현 작제물을 포함한다. 벡터 스터퍼 서열은 이종성 핵산을 포함하는 발현 작제물 5' 또는 3'에 인접하게 위치할 수 있다.
AAV는 바이러스 게놈의 복제 기점 역할을 하는 2개의 ITR이 측면에 있는 복제 (rep) 및 캡시드 (Cap)에 대한 단백질을 코딩하는 게놈을 갖는 단일 가닥 외피 비보유 DNA 바이러스이다. AAV는 패키징 서열도 포함하며, 이로써, 바이러스 게놈을 AAV 캡시드 내로 패키징할 수 있다. 재조합 AAV 벡터 (rAAV) (이는 또한 rAAV 벡터 게놈 또는 rAAV 게놈으로도 지칭)는 AAV로부터 야생형 게놈 (예컨대, Rep, Cap) 모두 또는 그 일부를 제거하고, 이를 비-천연 핵산, 예컨대, 이종성 핵산 서열 (예컨대, 억제성 핵산을 코딩하는 핵산 분자)로 대체하는 분자 방법을 사용함으로써 AAV의 야생형 게놈으로부터 수득될 수 있다. 전형적으로, AAV의 경우, 역 말단 반복부 (inverted terminal repeat; ITR) 서열 중 하나 또는 둘 모두는 rAAV 벡터 내에 보유된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 발현 작제물 및 벡터 스터퍼 서열 측면에 위치하는 5' 역 말단 반복부 (ITR) 및 3' ITR을 포함한다. 기능적 ITR 서열은 AAV 바이러스 입자를 구제, 복제 및 패키징하는 데 필요하다. 따라서, rAAV 벡터는 본원에서 바이러스의 복제 및 패키징 (예컨대, 기능적 ITR)을 위해 적어도 시스로 요구되는 서열을 포함하는 것으로 정의된다. 다른 모든 바이러스 서열은 트랜스로 공급될 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 벡터에 의해 효율적으로 패키징될 수 있는 트랜스진의 크기를 최대화하기 위해 AAV 게놈으로부터의 5' ITR 및 3' ITR만을 보유한다. 일부 실시양태에서, 각각의 AAV ITR은 전장 ITR (예컨대, 길이가 대략 145 bp이고, 기능적 Rep 결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs) 포함)이다. 일부 실시양태에서, ITR이 기능적 구제, 복제 및 패키징을 제공한다면, ITR 중 하나 또는 그 둘 모두 예컨대, 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형된 ITR에는 기능적 말단 분해 부위 (trs)가 결여되어 있고, 자가-상보성 AAV 벡터 (scAAV 벡터) 제조에 사용된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' 측에 돌연변이 ITR (말단 분해 부위 결여) 및 3' 측에 야생형 AAV ITR을 포함하는 자가-상보성 AAV 벡터이다. 말단 분해 부위가 결여된 돌연변이 5' ITR의 예는 서열 번호: 57, 또는 서열 번호: 13-24, 29-44, 및 78-82 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1-106에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 ITR은 AITR로 지칭되는 AAV2 ITR의 말단절단된 버전 (D-서열 및 TRS 결실)이다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열 번호: 57, 또는 서열 번호: 13-24, 29-44, 및 78-82 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열 번호: 58, 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2192-2358, 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2214-2358, 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 2229-2395, 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 2251-2395, 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 2184-2350, 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 2206-2350; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 2206-2350; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 2206-2350; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 2161-2305; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 2161-2305; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 2161-2305; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 2161-2305; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 2266-2410; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 2224-2368; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 2225-2369; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 2266-2410; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 2224-2368; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 2225-2369; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 2257-2401; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 2258-2402; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 2215-2359; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 2207-2351; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 2207-2351; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 2257-2401; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 2215-2359; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 2207-2351; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 2258-2402; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 2267-2411; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 2251-2395; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 2251-2395; 서열 번호: 82의 뉴클레오티드 2187-2331을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 서열 번호: 57을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 58을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 13의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 13의 뉴클레오티드 2192-2358을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 14의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 14의 뉴클레오티드 2192-2358을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 15의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 15의 뉴클레오티드 2192-2358을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 16의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 16의 뉴클레오티드 2192-2358을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 2229-2395을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 2184-2350을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 13의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 13의 뉴클레오티드 2214-2358을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 14의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 14의 뉴클레오티드 2214-2358을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 15의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 15의 뉴클레오티드 2214-2358을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 16의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 16의 뉴클레오티드 2214-2358을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 2251-2395를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 2206-2350을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 2206-2350을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 2216-2360을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 2216-2360을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 2206-2350을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 2216-2360을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 2216-2360을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 2161-2305를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 2161-2305를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 2161-2305를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 2161-2305를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 2266-2410을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 2224-2368을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 2216-2360을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 2225-2369를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 2266-2410을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 2224-2368을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 2216-2360을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 2225-2369를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 2257-2401을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 2258-2402를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 2215-2359를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR;서열 번호: 40의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 2207-2351을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 2207-2351을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 2257-2401을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 2215-2359를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 2207-2351을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 2258-2402를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 2267-2411을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 2251-2395를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 2251-2395를 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR; 또는 서열 번호: 82의 뉴클레오티드 1-106을 포함하거나 또는 이로 구성되는 5' ITR 및 서열 번호: 82의 뉴클레오티드 2187-2331을 포함하거나 또는 이로 구성되는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 영장류 혈청형 AAV 벡터 또는 인간 혈청형 AAV 벡터를 비롯한, 포유동물 혈청형 AAV 벡터 (예컨대, AAV 게놈 및 포유동물 혈청형 AAV로부터 유래된 ITR)이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 키메라 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV 12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8, AAV-DJ, AAV- PHP.A, AAV-PHP.B, AAVPHP.B2, AAVPHP.B3, AAVPHP.N/PHP.B-DGT, AAVPHP.B- EST, AAVPHP.B-GGT, AAVPHP.B-ATP, AAVPHP.B-ATT-T, AAVPHP.B-DGT-T, AAVPHP.B-GGT-T, AAVPHP.B-SGS, AAVPHP.B-AQP, AAVPHP.B-QQP, AAVPHP.B- SNP(3), AAVPHP.B-SNP, AAVPHP.B-QGT, AAVPHP.B-NQT, AAVPHP.B-EGS, AAVPHP.B-SGN, AAVPHP.B-EGT, AAVPHP.B-DST, AAVPHP.B-DST, AAVPHP.B-STP, AAVPHP.B-PQP, AAVPHP.B-SQP, AAVPHP.B-QLP, AAVPHP.B-TMP, AAVPHP.B-TTP, AAVPHP.S/G2A12, AAVG2A 15/G2A3, AAVG2B4, AAVG2B5, 또는 이의 변이체의 AAV 혈청형으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 이종성 핵산 서열은 치료제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 치료 단백질 또는 억제성 핵산을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 dsRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 신경변성 질환 관련 유전자를 표적화하는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 dsRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경변성 질환은 척수소뇌실조증-2, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽 치매, 원발성 측삭 경화증, 진행성 근위축증, 변연계 우세 연령 관련 TDP-43 뇌병증, 만성 외상성 뇌병증, 루이소체 치매, 피질기저 퇴행, 진행성 핵상 마비 (PSP), 괌의 치매 파킨슨병 ALS 복합증 (G-PDC), 피크병, 해마 경화증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 또는 알츠하이머병이다. 일부 실시양태에서, 신경변성 질환은 폴리글루타민 반복 질환이다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산 (예컨대, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 dsRNA)은 ATXN2를 표적화한다. 일부 실시양태에서, ATXN2는 인간 ATXN2를 비롯한, 포유동물 ATNX2를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 발현 작제물은 ATXN2를 표적화하는 인공 miRNA를 코딩되는 이종성 핵산을 포함한다. 가이드 서열 및 패신저 서열 및 ATXN2를 표적화하는 인공 miRNA를 코딩되는 이종성 핵산의 예는 표 5에 제공되어 있다. 코딩된 가이드, 패신저, 및 인공 miRNA 서열의 RNA 포맷 뿐만 아니라, 시스 플라스미드 및 rAAV 벡터 내로의 삽입을 위한 DNA 포맷 또한 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 ATXN2를 표적화하는 인공 miRNA를 코딩하고, 서열 번호: 1-4 및 71로부터 선택되는 가이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 1에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 5에 의해 제공된 패신저 서열을 포함하는 인공 miRNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 2에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 6에 의해 제공된 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 3에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 7에 의해 제공된 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 4에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 8에 의해 제공된 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 71에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 72에 의해 제공된 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 miRNA 백본 (또는 스캐폴드)에 내장된 가이드 서열 및 패신저 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA 백본은 miR-100 또는 miR-1-1이다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 서열 번호: 9-12 및 73 중 어느 하나에 의해 제공된 인공 miRNA 서열을 코딩한다. ATXN2를 표적화하는 가이드 서열, 패신저 서열, miR 백본, 및 인공 miRNA 서열의 추가 예는 PCT 공개 WO2021/159008 (이는 그 전문이 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.
전사 개시 서열, 종결 서열, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 리프레서 서열, 스플라이스 부위 서열, 폴리아데닐화 (폴리A) 신호 서열, 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상의 것을 비롯한 다른 발현 제어 서열은 (예컨대, 억제성 핵산을 코딩하는 것과 같은) 이종성 핵산에 작동가능하게 연결된 rAAV 벡터에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 H1 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, H1 프로모터는 네이티브 H1 프로모터, 예컨대, 서열 번호: 53에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 쇼트 H1 프로모터, 예컨대, 서열 번호: 54에 제시된 서열, 또는 서열 번호: 17, 25-28, 및 37-44 중 어느 하나의 뉴클레오티드 113-203을 포함하거나 또는 이로 구성되는 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 롱 H1 프로모터, 예컨대, 서열 번호: 52에 제시된 서열, 또는 서열 번호: 13-16 및 18-24 중 어느 하나의 뉴클레오티드 113-343을 포함하거나 또는 이로 구성되는 프로모터이다. 일부 실시양태에서, H1 프로모터는 특히 5' ITR에 말단 분해 부위가 결여되어 있을 때, 발현 작제물에서 5'에서 3' 방향으로 배향된다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 SV40 종결 서열을 포함한다. SV40 종결 서열의 예는 서열 번호: 77; 서열 번호: 20, 21, 23, 및 24 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-710; 서열 번호: 31, 32, 35, 및 36 중 어느 하나의 뉴클레오티드 358-579; 서열 번호: 40, 41, 및 44 중 어느 하나의 뉴클레오티드 349-570에 제시되어 있다.
rAAV 벡터에서는 하나 이상의 AAV 야생형 유전자가 전체적으로 또는 부분적으로 결실되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 복제 결함성이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터에는 기능적 Rep 단백질 및/또는 캡시드 단백질이 결여되어 있다. rAAV 벡터는 자가-상보성 AAV (scAAV) 벡터이다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR, ATXN2 특이적 인공 miRNA를 코딩하는 이종성 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터, 벡터 스터퍼 서열, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' ITR은 말단 분해 부위가 결여되도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 5'에서 3' 방향으로 배향된다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 13-24, 29-44, 및 78-80 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 13에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 14에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 15에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 16에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 17에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-335는 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 18에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 19에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 20에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 21에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 22에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 23에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 24에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 344-481은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 29에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-350은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 30에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-350은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 31에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-350은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 32에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-350은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 33에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-350은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 34에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-350은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 35에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-350은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 36에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-350은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 37에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-341은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 38에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-341은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 39에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-341은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 40에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-341은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 41에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-341은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 42에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-341은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 43에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-341은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 44에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-341은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 78에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-342는 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 79에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 213-351은 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 80에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-335는 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 5' ITR에서 3' ITR로 서열 번호: 81에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 204-335는 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된다.
본 개시내용의 재조합 AAV 벡터는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화될 수 있고, 이로써, rAAV 입자를 형성할 수 있다. "rAAV 입자" 또는 "rAAV 비리온"은, 5' AAV ITR 및 3' AAV ITR이 각 측면에 있는, 목적한 트랜스진을 포함하는 rAAV 벡터를 캡시드화하는, AAV 단백질 쉘을 포함하는 감염성, 복제 결함성 바이러스를 지칭한다. rAAV 입자는 숙주 세포가 후속 유전자 전달을 위해 감염성 rAAV 입자 내로 (목적한 트랜스진 서열을 함유하는) rAAV 벡터를 패키징하는 데 필요한 AAV 폴리펩티드를 코딩할 수 있도록 rAAV 벡터에 그에 도입된 AAV 헬퍼 기능 및 보조 기능을 부여하는 서열을 갖는 적합한 숙주 세포에서 생산된다.
숙주 세포 배양물을 사용하여 재조합 AAV 벡터를 AAV 캡시드 단백질 내로 패키징하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터를 패키징하는 데 필요한 성분 (예컨대, Rep 서열, cap 서열, 및/또는 보조 기능) 중 하나 이상의 것은 (예컨대, 벡터에 의해) 하나 이상의 필요한 성분을 함유하도록 조작된 적합한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. AAV 패키징에 필요한 성분의 발현은 세포를 패키징하는 숙주 내에서 유도성 또는 구성적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. AAV 헬퍼 벡터는 일반적으로 트랜스로 작용하는 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 일시적인 발현을 제공함으로써, AAV 복제에 필요한 상실한 AAV 기능을 보완하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, AAV 헬퍼 벡터에는 AAV ITR이 결여되어 있고, 그 스스로는 복제하거나 패키징할 수 없다. AAV 헬퍼 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자는 삼중 형질감염 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 6,001,650 (상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함) 참조). 상기 접근법에서, rAAV 입자는 rAAV 입자 내로 패키징되는 (트랜스진을 포함하는) rAAV 벡터, AAV 헬퍼 벡터, 및 보조 기능 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출가능한 야생형 AAV 비리온 (예컨대, 기능적 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하지 않고 효율적인 AAV 벡터 제조를 지원한다. 보조 기능 벡터는 복제를 위해 AAV가 의존하는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능 (예컨대, "보조 기능")을 위한 뉴클레오티드 서열을 코딩한다. 보조 기능은 제한없이, AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, 캡 발현 생성물 합성 및 AAV 캡시드 어셈블리에 관여하는 숙주 모이어티를 포함하는, AAV 복제에 필요한 기능을 포함한다. 바이러스 기반 보조 기능은 예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (단순 헤르페스 바이러스 타입 1 제외) 및 백시니아 바이러스와 같은 알려진 헬퍼 바이러스 중 임의의 것으로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 헬퍼 기능 및 보조 기능이 단일 벡터에 클로닝되는 이중 형질감염 방법은 rAAV 입자를 생성하는 데 사용된다.
AAV 캡시드는 rAAV 입자의 이러한 조직 특이성을 결정하는 데 중요한 성분이다. 따라서, 캡시드 조직 특이성을 갖는 rAAV 입자가 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV 12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8, AAV-DJ, AAV- PHP.A, AAV-PHP.B, AAVPHP.B2, AAVPHP.B3, AAVPHP.N/PHP.B-DGT, AAVPHP.B- EST, AAVPHP.B-GGT, AAVPHP.B-ATP, AAVPHP.B-ATT-T, AAVPHP.B-DGT-T, AAVPHP.B-GGT-T, AAVPHP.B-SGS, AAVPHP.B-AQP, AAVPHP.B-QQP, AAVPHP.B- SNP(3), AAVPHP.B-SNP, AAVPHP.B-QGT, AAVPHP.B-NQT, AAVPHP.B-EGS, AAVPHP.B-SGN, AAVPHP.B-EGT, AAVPHP.B-DST, AAVPHP.B-DST, AAVPHP.B-STP, AAVPHP.B-PQP, AAVPHP.B-SQP, AAVPHP.B-QLP, AAVPHP.B-TMP, AAVPHP.B-TTP, AAVPHP.S/G2A12, AAVG2A 15/G2A3, AAVG2B4, AAVG2B5, 및 이의 변이체의 AAV 혈청형으로부터 선택된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 예컨대, AAV9, AAVrh.10, AAV-PHP-B, 또는 이의 변이체와 같은, 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 통과할 수 있는 혈청형으로부터 선택된다. AAV9 캡시드 서열의 예는 미국 특허 번호 7,906,111 (상기 특허는 그 전문이 참조로 포함된다)에 제공되어 있다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 키메라 AAV 캡시드이다. 일부 실시양태에서, AAV 입자는 상이한 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 및 게놈을 갖는 슈도타입 AAV이다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자는 CNS의 세포를 형질도입시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 CNS의 비-뉴런 세포 또는 뉴런 세포를 형질도입시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CNS 세포는 뉴런, 교질 세포, 성상세포, 또는 소교 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 벡터 스터퍼 서열을 포함하는 rAAV 입자로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 (예컨대, HEK293T, COS 세포, HeLa 세포, KB 세포), 박테리아 세포 (이. 콜라이(E. coli)), 효모 세포, 곤충 세포 (Sf9, Sf21, 드로소필라(Drosophila), 모기) 등이다.
사용 방법
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물 (예컨대, 본원에 제공된 벡터 스터퍼 서열 및 치료제를 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자)을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 치료제를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 CNS 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CNS의 비-뉴런 세포 또는 뉴런 세포이다. 일부 실시양태에서, CNS의 비-뉴런 세포는 교질 세포, 성상세포, 또는 소교 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내의 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 신경변성 질환의 하나 이상의 증상을 앓거나, 또는 신경변성 질환을 앓는 것으로 의심되는 대상체로부터 유래된 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은, "치료하다"라는 용어는 신경변성 질환 (예컨대, ALS/FTD, 알츠하이머병, 파킨슨병 등)의 발병을 예방 또는 지연시키거나; 신경변성 질환의 중증도를 감소시키거나; 신경변성 질환의 특징이 되는 증상의 발달을 감소 또는 예방하거나; 신경변성 질환의 특징이 되는 증상의 악화를 방지하는 것, 또는 이의 임의의 조합을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 신경변성 질환을 앓거나, 또는 신경변성 질환이 발달할 위험이 있는 대상체이다. 신경변성 질환의 예로는 척수소뇌실조증-2, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽 치매, 원발성 측삭 경화증, 진행성 근위축증, 변연계 우세 연령 관련 TDP-43 뇌병증, 만성 외상성 뇌병증, 루이소체 치매, 피질기저 퇴행, 진행성 핵상 마비 (PSP), 괌의 치매 파킨슨병 ALS 복합증 (G-PDC), 피크병, 해마 경화증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 및 알츠하이머병을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법은 신경변성 질환의 특징이 되는 하나 이상의 증상의 발달 또는 진행을 감소, 예방 또는 지연시킨다. 신경변성 질환의 특징이 되는 증상의 예로는 운동 기능 장애, 인지 기능 장애, 감정/행동 기능 장애, 또는 또는 이의 임의의 조합, 마비, 떨림, 불안정증, 뻣뻣함, 연축, 근육 약화, 근육 경련, 근육 강직성, 근 위축증, 연하 곤란증, 호흡 곤란증, 언어 장애(speech and language difficulty) (예컨대, 불분명한 발음(slurred speech)), s느린 운동, 보행 곤란, 치매, 우울증, 불안, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 본 개시내용의 치료 방법은 단일요법으로서, 또는 신경변성 질환의 치료를 위한 하나 이상의 추가 요법과 함께 투여하는 것을 포함한다. 조합 요법은 하나 이상의 추가 요법과 동시에, 그 전에, 또는 그에 후속하여 대상체에게 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것을 의미할 수 있다. 조합 요법의 동시 투여는 본 개시내용의 조성물 및 추가 요법이 동일한 투여 형태로 투여되도록 제제화되거나, 또는 별도의 투여 형태로 투여되는 것을 의미할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 방법으로 치료되는 대상체는 포유동물 (예컨대, 마우스, 래트), 바람직하게, 영장류 (예컨대, 원숭이, 침팬지) 또는 인간이다.
본원에 기술된 임의의 방법에서, 본 개시내용의 조성물은 장관 (예컨대, 경구), 비경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척수강내, 연막하, 실질내, 선조체내, 두개내, 수조내, 뇌내, 뇌내 뇌실, 안구내, 뇌실내, 요추내, 피하, 경피, 진피내, 직장, 질내, 복강내, (산제, 연고, 크림 및/또는 점적제에 의해서와 같은) 국소, 점막, 비강, 협측, 설하; 기관내 점적주입, 기관지 점적주입 및/또는 흡입에 의해; 및/또는 구강 스프레이, 비강 스프레이 및/또는 에어로졸로서의 경로를 비롯한, 임의의 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일반적으로 가장 적절한 투여 경로는 작용제의 성질 (예컨대, 위장관 환경에서의 이의 안정성) 및/또는 대상체의 병태를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 CNS 내로 직접 주사된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 척수강내, 연막하, 실질내, 선조체내, 두개내, 수조내, 뇌내, 뇌내 뇌실, 안구내, 뇌실내, 요추내 투여, 또는 이의 임의의 조합에 의해 주사된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 대상체의 CNS 내로 직접 주사된다. 일부 실시양태에서, CNS 내로의 직접 주사는 뇌내 주사, 실질내 주사, 척수강내 주사, 선조체내 주사, 연막하 주사(subpial injection), 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, CNS 내로의 직접 주사는 대상체의 뇌척수액 (CSF) 내로의 직접 주사이고, 임의적으로 여기서 직접 주사는 수조내 주사(intracisternal injection), 뇌실내 주사, 요추내 주사, 또는 이의 임의의 조합이다.
실시예
실시예
1: 벡터 "
스터퍼
" 서열의 디자인
베이스
스터퍼
서열을 위한 '
비필수
" 인간 게놈 DNA의 선택
스터퍼 서열의 비바람직한 영향을 최소화하기 위해, 2가지 의도된 특성을 갖는 인간 게놈의 "비필수" 영역을 확인하였다: (a) (AAV의 경우 매우 드문 것으로 간주되지만) 게놈에서 통합이 발생하는 경우, 최소한의 영향을 미치는 서열; 및 (b) 예상 밖의 전사를 개시할 위험이 최소인 서열. 따라서, i) 결실 및 중복이 집단에서 일반적이고, 질환 관련 표현형과 연관이 없는 (진화적 압력의 증거 없음) 게놈 영역; 및/또는 ii) 인간 조직 간에 걸친 RNA 발현이 낮거나, 또는 검출불가능한 (강력한 내인성 인핸서/프로모터 요소가 결여된) 게놈 영역을 조사하였다. 이러한 검색으로부터 두 영역이 우선화되었다:
영역 I:
AMELY
유전자 영역 (
chrY:6,865,918
-6,874,027, HG38)
다중의 증거 라인은 AMELY 유전자 영역이 진화적 선택하에 있지 않다는 것을 시사한다. 첫째, AMELY 영역은 아주 오래된 복제 이벤트에서 발생하였고, 선택 중인 염색체 X에 기능적 호몰로그를 가지고 있다 (문헌 [Lahn, & Page, Science (1999) 286, 964-967]). 둘째, AMELY 유전자는 최근 양성 선택의 증거가 없는 예상보다 더 많은 단백질 변경 변이체 (예측되는 기능적 변이체 손실 포함)를 가지고 있다 (문헌 [Nature (2020) 581, 434-443]; https://gnomad.broadinstitute.org/gene/ENSG00000099721?dataset=gnomad_r2_1). 셋째, AMELY 영역의 유전적 변이체는 결실 또는 중복에 대해 인간에서 표현형에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. AMELY 중복은 일반적이며, 표현형은 없다 (문헌 [Hum Genet. (2015) 134:789-800]). 넷째, 결실은 일반적이며, 검출가능한 표현형은 없다 (문헌 [Hum Mol Genet (2007) 16:307-16]). 추가로, AMELY는 어떤 희귀 인간 질환과도 연관이 없다 (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM.org.)
AMELY mRNA는 대부분의 인간 조직에서 검출가능하게 발현되지 않으며 (GTEX, The GTEx Consortium. (Science (2020) 369:1318-1330)), 염색체 Y 보인자 (남성)에만 존재한다. 추가로, AMELX (AMELY의 기능적 호몰로그)는 발달 동안 치아 법랑질에 관여한다 (문헌 [Front Physiol. (2017) 8:435]).
영역 II:
PSG
유전자 영역 (
chr19:43
,511,809-43,530,631, HG38)
유사하게, 다중의 증거 라인은 임신 특이적 당단백질 (PSG)이 명확한 진화적 선택하에 있지 않다는 것을 시사한다. 첫째, PSG 클러스터는 세그먼트 중복으로부터 발생하였다 (문헌 [Dumont and Eichler PLoS One (2013) 8:e75949]). 둘째, 영역이 예상보다 더 많은 기능 변이의 손실이 예측되는 진화적 제약을 받고 있다는 증거는 없다 (문헌 [Nature (2020) 581:434-443; https://gnomad.broadinstitute.org/gene/ENSG00000243130?dataset=gnomad_r2_1]). 셋째, PSG 클러스터는 어떤 희귀 인간 질환과도 연관이 없다 (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM.org).
PSG 영역은 전형적으로 임신 중 태반에서만 높게 발현되며, 다른 조직에서는 발현되지 않거나, 낮게 발현된다 (GTEX, The GTEx Consortium. (Science (2020) 369: 1318-1330).
베이스
스터퍼
서열 변형
서열을 "불활성" 상태로 만들거나, 또는 임의의 발현된 영역, 공지된 또는 예측된 조절 요소 및 반복 요소 (레트로바이러스 및 전이 요소 포함)가 결여되도록 하는 목적하에 AMELY 영역 (chrY:6,865,918-6,874,027, HG38) 및 PSG 유전자 영역 (chr19:43,511,809-43,530,631, HG38)으로부터 DNA 서열을 변형시켰다. 이러한 변이는 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 영역에서 사용되도록 의도된 스터퍼 서열에 대해 가장 엄격하게 수행되었다.
구체적으로, 베이스 서열 (chrY:6,865,918-6,874,027, HG38) 및 (chr19:43,511,809-43,530,631, HG38)을 하기 방식으로 변형시켰다 (도 1 참조):
i) 발현된 영역: 진뱅크(Genbank) 데이터: (문헌 [Nucleic Acids Res. (2004) 32(Database issue):D23-6])을 토대로 엑손 + 양측 10 bp (엑손은 GENCODEv19에서 유전자 모델을 이용하여 정의되었다), 인간 발현된 서열 태그 (EST: UCSC 게놈 브라우저 상의 "Human ESTs Including Unspliced" 트랙을 이용하여 정의) 제거.
ii) 조절 요소 제거: UCSC 게놈 브라우저 상의 하기 트랙을 사용하여 CpG 아일랜드(CpG Islands) (문헌 [J Mol Biol. (1987) 196(2):261-82]), CHiP seq에 의해 확인된 영역 (전사 인자에 의해 결합되는 서열), ENCODE 3으로부터의 전사 인자 ChIP-seq 피크(Transcription Factor ChIP-seq Peaks) (129개의 세포 유형에서 340개의 인자) (문헌 [Nature (2012) 489(7414):57-74.]), 보존되는 전사 인자 결합 부위(Transcription Factor Binding Sites) (HMR 보존되는 전사 인자 결합 부위(HMR Conserved Transcription Factor Binding Sites) 트랙), VISTA 인핸서 (LBNL 트랙으로부터 비스타 HMR-보존된 비-코딩 인간 인핸서(Vista HMR-Conserved Non-coding Human Enhancers)), 및 오픈 조절 주석(Open Regulatory Annotation) "ORegAnno" (ORegAnno 트랙으로부터의 조절 요소; (문헌 [Nucleic Acids Res. (2016) 44(D1):D126-32.]))를 정의하였다.
iii) 반복 요소: 리피트마스커 트랙 (http://www.repeatmasker.org)에 의한 반복 요소를 이용하는 반복 마스킹된 요소 (SINE,LINE, LTR, DNA 요소), 마이크로새틀라이트 - 디뉴클레오티드 및 트리뉴클레오티드 반복부 트랙에 의해 정의된 마이크로새틀라이트 반복부 (문헌 [Nucleic Acids Res. (1999) 27(2):573-80]), 및 리피트마스커 (http://www.repeatmasker.org)에 의해 정의된 개재 및 단순 반복부 제거.
iv) 예상 밖의 번역 가능성을 감소시키기 위해, ATG 서열 빈도가 감소되도록 ATG 잔기를 변형시켰다.
v) CpG 디뉴클레오티드 편집. AAV에 패키징될 때 선천 면역 활성화를 유발하는 박테리아에서 생성된 시스 플라스미드로부터 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드의 가능성을 저하시키기 위해, 염기를 편집함으로써 CG 디뉴클레오티드의 존재를 감소시켰다.
실시예
2:
스터퍼
폴리뉴클레오티드를 사용하여
패키징된
AAV
벡터 게놈의 안전성 평가
어떤 추가 활성 요소 (예컨대, miRNA)도 포함하지 않고, 실시예 1에 따라 기술된 스터퍼 서열을 포함하는 벡터를 생체내 안전성에 대해 시험하였다. AMELY 및 PSG11 유래 스터퍼 각각 두 변이체를 포함하는 4개의 벡터 세트를 디자인하였다 (서열 번호: 25-28). 각 벡터는 좌측 ITR (서열 번호: 57)의 바로 하류인 5' 측에 H1 쇼트 프로모터를 포함하고, H1 쇼트 프로모터 하류 miRNA 대신 비-miRNA 제어 서열을 포함하였다. Pol III 종결인자는 제어 서열의 3'에 위치한다. 동시에, 3개의 대조군을 시험하였다: 비히클; H1 프로모터의 제어하에, HeLa 및 U2OS 세포 상에서 렌티바이러스 포맷으로 시험되었을 때 독성을 나타내는 것으로 앞서 밝혀진 ATXN2를 표적화하는 인간 miRNA 서열을 코딩하는 벡터 (scAAV_H1_miR16-2-1479_AMELY_V1 (서열 번호: 81)); 및 Atxn2 특이적 miRNA 뿐만 아니라, GFP를 코딩하는 벡터 (scAAV_H1_miR1-1-XD-14792_CBh_GFP_SV40p (서열 번호: 82)). 가정컨대, 특이적 인공 miRNA 서열의 오프-표적 효과를 통해 독성을 나타내는 것으로 앞서 밝혀진 인공 miRNA를 독성에 대한 양성 대조군으로서의 역할을 하는 것으로 선택하였다.
벡터를 16주령된 야생형 C57Bl/6 마우스에 꼬리 정맥을 통해 1.3E11 총 바이러스 게놈 (vg)으로 정맥내로 투여하였다. 칼럼 정제된 벡터의 DNA 농도에 기초하여 역가를 측정하였다. 상기 농도를, 벡터 게놈 qPCR에 의해서도 또한 적정된 유사하게 정제된 벡터의 농도와 비교하여 본 실시예에 기술된 스터퍼 벡터에 대한 상응하는 역가를 계산하였다. 혈액을 프로세싱하고, 혈청을 임의의 각 독성에 대한 프록시로서 간 효소 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)의 농도에 대해 평가하였다. 독성 양성 대조군 인공 miRNA를 발현하는 벡터는 간 효소 ALT 및 AST의 상당한 상승을 유도하였다. 그에 반해, 스터퍼 서열을 포함하는 벡터 중 어느 것도 간 효소의 상승을 유도하지 못했다 (도 2a-2b).
병리학자에 의해 간을 조직학적으로 평가하여 임의의 독성을 평가하였다. 투여 28일 후, 동물 (n = 스터퍼 벡터 처리당 동물 5마리)을 희생시키고, 간을 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 침지 고정시켰다. 간당 2개의 횡단 절편을 파라핀에 포매시키고, 5 ㎛ 두께로 절편화하고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 올림푸스(Olympus) BX60 현미경으로 현미경 사진을 촬영하였다. 독성 양성 대조군 miRNA를 투여받은 동물은 타원형 세포 과형성(oval cell hyperplasia), 간세포 융합 및 다핵형성(multinucleation), 림프조직구성 간염(lymphohistiocytic hepatitis), 동모양 혈관 섬유증(sinusoidal fibrosis), 조직구내 색소(intrahistiocytic pigment) 및 희귀 단일 세포 아폽토시스/괴사를 비롯한 다수의 병변을 나타내었다. 스터퍼 함유 벡터에서, 조직학적 관찰결과는 치료 관련 경향을 따르지 않고, 여러 치료군에 걸쳐 관찰된 부수적인 배경 병변으로 제한되었다. 관찰결과는 간 글리코겐증(hepatic glycogenosis) (간세포 글리코겐 축적)의 변이와 희귀한 미세육아종(microgranuloma)을 포함하였다. 관찰결과는 화합물 관련 치료 독성을 반영하는 것으로 간주되지 않았다.
실시예
3: 특정
스터퍼
디자인에서 벡터 게놈
말단절단물
평가
rAAV 벡터 게놈 제제는 말단절단된 벡터 게놈을 포함하는 것으로 알려져 있으며, 이는 예컨대, miRNA와 같은 헤어핀 구조에서 뿐만 아니라, DNA 2차 구조의 다른 영역에서도 가장 두드러지게 나타나는 것이다. 따라서, 상이한 형태의 스터퍼 서열을 포함하는 rAAV의 제제 중 말단절단된 게놈의 존재를 평가하였다.
도 3a-3c는 단편 분석기 분석으로부터의 DNA 트레이스를 보여주는 것이다. rAAV 벡터 (scAAV9_H1_long_miR-100_3330_PSG11_V5 (서열 번호: 16)) 제조 후, 벡터 DNA를 추출하고, 칼럼 정제하고 (자이모(Zymo), P/N D3015), 애질런트 단편 분석기(Agilent Fragment Analyzer) (HS NGS 단편(HS NGS Fragment) 1-6000 bp)에서 전개시켰다. 이중-피크 트레이스를 관찰할 수 있고 (도 3a), 이들 이중 피크는, 한 부위에서 우측 야생형 ITR을 제거하는 제한 분해에 의해 분해되기 때문에 ITR을 함유하는 전장 구조물인 것으로 결정되었다. 더 짧은, 말단절단된 게놈을 나타내는, 의도된 전장 생성물의 좌측에 더 작은 숄더도 또한 존재한다. amiRNA에서 말단절단된 벡터 게놈을 나타내는, amiRNA 중앙에 위치하는 서브-피크가 다수의 제제에서 발견된다 (도 3d). 제어 서열이 amiRNA 대신 사용되지만, 예컨대, 회문구조 서열과 같은 2차 구조를 포함하는 경우, 유사한 피크가 존재한다.
도 3e-3f는 PSG11로부터 유래된 2가지 버전의 스터퍼 서열 (PSG11_V1 (서열 번호: 45) 및 PSG11_V2 (서열 번호: 46)) 중 하나를 함유하는 시스 플라스미드로부터 유래된 두 rAAV 제제 (scAAV9_H1_MCS_PSG11_V1 (서열 번호: 27) 및 scAAV9_H1_MCS_PSG11_V2 (서열 번호: 28))를 비교하는 것이다. 상기 서열은 비록 PSG11_V2에서 ATG 서열을 제거하기 위해 ATG가 편집되었지만, 구조상 유사하였다. 발현 카세트 (H1 프로모터 및 amiRNA 또는 도 3e에 제시된 벡터에서 제어 서열)에 인접한 스터퍼 서열의 5' 부분에 약간의 구조적 차이가 있었다. 트레이스는 PSG11_V1 함유 벡터 게놈 제제에서 전장 생성물의 왼쪽에 있는 '숄더'가 더 작다는 것을 보여준다 (도 3f). 상기 벡터 제제에서는 amiRNA가 사용되지 않았다.
도 3g-3h는 스터퍼 서열 PSG11_V1 (서열 번호: 45) 또는 PSG11_V2 (서열 번호: 46) 중 하나를 함유하는 시스 플라스미드로부터 유래된 유사한 두 rAAV 제제 (scAAV9_H1_miR-1-1-XD-14792_PSG11_V1 (서열 번호: 78) 및 scAAV9_H1_native_miR-1-1-XD-14792_PSG11_V2 (서열 번호: 79))의 세트를 비교하는 것이다. 상기 경우에서, 두 벡터 모두 H1 프로모터 하류에 amiRNA 요소를 함유한다 (V1 함유 벡터 대비 PSG11_V2-함유 벡터 상에서 프로모터 서열에 3개의 뉴클레오티드가 삽입되어 있지만, 그 외에 5' 서열은 동일하다). 단편 분석기 트레이스의 검사에 의하면, amiRNA 부위의 말단절단부는 PSG11_V2 스터퍼 서열을 함유하는 벡터에서 상당히 더 크다는 것을 알 수 있다.
예컨대, 본원에 기술된 것과 같은 자가-상보성 AAV (scAAV) 벡터의 복제는 야생형 ITR로부터의 복제 개시를 포함한다. 본원에 기술된 서열에서, 이는 시스 플라스미드의 3' 측에 있다. 따라서, 폴리머라제는 처음에 3'에서 5'로 amiRNA를 향해 스터퍼 서열을 지나 횡단하게 될 것이다. 말단절단된 생성물 증가에 대한 잠재적인 설명은 amiRNA의 헤어핀 바로 앞에서 폴리머라제가 만날 수 있는 2차 구조가 가닥 교환 활성을 촉진시켜 말단절단을 악화시키게 된다. 상기 가설과 일치하여, amiRNA의 3'에 바로 PSG11_V2 스터퍼 서열 (서열 번호: 56; 도 4b) 대비 PSG11_V1 스터퍼 서열 (서열 번호: 55; 도 4a) 내의 DNA 서열의 200개의 뉴클레오티드의 폴딩 조사 결과, PSG11_V2 스터퍼에서 예측된 2차 구조가 증가된 영역이 밝혀졌다. PSG11_V1 서열로부터의 바람직한 서열 구조를 이용하여 "PSG11_V5" 스터퍼 서열 (서열 번호: 48))을 생성하였다. 이는 말단절단된 벡터 게놈이 감소된 벡터 제제를 수득하기 위해 구상된다. 도입된 _V5 스터퍼는 CG 서열 및 ATG 서열을 편집하여 저메틸화된 CpG 디뉴클레오티드 또는 의도하지 않은 오픈 리딩 프레임의 가능성을 감소시킨다.
실시예
4:
Atxn2
amiRNA
발현 카세트와 조합되었을 때의
스터퍼
서열의
안
전성에 대한 추가 평가
다양한 스터퍼 서열을 포함하는 24개의 상이한 벡터 디자인을 생체내 안전성에 대해서 평가한 실험을 수행하였다. H1 프로모터의 3개의 상이한 변이체 (H1 쇼트 (서열 번호: 54), H1 네이티브 (서열 번호: 53), H1 롱 (서열 번호: 52)), 2개의 상이한 ATXN2 표적화 인공 miRNA (3330 또는 14792 (또한 본원에서 1784로도 지칭))/miR 백본 (miR1.1. 또는 miR100) 조합 (miR100_3330 (encoding 서열 번호: 12 코딩); miR1.1_14792 (서열 번호: 73 코딩)), Pol-II 전사 종결인자 SV40 폴리아데닐화 서열의 존재 또는 부재, 및 상이한 버전의 스터퍼 서열 (AMELY_V3 (서열 번호: 51), PSG11_V2 (서열 번호: 46), PSG11_V3 (서열 번호: 47), PSG11_V5 (서열 번호: 48))를 다양한 조합으로 어셈블리하였다 (표 1 참조). 이전 실시예에서와 같이, 상기 벡터에서 H1 프로모터는 자가-상보성 AAV 벡터로서 패키징을 위해 의도되는 시스 플라스미드에서 5'에서 3'으로 배향되어 있고, 여기서 (말단 분해 부위가 결여된) 돌연변이체 ITR은 5' 측에 위치하고 (예컨대, 서열 번호: 57 또는 서열 번호: 13-24, 29-44, 및 78-82 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1-106), 야생형 AAV ITR은 3' 측에 위치한다 (예컨대, 서열 번호: 58 또는 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2214-2358). 상기 프로모터 배향을 사용하는 이유는 말단 분해 부위가 결여된 ITR을 포함하는 벡터 (자가-상보성 AAV 벡터)에서 miR-중심 말단절단물이 가능하기 때문이다. 5'에서 3'으로의 프로모터 배향에서 miR-중심 말단절단물을 포함하는 벡터는 프로모터를 포함하지 않게 되는 바, 이는 불활성이어야 한다. 프로모터가 3'에서 5'로의 배향이라면, 프로모터는 miR-중심 말단절단물을 갖는 벡터에 유지될 수 있다.
상기 시스 플라스미드를 이용하여 rAAV 벡터를 생성하고, 벡터를 12주령된 야생형 C57Bl/6 마우스에 체중에 의해 조정된, 3.21E9 벡터 게놈/g 마우스의 용량 (평균 총 용량 8.5E10 벡터 게놈)으로 꼬리 정맥 주사에 의해 i.v. 투여하였다. 0.001% PF-68을 포함하는 PBS를 비히클 대조군 동물에 투여하였다. 다양한 벡터 디자인을 투여받은 동물에서 투여 2주 후 하악하 출혈에 의해 채혈하고, 간 효소 농도 (아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST) 및 알라닌 트랜스아미나제 (ALT)) (도 5a-5b)를 측정하였다. 스터퍼-함유 벡터로 처리된 동물에 대한 거의 모든 데이터 점은 정상 참조 범위 내에 있었다. 비록 데이터 점 2개가 참조 이상으로 상승된 AST 신호를 보이지만, 상기 샘플에서 용혈은 관찰되지 않았고, 한 샘플은 비히클로 처리된 동물로부터의 것이었다. 상기 시점에 벡터 포맷 중 임의의 것을 투여받은 동물로부터의 다른 샘플들 중 어느 것에서도 AST 또는 ALT는 참조 범위 이상으로 상승하지 않았고, 이는 상기 스터퍼 서열을 코딩하는 벡터를 사용한 rAAV 투여에 대한 반응으로 급성 간 손상이 있었다는 증거는 없었다는 것을 시사하는 것이다.
스터퍼 함유 벡터를 정맥내로 투여받은 동물을 또한 조직학에 의해 간 독성에 대해 평가하였다. 투여 3주 후, 동물당 2개의 연속 0.5 cm 좌측 간엽 절편을 수집하고, 파라핀에 포매시키고, 5 ㎛로 절편화하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 숙련된 병리학자에 의해 슬라이드를 평가하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 군당 N = 1-2마리의 동물을 평가하였다. 평가 후, 시험 물품의 정맥내 투여는 평가된 모든 벡터에 대해 검사된 간 절편에서의 변화와 연관이 있는 것으로 해석되지는 않았다.
선조체내
시험
8주령된 야생형 C57Bl/6 마우스에 상기 벡터를 또한 선조체당 7.5E9 벡터 게놈의 용량으로 선조체 내로 직접 주사하여 투여하고, 서브벡터 세트 (표 2, 상기)를 조직학적 관찰에 의해 독성에 대하여 평가하였다. 투여 3주 후 동물로부터의 선조체 절편을 파라핀에 포매시켰고, 5 ㎛ 블록 어드밴스로 절단된 4개의 연속 절편을 별개의 슬라이드에 마운팅하였다. 3개 수준으로부터의 단계 절편을 함유하는 2개 슬라이드로 이루어진 세트를 포함하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신, 교질 섬유 산성 단백질 (GFAP) 면역조직화학법, 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA-1) 면역조직화학법 및 플루오로-제이드 B(fluoro-jade B)로 염색하였다. 후자의 3가지 염료를 이용하여 각각 성상세포 반응성, 소교 세포 반응성, 및 뉴런 사멸을 평가할 수 있다.
벡터 i.v. 투여로 처리된 동물로부터의 간 절편과 같이, 검사된 뇌 절편에서는 어떤 시험 물품의 효과도 확인되지 않았다. 아티팩트 처리는 일부 조직에서 해석을 제한하였다. 일반적으로, 주사 부위에서 변화가 관찰되었으며, 가벼운 신경교증 (H&E 염색된 슬라이드에서 확인), 경미한 소교세포증 (GFAP 표지된 슬라이드에서 확인) 및 미세한 헤모시데린 색소를 동반한 조직의 경미한 파괴를 포함하였다. 헤모시데린 색소는 실질내 주사 시 흔히 나타나는 변화이다. 시험 물품은 임의 동물로부터의 기저 핵/선조체 수준에서 검사된 절편 중 임의의 것에서 실험 절차와 연관된 악화 또는 변화를 유발하는 것으로 해석되지는 않았다.
전사 분석
벡터의 안전성을 추가로 평가하기 위해, 상기 벡터를 투여받은 동물로부터의 선조체 펀치 생검에 대해 시퀀싱 분석을 수행하였다. 퀴아젠(Qiagen)의 올프렙 DNA/RNA/단백질 미니 키트(AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit) (퀴아젠, P/N 80004)를 사용하여 선조체 조직을 칼럼 정제하여 (DNase 처리 후) RNA를 추출하였다. 리보-제로 플러스(Ribo-Zero Plus) 키트 (일루미나(Illumina), P/N 20040525)를 이용하는 스트랜디드 토탈 RNA 프렙 라이게이션(Stranded Total RNA Prep Ligation), 이어서, 일루미나 Novaseq 6000 시스템에서의 페어드 엔드(paired end) 2 x 100 bp 시퀀싱으로 가닥 RNA-seq 라이브러리를 제조하였다. 이어서, 상기 리드를 상기 동물에게 투여된 rAAV를 패키징하는 데 사용된 각각의 시스 플라스미드에 정렬하였다. 별개로, 시퀀싱된 RNA (퀴아젠, P/N 80004)를 추출하는 데 사용된 것과 동일한 펀치 생검으로부터 DNA를 정제하고, 벡터 노출을 확인하였다. 표 3에는 벡터와 함께 시험된 각 샘플에 대한 노출이 열거되어 있다.
도 6은 대표적인 벡터로부터의 리드의 파일업을 보여주는 것이다. 놀랍게도, PSG11 V5 스터퍼 서열과 함께 H1 쇼트 프로모터 및 miR 1.1 백본을 사용하였을 때, 예상되는 프리-miRNA 전사의 하류의 시스 플라스미드에 정렬되는 리드 개수는 증가하였다. 그에 반해, PSG11 V5 스터퍼와 함께 H1 롱 프로모터를 사용하였을 때에는 의도하지 않은 전사는 유익하게 최소량으로 발생하였다. 따라서, 이러한 요소 조합은 비-miRNA 전사의 빈도가 원하는 정도로 낮은 벡터 아키텍쳐를 생성하였다.
실시예
5: 상이한
rAAV
벡터 포맷에서
Atxn2
amiRNA
발현 카세트와 조합되었을 때의 스터퍼 서열의 기능성 입증
실시예 4에 기술된 24개의 벡터 조합으로 이루어진 세트를 투여받은 동물을 또한 스터퍼, 프로모터, 및 ATXN2 표적화 인공 miRNA의 조합 모두의 기능성에 대해서도 평가하였다. i.v. 투여 (용량: 3.21E9 vg/g 마우스) 3주 후 간 조직으로부터 RNA를 추출한 후, Atxn2 및 대조군 프로브 Hprt를 이용하여 RT-ddPCR을 수행함으로써 Atxn2의 녹다운을 평가하였다. 상기 ATXN2/대조군 전사체 비의 평균으로서 Atxn2 수준을 계산하였고, 추가로, 비히클을 투여받은 동물에 대해 수득된 비로 정규화하였다. 벡터 게놈에 대한 프로브 및 마우스 게놈 프로브를 이용하여 ddPCR을 사용함으로써 벡터 게놈 노출 또한 측정하였다. 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 스터퍼 서열 및 miRNA 벡터 성분의 모든 조합으로 처리된 동물에서 강건한 Atxn2 녹다운이 발생하였다.
실시예
6: 상이한
rAAV
벡터 포맷에서
ATXN2
amiRNA
발현 카세트와 조합되었을 때의 생산 수율 및
스터퍼
서열의 말단절단물의 추가 평가.
실시예 4는 프로모터의 "H1 쇼트" 변이체와 비교하여 프로모터의 "H1 롱" 변이체를 PSG11_V5 스터퍼 서열 상류에 삽입하였을 때, 인공 miRNA 서열 하류의 전사 활성을 감소시키는 예상 밖의 이점을 보여준다. H1 롱 및 H1 쇼트 프로모터 및 AMELY 및 PSG11 유래 스터퍼 서열의 조합의 생산 수율 또한 평가하였다. 생산 수율은 스터퍼 영역에 특이적인 프라이머/프로브 세트를 사용하여 벡터 게놈의 ddPCR에 의해 평가하였다. 일반적으로, AMELY_V3 (서열 번호: 51), PSG11_V5 (서열 번호: 48), PSG11_V3 (서열 번호: 47), 및 PSG11_V2 (서열 번호: 46)를 포함한, 평가된 스터퍼 서열과 함께 H1 롱 포맷 프로모터 (서열 번호: 52) 조합을 포함하는 시 스 플라스미드를 사용하였을 때, 더 높은 생산 수율을 얻었다 (도 7). 벡터 말단절단물 분석 (도 8a-8c)은 H1 쇼트 프로모터와 비교하여 H1 롱 버전의 프로모터가 상류에 포함되었을 때, 말단절단물은 더 적다는 것을 추가로 제안하였다. 전체적으로 보면, 아마도 rAAV 복제 및 패키징에 영향을 미칠 수 있는 국부 DNA 2차 구조 요소로 인해 상기 스터퍼 서열 상류에 H1 롱 프로모터를 포함하는 것이 많은 놀라운 이점이 있다.
실시예
7: 인공
miRNA의
추가적인 조합과 함께
스터퍼
서열을 포함하는 벡터 제조
실시예 1에 따라 생성되고, 실시예 4에 기술된 바와 같은 프로모터 및 특정 스터퍼 서열의 조합을 함유하는 스터퍼 서열을 AAV 벡터 게놈의 일부로서 rAAV에 패키징될 수 있는 이의 능력에 대해 평가하였다. 벡터의 상이한 페이로드와 관련하여 일관되게 우수한 생산성을 달성할 수 있는 능력 또한 상기 스터퍼 서열에 대해 시험하였다.
PSG11 인트론 영역으로부터 유래되고, 실시예 1의 디자인 규칙에 따라 변형되고, 최적의 H1 롱 프로모터 변이체를 함유하는 스터퍼 서열을 다양한 ATXN2 표적화 인공 miRNA 패키징 카세트를 함유하는 벡터 세트에 패키징하였다. 5' ITR에서 3' ITR로의 시스 플라스미드 서열은 서열 번호: 13 (scAAV_H1_long_miR100_1755_PSG11_V5_ITR_to_ITR), 서열 번호: 14 (scAAV_H1_long_miR100_2586_PSG11_V5_ITR_to_ITR), 서열 번호: 15 (scAAV_H1_long_miR100_2945_PSG11_V5_ITR_to_ITR), 및 서열 번호: 16 (scAAV_H1_long_miR100_3330_PSG11_V5_ITR_to_ITR)에 제시되어 있다. amiRNA 가이드, 패신저, 및 발현 카세트에 대한 서열은 표 5에 제시되어 있다.
H1 프로모터 ("H1 롱") (서열 번호: 52 또는 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 113-343)를 벡터에 도입시켰다. 상기 벡터의 AAV 생산으로부터의 수율은 표 6에 열거되어 있다.
AMELY로부터의 스터퍼 서열을 여러 벡터에 패키징하였다. 5' ITR에서 3' ITR로 ATXN2 표적화 인공 miRNA 카세트 및 AMELY 스터퍼 서열을 함유하는 벡터 서열이 "H1_short_miR16-2-1755_AMELY_V1" (서열 번호: 17) 및 "H1-miR1-1_1784_AMELY_V3" (서열 번호: 18)에 대해 제공된다. 상기 벡터에서, AMELY에 대한 주석 "_V1" 또는 "_V3"은 AMELY 스터퍼 서열의 상이한 버전을 지칭하고, 여기서 "_V3" 버전에서 ATG 서열은 편집되고, CpG 디뉴클레오티드는 편집된 것이고 (서열 번호: 51 또는 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177) 및 "_V1"은 상기와 같이 변형되지 않은 것이다 (서열 번호: 49 또는 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222). H1_short는 H1 프로모터의 91 bp 말단절단된 형태 (서열 번호: 54 또는 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 113-203)를 지칭한다. 상기 벡터의 생산 수율은 표 7에 열거되어 있다.
실시예
8: 추가
amiRNA와
조합된
스터퍼
폴리뉴클레오티드를 이용하여
패키
징된 AAV 벡터 게놈의 기능성 입증
본원에 기술된 스터퍼 서열 및 추가 amiRNA를 포함하는 벡터 게놈 내로 도입되었을 때의 페이로드의 기능성을 시험하는 실험을 수행하였다. 이는 스터퍼 서열과 amiRNA 발현 카세트의 화합성을 추가로 확립한다. 상기 기술된 벡터는 모두 ATXN2를 표적화하는 인공 miRNA를 발현하고; ATXN2 표적의 녹다운에 의해 기능성을 결정한다.
한 실험에서, 표 8에 열거된 벡터를 인간 줄기 세포 유래 운동 뉴런에서 ATXN2 mRNA의 녹다운에 대해 평가하였다. -벡터는 scAAV_H1_long_miR100_1755_PSG11_V5_ITR_to_ITR.gb (서열 번호: 13), scAAV_H1_long_miR100_2586_PSG11_V5_ITR_to_ITR.gb (서열 번호: 14), scAAV_H1_long_miR100_2945_PSG11_V5_ITR_to_ITR.gb (서열 번호: 15), 및 scAAV_H1_long_miR100_3330_PSG11_V5_ITR_to_ITR.gb (서열 번호: 16)를 포함하였다. 줄기 세포 유래 운동 뉴런을 AAV-DJ에 패키징된 명시된 벡터로 처리하였고, 형질도입 7일 후, RNA를 수확하고, ATXN2에 대한 프로브 및 하우스키핑 프로브 GUSB 및 B2M을 사용하여 RT-ddPCR을 이용함으로써 녹다운에 대해 평가하였다. GUSB 및 B2M 프로브에 대해 및 비형질도입된 세포에 대해 정규화된 바와 같은, 평균 ATXN2 mRNA 신호를 측정하였다. 3.16E4 벡터 게놈/세포 용량으로 처리된 세포에 대한 데이터가 열거되어 있다.
또 다른 실험에서, 성체 수컷 C57Bl/6 마우스 내로 정맥내 투여하고, 3주 투여 후, 표적 ATXN2의 녹다운을 측정함으로써 H1 롱 프로모터의 제어하에 AMELY_V3 스터퍼 (서열 번호: 51 또는 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177) 및 ATXN2 표적화 amiRNA를 포함하는 벡터를 시험하였다. 간 조직으로부터 RNA를 추출하고, Atxn2 및 대조군 프로브 Hprt 및 Gusb를 이용하여 RT-ddPCR을 수행함으로써 ATXN2의 녹다운을 평가하였다. 표 9에는 비히클 (PBS + 0.001% PF-68)을 투여받은 동물 대비 벡터를 투여받은 동물 3마리로부터 평가된 간 조직에서의 평균 녹다운 비율(%)이 열거되어 있다. 본 연구에서 투여된 용량을 평균적으로 8.5E10이며, 이는 마우스 체중에 대해 조정된 값이다. 표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 벡터를 투여받은 동물로부터의 간에서는 상당한 녹다운이 이루어졌고, 이는 스터퍼가 패키징된 AAV의 기능성을 시사하는 것이다.
상기 기술된 다양한 실시양태는 조합되어 추가 실시양태를 제공할 수 있다. 2021년 2월 5일 출원된 미국 특허 출원 번호 63/146,522 및 2021년 2월 5일 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2021/016939를 비롯한, 본 명세서에서 언급되고/거나, 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 실시양태의 측면들은 추가의 또 다른 실시양태를 제공하기 위해 필요한 경우 다양한 특허, 출원 및 공개문헌의 개념을 사용하도록 변형될 수 있다.
상기 기술된 설명에 비추어 본 실시양태는 상기와 같이 및 다르게 변경될 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서 사용되는 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적인 실시양태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이러한 청구범위 자격이 있는 등가물의 전체 범주와 함께 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING
<110> Maze Therapeutics, Inc.
<120> VECTORS COMPRISING STUFFER POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES
<130> 630264.402WO
<150> US 63/146,522
<151> 2021-02-05
<150> PCT/US2021/016939
<151> 2021-02-05
<160> 82
<170> PatentIn version 3.5
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ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120
aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180
acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240
gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300
atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacccaaaa gagagaagat 360
attgaggcct gttgccacat atgctgagac tgataatgtg ggtattagtc cgccacatca 420
tccgtctcaa catttgtgtc tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc 480
ctttttttac caggtcagtt gttgcttgtg aagaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag 540
aaggtggaag ggatttcact ctgtttttag agataggatt ggaactaaga attttaagtc 600
tatttgggtg aaggggcagg gaagtgtagg aagacagttc taattaggaa ggaggaatta 660
tactaggaag tagaggtaaa ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atctgaactt 720
atcaaatagg ctagtgtata cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta 780
gaaaggtatt gaggcagtta tttgcaagga acaattcaaa gtctggagac aagaagtcaa 840
gcaatacttt gagaagtggt tgagcttttt gggattggag agaattacac tattgagatt 900
tgttaaaaat attgaagaag gtttcacctt gtgaaattgt gtttctcaat tgaatctgag 960
aaacaattga gcagaggctg gagataattt tgtctaaaag acagtggggt acagggagca 1020
aaaaggccag ggagaaaggg aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggtt 1080
gaaggaggag atccaggccc agatacaggc aaataagtca attccctctc ccaagcttgg 1140
cagtcagccc tgcaggaacc aggataagag aaattgtttg gtaaaaacta acaaaccagg 1200
cttgattctt tgcagttagc tctttatctt tctctcccac aagtagtcag tagccttgtt 1260
ctagtgtttt ttgtgttacc tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg agttattgtt 1320
gttgatagta atatagtagc tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt gtttcccacc 1380
taaattgcac acttagaaac agttattggt aagccttata ttagatatat atagtgtctg 1440
gtagtcttac cctctctata attacacact ttttggcact gcccctttcc tgccttgcag 1500
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gtgtcccacc tgctgtgccc acagcctcaa acagccagtg acttcagagc caggaaacag 1620
ctcaggagtc tgccctgagg ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg gccaagggga 1680
ggcttggctt gaactggcag ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac caggactctt 1740
tctccacact tgctggtccc accccaggtt gagtgaggca gggccagtca ccagaggagc 1800
ccagagcaga gcaggaagca gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg ggcttcctcc 1860
tctcaattgg gggaaaagtg tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct tgtagttctt 1920
ggaagaggta caagaaaaca aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga cagtgagaag 1980
caactggttg ttcagcactc tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct accacaaagg 2040
gctcagggct gataaagccc cctccctacc tttctcaggc cagacacaag gtcagtcttg 2100
agaaaacaga aaaaaaagga gaagagagtc tgtagagaca aattgggagg gttcaggagg 2160
agaatttggg atttgcctgt gcccagctag cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat 2220
taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 2280
cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 2340
gagcgagcga gcgcgcag 2358
<210> 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> scAAV _H1_short_miR16-2-1755_AMELY V1_ITR_to_ITR
<220>
<221> misc_feature
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<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(203)
<223> H1 short promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(335)
<223> miR16-2-1755
<220>
<221> misc_feature
<222> (336)..(341)
<223> terminator
<220>
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atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac cacttatgtt tggatgaact gacatacttg ttccactctc 240
gggttgaaat ctgaagtgtg tagtgaaata tatattaaac acacttcagg cttcaacccg 300
ttagtgtgac agggatacag caactatttt atcaattttt ttattatgca tatcacataa 360
ttttatttaa aaatcattta gattttgatt gcgtgaagta cacaaccagt attccatatc 420
ctaatttgtt ttgtaataca gtcttcaaaa gttaaatgca aagaaattgt catataaact 480
tcccttcatt tggttcaggt ttcagtgatt gtatatgttc atacattttt attttatcaa 540
cgattttaac tgatgtgtaa acttcatttt ttaaaaagat ttgacgtagt ataatttcag 600
ttttctctaa aaagaaatat agtccaaatg gtgaatttgt atgagtaaat gagcagttct 660
taccttattc aagaatactc attcataata tgttgtctca aaagtttcat tcaacacata 720
gcaaaaggaa caattaaata atttaattgt ttccagtgag taccatttac aatacatgta 780
ttcaaaccaa tgtacaacca cttaagttga actctataat ttccaaagtt tctttgttca 840
ttcgttgtca ttagatatta ggtgtccatg aagccttctt ctacctttgg aacacttaaa 900
gcctattatt ttataacaaa ataacaattc tttccataaa tagctttgtc aaggtgtgag 960
cacattataa atccacggca ttttctatgc acagagagaa catgtgcttt agactagaat 1020
agccaatgat agtcgtcaga ttacttggga ttcaatcaat caatcaattt tcaaaaattc 1080
tgccccatat cacaattatt aagccattta taacatatat tatgattttt taattcagaa 1140
gttatcacat ttatacagta gtatatcatc aatagcttgt ataaattgga attacaggtg 1200
gatacatata agtgatagat cacataatct tatatacgta gaaataagat tttatggatg 1260
tggataaagt ttttttattg attattccca ttcatttgta agtgcttctt gtaatgggag 1320
attcagtcat aaattgaggt aacttctttt taaaagctta atcatctcaa gttagactga 1380
aaactactga aaatgggaaa ccttcgtata ggttttttta aagagatttc ccatctacct 1440
ttcatagctt gttcaaatat atgcactcta aaaattaccc accccatctt atcttaagcc 1500
ttcactgcaa ttctagcctc ttcttgtgag tcaaatcttt gaaatgaaag aactgatatt 1560
cccttattgc tgttgccctt aaaattaaga gggtttaata atatattttt ctattaatgg 1620
gttgtcataa tatacagtct ggtagaaatt caataataat aaaatttaaa cctatcataa 1680
aaactgtgtt cttaattacc aagccattta gataaatttg tttataatgt aaagatacaa 1740
catattactt ggactaatag aatcatagat ctgtaactac tacaactcta gaccctgagt 1800
tgttggaccc cttagaactc tggggccacc tttgctgcac cattttcaca ggatttgcat 1860
tgtagtggct tcacagagag tgactccaac cagagaagca gcagtgttgt ctttgccatt 1920
atggccatag gaatattgta tttcaaaaat ttgtaactgt gtacacagac atgatttttt 1980
acaaactaaa tttcccatta gtgtctgtat gtggagtaca catggtattt tcttaaaaat 2040
gcctaatatt ttcagggaat tacagatata ttagaatcca tttgatttaa tttactttca 2100
tcccatgcag aaattcactg atgcggtagg aaataagaag aaggtaaaac tgtttatttc 2160
cataggtcct gcttttcatt gtaagagcaa agcaaacata aaattatgcc gcaataatgt 2220
gagctagcgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga 2280
tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 2340
tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2395
<210> 18
<211> 2350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_long_miR1-1_1784_AMELY_V3 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(343)
<223> H1 long promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (344)..(481)
<223> miR1-1_1784
<220>
<221> misc_feature
<222> (482)..(488)
<223> terminator
<220>
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<223> AMELY_V3
<220>
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<223> 3' ITR
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ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120
aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180
acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240
gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300
atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacatgcag actgcctgct 360
tgggtacaga ccaaagagta gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg 420
gtctgaactc aggccgggac ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc 480
ctttttttat tttgcaaatc acaaaatttt atttaaaaat caattagatt ttgattgcct 540
gaagtacaca accagtattc caaatcctaa tttgttttgt aatacagtct tcaaaagtta 600
attgcaaaga aattgtcaaa taaacttccc ttcaattggt tcaggtttca gtgattgtat 660
ttgttcaaac aattttattt tatcaaggat tttaactgtt gtgtaaactt caatttttaa 720
aaagatttga cctagtataa tttcagtttt ctctaaaaag aaatatagtc caattggtga 780
atttgtttga gtaattgagc agttcttacc ttattcaaga atactcaatc aaaatttgtt 840
gtctcaaaag tttcaatcaa cacaaagcaa aaggaacaat taaataattt aattgtttcc 900
agtgagtacc aattacaata cttgtattca aaccagtgta caaccactta agttgaactc 960
tataatttcc aaagtttctt tgttcaatcc ttgtcaatag atattaggtg tccttgaagc 1020
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atcaatcaat caattttcaa aaattctgcc ccaaatcaca attattaagc caattataac 1260
aaatattttg attttttaat tcagaagtta tcacaattat acagtagtat atcaacaata 1320
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tacctagaaa taagattttt tggttgtgga taaagttttt ttattgatta ttcccaatca 1440
attgtaagtg cttcttgtat tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa 1500
agcttaatca actcaagtta gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt 1560
tttttaaaga gatttcccac ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa 1620
ttacccaccc caccttatct taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa 1680
atctttgaat tgaaagaact gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt 1740
ttaataatat atttttctat tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat 1800
aataataaaa tttaaaccta tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata 1860
aatttgttta tattgtaaag atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt 1920
aactactaca actctagacc ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg 1980
ctgcaccaat ttcacaggat ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga 2040
gaagcagcag tgttgtcttt gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt 2100
aactgtgtac acagacttga ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg 2160
agtacacttg gtattttgct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca 2220
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 2280
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 2340
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<210> 19
<211> 2350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> scAAV_H1_long_miR1-1_1784_PSG11_V2 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
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<220>
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<222> (113)..(343)
<223> H1 long promoter
<220>
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<222> (344)..(481)
<223> miR1-1_1784
<220>
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<220>
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<223> PSG11_V2
<220>
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acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240
gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300
atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacatgcag actgcctgct 360
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<211> 2360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_long_miR1-1_1784_SV40_AMELY_V3 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(343)
<223> H1 long promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (344)..(481)
<223> miR1-1_1784
<220>
<221> misc_feature
<222> (482)..(488)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (489)..(710)
<223> SV40 termination
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<223> AMELY_V3
<220>
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<222> (2216)..(2360)
<223> 3'ITR
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aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180
acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240
gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300
atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacatgcag actgcctgct 360
tgggtacaga ccaaagagta gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg 420
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ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta attgtttcca 720
gtgagtacca attacaatac ttgtattcaa accagtgtac aaccacttaa gttgaactct 780
ataatttcca aagtttcttt gttcaatcct tgtcaataga tattaggtgt ccttgaagcc 840
ttcttctacc tttggaacac ttaaagccta ttattttata acaaaataac aattctttcc 900
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gcttaatcaa ctcaagttag actgaaaact actgaaattg ggaaaccttc ctataggttt 1380
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ataataaaat ttaaacctat caaaaaaact gtgttcttaa ttaccaagcc aattagataa 1680
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tgcaccaatt tcacaggatt tgcagtgtag tggcttcaca gagagtgact ccaaccagag 1860
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ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacccaaaag agagaagata ttgaggcctg 240
ttgccacata tgctgagact gataatgtgg gtattagtcc gccacatcat ccgtctcaac 300
atttgtgtct gttaggcaat ctcacggacc tggggctttg cttatatgcc tttttttcag 360
acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 420
gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 480
aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg 540
aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa aatatagtcc aattggtgaa 600
tttgtttgag taattgagca gttcttacct tattcaagaa tactcaatca aaatttgttg 660
tctcaaaagt ttcaatcaac acaaagcaaa aggaacaatt aaataattta attgtttcca 720
gtgagtacca attacaatac ttgtattcaa accagtgtac aaccacttaa gttgaactct 780
ataatttcca aagtttcttt gttcaatcct tgtcaataga tattaggtgt ccttgaagcc 840
ttcttctacc tttggaacac ttaaagccta ttattttata acaaaataac aattctttcc 900
aaaaatagct ttgtcaaggt gtgagcacaa tataaatcca gggcaatttc tttgcacaga 960
gagaacttgt gctttagact agaatagcca gtgatagtcc tcagattact tgggattcaa 1020
tcaatcaatc aattttcaaa aattctgccc caaatcacaa ttattaagcc aattataaca 1080
aatattttga ttttttaatt cagaagttat cacaattata cagtagtata tcaacaatag 1140
cttgtataaa ttggaattac aggtggatac aaataagtga tagatcacaa aatcttatat 1200
acctagaaat aagatttttt ggttgtggat aaagtttttt tattgattat tcccaatcaa 1260
ttgtaagtgc ttcttgtatt gggagattca gtcaaaaatt gaggtaactt ctttttaaaa 1320
gcttaatcaa ctcaagttag actgaaaact actgaaattg ggaaaccttc ctataggttt 1380
ttttaaagag atttcccacc tacctttcaa agcttgttca aatatttgca ctctaaaaat 1440
tacccacccc accttatctt aagccttcac tgcaattcta gcctcttctt gtgagtcaaa 1500
tctttgaatt gaaagaactg atattccctt attgctgttg cccttaaaat taagagggtt 1560
taataatata tttttctatt attgggttgt caaaatatac agtctggtag aaattcaata 1620
ataataaaat ttaaacctat caaaaaaact gtgttcttaa ttaccaagcc aattagataa 1680
atttgtttat attgtaaaga tacaacaaat tacttggact aatagaatca aagatctgta 1740
actactacaa ctctagaccc tgagttgttg gaccccttag aactctgggg ccacctttgc 1800
tgcaccaatt tcacaggatt tgcagtgtag tggcttcaca gagagtgact ccaaccagag 1860
aagcagcagt gttgtctttg ccaatttggc caaaggaata ttgtatttca aaaatttgta 1920
actgtgtaca cagacttgat tttttacaaa ctaaatttcc caatagtgtc tgtttgtgga 1980
gtacacttgg tattttctta aaattgccta atattttcag ggaattacag atatattaga 2040
atccaattga tttaatttac tttcaaccct tgcagaaatt cactgttggg gtaggaaata 2100
agaagaaggt aaaactgttt atttccaaag gtcctgcttt tcagtgtaag agcaaagcaa 2160
acaaaaaatt ttgccccaat attgtgagct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc 2220
attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 2280
ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 2340
gtgagcgagc gagcgcgcag 2360
<210> 36
<211> 2369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_native_miR100_3330_SV40_PSG11_V5 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(212)
<223> H1 native promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (213)..(350)
<223> miR100_3330
<220>
<221> misc_feature
<222> (351)..(357)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (358)..(579)
<223> SV40 termination
<220>
<221> misc_feature
<222> (580)..(2196)
<223> PSG11_V5
<220>
<221> misc_feature
<222> (2225)..(2369)
<223> 3'ITR
<400> 36
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacccaaaag agagaagata ttgaggcctg 240
ttgccacata tgctgagact gataatgtgg gtattagtcc gccacatcat ccgtctcaac 300
atttgtgtct gttaggcaat ctcacggacc tggggctttg cttatatgcc tttttttcag 360
acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 420
gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 480
aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg 540
aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa ccaggtcagt tgttgcttgt 600
gaagaagggt gtggttaagt ctgcagtgca gaaggtggaa gggatttcac tctgttttta 660
gagataggat tggaactaag aattttaagt ctatttgggt gaaggggcag ggaagtgtag 720
gaagacagtt ctaattagga aggaggaatt atactaggaa gtagaggtaa aggaagtgag 780
aaggcttagt aaatagaaga aatctgaact tatcaaatag gctagtgtat acccctggag 840
attcttgatt aagtgaatta actagatttt agaaaggtat tgaggcagtt atttgcaagg 900
aacaattcaa agtctggaga caagaagtca agcaatactt tgagaagtgg ttgagctttt 960
tgggattgga gagaattaca ctattgagat ttgttaaaaa tattgaagaa ggtttcacct 1020
tgtgaaattg tgtttctcaa ttgaatctga gaaacaattg agcagaggct ggagataatt 1080
ttgtctaaaa gacagtgggg tacagggagc aaaaaggcca gggagaaagg gaactgcagg 1140
aattagtgct gagaagcagg agttagtggt tgaaggagga gatccaggcc cagatacagg 1200
caaataagtc aattccctct cccaagcttg gcagtcagcc ctgcaggaac caggataaga 1260
gaaattgttt ggtaaaaact aacaaaccag gcttgattct ttgcagttag ctctttatct 1320
ttctctccca caagtagtca gtagccttgt tctagtgttt tttgtgttac ctctttttcc 1380
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taagccttat attagatata tatagtgtct ggtagtctta ccctctctat aattacacac 1560
tttttggcac tgcccctttc ctgccttgca gagccccagg ggtgaatctt cctatttctc 1620
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aacagccagt gacttcagag ccaggaaaca gctcaggagt ctgccctgag gttgcttctc 1740
ttcttatttc cttgcagcct ggccaagggg aggcttggct tgaactggca gctcaattta 1800
gccaaattca ggacaggcca ccaggactct ttctccacac ttgctggtcc caccccaggt 1860
tgagtgaggc agggccagtc accagaggag cccagagcag agcaggaagc agagtctgag 1920
ctgctcctcc ctcacccaag gggcttcctc ctctcaattg ggggaaaagt gtgagcttgt 1980
ttcaaagcct cagttgttcc ttgtagttct tggaagaggt acaagaaaac aaagacctga 2040
cagaaggggt tgaggtggtg acagtgagaa gcaactggtt gttcagcact ctccttcttg 2100
tccctctgtg aagcctcttc taccacaaag ggctcagggc tgataaagcc ccctccctac 2160
ctttctcagg ccagacacaa ggtcagtctt gagaaagcta gcgtagataa gtagcatggc 2220
gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc 2280
gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 2340
gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 2369
<210> 37
<211> 2401
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_short_miR1-1_1784_AMELY_V3 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(203)
<223> H1 short promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(341)
<223> miR1-1_1784
<220>
<221> misc_feature
<222> (342)..(347)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (348)..(2228)
<223> AMELY_V3
<220>
<221> misc_feature
<222> (2257)..(2401)
<223> 3' ITR
<400> 37
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240
gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300
ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc ctttttttat tttgcaaatc 360
acaaaatttt atttaaaaat caattagatt ttgattgcct gaagtacaca accagtattc 420
caaatcctaa tttgttttgt aatacagtct tcaaaagtta attgcaaaga aattgtcaaa 480
taaacttccc ttcaattggt tcaggtttca gtgattgtat ttgttcaaac aattttattt 540
tatcaaggat tttaactgtt gtgtaaactt caatttttaa aaagatttga cctagtataa 600
tttcagtttt ctctaaaaag aaatatagtc caattggtga atttgtttga gtaattgagc 660
agttcttacc ttattcaaga atactcaatc aaaatttgtt gtctcaaaag tttcaatcaa 720
cacaaagcaa aaggaacaat taaataattt aattgtttcc agtgagtacc aattacaata 780
cttgtattca aaccagtgta caaccactta agttgaactc tataatttcc aaagtttctt 840
tgttcaatcc ttgtcaatag atattaggtg tccttgaagc cttcttctac ctttggaaca 900
cttaaagcct attattttat aacaaaataa caattctttc caaaaatagc tttgtcaagg 960
tgtgagcaca atataaatcc agggcaattt ctttgcacag agagaacttg tgctttagac 1020
tagaatagcc agtgatagtc ctcagattac ttgggattca atcaatcaat caattttcaa 1080
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caggtggata caaataagtg atagatcaca aaatcttata tacctagaaa taagattttt 1260
tggttgtgga taaagttttt ttattgatta ttcccaatca attgtaagtg cttcttgtat 1320
tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa agcttaatca actcaagtta 1380
gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt tttttaaaga gatttcccac 1440
ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa ttacccaccc caccttatct 1500
taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa atctttgaat tgaaagaact 1560
gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt ttaataatat atttttctat 1620
tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat aataataaaa tttaaaccta 1680
tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata aatttgttta tattgtaaag 1740
atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt aactactaca actctagacc 1800
ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg ctgcaccaat ttcacaggat 1860
ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga gaagcagcag tgttgtcttt 1920
gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt aactgtgtac acagacttga 1980
ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg agtacacttg gtattttctt 2040
aaaattgcct aatattttca gggaattaca gatatattag aatccaattg atttaattta 2100
ctttcaaccc ttgcagaaat tcactgttgg ggtaggaaat aagaagaagg taaaactgtt 2160
tatttccaaa ggtcctgctt ttcagtgtaa gagcaaagca aacaaaaaat tttgccccaa 2220
tattgtgagc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 2280
tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 2340
caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 2400
g 2401
<210> 38
<211> 2402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_short_miR1-1_1784_PSG11_V3 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(203)
<223> H1 short promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(341)
<223> miR-1-1 1784
<220>
<221> misc_feature
<222> (342)..(348)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
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<223> PSG11_V3
<220>
<221> misc_feature
<222> (2258)..(2402)
<223> 3'ITR
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ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240
gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300
ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc ctttttttgt atacccctgg 360
agattcttga ttaagtgaat taactagatt ttagaaaggt attgaggcag ttatttgcaa 420
ggaacaattc aaagtctgga gacaagaagt caagcaatac tttgagaagt ggttgagctt 480
tttgggattg gagagaatta cactattgag atttgttaaa aatattgaag aaggtttcac 540
cttgtgaaat tgtgtttctc aattgaatct gagaaacaat tgagcagagg ctggagataa 600
ttttgtctaa aagacagtgg ggtacaggga gcaaaaaggc cagggagaaa gggaactgca 660
ggaattagtg ctgagaagca ggagttagtg gttgaaggag gagatccagg cccagataca 720
ggcaaataag tcaattccct ctcccaagct tggcagtcag ccctgcagga accaggataa 780
gagaaaagaa gaaaagaaaa gaaggattga aggtgttgtt attttacttg ggggagcctc 840
aggaacaagc ttgtaacttg agatactgta taattgtttc ttcaaggact acaatatttc 900
tgttggaaaa ttgttgggag ttgattatat tcttgcagtt ttttttccct ctcaccttgt 960
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tttcagaggt gagaaaggct gattgctatt ttctttgtca gtggaacttg tcacctttgc 1080
accttttctt ggttgcaact ttttctcagt gtctctgttt ggtaaaaact aacaaaccag 1140
gcttgattct ttgcagttag ctctttatct ttctctccca caagtagtca gtagccttgt 1200
tctagtgttt tttgtgttac ctctttttcc tgaaaaagga aggtactgtt gagttattgt 1260
tgttgatagt aatatagtag ctgacagtgg ttcctctgtt tgtggcaact tgtttcccac 1320
ctaaattgca cacttagaaa cagttattgg taagccttat attagatata tatagtgtct 1380
ggtagtctta ccctctctat aattacacac tttttggcac tgcccctttc ctgccttgca 1440
gagccccagg ggtgaatctt cctatttctc cagctctgca acagtcactg tactcagtgc 1500
tgtgtcccac ctgctgtgcc cacagcctca aacagccagt gacttcagag ccaggaccca 1560
gctcaggagt ctgccctgag gttgcttctc ttcttatttc cttgcagcct ggccctgggg 1620
aggcttggct tgaactggca gctcaattta gccaaattca ggacaggcca ccaggactct 1680
ttctccacac ttgctggtcc caccccaggt tgagtgaggc agggccagtc accagaggag 1740
ccctgagcag agcaggaagc agagtctgag ctgctcctcc ctcacccaag gggcttcctc 1800
ctctcaattg ggggaaaagt gtgagcttgt ttcaaagcct cagttgttcc ttgtagttct 1860
tggaagaggt acaagaaaac aaagacctga cagaaggggt tgaggtggtg acagtgagaa 1920
gcaactggtt gttcagcact ctccttcttg tccctctgtg aagcctcttc taccacaaag 1980
ggctcagggc tgataaagcc ccctccctac ctttctcagg ccagacacaa ggtcagtctt 2040
gagaaaacag aaaaaaaagg agaagagagt ctgtagagac aaattgggca aattgttttc 2100
ctgactcttc tctgaaagct agatagactc cacctaaaac cctattgcca aggttgctgg 2160
ggagaataaa gccacagttg ttgtcaactg agggaagggg aagctccttg tctcttaaag 2220
ggacacagtg ctagcgtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc 2280
ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 2340
ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 2400
ag 2402
<210> 39
<211> 2359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_short_miR1-1_1784_PSG11_V5 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(203)
<223> H1 short promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(341)
<223> miR1-1_1784
<220>
<221> misc_feature
<222> (342)..(348)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (349)..(2186)
<223> PSG11_V5
<220>
<221> misc_feature
<222> (2215)..(2359)
<223> 3'ITR
<400> 39
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240
gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300
ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc ctttttttac caggtcagtt 360
gttgcttgtg aagaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag aaggtggaag ggatttcact 420
ctgtttttag agataggatt ggaactaaga attttaagtc tatttgggtg aaggggcagg 480
gaagtgtagg aagacagttc taattaggaa ggaggaatta tactaggaag tagaggtaaa 540
ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atctgaactt atcaaatagg ctagtgtata 600
cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta gaaaggtatt gaggcagtta 660
tttgcaagga acaattcaaa gtctggagac aagaagtcaa gcaatacttt gagaagtggt 720
tgagcttttt gggattggag agaattacac tattgagatt tgttaaaaat attgaagaag 780
gtttcacctt gtgaaattgt gtttctcaat tgaatctgag aaacaattga gcagaggctg 840
gagataattt tgtctaaaag acagtggggt acagggagca aaaaggccag ggagaaaggg 900
aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggtt gaaggaggag atccaggccc 960
agatacaggc aaataagtca attccctctc ccaagcttgg cagtcagccc tgcaggaacc 1020
aggataagag aaattgtttg gtaaaaacta acaaaccagg cttgattctt tgcagttagc 1080
tctttatctt tctctcccac aagtagtcag tagccttgtt ctagtgtttt ttgtgttacc 1140
tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg agttattgtt gttgatagta atatagtagc 1200
tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt gtttcccacc taaattgcac acttagaaac 1260
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acagcctcaa acagccagtg acttcagagc caggaaacag ctcaggagtc tgccctgagg 1500
ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg gccaagggga ggcttggctt gaactggcag 1560
ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac caggactctt tctccacact tgctggtccc 1620
accccaggtt gagtgaggca gggccagtca ccagaggagc ccagagcaga gcaggaagca 1680
gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg ggcttcctcc tctcaattgg gggaaaagtg 1740
tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct tgtagttctt ggaagaggta caagaaaaca 1800
aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga cagtgagaag caactggttg ttcagcactc 1860
tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct acccaaaggg ctcagggctg ataaagcccc 1920
ctccctacct ttctcaggcc agacacaagg tcagtcttga gaaaacagaa aaaaaaggag 1980
aagagagtct gtagagacaa attgggaggg ttcaggagga gaatttggga tttgcctgtg 2040
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cttcttgtat tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa agcttaatca 1320
actcaagtta gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt tttttaaaga 1380
gatttcccac ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa ttacccaccc 1440
caccttatct taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa atctttgaat 1500
tgaaagaact gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt ttaataatat 1560
atttttctat tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat aataataaaa 1620
tttaaaccta tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata aatttgttta 1680
tattgtaaag atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt aactactaca 1740
actctagacc ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg ctgcaccaat 1800
ttcacaggat ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga gaagcagcag 1860
tgttgtcttt gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt aactgtgtac 1920
acagacttga ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg agtacacttg 1980
gtattttctt aaaattgcct aatattttca gggaattaca gatatattag aatccaattg 2040
atttaattta ctttcaaccc ttgcagaaat tcactgttgg ggtaggaaat aagaagaagg 2100
taaaactgtt tatttccaaa ggtcctgctt ttcagtgtaa gagcaaagca aacaaaaaat 2160
tttgccccaa tattgtgagc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac 2220
aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 2280
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2340
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<210> 45
<211> 1881
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PSG11_V1 stuffer sequence
<400> 45
acgaggtcag atgttgcttg tgatgaaggg tgtggttaag tctgcagtgc agatggtgga 60
agggatttca ctctgttttt agacatagca ttggaactaa gaattttatg tctatatggg 120
tgaaggggca gggatgtgta ggaagacagt tctaattagg atggaggaat tatactagga 180
agtagaggta aaggaagtga gaaggcttag taaatagaag aaatgtgaac ttatcaaata 240
ggctagtgta tacccctgga gattcttgat taagtgaatt aactagattt tagaaaggta 300
atgaggcagt tatatgcaag gaacatttca aagtctggag acaagaagtc aagcaatact 360
ttgagaagtg gttgagcttt atgggaatgg agagaattac actattgaga tatgttaaaa 420
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agggagaaag ggaactgcag gaattagtgc tgagaagcag gagttagtgg atgaaggagg 600
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cctgcaggaa ccaggataag agaaaaatgg ttggtaaaaa ctaacatacc aggcttgatt 720
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cacacttaga aacagttaat ggtaagcctt atattagata tatatagtgt ctggtagtct 960
taccctctct ataattacac actttttggc actgcccctt tcctgccatg cagagcccca 1020
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agaaaaaaaa ggagaagaga gtctgtagag acaaattggg agggttcagg aggagaattt 1680
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<210> 46
<211> 1881
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PSG11_V2 stuffer sequence
<400> 46
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cagtagcctt gttctagtgt tttttgtgtt acctcttttt ccggaaaaag gaaggtactg 900
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caaggttgct ggggagaata aagccacagt tgttgtcaac tgagggaagg ggaagctcct 1860
tgtctcttaa agggacacag t 1881
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<211> 1881
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PSG11_V3 stuffer sequence
<400> 47
gtatacccct ggagattctt gattaagtga attaactaga ttttagaaag gtattgaggc 60
agttatttgc aaggaacaat tcaaagtctg gagacaagaa gtcaagcaat actttgagaa 120
gtggttgagc tttttgggat tggagagaat tacactattg agatttgtta aaaatattga 180
agaaggtttc accttgtgaa attgtgtttc tcaattgaat ctgagaaaca attgagcaga 240
ggctggagat aattttgtct aaaagacagt ggggtacagg gagcaaaaag gccagggaga 300
aagggaactg caggaattag tgctgagaag caggagttag tggttgaagg aggagatcca 360
ggcccagata caggcaaata agtcaattcc ctctcccaag cttggcagtc agccctgcag 420
gaaccaggat aagagaaaag aagaaaagaa aagaaggatt gaaggtgttg ttattttact 480
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cagtagcctt gttctagtgt tttttgtgtt acctcttttt cctgaaaaag gaaggtactg 900
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aaggtcagtc ttgagaaaac agaaaaaaaa ggagaagaga gtctgtagag acaaattggg 1740
caaattgttt tcctgactct tctctgaaag ctagatagac tccacctaaa accctattgc 1800
caaggttgct ggggagaata aagccacagt tgttgtcaac tgagggaagg ggaagctcct 1860
tgtctcttaa agggacacag t 1881
<210> 48
<211> 1697
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PSG11_V5 stuffer sequence
<400> 48
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ttgaggcagt tatttgcaag gaacaattca aagtctggag acaagaagtc aagcaatact 360
ttgagaagtg gttgagcttt ttgggattgg agagaattac actattgaga tttgttaaaa 420
atattgaaga aggtttcacc ttgtgaaatt gtgtttctca attgaatctg agaaacaatt 480
gagcagaggc tggagataat tttgtctaaa agacagtggg gtacagggag caaaaaggcc 540
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cctgcaggaa ccaggataag agaaattgtt tggtaaaaac taacaaacca ggcttgattc 720
tttgcagtta gctctttatc tttctctccc acaagtagtc agtagccttg ttctagtgtt 780
ttttgtgtta cctctttttc ctgaaaaagg aaggtactgt tgagttattg ttgttgatag 840
taatatagta gctgacagtg gttcctctgt ttgtggcaac ttgtttccca cctaaattgc 900
acacttagaa acagttattg gtaagcctta tattagatat atatagtgtc tggtagtctt 960
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gggtgaatct tcctatttct ccagctctgc aacagtcact gtactcagtg ctgtgtccca 1080
cctgctgtgc ccacagcctc aaacagccag tgacttcaga gccaggaaac agctcaggag 1140
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ctgataaagc cccctcccta cctttctcag gccagacaca aggtcagtct tgagaaaaca 1620
gaaaaaaaag gagaagagag tctgtagaga caaattggga gggttcagga ggagaatttg 1680
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<210> 49
<211> 1881
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMELY_V1 stuffer sequence
<400> 49
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tacattttta ttttatcaac gattttaact gatgtgtaaa cttcattttt taaaaagatt 240
tgacgtagta taatttcagt tttctctaaa aagaaatata gtccaaatgg tgaatttgta 300
tgagtaaatg agcagttctt accttattca agaatactca ttcataatat gttgtctcaa 360
aagtttcatt caacacatag caaaaggaac aattaaataa tttaattgtt tccagtgagt 420
accatttaca atacatgtat tcaaaccaat gtacaaccac ttaagttgaa ctctataatt 480
tccaaagttt ctttgttcat tcgttgtcat tagatattag gtgtccatga agccttcttc 540
tacctttgga acacttaaag cctattattt tataacaaaa taacaattct ttccataaat 600
agctttgtca aggtgtgagc acattataaa tccacggcat tttctatgca cagagagaac 660
atgtgcttta gactagaata gccaatgata gtcgtcagat tacttgggat tcaatcaatc 720
aatcaatttt caaaaattct gccccatatc acaattatta agccatttat aacatatatt 780
atgatttttt aattcagaag ttatcacatt tatacagtag tatatcatca atagcttgta 840
taaattggaa ttacaggtgg atacatataa gtgatagatc acataatctt atatacgtag 900
aaataagatt ttatggatgt ggataaagtt tttttattga ttattcccat tcatttgtaa 960
gtgcttcttg taatgggaga ttcagtcata aattgaggta acttcttttt aaaagcttaa 1020
tcatctcaag ttagactgaa aactactgaa aatgggaaac cttcgtatag gtttttttaa 1080
agagatttcc catctacctt tcatagcttg ttcaaatata tgcactctaa aaattaccca 1140
ccccatctta tcttaagcct tcactgcaat tctagcctct tcttgtgagt caaatctttg 1200
aaatgaaaga actgatattc ccttattgct gttgccctta aaattaagag ggtttaataa 1260
tatatttttc tattaatggg ttgtcataat atacagtctg gtagaaattc aataataata 1320
aaatttaaac ctatcataaa aactgtgttc ttaattacca agccatttag ataaatttgt 1380
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atggtatttt cttaaaaatg cctaatattt tcagggaatt acagatatat tagaatccat 1740
ttgatttaat ttactttcat cccatgcaga aattcactga tgcggtagga aataagaaga 1800
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aattatgccg caataatgtg a 1881
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<211> 1881
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMELY_V2 stuffer sequence
<400> 50
tattttgcaa atcacaaaat tttatttaaa aatcaattag attttgattg cgtgaagtac 60
acaaccagta ttccaaatcc taatttgttt tgtaatacag tcttcaaaag ttaattgcaa 120
agaaattgtc aaataaactt cccttcaatt ggttcaggtt tcagtgattg tatttgttca 180
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tatatttttc tattattggg ttgtcaaaat atacagtctg gtagaaattc aataataata 1320
aaatttaaac ctatcaaaaa aactgtgttc ttaattacca agccaattag ataaatttgt 1380
ttatattgta aagatacaac aaattacttg gactaataga atcaaagatc tgtaactact 1440
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aattttgccg caatattgtg a 1881
<210> 51
<211> 1690
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AMELY_V3 stuffer sequence
<400> 51
tattttgcaa atcacaaaat tttatttaaa aatcaattag attttgattg cctgaagtac 60
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tgacctagta taatttcagt tttctctaaa aagaaatata gtccaattgg tgaatttgtt 300
tgagtaattg agcagttctt accttattca agaatactca atcaaaattt gttgtctcaa 360
aagtttcaat caacacaaag caaaaggaac aattaaataa tttaattgtt tccagtgagt 420
accaattaca atacttgtat tcaaaccagt gtacaaccac ttaagttgaa ctctataatt 480
tccaaagttt ctttgttcaa tccttgtcaa tagatattag gtgtccttga agccttcttc 540
tacctttgga acacttaaag cctattattt tataacaaaa taacaattct ttccaaaaat 600
agctttgtca aggtgtgagc acaatataaa tccagggcaa tttctttgca cagagagaac 660
ttgtgcttta gactagaata gccagtgata gtcctcagat tacttgggat tcaatcaatc 720
aatcaatttt caaaaattct gccccaaatc acaattatta agccaattat aacaaatatt 780
ttgatttttt aattcagaag ttatcacaat tatacagtag tatatcaaca atagcttgta 840
taaattggaa ttacaggtgg atacaaataa gtgatagatc acaaaatctt atatacctag 900
aaataagatt ttttggttgt ggataaagtt tttttattga ttattcccaa tcaattgtaa 960
gtgcttcttg tattgggaga ttcagtcaaa aattgaggta acttcttttt aaaagcttaa 1020
tcaactcaag ttagactgaa aactactgaa attgggaaac cttcctatag gtttttttaa 1080
agagatttcc cacctacctt tcaaagcttg ttcaaatatt tgcactctaa aaattaccca 1140
ccccacctta tcttaagcct tcactgcaat tctagcctct tcttgtgagt caaatctttg 1200
aattgaaaga actgatattc ccttattgct gttgccctta aaattaagag ggtttaataa 1260
tatatttttc tattattggg ttgtcaaaat atacagtctg gtagaaattc aataataata 1320
aaatttaaac ctatcaaaaa aactgtgttc ttaattacca agccaattag ataaatttgt 1380
ttatattgta aagatacaac aaattacttg gactaataga atcaaagatc tgtaactact 1440
acaactctag accctgagtt gttggacccc ttagaactct ggggccacct ttgctgcacc 1500
aatttcacag gatttgcagt gtagtggctt cacagagagt gactccaacc agagaagcag 1560
cagtgttgtc tttgccaatt tggccaaagg aatattgtat ttcaaaaatt tgtaactgtg 1620
tacacagact tgatttttta caaactaaat ttcccaatag tgtctgtttg tggagtacac 1680
ttggtatttt 1690
<210> 52
<211> 231
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(231)
<223> H1 long promoter
<400> 52
ggaattcgaa cgctgacgtc atcaacccgc tccaaggaat cgcgggccca gtgtcactag 60
gcgggaacac ccagcgcgcg tgcgccctgg caggaagatg gctgtgaggg acaggggagt 120
ggcgccctgc aatatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat 180
gtctttggat ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actctttccc a 231
<210> 53
<211> 100
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(100)
<223> H1 native promoter
<400> 53
atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt 60
tgggaatctt ataagttctg tatgagacca ctctttccca 100
<210> 54
<211> 91
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(91)
<223> H1 short promoter
<400> 54
atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt 60
tgggaatctt ataagttctg tatgagacca c 91
<210> 55
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_MCS_PSG11_V1
<400> 55
acgaggtcag atgttgcttg tgatgaaggg tgtggttaag tctgcagtgc agatggtgga 60
agggatttca ctctgttttt agacatagca ttggaactaa gaattttatg tctatatggg 120
tgaaggggca gggatgtgta ggaagacagt tctaattagg atggaggaat tatactagga 180
agtagaggta aaggaagtga 200
<210> 56
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_MCS_PSG11_V2
<400> 56
gtatacccct ggagattctt gattaagtga attaactaga ttttagaaag gtattgaggc 60
agttatttgc aaggaacaat tcaaagtctg gagacaagaa gtcaagcaat actttgagaa 120
gtggttgagc tttttgggat tggagagaat tacactattg agatttgtta aaaatattga 180
agaaggtttc accttgtgaa 200
<210> 57
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' ITR lacking TRS
<400> 57
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgg 106
<210> 58
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' ITR
<400> 58
taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 60
gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 120
cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 145
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1755 guide (DNA)
<400> 59
tcgggttgaa atctgaagtg tg 22
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1755 passenger (DNA)
<400> 60
cacactccag ctttcaaacc gt 22
<210> 61
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR100_1755 (DNA)
<400> 61
cccaaaagag agaagatatt gaggcctgtt gccacatcgg gttgaaatct gaagtgtggt 60
attagtccgc acactccagc tttcaaaccg ttgtgtctgt taggcaatct cacggacctg 120
gggctttgct tatatgcc 138
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2945 guide (DNA)
<400> 62
tgtagtagaa ggctttggct ga 22
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2945 passenger (DNA)
<400> 63
tcagcccaag acttctaata ct 22
<210> 64
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR100_2945 (DNA)
<400> 64
cccaaaagag agaagatatt gaggcctgtt gccacatgta gtagaaggct ttggctgagt 60
attagtccgt cagcccaaga cttctaatac ttgtgtctgt taggcaatct cacggacctg 120
gggctttgct tatatgcc 138
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2586 guide (DNA)
<400> 65
tagattcaga agtagaactt gg 22
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2586 passenger (DNA)
<400> 66
ccaagtccta attctgactc tt 22
<210> 67
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR100_2586 (DNA)
<400> 67
cccaaaagag agaagatatt gaggcctgtt gccacataga ttcagaagta gaacttgggt 60
attagtccgc caagtcctaa ttctgactct ttgtgtctgt taggcaatct cacggacctg 120
gggctttgct tatatgcc 138
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3330 guide (DNA)
<400> 68
tatgctgaga ctgataatgt gg 22
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3330 passenger (DNA)
<400> 69
ccacatcatc cgtctcaaca tt 22
<210> 70
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR100_3330 (DNA)
<400> 70
cccaaaagag agaagatatt gaggcctgtt gccacatatg ctgagactga taatgtgggt 60
attagtccgc cacatcatcc gtctcaacat ttgtgtctgt taggcaatct cacggacctg 120
gggctttgct tatatgcc 138
<210> 71
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1784 (also 14792) guide (RNA)
<400> 71
auuaacuacu cuuuggucug aa 22
<210> 72
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1784 (also 14792) passenger (RNA)
<400> 72
uccagaccaa auauuaguua au 22
<210> 73
<211> 138
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR1.1_1784 (or miR1.1_14792) (RNA)
<400> 73
caugcagacu gccugcuugg guacagacca aagaguaguc gaauuaugga ccugcuaagc 60
uaauuaacua cucuuugguc ugaacucagg ccgggaccuc ucucgccgca cugaggggca 120
cuccacacca cgggggcc 138
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1784 (also 14792) guide (DNA)
<400> 74
attaactact ctttggtctg aa 22
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1784 (also 14792) passenger (DNA)
<400> 75
tccagaccaa atattagtta at 22
<210> 76
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR1.1_1784 (or miR1.1_14792) (DNA)
<400> 76
catgcagact gcctgcttgg gtacagacca aagagtagtc gaattatgga cctgctaagc 60
taattaacta ctctttggtc tgaactcagg ccgggacctc tctcgccgca ctgaggggca 120
ctccacacca cgggggcc 138
<210> 77
<211> 222
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 transcription termination signal
<400> 77
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180
gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222
<210> 78
<211> 2402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV9_H1_miR-1-1-XD-14792_PSG11_V1 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(203)
<223> H1 short promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(342)
<223> miR-1-1_XD-14792
<220>
<221> misc_feature
<222> (343)..(348)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (349)..(2229)
<223> PSG11_V1
<220>
<221> misc_feature
<222> (2258)..(2402)
<223> 3' ITR
<400> 78
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240
gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300
ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc cgttttttac gaggtcagat 360
gttgcttgtg atgaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag atggtggaag ggatttcact 420
ctgtttttag acatagcatt ggaactaaga attttatgtc tatatgggtg aaggggcagg 480
gatgtgtagg aagacagttc taattaggat ggaggaatta tactaggaag tagaggtaaa 540
ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atgtgaactt atcaaatagg ctagtgtata 600
cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta gaaaggtaat gaggcagtta 660
tatgcaagga acatttcaaa gtctggagac aagaagtcaa gcaatacttt gagaagtggt 720
tgagctttat gggaatggag agaattacac tattgagata tgttaaaaat aatgaagaag 780
gtttcaccat gtgaaattgt gtttctcatt tgaatctgag aaacaaatga gcagaggctg 840
gagataatta tgtctaaaag acagtggggt acagggagca taaaggccag ggagaaaggg 900
aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggat gaaggaggag atccaggccc 960
agatacaggc aaataagtca tttccctctc ccaagcatgg cagtcagccc tgcaggaacc 1020
aggataagag aaaaatggtt ggtaaaaact aacataccag gcttgattct ttgcagttag 1080
ctctttatct ttctctccca caagtagtca gtagccttgt tctagtgttt tatgtgttac 1140
ctctttttcc ggaaaaagga aggtactgtt gagttaatga tgatgatagt aatatagtag 1200
ctgacattgg ttcctctgta tgtggcatct tgtttcccat ctaaattgca cacttagaaa 1260
cagttaatgg taagccttat attagatata tatagtgtct ggtagtctta ccctctctat 1320
aattacacac tttttggcac tgcccctttc ctgccatgca gagccccagg ggtgaatctt 1380
cctatttctc cagctctgca tcagtcactg tactcagtgc tgtgtcccac gtgctgtgcc 1440
cacagcctca tacagccagt gacttcagag ccaggacgca gctcaggagt ctgccctgag 1500
gttgcttctc ttcttatttc cttgcagcct ggcccggggg aggcttggct tgaactggca 1560
gctcaattta gccaaattca ggacaggcca ccaggactct ttctccacac atgctggtcc 1620
caccccaggt tgagtgaggc agggccagtc accagaggag cccggagcag agcaggaagc 1680
agagtctgag ctgctcctcc ctcacccaag gggcttcctc ctctcatttg ggggaaaagt 1740
gtgagcttgt ttcaaagcct cagatgttcc ttgtagttca tggaagaggt acaagaaaac 1800
aaagacgtga cagaagggga tgaggtggtg acagtgagaa gcaactcgat gttcagcact 1860
ctccttcttg tccctctgtg aagcctcttc taccacatag ggctcagggc tgataaagcc 1920
ccctccctac ctttctcagg ccagacacaa ggtcagtcat gagaaaacag aaaaaaaagg 1980
agaagagagt ctgtagagac aaattgggag ggttcaggag gagaatttgg gatttgcctg 2040
tgcccatggg acacaggctg ggaataaaaa tgttttcctg actcttctct gaaagctaga 2100
tagactccac ctaaaaccct attgccaagg atgctgggcc cacagttgat gtcatctgag 2160
ggaaggggaa gctccttgtc tcttaaaggg acacagtgac cctctgagcc aagacacacc 2220
ctcaagtccg ctagcgtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc 2280
ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 2340
ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 2400
ag 2402
<210> 79
<211> 2411
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV9_H1_native_miR-1-1-XD-14792_PSG11_V2 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(212)
<223> H1 native promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (213)..(351)
<223> miR1-1-XD-14792
<220>
<221> misc_feature
<222> (352)..(357)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (358)..(2238)
<223> PSG11_V2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2267)..(2411)
<223> 3' ITR
<400> 79
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cgcatgcaga ctgcctgctt gggtacagac 240
caaagagtag tcgaattatg gacctgctaa gctaattaac tactctttgg tctgaactca 300
ggccgggacc tctctcgccg cactgagggg cactccacac cacgggggcc gttttttgta 360
tacccctgga gattcttgat taagtgaatt aactagattt tagaaaggta ttgaggcagt 420
tatttgcaag gaacaattca aagtctggag acaagaagtc aagcaatact ttgagaagtg 480
gttgagcttt ttgggattgg agagaattac actattgaga tttgttaaaa atattgaaga 540
aggtttcacc ttgtgaaatt gtgtttctca attgaatctg agaaacaatt gagcagaggc 600
tggagataat tttgtctaaa agacagtggg gtacagggag caaaaaggcc agggagaaag 660
ggaactgcag gaattagtgc tgagaagcag gagttagtgg ttgaaggagg agatccaggc 720
ccagatacag gcaaataagt caattccctc tcccaagctt ggcagtcagc cctgcaggaa 780
ccaggataag agaaaagaag aaaagaaaag aaggattgaa ggtgttgtta ttttacttgg 840
gggagcgtca ggaacaagct tgtaacttga gatactgtat aattgtttct tcaaggacta 900
caatatttct gttggaaaat tgttgggagt tgattatatt cttgcagttt tttttccctc 960
tcaccttgtt tctcaggtgg tgatcagtcc tctgtcaatt ctctactgca ctcaggtatt 1020
ttggaaggct ttcagacgtg agaaaggctg attgctattt tctttgtcag tggaacttgt 1080
cacctttgca ccttttcttg gttgcaactt tttctcagtg tctctgtttg gtaaaaacta 1140
acaaaccagg cttgattctt tgcagttagc tctttatctt tctctcccac aagtagtcag 1200
tagccttgtt ctagtgtttt ttgtgttacc tctttttccg gaaaaaggaa ggtactgttg 1260
agttattgtt gttgatagta atatagtagc tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt 1320
gtttcccacc taaattgcac acttagaaac agttattggt aagccttata ttagatatat 1380
atagtgtctg gtagtcttac cctctctata attacacact ttttggcact gcccctttcc 1440
tgccttgcag agccccaggg gtgaatcttc ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt 1500
actcagtgct gtgtcccacg tgctgtgccc acagcctcaa acagccagtg acttcagagc 1560
caggacgcag ctcaggagtc tgccctgagg ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg 1620
gcccggggga ggcttggctt gaactggcag ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac 1680
caggactctt tctccacact tgctggtccc accccaggtt gagtgaggca gggccagtca 1740
ccagaggagc ccggagcaga gcaggaagca gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg 1800
ggcttcctcc tctcaattgg gggaaaagtg tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct 1860
tgtagttctt ggaagaggta caagaaaaca aagacgtgac agaaggggtt gaggtggtga 1920
cagtgagaag caactcgttg ttcagcactc tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct 1980
accacaaagg gctcagggct gataaagccc cctccctacc tttctcaggc cagacacaag 2040
gtcagtcttg agaaaacaga aaaaaaagga gaagagagtc tgtagagaca aattgggcaa 2100
attgttttcc tgactcttct ctgaaagcta gatagactcc acctaaaacc ctattgccaa 2160
ggttgctggg gagaataaag ccacagttgt tgtcaactga gggaagggga agctccttgt 2220
ctcttaaagg gacacagtgc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac 2280
aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 2340
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2400
cgagcgcgca g 2411
<210> 80
<211> 2395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1_short_miR16-2-3330_AMELY_V1 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(203)
<223> H1 short promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(335)
<223> miR16-2-3330
<220>
<221> misc_feature
<222> (336)..(341)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (342)..(2222)
<223> AMELY_V1
<220>
<221> misc_feature
<222> (2251)..(2395)
<223> 3' ITR
<400> 80
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac cacttatgtt tggatgaact gacatacttg ttccactcta 240
tgctgagact gataatgtgg tagtgaaata tatattaaac cacattatcg ttctcagcat 300
ttagtgtgac agggatacag caactatttt atcaattttt ttattatgca tatcacataa 360
ttttatttaa aaatcattta gattttgatt gcgtgaagta cacaaccagt attccatatc 420
ctaatttgtt ttgtaataca gtcttcaaaa gttaaatgca aagaaattgt catataaact 480
tcccttcatt tggttcaggt ttcagtgatt gtatatgttc atacattttt attttatcaa 540
cgattttaac tgatgtgtaa acttcatttt ttaaaaagat ttgacgtagt ataatttcag 600
ttttctctaa aaagaaatat agtccaaatg gtgaatttgt atgagtaaat gagcagttct 660
taccttattc aagaatactc attcataata tgttgtctca aaagtttcat tcaacacata 720
gcaaaaggaa caattaaata atttaattgt ttccagtgag taccatttac aatacatgta 780
ttcaaaccaa tgtacaacca cttaagttga actctataat ttccaaagtt tctttgttca 840
ttcgttgtca ttagatatta ggtgtccatg aagccttctt ctacctttgg aacacttaaa 900
gcctattatt ttataacaaa ataacaattc tttccataaa tagctttgtc aaggtgtgag 960
cacattataa atccacggca ttttctatgc acagagagaa catgtgcttt agactagaat 1020
agccaatgat agtcgtcaga ttacttggga ttcaatcaat caatcaattt tcaaaaattc 1080
tgccccatat cacaattatt aagccattta taacatatat tatgattttt taattcagaa 1140
gttatcacat ttatacagta gtatatcatc aatagcttgt ataaattgga attacaggtg 1200
gatacatata agtgatagat cacataatct tatatacgta gaaataagat tttatggatg 1260
tggataaagt ttttttattg attattccca ttcatttgta agtgcttctt gtaatgggag 1320
attcagtcat aaattgaggt aacttctttt taaaagctta atcatctcaa gttagactga 1380
aaactactga aaatgggaaa ccttcgtata ggttttttta aagagatttc ccatctacct 1440
ttcatagctt gttcaaatat atgcactcta aaaattaccc accccatctt atcttaagcc 1500
ttcactgcaa ttctagcctc ttcttgtgag tcaaatcttt gaaatgaaag aactgatatt 1560
cccttattgc tgttgccctt aaaattaaga gggtttaata atatattttt ctattaatgg 1620
gttgtcataa tatacagtct ggtagaaatt caataataat aaaatttaaa cctatcataa 1680
aaactgtgtt cttaattacc aagccattta gataaatttg tttataatgt aaagatacaa 1740
catattactt ggactaatag aatcatagat ctgtaactac tacaactcta gaccctgagt 1800
tgttggaccc cttagaactc tggggccacc tttgctgcac cattttcaca ggatttgcat 1860
tgtagtggct tcacagagag tgactccaac cagagaagca gcagtgttgt ctttgccatt 1920
atggccatag gaatattgta tttcaaaaat ttgtaactgt gtacacagac atgatttttt 1980
acaaactaaa tttcccatta gtgtctgtat gtggagtaca catggtattt tcttaaaaat 2040
gcctaatatt ttcagggaat tacagatata ttagaatcca tttgatttaa tttactttca 2100
tcccatgcag aaattcactg atgcggtagg aaataagaag aaggtaaaac tgtttatttc 2160
cataggtcct gcttttcatt gtaagagcaa agcaaacata aaattatgcc gcaataatgt 2220
gagctagcgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga 2280
tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 2340
tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2395
<210> 81
<211> 2395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_miR16-2-1479_AMELY_V1 (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(203)
<223> H1 short promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(335)
<223> miR16-2-1479
<220>
<221> misc_feature
<222> (336)..(341)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (342)..(2222)
<223> AMELY_V1
<220>
<221> misc_feature
<222> (2251)..(2395)
<223> 3' ITR
<400> 81
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac cacttatgtt tggatgaact gacatacttg ttccactctt 240
gctaactggt ttgcccttgc tagtgaaata tatattaaag caagggcaag acagttagca 300
ttagtgtgac agggatacag caactatttt atcaattttt ttattatgca tatcacataa 360
ttttatttaa aaatcattta gattttgatt gcgtgaagta cacaaccagt attccatatc 420
ctaatttgtt ttgtaataca gtcttcaaaa gttaaatgca aagaaattgt catataaact 480
tcccttcatt tggttcaggt ttcagtgatt gtatatgttc atacattttt attttatcaa 540
cgattttaac tgatgtgtaa acttcatttt ttaaaaagat ttgacgtagt ataatttcag 600
ttttctctaa aaagaaatat agtccaaatg gtgaatttgt atgagtaaat gagcagttct 660
taccttattc aagaatactc attcataata tgttgtctca aaagtttcat tcaacacata 720
gcaaaaggaa caattaaata atttaattgt ttccagtgag taccatttac aatacatgta 780
ttcaaaccaa tgtacaacca cttaagttga actctataat ttccaaagtt tctttgttca 840
ttcgttgtca ttagatatta ggtgtccatg aagccttctt ctacctttgg aacacttaaa 900
gcctattatt ttataacaaa ataacaattc tttccataaa tagctttgtc aaggtgtgag 960
cacattataa atccacggca ttttctatgc acagagagaa catgtgcttt agactagaat 1020
agccaatgat agtcgtcaga ttacttggga ttcaatcaat caatcaattt tcaaaaattc 1080
tgccccatat cacaattatt aagccattta taacatatat tatgattttt taattcagaa 1140
gttatcacat ttatacagta gtatatcatc aatagcttgt ataaattgga attacaggtg 1200
gatacatata agtgatagat cacataatct tatatacgta gaaataagat tttatggatg 1260
tggataaagt ttttttattg attattccca ttcatttgta agtgcttctt gtaatgggag 1320
attcagtcat aaattgaggt aacttctttt taaaagctta atcatctcaa gttagactga 1380
aaactactga aaatgggaaa ccttcgtata ggttttttta aagagatttc ccatctacct 1440
ttcatagctt gttcaaatat atgcactcta aaaattaccc accccatctt atcttaagcc 1500
ttcactgcaa ttctagcctc ttcttgtgag tcaaatcttt gaaatgaaag aactgatatt 1560
cccttattgc tgttgccctt aaaattaaga gggtttaata atatattttt ctattaatgg 1620
gttgtcataa tatacagtct ggtagaaatt caataataat aaaatttaaa cctatcataa 1680
aaactgtgtt cttaattacc aagccattta gataaatttg tttataatgt aaagatacaa 1740
catattactt ggactaatag aatcatagat ctgtaactac tacaactcta gaccctgagt 1800
tgttggaccc cttagaactc tggggccacc tttgctgcac cattttcaca ggatttgcat 1860
tgtagtggct tcacagagag tgactccaac cagagaagca gcagtgttgt ctttgccatt 1920
atggccatag gaatattgta tttcaaaaat ttgtaactgt gtacacagac atgatttttt 1980
acaaactaaa tttcccatta gtgtctgtat gtggagtaca catggtattt tcttaaaaat 2040
gcctaatatt ttcagggaat tacagatata ttagaatcca tttgatttaa tttactttca 2100
tcccatgcag aaattcactg atgcggtagg aaataagaag aaggtaaaac tgtttatttc 2160
cataggtcct gcttttcatt gtaagagcaa agcaaacata aaattatgcc gcaataatgt 2220
gagctagcgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga 2280
tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 2340
tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2395
<210> 82
<211> 2331
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scAAV_H1_miR1-1-XD-14792_CBh_GFP_SV40p (5' ITR .. 3' ITR)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 5' ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(203)
<223> H1 promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (204)..(342)
<223> miR1-1-XD-14792
<220>
<221> misc_feature
<222> (343)..(348)
<223> terminator
<220>
<221> misc_feature
<222> (349)..(634)
<223> CMV early enhancer contains an 18-bp deletion relative to the
standard CMV enhancer
<220>
<221> misc_feature
<222> (636)..(913)
<223> chicken beta-actin promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (983)..(1079)
<223> SV40 intron with splice donor and acceptor sites
<220>
<221> misc_feature
<222> (1153)..(1869)
<223> GFP, mammalian codon-optimized
<220>
<221> misc_feature
<222> (1870)..(1899)
<223> Myc epitope tag
<220>
<221> misc_feature
<222> (1939)..(2161)
<223> SV40 termination
<220>
<221> misc_feature
<222> (2187)..(2331)
<223> 3' ITR
<400> 82
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggctcg agatatttgc 120
atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180
ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240
gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300
ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc cgttttttcg ttacataact 360
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt 420
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 480
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 540
taaatggccc gcctggcatt gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 600
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 660
cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 720
attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 780
gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 840
gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 900
cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg gcctagagtc gacgaggaac 960
tgaaaaacca gaaagttaac tggtaagttt agtctttttg tcttttattt caggtcccgg 1020
atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt tacttctagg 1080
cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgc ggccgatcca 1140
ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 1200
gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 1260
gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 1320
ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 1380
gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 1440
cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 1500
ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 1560
atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 1620
aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 1680
gttcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 1740
cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 1800
gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 1860
ctgtacaagg agcagaagct gatcagcgag gaggacctgt agcctgcagg ggccctcgac 1920
ccgggcggcc gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa 1980
ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg 2040
taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc 2100
aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta 2160
accggtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga 2220
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 2280
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca g 2331
Claims (39)
- 길이가 약 1300 내지 약 2300개의 뉴클레오티드 길이이고, 서열 번호: 45-51; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185, 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 및 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222 중 어느 하나와 적어도 75%의 동일성(identity)을 갖는 핵산을 포함하는 벡터 스터퍼 서열(vector stuffer sequence).
- 제1항에 있어서, 핵산 길이가 약 1500-2000개의 뉴클레오티드 길이인 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 길이가 약 1600 내지 1900개의 뉴클레오티드 길이인 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열 번호: 45-51; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 및 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 및 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열 번호: 45-51; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 489-2177; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 및 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222 중 어느 하나와 적어도 85%의 동일성을 갖는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열 번호: 45-51; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 및 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 및 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열 번호: 45-51; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 및 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열 번호: 45-51; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 및 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 및 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222 중 어느 하나와 적어도 97%의 동일성을 갖는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열 번호: 45-51; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 489-2185; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 342-2222; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 488-2177; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 711-2187; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 252-2132; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 357-2237; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 358-2195; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 580-2187; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 580-2196; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 349-2186; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 348-2228; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 349-2186; 및 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 571-2178; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 349-2229; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 358-2238; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 342-2222; 및 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 342-2222 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 이로 구성되는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터이고, 임의로 여기서 AAV 벡터가 자가-상보성(self-complementary)인 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 스터퍼 서열이 이종성 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물(expression construct)에 인접해 있는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제11항에 있어서, 이종성 핵산 서열이 치료제를 코딩하는(encoding) 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제12항에 있어서, 치료제가 억제성 핵산을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제13항에 있어서, 억제성 핵산이 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 dsRNA를 포함하는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제14항에 있어서, 억제성 핵산이 신경변성 질환 관련 유전자를 표적화(targeting)하는 miRNA를 포함하고, 임의로 여기서 신경변성 질환이 척수소뇌실조증-2(spinocerebellar ataxia-2), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 원발성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 진행성 근위축증(progressive muscular atrophy), 변연계 우세 연령 관련 TDP-43 뇌병증(limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy), 만성 외상성 뇌병증(chronic traumatic encephalopathy), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy: PSP), 괌의 치매 파킨슨병 ALS 복합증(dementia Parkinsonism ALS complex of guam: G-PDC), 피크병(Pick's disease), 해마 경화증(hippocampal sclerosis), 헌팅톤병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 또는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)인 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제15항에 있어서, 신경변성 질환이 폴리글루타민 반복 질환인 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 핵산이 ATXN2를 표적화하는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산이
(a) 서열 번호: 1-4 및 71로부터 선택되는 가이드 서열(guide sequence);
(b) 서열 번호: 1에 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 5에 의해 제공된 패신저 서열(passenger sequence); 서열 번호: 2에 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 6에 의해 제공된 패신저 서열; 서열 번호: 3에 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 7에 의해 제공된 패신저 서열; 서열 번호: 4에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 8에 의해 제공된 패신저 서열; 또는 서열 번호: 71에 의해 제공된 가이드 서열 및 서열 번호: 72에 의해 제공된 패신저 서열; 또는
(c) 서열 번호: 9-12 및 73 중 어느 하나에 의해 제공된 서열을 포함하는 인공 miRNA를 코딩하는 것인 벡터 스터퍼 서열. - 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 작제물이 프로모터(promoter), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 종결 신호, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제19항에 있어서, 프로모터가 H1 프로모터이고, 임의로 여기서
(a) H1 프로모터가 서열 번호: 52; 서열 번호: 13-16 및 18-24 중 어느 하나의 뉴클레오티드 113-343을 포함하는 H1 롱(long) 프로모터이거나;
(b) H1 프로모터가 서열 번호: 53을 포함하는 H1 프로모터이거나; 또는
(c) H1 프로모터가 서열 번호: 54 또는 서열 번호: 17, 25-28, 및 37-44 중 어느 하나의 뉴클레오티드 113-203을 포함하는 H1 쇼트(short) 프로모터인 것인 벡터 스터퍼 서열. - 제19항 또는 제20항에 있어서, 종결 신호가 SV40 종결 신호이고, 임의로 여기서 SV40 종결 신호가 서열 번호: 77에 의해 제공된 서열을 포함하는 것인 벡터 스터퍼 서열.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터 스터퍼 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
- 제22항에 있어서, AAV 벡터가 자가-상보성인 것인 재조합 AAV 벡터.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, AAV 벡터가 발현 작제물 및 벡터 스터퍼 서열 측면에 위치하는(flanking) 5' 역 말단 반복부 (inverted terminal repeat; ITR) 및 3' ITR을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
- 제24항에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR이 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVRh10, AAV11, 및 이의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형으로부터 수득되는 것인 재조합 AAV 벡터.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR 중 하나에 기능적 말단 분해 부위가 결여되어 있는 것인 재조합 AAV 벡터.
- 제26항에 있어서, 5' ITR에 기능적 말단 분해 부위가 결여되어 있는 것인 재조합 AAV 벡터.
- 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 5' ITR이 서열 번호: 57 또는 서열 번호: 13-24, 29-44, 및 78-82 중 어느 하나의 뉴클레오티드 1-106을 포함하고/거나;
(b) 3' ITR이 서열 번호: 58; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2192-2358; 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 2229-2395; 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 2184-2350; 서열 번호: 13-16 중 어느 하나의 뉴클레오티드 2214-2358, 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 2251-2395, 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 2206-2350, 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 2206-2350; 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 2206-2350; 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 25의 뉴클레오티드 2161-2305; 서열 번호: 26의 뉴클레오티드 2161-2305; 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 2161-2305; 서열 번호: 28의 뉴클레오티드 2161-2305; 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 2266-2410; 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 2224-2368; 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 2225-2369; 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 2266-2410; 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 2224-2368; 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 2216-2360; 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 2225-2369; 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 2257-2401; 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 2258-2402; 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 2215-2359; 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 2207-2351; 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 2207-2351; 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 2257-2401; 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 2215-2359; 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 2207-2351; 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 2258-2402; 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 2267-2411; 서열 번호: 80의 뉴클레오티드 2251-2395; 서열 번호: 81의 뉴클레오티드 2251-2395; 또는 서열 번호: 82의 뉴클레오티드 2187-2331을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터. - 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열 번호: 13-24, 29-44, 및 78-80 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열;
(b) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 13의 뉴클레오티드 서열;
(b) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 14의 뉴클레오티드 서열;
(c) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 15의 뉴클레오티드 서열;
(d) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 16의 뉴클레오티드 서열;
(e) 뉴클레오티드 204-335가 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 17의 뉴클레오티드 서열;
(f) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 18의 뉴클레오티드 서열;
(g) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 19의 뉴클레오티드 서열;
(h) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 서열;
(i) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 서열;
(j) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 서열;
(k) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 23의 뉴클레오티드 서열;
(l) 뉴클레오티드 344-481이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 24의 뉴클레오티드 서열;
(m) 뉴클레오티드 213-350이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 29의 뉴클레오티드 서열;
(n) 뉴클레오티드 213-350이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 30의 뉴클레오티드 서열;
(o) 뉴클레오티드 213-350이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 31의 뉴클레오티드 서열;
(p) 뉴클레오티드 213-350이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 32의 뉴클레오티드 서열;
(q) 뉴클레오티드 213-350이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 33의 뉴클레오티드 서열;
(r) 뉴클레오티드 213-350이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 서열;
(s) 뉴클레오티드 213-350이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 서열;
(t) 뉴클레오티드 213-350이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 서열;
(u) 뉴클레오티드 204-341이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 37의 뉴클레오티드 서열;
(v) 뉴클레오티드 204-341이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 38의 뉴클레오티드 서열;
(w) 뉴클레오티드 204-341이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 서열;
(x) 뉴클레오티드 204-341이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 40의 뉴클레오티드 서열;
(y) 뉴클레오티드 204-341이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 서열;
(z) 뉴클레오티드 204-341이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 42의 뉴클레오티드 서열;
(aa) 뉴클레오티드 204-341이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 서열;
(bb) 뉴클레오티드 204-341이 목적한 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 44의 뉴클레오티드 서열;
(cc) 뉴클레오티드 204-342가 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 78의 뉴클레오티드 서열;
(dd) 뉴클레오티드 213-351이 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 79의 뉴클레오티드 서열;
(ee) 뉴클레오티드 204-335가 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 80에 제시된 뉴클레오티드 서열; 또는
(ff) 뉴클레오티드 204-335가 목적한 인공 miRNA를 코딩하는 서열로 치환된 서열 번호: 81에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터. - 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자.
- 제30항에 있어서, rAAV 입자가 캡시드 단백질을 포함하는 것인 rAAV 입자.
- 제31항에 있어서, 캡시드 단백질이 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 통과할 수 있는 것인 rAAV 입자.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질인 것인 rAAV 입자.
- 대상체에게 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 치료제를 전달하는 방법.
- 제34항에 있어서, 대상체가 신경변성 질환을 앓거나, 또는 신경변성 질환이 발달(development)할 위험이 있는 것인 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 투여가 대상체의 CNS로의 직접 주사를 포함하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 직접 주사가 뇌내 주사, 실질내 주사, 척수강내 주사, 선조체내 주사, 연막하 주사(subpial injection), 또는 이의 임의의 조합인 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 직접 주사가 대상체의 뇌척수액 (CSF)으로의 직접 주사이고, 임의로 여기서 직접 주사는 수조내 주사, 뇌실내 주사, 및/또는 요추내 주사인 것인 방법.
- 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 신경변성 질환이 척수소뇌실조증-2, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽 치매, 원발성 측삭 경화증, 진행성 근위축증, 변연계 우세 연령 관련 TDP-43 뇌병증, 만성 외상성 뇌병증, 루이소체 치매, 피질기저 퇴행, 진행성 핵상 마비 (PSP), 괌의 치매 파킨슨병 ALS 복합증 (G-PDC), 피크병, 해마 경화증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 또는 알츠하이머병인 것인 방법.
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