JP2024506296A - スタッファーポリヌクレオチド配列を含むベクター - Google Patents
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Abstract
本開示は、ベクタースタッファーポリヌクレオチド、ならびに発現構築物およびベクター（例えば、ウイルスベクター）を含むその組成物、ならびに治療剤（例えば、阻害性核酸）を哺乳動物に送達するかまたは疾患を処置する方法を提供する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムのサイズには、制約があることが公知であり、４．７ｋｂというおよそ天然のサイズであるベクターサイズは成功裡にパッケージングされているが、遙かにより大きなベクターゲノムは、機能的ＡＡＶベクターの生成が低減されやすい。
Description
配列表に関する陳述
本出願と関連する配列表は、紙による写しの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参考として援用される。その配列表を含むテキストファイルの名称は、６３０２６４＿４０２ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。そのテキストファイルは、１６３ＫＢであり、２０２２年２月４日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子提出されている。
本出願と関連する配列表は、紙による写しの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参考として援用される。その配列表を含むテキストファイルの名称は、６３０２６４＿４０２ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。そのテキストファイルは、１６３ＫＢであり、２０２２年２月４日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子提出されている。
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムのサイズには、制約があることが公知であり、４．７ｋｂというおよそ天然のサイズであるベクターサイズは成功裡にパッケージングされているが、遙かにより大きなベクターゲノムは、機能的ＡＡＶベクターの生成が低減されやすい（Ｗｕら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０ １８（１）： ８０－８６）。他方で、ベクターゲノムパッケージング限界より実質的に小さなベクターゲノムは、最適未満のパッケージングを生じ得る（Ｄｏｎｇら， Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １９９６ ７：２１０１－２１１２）。またｃｉｓプラスミドが、その意図されたＡＡＶベクターゲノムにサイズが近い「骨格」配列（例えば、代表的には、細菌の中でそのプラスミドを増殖させるために必要とされる、細菌の耐性の源泉および抗生物質耐性のエレメントをコードする）を有する場合、意図されない「逆パッケージング」配列の量が増加し得る（Ｈａｕｃｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００９） １７：１４４－１５２）。これらの理由から、プラスミド骨格中の物質として、および意図されたＡＡＶペイロードが、天然のＡＡＶパッケージングサイズよりかなり小さい状況における使用のために、パッケージングされたＡＡＶにそれ自体では不都合な特性を付与しない「スタッファー配列」を含めることは、有益であり得る。不活性なスタッファー配列の重要性は、Ｋｅｉｓｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０２１） ２７：１９８２－１９８９によって強調されており、それによって、スタッファー配列を有する「ペイロードのない」ＡＡＶが、非ヒト霊長類において実質的な毒性を誘導する能力があることが示された。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムのサイズには、制約があることが公知であり、４．７ｋｂというおよそ天然のサイズであるベクターサイズは成功裡にパッケージングされているが、遙かにより大きなベクターゲノムは、機能的ＡＡＶベクターの生成が低減されやすい（Ｗｕら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０ １８（１）： ８０－８６）。他方で、ベクターゲノムパッケージング限界より実質的に小さなベクターゲノムは、最適未満のパッケージングを生じ得る（Ｄｏｎｇら， Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １９９６ ７：２１０１－２１１２）。またｃｉｓプラスミドが、その意図されたＡＡＶベクターゲノムにサイズが近い「骨格」配列（例えば、代表的には、細菌の中でそのプラスミドを増殖させるために必要とされる、細菌の耐性の源泉および抗生物質耐性のエレメントをコードする）を有する場合、意図されない「逆パッケージング」配列の量が増加し得る（Ｈａｕｃｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００９） １７：１４４－１５２）。これらの理由から、プラスミド骨格中の物質として、および意図されたＡＡＶペイロードが、天然のＡＡＶパッケージングサイズよりかなり小さい状況における使用のために、パッケージングされたＡＡＶにそれ自体では不都合な特性を付与しない「スタッファー配列」を含めることは、有益であり得る。不活性なスタッファー配列の重要性は、Ｋｅｉｓｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０２１） ２７：１９８２－１９８９によって強調されており、それによって、スタッファー配列を有する「ペイロードのない」ＡＡＶが、非ヒト霊長類において実質的な毒性を誘導する能力があることが示された。
Ｗｕら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０ １８（１）： ８０－８６
Ｄｏｎｇら， Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １９９６ ７：２１０１－２１１２
Ｈａｕｃｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００９） １７：１４４－１５２
Ｋｅｉｓｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０２１） ２７：１９８２－１９８９
改善されたパッケージング特徴を有するＡＡＶベクターが現在必要とされている。
詳細な説明
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用されることになるある特定の用語の定義を提供することは、本開示の理解に助けになり得る。さらなる定義は、本開示全体を通じて示される。
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用されることになるある特定の用語の定義を提供することは、本開示の理解に助けになり得る。さらなる定義は、本開示全体を通じて示される。
本説明において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、その記載される範囲内の任意の整数および適切な場合、別段示されなければ、その分数（例えば、整数の１／１０および１／１００）の値を含むと理解されるべきである。また、任意の物理的特徴（例えば、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚み）に関する本明細書で記載される任意の数値範囲は、別段示されなければ、その記載される範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、別段示されなければ、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。用語「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書で使用される場合、その列挙される構成要素の「１またはこれより多い（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」に言及することが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、その選択肢のうちの１つ、両方、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかを意味することが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義的に使用され、これら用語およびその変形は、限定でないと解釈されることが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合的に連結されたヌクレオチドサブユニット（例えば、ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチド）から構成される任意の核酸ポリマーに言及する。核酸の例としては、ＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」とは、１またはこれより多くのリボヌクレオチドを含む分子に言及し、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えＲＮＡ、ならびに１またはこれより多くのヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡを含む。ＲＮＡ分子のヌクレオチドは、標準的なヌクレオチドまたは非標準的なヌクレオチド（例えば、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチド）を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ」とは、１またはこれより多くのデオキシリボヌクレオチドを含む分子に言及し、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、単離されたＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ならびに１またはこれより多くのヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって天然に存在するＤＮＡとは異なる改変されたＤＮＡを含む。ＤＮＡ分子のヌクレオチドは、標準的なヌクレオチドまたは非標準的なヌクレオチド（例えば、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチド）を含み得る。
「単離された」とは、その天然の環境から単離されているかまたは人工的に生成されている物質に言及する。細胞に関して本明細書で使用される場合、「単離された」とは、その天然の環境から（例えば、被験体、器官、組織、または体液から）単離されている細胞に言及する。核鎖に関して本明細書で使用される場合、「単離された」とは、その天然の環境から（例えば、細胞、細胞小器官、または細胞質から）単離もしくは精製されているか、組換え生成されているか、増幅されているか、または合成されている核酸に言及する。実施形態において、単離された核酸は、ベクター内に含まれる核酸を含む。
本明細書で使用される場合、用語遺伝子の「野生型」または「非変異体」形態とは、通常のまたは非病原性の活性と関連するタンパク質（例えば、変異（例えば、神経変性疾患の発生、開始、または進行のより高いリスクを生じる反復領域拡大）を欠いているタンパク質）をコードする核酸に言及する。
本明細書で使用される場合、用語「変異」とは、遺伝子の構造、例えば、遺伝子配列における任意の変化であって、その遺伝子の変化した形態を生じるものに言及する。変異は、次世代に伝わってもよいし（遺伝性変異）、伝わらなくてもよい（体細胞変異）。遺伝子変異は、ＤＮＡ中の１個の塩基の置換、挿入、または欠失、または遺伝子もしくは染色体の複数の塩基もしくはより大きな部分の置換、挿入、欠失、もしくは再構成（反復拡大を含む）を含む。
本明細書で使用される場合、用語「阻害性核酸」とは、標的核酸（例えば、神経変性疾患標的ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、または成熟ｍＲＮＡ）の少なくとも一部分にハイブリダイズし、その発現または活性を阻害するガイド鎖配列を含む核酸に言及する。阻害性核酸は、標的核酸のタンパク質コード領域（例えば、エキソン）または非コード領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロンなど）を標的化し得る。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、１本鎖または２本鎖の分子である。阻害性核酸は、別個の鎖上に（例えば、２本鎖の二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ））または同じ鎖の中に（例えば、１本鎖の自己アニーリング二重鎖構造）パッセンジャー鎖配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡ）である。
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」とは、標的ｍＲＮＡの切断、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制、標的ｍＲＮＡ分解、またはこれらの組み合わせによって標的遺伝子のサイレンシングを媒介する能力がある小さな非コードＲＮＡ分子をいう。代表的には、ｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）ともいわれるヘアピンまたはステム－ループ（例えば、自己相補的１本鎖骨格を有する）二重鎖構造として転写され、これは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡへと酵素によりプロセシングされる（例えば、Ｄｒｏｓｈａ、ＤＧＣＲ８、Ｐａｓｈａなどによって）。Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、細胞質へとエクスポートされ、細胞質では、Ｄｉｃｅｒによって酵素によりプロセシングされて、パッセンジャー鎖とともにｍｉＲＮＡ二重鎖を生成し、次いで、１本鎖成熟ｍｉＲＮＡ分子を生成し、これは、その後、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へとロードされる。ｍｉＲＮＡへの言及は、合成または人工ｍｉＲＮＡを含み得る。
本明細書で使用される場合、「合成ｍｉＲＮＡ」または「人工ｍｉＲＮＡ」または「ａｍｉＲＮＡ」とは、内因性の、改変された、もしくは合成のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ骨格または足場）であって、ここでステム配列内の内因性ｍｉＲＮＡガイド配列およびパッセンジャー配列が、標的化された遺伝子の高度に効率的なＲＮＡサイレンシングを指示するｍｉＲＮＡガイド配列およびｍｉＲＮＡパッセンジャー配列で置き換えられているものに言及する（例えば、Ｅａｍｅｎｓら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２０１４） １０６２：２１１－２２４を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ガイド配列およびパッセンジャー配列の相補性の性質（例えば、塩基数、ミスマッチの位置、バルジのタイプなど）は、合成ｍｉＲＮＡが構築される内因性ｍｉＲＮＡ骨格におけるガイド配列およびパッセンジャー配列の相補性の性質と類似または異なり得る。
本明細書で使用される場合、用語「マイクロＲＮＡ骨格」、「ｍｉＲ骨格」、「マイクロＲＮＡ足場」、または「ｍｉＲ足場」とは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ足場であって、そのステム配列が目的のｍｉＲＮＡによって置き換えられ、目的のｍｉＲＮＡによって標的化される遺伝子においてＲＮＡサイレンシングを指示する機能的な成熟ｍｉＲＮＡを生成することができるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ足場に言及する。ｍｉＲ骨格は、５’隣接領域（５’ｍｉＲコンテクストともいわれ、≧９ヌクレオチド）、ｍｉＲＮＡ二重鎖（ガイド鎖配列およびパッセンジャー鎖配列）を含むステム領域、ならびに基部ステム（ｂａｓａｌ ｓｔｅｍ）（５’および３’、各約４～１３ヌクレオチド）、末端ループを含む少なくとも１つのループモチーフ領域（末端ループについては≧１０ヌクレオチド）、３’隣接領域（３’ｍｉＲコンテクストともいわれ、≧９ヌクレオチド）、ならびに必要に応じてステムにおいて１個もしくはこれより多くのバルジを含む。ｍｉＲ骨格は、野生型ｍｉＲＮＡ足場から完全にもしくは部分的に由来してもよいし、完全に人工配列であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語、阻害性核酸の「アンチセンス鎖配列」または「ガイド鎖配列」は、サイレンシングのために標的化される遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０ヌクレオチド（例えば、約１５～３０ヌクレオチド、１６～２５ヌクレオチド、１８～２３ヌクレオチド、または１９～２２ヌクレオチド）の領域に対して実質的に相補的（例えば、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的）である配列に言及する。上記アンチセンス配列は、標的特異的サイレンシングを指示するために、例えば、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによって標的ｍＲＮＡの破壊を誘発するために、標的ｍＲＮＡ配列に対して十分に相補的である。いくつかの実施形態において、上記アンチセンス配列またはガイド鎖配列とは、Ｄｉｃｅｒによる切断後に残っている成熟配列に言及する。
本明細書で使用される場合、用語、阻害性核酸の「センス配列」または「パッセンジャー鎖配列」とは、標的ｍＲＮＡに相同性であり、かつ阻害性核酸の上記アンチセンス鎖配列またはガイド鎖配列に対して部分的にもしくは完全に相補的である配列に言及する。阻害性核酸のアンチセンス鎖配列およびセンス鎖配列は、二重鎖構造を形成する（例えば、２本鎖の二重鎖または１本鎖の自己アニーリング二重鎖構造を形成する）ためにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、上記センス配列またはパッセンジャー鎖配列とは、Ｄｉｃｅｒによる切断後に残っている成熟配列に言及する。
本明細書で使用される場合、「二重鎖」とは、阻害性核酸に言及して使用される場合、二重鎖構造を形成するために一緒にハイブリダイズしている２つの核酸鎖（例えば、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖）に言及する。二重鎖は、２つの別個の核酸鎖によって、または自己相補性の領域を有する単一の核酸鎖（例えば、ヘアピンまたはステム－ループ）によって、形成され得る。
本明細書で使用される場合、用語「相補的」とは、ポリヌクレオチドが互いと塩基対を形成する能力に言及する。塩基対は、代表的には、アンチパラレルポリヌクレオチド鎖または単一の自己アニーリングポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチドサブユニット間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ様式（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）において、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式において塩基対を形成し得る。当業者に明らかなように、ＤＮＡとは対照的にＲＮＡを使用する場合、アデノシンに対して相補的であると考えられる塩基は、チミンではなくウラシルである。さらに、「Ｕ」が本発明の文脈において示される場合、別段述べられなければ、「Ｔ」を置き換えることができることが理解される。相補的はまた、改変されていない核酸塩基と改変された核酸塩基（例えば、シトシンの代わりに使用される５－メチルシトシン）との間でのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含する。２つのポリヌクレオチド鎖間で完全な相補性（full complementarity）、完全な相補性（perfect complementarity）または１００％相補性とは、１つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成し得る場合である。％相補性とは、整列させた参照配列（例えば、標的ｍＲＮＡ、パッセンジャー鎖）に対して相補的である核酸分子中の連続したヌクレオチド配列のヌクレオチド数を、全ヌクレオチド数で除算し、１００を乗算したものに言及する。このようなアラインメントにおいて、塩基対を形成しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入および欠失は、連続したヌクレオチド配列の％相補性を計算するにあたっては許容されない。相補性を計算するにあたって、核酸塩基に対する化学的改変は、核酸塩基のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合能力が保持される限りにおいて考慮されないことは、当業者によって理解される（例えば、５－メチルシトシンは、％相補性を計算する目的ではシトシンと同じと見做される）。
２つまたはこれより多くの核酸配列間の「パーセント同一性」とは、参照配列によって共有される核酸分子における連続したヌクレオチド配列のヌクレオチド割合（すなわち、％同一性＝同一ヌクレオチドの数／整列させた領域におけるヌクレオチドの総数（例えば、連続したヌクレオチド配列）×１００）に言及する。挿入および欠失は、連続したヌクレオチド配列の％同一性を計算するにあたっては許容されない。同一性を計算するにあたって、核酸塩基に対する化学的改変は、核酸塩基のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合能力が保持される限りにおいて考慮されないことは、当業者によって理解される（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性を計算する目的ではシトシンと同じと見做される）。
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」または「「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」とは、アンチパラレル鎖上の塩基対間で水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成する２つの核酸鎖に言及する。２つの核酸鎖間のハイブリダイゼーションの強度は、融解温度（Ｔｍ）によって記載され得、その温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおいて、標的配列の５０％が相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度として定義される。
本明細書で使用される場合、「発現構築物」とは、配列をコードする核酸の一部または全てが転写され得る前記核酸（例えば、導入遺伝子）を含む遺伝子構築物の任意のタイプに言及する。いくつかの実施形態において、発現は、例えば、生物学的に活性なポリペプチド生成物または阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を転写された遺伝子から生成するために、核酸の転写を含む。いくつかの実施形態において、上記導入遺伝子は、発現制御配列に作動可能に連結される。
本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」とは、天然にまたは遺伝子操作手段によって、別の細胞へと移入され、転写され、必要に応じて翻訳され得る外因性核酸に言及する。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子発現」とは、核酸が核酸分子から転写され、ペプチドまたはタンパク質へとしばしば翻訳されるプロセスに言及する。上記プロセスは、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。「遺伝子発現」の測定への言及は、転写生成物（例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）、翻訳生成物（例えば、ペプチドまたはタンパク質）の測定に言及し得る。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子の発現を阻害する」とは、遺伝子の発現を低減する、ダウンレギュレートする、抑制する、遮断する、減少させる、または停止させることを意味する。遺伝子の発現生成物は、その遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。代表的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、そこから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減を生じる。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的技術を使用して決定され得る。
本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、核酸分子（例えば、阻害性核酸をコードする導入遺伝子）を細胞間で輸送し、適切な発現制御配列に作動可能に連結されている場合に、その核酸分子の発現をもたらすことができる遺伝子構築物に言及する。発現制御配列としては、以下が挙げられ得る： 転写開始配列、終結配列（本明細書においてターミネーター配列ともいわれる）、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望される場合、コードされる生成物の分泌を増強する配列。上記ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、トランスポゾン、コスミド、ファージミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどであり得る。適切な宿主細胞へといったん形質転換されると、上記ベクターは、宿主ゲノムとは無関係に複製および機能してもよいし、場合によっては、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」とは、目的の組成物（例えば、阻害性核酸）を含むか、または含む能力のある任意の細胞をいう。実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、齧歯類細胞（マウスもしくはラット）または霊長類細胞（サル、チンパンジー、もしくはヒト）である。実施形態において、宿主細胞は、インビトロまたはインビボにあり得る。実施形態において、宿主細胞は、樹立細胞株または初代細胞に由来し得る。実施形態において、宿主細胞は、ＣＮＳの細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞、星細胞、およびミクログリア細胞）である。
本明細書で使用される場合、「神経変性疾患」または「神経変性障害」とは、病的状態としての神経細胞死を示す疾患または障害をいう。神経変性疾患は、慢性的な神経変性、例えば、数年間の期間にわたるゆっくりとした進行性の神経細胞死、または急性的な神経変性、例えば、突然の発生または神経細胞死を示し得る。慢性的な神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。慢性的な神経変性疾患は、ＴＤＰ－４３プロテイノパチー（核から細胞質への誤った局在化、ユビキチン化および高リン酸化されたＴＤＰ－４３の封入体への沈着、毒性のＣ末端ＴＤＰ－４３フラグメントの形成をもたらすタンパク質短縮、ならびにタンパク質凝集よって特徴づけられる）を特徴とする疾患を含む。ＴＤＰ－４３プロテイノパチー疾患としては、ＡＬＳ、ＦＴＤ、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体型認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム島の認知症パーキンソニズムＡＬＳ複合（dementia Parkinsonism ALS complex of guam）（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病が挙げられる。急性の神経変性は、虚血（例えば、脳卒中、外傷性脳傷害）、脱髄または外傷による軸索離断（例えば、脊髄損傷または多発性硬化症）によって引き起こされ得る。神経変性疾患は、主に１つの種類のニューロンまたは複数の種類のニューロンの死を示し得る。
本明細書で使用される場合、「被験体、「患者」および「個体は、本明細書で交換可能に使用され、処置または治療のために選択された、生きている生物（例えば、哺乳動物）をいう。被験体の例としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類（サル、チンパンジー）、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット、ブタ、およびこれらのトランスジェニック種）が挙げられる。
スタッファー配列および発現構築物
ＡＡＶは、全長ゲノム、すなわち、天然のゲノムとほぼ同じサイズであり、多く過ぎも小さすぎもしないものを優先的にパッケージする。しかし、阻害性核酸配列をコードする発現カセットは、ＡＡＶ全長ゲノムより実質的に小さい。フラグメント化されたゲノムのパッケージングを回避するために、スタッファー配列は、異種核酸配列を含む発現構築物に連結し、５’ ＩＴＲおよび３’ ＩＴＲによって挟んで、パッケージング可能なゲノムを拡大することができ、その結果、上記ＩＴＲ間の長さにおいてサイズがほぼ通常であるゲノムを生じた。一般に、ＡＡＶのパッケージング能力は、５’ ＩＴＲと３’ ＩＴＲとの間で約４．７ｋｂである。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターに関しては、そのパッケージング能力は、５’ ＩＴＲと３’ ＩＴＲとの間で約２．４ｋｂである。
ＡＡＶは、全長ゲノム、すなわち、天然のゲノムとほぼ同じサイズであり、多く過ぎも小さすぎもしないものを優先的にパッケージする。しかし、阻害性核酸配列をコードする発現カセットは、ＡＡＶ全長ゲノムより実質的に小さい。フラグメント化されたゲノムのパッケージングを回避するために、スタッファー配列は、異種核酸配列を含む発現構築物に連結し、５’ ＩＴＲおよび３’ ＩＴＲによって挟んで、パッケージング可能なゲノムを拡大することができ、その結果、上記ＩＴＲ間の長さにおいてサイズがほぼ通常であるゲノムを生じた。一般に、ＡＡＶのパッケージング能力は、５’ ＩＴＲと３’ ＩＴＲとの間で約４．７ｋｂである。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターに関しては、そのパッケージング能力は、５’ ＩＴＲと３’ ＩＴＲとの間で約２．４ｋｂである。
好ましくは、ベクタースタッファー配列を得るための出発配列は、哺乳動物起源（例えば、ヒト起源）のものである。スタッファー配列の長さは、ベクターゲノムがＡＡＶキャプシドの（天然の）パッケージング限界であるかまたはその付近であるように調整され得る。さらに、ベクタースタッファー配列は、インビボでの遺伝子療法の文脈において有害作用を最小限にするように設計され得る。例えば、ヒトゲノムの領域は、ゲノム中の組み込みが起こる場合に最小限の影響を、および予測外の転写を開始する最小限のリスクを有する配列を特定することによって、ベクタースタッファー配列の供給源として特定され得る。従って、上記ゲノムの領域は、以下のものにおいて調べられ得る： ｉ）欠失および重複が集団において一般的でありかつ疾患関連表現型と関連しない（進化圧（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の証拠がない）、ならびに／または ｉｉ）ヒト組織にわたるＲＮＡ発現が低いか、または検出不能であった（強い固有のエンハンサー／プロモーターエレメントを欠いている）。さらに、ベクタースタッファー配列は、ベクター配列を不活性または安全にするために、１またはこれより多くのエレメントを低減、最小化、除去、または欠如するように設計され得る。いくつかの実施形態において、ベクタースタッファー配列は、以下のように改変される： 発現された領域（例えば、両側にエキソン＋１０ｂｐ、ヒトＥＳＴｓ）を低減または除去する； 調節エレメント（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、スプライシングドナーもしくはアクセプター、または導入遺伝子の転写に潜在的に影響を及ぼし得るヒトゲノムにおいて見出される他のシス作用性エレメント）を低減または除去する； 反復エレメント（例えば、マイクロサテライト反復、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復）を低減または除去する； ＡＴＧコドンを低減、除去、または改変して、ペプチドが潜伏性開始コドンに起因してフィラー配列もしくはスタッファー配列から生成される可能性を低減または排除する； ＣｐＧジヌクレオチドを低減または排除して、自然免疫応答を誘導する（細菌において生成されるｃｉｓプラスミドからの）非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの尤度を下げる； またはこれらの任意の組み合わせ。本開示は、前述の特徴のうちの１またはこれより多くのものを有し、以下のうちの１またはこれより多くのさらなる特徴： 高力価； 低毒性； ならびにｍｉＲＮＡおよび／もしくはスタッファー配列における低減された短縮を有するベクタースタッファー配列を提供する。
１つの局面において、本開示は、約１３００～約２３００ヌクレオチドの長さの、以下と少なくとも７５％同一性を有する核酸を含むベクタースタッファー配列を提供する： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９， 配列番号５０； または配列番号５１。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、約１５００～２０００ヌクレオチドの長さの、以下と少なくとも７５％同一性を有する核酸を含む： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９、配列番号５０；または配列番号５１。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、約１６００～１９００ヌクレオチドの長さの、以下と少なくとも７５％同一性を有する核酸を含む： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９， 配列番号５０；または配列番号５１。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、以下と少なくとも８０％同一性を有する核酸を含む： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９、配列番号５０；または配列番号５１。いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、約１，３００～２，３００ヌクレオチドの長さの、約１，５００～２，０００ヌクレオチドの長さの、または約１，６００～１，９００ヌクレオチドの長さの核酸を含む。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、以下と少なくとも８５％同一性を有する核酸を含む： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９， 配列番号５０；または配列番号５１。いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、約１，３００～２，３００ヌクレオチドの長さの、約１，５００～２，０００ヌクレオチドの長さの、または約１，６００～１，９００ヌクレオチドの長さの核酸を含む。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、以下と少なくとも９０％同一性を有する核酸を含む： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９， 配列番号５０；または配列番号５１。いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、約１，３００～２，３００ヌクレオチドの長さの、約１，５００～２，０００ヌクレオチドの長さの、または約１，６００～１，９００ヌクレオチドの長さの核酸を含む。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、以下と少なくとも９５％同一性を有する核酸を含む： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９， 配列番号５０；または配列番号５１。いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、約１，３００～２，３００ヌクレオチドの長さの、約１，５００～２，０００ヌクレオチドの長さの、または約１，６００～１，９００ヌクレオチドの長さの核酸を含む。いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、以下と少なくとも９７％同一性を有する核酸を含む： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９、配列番号５０；または配列番号５１。いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、約１，３００～２，３００ヌクレオチドの長さの、約１，５００～２，０００ヌクレオチドの長さの、または約１，６００～１，９００ヌクレオチドの長さの核酸を含む。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、以下を含むかまたはからなる： 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号４５； 配列番号４６； 配列番号４７； 配列番号４８； 配列番号４９、配列番号５０；または配列番号５１。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、配列番号４８、または配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５を含むかまたはからなる。
いくつかの実施形態において、上記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、必要に応じて、ここで上記ＡＡＶベクターは、自己相補的である。
いくつかの実施形態において、上記ベクタースタッファー配列は、異種核酸配列を含む発現構築物に隣接して（例えば、５’側または３’側に）配置される。いくつかの実施形態において、上記異種核酸配列は、治療剤をコードする。いくつかの実施形態において、上記治療剤は、治療用タンパク質をコードする核酸または阻害性核酸を含む。いくつかの実施形態において、上記阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記阻害性核酸は、神経変性疾患関連遺伝子を標的化する、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または（of）ｄｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記神経変性疾患は、脊髄小脳失調症２型、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体型認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム島の認知症パーキンソニズムＡＬＳ複合（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、またはアルツハイマー病である。いくつかの実施形態において、上記神経変性疾患は、ポリグルタミン反復病（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｒｅｐｅａｔ ｄｉｓｅａｓｅ）である。いくつかの実施形態において、上記阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡ）は、ＡＴＸＮ２を標的化する。ＡＴＸＮ２とは、ポリグルタミン（ポリＱ、ＣＡＧ反復）トラクトを含む、ＡＴＸＮ２遺伝子によってコードされるタンパク質をいう。ＡＴＸＮ２遺伝子または転写物は、ＡＴＸＮ２の通常のアレル（これは、代表的には、２２回もしくは２３回反復を有する）、または中程度（約２４～３２回反復）もしくはより長い反復拡大（約３３回から＞１００回の反復）を有する変異したアレルに言及し得る。いくつかの実施形態において、ＡＴＸＮ２とは、ヒトＡＴＸＮ２を含む哺乳動物ＡＴＮＸ２に言及する。
いくつかの実施形態において、上記発現構築物は、ＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡをコードする異種核酸を含む。ガイド配列およびパッセンジャー配列、ならびにＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡをコードする異種核酸の例は、表５に提供される。そのコードされるガイド配列、パッセンジャー配列、および人工ｍｉＲＮＡ配列のＲＮＡフォーマットは、ｃｉｓプラスミドおよびｒＡＡＶベクターへの挿入のためのＤＮＡフォーマットと同様に提供される。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡをコードし、配列番号１～４および７１から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号１によって提供されるガイド配列および配列番号５によって提供されるパッセンジャー配列を含む人工ｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号２によって提供されるガイド配列および配列番号６によって提供されるパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号３によって提供されるガイド配列および配列番号７によって提供されるパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号４によって提供されるガイド配列および配列番号８によって提供されるパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号７１によって提供されるガイド配列および配列番号７２によって提供されるパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、上記異種核酸は、ｍｉＲＮＡ骨格（または足場）に埋め込まれた、ガイド配列およびパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡ骨格は、ｍｉＲ－１００またはｍｉＲ－１－１である。いくつかの実施形態において、上記異種核酸は、配列番号９～１２および７３のうちのいずれか１つによって提供される人工ｍｉＲＮＡ配列をコードする。ＡＴＸＮ２標的化ガイド配列、パッセンジャー配列、ｍｉＲ骨格、および人工ｍｉＲＮＡ配列のさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０２１／１５９００８（その全体において本明細書に参考として援用される）において提供される。
いくつかの実施形態において、上記発現構築物は、上記導入遺伝子（例えば、人工ｍｉＲＮＡをコードする核酸）と作動可能に連結された１またはこれより多くの発現制御配列（調節配列）をさらに含む。「作動可能に連結された」配列は、導入遺伝子と連続しているか、または導入遺伝子の発現を制御するためにその導入遺伝子からトランスでもしくは一定の距離において作用する発現制御配列を含む。発現制御配列の例としては、転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、スプライス部位配列、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、内因性プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、ＣＮＳ特異的）、または細胞特異的プロモーター（ニューロン、グリア細胞、または星細胞）である。構成的プロモーターの例としては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーとともに）、ＳＶ４０プロモーター、およびジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制性システム、テトラサイクリン誘導性システム、ＲＵ４８６誘導性システム、およびラパマイシン誘導性システムが挙げられる。使用され得るプロモーターのさらなる例としては、例えば、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、ＣＡＧプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＪｅＴプロモーター、シナプシンプロモーター、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター、またはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６、Ｈ１など）が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、組織特異的ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、上記組織特異的ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ニューロン特異的発現を示す遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、上記ニューロン特異的プロモーターは、シナプシン１プロモーターまたはシナプシン２プロモーターである。
いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、Ｈ１プロモーターである。いくつかの実施形態において、上記Ｈ１プロモーターは、本明細書において「天然」Ｈ１プロモーターといわれるプロモーター（例えば、配列番号５３に示される配列を含むかまたはからなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、本明細書において「ショート」Ｈ１プロモーターといわれるプロモーター（例えば、配列番号５４に示される配列または配列番号１７、２５～２８、および３７～４４のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１３～２０３を含むまたはからなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、本明細書において「ロング」Ｈ１プロモーターといわれるプロモーター（例えば、配列番号５２に示される配列または配列番号１３～１６および１８～２４のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１３～３４３を含むまたはからなるプロモーター）である。
いくつかの実施形態において、上記終結配列は、ＳＶ４０終結配列である。ＳＶ４０終結配列の例は、配列番号７７； 配列番号２０、２１、２３、および２４のうちのいずれか１つのヌクレオチド４８９～７１０； 配列番号３１、３２、３５、および３６のうちのいずれか１つのヌクレオチド３５８～５７９； 配列番号４０、４１、および４４のうちのいずれか１つのヌクレオチド３４９～５７０に示される。
いくつかの実施形態において、本開示の阻害性核酸をコードする配列は、発現構築物の非翻訳領域に配置される。いくつかの実施形態において、本開示の阻害性核酸をコードする配列は、発現構築物のイントロン、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に配置される。いくつかの実施形態において、本開示の阻害性核酸をコードする配列は、上記プロモーターの下流側かつ発現される遺伝子の上流側のイントロンに配置される。
ベクターおよび宿主細胞
別の局面において、本開示のベクタースタッファー配列を含むベクターが提供される。ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターの例としては、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ｍｏｕｓｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）、マウス白血病ウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター）、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、またはトリ細網内皮症ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ １型およびＨＩＶ ２型を含む））、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、またはマエディ－ビスナウイルスベクターである。
別の局面において、本開示のベクタースタッファー配列を含むベクターが提供される。ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターの例としては、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ｍｏｕｓｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）、マウス白血病ウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター）、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、またはトリ細網内皮症ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ １型およびＨＩＶ ２型を含む））、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、またはマエディ－ビスナウイルスベクターである。
いくつかの実施形態において、上記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター）であり、これは、組換え法によって生成される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、本開示のベクタースタッファー配列および異種核酸配列（例えば、阻害性核酸をコードする）を含む発現構築物を含む。上記ベクタースタッファー配列は、上記異種核酸を含む発現構築物の５’側または３’側のいずれかに隣接して配置され得る。
ＡＡＶは、複製（ｒｅｐ）およびキャプシド（Ｃａｐ）のためのタンパク質をコードし、２つのＩＴＲ（これは、ウイルスゲノムの複製起点として働く）に挟まれたゲノムを有する、１本鎖のエンベロープのないＤＮＡウイルスである。ＡＡＶはまた、パッケージング配列を含み、これは、ＡＡＶキャプシドへのウイルスゲノムのパッケージングを可能にする。組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（ｒＡＡＶベクターゲノム、またはｒＡＡＶゲノムともいわれる）は、野生型ゲノム（例えば、Ｒｅｐ、Ｃａｐ）の全てまたは一部をＡＡＶから除去するために分子的方法を使用し、それを非天然の核酸（例えば、異種核酸配列（例えば、阻害性核酸をコードする核酸分子）で置き換えることによって、ＡＡＶの野生型ゲノムから得られ得る。代表的には、ＡＡＶに関しては、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のうちの一方または両方が、ｒＡＡＶベクターにおいて保持される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、発現構築物およびベクタースタッファー配列に隣接する５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）および３’ ＩＴＲを含む。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶウイルス粒子の救済、複製およびパッケージングのために必要である。従って、ｒＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされる少なくともそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むように本明細書で定義される。全ての他のウイルス配列は、トランスで供給され得る。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、上記ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するために、ＡＡＶゲノムに由来する５’ ＩＴＲおよび３’ ＩＴＲを保持するのみである。いくつかの実施形態において、各ＡＡＶ ＩＴＲは、全長ＩＴＲ（例えば、およそ１４５ｂｐの長さであり、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を含む）である。いくつかの実施形態において、上記ＩＴＲのうちの一方または両方は、上記ＩＴＲが機能的な救済、複製、及びパッケージングを提供することを条件として、例えば、挿入、欠失、または置換によって改変される。いくつかの実施形態において、改変されたＩＴＲは、機能的末端分解部位（ｔｒｓ）を欠いており、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶベクター）の生成のために使用される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’側に変異体ＩＴＲ（末端分解部位を欠いている）および３’側に野生型ＡＡＶ ＩＴＲを含む自己相補的ＡＡＶベクターである。末端分解部位を欠いている変異体５’ ＩＴＲの例は、配列番号５７、または配列番号１３～２４、２９～４４、および７８～８２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～１０６に示される。いくつかの実施形態において、改変されたＩＴＲは、ＡＩＴＲ（Ｄ－配列およびＴＲＳが欠失している）といわれるＡＡＶ２ ＩＴＲの短縮型バージョンである
いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、配列番号５７、または配列番号１３～２４、２９～４４、および７８～８２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、以下を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲを含む： 配列番号５８、配列番号１３～１６のうちのいずれか１つのヌクレオチド２１９２～２３５８、配列番号１３～１６のうちのいずれか１つのヌクレオチド２２１４～２３５８、配列番号１７のヌクレオチド２２２９～２３９５、配列番号１７のヌクレオチド２２５１～２３９５、配列番号１８のヌクレオチド２１８４～２３５０、配列番号１８のヌクレオチド２２０６～２３５０； 配列番号１９のヌクレオチド２２０６～２３５０； 配列番号２０のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号２１のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号２２のヌクレオチド２２０６～２３５０； 配列番号２３のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号２４のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号２５のヌクレオチド２１６１～２３０５； 配列番号２６のヌクレオチド２１６１～２３０５； 配列番号２７のヌクレオチド２１６１～２３０５； 配列番号２８のヌクレオチド２１６１～２３０５； 配列番号２９のヌクレオチド２２６６～２４１０； 配列番号３０のヌクレオチド２２２４～２３６８； 配列番号３１のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号３２のヌクレオチド２２２５～２３６９； 配列番号３３のヌクレオチド２２６６～２４１０； 配列番号３４のヌクレオチド２２２４～２３６８； 配列番号３５のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号３６のヌクレオチド２２２５～２３６９； 配列番号３７のヌクレオチド２２５７～２４０１； 配列番号３８のヌクレオチド２２５８～２４０２； 配列番号３９のヌクレオチド２２１５～２３５９； 配列番号４０のヌクレオチド２２０７～２３５１； 配列番号４１のヌクレオチド２２０７～２３５１； 配列番号４２のヌクレオチド２２５７～２４０１； 配列番号４３のヌクレオチド２２１５～２３５９； 配列番号４４のヌクレオチド２２０７～２３５１； 配列番号７８のヌクレオチド２２５８～２４０２； 配列番号７９のヌクレオチド２２６７～２４１１； 配列番号８０のヌクレオチド２２５１～２３９５； 配列番号８１のヌクレオチド２２５１～２３９５； 配列番号８２のヌクレオチド２１８７～２３３１。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、以下を含む： 配列番号５７を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲ、および配列番号５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１３のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１３のヌクレオチド２１９２～２３５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１４のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１４のヌクレオチド２１９２～２３５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１５のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１５の２１９２～２３５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１６のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１６の２１９２～２３５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１７のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１７のヌクレオチド２２２９～２３９５を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１８のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１８のヌクレオチド２１８４～２３５０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１３のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１３のヌクレオチド２２１４～２３５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１４のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１４のヌクレオチド２２１４～２３５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１５のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１５の２２１４～２３５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１６のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１６の２２１４～２３５８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１７のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１７の２２５１～２３９５を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１８のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１８のヌクレオチド２２０６～２３５０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号１９のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号１９のヌクレオチド２２０６～２３５０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２０のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２０のヌクレオチド２２１６～２３６０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２１のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２１のヌクレオチド２２１６～２３６０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２２のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２２のヌクレオチド２２０６～２３５０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２３のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２３のヌクレオチド２２１６～２３６０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２４のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２４のヌクレオチド２２１６～２３６０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２５のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２５のヌクレオチド２１６１～２３０５を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２６のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２６のヌクレオチド２１６１～２３０５を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２７のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２７のヌクレオチド２１６１～２３０５を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２８のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２８のヌクレオチド２１６１～２３０５を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号２９のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号２９のヌクレオチド２２６６～２４１０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３０のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３０のヌクレオチド２２２４～２３６８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３１のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３１のヌクレオチド２２１６～２３６０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３２のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３２のヌクレオチド２２２５～２３６９を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３３のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３３のヌクレオチド２２６６～２４１０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３４のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３４のヌクレオチド２２２４～２３６８を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３５のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３５のヌクレオチド２２１６～２３６０を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３６のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３６のヌクレオチド２２２５～２３６９を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３７のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３７のヌクレオチド２２５７～２４０１を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３８のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３８のヌクレオチド２２５８～２４０２を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号３９のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号３９のヌクレオチド２２１５～２３５９を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号４０のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号４０のヌクレオチド２２０７～２３５１を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号４１のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号４１のヌクレオチド２２０７～２３５１を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号４２のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号４２のヌクレオチド２２５７～２４０１を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号４３のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号４３のヌクレオチド２２１５～２３５９を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； ａ 配列番号４４のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号４４のヌクレオチド２２０７～２３５１を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号７８のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号７８のヌクレオチド２２５８～２４０２を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号７９のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号７９のヌクレオチド２２６７～２４１１を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号８０のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号８０のヌクレオチド２２５１～２３９５を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ； 配列番号８１のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号８１のヌクレオチド２２５１～２３９５を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ；あるいは配列番号８２のヌクレオチド１～１０６を含むかまたはからなる５’ ＩＴＲおよび配列番号８２のヌクレオチド２１８７～２３３１を含むかまたはからなる３’ ＩＴＲ。
いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、霊長類血清型ＡＡＶベクターまたはヒト血清型ＡＡＶベクターを含む、哺乳動物の血清型ＡＡＶベクター（例えば、哺乳動物の血清型ＡＡＶに由来するＡＡＶゲノムおよびＩＴＲ）である。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、キメラＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、上記ＩＴＲは、以下のＡＡＶ血清型から選択される： ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ １２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ １５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５、またはこれらのバリアント。
いくつかの実施形態において、上記異種核酸配列は、治療剤をコードする。いくつかの実施形態において、上記治療剤は、治療用タンパク質をコードする核酸または阻害性核酸を含む。いくつかの実施形態において、上記阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記阻害性核酸は、神経変性疾患関連遺伝子を標的化する、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または（of）ｄｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記神経変性疾患は、脊髄小脳失調症２型、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体型認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム島の認知症パーキンソニズムＡＬＳ複合（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、またはアルツハイマー病である。いくつかの実施形態において、上記神経変性疾患は、ポリグルタミン反復病である。いくつかの実施形態において、上記阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡ）は、ＡＴＸＮ２を標的化する。いくつかの実施形態において、ＡＴＸＮ２とは、哺乳動物ＡＴＮＸ２（ヒトＡＴＸＮ２を含む）をいう。
いくつかの実施形態において、上記発現構築物は、ＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡをコードする異種核酸を含む。ガイド配列およびパッセンジャー配列ならびにＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡを含む異種核酸の例は、表５において提供される。そのコードされるガイド配列、パッセンジャー配列、および人工ｍｉＲＮＡ配列のＲＮＡフォーマットは、ｃｉｓプラスミドおよびｒＡＡＶベクターへの挿入のためのＤＮＡフォーマットと同様に提供される。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡをコードし、配列番号１～４および７１から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号１によって提供されるガイド配列および配列番号５によって提供されるパッセンジャー配列を含む人工ｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号２によって提供されるガイド配列および配列番号６によって提供されるパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号３によって提供されるガイド配列および配列番号７によって提供されるパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号４によって提供されるガイド配列および配列番号８によって提供されるパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、配列番号７１によって提供されるガイド配列および配列番号７２によって提供されるパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、上記異種核酸は、ｍｉＲＮＡ骨格（または足場）に埋め込まれたガイド配列およびパッセンジャー配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡ骨格は、ｍｉＲ－１００またはｍｉＲ－１－１である。いくつかの実施形態において、上記異種核酸は、配列番号９～１２および７３のうちのいずれか１つによって提供される人工ｍｉＲＮＡ配列をコードする。ＡＴＸＮ２を標的化するガイド配列、パッセンジャー配列、ｍｉＲ骨格、および人工ｍｉＲＮＡ配列のさらなる例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０２１／１５９００８（これはその全体において参考として援用される）において提供される。
他の発現制御配列は、上記異種核酸（例えば、阻害性核酸をコードする）に作動可能に連結される上記ｒＡＡＶベクター中に存在し得、それらとしては、転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、スプライス部位配列、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、またはこれらの任意の組み合わせのうちの１またはこれより多くのものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、Ｈ１プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、上記Ｈ１プロモーターは、天然Ｈ１プロモーター（例えば、配列番号５３に示される配列を含むかまたはからなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ショートＨ１プロモーター（例えば、配列番号５４に示される配列、または配列番号１７、２５～２８、および３７～４４のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１３～２０３を含むかまたはからなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、ロングＨ１プロモーター（例えば、配列番号５２、または配列番号１３～１６および１８～２４のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１３～３４３に示される配列を含むかまたはからなるプロモーター）である。いくつかの実施形態において、上記Ｈ１プロモーターは、発現構築物において、特に、５’ ＩＴＲが末端分解部位を欠いている場合に、５’から３’方向に配向される。
いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、ＳＶ４０終結配列を含む。ＳＶ４０終結配列の例は、配列番号７７； 配列番号２０、２１、２３、および２４のうちのいずれか１つのヌクレオチド４８９～７１０； 配列番号３１、３２、３５、および３６のうちのいずれか１つのヌクレオチド３５８～５７９； 配列番号４０、４１、および４４のうちのいずれか１つのヌクレオチド３４９～５７０に示される。
ｒＡＡＶベクターは、全体的にまたは部分的に欠失される１またはこれより多くのＡＡＶ野生型遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、複製欠損性である。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、機能的Ｒｅｐタンパク質および／またはキャプシドタンパク質を欠く。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。
いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲ、ＡＴＸＮ２特異的人工ｍｉＲＮＡをコードする異種核酸に作動可能に連結されたプロモーター、ベクタースタッファー配列、および３’ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、上記５’ ＩＴＲは、末端分解部位を欠くように改変される。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、５’から３’方向において配向される。
いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号１３～２４、２９～４４、および７８～８０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３３５は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号２４に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド３４４～４８１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号２９に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５０は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５０は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５０は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５０は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５０は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５０は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５０は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５０は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号３９に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号４４に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号７８に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３４２は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号７９に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２１３～３５１は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号８０に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３３５ は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまで、配列番号８１に示されるヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド２０４～３３５は、目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている。
本開示の組換えＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ粒子を形成するために１またはこれより多くのＡＡＶキャプシドタンパク質によって被包され得る。「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」とは、ＡＡＶタンパク質シェルを含み、目的の導入遺伝子（これは、５’ ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ ＡＡＶ ＩＴＲが各側に隣接している）を含むｒＡＡＶベクターを被包する感染性の複製欠損ウイルスに言及する。ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能およびアクセサリー機能を指定する配列をその中に導入された適切な宿主細胞中で産生され、その宿主細胞が、上記ｒＡＡＶベクター（目的の導入遺伝子配列を含む）を、その後の遺伝子送達のために感染性ｒＡＡＶ粒子へとパッケージングするために必要とされるＡＡＶポリペプチドをコードし得るようにする。
宿主細胞培養物を使用してＡＡＶキャプシドタンパク質へと組換えＡＡＶベクターをパッケージングする方法は、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターをパッケージングするために必要とされる構成要素のうちの１またはこれより多くのもの（例えば、Ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはアクセサリー機能）は、（例えば、ベクターによって）上記１またはこれより多くの必要とされる構成要素を含むように操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。ＡＡＶパッケージングのためのその必要とされる構成要素の発現は、宿主パッケージング細胞において誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下にあり得る。ＡＡＶヘルパーベクターは、ＡＡＶ複製のために必要な、失っているＡＡＶ機能を補完するために、トランスで機能するＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の一過性の発現を提供するために一般に使用される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパーベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、それら自体で複製もパッケージングもできない。ＡＡＶヘルパーベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態にあり得る。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、三重トランスフェクション法（例えば、米国特許第６，００１，６５０号（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）を使用して生成され得る。このアプローチにおいて、上記ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパーベクター、およびアクセサリー機能ベクターへとパッケージングされるために、宿主細胞をｒＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）でトランスフェクトすることによって生成され得る。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（例えば、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）をも生成することなく、効率的ＡＡＶベクター生成を支援する。上記アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来ウイルスおよび／または細胞機能（例えば、「アクセサリー機能のためのヌクレオチド配列をコードする。上記アクセサリー機能は、ＡＡＶ複製のために必要とされるそれらの機能（ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現生成物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリの活性化に関与するそれらの部分が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。ウイルスベースのアクセサリー機能は、公知のヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルス）のうちのいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態において、二重トランスフェクション法（この場合、ＡＡＶヘルパー機能およびアクセサリー機能は、単一のベクター上にクローニングされる）は、ｒＡＡＶ粒子を生成するために使用される。
ＡＡＶキャプシドは、ｒＡＡＶ粒子のこれらの組織特異性を決定するに当たって重要なエレメントである。従って、キャプシド組織特異性を有するｒＡＡＶ粒子が選択され得る。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ １２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＴＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＧＧＴ－Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ－ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ １５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５、およびこれらのバリアントのＡＡＶ血清型から選択されるキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、血液脳関門を横断する能力のある血清型、例えば、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ－Ｂ、またはこれらのバリアントから選択される。ＡＡＶ９キャプシド配列の例は、米国特許第７，９０６，１１１号（その全体において参考として援用される）において提供される。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、キメラＡＡＶキャプシドである。いくつかの実施形態において、上記ＡＡＶ粒子は、異なるＡＡＶ血清型に由来するキャプシドおよびゲノムを有する偽型化ＡＡＶである。
いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶ粒子は、ＣＮＳの細胞を形質導入する能力がある。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶ粒子は、ＣＮＳの非ニューロン細胞またはニューロン細胞を形質導入する能力がある。いくつかの実施形態において、上記ＣＮＳ細胞は、ニューロン、グリア細胞、星細胞、またはミクログリア細胞である。
別の局面において、本開示は、本明細書で記載されるベクタースタッファー配列を含むｒＡＡＶ粒子でトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞である。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞）、細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、蚊）などである。
使用方法
別の局面において、本開示は、治療剤を被験体に送達する方法であって、上記方法は、本開示の組成物（例えば、本明細書で提供されるベクタースタッファー配列および治療剤をコードする異種核酸配列を含む発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子、）を投与することを包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＣＮＳ細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＣＮＳの非ニューロン細胞またはニューロン細胞である。いくつかの実施形態において、上記ＣＮＳの非ニューロン細胞は、グリア細胞、星細胞、またはミクログリア細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、インビトロにある。いくつかの実施形態において、上記細胞は、神経変性疾患の１もしくはこれより多くの症状を有するか、または神経変性疾患を有すると疑われる被験体に由来する。
別の局面において、本開示は、治療剤を被験体に送達する方法であって、上記方法は、本開示の組成物（例えば、本明細書で提供されるベクタースタッファー配列および治療剤をコードする異種核酸配列を含む発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子、）を投与することを包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＣＮＳ細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＣＮＳの非ニューロン細胞またはニューロン細胞である。いくつかの実施形態において、上記ＣＮＳの非ニューロン細胞は、グリア細胞、星細胞、またはミクログリア細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、インビトロにある。いくつかの実施形態において、上記細胞は、神経変性疾患の１もしくはこれより多くの症状を有するか、または神経変性疾患を有すると疑われる被験体に由来する。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」とは、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ／ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病など）の発生を防止もしくは遅らせること；神経変性疾患の重篤度を低減すること； 神経変性疾患に特徴的な症状の発生を低減または防止すること； 神経変性疾患に特徴的な症状の増悪を防止すること、またはこれらの任意の組み合わせに言及する。
いくつかの実施形態において、被験体は、神経変性疾患を有するか、または神経変性疾患を発生させるリスクにある。神経変性疾患の例としては、脊髄小脳失調症２型、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体型認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム島の認知症パーキンソニズムＡＬＳ複合（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本開示の処置のための方法は、神経変性疾患に特徴的な１またはこれより多くの症状の発生または進行を低減、防止、または遅らせる。神経変性疾患に特徴的な症状の例としては、運動機能障害、認知機能障害、情動／行動機能障害、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。麻痺、震え、不安定、硬直、痙攣、筋力低下、筋痙攣、筋硬直、筋萎縮症、嚥下困難、呼吸困難、発話および言語障害（ｓｐｅｅｃｈ ａｎｄ ｌａｎｇｕａｇｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｉｅｓ）（例えば、不明瞭発語）、動作緩慢、歩行困難、認知症、うつ、不安、またはこれらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態において、本開示の処置のための方法は、神経変性疾患の処置のための単剤療法としての、または１またはこれより多くのさらなる治療との組み合わせでの投与を包含する。併用療法は、１またはこれより多くの治療と併せて、その前、引き続いての、被験体への本開示の組成物の投与を意味し得る。併用療法の同時の投与は、本開示の組成物およびさらなる治療が、同じ投与形態での投与のために製剤化されているか、または別個の投与形態において投与されることを意味し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおいて処置される被験体は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット）、好ましくは霊長類（例えば、サル、チンパンジー）、またはヒトである。
本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおいて、本開示の組成物は、任意の経路によって（経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、軟膜下、実質内、線条体内、頭蓋内、大槽内、脳内、脳室内、眼内、室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、腰椎内、皮下、経皮、皮内、直腸、腟内、腹腔内、局所（散剤、軟膏剤、クリーム剤、および／もしくは滴剤によるような）、粘膜、鼻、頬側（bucal）、舌下が挙げられる）； 気管内滴注、気管支滴注、および／もしくは吸入によって；ならびに／または経口スプレー、鼻スプレー、および／もしくはエアロゾルとして、被験体に投与され得る。一般に、最も適切な投与経路は、薬剤の性質（例えば、消化管の環境におけるその安定性）、および／または被験体の状態を含む種々の要因に依存する。いくつかの実施形態において、組成物は、被験体のＣＮＳへと直接注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、髄腔内、軟膜下、実質内、線条体内、頭蓋内、大槽内、脳内、脳室内、眼内、室内、腰椎内投与、またはこれらの任意の組み合わせによって注射される。
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、被験体のＣＮＳへと直接注射される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳへの直接注射は、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、線条体内注射、軟膜下注射、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＣＮＳへの直接注射は、被験体の脳脊髄液（ＣＳＦ）への直接注射であり、必要に応じて、ここで上記直接注射は、大槽内注射、室内注射、腰椎内注射、またはこれらの任意の組み合わせである。
実施例
実施例１：ベクター「スタッファー」配列の設計
ベーススタッファー配列についての「必ずしも必要でない」ヒトゲノムＤＮＡの選択
スタッファー配列のいかなる望ましくない影響をも最小限にするために、2つの意図した特性を有するヒトゲノムの「必ずしも必要でない」領域を特定した：（ａ）ゲノムにおける組み込みが起こる場合に最小限の影響を有する配列（しかし、これはＡＡＶに関しては非常に希であると考えられる）；および（ｂ）予測外の転写の開始の最小限のリスクを有する配列。従って、ｉ）欠失および重複が集団において一般的であり、疾患関連表現型とは関連していない（進化圧の証拠がない）；ならびに／またはｉｉ）ヒト組織にわたるＲＮＡ発現が低いかまたは検出不能である（強い固有のエンハンサー／プロモーターエレメントを欠いている）ゲノムの領域を調べた。この検索から、２つの領域を優先した：
実施例１：ベクター「スタッファー」配列の設計
ベーススタッファー配列についての「必ずしも必要でない」ヒトゲノムＤＮＡの選択
スタッファー配列のいかなる望ましくない影響をも最小限にするために、2つの意図した特性を有するヒトゲノムの「必ずしも必要でない」領域を特定した：（ａ）ゲノムにおける組み込みが起こる場合に最小限の影響を有する配列（しかし、これはＡＡＶに関しては非常に希であると考えられる）；および（ｂ）予測外の転写の開始の最小限のリスクを有する配列。従って、ｉ）欠失および重複が集団において一般的であり、疾患関連表現型とは関連していない（進化圧の証拠がない）；ならびに／またはｉｉ）ヒト組織にわたるＲＮＡ発現が低いかまたは検出不能である（強い固有のエンハンサー／プロモーターエレメントを欠いている）ゲノムの領域を調べた。この検索から、２つの領域を優先した：
領域Ｉ：ＡＭＥＬＹ遺伝子領域（ｃｈｒＹ：６，８６５，９１８－６，８７４，０２７， ＨＧ３８）
多数の一連の証拠から、ＡＭＥＬＹ遺伝子領域は進化的選択の下にないことが示唆される。第１に、ＡＭＥＬＹ領域は、古来の重複事象から生じたものであり、選択下にあるＸ染色体上に機能的ホモログを有する（Ｌａｈｎ， ＆ Ｐａｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９） ２８６， ９６４－９６７）。第２に、ＡＭＥＬＹ遺伝子は、最近の陽性選択の証拠はなく、予測されるより多くのタンパク質変化バリアント（ｐｔｏｔｅｉｎ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ）（推定される機能喪失バリアントを含む）を有する（Ｎａｔｕｒｅ（２０２０） ５８１， ４３４－４４３； ｈｔｔｐｓ：／／ｇｎｏｍａｄ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅ／ＥＮＳＧ００００００９９７２１？ｄａｔａｓｅｔ＝ｇｎｏｍａｄ＿ｒ２＿１）。第３に、ＡＭＥＬＹ領域の遺伝的バリアントは、欠失または重複に関してヒトにおいて表現型的影響を有しないことが示されている。ＡＭＥＬＹの重複は一般的であり、表現型を有しない（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．（２０１５） １３４：７８９－８００）。第４に、欠失は一般的であり、検出可能な表現型を有しない（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ （２００７） １６：３０７－１６）。さらに、ＡＭＥＬＹは、ヒトのいかなる希少疾患とも関連付けられていない（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ， ＯＭＩＭ．ｏｒｇ．）。
多数の一連の証拠から、ＡＭＥＬＹ遺伝子領域は進化的選択の下にないことが示唆される。第１に、ＡＭＥＬＹ領域は、古来の重複事象から生じたものであり、選択下にあるＸ染色体上に機能的ホモログを有する（Ｌａｈｎ， ＆ Ｐａｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９） ２８６， ９６４－９６７）。第２に、ＡＭＥＬＹ遺伝子は、最近の陽性選択の証拠はなく、予測されるより多くのタンパク質変化バリアント（ｐｔｏｔｅｉｎ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ）（推定される機能喪失バリアントを含む）を有する（Ｎａｔｕｒｅ（２０２０） ５８１， ４３４－４４３； ｈｔｔｐｓ：／／ｇｎｏｍａｄ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅ／ＥＮＳＧ００００００９９７２１？ｄａｔａｓｅｔ＝ｇｎｏｍａｄ＿ｒ２＿１）。第３に、ＡＭＥＬＹ領域の遺伝的バリアントは、欠失または重複に関してヒトにおいて表現型的影響を有しないことが示されている。ＡＭＥＬＹの重複は一般的であり、表現型を有しない（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．（２０１５） １３４：７８９－８００）。第４に、欠失は一般的であり、検出可能な表現型を有しない（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ （２００７） １６：３０７－１６）。さらに、ＡＭＥＬＹは、ヒトのいかなる希少疾患とも関連付けられていない（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ， ＯＭＩＭ．ｏｒｇ．）。
ＡＭＥＬＹ ｍＲＮＡは、大部分のヒト組織において検出可能に発現されず（ＧＴＥＸ， Ｔｈｅ ＧＴＥｘ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０２０） ３６９：１３１８－１３３０）、Ｙ染色体キャリア（男性）にのみ存在する。さらに、ＡＭＥＬＸ（ＡＭＥＬＹの機能的ホモログ）は、発生の間に歯のエナメル質に関与する（Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． （２０１７） ８：４３５）。
領域ＩＩ：ＰＳＧ遺伝子領域（ｃｈｒ１９：４３，５１１，８０９－４３，５３０，６３１， ＨＧ３８）
同様に、多数の一連の証拠から、妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）は明確な進化的選択の下にないことが示唆される。第１に、ＰＳＧクラスターは、分節重複から生じた（Ｄｕｍｏｎｔ ａｎｄ Ｅｉｃｈｌｅｒ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１３） ８：ｅ７５９４９）。第２に、上記領域が、予測されるより多くの機能喪失バリアントが推定される進化的制約の下にあるという証拠は存在しない（Ｎａｔｕｒｅ（２０２０） ５８１：４３４－４４３； ｈｔｔｐｓ：／／ｇｎｏｍａｄ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅ／ＥＮＳＧ０００００２４３１３０？ｄａｔａｓｅｔ＝ｇｎｏｍａｄ＿ｒ２＿１）。第３に、ＰＳＧクラスターは、ヒトのいかなる希少疾患とも関連付けられていない（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ， ＯＭＩＭ．ｏｒｇ）。
同様に、多数の一連の証拠から、妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）は明確な進化的選択の下にないことが示唆される。第１に、ＰＳＧクラスターは、分節重複から生じた（Ｄｕｍｏｎｔ ａｎｄ Ｅｉｃｈｌｅｒ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１３） ８：ｅ７５９４９）。第２に、上記領域が、予測されるより多くの機能喪失バリアントが推定される進化的制約の下にあるという証拠は存在しない（Ｎａｔｕｒｅ（２０２０） ５８１：４３４－４４３； ｈｔｔｐｓ：／／ｇｎｏｍａｄ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅ／ＥＮＳＧ０００００２４３１３０？ｄａｔａｓｅｔ＝ｇｎｏｍａｄ＿ｒ２＿１）。第３に、ＰＳＧクラスターは、ヒトのいかなる希少疾患とも関連付けられていない（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ， ＯＭＩＭ．ｏｒｇ）。
ＰＳＧ領域は、代表的には、妊娠中に胎盤によってのみ高度に発現され、他の組織では、発現がない／低い（ＧＴＥＸ， Ｔｈｅ ＧＴＥｘ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０２０） ３６９： １３１８－１３３０）。
ベーススタッファー配列の改変
ＡＭＥＬＹ領域（ｃｈｒＹ：６，８６５，９１８－６，８７４，０２７， ＨＧ３８）およびＰＳＧ遺伝子領域（ｃｈｒ１９：４３，５１１，８０９－４３，５３０，６３１， ＨＧ３８）に由来するＤＮＡ配列を、配列を「不活性にする」、または何らかの発現される領域、公知もしくは推定される調節エレメントおよび反復エレメント（レトロウイルスエレメントおよび転位因子を含む）を欠くという目的で改変した。これらの変化を、パッケージングされたベクターゲノムを含む領域において使用されることを意図したスタッファー配列に関して最も厳密に実施した。
ＡＭＥＬＹ領域（ｃｈｒＹ：６，８６５，９１８－６，８７４，０２７， ＨＧ３８）およびＰＳＧ遺伝子領域（ｃｈｒ１９：４３，５１１，８０９－４３，５３０，６３１， ＨＧ３８）に由来するＤＮＡ配列を、配列を「不活性にする」、または何らかの発現される領域、公知もしくは推定される調節エレメントおよび反復エレメント（レトロウイルスエレメントおよび転位因子を含む）を欠くという目的で改変した。これらの変化を、パッケージングされたベクターゲノムを含む領域において使用されることを意図したスタッファー配列に関して最も厳密に実施した。
具体的には、塩基配列（ｃｈｒＹ：６，８６５，９１８－６，８７４，０２７， ＨＧ３８）および（ｃｈｒ１９：４３，５１１，８０９－４３，５３０，６３１， ＨＧ３８）を、以下の様式において改変した（図１を参照のこと）：
ｉ）以下の発現される領域を除去する：両側にエキソン＋１０ｂｐ（エキソンをＧＥＮＣＯＤＥｖ１９において遺伝子モデルを使用して定義した）、ヒト発現配列タグ（ＥＳＴ’ｓ： ＵＣＳＣゲノムブラウザ上の「Ｈｕｍａｎ ＥＳＴｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ」トラックを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータに基づいて定義：（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２００４） ３２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２３－６．）。
ｉｉ）調節エレメントを除去する： ＵＣＳＣゲノムブラウザ上の以下のトラックを使用して、以下を定義した： ＣｐＧアイランド（ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄｓ）（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （１９８７） １９６（２）：２６１－８２）、ＥＮＣＯＤＥ ３（Ｎａｔｕｒｅ（２０１２） ４８９（７４１４）：５７－７４．）からのＣＨｉＰ ｓｅｑ（転写因子によって結合される配列）転写因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ Ｐｅａｋｓ）（１２９の細胞タイプにおける３４０の因子）によって特定される領域、保存された転写因子結合部位（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ）（ＨＭＲ保存転写因子結合部位（ＨＭＲ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ）トラック）、ＶＩＳＴＡエンハンサー（ＬＢＮＬ由来Ｖｉｓｔａ ＨＭＲ－保存非コードヒトエンハンサー（Ｖｉｓｔａ ＨＭＲ－Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｆｒｏｍ ＬＢＮＬ）トラック）、およびオープン調節アノテーション（Ｏｐｅｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）「ＯＲｅｇＡｎｎｏ」（ＯＲｅｇＡｎｎｏトラックからの調節エレメント；（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２０１６） ４４（Ｄ１）：Ｄ１２６－３２．）。
ｉｉｉ）反復エレメントを除去する： リピートマスカーによる反復エレメント（Ｒｅｐｅａｔｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｂｙ ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）トラック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）を使用して、反復マスクエレメント（ＳＩＮＥ、ＬＩＮＥ、ＬＴＲ、ＤＮＡエレメントを含む）、マイクロサテライト－ジヌクレオチドおよびトリヌクレオチド反復（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ － Ｄｉ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｔｒｉ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）トラック（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９９） ２７（２）：５７３－８０）によって定義されるマイクロサテライト反復、ならびにリピートマスカー（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）によって定義される中断されたおよび単純な反復。
ｉｖ）予測外の翻訳の尤度を低減するために、ＡＴＧ残基を改変して、ＡＴＧ配列の頻度を低減した。
ｖ）ＣｐＧジヌクレオチドの編集。ＡＡＶにパッケージングされる場合に、自然免疫活性化を誘発する、細菌において生成されるｃｉｓプラスミドからの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの尤度を下げるために、ＣＧジヌクレオチドの存在を、塩基を編集することによって低減した。
ｉ）以下の発現される領域を除去する：両側にエキソン＋１０ｂｐ（エキソンをＧＥＮＣＯＤＥｖ１９において遺伝子モデルを使用して定義した）、ヒト発現配列タグ（ＥＳＴ’ｓ： ＵＣＳＣゲノムブラウザ上の「Ｈｕｍａｎ ＥＳＴｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ」トラックを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータに基づいて定義：（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２００４） ３２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２３－６．）。
ｉｉ）調節エレメントを除去する： ＵＣＳＣゲノムブラウザ上の以下のトラックを使用して、以下を定義した： ＣｐＧアイランド（ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄｓ）（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （１９８７） １９６（２）：２６１－８２）、ＥＮＣＯＤＥ ３（Ｎａｔｕｒｅ（２０１２） ４８９（７４１４）：５７－７４．）からのＣＨｉＰ ｓｅｑ（転写因子によって結合される配列）転写因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ Ｐｅａｋｓ）（１２９の細胞タイプにおける３４０の因子）によって特定される領域、保存された転写因子結合部位（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ）（ＨＭＲ保存転写因子結合部位（ＨＭＲ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ）トラック）、ＶＩＳＴＡエンハンサー（ＬＢＮＬ由来Ｖｉｓｔａ ＨＭＲ－保存非コードヒトエンハンサー（Ｖｉｓｔａ ＨＭＲ－Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｆｒｏｍ ＬＢＮＬ）トラック）、およびオープン調節アノテーション（Ｏｐｅｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）「ＯＲｅｇＡｎｎｏ」（ＯＲｅｇＡｎｎｏトラックからの調節エレメント；（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２０１６） ４４（Ｄ１）：Ｄ１２６－３２．）。
ｉｉｉ）反復エレメントを除去する： リピートマスカーによる反復エレメント（Ｒｅｐｅａｔｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｂｙ ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）トラック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）を使用して、反復マスクエレメント（ＳＩＮＥ、ＬＩＮＥ、ＬＴＲ、ＤＮＡエレメントを含む）、マイクロサテライト－ジヌクレオチドおよびトリヌクレオチド反復（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ － Ｄｉ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｔｒｉ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）トラック（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９９） ２７（２）：５７３－８０）によって定義されるマイクロサテライト反復、ならびにリピートマスカー（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）によって定義される中断されたおよび単純な反復。
ｉｖ）予測外の翻訳の尤度を低減するために、ＡＴＧ残基を改変して、ＡＴＧ配列の頻度を低減した。
ｖ）ＣｐＧジヌクレオチドの編集。ＡＡＶにパッケージングされる場合に、自然免疫活性化を誘発する、細菌において生成されるｃｉｓプラスミドからの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの尤度を下げるために、ＣＧジヌクレオチドの存在を、塩基を編集することによって低減した。
実施例２：スタッファーポリヌクレオチドを使用してパッケージングされたＡＡＶベクターゲノムの安全性の評価
実施例１に従って記載されるスタッファー配列を、いかなるさらなる活性エレメント（例えば、ｍｉＲＮＡ）の包含もなしに組み込むベクターを、インビボで安全性に関して試験した。ＡＭＥＬＹおよびＰＳＧ１１に由来するスタッファーの各々の２つのバリアントで４つのベクターのセットを設計した（配列番号２５～２８）。各ベクターは、左ＩＴＲ（配列番号５７）の直ぐ下流の５’側においてＨ１ショートプロモーターを含み、非ｍｉＲＮＡ制御配列を、上記Ｈ１ショートプロモーターの下流にｍｉＲＮＡの代わりに含めた。Ｐｏｌ ＩＩＩターミネーターを、制御配列の３’側に配置する。並行して、３つのコントロールを試験した： ビヒクル； Ｈ１プロモーターの制御下で、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞上で、レンチウイルスフォーマットで試験した場合に毒性を示すことが以前に示されたＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡ配列をコードするベクター（ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ｍｉＲ１６－２－１４７９＿ＡＭＥＬＹ＿Ｖ１（配列番号８１））；およびＡｔｘｎ２特異的ｍｉＲＮＡおよびＧＦＰをコードするベクター（ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ｍｉＲ１－１－ＸＤ－１４７９２＿ＣＢｈ＿ＧＦＰ＿ＳＶ４０ｐ（配列番号８２））。毒性を示すことが以前に示された人工ｍｉＲＮＡを選択して、上記特異的人工ｍｉＲＮＡ配列のオフターゲット効果をおそらく介して、毒性に関する陽性コントロールとして供した。
実施例１に従って記載されるスタッファー配列を、いかなるさらなる活性エレメント（例えば、ｍｉＲＮＡ）の包含もなしに組み込むベクターを、インビボで安全性に関して試験した。ＡＭＥＬＹおよびＰＳＧ１１に由来するスタッファーの各々の２つのバリアントで４つのベクターのセットを設計した（配列番号２５～２８）。各ベクターは、左ＩＴＲ（配列番号５７）の直ぐ下流の５’側においてＨ１ショートプロモーターを含み、非ｍｉＲＮＡ制御配列を、上記Ｈ１ショートプロモーターの下流にｍｉＲＮＡの代わりに含めた。Ｐｏｌ ＩＩＩターミネーターを、制御配列の３’側に配置する。並行して、３つのコントロールを試験した： ビヒクル； Ｈ１プロモーターの制御下で、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞上で、レンチウイルスフォーマットで試験した場合に毒性を示すことが以前に示されたＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡ配列をコードするベクター（ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ｍｉＲ１６－２－１４７９＿ＡＭＥＬＹ＿Ｖ１（配列番号８１））；およびＡｔｘｎ２特異的ｍｉＲＮＡおよびＧＦＰをコードするベクター（ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ｍｉＲ１－１－ＸＤ－１４７９２＿ＣＢｈ＿ＧＦＰ＿ＳＶ４０ｐ（配列番号８２））。毒性を示すことが以前に示された人工ｍｉＲＮＡを選択して、上記特異的人工ｍｉＲＮＡ配列のオフターゲット効果をおそらく介して、毒性に関する陽性コントロールとして供した。
ベクターを、尾静脈を介して１．３Ｅ１１ 全ウイルスゲノム（ｖｇ）を１６週齢の野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内投与した。カラム精製ベクターのＤＮＡ濃度に基づいて力価を決定した。この濃度を、ベクターゲノムｑＰＣＲによっても力価測定した、同様に精製したベクターの濃度と比較して、本実施例において記載されるスタッファーベクターについての相当する力価を計算した。血液を処理し、血清を、任意の肝毒性の代用物として、肝酵素、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の濃度に関して評価した。毒性の陽性コントロール人工ｍｉＲＮＡを発現するベクターは、肝酵素、ＡＬＴおよびＡＳＴの実質的上昇を誘発した。対照的に、スタッファー配列を有するベクターはいずれも、肝酵素の上昇を誘発しなかった（図２Ａ～２Ｂ）。
肝臓の組織学的評価を、任意の毒性を評価するために病理学者が行った。投与の２８日後、動物（ｎ＝５動物／スタッファーベクター処置）を屠殺し、肝臓を、４％ パラホルムアルデヒド中で２４時間浸漬固定した。肝臓１つあたり２つの断面をパラフィン中に包埋し、５ミクロン厚において切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。顕微鏡写真を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０顕微鏡で撮影した。毒性陽性コントロールｍｉＲＮＡを投与した動物は、卵円形細胞過形成、肝細胞融合および多核化、リンパ組織球性肝炎、類洞線維症、組織球内色素、および希な単一細胞アポトーシス／壊死を含む多くの病変を示した。スタッファー含有ベクターにおいて、組織学的所見は、付随的なバックグラウンド病変に限定され、処置関連傾向に従わず、複数の処置群にわたって認められた。所見は、肝の糖原病（肝細胞グリコーゲン蓄積）および稀少な小肉芽腫におけるバリエーションを含んだ。所見は、化合物関連処置毒性を反映するとは見做されなかった。
実施例３：特異的スタッファー設計におけるベクターゲノム短縮の評価
ｒＡＡＶベクターゲノム調製物は、ｍｉＲＮＡのようなヘアピン構造において最も顕著であるが、ＤＮＡ二次構造の他の領域においても顕著である短縮化ベクターゲノムを含むことが公知である。従って、スタッファー配列の異なる形態を含むｒＡＡＶの調製物における短縮化ゲノムの存在を、評価した。
ｒＡＡＶベクターゲノム調製物は、ｍｉＲＮＡのようなヘアピン構造において最も顕著であるが、ＤＮＡ二次構造の他の領域においても顕著である短縮化ベクターゲノムを含むことが公知である。従って、スタッファー配列の異なる形態を含むｒＡＡＶの調製物における短縮化ゲノムの存在を、評価した。
図３Ａ～３Ｃは、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ分析からのＤＮＡトレースを示す。ｒＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ９＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ－１００＿３３３０＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５（配列番号１６））生成の後に、ベクターＤＮＡを抽出し、カラム精製し（Ｚｙｍｏ， Ｐ／Ｎ Ｄ３０１５）、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＨＳ ＮＧＳ Ｆｒａｇｍｅｎｔ １－６０００ｂｐ）で実行した。二重ピークトレースが認められ得（図３Ａ）、これらの二重ピークは、ＩＴＲを含む全長構造であることが決定された。なぜならそれらは、右側の野生型ＩＴＲを除去する部位において制限消化によって分解されるからである。意図された全長生成物の左により小さなショルダー（より短い短縮化されたゲノムを示す）がまた、存在する。ａｍｉＲＮＡを中心としたサブピーク（ａｍｉＲＮＡにおいて短縮化されたベクターゲノムの代表である）は、多くの調製物において見出される（図３Ｄ）。類似のピークは、コントロール配列がａｍｉＲＮＡの代わりに使用されるが、パリンドローム配列のような二次構造を含む場合に存在する。
図３Ｅ～３Ｆは、ＰＳＧ１１に由来するスタッファー配列の２つのバージョン（ＰＳＧ１１＿Ｖ１（配列番号４５）およびＰＳＧ１１＿Ｖ２（配列番号４６））のうちの一方を含むｃｉｓプラスミドに由来する２つのｒＡＡＶ調製物（ｓｃＡＡＶ９＿Ｈ１＿ＭＣＳ＿ＰＳＧ１１＿Ｖ１（配列番号２７）およびｓｃＡＡＶ９＿Ｈ１＿ＭＣＳ＿ＰＳＧ１１＿Ｖ２（配列番号２８））を比較する。これらの配列は構造的に類似であるが、ＡＴＧ部位を編集して、ＰＳＧ１１＿Ｖ２におけるＡＴＧ配列を排除した。発現カセットに隣接するスタッファー配列の５’部分にいくらかの構造的差異が存在した（Ｈ１プロモーターおよびａｍｉＲＮＡまたは図３Ｅに示されるベクターにおいてのいずれか、制御配列）。トレースは、全長生成物の左にある「ショルダー」が、ＰＳＧ１１＿Ｖ１含有ベクターゲノム調製物ではより小さいことを示す（図３Ｆ）。これらのベクター調製物において、ａｍｉＲＮＡは使用されなかった。
図３Ｇ～３Ｈは、スタッファー配列ＰＳＧ１１＿Ｖ１（配列番号４５）またはＰＳＧ１１＿Ｖ２（配列番号４６）のいずれかを含むｃｉｓプラスミドに由来する２つのｒＡＡＶ調製物（ｓｃＡＡＶ９＿Ｈ１＿ｍｉＲ－１－１－ＸＤ－１４７９２＿ＰＳＧ１１＿Ｖ１（配列番号７８）およびｓｃＡＡＶ９＿Ｈ１＿ｎａｔｉｖｅ＿ｍｉＲ－１－１－ＸＤ－１４７９２＿ＰＳＧ１１＿Ｖ２（配列番号７９））の類似のセットを比較する。この場合、両方のベクターが、Ｈ１プロモーターの下流にａｍｉＲＮＡエレメントを含む（ＰＳＧ１１＿Ｖ２含有ベクターのプロモーター配列においては、Ｖ１含有ベクターに対比して３ヌクレオチドが挿入されているが、他の点では、５’配列は同一である）。フラグメントアナライザートレース（図３Ｈ）の精査によれば、ａｍｉＲＮＡ部位における短縮が、ＰＳＧ１１＿Ｖ２スタッファー配列を含むベクターにおいてかなり大きいことが認められ得る。
ここで記載されるもののような自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターの複製は、野生型ＩＴＲからの複製の開始を伴う。ここで記載される配列において、これは、ｃｉｓプラスミドにおいて３’側に存在する。従って、ポリメラーゼは、最初に、スタッファー配列を通って３’から５’へとａｍｉＲＮＡに向かって通過して横切る。そ短縮化生成物の増加に関する潜在的説明は、ポリメラーゼがａｍｉＲＮＡのヘアピンの直前に遭遇し得る二次構造が、悪化した短縮化をもたらす鎖スイッチング活性を促進するということである。この仮説と一致して、ａｍｉＲＮＡの直ぐ３’側で、ＰＳＧ１１＿Ｖ２スタッファー配列（配列番号５６； 図４Ｂ）に対比してＰＳＧ１１＿Ｖ１スタッファー配列（配列番号５５； 図４Ａ）内のＤＮＡ配列の２００ヌクレオチドの折りたたみを調べると、ＰＳＧ１１＿Ｖ２スタッファーにおいて推定二次構造の増加の領域が明らかになった。従って、ＰＳＧ１１＿Ｖ１配列構造は、都合がよかった。「ＰＳＧ１１＿Ｖ５」スタッファー配列（配列番号４８）は、ＰＳＧ１１＿Ｖ１配列に由来する都合の良い配列構造を使用することによって生成した。これは、短縮化ベクターゲノムが低減したベクター調製物を生じると想定される。低メチル化ＣｐＧジヌクレオチドまたは意図されないオープンリーディングフレームについての潜在性を低減するために、上記＿Ｖ５スタッファーには、ＣＧ配列およびＡＴＧ配列への編集を組み込んだ。
実施例４：Ａｔｘｎ２ ａｍｉＲＮＡ発現カセットと組み合わせた場合のスタッファー配列の安全性のさらなる評価
種々のスタッファー配列を含む２４の異なるベクター設計をインビボでの安全性に関して評価する実験を行った。Ｈ１プロモーターの３種の異なるバリアント（Ｈ１ショート（配列番号５４）、Ｈ１天然（配列番号５３）、Ｈ１ロング（配列番号５２））、２種の異なるＡＴＸＮ２標的化人工ｍｉＲＮＡ（３３３０または１４７９２（本明細書中で１７８４ともいわれる））／ｍｉＲ骨格（ｍｉＲ１．１．またはｍｉＲ１００）の組み合わせ（ｍｉＲ１００＿３３３０（配列番号１２をコードする）； ｍｉＲ１．１＿１４７９２（配列番号７３をコードする））、Ｐｏｌ－ＩＩ転写ターミネーターＳＶ４０ポリアデニル化配列の存在または非存在、およびスタッファー配列の異なるバージョン（ＡＭＥＬＹ＿Ｖ３（配列番号５１）、ＰＳＧ１１＿Ｖ２（配列番号４６）、ＰＳＧ１１＿Ｖ３（配列番号４７）、ＰＳＧ１１＿Ｖ５（配列番号４８））を、種々の組み合わせにおいてアセンブルした（表１を参照のこと）。以前の例にあるように、これらのベクターにおいて、Ｈ１プロモーターは、自己相補的ＡＡＶベクターとしてのパッケージングが意図されたｃｉｓプラスミドにおいて５’から３’へと配向され、ここで変異体ＩＴＲ（末端分解部位を欠いている）は５’側にあり（例えば、配列番号５７または配列番号１３～２４、２９～４４、および７８～８２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～１０６）、及び野生型ＡＡＶ ＩＴＲは３’側にある（例えば、配列番号５８または配列番号１３～１６のうちのいずれか１つのヌクレオチド２２１４～２３５８）。このプロモーター配向を使用する理由は、ｍｉＲ中心の短縮が、末端分解部位を欠いているＩＴＲを組み込むベクター（自己相補的ＡＡＶベクター）において可能であるからである。５’から３’へのプロモーター配向において、ｍｉＲ中心の短縮を有するベクターは、プロモーターを含まないと思われるので、不活性であるはずである。プロモーターが３’から５’の配向にあるとすれば、プロモーターは、ｍｉＲ中心の短縮を有するベクターに保持され得る。
種々のスタッファー配列を含む２４の異なるベクター設計をインビボでの安全性に関して評価する実験を行った。Ｈ１プロモーターの３種の異なるバリアント（Ｈ１ショート（配列番号５４）、Ｈ１天然（配列番号５３）、Ｈ１ロング（配列番号５２））、２種の異なるＡＴＸＮ２標的化人工ｍｉＲＮＡ（３３３０または１４７９２（本明細書中で１７８４ともいわれる））／ｍｉＲ骨格（ｍｉＲ１．１．またはｍｉＲ１００）の組み合わせ（ｍｉＲ１００＿３３３０（配列番号１２をコードする）； ｍｉＲ１．１＿１４７９２（配列番号７３をコードする））、Ｐｏｌ－ＩＩ転写ターミネーターＳＶ４０ポリアデニル化配列の存在または非存在、およびスタッファー配列の異なるバージョン（ＡＭＥＬＹ＿Ｖ３（配列番号５１）、ＰＳＧ１１＿Ｖ２（配列番号４６）、ＰＳＧ１１＿Ｖ３（配列番号４７）、ＰＳＧ１１＿Ｖ５（配列番号４８））を、種々の組み合わせにおいてアセンブルした（表１を参照のこと）。以前の例にあるように、これらのベクターにおいて、Ｈ１プロモーターは、自己相補的ＡＡＶベクターとしてのパッケージングが意図されたｃｉｓプラスミドにおいて５’から３’へと配向され、ここで変異体ＩＴＲ（末端分解部位を欠いている）は５’側にあり（例えば、配列番号５７または配列番号１３～２４、２９～４４、および７８～８２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～１０６）、及び野生型ＡＡＶ ＩＴＲは３’側にある（例えば、配列番号５８または配列番号１３～１６のうちのいずれか１つのヌクレオチド２２１４～２３５８）。このプロモーター配向を使用する理由は、ｍｉＲ中心の短縮が、末端分解部位を欠いているＩＴＲを組み込むベクター（自己相補的ＡＡＶベクター）において可能であるからである。５’から３’へのプロモーター配向において、ｍｉＲ中心の短縮を有するベクターは、プロモーターを含まないと思われるので、不活性であるはずである。プロモーターが３’から５’の配向にあるとすれば、プロモーターは、ｍｉＲ中心の短縮を有するベクターに保持され得る。
ｒＡＡＶベクターを、これらのｃｉｓプラスミドで生成し、ベクターを、１２週齢の野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、体重によって調整した３．２１Ｅ９ ベクターゲノム／ｇ マウスの用量（平均全用量 ８．５Ｅ１０ ベクターゲノム）において尾静脈注射によってｉ．ｖ．投与した。ビヒクルコントロール動物に、０．００１％ ＰＦ－６８を有するＰＢＳを投与した。投与の２週間後に顎下採血によって血液を集め、肝酵素濃度（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ））（図５Ａ～５Ｂ）を、種々のベクター設計を投与した動物において測定した。スタッファー含有ベクターで処置した動物に関するほとんど全てのデータ点は、正常な参照範囲内であった。２つのデータ点は、ＡＳＴシグナルが参照を上回って上昇したことを示すが、溶血がこれらのサンプルにおいて注記され、１サンプルはビヒクル処置動物に由来した。この時点において上記ベクターフォーマットのうちのいずれかを投与した動物に由来する他のサンプルのうちのいずれにおいても、参照範囲を上回ってＡＳＴもＡＬＴも上昇せず、これは、これらのスタッファー配列をコードするベクターでのｒＡＡＶ投与に応答した急性の肝傷害の証拠が存在しなかったことを示唆する。
スタッファー含有ベクターを静脈内投与した動物を、組織像によって肝毒性に関しても評価した。投与の３週間後に、０．５ｃｍ 左肝葉断片を連続して２枚、動物１匹あたりで採取し、パラフィン包埋し、５ミクロンへと切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。訓練された病理学者がスライドを評価した。表１に示されるように、１群あたりＮ＝１～２動物を評価した。評価後、試験物品の静脈内投与は、評価した全てのベクターに関して、試験した肝臓切片における変化と関連しているとは解釈されなかった。
線条体内試験
これらのベクターを、８週齢の野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１線条体あたり７．５Ｅ９ ベクターゲノムの用量において、線条体への直接注射を介しても投与し、組織像観察によって毒性に関してベクターの部分セット（表２、上記）を評価した。投与後３週間の動物からの線条体の断片をパラフィン包埋し、５ミクロンブロックアドバンス（５ ｍｉｃｒｏｎ ｂｌｏｃｋ ａｄｖａｎｃｅ）で切断した４枚の連続切片を、別個のスライドに載せた。３つのレベルからのステップセクションを含む２枚のスライドのセットを、含めた。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫組織化学、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ－１）免疫組織化学、ならびにｆｌｏｒｏ－ｊａｄｅ Ｂで染色した。後者３つの染色を、それぞれ、星細胞反応性、ミクログリア反応性、およびニューロン死を評価するために使用し得る。
ｉ．ｖ．投与ベクターで処置した動物からの肝臓切片と同様に、試験物品の影響は、試験した脳切片において特定されなかった。いくらかの組織では、取り扱いによるアーチファクトが解釈を制限した。一般に、変化は、注射部位において観察され、軽いグリオーシス（Ｈ＆Ｅ染色したスライドで特定）、わずかなミクログリオーシス（ＧＦＡＰ標識スライドで特定）、および微妙なヘモジデリン色素を有する組織のわずかな破壊を含んだ。ヘモジデリン色素は、実質内注射に伴う一般的な変化である。試験物品は、任意の動物からの基底核／線条体のレベルにおいて試験した切片のいずれにおいても、実験手順と関連する増悪または変化を引き起こすとは解釈されなかった。
転写分析
ベクターの安全性をさらに評価するために、上記のベクターを投与した動物からの線条体パンチ生検で配列決定分析を行った。線条体組織をカラム精製して、ＱｉａｇｅｎのＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｐ／Ｎ ８０００４）を使用して（ＤＮａｓｅ処理後に）ＲＮＡを抽出した。Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ Ｐｌｕｓキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｐ／Ｎ ２００４０５２５）で調製し、続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ６０００システムでペアエンド２×１００ｂｐ配列決定を行った。次いで、これらのリードを、その動物に投与されたｒＡＡＶをパッケージングするために使用したそれぞれのｃｉｓプラスミドに対して整列させた。別個に、ＤＮＡを、その配列決定したＲＮＡを抽出するために使用した同じパンチ生検から精製し（Ｑｉａｇｅｎ， Ｐ／Ｎ ８０００４）、ベクター曝露を確認した。表３は、ベクターとともに、試験した各サンプルについての曝露を列挙する。
ベクターの安全性をさらに評価するために、上記のベクターを投与した動物からの線条体パンチ生検で配列決定分析を行った。線条体組織をカラム精製して、ＱｉａｇｅｎのＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｐ／Ｎ ８０００４）を使用して（ＤＮａｓｅ処理後に）ＲＮＡを抽出した。Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ Ｐｌｕｓキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｐ／Ｎ ２００４０５２５）で調製し、続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ６０００システムでペアエンド２×１００ｂｐ配列決定を行った。次いで、これらのリードを、その動物に投与されたｒＡＡＶをパッケージングするために使用したそれぞれのｃｉｓプラスミドに対して整列させた。別個に、ＤＮＡを、その配列決定したＲＮＡを抽出するために使用した同じパンチ生検から精製し（Ｑｉａｇｅｎ， Ｐ／Ｎ ８０００４）、ベクター曝露を確認した。表３は、ベクターとともに、試験した各サンプルについての曝露を列挙する。
図６は、代表的なベクターからのリードの集積（ｐｉｌｅｕｐ）を示す。驚くべきことに、ＰＳＧ１１ Ｖ５スタッファー配列とともに、Ｈ１ショートプロモーターおよびｍｉＲ １．１骨格を使用すると、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの予測される転写の下流でｃｉｓプラスミドに整列するリードの数の増加がもたらされた。対照的に、ＰＳＧ１１ Ｖ５スタッファーとともにＨ１ロングプロモーターを使用すると、意図されない転写の有益な最小量がもたらされた。従って、エレメントのこの組み合わせは、非ｍｉＲＮＡ転写の望ましい低頻度を有するベクター構成を生じた。
実施例５：異なるｒＡＡＶベクターフォーマットにおけるＡｔｘｎ２ ａｍｉＲＮＡ発現カセットと組み合わせた場合のスタッファー配列の機能性の実証
実施例４に記載される２４のベクター組み合わせのセットを投与した動物を、スタッファー、プロモーター、およびＡＴＸＮ２標的化人工ｍｉＲＮＡの組み合わせの全ての機能性に関しても評価した。Ａｔｘｎ２のノックダウンを、ｉ．ｖ．投与（用量： ３．２１Ｅ９ ｖｇ／グラム マウス）の３週間後に肝臓組織からＲＮＡを抽出し、次いで、Ａｔｘｎ２およびコントロールプローブＨｐｒｔを用いるＲＴ－ｄｄＰＣＲを行うことによって評価した。Ａｔｘｎ２レベルを、これらのＡＴＸＮ２／コントロール転写物比の平均として計算し、ビヒクルを投与した動物に関して得られた比に対してさらに正規化した。ベクターゲノム曝露をまた、ベクターゲノムに対するプローブおよびマウスゲノムプローブ（Ｔｅｒｔ）を用いるｄｄＰＣＲを使用して測定した。表４に認められるように、強いＡｔｘｎ２ノックダウンが、スタッファー配列およびｍｉＲＮＡベクター構成要素の全ての組み合わせで処置した動物において起こった。
実施例４に記載される２４のベクター組み合わせのセットを投与した動物を、スタッファー、プロモーター、およびＡＴＸＮ２標的化人工ｍｉＲＮＡの組み合わせの全ての機能性に関しても評価した。Ａｔｘｎ２のノックダウンを、ｉ．ｖ．投与（用量： ３．２１Ｅ９ ｖｇ／グラム マウス）の３週間後に肝臓組織からＲＮＡを抽出し、次いで、Ａｔｘｎ２およびコントロールプローブＨｐｒｔを用いるＲＴ－ｄｄＰＣＲを行うことによって評価した。Ａｔｘｎ２レベルを、これらのＡＴＸＮ２／コントロール転写物比の平均として計算し、ビヒクルを投与した動物に関して得られた比に対してさらに正規化した。ベクターゲノム曝露をまた、ベクターゲノムに対するプローブおよびマウスゲノムプローブ（Ｔｅｒｔ）を用いるｄｄＰＣＲを使用して測定した。表４に認められるように、強いＡｔｘｎ２ノックダウンが、スタッファー配列およびｍｉＲＮＡベクター構成要素の全ての組み合わせで処置した動物において起こった。
実施例６：異なるｒＡＡＶベクターフォーマットにおけるＡＴＸＮ２ ａｍｉＲＮＡ発現カセットと組み合わせた場合のスタッファー配列の生成収量および短縮のさらなる評価
実施例４は、プロモーターの「Ｈ１ロング」バリアントを、プロモーターの「Ｈ１ショート」バリアントに対比してＰＳＧ１１＿Ｖ５スタッファー配列の上流に挿入した場合に、人工ｍｉＲＮＡ配列の下流における転写活性を低減するという予測外の利点を示す。Ｈ１ロングプロモーターおよびＨ１ショートプロモーター、ならびにＡＭＥＬＹおよびＰＳＧ１１に由来するスタッファー配列の組み合わせの生成収量もまた、評価した。生成収量を、スタッファー領域に対して特異的なプライマー／プローブセットを使用して、ベクターゲノムのｄｄＰＣＲによって評価した。一般に、ＡＭＥＬＹ＿Ｖ３（配列番号５１）、ＰＳＧ１１＿Ｖ５（配列番号４８）、ＰＳＧ１１＿Ｖ３（配列番号４７）、およびＰＳＧ１１＿Ｖ２（配列番号４６）を含む、評価されるスタッファー配列とのＨ１ロングフォーマットプロモーター（配列番号５２）組み合わせを有するｃｉｓプラスミドの使用は、より高い生成収量を生じた（図７）。ベクター短縮の分析（図８Ａ～８Ｃ）から、Ｈ１ショートプロモーターと比較して、プロモーターのＨ１ロングバージョンを上流に含めた場合に、短縮がより少ないことがさらに示唆された。まとめると、これらのスタッファー配列の上流にＨ１ロングプロモーターを含めると、おそらく、ｒＡＡＶ複製およびパッケージングに影響し得る局所的ＤＮＡ二次構造エレメントに起因して、多くの驚くべき利益がある。
実施例４は、プロモーターの「Ｈ１ロング」バリアントを、プロモーターの「Ｈ１ショート」バリアントに対比してＰＳＧ１１＿Ｖ５スタッファー配列の上流に挿入した場合に、人工ｍｉＲＮＡ配列の下流における転写活性を低減するという予測外の利点を示す。Ｈ１ロングプロモーターおよびＨ１ショートプロモーター、ならびにＡＭＥＬＹおよびＰＳＧ１１に由来するスタッファー配列の組み合わせの生成収量もまた、評価した。生成収量を、スタッファー領域に対して特異的なプライマー／プローブセットを使用して、ベクターゲノムのｄｄＰＣＲによって評価した。一般に、ＡＭＥＬＹ＿Ｖ３（配列番号５１）、ＰＳＧ１１＿Ｖ５（配列番号４８）、ＰＳＧ１１＿Ｖ３（配列番号４７）、およびＰＳＧ１１＿Ｖ２（配列番号４６）を含む、評価されるスタッファー配列とのＨ１ロングフォーマットプロモーター（配列番号５２）組み合わせを有するｃｉｓプラスミドの使用は、より高い生成収量を生じた（図７）。ベクター短縮の分析（図８Ａ～８Ｃ）から、Ｈ１ショートプロモーターと比較して、プロモーターのＨ１ロングバージョンを上流に含めた場合に、短縮がより少ないことがさらに示唆された。まとめると、これらのスタッファー配列の上流にＨ１ロングプロモーターを含めると、おそらく、ｒＡＡＶ複製およびパッケージングに影響し得る局所的ＤＮＡ二次構造エレメントに起因して、多くの驚くべき利益がある。
実施例７：人工ｍｉＲＮＡのさらなる組み合わせとともにスタッファー配列を組み込むベクターの生成
実施例１に従って作製し、実施例４に記載されるとおりのプロモーターおよび特異的スタッファー配列の組み合わせを含むスタッファー配列を、それらが、ＡＡＶベクターゲノムの一部として、ｒＡＡＶにおいてパッケージングされる能力に関して評価した。ベクターにおいて異なるペイロードの文脈において良好な生産性を一貫して達成する能力をも、これらのスタッファー配列に関して試験した。
実施例１に従って作製し、実施例４に記載されるとおりのプロモーターおよび特異的スタッファー配列の組み合わせを含むスタッファー配列を、それらが、ＡＡＶベクターゲノムの一部として、ｒＡＡＶにおいてパッケージングされる能力に関して評価した。ベクターにおいて異なるペイロードの文脈において良好な生産性を一貫して達成する能力をも、これらのスタッファー配列に関して試験した。
ＰＳＧ１１イントロン領域に由来し、実施例１における設計規則に従って改変され、最適なＨ１ロングプロモーターバリアントを含むスタッファー配列を、種々のＡＴＸＮ２標的化人工ｍｉＲＮＡパッケージングカセットを含むベクターのセットにおいてパッケージングした。５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲのｃｉｓプラスミド配列は、以下に示される： 配列番号１３（ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ１００＿１７５５＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５＿ＩＴＲ＿ｔｏ＿ＩＴＲ）、配列番号１４（ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ１００＿２５８６＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５＿ＩＴＲ＿ｔｏ＿ＩＴＲ）、配列番号１５（ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ１００＿２９４５＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５＿ＩＴＲ＿ｔｏ＿ＩＴＲ）、および配列番号１６ （ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ１００＿３３３０＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５＿ＩＴＲ＿ｔｏ＿ＩＴＲ）。ａｍｉＲＮＡガイド、パッセンジャー、および発現カセットの配列は、表５に記載される。
Ｈ１プロモーター（「Ｈ１ロング」）（配列番号５２または配列番号１３～１６のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１３～３４３）を、ベクターに組み込んだ。これらのベクターのＡＡＶ生成からの収量を、表６に列挙する。
ＡＭＥＬＹに由来するスタッファー配列を、いくつかのベクターにおいてパッケージングした。ＡＴＸＮ２標的化人工ｍｉＲＮＡカセットおよびＡＭＥＬＹスタッファー配列を含む５’ ＩＴＲから３’ ＩＴＲまでのベクター配列を、「Ｈ１＿ショート＿ｍｉＲ１６－２－１７５５＿ＡＭＥＬＹ＿Ｖ１」（配列番号１７）および「Ｈ１ － ｍｉＲ１－１＿１７８４＿ＡＭＥＬＹ＿Ｖ３」（配列番号１８）に提供する。これらのベクターにおいて、ＡＭＥＬＹに関する註釈「＿Ｖ１」または「＿Ｖ３」は、ＡＭＥＬＹスタッファー配列の異なるバージョンに言及し、ここで「＿Ｖ３」バージョンではＡＴＧ配列が編集され、ＣｐＧジヌクレオチドが編集され（配列番号５１または配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７）、「＿Ｖ１」は、そのように改変されていない（配列番号４９または配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２）。Ｈ１＿ショートとは、Ｈ１プロモーターの９１ｂｐ短縮化形態（配列番号５４または配列番号１７のヌクレオチド１１３～２０３）に言及する。これらのベクターの生成からの収量を、表７に列挙する。
実施例８：さらなるａｍｉＲＮＡと組み合わせたスタッファーポリヌクレオチドを使用してパッケージングされるＡＡＶベクターゲノムの機能性の実証
本明細書に記載されるスタッファー配列およびさらなるａｍｉＲＮＡを組み込むベクターゲノムへと組み込まれる場合に、ペイロードの機能性を試験する実験を行った。これは、スタッファー配列とａｍｉＲＮＡ発現カセットとの適合性をさらに確立する。上記で記載されるベクターは全て、ＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡを発現する；機能性を、ＡＴＸＮ２標的のノックダウンによって決定する。
本明細書に記載されるスタッファー配列およびさらなるａｍｉＲＮＡを組み込むベクターゲノムへと組み込まれる場合に、ペイロードの機能性を試験する実験を行った。これは、スタッファー配列とａｍｉＲＮＡ発現カセットとの適合性をさらに確立する。上記で記載されるベクターは全て、ＡＴＸＮ２を標的化する人工ｍｉＲＮＡを発現する；機能性を、ＡＴＸＮ２標的のノックダウンによって決定する。
１つの実験において、表８に列挙されるベクターを、ヒト幹細胞由来運動ニューロンにおけるＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのノックダウンに関して評価した。ベクターは、以下を含んだ： ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ１００＿１７５５＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５＿ＩＴＲ＿ｔｏ＿ＩＴＲ．ｇｂ（配列番号１３）、ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ１００＿２５８６＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５＿ＩＴＲ＿ｔｏ＿ＩＴＲ．ｇｂ（配列番号１４）、ｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ１００＿２９４５＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５＿ＩＴＲ＿ｔｏ＿ＩＴＲ．ｇｂ（配列番号１５）、およびｓｃＡＡＶ＿Ｈ１＿ロング＿ｍｉＲ１００＿３３３０＿ＰＳＧ１１＿Ｖ５＿ＩＴＲ＿ｔｏ＿ＩＴＲ．ｇｂ（配列番号１６）。幹細胞由来運動ニューロンを、ＡＡＶ－ＤＪにパッケージングされた、示されるベクターで処理し、形質導入の７日後に、ＲＮＡを採取し、ＡＴＸＮ２に対するプローブ、ならびにハウスキーピングプローブＧＵＳＢおよびＢ２Ｍを用いるＲＴ－ｄｄＰＣＲを使用してノックダウンに関して評価した。平均ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡシグナル（ＧＵＳＢおよびＢ２Ｍプローブ、ならびに形質導入されていない細胞に対して正規化される）を、測定した。データを、３．１６Ｅ４ ベクターゲノム／細胞の用量で処理した細胞に関して列挙する。
別の実験において、ＡＭＥＬＹ＿Ｖ３スタッファー（配列番号５１または配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７）およびＨ１ロングプロモーターの制御下にあるＡＴＸＮ２標的化ａｍｉＲＮＡを含むベクターを、成体雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへの静脈内投与および投与の３週間後に測定した標的ＡＴＸＮ２のノックダウンによって試験した。Ａｔｘｎ２のノックダウンを、肝臓組織からＲＮＡを抽出し、Ａｔｘｎ２ならびにコントロールプローブＨｐｒｔおよびＧｕｓｂを用いるＲＴ－ｄｄＰＣＲを行うことによって評価した。表９は、ビヒクル（ＰＢＳ＋０．００１％ ＰＦ－６８）を投与した動物と比較して、ベクターを投与した３匹の動物から評価した肝臓組織における平均パーセントノックダウンを列挙する。投与した用量は、この試験では平均して８．５Ｅ１０であり、マウスの体重に対して調整した。表９において認められ得るように、このベクターを投与した動物に由来する肝臓において実質的なノックダウンが存在し、これは、スタッファーでパッケージングされるＡＡＶの機能性を示す。
上で記載される種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本明細書中で言及されるならびに／または２０２１年２月５日出願の米国特許出願第６３／１４６，５２２号および２０２１年２月５日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１６９３９を含む出願データシートの中に列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。実施形態の局面は、その種々の特許、出願および刊行物の概念を使用してなおさらなる実施形態を提供するために必要であれば、改変され得る。
これらのおよび他の変更は、上記の詳細な説明に鑑みて上記実施形態に対して行われ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、その特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲において開示される具体的実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、このような特許請求の範囲によって権利化される均等物の全範囲とともに、全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。よって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
Claims (39)
- 約１３００～約２３００ヌクレオチドの長さの核酸を含み、以下のうちのいずれか１つと少なくとも７５％同一性を有するベクタースタッファー配列： 配列番号４５～５１； 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５、配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２；および配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２。
- 前記核酸は、約１５００～２０００ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記核酸は、約１６００～１９００ヌクレオチドの長さである、請求項１または２に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記核酸は、以下のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列： 配列番号４５～５１； 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８；および配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； および配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２。
- 前記核酸は、以下のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列： 配列番号４５～５１； 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号１９のヌクレオチド４８９～２１７７； 配列番号２０のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２；および配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２。
- 前記核酸は、以下のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列： 配列番号４５～５１； 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６；および配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２；および配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２。
- 前記核酸は、以下のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列： 配列番号４５～５１； 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； および配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２。
- 前記核酸は、以下のうちのいずれか１つと少なくとも９７％同一性を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列： 配列番号４５～５１； 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６； および配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２； および配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２。
- 前記核酸は、以下のうちのいずれか１つを含むかまたはからなる、請求項１～８のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列： 配列番号４５～５１； 配列番号１３～１６のいずれか１つのヌクレオチド４８９～２１８５； 配列番号１７のヌクレオチド３４２～２２２２； 配列番号１８のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２１のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２２のヌクレオチド４８８～２１７７； 配列番号２３のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２４のヌクレオチド７１１～２１８７； 配列番号２５のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２６のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２７のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２８のヌクレオチド２５２～２１３２； 配列番号２９のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３０のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３１のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３２のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３３のヌクレオチド３５７～２２３７； 配列番号３４のヌクレオチド３５８～２１９５； 配列番号３５のヌクレオチド５８０～２１８７； 配列番号３６のヌクレオチド５８０～２１９６； 配列番号３７のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号３８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号３９のヌクレオチド３４９～２１８６； 配列番号４０のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４１のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号４２のヌクレオチド３４８～２２２８； 配列番号４３のヌクレオチド３４９～２１８６；および配列番号４４のヌクレオチド５７１～２１７８； 配列番号７８のヌクレオチド３４９～２２２９； 配列番号７９のヌクレオチド３５８～２２３８； 配列番号８０のヌクレオチド３４２～２２２２；および配列番号８１のヌクレオチド３４２～２２２２。
- 前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、必要に応じて前記ＡＡＶベクターは、自己相補的である、請求項１～９のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記ベクタースタッファー配列は、異種核酸配列を含む発現構築物に隣接する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記異種核酸配列は、治療剤をコードする、請求項１１に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記治療剤は、阻害性核酸をコードする核酸を含む、請求項１２に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡを含む、請求項１３に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記阻害性核酸は、神経変性疾患関連遺伝子を標的化するｍｉＲＮＡを含み、必要に応じて前記神経変性疾患は、脊髄小脳失調症２型、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体型認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム島の認知症パーキンソニズムＡＬＳ複合（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、またはアルツハイマー病である、請求項１４に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記神経変性疾患は、ポリグルタミン反復病である、請求項１５に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記阻害性核酸は、ＡＴＸＮ２を標的化する、請求項１３～１６のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記異種核酸は、
（ａ）配列番号１～４および７１から選択されるガイド配列；
（ｂ）配列番号１において提供されるガイド配列および配列番号５によって提供されるパッセンジャー配列；配列番号２において提供されるガイド配列および配列番号６によって提供されるパッセンジャー配列；配列番号３において提供されるガイド配列および配列番号７によって提供されるパッセンジャー配列；配列番号４において提供されるガイド配列および配列番号８によって提供されるパッセンジャー配列；もしくは配列番号７１によって提供されるガイド配列および配列番号７２によって提供されるパッセンジャー配列；または
（ｃ）配列番号９～１２および７３のうちのいずれか１つによって提供される配列、
を含む人工ｍｉＲＮＡをコードする、請求項１３～１７のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列。 - 前記発現構築物は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１～１８のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列。
- 前記プロモーターは、Ｈ１プロモーターであり、必要に応じてここで：
（ａ）前記Ｈ１プロモーターは、配列番号５２；配列番号１３～１６および１８～２４のいずれか１つのヌクレオチド１１３～３４３を含むＨ１ロングプロモーターである；
（ｂ）前記Ｈ１プロモーターは、配列番号５３を含むＨ１プロモーターである；または
（ｃ）前記Ｈ１プロモーターは、配列番号５４、または配列番号１７、２５～２８、および３７～４４のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１３～２０３を含むＨ１ショートプロモーターである、
請求項１９に記載のベクタースタッファー配列。 - 前記終結シグナルは、ＳＶ４０終結シグナルであり、必要に応じてここで前記ＳＶ４０終結シグナルは、配列番号７７によって提供される配列を含む、請求項１９または２０に記載のベクタースタッファー配列。
- 請求項１～２１のいずれか１項に記載のベクタースタッファー配列を含む組換えＡＡＶベクター。
- 前記ＡＡＶベクターは、自己相補的である、請求項２２に記載の組換えＡＡＶベクター。
- 前記ＡＡＶベクターは、前記発現構築物およびベクタースタッファー配列に隣接する５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）および３’ ＩＴＲを含む、請求項２２または２３に記載の組換えＡＡＶベクター。
- 前記５’ ＩＴＲおよび３’ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲｈ１０、ＡＡＶ１１、およびこれらのバリアントからなる群より選択される。ＡＡＶ血清型から得られる、請求項２４に記載の組換えＡＡＶベクター。
- 前記５’ ＩＴＲおよび３’ ＩＴＲのうちの一方は、機能的末端分解部位を欠いている、請求項２４または２５に記載の組換えＡＡＶベクター。
- 前記５’ ＩＴＲは、機能的末端分解部位を欠いている、請求項２６に記載の組換えＡＡＶベクター。
- （ａ）前記５’ ＩＴＲは、配列番号５７、もしくは配列番号１３～２４、２９～４４、および７８～８２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～１０６を含む；ならびに／または
（ｂ）前記３’ ＩＴＲは、配列番号５８； 配列番号１３～１６のうちのいずれか１つのヌクレオチド２１９２～２３５８； 配列番号１７のヌクレオチド２２２９～２３９５； 配列番号１８のヌクレオチド２１８４～２３５０； 配列番号１３～１６のうちのいずれか１つのヌクレオチド２２１４～２３５８、配列番号１７のヌクレオチド２２５１～２３９５、配列番号１８のヌクレオチド２２０６～２３５０、配列番号１９のヌクレオチド２２０６～２３５０； 配列番号２０のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号２１のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号２２のヌクレオチド２２０６～２３５０； 配列番号２３のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号２４のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号２５のヌクレオチド２１６１～２３０５； 配列番号２６のヌクレオチド２１６１～２３０５； 配列番号２７のヌクレオチド２１６１～２３０５； 配列番号２８のヌクレオチド２１６１～２３０５； 配列番号２９のヌクレオチド２２６６～２４１０； 配列番号３０のヌクレオチド２２２４～２３６８； 配列番号３１のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号３２のヌクレオチド２２２５～２３６９； 配列番号３３のヌクレオチド２２６６～２４１０； 配列番号３４のヌクレオチド２２２４～２３６８； 配列番号３５のヌクレオチド２２１６～２３６０； 配列番号３６のヌクレオチド２２２５～２３６９； 配列番号３７のヌクレオチド２２５７～２４０１； 配列番号３８のヌクレオチド２２５８～２４０２； 配列番号３９のヌクレオチド２２１５～２３５９； 配列番号４０のヌクレオチド２２０７～２３５１； 配列番号４１のヌクレオチド２２０７～２３５１； 配列番号４２のヌクレオチド２２５７～２４０１； 配列番号４３のヌクレオチド２２１５～２３５９； 配列番号４４のヌクレオチド２２０７～２３５１； 配列番号７８のヌクレオチド２２５８～２４０２； 配列番号７９のヌクレオチド２２６７～２４１１； 配列番号８０のヌクレオチド２２５１～２３９５； 配列番号８１のヌクレオチド２２５１～２３９５；または配列番号８２のヌクレオチド２１８７～２３３１を含む、
請求項２４～２７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。 - （ａ）配列番号１３～２４、２９～４４、および７８～８０のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列；
（ｂ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号１３のヌクレオチド配列；
（ｂ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号１４のヌクレオチド配列；
（ｃ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号１５のヌクレオチド配列；
（ｄ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号１６のヌクレオチド配列；
（ｅ）ヌクレオチド２０４～３３５が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号１７のヌクレオチド配列；
（ｆ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号１８のヌクレオチド配列；
（ｇ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号１９のヌクレオチド配列；
（ｈ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号２０のヌクレオチド配列；
（ｉ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号２１のヌクレオチド配列；
（ｊ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号２２のヌクレオチド配列；
（ｋ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号２３のヌクレオチド配列；
（ｌ）ヌクレオチド３４４～４８１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号２４のヌクレオチド配列；
（ｍ）ヌクレオチド２１３～３５０が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号２９のヌクレオチド配列；
（ｎ）ヌクレオチド２１３～３５０が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３０のヌクレオチド配列；
（ｏ）ヌクレオチド２１３～３５０が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３１のヌクレオチド配列；
（ｐ）ヌクレオチド２１３～３５０が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３２のヌクレオチド配列；
（ｑ）ヌクレオチド２１３～３５０が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３３のヌクレオチド配列；
（ｒ）ヌクレオチド２１３～３５０はが目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３４のヌクレオチド配列；
（ｓ）ヌクレオチド２１３～３５０が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３５のヌクレオチド配列；
（ｔ）ヌクレオチド２１３～３５０が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３６のヌクレオチド配列；
（ｕ）ヌクレオチド２０４～３４１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３７のヌクレオチド配列；
（ｖ）ヌクレオチド２０４～３４１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３８のヌクレオチド配列；
（ｗ）ヌクレオチド２０４～３４１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号３９のヌクレオチド配列；
（ｘ）ヌクレオチド２０４～３４１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号４０のヌクレオチド配列；
（ｙ）ヌクレオチド２０４～３４１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号４１のヌクレオチド配列；
（ｚ）ヌクレオチド２０４～３４１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号４２のヌクレオチド配列；
（ａａ）ヌクレオチド２０４～３４１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号４３のヌクレオチド配列；
（ｂｂ）ヌクレオチド２０４～３４１が目的のｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号４４のヌクレオチド配列；
（ｃｃ）ヌクレオチド２０４～３４２が目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号７８のヌクレオチド配列；
（ｄｄ）ヌクレオチド２１３～３５１が目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号７９のヌクレオチド配列；
（ｅｅ）ヌクレオチド２０４～３３５が目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号８０に示されるヌクレオチド配列；または
（ｆｆ）ヌクレオチド２０４～３３５が目的の人工ｍｉＲＮＡをコードする配列で置換されている、配列番号８１に示されるヌクレオチド配列を含む、
請求項２２～２８のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。 - 請求項２２～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶ粒子。
- 前記ｒＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質を含む、請求項３０に記載のｒＡＡＶ粒子。
- 前記キャプシドタンパク質は、血液脳関門を横断する能力がある、請求項３１に記載のｒＡＡＶ粒子。
- 前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質である、請求項３１または３２に記載のｒＡＡＶ粒子。
- 治療剤を被験体に送達する方法であって、前記方法は、前記被験体に、請求項２８～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を投与することを包含する方法。
- 被験体は、神経変性疾患を有するかまたは神経変性疾患を発生させるリスクがある、請求項３４に記載の方法。
- 前記投与は、前記被験体のＣＮＳへの直接注射を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
- 前記直接注射は、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、線条体内注射、軟膜下注射、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３６に記載の方法。
- 前記直接注射は、前記被験体の脳脊髄液（ＣＳＦ）への直接注射であり、必要に応じてここで前記直接注射は、大槽内（intracistemal）注射、室内注射、および／または腰椎内注射である、請求項３６に記載の方法。
- 前記神経変性疾患は、脊髄小脳失調症２型、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体型認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム島の認知症パーキンソニズムＡＬＳ複合（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、またはアルツハイマー病である、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
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