BR112020012471A2 - construtos compreendendo fatores de viabilidade neuronal e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a construtos aperfeiçoados compreendendo os Fatores de Viabilidade de Cone Derivado de Hastes curtos e longos e a métodos para tratar doenças degenerativas da retina.

Description

CONSTRUTOS COMPREENDENDO FATORES DE VIABILIDADE NEURONAL E USOS DOS MESMOS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a distúrbios neurodegenerativos da retina e mais particularmente a uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir distúrbios neurodegenerativos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Distúrbio neurodegenerativo abrange uma gama de condições seriamente debilitantes que são caracterizadas por degeneração de neurônios.

[003] Distrofias de cone-bastonete, como retinite pigmentosa (RP), são doenças degenerativas da retina geneticamente heterogêneas caracterizadas pela morte progressiva de fotorreceptores de bastonete seguida pela perda consecutiva de cones. RP é uma das formas mais comuns de degeneração hereditária da retina, que afeta em torno de 1:3.500 pessoas no mundo inteiro (1). Mutações que causam RP em mais de 63 genes distintos foram identificadas até a presente data com uma proporção significativa dessas mutações em transcritos específicos de bastonete. Pacientes com RP apresentam inicialmente perda de visão sob condições de luz fraca como resultado da disfunção de bastonete, com preservação relativa da visão mediada por cone macular. À medida que a doença avança, entretanto, a perda primária de bastonetes é seguida por degeneração de cone e um déficit em visão mediada por cone correspondente. Na sociedade moderna, na qual grande parte do ambiente tem luz artificial, e muitas atividades se baseiam em visão colorida de alta acuidade, a retenção de visão mediada por cone em pacientes com RP levaria a uma melhora significativa em qualidade de vida.

[004] A perda de cones em subconjuntos de RP causada por mutações específicas de bastonete não é perfeitamente entendida, embora vários mecanismos, que não são necessariamente mutuamente exclusivos, tenham sido propostos. Alguns mecanismos em hipótese implicam um ‘efeito vizinho’ pelo que a morte de cones é uma consequência da liberação de endotoxinas a partir da degeneração de bastonetes em volta, ou como resultado da perda de contato com bastonetes, epitélio de pigmento da retina (RPE) ou Muller glia. Alternativamente, a ativação de células Muller e a liberação de moléculas tóxicas podem desempenhar um papel. Outra hipótese é que as quantidades de oxigênio ou retinoides distribuídos para a camada fotorreceptora pelo RPE a partir da circulação de sangue coroidal são excessivas e tóxicas à medida que a carga metabólica de bastonetes é perdida (2). Punzo et al. Mostraram evidência de que em modelos murinos de degeneração da retina os cones morrem em parte como resultado de privação e desequilíbrio nutricional, impulsionado pelo alvo mamífero/insulina de via de rapamicina (3). Adicionalmente, foi sugerido que a perda de um fator de sobrevivência secretado pelos bastonetes e exigido para sobrevivência de cones pode contribuir para a perda de cones (4, 5).

[005] Em acordo com a última hipótese, foi mostrado que tecido da retina saudável transplantado suporta sobrevivência de cone em áreas distantes do tecido enxertado no camundongo rd1 (6, 7).

[006] O pedido de patente internacional WO2008/148860A1 descreve uma família de fatores tróficos, chamados de fator de viabilidade de cone derivado de bastonete (RdCVF) e RdCVF2 que são capazes de aumentar a sobrevivência de neurônios e são úteis para tratamento e/ou prevenção de distúrbios neurodegenerativos como RP.

[007] O fator de viabilidade de cone derivado de bastonete (RdCVF) foi originalmente identificado a partir de um método de rendimento alto de classificação de bibliotecas de cDNA como uma molécula candidata responsável por esse efeito de resgate (4). Os bastonetes secretam RdCVF e portanto, à medida que os bastonetes morrem, a fonte desse fator parácrino é perdida e os níveis de RdCVF diminuem. A perda de expressão de RdCVF e fatores secretados como esse, pode contribuir, portanto, para a onda secundária de degeneração de cones observada em distrofias de cone-bastonete. Foi mostrado que RdCVF media a sobrevivência de cone tanto em cultura (8) como quando injetado de modo sub-retiniano em modelos de camundongos e ratos de formas recessiva e dominante de retinite pigmentosa (4, 9). A ruptura de Nxnl1, o gene que codifica RdCVF, torna os fotorreceptores de camundongos cada vez mais suscetíveis à disfunção de fotorreceptor e perda de cone ao longo do tempo (10).

[008] Nxnl1 codifica para duas isoformas de proteína através de junção diferencial. A isoforma que media sobrevivência de cone, RdCVF é uma proteína de dobra-tiorredoxina truncada de seu equivalente mais longo, RdCVFL, que inclui uma extensão de terminal-C conferindo atividade de tiol-oxidorredutase enzimática (11). RdCVFL, que contém todos os aminoácidos de RdCVF, é codificado por exons 1 e 2 do gene Nxnl1 e é um membro da família de tiorredoxina (12). Tiorredoxinas têm diversas funções, incluindo manter o ambiente redutor adequado em células e participar em vias apoptóticas. Essas funções são realizadas através de reações de tiol oxidorredutase mediadas por um sítio catalítico CXXC conservado em uma dobra tiorredoxina (13).

[009] Byrne et al. (32) mostraram que as duas isoformas de RdCVF têm funções complementares. A administração sistêmica de um vírus adeno- associado (AAV) que codifica RdCVF melhorou a função de cone e retardou a perda de cone, enquanto RdCVFL aumentou mRNA de rodopsina e reduziu stress oxidativo. RdCVFL evita dano foto-oxidativo aos bastonetes (36).

[010] O pedido de patente internacional WO 2016/185037 descreve vetores AAV que codificam tanto RdCVF como RdCVFL, em particular o AAV CT35, e o uso dos referidos vetores para tratar patologias como retinite pigmentosa.

[011] Um efeito sinérgico entre RdCVF e RdCVFL foi demonstrado (34). Por um lado, RdCVF é produzido e secretado pelo epitélio pigmentado da retina (RPF), protegendo os cones por estimular glicólise aeróbica através do receptor de RdCVF na superfície de célula dos cones por um mecanismo autônomo não celular (37). Por outro lado, RdCVFL protege os cones contra dano oxidativo em um modo autônomo de células, devido a sua função de tiol oxidorredutase.

[012] Os inventores observaram agora que a produção de tais vetores de AAV apresenta inesperadamente um problema de encapsidação do genoma de AAV. Esse problema de acondicionamento incompleto leva a um defeito na produção de partículas de AAV com genoma completo.

[013] Isso apresenta uma limitação para a produção de vetores AAV em conformidade com GMP para uso em terapia humana.

[014] Desse modo, há ainda necessidade de construtos aperfeiçoados para a expressão de fatores de RdCVF e RdCVFL para tratamento de distúrbios neurodegenerativos da retina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[015] Os inventores encontraram que a produção de um vetor AAV único compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL poderia estar sujeita a problemas de acondicionamento incompleto do DNA de filamento único de AAC no capsídeo viral. Essa encapsidação incompleta leva à produção de um genoma de AAV incompleto, assim um DNA de tamanho menor.

[016] Os inventores descobriram surpreendentemente que essa encapsidação incompleta foi devido à presença de sequências repetidas diretas compreendidas no genoma de AAV e que limitando o comprimento de nucleotídeos que são idênticos entre os primeiro e segundo cassetes de expressão a no máximo 200 nucleotídeos idênticos contíguos, AAV pode ser totalmente acondicionado.

[017] Desse modo, a presente invenção fornece uma solução para esse problema, por fornecer vetores AAV compreendendo um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL, em que a produção de partículas de AAV é otimizada.

[018] AAV de acordo com a invenção compreende um primeiro e um segundo cassetes de expressão que apresentam no máximo 200 nucleotídeos idênticos contíguos, de preferência no máximo 190, ainda mais preferencialmente no máximo 180, 170, 167, 165, 164, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 55, 54, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9 ou 8 nucleotídeos idênticos contíguos.

[019] Os inventores desenvolveram várias soluções alternativas e/ou cumulativas para o problema de sequências repetidas diretas entre os primeiro e segundo cassetes de expressão.

[020] Desse modo, em um aspecto, a presente invenção se refere a um vetor adeno-associado (AAV) compreendendo: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL,

[021] em que os referidos primeiro e o segundo cassetes de expressão apresentam menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos.

[022] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor adeno- associado (AAV) compreendendo: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL,

[023] para uso em um método de tratamento de um distúrbio neurodegenerativo da retina,

[024] em que os referidos primeiro e segundo cassetes de expressão apresentam menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos.

[025] A presente invenção também se refere a um método para tratar um paciente que sofre de uma doença degenerativa da retina compreendendo a etapa que consiste em administrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor adeno-associado (AAV) compreendendo: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL,

[026] em que os referidos primeiro e o segundo cassetes de expressão apresentam menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos.

[027] A invenção também se refere ao uso de uma sequência de DNA humano inerte em um construto de AAV.

[028] Em um aspecto, a invenção se refere a um AAV compreendendo um ácido nucleico tendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10, em que o referido ácido nucleico tendo a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 10 não está presente em um cassete de expressão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[029] Desse modo, em um aspecto, a presente invenção se refere a um vetor adeno-associado (AAV) compreendendo: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL,

[030] em que os referidos primeiro e o segundo cassetes de expressão apresentam menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos.

[031] O fato de que o primeiro e o segundo cassetes de expressão apresentam menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos significa que o primeiro e o segundo cassetes de expressão têm menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos em comum.

[032] Tipicamente, os primeiro e segundo cassetes de expressão compartilham no máximo 200 nucleotídeos idênticos contíguos, de preferência no máximo 190, ainda mais preferencialmente no máximo 180, 170, 167, 165, 164, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 55, 54, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9 ou 8 nucleotídeos idênticos contíguos.

[033] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um vetor adeno- associado (AAV) compreendendo: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL,

[034] para uso em um método de tratamento de um distúrbio neurodegenerativo da retina,

[035] em que os referidos primeiro e segundo cassetes de expressão exibem menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos.

[036] A presente invenção também se refere a um método para tratar um paciente que sofre de uma doença degenerativa da retina compreendendo a etapa que consiste em administrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor adeno-associado (AAV) compreendendo: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL,

[037] em que os referidos primeiro e o segundo cassetes de expressão exibem menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos.

[038] Como usado na presente invenção, o termo Fator de Viabilidade de cone derivado de Bastonete (RdCVF) se refere à proteína codificada pelo gene semelhante a tiorredoxina 6 (TXNL6) ou semelhante a Nucleorredoxina 1 (NXNL1). Abrange as proteínas de RdCVF de qualquer espécie de animal. Tipicamente, as proteínas de RdCVF de acordo com a presente invenção podem ser proteínas de RdCVF de mamífero, incluindo, mas não limitado a camundongos, ratos, gatos, cães, primatas não humanos e humanos.

[039] A menos que de outro modo especificado, o termo “RdCVF” se refere à isoforma curta do gene NXNL1 e “RdCVFL” ou “RdCVF-L” à isoforma longa do gene NXNL1.

[040] Tipicamente, em camundongos a isoforma curta (RdCVF) é uma proteína longa de 109 aminoácidos, referenciada sob o número de acessão Uniprot Q91W38. A isoforma longa de murino (RdCVFL) é uma proteína longa de 217 aminoácidos referenciada sob Q8VC33.

[041] Em uma modalidade da invenção, a isoforma curta de RdCVF é a isoforma curta humana de RdCVF (hRdCVF), tendo a seguinte sequência: 10 20 30 40 50

MASLFSGRIL IRNNSDQDEL DTEAEVSRRL ENRLVLLFFG AGACPQCQAF 60 70 80 90 100

VPILKDFFVR LTDEFYVLRA AQLALVYVSQ DSTEEQQDLF LKDMPKKWLF

LPFEDDLRR (SEQ ID NO: 1)

[042] Por conseguinte, o primeiro ácido nucleico, que codifica a isoforma curta de RdCVF pode compreender a seguinte sequência de ácido nucleico humano:

ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGAC GAGCTG GATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTT CTTTGGT GCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTC GTGCGG CTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTG TCCCAG GACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATG

GCTTTTC CTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGTGA (SEQ ID NO: 3)

[043] Alternativamente, o primeiro ácido nucleico pode compreender um ácido nucleico que difere da SEQ ID NO: 3, mas codifica a mesma sequência de aminoácidos.

[044] Sequências de ácido nucleico adequadas incluem, mas não são limitadas a: - polimorfismo do cDNA que codifica RdCVF humano; - combinações de polimorfismos (haplótipos raros) do cDNA que codifica RdCVF humano. Um exemplo de cDNA de haplótipo raro é estabelecido como SEQ ID NO: 11, - sequências “otimizadas” nas quais certos códons são substituídos por códons que codificam para o mesmo aminoácido. Sequências otimizadas por códon adequadas que codificam RdCVF incluem, mas não são limitadas a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 12; - sequências homólogas. Por exemplo, os inventores descobriram que a sequência de cDNA de chimpanzé que codifica a isoforma curta de RdCVF de chimpanzé pode ser usada, uma vez que codifica a mesma sequência de aminoácidos que o cDNA humano. O cDNA de chimpanzé tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 4.

[045] Em uma modalidade da invenção, a isoforma longa do gene NXNL1 é a isoforma longa humana RdCVFL (hRdCVFL), tendo a sequência referenciada sob o número de acessão Q96CM4 e estabelecida abaixo: 10 20 30 40 50

MASLFSGRIL IRNNSDQDEL DTEAEVSRRL ENRLVLLFFG AGACPQCQAF 60 70 80 90 100

VPILKDFFVR LTDEFYVLRA AQLALVYVSQ DSTEEQQDLF LKDMPKKWLF 110 120 130 140 150

LPFEDDLRRD LGRQFSVERL PAVVVLKPDG DVLTRDGADE IQRLGTACFA 160 170 180 190 200

NWQEAAEVLD RNFQLPEDLE DQEPRSLTEC LRRHKYRVEK AARGGRDPGG 210 GGGEEGGAGG LF (SEQ ID NO: 2)

[046] Por conseguinte, o segundo ácido nucleico, que codifica RdCVFL pode compreender a seguinte sequência de ácido nucleico humano:

ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGAC GAGCTG GATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTT CTTTGGT GCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTC GTGCGG CTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTG TCCCAG GACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATG GCTTTTC CTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGGACCTCGGGCGCCAGTTCTCAGTGGA GCGCCTG CCGGCGGTCGTGGTGCTCAAGCCGGACGGGGACGTGCTCACTCGCGACGGCGC CGACGAG ATCCAGCGCCTGGGCACCGCCTGCTTCGCCAACTGGCAGGAGGCGGCCGAGGT GCTGGAC CGCAACTTCCAGCTGCCAGAGGACCTGGAGGACCAGGAGCCACGGAGCCTCAC CGAGTGC CTGCGCCGCCACAAGTACCGCGTGGAAAAGGCGGCGCGAGGCGGGCGCGACC

CCGGGGGA GGGGGTGGGGAGGAGGGCGGGGCCGGGGGGCTGTTCTGA (SEQ ID NO: 5)

[047] Alternativamente, o segundo ácido nucleico pode compreender um ácido nucleico que difere da SEQ ID NO: 5 mas codifica a mesma sequência de aminoácidos.

[048] Sequências de ácidos nucleicos adequadas incluem, mas não são limitadas a: - polimorfismos do cDNA que codificam RdCVF humano ou combinações dos mesmos; - sequências “otimizadas” nas quais certos códons são substituídos por códons que codificam para o mesmo aminoácido; sequências otimizadas por códon adequadas que codificam RdCVF incluem, mas não são limitadas a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 12;

- sequências homólogas em outras espécies.

[049] As sequências das proteínas de RdCVF e RdCVFL são descritas por Chalmel et al. 2007 (39) e o pedido de patente internacional WO2008/148860.

[050] Como usado na presente invenção, o termo “vetor adeno-associado” ou “AAV” tem seu significado geral na técnica.

[051] AAVs foram extensamente descritos na técnica como vetores adequados para distribuição de gene. Realmente, AAVs são não patogênicos e apresentam uma ampla gama de especificidade de tecido, dependendo de seu sorotipo. Tipicamente, AAVs de acordo com a presente invenção são AAVs que são capazes de direcionar para células da retina.

[052] Os exemplos incluem, mas não são limitados a AAV2, AAV8, AAV2/8, AAV2/5, AAV2/9 e AAV7m8.

[053] Em uma modalidade, o AAV de acordo com a presente invenção é obtido de acordo com o método descrito no pedido de patente internacional WO2012/158757.

[054] Tipicamente, os primeiro e segundo ácidos nucleicos, que codificam respectivamente a isoforma curta e longa do gene NXNL1, estão sob o controle de um promotor que permite a expressão da referida isoforma curta e longa nas células alvo.

[055] Promotores adequados podem ser promotores ubíquos, como promotor de CMV/CBA.

[056] Promotores adequados podem ser promotores que permitem a expressão na retina, de preferência em células epiteliais pigmentadas da retina e células fotorreceptoras.

[057] Em uma modalidade, o promotor permite expressão de gene em células epiteliais pigmentadas da retina.

[058] Em uma modalidade, o promotor permite expressão de gene em fotorreceptores de cone. Um exemplo não limitante é o promotor de opsina cone.

[059] Tipicamente, a isoforma curta do gene NXNL1 é expressa pelo menos por células epiteliais pigmentadas da retina e a isoforma longa é expressa pelo menos por células fotorreceptoras de cone.

[060] Em uma modalidade da invenção, promotores diferentes são usados para conduzir a expressão da isoforma curta e da isoforma longa.

[061] Tipicamente, a isoforma curta do gene NXNL1 pode ser expressa sob o controle do promotor de CMV/CBA e a isoforma lona do gene NXNL1 pode ser expressa sob o controle do promotor de opsina cone.

[062] Em uma modalidade da invenção, os dois cassetes de expressão são invertidos, com um cassete de expressão sendo 5’ a 3’ e o outro cassete de expressão sendo 3’ a 5’.

[063] Os inventores encontraram que essa configuração também foi adequada para evitar acondicionamento incompleto.

[064] Em uma modalidade da invenção, o referido vetor adeno-associado (AAV) acima descrito compreende ainda uma sequência de preenchimento da SEQ ID NO: 10.

[065] Em uma modalidade específica, a presente invenção se refere a um vetor adeno-associado (AAV) compreendendo: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico compreendendo um cDNA otimizado por códon que codifica RdCVF, sob o controle de um promotor ubíquo, de preferência o promotor de CMV/CBA; e - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico compreendendo um cDNA otimizado por códon que codifica RdCVFL sob o controle do promotor opsina cone (OPN1L/MW).

[066] Em uma modalidade, o primeiro ácido nucleico compreendendo um cDNA otimizado por códon que codifica RdCVF tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 12.

[067] Em uma modalidade, o segundo ácido nucleico compreendendo um cDNA otimizado por códon que codifica RdCVFL tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 13.

[068] Em uma modalidade, o vetor adeno-associado tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 6 (correspondendo ao construto 3 dos Exemplos abaixo).

[069] No contexto da invenção, o termo “tratar” ou “tratamento”, como usado na presente invenção, significa reverter, aliviar, inibir o progresso de, ou prevenir o distúrbio ou condição à qual tal termo se aplica, ou um ou mais sintomas de tal distúrbio ou condição (por exemplo, doenças degenerativas da retina).

[070] O termo “doenças degenerativas da retina” abrange todas as doenças associadas à degeneração de cone, doença degenerativa da retina inclui, mas não é limitado a Retinite pigmentosa, degeneração macular relacionada à idade, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen-Kornzweig, doença de Best, coroideremia, atrofia girata, amaurose congênita de Leber, doença de Refsum, doença de Stargardt ou síndrome de Usher.

[071] Em uma modalidade da invenção, a doença degenerativa da retina é Retinite Pigmentosa.

[072] De acordo com a invenção, o termo “paciente” ou “paciente em necessidade da mesma” é destinado a um mamífero humano ou não humano afetado ou provável de ser afetado com doenças degenerativas da retina.

[073] De acordo com a presente invenção, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de uma composição é uma que é suficiente para obter um efeito biológico desejado, nesse caso aumentando a viabilidade de neurônio. Entende-se que a dosagem eficaz será dependente da idade, sexo, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento simultâneo, caso haja, frequência de tratamento e natureza do efeito desejado. Entretanto, a dosagem preferida pode ser moldada de acordo com o paciente individual, como é entendido e determinável por uma pessoa com conhecimentos na técnica, sem experimentação indevida.

[074] O vetor de expressão da invenção pode ser adequado para administração intraocular. Em uma modalidade específica, o vetor de expressão é administrado por injeção sub-retiniana.

[075] Em um aspecto, a invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um vetor adeno-associado (AAV) e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que o referido AAV compreende: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF, - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL, em que os referidos primeiro e segundo cassetes de expressão apresentam menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos.

[076] Em outro aspecto, a invenção se refere a um AAV compreendendo um ácido nucleico que tem a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10, em que o referido ácido nucleico tendo a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 10 não está presente em um cassete de expressão. Essa sequência SEQ ID NO: 10 tem o papel de DNA de preenchimento no AAV. O papel de uma sequência de preenchimento é aumentar o tamanho do vetor para evitar que o plasmídeo proviral seja encapsidado ao invés do gene de interesse.

[077] Usualmente, preenchimentos correspondendo a DNA de lambda de bacteriófago são usados em AAV. Entretanto, as sequências de lambda bacteriófago mais comumente usadas como preenchimento contêm quadros de leitura aberta, as regiões nin. Embora sejam considerados como inertes devido à distância filogenética a Ser Humano, Cheng et al. (38) demonstraram que tais preenchimentos não eram tão inertes quanto esperado porque as regiões nin podem ter atividade de transcrição forte. Desse modo, quando AAV com tal preenchimento é administrado a um paciente humano, há risco de transcrição do DNA de lambda de bacteriófago.

[078] Desse modo, foi importante desenvolver um novo preenchimento inerte. Os inventores encontraram que o ácido nucleico tendo a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 10 poderia inesperadamente ser usado como um DNA de “preenchimento”, para aumentar o tamanho dos construtos de AAV, em substituição do preenchimento de lambda de bacteriófago. O referido ácido nucleico tendo a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 10 tem a grande vantagem de ser inerte porque essa sequência é uma sequência não traduzida, não é um alvo miRNA, é uma sequência não telomérica, não contém nenhuma origem de replicação de DNA e não contém repetição de nucleotídeos. Essa sequência tendo qualquer atividade funcional, não há risco de transcrição quando é usada como um preenchimento em um AAV.

[079] A sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 10 foi selecionada através de um processo rigoroso como descrito na figura 3. É uma abordagem de bioinformática que consiste em identificar no genoma humano região que não contém nenhum elemento como centrômeros, genes, pseudogenes, origens de replicação, repetições ou sequências alvejadas para RNA micro. A sequência NO: 10 foi selecionada entre esses locais.

[080] A invenção será ainda ilustrada através dos seguintes exemplos e figuras.

LEGENDAS DAS FIGURAS

[081] Figura 1: representação esquemática de construtos preferidos de acordo com a invenção:

[082] A figura 1A representa o construto CT35, um exemplo comparativo (desse modo não um construto de acordo com a presente invenção) revelado em WO2016/185037. As figuras 1B, 1C e 1D representam respectivamente construtos 3 (C03), 6 (C06) e 11 (C11) de acordo com a invenção.

[083] Figura 2: DNA de filamento único de tamanho de genoma de AAV analisado por eletroforese de gel em desnaturação.

[084] O tamanho do DNA de filamento único do genoma de AAV de construtos diferentes foi analisado por eletroforese de gel sob condições de desnaturação: - Construto 3 (C03) que expressa ambos RdCVF e RdCVFL (7v7. AAV2- CMV/CBAorig-RdCVF-5’_1.7.OPN1L/MW-RdCVFL) - CT35 que expressa ambos RdCVF e RdCVFL (AAV2-CMV/CBA-RdCVF- CMV/CBA-RdCVFL) (SEQ ID NO: 15) CT37 que expressa somente RdCVF (AAV2-CMV/CBA-RdCVF + preenchimento) (SEQ ID NO: 16).

[085] Figura 3: Representação esquemática do processo de seleção para um DNA de “preenchimento” inerte.

[086] Figura 4: Comparação de acondicionamento.

[087] Figura 4A: outra representação do AAV CT35. Nesse AAV expressando tanto RdCVF como RdCVFL, o primeiro e o segundo cassetes de expressão têm 390 nucleotídeos idênticos contíguos devido à repetição direta do promotor [CMV/CBA delta 390].

[088] Figura 4B: simulação gráfica de uma recombinação entre as duas cópias [CMV/CBA delta 390] que produziriam uma eliminação do cassete [CMV/CBA delta 390-RdCVF] ou uma recombinação com o cassete [CMV/CBA delta 390-RdCVFL].

[089] Figura 4C: Transdução de CT35 (AAV-CMV / CBA-RdCVF_CMV / CBA- RdCVFL) em células primárias de epitélio pigmentado de porcino. Análise de Western blot de RdCVF e RdCVFL usando anticorpos anti-RdCVF policlonais de coelho (4).

[090] Figura 4D: Outra representação do AAV C06 e simulação gráfica de uma recombinação. Nesse AAV, o primeiro e o segundo cassetes de expressão compartilham uma repetição direta de 167 nucleotídeos idênticos contíguos.

[091] Figura 4E: outra representação do AAV C03.

[092] Figura 4F: análise de integridade de genoma de AAVs encapsidados C06, C03, CT35 e CT37 (proteínas de capsídeo mais DNA).

[093] Figuras 4G e 4H: as tabelas representando para C03 e C06 a percentagem de capsídeos compreendendo um AAV encapsidado completo (cheio), a percentagem de capsídeos compreendendo um AAV incompletamente encapsidado (intermediário) e a percentagem de capsídeos não compreendendo AAV (vazio; sem DNA). A Tabela 4G mostra resultados de detecção obtidos tanto para proteína de capsídeo como DNA (genoma de AAV). A Tabela 4H mostra resultados de detecção obtidos somente para DNA.

EXEMPLOS Exemplo 1

[094] A seguinte seção fornece exemplos não limitantes de construtos adequados de acordo com a invenção.

[095] Construto 3 (C03): 7v7. AAV2-CMV/CBAorig-RdCVF-5’_1.7.OPN1L/MW- RdCVFL. Como mostrado na figura 1B, nesse construto, a sequência de cDNA de RdCVF humano foi otimizada por códon (usando um primeiro processo de otimização v1) e colocada sob o promotor ubíquo CMV/CBA. O cDNA de RdCVFL humano foi também otimizado por códon (usando um processo de otimização diferente v2) e foi colocado sob o controle do promotor de opsina cone. A repetição direta compartilhada entre o primeiro e o segundo cassete de expressão tem 9 nucleotídeos de comprimento.

[096] O vetor AAV tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 6. Construto 6 (C06): AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL.

[097] Como mostrado nas figuras 1C e 4D, nesse construto, a sequência de cDNA de RdCVF de chimpanzé foi usada no primeiro cassete expresso e colocada sob o promotor ubíquo CMV/CBA. O cDNA de RdCVFL humano foi colocado sob o controle do promotor de opsina cone. A repetição direta compartilhada entre o primeiro e o segundo cassete de expressão tem 169 nucleotídeos de comprimento.

[098] O vetor AAV tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 7. Construto 7 (C07): AAV2_rev_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL

[099] Esse construto é similar ao construto 6, exceto que o primeiro cassete de expressão é colocado em orientação reversa.

[0100] O vetor AAV tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 8. Construto 8 (C08): AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_rev_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL- hGH

[0101] Esse construto é similar ao construto 6, exceto que o segundo cassete de expressão é colocado na orientação reversa.

[0102] O vetor AAV tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 9. Construto 11 (C11): AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_rare_haplotype_human_5p_1.7_OPN1LMW _RdCVFL

[0103] Como mostrado na figura 1D, nesse construto, o primeiro cassete de expressão compreende um cDNA que codifica RdCVF humano que é uma combinação de polimorfismos (haplótipo raro), sob o promotor ubíquo CMV/CBA. O segundo cassete de expressão compreende o cDNA de RdCVFL humano, sob o controle do promotor de opsina cone. A repetição direta compartilhada entre o primeiro e o segundo cassete de expressão tem 54 nucleotídeos de comprimento.

[0104] O vetor AAV tem a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 14. Exemplo 2: Construtos de AAV que apresentam longos trechos de nucleotídeos idênticos são sujeitas a acondicionamento incompleto. Materiais e métodos Produção de vetores virais

[0105] Vetores AAV que contêm cDNA que codifica RdCVF de camundongo, RdCVFL ou eGFP foram produzidos pelo método de co-transfecção de plasmídeo (31). AAV recombinante foi purificado por cloreto de césio ou ultracentrifugação de gradiente de iodixanol. O eluente viral foi permutado por tampão e concentrado com Unidades de Filtro centrífugo Ultra-15 da Amicon em PBS e titulados por PCR quantitativo em relação a uma curva padrão. Eletroforese de gel de desnaturação

[0106] O DNA genômico foi extraído e submetido a eletroforese de gel de desnaturação. O tamanho dos ácidos nucleicos foi comparado com uma escada de DNA. Resultados

[0107] As figuras 2 e 4F mostram que o construto CT37, reveladas em WO2016/185037 e desse modo não é um construto de acordo com a invenção. Esse exemplo comparativo que somente expressa RdCVF é sujeito a um acondicionamento completo uma vez que sua produção resulta em DNA nos tamanhos esperados de ~5000 bp.

[0108] Como mostrado nas figuras 2 e 4F, CT35, compreendendo uma repetição de 390 nucleotídeos idênticos contínuos (figura 4A), é sujeito a acondicionamento incompleto uma vez que sua produção resulta em tamanhos de genoma de AAV anormais ao invés de genoma de AAV de 4804 bp.

[0109] Desse modo, é bem demonstrado que expressar um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL em um AAV pode levar a encapsidação incompleta do DNA de filamento único de AAV no capsídeo viral.

[0110] Em contraste, o construto C06 de acordo com a invenção, que expressa tanto RdCVF como RdCVFL e compreende uma repetição direta com somente 167 nucleotídeos de comprimento, mostra uma banda no tamanho esperado de 4942 bp. Esse resultado demonstra uma encapsidação completa com o construto C06.

[0111] Do mesmo modo, o construto C03, compreendendo uma repetição de 9 nucleotídeos idênticos contínuos, mostra uma banda única no tamanho esperado de 4926 bp.

[0112] É mostrado que a diminuição do número de nucleotídeos idênticos contíguos compartilhados entre os dois cassetes de expressão, permite aumentar a proporção de encapsidação completa de um AAV compreendendo tanto um ácido nucleico que codifica RdCVF como um ácido nucleico que codifica RdCVFL.

[0113] Desse modo, os inventores demonstraram que acondicionamento completo é obtido quando o primeiro e o segundo cassete de expressão não contêm mais do que 200 ácidos nucleicos contíguos.

[0114] Para explorar ainda o fenômeno, ultracentrifugação analítica foi usada de acordo com Burnham et al. (35) para comparar os construtos diferentes

(figuras 4G e 4H). os resultados para C03 e C06 mostram que a banda extra observada no gel de desnaturação casa com aquela da alta percentagem de partículas de AAV com coeficientes de sedimentação intermediários, representa partículas que estão entre cheio e vazio, e desse modo correspondendo a partículas compreendendo um AAV acondicionado incompletamente. De acordo com os resultados obtidos na eletroforese de gel de desnaturação, o construto C06 mostra encapsidação total de 18% e o construto C03 forneceu resultados apropriados no método de ultracentrifugação analítica, indicando uma alta percentagem das partículas de AAV total (58%) (figura 4H).

[0115] Isso confirma que há um aumento da percentagem de partículas com genoma integral quando o número de nucleotídeos idênticos contíguos compartilhados entre os dois cassetes de expressão não é superior a 200. Exemplo 3: combinação de RdCVF e RdCVFL resulta em um efeito sinérgico.

[0116] Os seguintes construtos foram produzidos e introduzidos em um vetor AAV2.

[0117] O plasmídeo proviral p618 e seus elementos são descritos no pedido de patente internacional publicado como WO2012158757A1 e na publicação (33). 2xRdCVF: plasmídeo p857 e AAV CT39

[0118] P857/CT39 foi projetado para aumentar o nível de expressão de RdCVF em comparação com CT37 (RdCVF-preenchimento) para obter proteção de cone suficiente em pacientes que sofrem de retinite pigmentosa (RP). RdCVF-RdCVFL: plasmídeo p853 e AAV CT35

[0119] Esse vetor é capaz de co-expressar a isoforma curta e longa de RdCVF.

[0120] Entretanto, sua produção é sujeita a eventos de acondicionamento incompleto anormais que limitam seu uso como um agente terapêutico.

Exemplo 4: Seleção de um DNA inerte para substituir preenchimentos de lambda de fago

[0121] Os inventores desenvolveram um processo de classificação para identificar uma sequência de ácido nucleico que poderia ser usada como uma alternativa mais segura para as sequências de preenchimento de lambda de fago usadas tradicionalmente para obter construtos de AAV tendo um tamanho suficiente.

[0122] A classificação do genoma humano inteiro foi realizada para eliminar sequências indesejáveis como centrômeros, genes conhecidos, pseudogenes, repetições, alvos de miRNA, origens de replicação. Esse processo de classificação inventivo resultou na seleção de SEQ ID NO: 10, que é uma sequência inerte do cromossomo humano 15. Exemplo 5: Análise de recombinação

[0123] A análise de Western blot na figura 4C mostra a expressão de RdCVF e RdCVFL usando anticorpos anti-RdVF policlonais de coelho. Ambas as proteínas são detectadas para o construto CT35, que demonstra que CT35 não é sujeito à recombinação homóloga. Referências

[0124] Ao longo desse pedido, várias referências descrevem o estado da técnica ao qual essa invenção se refere. As revelações dessas referências são pela presente incorporadas por referência na presente invenção.

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Claims (8)

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor adeno-associado (AAV) compreendendo: - um primeiro cassete de expressão compreendendo um primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF e - um segundo cassete de expressão compreendendo um segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL, caracterizado pelo fato de que os referidos primeiro e segundo cassetes de expressão apresentam menos do que 200 nucleotídeos idênticos contíguos.

2. AAV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um sorotipo AAV2/8.

3. AAV de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro ácido nucleico que codifica RdCVF está sob o controle de um promotor ubíquo, preferencialmente o promotor de CMV/CBA.

4. AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL está sob o controle do promotor de opsina cone.

5. AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de ácido nucleico como estabelecida no grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8 e SEQ ID NO: 9, preferencialmente SEQ ID NO: 6.

6. AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de preenchimento de SEQ ID NO: 10.

7. Uso de um AAV definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio neurodegenerativo da retina.

8. AAV compreendendo um ácido nucleico tendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10, caracterizado pelo fato de que o referido ácido nucleico tendo a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 10 não está presente em um cassete de expressão.