CN101432291A - 嵌合腺病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了嵌合腺病毒载体以及使用所述载体激发针对目的抗原的免疫反应的方法。

Description

嵌合腺病毒载体
相关申请的交叉引用
本申请要求下述美国临时专利申请的优先权：于2006年2月28日提交的美国临时专利申请No.60/778026，于2006年5月19日提交的美国临时专利申请No.60/801,645，于2006年5月22日提交的美国临时专利申请60/802,992，于2006年8月4日提交的美国临时专利申请No.60/821,492，于2006年9月22日提交的美国临时专利申请60/846,658以及于2006年9月28日提交的美国临时专利申请No.60/848,195)，为了所有的目的，其公开内容整体通过引用并入本文。
关于在联邦政府资助的研究开发中产生的发明的权利的声明
不适用
发明背景
疫苗是用于预防和/或治疗大量疾病和病症(例如，病毒感染、细菌感染和癌症)的重要手段。基于核酸的疫苗具有超过蛋白或减毒活疫苗的若干优势。表达抗原的核酸向靶细胞的导入使得针对目的抗原产生免疫反应的疫苗快速开发。对于蛋白疫苗，当每次产生了新的疫苗时都需要开发有效且高效的蛋白纯化方法。对于活疫苗，需要确定减毒作用的方法没有完全阻止病原体的生长，也要证明其在人体内是完全安全的。蛋白纯化和减毒作用的方法学的开发是极其费时的过程。相反，大部分基于核酸的疫苗每次使用相同的生产工艺就能够被很快地生产出，仅仅在编码目的抗原的核酸中有快速变化。复制缺陷型腺病毒是基于核酸的疫苗系统，其快速地、可预料地和廉价地以高效价被制备[Polo，J.M.and Dubensky，T.W.，Jr.，Drug Discov Today，7(13)，719-727(2002)]。然而，给予本领域已知的腺病毒载体后抗原特异性反应的效率是低的。因此，在本领域中需要能够高效地激发针对目的抗原的免疫反应的新腺病毒载体。本发明满足这些和其它需要。
发明概述
本发明提供了包含编码异源多肽的核酸的嵌合腺病毒载体，以及激发对异源多肽的免疫反应的方法。
本发明的一个实施方案提供了包含表达盒的嵌合腺病毒表达载体，所述表达盒包含：(a)可操作地连接于编码toll样受体(TLR)-3激动剂的核酸的第一启动子；和(b)可操作地连接于编码异源多肽的核酸的第二启动子。在一些实施方案中，所述TLR-3激动剂是dsRNA。在一些实施方案中，所述编码TLR激动剂的核酸包含选自SEQ ID NOS：3、7、8、9、10、11和12的序列。在一些实施方案中，所述异源多肽选自HIV包膜多肽(例如，gp41、gp120或gp160)和流感HA多肽。在一些实施方案中，所述第一和第二启动子是相同的。在一些实施方案中，第一和第二启动子是不同的。在一些实施方案中，所述启动子选自β肌动蛋白启动子和CMV启动子。本发明还提供了包含表达载体的免疫原性组合物。
本发明的另一实施方案提供了通过给予哺乳动物个体(例如，诸如小鼠、大鼠或豚鼠的啮齿类动物，或诸如黑猩猩、猕猴或人的灵长类动物)免疫原性有效量的组合物，以激发对异源多肽的免疫反应的方法。在一些实施方案中，所述载体通过任何一种非胃肠外途径(例如，经口、经鼻或粘膜)给药。在一些实施方案中，所述异源多肽在选自树突细胞、微褶细胞和肠上皮细胞的细胞中表达。
本发明的另一实施方案提供了免疫原性组合物，其包括：(a)包含可操作地连接于编码异源多肽的核酸的启动子的嵌合腺病毒表达载体；和(b)TLR-3激动剂(例如，dsRNA)。在一些实施方案中，所述TLR-3激动剂由核酸编码。本发明还提供了通过以任何非胃肠外途径(例如，口腔、经鼻、粘膜)给予哺乳动物个体(例如，诸如小鼠、大鼠或豚鼠的啮齿类动物，或诸如黑猩猩、猕猴或人的灵长类动物)所述组合物，以激发免疫反应的方法。
本发明的另一实施方案提供了包括在SEQ ID NOS：1、2、6、7、13、14、15、16或17中提及的序列的分离的核酸。
附图简述
图1显示了证实在口腔递送载体后诱导抗原特异性免疫反应时，本发明的嵌合腺病毒载体(即，DS1)与TLR-3激动剂联用比标准腺病毒载体(即，rAd5)更有效的数据。图1A显示了描述口腔递送腺病毒载体后第3周时，针对HIV包膜蛋白(即，gp120)的抗体效价的数据。图1B显示了描述在口腔递送腺病毒载体后第6周时，针对HIV包膜蛋白(即，gp120)的抗体效价的数据。
图2显示了证实本发明的嵌合腺病毒载体(即，DS1b或DS1c)与TLR-3激动剂联用比标准腺病毒载体(即，rAd5)更有效地诱导抗原特异性免疫反应的数据。图2A显示了描述在口腔给予载体后第3周时，抗GFP IgG效价的数据。图2B显示了描述在第0、4和8周给予载体后第10周时，针对GFP的CD8+T细胞应答的数据。图2C显示了描述在口腔给予载体后第3周时，抗HA抗体效价的数据。
图3显示了证实当本发明的嵌合腺病毒载体经非胃肠外给药时，较好地用于激发免疫反应的数据。图3A显示了描述在肌内给予DS1后第3周时，抗gp120抗体效价的数据。图3B显示了描述在鼻内给予DS1c后第3周时，抗HA抗体效价的数据。
图4显示了证实表达的TLR-3配体激动剂能够诱导抗原呈递细胞的激活的数据。图4A显示了描述树突细胞被表达的dsRNA TLR-3激动剂luc1激活的数据。图4B显示了描述表达的dsRNA TLR-3激动剂luc1和ml激活树突细胞的数据。
图5是本发明的嵌合腺病毒载体，即，包含编码表达ds RNA TLR-3激动剂的核酸的嵌合腺病毒载体的示意图。
图6显示了证实本发明的嵌合腺病毒载体在口腔递送后，有效地诱导抗原特异性免疫反应的数据。图6显示了描述在口腔给予包含编码dsRNA TLR-3激动剂luc1的核酸序列的嵌合腺病毒后第3周时，抗gp120抗体效价的数据。
图7显示了证实TLR-7/8激动剂在诱导抗原特异性免疫反应方面有效性较差的数据。
图8显示了证实本发明的嵌合腺病毒载体在口腔递送后，有效地诱导抗原特异性免疫反应的数据。图8A显示了描述在口腔给予包含编码dsRNA TLR-3激动剂luc1的核酸序列的嵌合腺病毒后第4周时，抗HA抗体效价的数据。图8B显示了描述在给予包含编码dsRNATLR-3激动剂luc1的核酸序列的嵌合腺病毒后第4周或7周时，抗HA抗体效价的数据。图8C显示了描述在口腔或鼻内给予包含编码dsRNA TLR-3激动剂luc1的核酸序列的嵌合腺病毒后第3周时，抗HA抗体效价的数据。
序列简述
SEQ ID NO：1显示嵌合腺病毒载体DS1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2显示嵌合腺病毒载体DS2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3显示编码TLR-3激动剂的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4显示编码TLR-3激动剂的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5显示编码TLR-3激动剂的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6显示包含编码流感HA的核酸和编码TLR-3激动剂(luc)的核酸的嵌合腺病毒载体的核苷酸序列，其中所述的流感HA和TLR-3激动剂是相同方向。
SEQ ID NO：7显示包含编码流感HA的核酸和编码TLR-3激动剂(luc)的核酸的嵌合腺病毒载体的核苷酸序列，其中所述的流感HA和TLR-3激动剂是相反方向。
SEQ ID：8显示编码短发夹RNA TLR-3激动剂的核苷酸序列。所述序列的互补部分以大写字母表示，连接序列以小写字母表示。
SEQ ID NO：9显示编码短发夹RNA TLR-3激动剂(gl)的核苷酸序列。所述序列的互补部分以大写字母表示，连接序列以小写字母表示。
SEQ ID NO：10显示编码短发夹RNA TLR-3激动剂(luc)的核苷酸序列。所述序列的互补部分以大写字母表示，连接序列以小写字母表示。
SEQ ID NO：11显示编码短发夹RNA TLR-3激动剂(ml)的核苷酸序列。所述序列的互补部分以大写字母表示，连接序列以小写字母表示。
SEQ ID NO：12显示编码短发夹RNA TLR-3激动剂的核苷酸序列。所述序列的互补部分以大写字母表示，连接序列以小写字母表示。
SEQ ID NO：13显示嵌合腺病毒载体DS1c的核苷酸序列。所述序列包含编码HA(PR8/34)的核苷酸。
SEQ ID NO：14显示嵌合腺病毒载体DS2β-luc的核苷酸序列。所述载体包含在β肌动蛋白启动子的调控下编码TLR-3激动剂luc的序列。所述载体还包含用于插入编码目的抗原的核酸序列的开放克隆位点。
SEQ ID NO：15显示嵌合腺病毒载体DS2C-luc的核苷酸序列。所述载体包含CMV启动子调控的编码TLR-3激动剂luc的序列。所述载体还包含用于插入编码目的抗原的核酸序列的开放克隆位点。
SEQ ID NO：16显示穿梭(pshuttle)载体的核苷酸序列，所述的穿梭载体包含CMV启动子调控的编码TLR-3激动剂luc的核酸序列和在一个单独的CMV启动子的控制下编码HA(禽流感)的核酸序列
SEQ ID NO：17显示嵌合腺病毒载体ND1.1214的核苷酸序列。编码异种抗原的核酸以粗体表示，并且在侧面与5′末端Cla I识别位点和3′末端与Not 1识别位点连接。编码TLR-3激动剂的核酸序列以斜体表示，连接序列以粗体表示。
发明详述
I.前言
本发明提供了新颖的嵌合腺病毒载体，其能够以非胃肠外给药以激发针对目的抗原的免疫反应。本发明的嵌合腺病毒载体包含编码异源多肽的核酸和编码TLR-3激动剂的核酸。所述嵌合腺病毒载体激发特异针对异源多肽的强且有效的免疫反应，特别是当通过非胃肠外途径给予时(例如，经口、经鼻或粘膜)。
本发明是基于当与病毒载体联合用药时，dsRNA TLR-3激动剂的给药是有效佐剂这一令人惊喜的发现。事实上，考虑到dsRNA模拟的聚肌胞苷酸(poly I：C)主要被提议的用途是作为抗病毒剂[Nemes，et al，Proc Soc Exp Biol Med.(1969)132：776；Schafer，et al，Nature.(1970)226：449；Fenje，et al，Nature(1970)226：171.]，将dsRNA用作病毒载体的佐剂是违反直觉的。
II.定义
本文使用的关于诸如核酸、蛋白或载体的术语“嵌合”或“重组”，表明所述的核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白，或改变天然核酸或蛋白被修饰。因此，例如，嵌合和重组载体包含在载体的天然(非嵌合或非重组)形式中没有发现的核酸序列。嵌合腺病毒表达载体是指包含编码异源多肽的核酸序列的腺病毒表达载体。
“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在宿主细胞中转录的特异的核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包含可操作地连接于启动子的欲被转录的核酸。
本文使用的术语“启动子”或“表达调控制序列”是指大量一系列指导核酸的直接转录核酸的核酸调控制序列。如本文所使用的，启动子包含在转录的起始位点附近的必需的核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子或，TATA元件的情况下。启动子还任选地包含能够被定位于来自距离于转录的起始位点的多达几千个碱基对的远端增强子或抑制子元件。启动子包括组成型和诱导型启动子。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下都有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境和发育调控下有活性的启动子。术语“可操作地连接”是指在核酸表达控制序列(例如，启动子或一系列大量转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能连接，其中所述表达控制序列指导与第二序列对应的核酸的转录。
本文使用的术语“TLR激动剂”或“Toll样受体激动剂”是指结合和刺激诸如TLR-2、TLR-3、TLR-6、TLR-7或TLR-8的Toll样受体的化合物。MacKichan在IAVI Report.9：1-5(2005)中以及Abreu等人在J Imμnol，174(8)，4453-4460(2005)中综述了TLR激动剂。激动剂在与其受体结合后诱导信号转导。
本文使用的术语“TLR-3激动剂”或“Toll样受体3激动剂”是指结合和刺激TLR-3的化合物。TLR-3激动剂已经被确定包含双链RNA、来自病毒的dsRNA、一些包括聚肌苷-聚胞苷酸(聚肌胞苷酸)-聚腺苷-聚尿苷酸(聚腺尿苷酸)和聚肌苷酸：聚胞苷酸在内的化学合成的双链RNA的类似物，以及针对导致IFN-β产生的TLR-3的抗体(或抗体的交联)[Matsumoto，M，et al，Biochem Biophys Res Comμn 24：1364(2002)，de Bouteiller，et al，J Biol Chem 18：38133-45(2005)]。TLR-3激动剂还包括表达的dsRNA(例如，由包括SEQ ID NOS：3、7、8、9、10、11或12中显示的序列的核酸编码的dsRNA)。
本文使用的术语“TLR-7/8激动剂”或“Toll样受体7/8激动剂”是指结合和刺激TLR-7或TLR-8受体的化合物；这些受体识别多种相同的配体。一些诸如病毒单链RNA、咪喹莫特、洛索立宾、多尿苷酸或雷西莫特的TLR-7/8激动剂已经被确定。
当使用术语“异源”提及核酸的部分时表明所述核酸包含在自然界中没有发现彼此关系相同的两个或多个序列。例如，核酸通常被重组产生，使来自于无关基因的两个或多个序列排列成为新的功能核酸，例如，来自于一个来源的启动子和来自另一来源的编码区。类似地，异源蛋白表明所述蛋白包含在自然界中没有发现彼此关系相同的两个或多个序列(例如，融合蛋白)。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中互换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。所述术语包括包含已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，其是合成的、天然存在和非天然存在的。所述核酸与参考核酸具有相似的结合特性，且其以与参考核苷酸相似的方式代谢。这种类似物的实例包括，但不限于，磷硫酰、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸、肽核酸(PNAs)。
除非另外的说明，特殊的核酸序列还包括其保守性修饰的变异体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指明的序列。特别是，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位由混合碱基和/或脱氧次黄苷残基替换的序列来实现(Batzer etal，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini et al，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
抗原是指能够被T细胞受体和/或抗体识别的蛋白或多肽链的部分。通常，抗原是来源于细菌、病毒或真菌蛋白。
本发明的组合物的“免疫原性有效剂量或量”是激发或调节特异针对异源多肽的免疫反应的量。免疫反应包括体液免疫反应和细胞介导的免疫反应。在任何阶段，免疫原性组合物都能够用于在治疗或预防上治疗或预防疾病。
“体液免疫反应”由血液的无细胞成分，即血浆或血清介导；将血清或血浆从一个个体转移到另一个体以转移免疫。
“细胞介导的免疫反应”由抗原特异性淋巴细胞介导；将抗原特异性淋巴细胞从一个体转移到另一个体以转移免疫。
嵌合腺病毒载体或包含嵌合腺病毒载体的组合物的“治疗剂量”或“治疗有效量”或“有效量”是预防、减轻、减弱或降低疾病和病症的症状严重性的载体或包含载体的组合物的量，所述疾病和病症与异源多肽的来源(例如，病毒、细菌、寄生虫或癌症)相关。
抗体是指特异性结合和识别抗原的由免疫球蛋白基因编码的多肽或其片段。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其分别依次定义IgG、IgM、IgA、IgD和IgE免疫球蛋白类别。
T细胞是指一类特殊的表达由一族基因编码的特异性受体(T细胞受体)的淋巴细胞。识别的T细胞受体基因包括α、β、δ和γ位点，并且所述T细胞受体通常(但是不是普遍地)识别MHC与短肽的组合。
获得性免疫反应是指抗原的T细胞和/或抗体识别。
本文使用的抗原呈递细胞(APCs)是指能够将免疫原性肽或其片段呈递到T细胞以激活或增强免疫反应的细胞。APCs包括树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和可以被设计成为高效的APCs的其它细胞。这种细胞可以，但不必需，被遗传修饰，以增加呈递抗原的能力、改善T细胞应答的激活和/或维持、使本身具有抗肿瘤作用和/或与接受体在免疫学上相容(即，匹配的HLA单倍型)。APCs可以从包括骨髓、外周血、肿瘤和肿瘤旁组织在内的多种生物体液和器官中分离出，并且可以是自体的、同种异体的、同系的或异种的细胞。APCs通常利用来自主要组织相容性(MHC)位点的受体将短多肽呈递到T细胞。
佐剂是非特异性免疫反应增强子。适合的佐剂包括，例如，霍乱毒素、单磷酰脂质A(MPL)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A和Al(OH)。佐剂也可以是那些通过诸如Toll样受体的次级信号分子引起APC激活和增强T细胞呈递的物质。Toll样受体的实例包括识别双链RNA、细菌鞭毛、LPS、CpG DNA和细菌脂肽的受体(最近在[Abreuet al，J Immunol，174(8)，4453-4460(2005)]中被综述)。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，其指氨基酸残基的多聚体。所述术语适用于氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，还适用于天然存在的氨基酸多聚体和非天然存在的氨基酸多聚体。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成氨基酸，以及氨基酸类似物和以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及被后修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、
Figure A200780015345D0014134409QIETU
-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即具有被结合到氢、羧基、氨基的
Figure A200780015345D0014134415QIETU
碳和R基的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这种类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的化学化合物。
本文氨基酸可以由其公知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸也可以由其公认的单字母代码来表示。
“保守性修饰的变异体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守性修饰的变异体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者如果所述核酸不编码氨基酸序列，保守性修饰的变异体指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任一指定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一位置，所述密码子能够被改变为所述对应密码子的任何一种，而不改变所编码的多肽。这种核酸变异体是“沉默变异体”，其是保守性修饰的变异体的一种。本文中编码多肽的每一核酸序列还描述了核酸的每一种可能的沉默变异体。技术人员会认识到核酸中的每一密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)可以被修饰以获得功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一种沉默变异体内含在每一个所描述的序列中。
对于氨基酸序列，技术人员会认识在编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小百分比的氨基酸的，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别替代替换、缺失或添加是“保守性修饰的变异体”，其中所述改变导致将氨基酸用化学上相似的氨基酸替换替代。提供功能上相似的氨基酸的保守替换替代表是本领域公知的。这种保守性修饰的变异体是除本发明的多态变异体、种间同系物(interspecies homologs)、等位基因以外的，并且不排除本发明的多态变异体、种间同系物、等位基因。
以下八组每一组都包含彼此保守替换替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸I，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)
(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。
短语“选择性(或特异性)杂交”是指在严格杂交条件下，分子仅与存在于复杂混合物中(例如，全细胞的或文库DNA或RNA)特定的核苷酸序列结合、双重(duplexing)或杂交。
术语“严格杂交条件”是指在所述条件下，探针通常在核酸的复杂混合物中杂交到其靶序列，而不杂交到其它序列。严格条件是序列依赖的，并且在不同的环境下不同。较长序列特定地在较高温下杂交。在Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays(杂交原理和核酸分析策略的概述)”(1993)中存在核酸杂交的广泛指导。通常，对于在确定的离子强度Ph下特定的序列，选择的严格条件比热熔点I低约5-10℃。Tm是在平衡状态下与靶标互补的探针的50％探针杂交到靶序列(由于靶序列过量存在，在Tm下，在平衡状态下时占据50％的探针被占据)的温度(在确定的离子强度、Ph和核酸浓度下)。严格条件是其中在Ph7.0至8.3下时，盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01M至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如，10至50核苷酸)，温度至少为约30℃以及对于长探针，温度至少为约60℃的那些条件。严格条件也可以用添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的二倍，任选地十倍于背景杂交。示例的严格杂交条件如下：50％甲酰胺，5x SSC和1％ SDS于42℃孵育，或者，5x SSC，1％ SDS，于65℃孵育，并于65℃下，在0.2x SSC和0.1％ SDS中冲洗。
在严格条件下，如果核苷酸编码的多肽基本相同，那么没有互相杂交的所述核酸仍然基本相同。例如，这发生在当使用遗传密码允许的最大密码简并来产生核酸的副本时。在这种情况下，核酸通常在中度严格杂交条件下杂交。示例的“中度严格杂交条件”包括在40％甲酰胺的缓冲盐、1M NaCl、1％ SDS中于37℃进行杂交，并于45℃下在1X SSC中冲洗。阳性杂交至少是背景的二倍。普通技术人员会轻易地认识到可以利用可选择的杂交和冲洗条件来提供相似的严格条件。
“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因的框架区的多肽或其片段，所述多肽或其片段特异性结合和识别抗原。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其分别依次确定IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类免疫球蛋白。
示例的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含一个四聚体。每一四聚体包含两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N端确定了约100至110或更多主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
当用于提及蛋白或肽时，短语“特异性(选择性)结合”于抗体或“特异性(或选择性)免疫反应”，是指确定所述蛋白在蛋白和其它生物制品的异质性群体中存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，将指定抗体结合到特定的蛋白至少是二倍于背景，并且基本上不以显著量结合到样品中存在的其它蛋白上。在这种条件下，与抗体的特异结合可能需要基于其对特定蛋白特异性而被选择的抗体。例如，可以选择针对融合蛋白的多克隆抗体以仅获得与融合蛋白发生特异性免疫反应，而不与所述融合蛋白的个别组分发生特异性免疫反应的那些多克隆抗体。该选择可以通过扣除与个别抗原交叉反应的抗体来实现。多种免疫测定形式可以用于选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规用于选择与蛋白发生特异性免疫反应的抗体(参见，例如，Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual(1988)，for a description of immunoassay formats and conditionsthat can be used to determine specific immunoreactivity(能够用于测定特异的免疫反应性的免疫测定形式和条件的说明))。通常，特异性或选择性反应将至少为背景信号或干扰的二倍，更通常大于10倍至100倍背景。
多核苷酸可以包括天然序列(即，编码个别多肽或dsRNA或其部分的内源序列)或可以包括这种序列的变异体。多核苷酸变异体可以包含一个或多个替换、添加、删除和/或插入，使得编码的多肽与包含天然抗原的多肽相比生物活性没有降低。多核苷酸变异体可以包含一个或多个替换、添加、删除和/或插入，使得编码的dsRNA的TLR-3激动活性与不包含替换、添加、删除和/或插入的dsRNA的TLR-3激动活性相比没有降低。优选地，变异体至少显示与编码天然多肽或其蛋白的多核苷酸序列，或与编码具有TLR-3激动活性的dsRNA的多核苷酸序列约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的一致性。
在用于两种或更多核酸(例如，TLR-3激动剂dsRNA)或多肽序列时，术语“相同的”或“同一性”百分比，是指使用下述序列比较算法的一种或通过手工比对和视觉检测在比较窗或测量的指定区域上比较和比对序列的最大对应时，两种或更多序列或亚序列相同或者具有相同的特定百分比的氨基酸残基或核苷酸(即50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或在特定区更相同)。这种序列被称为“基本相同”。该定义也指测试序列的补偿。任选地，同一性在长度至少约10至约100、约20至约75、约30至约50个氨基酸或核苷酸的区域上存在。
对于序列比较，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用缺省的程序参数，或指定可选择的参数。然后，基于程序参数，用序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
本文使用的“比较窗”包括参考数目约10至约500、约25至约200、50至约150的毗邻位置的任何一段，其中一序列与参考序列最佳对齐后，可以将所述序列与相同数目毗邻位置的参考数列进行比较。用于比较的序列对齐方法是本领域众所周知的。可以通过以下方法实施用于比较的最佳对齐，例如，通过Smith & Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源算法、通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源对齐算法、通过Pearson & Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的检索相似性方法、通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过手工对齐和视觉检测(参见，例如，Current Protocols in MolecularBiology(分子生物学的通用实验设计)(Ausubel et al.，eds.1995supplement))。
实用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式双比对从一组相关序列中创造一个多序列比对，以显示关系和序列同一性百分比。PILEUP还标绘了子目录结构或显示用于创建比对的聚类关系的树状图。PILEUP使用Feng & Doolittle，J.MoI.Evol.35：351-360(1987)中简化的渐进式比对方法。采用的方法与Higgins & Sharp，CABIOS5：151-153(1989)中描述的方法相似。该程序能够比对高达300个序列，各个序列的最大长度为5,000核苷酸或氨基酸。多重比对过程以两个最相似序列的双比对开始，产生双比对序列的簇。然后，该簇与下一个最相关的序列或比对序列簇进行比对。两簇序列通过两个独立序列的双比对的简单扩展来比对。最终比对由一系列渐进式双比对来实现。通过指定序列比较区域的特异性序列及其氨基酸或核苷酸坐标，以及指定程序参数来运行程序。使用PILEUP，将参考序列与其它测试序列进行比较以确定序列同一性关系的百分比，使用的参数如下：缺省间隔权重(gapweight)(3.00)，缺省间隔长度权重(gap length weight)(0.10)以及加权的端隙(weighted end gaps)。PILEUP能够从诸如7.0版本(Devereaux et al.，Nuc.Acids Res.12：387-395(1984))的GCG序列分析软件包获得。
适合测定序列同一性百分比和序列相似性的另一实例是分别在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul et al.，J.MoI.Biol.215：403-410(1990)中描述的BLAST和BLAST2.0算法。通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，实施BLAST分析的软件是公开可用的。该算法涉及通过确定查询序列的短字长W首先确定高分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或者满足一些阳性评价的阈值评分T。T是指作为邻域字评分阈值(Altschul et al.，supra)。这些初始邻域字采集数作为初始检索的种子以找到包含它们的更长的HSPs。沿着每个序列的两个方向扩展字采集数，直到累积比对评分能够被增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；通常大于0)和N(不匹配残基的惩罚评分；通常小于0)计算累计评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。在每一方向上字采集数的扩展被停止，当：由于质量X累计比对评分从其最大取得值下降；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变成零或以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用词长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为缺省。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3，期望值(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：10915(1989))比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为缺省。
BLAST算法还进行两个序列相似性的统计分析(参见，例如，Karlin & Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小汇总概率(P(N))，其提供了概率的指征，通过所述概率，两种核酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生。例如，如果测试核酸序列与参考核酸序列相比，最小汇总概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，那么该核酸被认为与参考序列相似。
III.本发明的组合物
本发明提供了包含嵌合腺病毒载体的组合物。在一些实施方案中，本发明的嵌合腺病毒载体包含可操作地连接于编码异源多肽的核酸的第一启动子和可操作地连接于编码TLR3激动剂的核酸的第二启动子。第一或第二启动子可以是相同的或不同的。在一些实施方案，第一和第二启动子独立地选自：β肌动蛋白启动子和CMV启动子。
在一些实施方案中，嵌合腺病毒载体包含腺病毒基因组(减去E1和E3基因)和编码激活IRF-3和TLR-3下游的其它信号分子的基因的核酸。嵌合载体能够被给予到表达Ad′s E1基因的细胞，使得细胞产生重组腺病毒(rAd)。该rAd能够被采集，并能够是在哺乳动物中将转基因组合物递送到另一细胞以激发对异源多肽的免疫反应的单轮感染。
A.适合的腺病毒载体
在一些实施方案中，腺病毒载体是腺病毒5，包括，例如，E1/E3区域缺失的Ad5和E4区域缺失的Ad5。其它适合的腺病毒载体包括菌株2，经口测试菌株4和7，肠腺病毒40和41，以及足以递送抗原并激发针对转基因抗原的获得性免疫反应的其它菌株(例如Ad34)[Lubeck et al.，Proc Natl Acad Sci USA，86(17)，6763-6767(1989)；Shenetal.，J Virol，75(9)，4297-4307(2001)；Bailey et al.，Virology，202(2)，695-706(1994)]。在一些实施方案中，腺病毒载体是活的复制缺陷型腺病毒载体(例如删除E1和E3的rAd5)，活的并减弱的腺病毒载体(例如E1B55K缺失病毒)，或者具有野生型复制的活腺病毒载体。
用于在体内转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译调控序列可以由病毒来源提供。例如，通常使用的启动子和增强子来源于，例如，β肌动蛋白、腺病毒、猿猴病毒(simian virus)(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)。例如，在以下启动子的指导下，允许蛋白表达的载体是适合的：CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、转导子(transducer)启动子或在哺乳动物细胞中对表达显示有效的其它启动子。还可以使用病毒基因组启动子、调控和/或信号序列，前提是这些调控序列与选择的宿主细胞相容。
B.异源多肽
编码合适的异源多肽的核酸可以来源于抗原，例如，诸如，病毒抗原、细菌抗原、癌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。
病毒抗原可以来源于，例如，在Shiver et al.Nature 415(6869)：331(2002)中提出的人免疫缺陷病毒(例如，gag(p55和p160)、pol、env(gp120和gp41)；在基因库登录号EF363127；EF363126；EF363125；EF363124；EF363123；EF363122；EF192592和EF192591中提出的HIV基因组序列；在基因库登录号EF396891；EF396890；EF396889；EF396888；EF396887；EF396886；EF396885；EF396884；EF396883；EF396882；EF396881；EF396880；EF396879；EF396878；EF396877；EF396876；EF39687；EF396874；EF396873和EF396872中提出的HIVgag序列；在基因库登录号EF396810；EF396809；EF396808；EF396807；EF396806；EF396805；EF396804；EF396803；EF396802；EF396801；EF396800；EF396799；EF396798；EF396797；EF396796；EF396795；EF396794；EF396793；EF396792和EF396791中提出的HIV pol序列；在基因库登录号9：EF367234；EF367233；EF367232；EF367231；EF367230；EF367229；EF367228；EF367227；EF367226；EF367225；EF367224和EF367223中提出的HIV env序列；人乳头瘤病毒(例如，诸如Donnelly等人在J Infect Dis.173：314(1996)中描述的衣壳蛋白L1和在基因库登录号EF362755；EF362754；NC_001694；NC_001693；NC_001691；NC_001690；NC_005134；NC_001458；NC_001457；NC_001354；NC_001352；NC_001526和X94164)中提出的序列)，爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)，单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus)，人疱疹病毒(human herpes virus)，鼻病毒(rhinoviruses)，柯萨奇病毒(cocksackieviruses)，肠道病毒(enteroviruses)，甲、乙、丙和戊型肝炎(例如，诸如Lubeck等人在PNAS USA 86：6763(1989)中描述的乙型肝炎表面抗原，以及基因库登录号AB236481；AB236471；AB206501；AB206489；AB206487；AB221788；AB221777；AB221773；AR933671；AR933670；AB236514；AB236513；AB236512；AB236511；AB236510；AB236509；AB236508；AB236507中提出的序列)；丙型肝炎NS 5(参见，例如，基因库登录号X59609；DQ911563；S71627；S70787；S70786；S70341；S62220；S70790；S70789；S70788和AB204642))，腮腺炎病毒(mumps virus)，风疹病毒(rubella virus)，麻疹病毒(measles virus)，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)，天花病毒(smallpoxvirus)，狂犬病病毒(rabies virus)和水痘一带状疱疹病毒(Variella-zostervirus)。流感抗原包括，例如，血凝素(HA)、基质蛋白1(M1)和核蛋白(NP)(参见，例如，Donnelly，et al.，Vaccine 15：865(1997)和基因库登录号AB294219；AB294217；AB294215；AB294213；EF102944；EF102943；EF102942；EF102941；EF102940；EF102939；EF102938；EF102937；EF102936；EF102935；EF102934；EF102933；DQ643982；DQ464354；CY019432；CY019424；CY019416；CY019408；CY019400；CY019392；CY019384；CY019376；CY019368；CY019360；CY019352；EF124794；EF110519；EF110518；EF165066；EF165065；EF165064和EF165063中提出的流感HA序列；基因库登录号AB292791；CY019980；CY019972；CY019964；CY019956；CY019948；CY019940；CY019628；CY019652；CY019644；CY019932；CY019924；CY019916；CY019908；CY019900；CY019892；CY019884；CY019876；CY019868；CY019860中提出的流感M1序列；基因库登录号AB292790；CY019461；CY019974；CY019966；CY019958；CY019950；CY019942；CY019630；CY019654；CY019646；CY019934；CY019926；CY019918CY019910；CY019902；CY019894；CY019886；CY019878；CY019870和CY019862中提出的流感NP序列。
适合的病毒抗原还包括，例如，病毒非结构蛋白。本文使用的术语“病毒非结构蛋白”是指由不编码诸如那些产生衣壳或包绕病毒的蛋白的结构多肽的病毒核酸编码的蛋白。非结构蛋白包括促进病毒核酸复制和病毒基因表达的那些蛋白，例如，诸如，来自于委内瑞拉马脑炎(Venezuelan Equine encephalitis)(VEE)、EEE或塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)的非结构蛋白1、2、3和4(分别是NS1、NS2、NS3和NS4)[Dubensky et al.，J Virol，70(1)，508-519(1996)；Petrakovaet al.，J Virol 2005 79(12)：7597-608；美国专利Nos.5,185,440，5,739,026，6,566,093和5,814,482]。一些合适的甲病毒(alphaviruses)的典型实例包括Aura(ATCC VR-368)，贝巴鲁病毒(Bebaru virus)(ATCC VR-600，ATCC VR-1240)，犰狳(Cabassou)(基因库登录号AF398387，ATCC VR-922)，切昆贡亚病毒(Chikungunya virus)(ATCCVR-64，ATCC VR-1241)，东方马脑脊髓炎病毒(Eastern equineencephalomyelitis virus)(基因库登录号AY705241，AY705240，ATCCVR-65，ATCC VR-1242)，福特摩尔氏根(Fort Morgan)(ATCC VR-924)，盖塔病毒(Getah virus)(ATCC VR-369，ATCC VR-1243)，克泽拉格齐(Kyzylagach)(ATCC VR-927)，马亚罗(Mayaro)(ATCC VR-66)，马亚罗病毒(Mayaro virus)(ATCC VR-1277)，米德尔伯格(Middleburg)(ATCC VR-370)，穆坎布病毒(Mcambo virus)(ATCC VR-580，ATCCVR-1244)，恩杜穆(Ndumu)(ATCC VR-371)，皮春纳病毒(Pixuna virus)(ATCC VR-372，ATCC VR-1245)，罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCCVR-373，ATCC VR-1246)，塞姆利基森林(Semliki Forest)(基因库登录号AJ251359，ATCC VR-67，ATCC VR-1247)，辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)(基因库登录号J02363，ATCC VR-68，ATCC VR-1248)，托纳特(Tonate)(ATCC VR-925)，特里尼蒂(Triniti)(ATCC VR-469)，乌纳(Una)(ATCC VR-374)，委内瑞拉马脑脊髓炎(Venezuelan equineencephalomyelitis)(ATCC VR-69)，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(Venezuelan equine encephalomyelitis virus)(基因库登录号AY986475，AY973944，NC 001449，ATCC VR-923，ATCC VR-1250 ATCCVR-1249，ATCC VR-532)，西方马脑脊髓炎(Western equineencephalomyelitis)(ATCC VR-70，ATCC VR-1251，ATCC VR-622，ATCC VR-1252)，沃达罗河(Whataroa)(ATCC VR-926)和Y-62-33(ATCC VR-375)。
细菌抗原可以来自于，例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、莱姆病螺旋体(Borreliaburgdorferi)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、肉毒棱菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、霍乱弧菌(Vibrio chloerae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、鼠疫菌(Yersinia pestis)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、支原体属(Mycoplasmsp.)、奈瑟球菌ransducer s(Neisseria ransducer s)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)(例如，基因库登录号U25679；A09803；EF158842；X76391；AF390572中提出的霍乱毒素亚单位B；Wu等人在Infectionand Immunity Vol.69(12)：7695(2001)中描述的和基因库登录号NC_002505和AE004169)中提出的霍乱毒素共调菌毛(TCP)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylorii)(基因库登录号AY848858；AF042737；AF042736；AF042735；AF042734；NC_000921中提出的VacA；基因库登录号AF043490；AF043489；AF043488；AF043487中提出的CagA；基因库登录号AF284121；AF284120；AF284119；AF284118；AF284117；AF284116；AB045143；AB045142；AF227081；AF227080；AF227079；AF227078；AF227077；AF227076；AF227075；AF227074中提出的NAP；基因库登录号NC_000921中提出的Hsp或过氧化氢酶；如基因库登录号AM417610；AM417609；AM417608；AM417607；AM417606；AM417605；AM417604；AM417603；AM417602；AM417601和AM417600中提出的尿素酶；基因库登录号NC_000913；U00096；NC_002655；BA000007；AE014075中提出的大肠杆菌抗原；包括基因库登录号AB214865；AB214864；AB214863；AB214862中提出的大肠杆菌菌毛抗原；基因库登录号X83966；V00275；X83966；J01646；V00275；M35581；M17873；M17874；K01995；M61015；M17894；M17101；K00433中提出的大肠杆菌不耐热肠毒素。
寄生虫抗原可以来自于，例如，贾第虫属(Giardia lamhlia)、利氏曼原虫属(Leishmania sp.)、锥虫属(Trypanosoma sp.)、毛滴虫属(Trichomonas sp.)、疟原虫属(Plasmodium sp.)(例如，恶性疟原虫(P.faciparum)表面蛋白抗原，例如，基因库登录号XM_001347551；X07802；AF193769；AF179423；AF154117和AF030628中提出的pfs25序列，基因库登录号L25843中提出的pfs28序列，如基因库登录号EF158081；EF158079；EF158078；EF158076；EF158075和EF158085中提出的pfs45序列，基因库登录号AF356146；AF356145；AF356144；AF356143；AF356142；AF356141；AF356140；AF356139；AF356138；AF356137；AF356136；AF356135；AF356134；AF356133；AF356132；AF356131；AF356130；AF356129；AF356128；AF356127中提出的pfs84、pfs48/45序列，基因库登录号NC_000910；XM_001349564；AE001393；L22219；L08135和AF269242中提出的pfs230序列，间日抗原(P.vivax antigens)例如，基因库登录号DQ641509；DQ641508；DQ641507；AY639972；AY639971；AY639970；AY639969；AY639968；AY639967；AY639966和AY639965中提出的Pvs25序列；以及基因库登录号AB033364；AB033363；AB033362；AB033361；AB033360；AB033359；AB033358；AB033357；AB033356；B033355；AB033354；AB033353；AB033352；AB033351；AB033350；AB033349；AB033348；AB033347；AB033346和AB033345中提出的Pvs28序列)，血吸虫属(Schistosoma sp.)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(例如，基因库登录号AX253506；AX253504；AX253502和AX211309中提出的Ag85序列；MPT64，ESAT-6，CFP10，R8307，MTB-32 MTB-39，CSP，LSA-1，LSA-3，EXP1，SSP-2，SALSA，STARP，GLURP，MSP-1，MSP-2，MSP-3，MSP-4，MSP-5，MSP-8，MSP-9，AMA-1，1型整合膜蛋白，RESA，EBA-175，以及基因库登录号BX842572；BX842573；BX842574；BX842575；BX842576；BX842577；BX842578；BX842579；BX842580；BX842581；BX842582；BX842583；BX842584和NC_000962中提出的DBA序列，基因库登录号AY299175；AY299174；AY299144；AF547886和AF547885中提出的HSP65序列)。
癌抗原包括，例如，在诸如结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、白血病、淋巴瘤或骨髓瘤中表达的抗原，示例性癌抗原包括，例如，HPV L1、HPV L2、HPV E1、HPV E2、胎盘碱性磷酸酶、AFP、BRCA1、Her2/neu、CA 15-3、CA 19-9、CA-125、CEA、Hcg、尿激酶型纤溶酶原激活物(Upa)、纤溶酶原激活物抑制剂。
真菌抗原可以来自于，例如，足癣(Tinea pedis)、体癣(Tineacorporus)、股癣(Tinea cruris)、甲癣(Tinea unguium)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carionii)、球孢子菌(Coccidioides immitis)、念珠菌(Candida sp.)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)。
编码免疫原性多肽的核酸通常由重组DNA方法产生(参见，例如，Ausubel，et al.ed.(2001)Current Protocols in Molecular Biology)。例如，编码免疫原性多肽的DNA序列能够由cDNA片段和短寡核苷酸连接子或由一系列的寡核苷酸装配，或者使用适当的引物从cDNA扩增，以提供能够插入重组表达载体中(即，质粒载体或病毒载体)和在重组转录单位中被表达的合成基因。一旦产生编码免疫原性多肽的核酸，其可以被插入到适合体内或离体表达的重组表达载体。
重组表达载体包含编码免疫原性多肽的DNA序列，所述免疫原性多肽可操作地连接到来源于哺乳动物或病毒基因的适合的转录或翻译调控元件。这种调控元件包括转录启动子、调控转录的任选的操纵基因序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列以及调控转录和翻译终止的序列。此外，促进转化体的识别的复制起始区和选择标记可以被合并。用于重组表达载体的基因可以在多种病毒中被分开，使得基因产物在两种不同的载体上，并且所述载体用于共转导以提供全部反向基因产物。诸如插入的尺寸限制或结合的基因产物对病毒产生细胞系的毒性可能是分割基因产物的原因。
C.TLR激动剂
根据本发明的方法，TLR激动剂用于增强针对异源多肽的免疫反应。在一些实施方案中，使用TLR-3激动剂。在其它实施方案中，使用TLR 7/8激动剂。本文描述的TLR激动剂能够与编码目的抗原的表达载体同时递送，或与编码目的抗原的表达载体分开(即，时间上或空间上)递送。例如，表达载体可以通过非胃肠外途径给药(例如，经口、经鼻或粘膜)，而TLR激动剂通过胃肠外途径递送(例如，肌内、腹膜内或皮下)。
1.TLR-3激动剂
在本发明的优选实施方案中，TLR-3激动剂用于刺激目的抗原的免疫识别。TLR-3激动剂包括，例如，短发夹RNA、病毒来源的RNA、能够形成双链或短发夹RNA的RNA的短片段、以及短干扰RNA(siRNA)。在本发明的一个实施方案中，所述TLR-3是病毒来源的dsRNA，例如诸如，来源于辛德毕斯病毒(Sindbis virus)的dsRNA或dsRNA病毒中间体[Alexopoulou et al，Nature 413：732-8(2001)]。在一些实施方案中，TLR-3激动剂是短发夹RNA。短发夹RNA通常包含由连接子序列连接的两个互补序列。特定的连接子序列不是本发明的关键方面。任何合适的连接子序列都能够使用，只要其不干扰两个互补序列形成dsRNA的结合。
在一些实施方案中，短发夹RNA包括SEQ ID NOS：3、4、5、8、9、10、11或12中提出的序列，与SEQ ID NOS：3、4、5、8、9、10、11或12中提出的序列基本上相同的序列，或SEQ ID NOS：3、4、5、8、9、10、11或12中提出的序列的变异体。在某些实施方案中，作为TLR-3激动剂的dsRNA不编码特定的多肽，但是当体外或体内接触应答细胞(例如，树突细胞、外周血单核细胞或巨噬细胞)时，产生促炎细胞因子(例如，IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α、IFN-β)。在某些情况下，编码TLR-3激动剂(例如，表达的dsRNA)的核酸和包含编码异种抗原的核酸的嵌合腺病毒载体以相同制剂给药。在其它情况下，编码TLR-3激动剂的核酸和包含编码异源多肽的核酸的嵌合腺病毒载体以不同制剂给药。当编码TLR-3激动剂的核酸和包含编码异种抗原的核酸的腺病毒载体以不同制剂给药时，它们可以同时或连续给药。例如，可以首先给予编码TLR-3激动剂的核酸，其次是嵌合腺病毒载体(例如，1、2、4、8、12、16、20或24小时，2、4、6、8或10天以后)。可选择地，可以首先给予所述腺病毒载体，其次是编码TLR-3激动剂的核酸(例如，1、2、4、8、12、16、20或24小时，2、4、6、8或10天以后)。在一些实施方案中，编码TLR-3激动剂的核酸和编码异种抗原的核酸受相同启动子的调控。在其它实施方案中，编码TLR-3激动剂的核酸和编码异种抗原的核酸受不同启动子的调控。
双链RNA的一些化学合成类似物是可以商购。这些双链RNA的化学合成类似物包括聚肌苷-聚胞苷酸(聚肌胞苷酸)、聚腺苷酸：聚尿苷酸(聚腺尿苷酸)和聚肌苷酸：聚胞苷酸。针对TLR-3的抗体也能够导致IFN-β或促炎细胞因子的产生[Matsumoto et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.24：1364(2002)，de Bouteiller et al，J Biol.Chem.18：38133-45(2005)]。可商购的任何序列的siRNA片段也可以通过诸如Invitrogen的来源获得。
2.TLR 7/8激动剂
在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR 7/8激动剂。TLR 7/8配体通常是单链、病毒来源的RNA。由于受体在诸如内涵体的细胞内区室中表达，不是所有的RNA短片段都会触发TLR 7/8信号级联，因为其需要到达正确的区室。一些已经显示了通过外源添加以触发TLR 7/8信号级联的配体是多聚尿苷酸、雷西莫特和咪喹莫特[Westwood，et al，Vaccine 24：1736-1745(2006)]。
IV.药物组合物
包含本文描述的载体的药物组合物还可以包含其它化合物，所述其它化合物可以是有生物学活性的或无活性的。多肽可以，但是不是必须与例如在美国专利Nos.4,372,945和4,474,757中描述的其它大分子偶联。药物组合物通常可以用于预防和治疗目的。药物组合物可以包括保护不受胃降解，使得给予的嵌合腺病毒载体可以达到预期的部位的方法。对于口腔环境，其中的一些可用的包括丙烯酸树脂和时钟(Time Clock)释放系统，以及特异性针对腺病毒设计的其它方法[Lubecketal.，Proc Natl Acad Sd USA，86(17)，6763-6767(1989)；Chourasia andJain，J Pharm Pharm Sci，6(1)，33-66(2003)]。，用于口腔递送DNA和药物的微胶囊的一些方法也已经被描述(参见，例如，美国专利公开号2004043952)。在一些实施方案中，丙烯酸树脂系统将被用于递送嵌合腺病毒载体到小肠下端。然而，递送到小肠的其它部位的也应该起作用。
如上所述，本发明的嵌合腺病毒载体可以使用任何本领域的普通技术人员已知的递送系统递送。众多基因递送技术是本领域公知的，例如，由Rolland(1998)Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems15：143-198和其中引用的参考文献描述的那些技术。
显而易见的是，免疫原性组合物可以包含编码异源多肽(例如，免疫原性多肽)的多核苷酸的药物可接受的盐。这种盐可以由药物可接受的无毒的碱来制备，包括有机碱(例如，伯、仲和叔胺的盐以及碱性氨基酸)和无机碱(例如，钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)。盐的一些特殊实例包括磷酸盐缓冲盐水和注射用盐水。
在本发明的药物组合物中可以使用本领域的普通技术人员公知的任何适合的载体。适合的载体包括，例如，水，盐水，乙醇，脂肪，蜡，缓冲液，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁的固体载体，或生物可降解的微球体(例如，聚乳酸盐聚羟乙酸盐)。适合的生物可降解的微球体在例如美国专利Nos.4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883中被公开。免疫原性多肽和/或载体病毒可以被包裹在生物可降解的微球体中或与微球体的表面结合。
这种组合物还可以包括缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)，甘露醇、蛋白、多肽或诸如甘氨酸的氨基酸、抗氧化剂、抑菌剂、诸如EDTA或谷胱甘肽的螯合剂、佐剂(例如，氢氧化铝)、致使受体血液形成等渗、低渗或弱高渗的溶液、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可选择地，本发明的组合物可以被形成为冷冻干产物。还可以使用公知的技术将化合物包裹在脂质体中。
在本发明的一些实施方案中，所述组合物还包含佐剂。适合的佐剂包括，例如，脂质和无脂化合物、霍乱毒素(CT)、CT B亚基、CT衍生的CTK63、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、LT衍生的LTK63、Al(OH)3和在诸如WO 04/020592，Anderson和Crowle，Infect.Immun.31(1)：413-418(1981)，Roterman et al.，J.Physiol.Pharmacol，44(3)：213-32(1993)，Arora and Crowle，J.Reticuloendothel.24(3)：271-86(1978)，和Crowle and May，Infect.Immun.38(3)：932-7(1982))中描述的多离子有机酸。适合的多离子有机酸包括，例如6，6′-[3，3′-二甲基[1，1′-二苯基]-4，4′-二基]双(偶氮基)双[4-氨基-5-羟基-1，3-萘-二磺酸](伊文思蓝)和3，3′-[1，1′二苯基]-4，4′-二基双(偶氮基)双[4-氨基-1-萘磺酸](刚果红)。本领域的技术人员可以理解的是，多离子有机酸与任何类型的给药结合起来可以用于任何基因免疫方法。
其它适合的佐剂包括局部免疫调节剂，例如，诸如咪唑并喹啉的家族成员，例如，咪喹莫特和雷西莫特(参见，例如，Hengge et al.，LancetInfect.Dis.1(3)：189-98(2001)。本发明还能够使用表达的TLR-3激动剂(例如，dsRNA)和TLR-7激动剂(例如，ssRNA)。
另外的适合的佐剂可以商购，例如，另外的基于铝的佐剂(例如，铝胶、再水合胶、磷酸铝、Algammulin)；基于油的佐剂(弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)，Specol，RIBI，TiterMax，Montanide ISA50或Seppic MONTANIDE ISA 720)；基于非离子嵌段共聚物的佐剂，细胞因子(例如，GM-CSF或Flat3配体)；Merck佐剂65(Merck和Company，Inc.，Rahway，N.J.)；AS-2(SmithKlineBeecham，Philadelphia，Pa.)；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球体；单磷酰脂A和Quil A。诸如GM-CSF或白细胞介素-2、白细胞介素-7或白细胞介素-12的细胞因子也是适合的佐剂。血蓝蛋白(例如，匙孔血蓝蛋白)和蠕虫血红蛋白也可以用于本发明。多糖佐剂例如，诸如，壳多糖、壳聚糖和脱乙酰壳多糖也适合作为佐剂。其它适合的佐剂包括胞壁酰二肽(MDP，N乙酰胞壁酰L丙氨酰D异谷氨酰胺)细菌肽聚糖及其衍生物(例如，苏氨酰-MDP和MTPPE)。BCG和BCG细胞壁骨架(CWS)在本发明中也可以用作佐剂，包括或不包括海藻糖二霉菌酸酯。海藻糖二霉菌酸酯可以单独被使用(参见，例如，美国专利No.4,579,945)。去毒内毒素单独作为佐剂或与其它佐剂结合使用(参见，例如，美国专利Nos.4,866,034；4,435,386；4,505,899；4,436,727；4,436,728；4,505,900和4,520,019。皂苷QS21、QS17、QS7也可以用作佐剂(参见，例如，美国专利No.5,057,540；EP 0362 279；WO96/33739和WO 96/11711)。其它适合的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，France)、SAF(Chiron，Calif.，United States)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如，SBAS-2、SBAS-4或SBAS-6或其变异体，购于SmithKline Beecham，Rixensart，Belgium)、Detox(Corixa，Hamilton，Mont.)和RC-529(Corixa，Hamilton，Mont.)。
超抗原也被考虑在本发明中作为佐剂使用。超抗原包括葡萄球菌胞外蛋白，例如，来自于金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的α、β、γ和Δ肠毒素、以及α、β、γ和Δ大肠杆菌外毒素。常见的葡萄球菌肠毒素被称为葡萄球菌肠毒素A(SEA)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)，通过描述的E(SEE)的肠毒素(Rott et al.，1992)。化脓性链球菌B(SEB)、产气荚膜梭菌肠毒素(Bowness et al.，1992)、来自于化脓性链球菌(S.pyogenes)的细胞质膜相关蛋白(CAP)(Sato et al.，1994)和来自于金黄色葡萄球菌的中毒休克综合征毒素1(TSST1)(Schwab et al.，1993)也是有用的超抗原。
在本文提供的药物组合物中，所述佐剂组合物能够被设计为诱导例如，主要是Th1或Th2型免疫反应。高水平的Th1型细胞因子(例如，IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12)趋向促进诱导针对给予的抗原的细胞介导的免疫反应。相反地，高水平的Th2型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)趋向促进诱导体液免疫反应。在口腔递送本文提供的包含免疫原性多肽的组合物后，通常会激发包括Th1-和Th2-型应答的免疫反应。
本文描述的组合物可以作为持续释放制剂(即，在给药后起缓慢释放化合物作用的诸如胶囊或海绵剂型)的部分来给药。这种制剂通常可以使用公知的技术制备(参见，例如，Coombes et al.(1996)Vaccine14：1429-1438)。持续释放制剂可以包含多肽、多核苷酸或分散在载体基质中和/或包含在用速率控制膜包围的囊(reservoir)中的抗体。
在这种制剂中使用的载体是生物相容的，也可以是生物可降解的；优选地，所述剂型提供活性成分释放的较恒定水平。这种载体包括聚(丙交酯乙交酯共聚物)微粒，以及聚丙烯酸脂、胶乳、淀粉、纤维素和葡聚糖。其它延时释放载体包括超分子生物载体，其包括非流动性亲水核心(例如，交联多糖或寡糖)以及，任选地，包含两性化合物的外部涂层(参见，例如，WO 94/20078；WO 94/23701和WO 96/06638)。包含在持续释放剂型中的活性化合物的量取决于植入部位，释放速率和预期持续时间，以及被治疗或预防状态的性质。
所述药物组合物可以存在于单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或管形瓶。这种容器优选全密封的容器以保持剂型的无菌性直至使用。通常，制剂可以以悬液、溶液或乳液贮存在油性或水性载体中。可选择地，药物组合物可以在冷冻干燥的条件下贮存，使用前只需要立即加入无菌流体载体。
V.本发明的治疗用途
本发明的一个方面涉及使用本文描述的免疫原性组合物激发个体或患有例如，诸如病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、霉菌感染或癌症的患者的抗原特异性免疫反应。本文使用的“个体”或“患者”是指任何温血动物，例如，诸如啮齿类动物、猫科动物、犬科动物、优选人的灵长类动物。免疫原性组合物可以在疾病的任何阶段，即癌前期、癌或转移阶段，用于治疗或用于预防疾病。例如，本文描述的组合物可以用于治疗诸如HIV或肝炎的病毒性疾病，或用于预防或治疗癌症。在这种方法中，通常给予患者药物组合物。所述患者可以或不可以罹患疾病或病症(例如，病毒感染、细菌感染或癌)。因此，上述药物组合物可以用于预防疾病或病症的发展(例如，病毒感染、细菌感染或癌)或用于治疗罹患疾病或病症的患者(例如，病毒感染、细菌感染或癌)。所述疾病或病症可以使用本领域通常可接受的标准进行诊断。例如，病毒感染可以通过测量来自于患者的样品中的病毒效价来诊断，细菌感染可以通过测定来自于患者的样品中的细菌来诊断，肿瘤可以通过测定恶性肿瘤的存在来诊断。药物组合物可以在手术切除原发肿瘤和/或诸如放射治疗或常规化学治疗药物治疗之前或之后给予。
免疫治疗通常是主动免疫治疗，其中治疗依赖于内源性宿主免疫系统针对诸如肿瘤或感染细菌或病毒的细胞的体内激活，并给予免疫反应调节剂(本文提供的包含编码免疫原性多肽的核酸的组合物)。
本文描述的预防或治疗性组合物的给药频率和剂量，将因个体不同而不同，并且使用标准技术可以轻易地确立。通常在52周期间可以给予1至10次剂量。通常1个月的间隔给予3次剂量，更通常，每2-3个月给予2-3次剂量。对于某些治疗，间隔可能大约为一年一次。此后定期进行加强免疫。可选择的方案可以适合个体患者和特殊的疾病和病症。适合的剂量是当如上所述给药时，能够促进诸如抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、免疫反应的化合物的量，并至少高于基础(即，未处理的)水平的10-50％。这种应答可以通过测量患者的抗肿瘤抗体或通过疫苗依赖的溶细胞性T细胞的产生来监测，所述溶细胞性T细胞能够在体外杀死诸如患者的肿瘤细胞、患者的受病毒感染的细胞或患者的受细菌感染的细胞。将已接种的患者与未接种的患者比较，这种疫苗应该还能够激发导致改善的临床结果(例如，更频繁地缓解、完全或部分或更长时间的无病存活)的免疫反应。通常，病毒效价的量会为1.0 x 104pfu/动物至1.0 x 1015pfu/动物。适合的剂量大小将随患者的体重而变化，但是通常会在约0.01ml至约10ml变动，更通常，是约0.025至约7.5ml，最通常是约0.05至约5ml。本领域的技术人员可以理解的是，根据特定的患者或被治疗的特定疾病或病症可以调整剂量大小。对于口腔给药，嵌合腺病毒载体能够被方便地制成药丸。
一般来说，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处的量提供活性化合物。这种应答可以通过确立已接种的患者与未接种的患者相比较的改善的临床结果(例如，更频繁地缓解、完全或部分或更长时间的无病存活)来监测。这种免疫反应通常可以使用前面描述的标准增殖、细胞毒性或细胞因子分析来评价，其可以使用从治疗前和治疗后的患者中获得的样品来实施。
例如，在免疫原性多肽和体液中特异针对免疫原性多肽的抗体之间形成的免疫复合物的测定可以用于监测治疗的有效性，所述治疗涉及特定的免疫原性多肽，用于与所述免疫原性多肽相关的疾病或病症。在治疗开始之前和之后，可以通过前面描述的方法学分析从个体中取出的体液样品的免疫复合物。简单地说，将两样品中检测到的免疫复合物的数目进行比较。第二个样品(治疗开始后)相对于第一个样品(治疗前)中的免疫复合物数目的显著变化反映了成功的治疗。
A.本发明的组合物的给药
根据本发明的方法，包含嵌合腺病毒载体的组合物通过非胃肠外途径(例如，经口、经鼻或经粘膜，例如阴道、肺、唾液腺、鼻腔、小肠、结肠、直肠、扁桃体或淋巴集结)给药。所述组合物可以单独或与前面描述的佐剂一起给药。在一些实施方案中，所述佐剂由核酸序列(例如，编码IL-2、GM-CSF、IL-12或细菌鞭毛蛋白的核酸)编码。在本发明的一些实施方案中，所述佐剂与所述组合物同时给药。在本发明的其它实施方案中，所述佐剂在所述组合物之后给药，例如，在给予组合物后6、12、18、24、36、48、60或72小时。
B.针对目的抗原的免疫反应的测定
针对异源多肽的免疫反应能够使用本领域已知的任何手段来测定，包括，例如，测定CD4+或CD8+T细胞的特异性激活或通过测定特异性结合到多肽的抗体的存在。
与粘膜、体液或细胞介导的免疫反应相关的CD4+或CD8+T细胞的特异性激活可以由多种方式测定。测定特异性T细胞激活的方法包括，但是不限于测定T细胞的增殖、细胞因子(例如，淋巴因子)的产生或溶细胞活性的产生(即，针对免疫原性多肽特异性的细胞毒性T细胞的产生)。对于CD4+T细胞，用于测定特异性T细胞激活的优选方法是测定T细胞的增殖。对于CD8+T细胞，用于测定特异性T细胞激活的优选方法是使用51Cr释放法测定溶细胞活性的发生(参见，例如，Brossart and Bevan，Blood 90(4)：1594-1599(1997)and Lenz et al.，J.Exp.Med.192(8)：1135-1142(2000))。
T细胞增殖的检测可以通过多种已知的技术实现。例如，T细胞增殖能够通过测定DNA合成速率来检测。已经被刺激增殖的T细胞显示DNA合成速率的增加。测定DNA合成速率的典型方式是，例如，通过用氚标记胸腺嘧啶核苷，被掺入到新合成的DNA中的核苷酸前体脉冲标记T细胞的培养物。被掺入的氚标记胸腺嘧啶核苷的量能够使用液体闪烁分光光度计测定。检测T细胞增殖的其它方式包括测定白细胞介素2(IL-2)的产生、Ca2+通量或诸如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑的染料的摄取。可选择地，可以测定淋巴因子(例如，干扰素γ)的合成，或可以定量针对对免疫原性多肽应答的T细胞的相对数目。
包括粘膜抗体应答的抗体免疫反应(aka体液免疫反应或B细胞应答)能够使用本领域已知的免疫分析来测定[Tucker et al.，Mol Therapy，8,392-399(2003)；Tucker et al，Vaccine，22，2500-2504(2004)]。适合的免疫分析包括David等人的双单克隆抗体夹心免疫测定技术(美国专利No.4,376,110)；单克隆-多克隆抗体夹心分析法(Wide et al.，in Kirkhamand Hunter，eds.，Radioimmunoassay Methods，E.and S.Livingstone，Edinburgh(1970))；Gordon等人的“蛋白印迹”法(美国专利No.4,452,901)；标记配体的免疫沉淀(Brown et al.(1980)J.Biol.Chem.255：4980-4983)；例如由Raines et al.(1982)J.Biol.Chem.257：5154-5160描述的酶联免疫吸附测定(ELISA)；包括使用荧光染料的免疫细胞化学技术(Brooks et al.(1980)Clin.Exp.Immunol.39：477)；以及活性的中和(Bowen-Pope et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：2396-2400)。除了前面描述的免疫分析以外，也可以利用许多其它的免疫分析，包括在美国专利Nos.3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074和4,098,876中描述的那些。
实施例
下面的实施例用于示例本发明，但并不是限制本发明。
实施例1：嵌合腺病毒载体的构建(DSI)
为了证实TLR-3激动剂能够改善针对表达的目的抗原的获得性免疫反应，构建了包含编码多种不同目的抗原的核酸序列的多种不同嵌合腺病毒载体。在本实施例中，将编码gp120(NIH AIDS Reagent andReference Reagent Program)的核酸置于CMV启动子的调控下，所述启动子携带就在穿梭载体(pShuttle，Qbiogene)中的起始密码子上游的小内含子。来自于bGH的聚腺苷酸尾位于编码gp120的核酸的下游。载体序列在SEQ ID NO：1中被描述。实施与载体pAd(Qbiogene)的同源重组以制备能够产生包含编码gp120的核酸的重组腺病毒(删除了E1/E3)的载体。通过将新pAd-CMV-gp120表达载体转染入293细胞产生DSI。效价通过标准方法测定。
实施例2：DSI(载体加上TLR-3激动剂)诱导抗原特异性的免疫反应优 于标准的rAd5。
为了测定添加TLR-3激动剂是否能够改善获得性免疫反应，通过口腔服管饲法在第0周和第3周给予动物10 x IO7 10 x I07PFU的rAd-CMV-gp120加上5μg/ml聚肌胞苷酸(DS1)，或单独的rAd-CMV-gp120(rAd5)。两种载体在CMV启动子的控制调控下都表达HIV gp120，并都使用删除了E1/E3的重组5型腺病毒。如在Tucker，et al.，Mol Ther 8：392(2004))中描述的，在初次给药后第3周和第6周通过抗gp120 IgG ELISA后第3周和第6周测量血浆中针对gp120的抗体效价。如图1所示，在初次始口腔给药后第3周和第6周时，在激发针对蛋白gp120的抗体应答中，DS1的表现明显优于比rAd5好。特别是，在第6周时，给予DS1组的针对gp120的平均抗体效价在给予DS1组中比给予rAd5的的组的效价好高100倍。也可以看出，显而易见的是，DS1组被第4周的再次给药加强，其中在第3周和至第6周的之间抗体平均效价增加了20倍以上，而rAd5组的平均抗体效价仅仅显示了出轻微的增加。该结果证实了在口腔给予包含编码目的抗原的核酸的嵌合腺病毒载体后，添加TLR-3激动剂能够大大提高Ad5介导的针对目的抗原的Ad5介导的抗体应答。作为测定所述分析的阳性对照，在第3周时，来自皮下注射gp120加上弗氏完全佐剂的动物的血清也在抗gp120 ELISA中被测量测定。将未处理的动物和单独给予dsRNA类似物(dsRNA)的动物分别作为所述ELISA的阴性和背景对照用于ELISA。每一组包括6只动物。
实施例3：第二嵌合腺病毒载体(DSIb)和第三嵌合腺病毒载体(DS1c) 的构建
使用标准的限制性内切酶酶切将编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸插入到pShuttle-CMV(Qbiogene)中。为了制备能够产生包含编码GFP的核酸序列的重组Ad(删除E1/E3)的载体，通过同源重组将质粒pShuttleCMV-GFP与前面所述的载体pAd(Qbiogene)结合。编码来自于流感A/PR/8/34的血凝素(HA)的核酸被克隆，并置于pShuttle-CMV载体(Qbiogene)(SEQ ID NO：13)中。为了制备能够产生包括编码HA的核酸序列的重组Ad(删除E1/E3)的载体，通过同源重组将质粒pShuttleCMV-HA(PR/8)与如前所述的载体pAd(Qbiogene)结合。通过将新pAd-CMV-GFP和pAd-CMV-HA表达构建体转染入293细胞制备重组的Ad。效价通过标准方法测定。
实施例4：DSIb(Ad-CMV-GFP加上TLR-3激动剂)和DS1c (Ad-CMV-HA加上TLR-3激动剂)诱导抗原特异性的免疫反应优于标 准的rAd5。
通过口腔管饲法在第0周给予动物10 x 107PFU的Ad-CMV-GFP加上5μg/ml聚肌胞苷酸(DS1b)或Ad-CMV-GFP(rAd5)。两种病毒都在CMV启动子的调控下表达GFP，并使用删除E1/E3的重组5型腺病毒。通过抗GFP IgG ELISA，在开始给予病毒后第3周测量血浆中GFP的抗体效价。如图2所示，在初始口腔给药后第3周，DS1b组在激发针对GFP蛋白的抗体应答中明显优于rAd5。
通过脾细胞的四聚体染色测定针对GFP的CD8+T细胞应答。动物在第0、4、8周接种，并在第10周采集脾。脾细胞用识别Ba1b/c小鼠中GFP优势免疫表位的CD8-FITC和四聚体染色。结果显示DS1b载体的口腔给药在诱导四聚体阳性CD8细胞中在统计学上优于单独给予rAd(图2b)。
通过口腔管饲法在第0周给予动物10 x 107PFU的Ad-CMV-HA加上5μg/ml聚肌胞苷酸(DS1c)或Ad-CMV-HA(rAd5)。两种病毒在CMV启动子的调控下都表达HA，并使用删除E1/E3的重组5型腺病毒。通过抗PR8/34IgG ELISA，在起始给予病毒后第3周测量血浆中HA的抗体效价。测定抗体应答的步骤与前面描述的相似，除了ELISA板涂有5μg/ml的A/PR8/34全裂解液(Advanced BiotechnologyIncorporated，Gaithersburg，MD)。如图2C所示，在初始口腔给药后第3周DS1c组在激发对流感的抗体应答中的表现明显优于rAd5(约高100倍)。这些研究结果还证实TLR-3激动剂与嵌合重组腺病毒载体联用可以普遍应用于多种不同的异种抗原，使抗体效价提高100倍。
实施例5：非胃肠外途径递送优于胃肠外途径
通过将1.0 x 107pfu的pAd-CMV-gp120(DS10+/-5μg/ml聚肌胞苷酸)直接注射到动物的四头肌中来检测肌肉内递送。如前面所述测量针对GFP的血浆血清IgG效价。每组包括六只动物。如图3A所示，给药后第3周时，在给予TLR-3激动剂(i.m.rAd+PI)的组观察到针对gp120的明显抗体效价。(图3a)。
通过将20μl的1.1 x 106pfu的DS1c+/-5μg/ml的聚肌胞苷酸给予到小鼠的鼻腔来检测经鼻给药。在给予配制在无菌盐水中的病毒前，用异氟醚轻度麻醉小鼠。结果显示rAd-CMV-HA加上聚肌胞苷酸(DS1c)与给予标准的rAd-CMV-HA的动物相比，抗体效价轻度升高。结果被标绘为DS1c(N＝6)和rAd(N＝5)组的个体动物的结果。未处理的动物(N＝4)用作阴性对照。
实施例6：表达的TLR3激动剂的构建。
DNA的45bp短片段通过排序DNA寡核苷酸来合成，当一起退火时，形成45bp片段以设计为形成双链RNA的发夹(GAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC)(SEQ ID NO：10)。该短片段(称为luc1)被克隆到包含人β肌动蛋白启动子和BGH聚腺苷酸尾的质粒pSK中。该质粒被称为pSk-luc1。
实施例7：pSK-luc1在树突细胞培养物中的功能与聚肌胞苷酸相似， 聚肌胞苷酸和rAd的作用是累加的。
为了测定上述实施例6中表达的TLR-3激动剂是否能够与TLR-3配体聚肌胞苷酸一样作为促炎细胞因子和树突细胞成熟的诱导剂发挥作用，在树突细胞培养物中检测表达的dsRNA TLR-3激动剂。用flt-3配体(200ng/ml)、5％血清在DMEM培养基中培养来自于Ba1b/c小鼠的股骨骨髓，以制备原代树突细胞培养物。原代骨髓培养物建立后第5天，用pSk-luc1、pSK-β2(形成200bp发夹的β半乳糖苷酶长片段)或pcDNA3(空表达载体)转染293细胞。第6天时，被转染的细胞用UV照射处理(40kJ/cm2处理20秒)，以引起细胞凋亡，并且将这些细胞添加到树突细胞。将聚肌胞苷酸(1μg/ml)、rAd(1pfu/细胞)、rAd+聚肌胞苷酸、pSK-luc1转染的细胞，pSK-β2转染的细胞或pcDNA3转染的细胞添加到树突细胞，并培养过夜。如图4A所示，pSK-luc1转染的细胞能够显著地提高树突细胞的激活，如通过小鼠IL-6ELISA所测定的那样。该试验的结果还显示rAd与TLR3配体(聚肌胞苷酸)结合在一起能够极大地提高树突细胞活性。
还检测了另外的配体。在SEQ ID NO：11(ml)中描述的TLR-3激动剂也形成了约与luc1大小相同的dsRNA发夹。这些配体通过重叠寡核苷酸并将其一起退火，随后克隆入受人β肌动蛋白启动子的调控的pSK载体中而制备。如前面所述，将载体转染到293细胞中并添加到原代树突细胞。如图4B所示，这些另外配体能够与配体luc1相似地激活树突细胞(图4B)。
实施例8：第四嵌合腺病毒载体(DS2)和快速克隆载体(DS2β-luc和 DS2C-luc)的构建。
编码gp120(来自于NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram)的核酸置于CMV启动子的调控下，所述启动子携带就在穿梭载体(pShuttleCMV，Qbiogene)中的起始密码子上游的小内含子。来自于bGH的聚腺苷酸尾位于编码gp120的核酸的下游。将在人β肌动蛋白启动子调控下的dsRNA TLR-3激动剂luc1和聚腺核酸(如上述实施例5中所描述的)插入gp120pShuttle载体中，使得编码gp120的核酸和编码TLR-3激动剂的核酸在两个分离启动子的控制下包含在单一载体中。编码目的抗原的核酸的表达和TLR-3激动剂的表达的方向如图5所示例。
还构建了被称为DS2β-luc(SEQ ID NO：14)和DS2C-luc(SEQ IDNO：15)的两个通用穿梭载体，使得编码任何目的抗原的核酸在CMV启动子的调控下能够被插入，并且人β肌动蛋白启动子或CMV启动子用于启动dsRNA TLR-3激动剂的表达。特别是，载体DS2C-luc具有编码目的抗原的核酸能够容易地被克隆进入的独特Kpn1位点。这些载体的目的是使随后的载体构建更容易，因为编码任何目的抗原的核酸能够被插入到所述克隆位点以快速地制备能够激发针对目的抗原的抗体和T细胞应答的载体。如前面一样实施DS2与载体pAd(Qbiogene)的同源重组，以制备能够产生包含编码GFP的核酸和编码dsRNA LR-3激动剂luc1的核酸的重组Ad(删除E1/E3)的载体。重组Ad通过将新pAd-β肌动蛋白-luc1-CMV-gp120表达载体转染到293细胞来产生。效价通过标准方法测定。
实施例9：口腔递送DS2后，抗原特异性免疫反应的诱导。
通过口腔管饲法在第0周给予动物10 x 107PFU的pAd-CMV-gp120加上TLR-3激动剂luc1(DS2)或pAd-CMV-gp120(rAd5)。两种病毒在CMV启动子的调控下都表达gp120，并使用删除E1/E3的重组5型腺病毒。通过抗gp120IgG ELISA，在给予病毒后第3周测量血浆中gp120的抗体效价。ELISA实验方案已经在前面描述过(Tucker，et al，Mol Therapy 8：392(2004))。结果证实DS2能够诱导试验中使用的异种抗原gp120的抗体效价约提高2log。DS2载体包含编码表达gp120的核酸序列和表达dsRNA TLR-3激动剂的核酸序列。作为所述分析的阳性对照，在抗gp120ELISA中还测定了来自皮下注射了10微克gp120蛋白加上弗氏完全佐剂的两只动物的血清。未处理的动物作为所述ELISA的阴性对照。每组包括6只动物。结果如图6所示。
实施例10：口腔递送DS3后，抗原特异性免疫反应的诱导。
通过口腔管饲法在第0周给予动物10 x 107PFU的pAd-CMV-流感HA(来自于A/PR/8/34)加上TLR7/8配体聚尿苷酸(DS3)或pAd-CMV-HA(rAd5)。两种病毒在CMV启动子的调控下都表达流感HA，并使用删除E1/E3的重组5型腺病毒。通过抗流感HA IgG ELISA，在给予病毒后第3周测量血浆中HA的抗体效价。每组包括6只动物。结果如图7所示。
实施例11：第五、第六和第七嵌合腺病毒载体的构建(DS2b、DS2b-for 和ND1.1214)。
流感HA(A/Indo/5/2005)基因由CelTek(Nashville，TN)合成，并置于具有CMV启动子的的载体pShuttleCMV(Qbiogene)中，所述启动子携带就在穿梭载体中的起始密码子上游的小内含子。将带有人β肌动蛋白启动子和聚腺苷酸(在实施例5中描述)的luc1 DNA置于抗原的载体下游，在图5所示的DS2b的方向上。Luc1序列是(GAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC)(SEQ ID NO：10)，并且完整的pShuttle载体在SEQ ID NO：6中被描述。在穿梭载体中带有启动子的luc1的可选择的方向如SEQID NO：7中所描述的，并且指定为DS2b-for。我们也已经构建了另一pShuttle载体(被称为DS2bC-HA)(SEQ ID NO：16)，其包括启动前面描述的TLR-3激动剂luc1和流感HA表达的两个独立CMV启动子。如前面一样实施与载体pAd(Qbiogene)的同源重组，以产生能够在分离启动子的调控下产生包含编码HA和TLR-3激动剂luc1的核酸的重组Ad的载体。重组Ad通过将新pAd载体转染到293细胞来产生。效价通过标准方法测定。包含DS2C-luc的完整pAd载体被命名为ND1.1214，并于2007年2月22日保藏在ATCC专利保藏机构(Manassus，VA)。所述嵌合腺病毒载体的核酸序列在SEQ ID NO：17中提出。编码异种抗原的核酸以粗体表示，并且侧面5′末端与CIa I识别位点连接，3′末端与Not 1识别位点连接。编码TLR-3激动剂的核酸序列以斜体表示，连接子序列以粗体表示。编码任何目的抗原的核酸序列和编码任何合适的表达的TLR-3激动剂的核酸序列都能够被插入嵌合腺病毒载体中。
实施例12：口腔递送DS2b后，抗原特异性免疫反应的诱导。
通过口腔管饲法在第0周给予动物10 x 107 PFU的pAd-CMV-HA加上反向TLR-3激动剂luc1(DS2b)或加上正向TLR-3激动剂luc1(DS2b-for)，或者pAd-CMV-HA(rAd5)。这些病毒都在CMV启动子的调控下表达流感HA抗原，并使用删除E1/E3的重组5型腺病毒。通过抗HA IgG ELISA，在给予病毒后第3周测定血浆中HA的抗体效价。结果证实DS2b载体激发针对蛋白HA的抗体应答高于标准的rAd载体(rAd5)。DS2b载体包含表达HA的rAd5，还表达toll样受体3(TLR3)激动剂，双链发夹RNA，这表明使用编码的dsRNA配体能够改善针对目的抗原的获得性免疫反应。如图8A和图6所示，表达的dsRNA能够改善针对多个不同异种抗原的获得性免疫反应。将未处理的动物作为所述ELISA的阴性对照。每组包括6只动物。
在口腔或肌肉给予每只动物1.0 x 107pfu病毒后第0周和第5周，测定相反方向的载体(DS2for)的抗体应答。在初始给药后第4周和第7周测量对HA的抗体应答。如图8B所示，所述相反方向载体也能够诱导对异种抗原的显著的抗体应答。在第4周的时间点，DS1b和DS1bfor载体诱导对HA的相似应答。显著地，DS1bfor载体证实了抗体应答的加强效果，并显示了多剂量能够用于增加对异种抗原的抗体应答。
另一实施例也证实了嵌合腺病毒载体方法的潜力。通过口腔(1.0 x 107pfu)或经鼻(3 x 106pfu)给予动物载体ND1.1214，并在第3周测量针对异种抗原的抗体应答。如图8C所示，在口腔给药后，测量到了针对HA的显著抗体应答，远超出口腔给予单一rAd载体的通常值。
为了所有的目的，本说明书中引用的所有出版物、专利公开物、专利和Genback登录号申请都通过引用的方式以其整体并入本文，如同每一出版物、专利公开物或专利被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
非正式序列表
SEQ ID NO：1(DS1)
taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat
gagggggtgg agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg
acgtagtagt gtggcggaag tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg
taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt ttggtgtgcg ccggtgtaca
caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg tagtaaattt
gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga
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cataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgat
tattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatat
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GTATAGCTTCTAGAGATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCTCTAAAGGAGATACCC
GGCCAGACACCCTCACCTGCGGTGCCCAGCTGCCCAGGCTGAGGCAAGAGAAGGCCAG
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GGTCGCTTCCGTGCTAGCTGTGGAGAAGCTGTGGGTGACTGTATACTATGGGGTGCCT
GTGTGGAAGGAGGCCACCACCACCCTGTTCTGTGCCTCTGATGCCAAGGCCTATGACA
CTGAGGTCCACAATGTCTGGGCCACCCATGCCTGTGTGCCCACTGACCCCAACCCTCA
GGAGGTGGTGCTGGAGAATGTGACTGAGCACTTCAACATGTGGAAGAACAACATGGTG
GAGCAGATGCAGGAGGACATCATCAGCCTGTGGGACCAGAGCCTGAAGCCCTGTGTGA
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CCTGCTGGCTTTGCCATCCTGAAGTGCAATGACAAGACCTTCAATGGCAAAGGCCCTT
GCAAGAATGTGAGCACTGTGCAGTGCACTCATGGCATCAGGCCTGTGGTGAGCACCCA
GCTGCTGCTGAATGGCAGCCTGGCTGAGGAGGAGGTGGTGATCAGGTCTGACAACTTC
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TGAAGGAGTCTGTGGAGATCAACTGCACCAGGCCCAACAACAACACCAGGAAGAGCAT
TCACATTGGCCCTGGCAGGGCCTTCTACACCACTGGGGAGATCATTGGGGACATCAGG
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GCTGAGGGAGCAGTTTGAGAACAAGACCATTGTGTTCAATCACAGCTCTGGTGGTGAT
CCTGAGATTGTGATGCACAGCTTCAACTGTGGTGGTGAGTTCTTCTACTGCAACAGCA
CCCAGCTGTTCAACAGCACCTGGAACAACAACACTGAGGGCAGCAACAACACTGAGGG
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GGCAAGGCCATGTATGCTCCTCCCATCAGGGGCCAGATCAGGTGCAGCAGCAACATCA
CTGGCCTGCTGCTGACCAGGGATGGTGGCATCAATGAGAATGGCACTGAGATTTTCAG
GCCTGGTGGTGGGGACATGAGGGACAACTGGAGGTCTGAGCTGTACAAGTACAAGGTG
GTGAAGATTGAGCCCCTTGGTGTGGCTCCCACCAAGGCTAAGCGCAGGGTGGTGCAGA
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CCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCC
GGAGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCAGG
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TGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGC
CCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGA
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CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT
GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG
GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGG
TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG
CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA
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TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC
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CCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGT
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GGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCCCAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTA
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421    ggtgggaaag aatatataag gtgggggtct tatgtagttt tgtatctgttttgcagcagc
481    cgccgccgcc atgagcacca actcgtttga tggaagcatt gtgagctcatatttgacaac
541    gcgcatgccc ccatgggccg gggtgcgtca gaatgtgatg ggctccagcattgatggtcg
601    ccccgtcctg cccgcaaact ctactacctt gacctacgag accgtgtctggaacgccgtt
661    ggagactgca gcctccgccg ccgcttcagc cgctgcagcc accgcccgcgggattgtgac
721    tgactttgct ttcctgagcc cgcttgcaag cagtgcagct tcccgttcatccgcccgcga
781    tgacaagttg acggctcttt tggcacaatt ggattctttg acccgggaacttaatgtcgt
841    ttctcagcag ctgttggatc tgcgccagca ggtttctgcc ctgaaggcttcctcccctcc
901    caatgcggtt taaaacataa ataaaaaacc agactctgtt tggatttggatcaagcaagt
961    gtcttgctgt ctttatttag gggttttgcg cgcgcggtag gcccgggaccagcggtctcg
1021   gtcgttgagg gtcctgtgta ttttttccag gacgtggtaaaggtgactct ggatgttcag
1081   atacatgggc ataagcccgt ctctggggtg gaggtagcaccactgcagag cttcatgctg
1141   cggggtggtg ttgtagatga tccagtcgta gcaggagcgctgggcgtggt gcctaaaaat
1201   gtctttcagt agcaagctga ttgccagggg caggcccttggtgtaagtgt ttacaaagcg
1261   gttaagctgg gatgggtgca tacgtgggga tatgagatgcatcttggact gtatttttag
1321   gttggctatg ttcccagccata tccctccg gggattcatgttgtgcagaa ccaccagcac
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1501   gggcccacgg gcggcggcct gggcgaagatat ttctgggatcactaacgt catagttgtg
1561   ttccaggatg agatcgtcat aggccatttt tacaaagcgcgggcggaggg tgccagactg
1621   cggtataatg gttccatccg gcccaggggc gtagttaccctcacagattt gcatttccca
1681   cgctttgagt tcagatgggg ggatcatgtc tacctgcggggcgatgaaga aaacggtttc
1741   cggggtaggg gagatcagct gggaagaaag caggttcctgagcagctgcg acttaccgca
1801   gccggtgggcc cgtaaatca cacctattac cgggtgcaactggtagttaa gagagctgca
1861   gctgccgtca tccctgagca ggggggccac ttcgttaagcatgtccctgact cgcatgtt
1921   ttccctgacc aaatccgcca gaaggcgctcgc cgcccagcgatagcagtt cttgcaagga
1981   agcaaagttt ttcaacggtt tgagaccgtc cgccgtaggcatgcttttga gcgtttgacc
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2161   agacgggcca gggtcatgtc tttccacggg cgcagggtcctcgtcagcgt agtctgggtc
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3961   cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcagaggtggcgaa acccgacagg
4021   actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctcgtgcgctctc ctgttccgac
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4321   agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtggtggcctaact acggctacac
4381   tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagccagttaccttcg gaaaaagagt
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4561   gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggattttggtcatga gattatcaaa
4621   aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagttttaaatcaa tctaaagtat
4681   atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatcagtgaggcac ctatctcagc
4741   gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactccccgtcgtgtaga taactacgat
4801   acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgataccgcgagacc cacgctcacc
4861   ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagggccgagcgca gaagtggtcc
4921   tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgccgggaagcta gagtaagtag
4981   ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgctgcagccatga gattatcaaa
5041   aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta gaaagccagtccgcagaaac ggtgctgacc
5101   ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaaaacgcaagcg caaagagaaa
5161   gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagactgggcggttt tatggacagc
5221   aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaaggttgggaagc cctgcaaagt
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5521   cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcgcggctatcgt ggctggccac
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5641   gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatctcaccttgctc ctgccgagaa
5701   agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacgcttgatccgg ctacctgccc
5761   attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgtactcggatgg aagccggtct
5821   tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctcgcgccagccg aactgttcgc
5881   caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtcgtgacccatg gcgatgcctg
5941   cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctggattcatcgact gtggccggct
6001   gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacccgtgatattg ctgaagagct
6061   tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggtatcgccgctc ccgattcgca
6121   gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctgaattttgttaa aatttttgtt
6181   aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaacatcccttat aaatcaaaag
6241   aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaacaagagtcca ctattaaaga
6301   acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatcagggcgatggc ccactacgtg
6361   aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt cgaggtgccgtaaagctcta aatcggaacc
6421   ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagccggcgaacgtg gcgagaaagg
6481   aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggcaagtgtagcg gtcacgctgc
6541   gcgtaaccac cacacccgcg cgcttaatgc gccgctacagggcgcgtcca ttcgccattc
6601   aggatcgaat taattcttaa t
SEQ ID：2(载体序列DS2)
taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat
gagggggtgg agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg
acgtagtagt gtggcggaag tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg
taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt ttggtgtgcg ccggtgtaca
caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg tagtaaattt
gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga
ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg
taatactGCTAGAgatCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTA
ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACG
ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTGGCCAcagagcttggcccattgcatacgttgt
atccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttg
acattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagc
ccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc
ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat
agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggca
gtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaat
ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagta
catctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaat
gggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtca
atgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactc
cgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcaga
gctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctcc
atagaagacaccgggaccgatccagcctgactctagCctAGCTCtgaagttggtggtg
aggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaa
ctgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctg
cctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGA
GGTCGACGGTATCGATGGGTACAGCTTCTAGAGATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGT
GCTCTAAAGGAGATACCCGGCCAGACACCCTCACCTGCGGTGCCCAGCTGCCCAGGCT
GAGGCAAGAGAAGGCCAGAAACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTT
GTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCGTGCTAGCTGTGGAGAAGCTGTGGGTGACT
GTATACTATGGGGTGCCTGTGTGGAAGGAGGCCACCACCACCCTGTTCTGTGCCTCTG
ATGCCAAGGCCTATGACACTGAGGTCCACAATGTCTGGGCCACCCATGCCTGTGTGCC
CACTGACCCCAACCCTCAGGAGGTGGTGCTGGAGAATGTGACTGAGCACTTCAACATG
TGGAAGAACAACATGGTGGAGCAGATGCAGGAGGACATCATCAGCCTGTGGGACCAGA
GCCTGAAGCCCTGTGTGAAGCTGACCCCCCTGTGTGTGACCCTGAACTGCAAGGATGT
GAATGCCACCAACACCACCAATGACTCTGAGGGCACTATGGAGAGGGGTGAGATCAAG
AACTGCAGCTTCAACATCACCACCAGCATCAGGGATGAGGTGCAGAAGGAGTATGCCC
TGTTCTACAAGCTGGATGTGGTGCCCATTGACAACAACAACACCAGCTACAGGCTGAT
CAGCTGTGACACCTCTGTGATCACCCAGGCCTGCCCCAAGATCAGCTTTGAGCCCATC
CCCATCCACTACTGTGCCCCTGCTGGCTTTGCCATCCTGAAGTGCAATGACAAGACCT
TCAATGGCAAAGGCCCTTGCAAGAATGTGAGCACTGTGCAGTGCACTCATGGCATCAG
GCCTGTGGTGAGCACCCAGCTGCTGCTGAATGGCAGCCTGGCTGAGGAGGAGGTGGTG
ATCAGGTCTGACAACTTCACCAACAATGCCAAGACCATCATTGTGCAGC
TGAAGGAGTCTGTGGAGATCAACTGCACCAGGCCCAACAACAACACCAGGAAGAGCAT
TCACATTGGCCCTGGCAGGGCCTTCTACACCACTGGGGAGATCATTGGGGACATCAGG
CAGG
CCCACTGCAACATCAGCAGGGCCAAGTGGAATGACACCCTGAAGCAGATTGTGATCAA
GCTGAGGGAGCAGTTTGAGAACAAGACCATTGTGTTCAATCACAGCTCTGGTGGTGAT
CCTGAGATTGTGATGCACAGCTTCAACTGTGGTGGTGAGTTCTTCTACTGCAACAGCA
CCCAGCTGTTCAACAGCACCTGGAACAACAACACTGAGGGCAGCAACAACACTGAGGG
CAACACCATCACCCTGCCTTGCAGGATCAAGCAGATCATCAACATGTGGCAGGAGGTG
GGCAAGGCCATGTATGCTCCTCCCATCAGGGGCCAGATCAGGTGCAGCAGCAACATCA
CTGGCCTGCTGCTGACCAGGGATGGTGGCATCAATGAGAATGGCACTGAGATTTTCAG
GCCTGGTGGTGGGGACATGAGGGACAACTGGAGGTCTGAGCTGTACAAGTACAAGGTG
GTGAAGATTGAGCCCCTTGGTGTGGCTCCCACCAAGGCTAAGCGCAGGGTGGTGCAGA
GGGAGAAGcgcgctgtgggctgaggatccCGAGGGTGAGTGCTCCTGCCTGGACGCAT
CCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCC
GGAGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCAGG
CTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGG
TGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGC
CCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGA
TTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC
ATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGAC
AGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCC
ACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC
CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT
GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG
GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGG
TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG
CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA
GGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCT
GCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACA
GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC
TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC
AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT
CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA
TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT
CTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGC
TCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGT
GCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGGTCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACC
CCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGT
CCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATG
GGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCCCAAGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTA
TAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCA
CTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGgatct
ggg cgtggttaag
421    ggtgggaaag aatatataag gtgggggtct tatgtagttt tgtatctgttttgcagcagc
481    cgccgccgcc atgagcacca actcgtttga tggaagcatt gtgagctcat
CGGCGGCCGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCG
ACTGTGCCTT
CTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG
TGCCACTCCCAC
TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCT
ATTCTGGGGGGT
GGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGG
ATGCGGTGGGCT
CTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAACCACC
GCGGTGGCGGCCGCCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATT
TTATTTCTAGAGAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTT
CCTGCAGGAATTCGCCCTTTAGATATCATCGATGTCTCGGCGGTGGTGGCGCGTCGCG
CCGCTGGGTTTTATAGGGCGCCGCCGCGGCCGCTCGAGCCATAAAAGGCAACTTTCGG
AACGGCGCACGCTGATTGGCCCCGCGCCGCTCACTCACCGGCTTCGCCGCACAGTGCA
GCATTTTTTTACCCCCTCTCCCCTCCTTTTGCGAAAAAAAAAAAGAGCGAGAGCGAGA
TTGAGGAAGAGGAGGAGGGAGAGTTTTGGCGTTGGCCGCCTTGGGGTGCTGGGCGTCG
ACGATATCTAAGGGCGAATTCGATATCAagctagctTgtcgactcg aagatctggg
cgtggttaag
421    ggtgggaaag aatatataag gtgggggtct tatgtagttttgtatctgtt ttgcagcagc
481    cgccgccgcc atgagcacca actcgtttga tggaagcattgtgagctcat atttgacaac
541    gcgcatgccc ccatgggccg gggtgcgtca gaatgtgatgggctccagca ttgatggtcg
601    ccccgtcctg cccgcaaact ctactacctt gacctacgagaccgtgtctg gaacgccgtt
661    ggagactgca gcctccgccg ccgcttcagc cgctgcagccaccgcccgcg ggattgtgac
721    tgactttgct ttcctgagcc cgcttgcaag cagtgcagcttcccgttcat ccgcccgcga
781    tgacaagttg acggctcttt tggcacaatt ggattctttgacccgggaac ttaatgtcgt
841    ttctcagcag ctgttggatc tgcgccagca ggtttctgccctgaaggctt cctcccctcc
901    caatgcggtt taaaacataa ataaaaaacc agactctgtttggatttgga tcaagcaagt
961    gtcttgctgt ctttatttag gggttttgcg cgcgcggtaggcccgggacc agcggtctcg
1021   gtcgttgagg gtcctgtgta ttttttccag gacgtggtaaaggtgactct ggatgttcag
1081   atacatgggc ataagcccgt ctctggggtg gaggtagcaccactgcagag cttcatgctg
1141   cggggtggtg ttgtagatga tccagtcgta gcaggagcgctgggcgtggt gcctaaaaat
1201   gtctttcagt agcaagctga ttgccagggg caggcccttggtgtaagtgt ttacaaagcg
1261   gttaagctgg gatgggtgca tacgtgggga tatgagatgcatcttggact gtatttttag
1321   gttggctatg ttcccagcca tatccctccg gggattcatgttgtgcagaa ccaccagcac
1381   agtgtatccg gtgcacttgg gaaatttgtc atgtagcttagaaggaaatg cgtggaagaa
1441   cttggagacg cccttgtgac ctccaagatt ttccatgcattcgtccataa tgatggcaat
1501   gggcccacgg gcggcggcct gggcgaagat atttctgggatcactaacgt catagttgtg
1561   ttccaggatg agatcgtcat aggccatttt tacaaagcgcgggcggaggg tgccagactg
1621   cggtataatg gttccatccg  gcccaggggc gtagttaccctcacagattt gcatttccca
1681   cgctttgagt tcagatgggg ggatcatgtc tacctgcggggcgatgaaga aaacggtttc
1741   cggggtaggg gagatcagct gggaagaaag caggttcctgagcagctgcg acttaccgca
1801   gccggtgggc ccgtaaatca cacctattac cgggtgcaactggtagttaa gagagctgca
1861   gctgccgtca tccctgagca ggggggccac ttcgttaagcatgtccctga ctcgcatgtt
1921   ttccctgacc aaatccgcca gaaggcgctc gccgcccagcgatagcagtt cttgcaagga
1981   agcaaagttt ttcaacggtt tgagaccgtc cgccgtaggcatgcttttga gcgtttgacc
2041   aagcagttcc aggcggtccc acagctcggt cacctgctctacggcatctc gatccagcat
2101   atctcctcgt ttcgcgggtt ggggcggctt tcgctgtacggcagtagtcg  gtgctcgtcc
2161   agacgggcca gggtcatgtc tttccacggg cgcagggtcctcgtcagcgt agtctgggtc
2221   acggtgaagg ggtgcgctcc gggctgcgcg ctggccagggtgcgcttgag gctggtcctg
2281   ctggtgctga agcgctgccg gtcttcgccc tgcgcgtcggccaggtagca tttgaccatg
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2401   gcgccgcacg aggggcagtg cagacttttg agggcgtagagcttgggcgc gagaaatacc
2461   gattccgggg agtaggcatc cgcgccgcag gccccgcagacggtctcgca ttccacgagc
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2581   ttcttacctc tggtttccat gagccggtgt ccacgctcggtgacgaaaag gctgtccgtg
2641   tccccgtata cagacttgag agggagttta aacgaattcaatagcttgtt gcatgggcgg
2701   cgatataaaa tgcaaggtgc tgctcaaaaa atcaggcaaagcctcgcgca aaaaagaaag
2761   cacatcgtag tcatgctcat gcagataaag gcaggtaagctccggaacca ccacagaaaa
2821   agacaccatt tttctctcaa acatgtctgc gggtttctgcataaacacaa aataaaataa
2881   caaaaaaaca tttaaacatt agaagcctgt cttacaacaggaaaaacaac ccttataagc
2941   ataagacgga ctacggccat gccggcgtga ccgtaaaaaaactggtcacc gtgattaaaa
3001   agcaccaccg acagctcctc ggtcatgtcc ggagtcataatgtaagactc ggtaaacaca
3061   tcaggttgat tcatcggtca gtgctaaaaa gcgaccgaaatagcccgggg gaatacatac
3121   ccgcaggcgt agagacaaca ttacagcccc cataggaggtataacaaaat taataggaga
3181   gaaaaacaca taaacacctg aaaaaccctc ctgcctaggcaaaatagcac cctcccgctc
3241   cagaacaaca tacagcgctt cacagcggca gcctaacagtcagccttacc agtaaaaaag
3301   aaaacctatt aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagctcaatcagtca cagtgtaaaa
3361   aagggccaag tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaatgacgtaacg gttaaagtcc
3421   acaaaaaaca cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgcccagaaacgaaag ccaaaaaacc
3481   cacaacttcc tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgttacgtaacttcc cattttaaga
3541   aaactacaat tcccaacaca tacaagttac tccgccctaaaacctacgtc acccgccccg
3601   ttcccacgcc ccgcgccacg tcacaaactc caccccctcattatcatatt ggcttcaatc
3661   caaaataagg tatattattg atgatgttaa ttaacatgcatggatccata tgcggtgtga
3721   aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcaggcgctcttccg cttcctcgct
3781   cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcggtatcagctc actcaaaggc
3841   ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcaggaaagaacatgt gagcaaaagg
3901   ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctggcgtttttcc ataggctccg
3961   cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcagaggtggcgaa acccgacagg
4021   actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctcgtgcgctctc ctgttccgac
4081   cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcgggaagcgtgg cgctttctca
4141   tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgttcgctccaagc tgggctgtgt
4201   gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatccggtaactatc gtcttgagtc
4261   caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagccactggtaaca ggattagcag
4321   agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtggtggcctaact acggctacac
4381   tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagccagttaccttcg gaaaaagagt
4441   tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagcggtggttttt ttgtttgcaa
4501   gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagatcctttgatct tttctacggg
4561   gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggattttggtcatga gattatcaaa
4621   aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagttttaaatcaa tctaaagtat
4681   atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatcagtgaggcac ctatctcagc
4741   gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactccccgtcgtgtaga taactacgat
4801   acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgataccgcgagacc cacgctcacc
4861   ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagggccgagcgca gaagtggtcc
4921   tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgccgggaagcta gagtaagtag
4981   ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgctgcagccatga gattatcaaa
5041   aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta gaaagccagtccgcagaaac ggtgctgacc
5101   ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaaaacgcaagcg caaagagaaa
5161   gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagactgggcggttt tatggacagc
5221   aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaaggttgggaagc cctgcaaagt
5281   aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgcaggggatcaa gctctgatca
5341   agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagatggattgcacg caggttctcc
5401   ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggcacaacagacaa tcggctgctc
5461   tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccggttctttttg tcaagaccga
5521   cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcgcggctatcgt ggctggccac
5581   gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcactgaagcgggaa gggactggct
5641   gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatctcaccttgctc ctgccgagaa
5701   agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacgcttgatccgg ctacctgccc
5761   attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgtactcggatgg aagccggtct
5821   tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctcgcgccagccg aactgttcgc
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6001   gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacccgtgatattg ctgaagagct
6061   tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggtatcgccgctc ccgattcgca
6121   gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctgaattttgttaa aatttttgtt
6181   aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaacatcccttat aaatcaaaag
6241   aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaacaagagtcca ctattaaaga
6301   acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatcagggcgatggc ccactacgtg
6361   aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt cgaggtgccgtaaagctcta aatcggaacc
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6601   aggatcgaat taattcttaa t
SEQ ID No：3
GAAACGATATGGGCTGAATACTTAAGTATTCAGCCCATATCGTTTC.
Seq id no：4
CGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGCCCTTAGA
TATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTT
CCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAA
AAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGC
GCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAACC
CAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACATCGATGATATCTA
AAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCC
GCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTCAGCTGCGGATCCATTCGCCATTC
AGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGC
TGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCA
GTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA
TTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCC
TGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTT
TCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCG
GCCGCCACCGCGGTGGAGCT
Atcgaattcaagcttgtcgactc gaagatc
CT AG ACTAGTGGAT CCCCCGGGCTGCAGGAATT
CGCCCTTTAGATATCATCGATGTCTCGGCGGTGGTGGCGCGTCGCGCCGCTGGGTTTT
ATAGGGCGCCGCCGCGGCCGCTCGAGCCATAAAAGGCAACTTTCGGAACGGCGCACGC
TGATTGGCCCCGCGCCGCTCACTCACCGGCTTCGCCGCACAGTGCAGCATTTTTTTAC
CCCCTCTCCCCTCCTTTTGCGAAAAAAAAAAAGAGCGAGAGCGAGATTGAGGAAGAGG
AGGAGGGAGAGTTTTGGCGTTGGCCGCCTTGGGGTGCTGGGCGTCGACGATATCTAAG
GGCGAATT C GATATCAAGC TTATCGATAC CGTCGACCTC GAGGGGGGGC CCG
SEQ NO：5
CGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATC
GAATTCGCCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCA
ACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTC
GCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGT
GAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAG
CGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACA
TCGATGATATCTA
AAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCC
GCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTT
CAGCTGCGGATCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGC
GATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGT
GCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACG
TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAAT
TGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATC
GAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTT
TCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCG
GCCGCCACCGCGGTGGAGCTA
Tcgaattcaagcttgtcgactc gaagatcgtaca
caggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttg
tagtaaatttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactgaataa
ga
ggaagtgaaatctgaataattttgtgttactcatagcgcgtaatactggtac
CGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATC
GAATTCGCCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCA
ACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTC
GCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGT
GAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAG
CGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACA
TCGATGATATCTA
AAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGG
GCTGCAGGAATTC
GATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCA
ATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA
CGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGC
ACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATC
GCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGATCCGCAGCTG
AAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCA
TCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCG
GCCGCCACCGCGGTGGAGCTA
SEQ ID：6
taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat
gagggggtgg agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg
acgtagtagt gtggcggaag tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg
taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt ttggtgtgcg ccggtgtaca
caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg tagtaaattt
gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga
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taatactGCTAGAgatCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTA
ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACG
ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTGGCCAcagagcttggcccattgcatacgttgt
atccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttg
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ccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc
ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat
agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggca
gtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaat
ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagta
catctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaat
gggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtca
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cgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcaga
gctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctcc
atagaagacaccgggaccgatccagcctgactctagCctAGCTCtgaagttggtggtg
aggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaa
ctgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctg
cctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGA
GGTCGACGGTATcgatgcca ccATGGAGAA AATCGTCCTG TTGCTCGCTA
TTGTGTCTCT
51     AGTGAAGAGC GATCAAATTT GTATCGGCTA CCATGCCAAT AACTCAACAG
101    AGCAGGTCGA TACTATCATG GAGAAAAACG TAACAGTTAC TCATGCCCAA
151    GACATCTTGG AAAAGACCCA CAACGGCAAA CTTTGCGACC TGGATGGAGT
201    GAAGCCCCTG ATCCTCCGGG ACTGTTCAGT CGCTGGTTGG CTGCTCGGGA
251    ACCCTATGTG TGATGAGTTT ATCAACGTGC CTGAATGGTC TTACATTGTG
301    GAGAAGGCTA ACCCTACCAA TGACCTCTGC TATCCTGGGT CATTTAACGA
351    TTACGAGGAA CTGAAACACC TGTTGTCTAG AATTAACCAC TTTGAAAAGA
401   TACAGATTAT ACCCAAGTCT AGTTGGAGTG ATCACGAAGC CTCCTCAGGC
451   GTTAGCTCAG CGTGTCCCTA TCTGGGCTCT CCATCCTTCT TTAGAAATGT
501   GGTCTGGTTA ATCAAAAAGA ACAGTACCTA CCCAACCATC AAAAAGTCTT
551   ATAACAATAC CAATCAGGAG GACCTGCTCG TGTTGTGGGG TATCCATCAC
601   CCGAACGACG CCGCTGAACA GACTAGGCTG TATCAGAACC CCACTACATA
651   CATCAGTATT GGCACGAGTA CTCTGAACCA GCGATTAGTG CCAAAGATTG
701   CAACACGGAG CAAAGTAAAT GGGCAATCTG GCAGGATGGA GTTTTTCTGG
751   ACAATCTTAA AACCCAACGA TGCGATAAAT TTCGAGTCCA ATGGCAATTT
801   CATCGCCCCT GAATACGCCT ATAAGATCGT GAAAAAGGGG GACTCTGCAA
851   TTATGAAGTC CGAATTAGAG TATGGCAATT GCAACACGAA GTGCCAGACA
901   CCAATGGGAG CCATTAATAG CTCAATGCCC TTCCATAATA TTCATCCATT
951   GACCATTGGG GAGTGCCCAA AGTACGTGAA GTCCAACCGC CTGGTCCTCG
1001  CAACCGGTCT AAGAAATAGC CCGCAGAGAG AATCGCGGAG GAAGAAACGT
1051  GGCCTGTTTG GCGCGATTGC CGGATTCATC GAGGGAGGCT GGCAGGGTAT
1101  GGTCGATGGT TGGTACGGAT ACCACCATAG CAACGAACAG GGGTCCGGCT
1151  ATGCAGCAGA TAAGGAGAGC ACTCAGAAAG CTATTGACGG AGTTACAAAC
1201  AAGGTTAATA GTATTATAGA TAAAATGAAC ACGCAATTCG AGGCCGTTGG
1251  GAGGGAGTTT AACAATCTGG AACGCCGGAT CGAAAATCTG AATAAGAAAA
1301  TGGAAGACGG CTTCCTTGAC GTGTGGACTT ATAATGCAGA GCTGCTTGTA
1351  CTCATGGAGA ACGAGAGGAC CCTGGATTTC CACGATAGCA ACGTGAAGAA
1401  CCTTTACGAC AAGGTGAGAC TTCAGCTCCG AGACAACGCC AAGGAGCTGG
1451  GGAATGGATG CTTCGAGTTT TACCACAAAT GTGACAATGA GTGCATGGAA
1501  AGTATACGCA ACGGGACCTA CAATTACCCT CAGTATAGCG AAGAGGCTCG
1551  GCTCAAACGC GAAGAGATAA GCGGGGTGAA ATTGGAATCA ATCGGAACAT
1601  ATCAAATCCT GTCCATCTAT TCCACCGTCG CCTCTTCGCT GGCCCTCGCT
1651  ATCATGATGG CTGGTCTGTC CCTATGGATG TGTTCCAATG GAAGCCTTCA
1701  GTGCCGTATT TGTATATGAg c
GGCCGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTG
TGCCTT
CTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG
TGCCACTCCCAC
TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCT
ATTCTGGGGGGT
GGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGG
ATGCGGTGGGCT
CTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAA
CCACCGCGGTGGCGGCCGCCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAG
ATATTTTATTTCTAGAGAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATAT
CGTTTCCTGCAGGAATTCGCCCTTTAGATATCATCGATGTCTCGGCGGTGGTGGCGCG
TCGCGCCGCTGGGTTTTATAGGGCGCCGCCGCGGCCGCTCGAGCCATAAAAGGCAACT
TTCGGAACGGCGCACGCTGATTGGCCCCGCGCCGCTCACTCACCGGCTTCGCCGCACA
GTGCAGCATTTTTTTACCCCCTCTCCCCTCCTTTTGCGAAAAAAAAAAAGAGCGAGAG
CGAGATTGAGGAAGAGGAGGAGGGAGAGTTTTGGCGTTGGCCGCCTTGGGGTGCTGGG
CGTCGACGATATCTAAGGGCGAATTCGATATCA
AGCTAGCT Tgtcgactcg aagatctggg cgtggttaag
421   ggtgggaaag aatatataag gtgggggtct tatgtagttttgtatctgtt ttgcagcagc
481   cgccgccgcc atgagcacca actcgtttga tggaagcattgtgagctcat atttgacaac
541   gcgcatgccc ccatgggccg gggtgcgtca gaatgtgatgggctccagca ttgatggtcg
601   ccccgtcctg cccgcaaact ctactacctt gacctacgagaccgtgtctg gaacgccgtt
661   ggagactgca gcctccgccg ccgcttcagc cgctgcagccaccgcccgcg ggattgtgac
721   tgactttgct ttcctgagcc cgcttgcaag cagtgcagcttcccgttcat ccgcccgcga
781   tgacaagttg acggctcttt tggcacaatt ggattctttgacccgggaac ttaatgtcgt
841   ttctcagcag ctgttggatc tgcgccagca ggtttctgccctgaaggctt cctcccctcc
901   caatgcggtt taaaacataa ataaaaaacc agactctgtttggatttgga tcaagcaagt
961   gtcttgctgt ctttatttag gggttttgcg cgcgcggtaggcccgggacc agcggtctcg
1021  gtcgttgagg gtcctgtgta ttttttccag gacgtggtaaaggtgactct ggatgttcag
1081  atacatgggc ataagcccgt ctctggggtg gaggtagcaccactgcagag cttcatgctg
1141  cggggtggtg ttgtagatga tccagtcgta gcaggagcgctgggcgtggt gcctaaaaat
1201  gtctttcagt agcaagctga ttgccagggg caggcccttggtgtaagtgt ttacaaagcg
1261  gttaagctgg gatgggtgca tacgtgggga tatgagatgcatcttggact gtatttttag
1321  gttggctatg ttcccagcca tatccctccg gggattcatgttgtgcagaa ccaccagcac
1381  agtgtatccg gtgcacttgg gaaatttgtc atgtagcttagaaggaaatg cgtggaagaa
1441  cttggagacg cccttgtgac ctccaagatt ttccatgcattcgtccataa tgatggcaat
1501  gggcccacgg gcggcggcct gggcgaagat atttctgggatcactaacgt catagttgtg
1561  ttccaggatg agatcgtcat aggccatttt tacaaagcgcgggcggaggg tgccagactg
1621  cggtataatg gttccatccg gcccaggggc gtagttaccctcacagattt gcatttccca
1681  cgctttgagt tcagatgggg ggatcatgtc tacctgcggggcgatgaaga aaacggtttc
1741  cggggtaggg gagatcagct gggaagaaag caggttcctgagcagctgcg acttaccgca
1801  gccggtgggc ccgtaaatca cacctattac cgggtgcaactggtagttaa gagagctgca
1861  gctgccgtca tccctgagca ggggggccac ttcgttaagcatgtccctga ctcgcatgtt
1921  ttccctgacc aaatccgcca gaaggcgctc gccgcccagcgatagcagtt cttgcaagga
1981  agcaaagttt ttcaacggtt tgagaccgtc cgccgtaggcatgcttttga gcgtttgacc
2041  aagcagttcc aggcggtccc acagctcggt cacctgctctacggcatctc gatccagcat
2101   atctcctcgt ttcgcgggtt ggggcggctt tcgctgtacggcagtagtcg gtgctcgtcc
2161   agacgggcca gggtcatgtc tttccacggg cgcagggtcctcgtcagcgt agtctgggtc
2221   acggtgaagg ggtgcgctcc gggctgcgcg ctggccagggtgcgcttgag gctggtcctg
2281   ctggtgctga agcgctgccg gtcttcgccc tgcgcgtcggccaggtagca tttgaccatg
2341   gtgtcatagt ccagcccctc cgcggcgtgg cccttggcgcgcagcttgcc cttggaggag
2401   gcgccgcacg aggggcagtg cagacttttg agggcgtagagcttgggcgc gagaaatacc
2461   gattccgggg agtaggcatc cgcgccgcag gccccgcagacggtctcgca ttccacgagc
2521   caggtgagct ctggccgttc ggggtcaaaa accaggtttcccccatgctt tttgatgcgt
2581   ttcttacctc tggtttccat gagccggtgt ccacgctcggtgacgaaaag gctgtccgtg
2641   tccccgtata cagacttgag agggagttta aacgaattcaatagcttgtt gcatgggcgg
2701   cgatataaaa tgcaaggtgc tgctcaaaaa atcaggcaaagcctcgcgca aaaaagaaag
2761   cacatcgtag tcatgctcat gcagataaag gcaggtaagctccggaacca ccacagaaaa
2821   agacaccatt tttctctcaa acatgtctgc gggtttctgcataaacacaa aataaaataa
2881   caaaaaaaca tttaaacatt agaagcctgt cttacaacaggaaaaacaac ccttataagc
2941   ataagacgga ctacggccat gccggcgtga ccgtaaaaaaactggtcacc gtgattaaaa
3001   agcaccaccg acagctcctc ggtcatgtcc ggagtcataatgtaagactc ggtaaacaca
3061   tcaggttgat tcatcggtca gtgctaaaaa gcgaccgaaatagcccgggg gaatacatac
3121   ccgcaggcgt agagacaaca ttacagcccc cataggaggtataacaaaat taataggaga
3181   gaaaaacaca taaacacctg aaaaaccctc ctgcctaggcaaaatagcac cctcccgctc
3241   cagaacaaca tacagcgctt cacagcggca gcctaacagtcagccttacc agtaaaaaag
3301   aaaacctatt aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagctcaatcagtca cagtgtaaaa
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4921   tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgccgggaagcta gagtaagtag
4981   ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgctgcagccatga gattatcaaa
5041   aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta gaaagccagtccgcagaaac ggtgctgacc
5101   ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaaaacgcaagcg caaagagaaa
5161   gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagactgggcggttt tatggacagc
5221   aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaaggttgggaagc cctgcaaagt
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5341   agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagatggattgcacg caggttctcc
5401   ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggcacaacagacaa tcggctgctc
5461   tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccggttctttttg tcaagaccga
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5701   agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacgcttgatccgg ctacctgccc
5761   attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgtactcggatgg aagccggtct
5821   tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctcgcgccagccg aactgttcgc
5881   caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtcgtgacccatg gcgatgcctg
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6001   gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacccgtgatattg ctgaagagct
6061   tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggtatcgccgctc ccgattcgca
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6181   aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaacatcccttat aaatcaaaag
6241   aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaacaagagtcca ctattaaaga
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SEQ ID：7
taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat
gagggggtgg agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg
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TTGTGTCTCT
51     AGTGAAGAGC GATCAAATTT GTATCGGCTA CCATGCCAAT AACTCAACAG
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901    CCAATGGGAG CCATTAATAG CTCAATGCCC TTCCATAATA TTCATCCATT
951    GACCATTGGG GAGTGCCCAA AGTACGTGAA GTCCAACCGC CTGGTCCTCG
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1301   TGGAAGACGG CTTCCTTGAC GTGTGGACTT ATAATGCAGA GCTGCTTGTA
1351   CTCATGGAGA ACGAGAGGAC CCTGGATTTC CACGATAGCA ACGTGAAGAA
1401   CCTTTACGAC AAGGTGAGAC TTCAGCTCCG AGACAACGCC AAGGAGCTGG
1451   GGAATGGATG CTTCGAGTTT TACCACAAAT GTGACAATGA GTGCATGGAA
1501   AGTATACGCA ACGGGACCTA CAATTACCCT CAGTATAGCG AAGAGGCTCG
1551   GCTCAAACGC GAAGAGATAA GCGGGGTGAA ATTGGAATCA ATCGGAACAT
1601   ATCAAATCCT GTCCATCTAT TCCACCGTCG CCTCTTCGCT GGCCCTCGCT
1651   ATCATGATGG CTGGTCTGTC CCTATGGATG TGTTCCAATG GAAGCCTTCA
1701   GTGCCGTATT TGTATATGAg c
GGCCGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTG
TGCCTT
CTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG
TGCCACTCCCAC
TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCT
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GGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGG
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TGATATCGAATTCGCCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGC
CAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAA
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GGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGC
CGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACATCGA
TGATATCTAAAGGGCGAATTCCTGCAGgaaacgatatgggctgaatacggatccgtat
tcagcccatatcgtttcTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGT
TGGTTTTTTGTGTGGCGGCCGCCACCGCGGTGG
agctTgtcgactcg aagatctggg cgtggttaag
421    ggtgggaaag aatatataag gtgggggtct tatgtagttttgtatctgtt ttgcagcagc
481    cgccgccgcc atgagcacca actcgtttga tggaagcattgtgagctcat atttgacaac
541    gcgcatgccc ccatgggccg gggtgcgtca gaatgtgatgggctccagca ttgatggtcg
601    ccccgtcctg cccgcaaact ctactacctt gacctacgagaccgtgtctg gaacgccgtt
661    ggagactgca gcctccgccg ccgcttcagc cgctgcagccaccgcccgcg ggattgtgac
721    tgactttgct ttcctgagcc cgcttgcaag cagtgcagcttcccgttcat ccgcccgcga
781    tgacaagttg acggctcttt tggcacaatt ggattctttgacccgggaac ttaatgtcgt
841    ttctcagcag ctgttggatc tgcgccagca ggtttctgccctgaaggctt cctcccctcc
901    caatgcggtt taaaacataa ataaaaaacc agactctgtttggatttgga tcaagcaagt
961    gtcttgctgt ctttatttag gggttttgcg cgcgcggtaggcccgggacc agcggtctcg
1021   gtcgttgagg gtcctgtgta ttttttccag gacgtggtaaaggtgactct ggatgttcag
1081   atacatgggc ataagcccgt ctctggggtg gaggtagcaccactgcagag cttcatgctg
1141   cggggtggtg ttgtagatga tccagtcgta gcaggagcgctgggcgtggt gcctaaaaat
1201   gtctttcagt agcaagctga ttgccagggg caggcccttggtgtaagtgt ttacaaagcg
1261   gttaagctgg gatgggtgca tacgtgggga tatgagatgcatcttggact gtatttttag
1321   gttggctatg ttcccagcca tatccctccg gggattcatgttgtgcagaa ccaccagcac
1381   agtgtatccg gtgcacttgg gaaatttgtc atgtagcttagaaggaaatg cgtggaagaa
1441   cttggagacg cccttgtgac ctccaagatt ttccatgcattcgtccataa tgatggcaat
1501   gggcccacgg gcggcggcct gggcgaagat atttctgggatcactaacgt catagttgtg
1561   ttccaggatg agatcgtcat aggccatttt tacaaagcgcgggcggaggg tgccagactg
1621   cggtataatg gttccatccg gcccaggggc gtagttaccctcacagattt gcatttccca
1681   cgctttgagt tcagatgggg ggatcatgtc tacctgcggggcgatgaaga aaacggtttc
1741   cggggtaggg gagatcagct gggaagaaag caggttcctgagcagctgcg acttaccgca
1801   gccggtgggc ccgtaaatca cacctattac cgggtgcaactggtagttaa gagagctgca
1861   gctgccgtca tccctgagca ggggggccac ttcgttaagcatgtccctga ctcgcatgtt
1921   ttccctgacc aaatccgcca gaaggcgctc gccgcccagcgatagcagtt cttgcaagga
1981   agcaaagttt ttcaacggtt tgagaccgtc cgccgtaggcatgcttttga gcgtttgacc
2041   aagcagttcc aggcggtccc acagctcggt cacctgctctacggcatctc gatccagcat
2101   atctcctcgt ttcgcgggtt ggggcggctt tcgctgtacggcagtagtcg gtgctcgtcc
2161   agacgggcca gggtcatgtc tttccacggg cgcagggtcctcgtcagcgt agtctgggtc
2221   acggtgaagg ggtgcgctcc gggctgcgcg ctggccagggtgcgcttgag gctggtcctg
2281   ctggtgctga agcgctgccg gtcttcgccc tgcgcgtcggccaggtagca tttgaccatg
2341   gtgtcatagt ccagcccctc cgcggcgtgg cccttggcgcgcagcttgcc cttggaggag
2401   gcgccgcacg aggggcagtg cagacttttg agggcgtagagcttgggcgc gagaaatacc
2461   gattccgggg agtaggcatc cgcgccgcag gccccgcagacggtctcgca ttccacgagc
2521   caggtgagct ctggccgttc ggggtcaaaa accaggtttcccccatgctt tttgatgcgt
2581   ttcttacctc tggtttccat gagccggtgt ccacgctcggtgacgaaaag gctgtccgtg
2641   tccccgtata cagacttgag agggagttta aacgaattcaatagcttgtt gcatgggcgg
2701   cgatataaaa tgcaaggtgc tgctcaaaaa atcaggcaaagcctcgcgca aaaaagaaag
2761   cacatcgtag tcatgctcat gcagataaag gcaggtaagctccggaacca ccacagaaaa
2821   agacaccatt tttctctcaa acatgtctgc gggtttctgcataaacacaa aataaaataa
2881   caaaaaaaca tttaaacatt agaagcctgt cttacaacaggaaaaacaac ccttataagc
2941   ataagacgga ctacggccat gccggcgtga ccgtaaaaaaactggtcacc gtgattaaaa
3001   agcaccaccg acagctcctc ggtcatgtcc ggagtcataatgtaagactc ggtaaacaca
3061   tcaggttgat tcatcggtca gtgctaaaaa gcgaccgaaatagcccgggg gaatacatac
3121   ccgcaggcgt agagacaaca ttacagcccc cataggaggtataacaaaat taataggaga
3181   gaaaaacaca taaacacctg aaaaaccctc ctgcctaggcaaaatagcac cctcccgctc
3241   cagaacaaca tacagcgctt cacagcggca gcctaacagtcagccttacc agtaaaaaag
3301   aaaacctatt aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagctcaatcagtca cagtgtaaaa
3361   aagggccaag tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaatgacgtaacg gttaaagtcc
3421   acaaaaaaca cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgcccagaaacgaaag ccaaaaaacc
3481   cacaacttcc tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgttacgtaacttcc cattttaaga
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3661   caaaataagg tatattattg atgatgttaa ttaacatgcatggatccata tgcggtgtga
3721   aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcaggcgctcttccg cttcctcgct
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4021   actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctcgtgcgctctc ctgttccgac
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4321   agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtggtggcctaact acggctacac
4381   tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagccagttaccttcg gaaaaagagt
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4621   aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagttttaaatcaa tctaaagtat
4681   atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatcagtgaggcac ctatctcagc
4741   gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactccccgtcgtgtaga taactacgat
4801   acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgataccgcgagacc cacgctcacc
4861   ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagggccgagcgca gaagtggtcc
4921   tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgccgggaagcta gagtaagtag
4981   ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgctgcagccatga gattatcaaa
5041   aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta gaaagccagtccgcagaaac ggtgctgacc
5101   ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaaaacgcaagcg caaagagaaa
5161   gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagactgggcggttt tatggacagc
5221   aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaaggttgggaagc cctgcaaagt
5281   aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgcaggggatcaa gctctgatca
5341   agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagatggattgcacg caggttctcc
5401   ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggcacaacagacaa tcggctgctc
5461   tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccggttctttttg tcaagaccga
5521   cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcgcggctatcgt ggctggccac
5581   gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcactgaagcgggaa gggactggct
5641   gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatctcaccttgctc ctgccgagaa
5701   agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacgcttgatccgg ctacctgccc
5761   attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgtactcggatgg aagccggtct
5821   tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctcgcgccagccg aactgttcgc
5881   caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtcgtgacccatg gcgatgcctg
5941   cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctggattcatcgact gtggccggct
6001   gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacccgtgatattg ctgaagagct
6061   tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggtatcgccgctc ccgattcgca
6121   gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctgaattttgttaa aatttttgtt
6181   aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaacatcccttat aaatcaaaag
6241   aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaacaagagtcca ctattaaaga
6301   acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatcagggcgatggc ccactacgtg
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6421   ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagccggcgaacgtg gcgagaaagg
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SEQ ID：8GATGGTGCTTCAAGCTAGTACttaaGTACTAGCTTGAAGCACCATC
SEQ ID：9GATGGTGCTTCAAGCTAGTACggatccGTACTAGCTTGAAGCACCATC
SEQ ID：10GAAACGATATGGGCTGAATACggatccGTATTCAGCCCATATCGTTTC
SEQ ID：11CCTAATAATTAT CAAAATGTggatccACATTTTGATAATTATTAGG
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SEQ ID：13(DS1c)
1 taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataatgagggggtgg
61     agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtgacgtagtagt gtggcggaag
121    tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacggatgtggcaaa agtgacgttt
181    ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgcgcggttttag gcggatgttg
241    tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccattttcgcgggaaaa ctgaataaga
301    ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcgtaatactgta atagtaatca
361    attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttccgcgttacata acttacggta
421    aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccattgacgtcaat aatgacgtat
481    gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtcaatgggtgga gtatttacgg
541    taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgccaagtacgcc ccctattgac
601    gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagtacatgacctt atgggacttt
661    cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctattaccatggtgat gcggttttgg
721    cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggggatttccaag tctccacccc
781    attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaacgggactttcc aaaatgtcgt
841    aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtgtacggtggga ggtctatata
901 agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat
ctGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGGAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTGC
ACTTGCAGCTGCAGATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACC
GACACTGGTGACACAGTActcgagaaga atgtgacagt gacacactct
gttaacctgc
181    tcgaagacag ccacaacgga aaactatgta gattaaaagg aatagccccactacaattgg
241    ggaaatgtaa catcgccgga tggctcttgg gaaacccaga atgcgacccactgcttccag
301    tgagatcatg gtcctacatt gtagaaacac caaactctga gaatggaatatgttatccag
361    gagatttcat cgactatgag gagctgaggg agcaattgag ctcagtgtcatcattcgaaa
421    gattcgaaat atttcccaaa gaaagctcat ggcccaacca caacacaaccaaaggagtaa
481    cggcagcatg ctcccatgcg gggaaaagca gtttttacag aaatttgctatggctgacgg
541    agaaggaggg ctcataccca aagctgaaaa attcttatgt gaacaagaaagggaaagaag
601    tccttgtact gtggggtatt catcacccgt ctaacagtaa ggatcaacagaatatctatc
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781    tgctaaaacc cggagacaca ataatatttg aggcaaatgg aaatctaatagcaccaaggt
841    atgctttcgc actgagtaga ggctttgggt ccggcatcat cacctcaaacgcatcaatgc
901    atgagtgtaa cacgaagtgt caaacacccc tgggagctat aaacagcagtctccctttcc
961    agaatataca cccagtcaca ataggagagt gcccaaaata cgtcaggagtgccaaattga
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1141    atcagaatga acagggatca ggctatgcag cggatcaaaa aagcacacaaaatgccatta
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1261   tgggtaaaga attcaacaaa ttagaaaaaa ggatggaaaa tttaaataaaaaagttgatg
1321   atggatttct ggacatttgg acatataatg cagaattgtt agttctactggaaaatgaaa
1381   ggactctgga tttccatgac tcaaatgtga agaatctgta tgagaaagtaaaaagccaat
1441   taaagaataa tgccaaagaa atcggaaatg gatgttttga gttctaccacaagtgtgaca
1501   atgaatgcat ggaaagtgta agaaatggga cttatgatta tcccaaatattcagaagagt
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CCCAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAA
CGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCG
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GGATGG GCGGCCGCtcgagcct aagcttctag ataagatatc cgatccaccg
gatctagata actgatcata
1021   atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaaaaaacctccc acacctcccc
1081   ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgttaacttgtttat tgcagcttat
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1681   tcgtttctca gcagctgttg gatctgcgcc agcaggtttctgccctgaag gcttcctccc
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1921   tcagatacat gggcataagc ccgtctctgg ggtggaggtagcaccactgc agagcttcat
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2041   aaatgtcttt cagtagcaag ctgattgcca ggggcaggcccttggtgtaa gtgtttacaa
2101   agcggttaag ctgggatggg tgcatacgtg gggatatgagatgcatcttg gactgtattt
2161   ttaggttggc tatgttccca gccatatccc tccggggattcatgttgtgc agaaccacca
2221   gcacagtgta tccggtgcac ttgggaaatt tgtcatgtagcttagaagga aatgcgtgga
2281   agaacttgga gacgcccttg tgacctccaa gattttccatgcattcgtcc ataatgatgg
2341   caatgggccc acgggcggcg gcctgggcga agatatttctgggatcacta acgtcatagt
2401   tgtgttccag gatgagatcg tcataggcca tttttacaaagcgcgggcgg agggtgccag
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2521   cccacgcttt gagttcagat ggggggatca tgtctacctgcggggcgatg aagaaaacgg
2581   tttccggggt aggggagatc agctgggaag aaagcaggttcctgagcagc tgcgacttac
2641   cgcagccggt gggcccgtaa atcacaccta ttaccgggtgcaactggtag ttaagagagc
2701   tgcagctgcc gtcatccctg agcagggggg ccacttcgttaagcatgtcc ctgactcgca
2761   tgttttccct gaccaaatcc gccagaaggc gctcgccgcccagcgatagc agttcttgca
2821   aggaagcaaa gtttttcaac ggtttgagac cgtccgccgtaggcatgctt ttgagcgttt
2881   gaccaagcag ttccaggcgg tcccacagct cggtcacctgctctacggca tctcgatcca
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3181   catggtgtca tagtccagcc cctccgcggc gtggcccttggcgcgcagct tgcccttgga
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3361   gagccaggtg agctctggcc gttcggggtc aaaaaccaggtttcccccat gctttttgat
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3661   aaaaagacac catttttctc tcaaacatgt ctgcgggtttctgcataaac acaaaataaa
3721   ataacaaaaa aacatttaaa cattagaagc ctgtcttacaacaggaaaaa caacccttat
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4381   aagaaaacta caattcccaa cacatacaag ttactccgccctaaaaccta cgtcacccgc
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4501   aatccaaaat aaggtatatt attgatgatg ttaattaacatgcatggatc catatgcggt
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7261   aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaaagccggcgaa cgtggcgaga
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SEQ ID：14 DS2β-luc
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gagggggtgg agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg
acgtagtagt gtggcggaag tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg
taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt ttggtgtgcg ccggtgtaca
caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg tagtaaattt
gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga
ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg
taatactGCTAGAgatCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTA
ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACG
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atccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttg
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ccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc
ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat
agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggca
gtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaat
ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagta
catctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaat
gggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtca
atgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactc
cgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcaga
gctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctcc
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aggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaa
ctgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctg
cctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGA
GGTCGACGGTATCGATGGGTACCGGCGGCCGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGC
TAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTT
CTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG
TGCCACTCCCAC
TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCT
ATTCTGGGGGGT
GGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGG
ATGCGGTGGGCT
CTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAACCACC
GCGGTGGCGGCCGCCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATT
TTATTTCTAGAGAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTT
CCTGCAGGAATTCGCCCTTTAGATATCATCGATGTCTCGGCGGTGGTGGCGCGTCGCG
CCGCTGGGTTTTATAGGGCGCCGCCGCGGCCGCTCGAGCCATAAAAGGCAACTTTCGG
AACGGCGCACGCTGATTGGCCCCGCGCCGCTCACTCACCGGCTTCGCCGCACAGTGCA
GCATTTTTTTACCCCCTCTCCCCTCCTTTTGCGAAAAAAAAAAAGAGCGAGAGCGAGA
TTGAGGAAGAGGAGGAGGGAGAGTTTTGGCGTTGGCCGCCTTGGGGTGCTGGGCGTCG
ACGATATCTAAGGGCGAATTCGATATCAagctagctTgtcgactcg aagatctggg
cgtggttaag
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661    ggagactgca gcctccgccg ccgcttcagc cgctgcagccaccgcccgcg ggattgtgac
721    tgactttgct ttcctgagcc cgcttgcaag cagtgcagcttcccgttcat ccgcccgcga
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1021   gtcgttgagg gtcctgtgta ttttttccag gacgtggtaaaggtgactct ggatgttcag
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1861   gctgccgtca tccctgagca ggggggccac ttcgttaagcatgtccctga ctcgcatgtt
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4021   actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctcgtgcgctctc ctgttccgac
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5101   ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaaaacgcaagcg caaagagaaa
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5821   tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctcgcgccagccg aactgttcgc
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6001   gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacccgtgatattg ctgaagagct
6061   tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggtatcgccgctc ccgattcgca
6121   gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctgaattttgttaa aatttttgtt
6181   aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaacatcccttat aaatcaaaag
6241   aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaacaagagtcca ctattaaaga
6301   acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatcagggcgatggc ccactacgtg
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6601   aggatcgaat taattcttaa t
SEQ ID：16 穿梭载体HA，CMV-luc
taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat
gagggggtgg agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg
acgtagtagt gtggcggaag tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg
taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt ttggtgtgcg ccggtgtaca
caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg tagtaaattt
gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga
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taatactGCTAGAgatCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTA
ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACG
ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTGGCCAcagagcttggcccattgcatacgttgt
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ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagta
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gctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctcc
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aggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaa
ctgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctg
cctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGA
GGTCGACGGTATcgatgcca ccATGGAGAA AATCGTCCTG TTGCTCGCTA
TTGTGTCTCT
51     AGTGAAGAGC GATCAAATTT GTATCGGCTA CCATGCCAAT AACTCAACAG
101    AGCAGGTCGA TACTATCATG GAGAAAAACG TAACAGTTAC TCATGCCCAA
151    GACATCTTGG AAAAGACCCA CAACGGCAAA CTTTGCGACC TGGATGGAGT
201    GAAGCCCCTG ATCCTCCGGG ACTGTTCAGT CGCTGGTTGG CTGCTCGGGA
251    ACCCTATGTG TGATGAGTTT ATCAACGTGC CTGAATGGTC TTACATTGTG
301    GAGAAGGCTA ACCCTACCAA TGACCTCTGC TATCCTGGGT CATTTAACGA
351    TTACGAGGAA CTGAAACACC TGTTGTCTAG AATTAACCAC TTTGAAAAGA
401    TACAGATTAT ACCCAAGTCT AGTTGGAGTG ATCACGAAGC CTCCTCAGGC
451    GTTAGCTCAG CGTGTCCCTA TCTGGGCTCT CCATCCTTCT TTAGAAATGT
501    GGTCTGGTTA ATCAAAAAGA ACAGTACCTA CCCAACCATC AAAAGTCTT
551    ATAACAATAC CAATCAGGAG GACCTGCTCG TGTTGTGGGG TATCCATCAC
601    CCGAACGACG CCGCTGAACA GACTAGGCTG TATCAGAACC CCACTACATA
651    CATCAGTATT GGCACGAGTA CTCTGAACCA GCGATTAGTG CCAAAGATTG
701    CAACACGGAG CAAAGTAAAT GGGCAATCTG GCAGGATGGA GTTTTTCTGG
751    ACAATCTTAA AACCCAACGA TGCGATAAAT TTCGAGTCCA ATGGCAATTT
801    CATCGCCCCT GAATACGCCT ATAAGATCGT GAAAAAGGGG GACTCTGCAA
851    TTATGAAGTC CGAATTAGAG TATGGCAATT GCAACACGAA GTGCCAGACA
901    CCAATGGGAG CCATTAATAG CTCAATGCCC TTCCATAATA TTCATCCATT
951    GACCATTGGG GAGTGCCCAA AGTACGTGAA GTCCAACCGC CTGGTCCTCG
1001   CAACCGGTCT AAGAAATAGC CCGCAGAGAG AATCGCGGAG GAAGAAACGT
1051   GGCCTGTTTG GCGCGATTGC CGGATTCATC GAGGGAGGCT GGCAGGGTAT
1101   GGTCGATGGT TGGTACGGAT ACCACCATAG CAACGAACAG GGGTCCGGCT
1151   ATGCAGCAGA TAAGGAGAGC ACTCAGAAAG CTATTGACGG AGTTACAAAC
1201   AAGGTTAATA GTATTATAGA TAAAATGAAC ACGCAATTCG AGGCCGTTGG
1251   GAGGGAGTTT AACAATCTGG AACGCCGGAT CGAAAATCTG AATAAGAAAA
1301   TGGAAGACGG CTTCCTTGAC GTGTGGACTT ATAATGCAGA GCTGCTTGTA
1351   CTCATGGAGA ACGAGAGGAC CCTGGATTTC CACGATAGCA ACGTGAAGAA
1401   CCTTTACGAC AAGGTGAGAC TTCAGCTCCG AGACAACGCC AAGGAGCTGG
1451   GGAATGGATG CTTCGAGTTT TACCACAAAT GTGACAATGA GTGCATGGAA
1501   AGTATACGCA ACGGGACCTA CAATTACCCT CAGTATAGCG AAGAGGCTCG
1551   GCTCAAACGC GAAGAGATAA GCGGGGTGAA ATTGGAATCA ATCGGAACAT
1601   ATCAAATCCT GTCCATCTAT TCCACCGTCG CCTCTTCGCT GGCCCTCGCT
1651   ATCATGATGG CTGGTCTGTC CCTATGGATG TGTTCCAATG GAAGCCTTCA
1701   GTGCCGTATT TGTATATGAg c
GGCCGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTG
TGCCTT
CTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG
TGCCACTCCCAC
TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCT
ATTCTGGGGGGT
GGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGG
ATGCGGTGGGCT
CTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAAAGCTtaacatcatcaataatatac
cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg
61   agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtgacgtagtagt gtggcggaag
121  tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacggatgtggcaaa agtgacgttt
181  ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgcgcggttttag gcggatgttg
241  tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccattttcgcgggaaaa ctgaataaga
301  ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcgtaatactgta atagtaatca
361  attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttccgcgttacata acttacggta
421  aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccattgacgtcaat aatgacgtat
481  gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtcaatgggtgga gtatttacgg
541  taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgccaagtacgcc ccctattgac
601  gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagtacatgacctt atgggacttt
661  cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctattaccatggtgat gcggttttgg
721  cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggggatttccaag tctccacccc
781  attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaacgggactttcc aaaatgtcgt
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cgctagAGATCTGGgaaacgatatgggctgaatacggatccgtattcagcccatatcg
tttcT CT AGA AAT AAA ATA TCT TTA TTT TCA TTA CAT CTG TGT GTT
GGT TTT TTG TGT GGC
GG CCGCtcgagcct AAGCTTctag ataagatatc cgatccaccg gatctagata
actgatcata
1021   atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaaaaaacctccc acacctcccc
1081   ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgttaacttgtttat tgcagcttat
1141   aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaaataaagcatt tttttcactg
1201   cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatcttaacgcggatc tgggcgtggt
1261   taagggtggg aaagaatata taaggtgggg gtcttatgtagttttgtatc tgttttgcag
1321   cagccgccgc cgccatgagc accaactcgt ttgatggaag cattgtgAGCTTgtcgactcg aagatctggg cgtggttaag
421    ggtgggaaag aatatataag gtgggggtct tatgtagttttgtatctgtt ttgcagcagc
481    cgccgccgcc atgagcacca actcgtttga tggaagcattgtgagctcat atttgacaac
541    gcgcatgccc ccatgggccg gggtgcgtca gaatgtgatgggctccagca ttgatggtcg
601    ccccgtcctg cccgcaaact ctactacctt gacctacgagaccgtgtctg gaacgccgtt
661    ggagactgca gcctccgccg ccgcttcagc cgctgcagccaccgcccgcg ggattgtgac
721    tgactttgct ttcctgagcc cgcttgcaag cagtgcagcttcccgttcat ccgcccgcga
781    tgacaagttg acggctcttt tggcacaatt ggattctttgacccgggaac ttaatgtcgt
841    ttctcagcag ctgttggatc tgcgccagca ggtttctgccctgaaggctt cctcccctcc
901    caatgcggtt taaaacataa ataaaaaacc agactctgtttggatttgga tcaagcaagt
961    gtcttgctgt ctttatttag gggttttgcg cgcgcggtaggcccgggacc agcggtctcg
1021   gtcgttgagg gtcctgtgta ttttttccag gacgtggtaaaggtgactct ggatgttcag
1081   atacatgggc ataagcccgt ctctggggtg gaggtagcaccactgcagag cttcatgctg
1141   cggggtggtg ttgtagatga tccagtcgta gcaggagcgctgggcgtggt gcctaaaaat
1201   gtctttcagt agcaagctga ttgccagggg caggcccttggtgtaagtgt ttacaaagcg
1261   gttaagctgg gatgggtgca tacgtgggga tatgagatgcatcttggact gtatttttag
1321   gttggctatg ttcccagcca tatccctccg gggattcatgttgtgcagaa ccaccagcac
1381   agtgtatccg gtgcacttgg gaaatttgtc atgtagcttagaaggaaatg cgtggaagaa
1441   cttggagacg cccttgtgac ctccaagatt ttccatgcattcgtccataa tgatggcaat
1501   gggcccacgg gcggcggcct gggcgaagat atttctgggatcactaacgt catagttgtg
1561   ttccaggatg agatcgtcat aggccatttt tacaaagcgcgggcggaggg tgccagactg
1621   cggtataatg gttccatccg gcccaggggc gtagttaccctcacagattt gcatttccca
1681   cgctttgagt tcagatgggg ggatcatgtc tacctgcggggcgatgaaga aaacggtttc
1741   cggggtaggg gagatcagct gggaagaaag caggttcctgagcagctgcg acttaccgca
1801   gccggtgggc ccgtaaatca cacctattac cgggtgcaactggtagttaa gagagctgca
1861   gctgccgtca tccctgagca ggggggccac ttcgttaagcatgtccctga ctcgcatgtt
1921   ttccctgacc aaatccgcca gaaggcgctc gccgcccagcgatagcagtt cttgcaagga
1981   agcaaagttt ttcaacggtt tgagaccgtc cgccgtaggcatgcttttga gcgtttgacc
2041   aagcagttcc aggcggtccc acagctcggt cacctgctctacggcatctc gatccagcat
2101   atctcctcgt ttcgcgggtt ggggcggctt tcgctgtacggcagtagtcg gtgctcgtcc
2161   agacgggcca gggtcatgtc tttccacggg cgcagggtcctcgtcagcgt agtctgggtc
2221   acggtgaagg ggtgcgctcc gggctgcgcg ctggccagggtgcgcttgag gctggtcctg
2281   ctggtgctga agcgctgccg gtcttcgccc tgcgcgtcggccaggtagca tttgaccatg
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2461   gattccgggg agtaggcatc cgcgccgcag gccccgcagacggtctcgca ttccacgagc
2521   caggtgagct ctggccgttc ggggtcaaaa accaggtttcccccatgctt tttgatgcgt
2581   ttcttacctc tggtttccat gagccggtgt ccacgctcggtgacgaaaag gctgtccgtg
2641   tccccgtata cagacttgag agggagttta aacgaattcaatagcttgtt gcatgggcgg
2701   cgatataaaa tgcaaggtgc tgctcaaaaa atcaggcaaagcctcgcgca aaaaagaaag
2761   cacatcgtag tcatgctcat gcagataaag gcaggtaagctccggaacca ccacagaaaa
2821   agacaccatt tttctctcaa acatgtctgc gggtttctgcataaacacaa aataaaataa
2881   caaaaaaaca tttaaacatt agaagcctgt cttacaacaggaaaaacaac ccttataagc
2941   ataagacgga ctacggccat gccggcgtga ccgtaaaaaaactggtcacc gtgattaaaa
3001   agcaccaccg acagctcctc ggtcatgtcc ggagtcataatgtaagactc ggtaaacaca
3061   tcaggttgat tcatcggtca gtgctaaaaa gcgaccgaaatagcccgggg gaatacatac
3121   ccgcaggcgt agagacaaca ttacagcccc cataggaggtataacaaaatt aataggaga
3181   gaaaaacaca taaacacctg aaaaaccctc ctgcctaggcaaaatagcac cctcccgctc
3241   cagaacaaca tacagcgctt cacagcggca gcctaacagtcagccttacc agtaaaaaag
3301   aaaacctatt aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagctcaatcagtca cagtgtaaaa
3361   aagggccaag tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaatgacgtaacg gttaaagtcc
3421   acaaaaaaca cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgcccagaaacgaaag ccaaaaaacc
3481   cacaacttcc tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgttacgtaacttcc cattttaaga
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3661   caaaataagg tatattattg atgatgttaa ttaacatgcatggatccata tgcggtgtga
3721   aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcaggcgctcttccg cttcctcgct
3781   cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcggtatcagctc actcaaaggc
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4021   actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctcgtgcgctctc ctgttccgac
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4501   gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagatcctttgatct tttctacggg
4561   gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggattttggtcatga gattatcaaa
4621   aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagttttaaatcaa tctaaagtat
4681   atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatcagtgaggcac ctatctcagc
4741   gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactccccgtcgtgtaga taactacgat
4801   acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgataccgcgagacc cacgctcacc
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4921   tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgccgggaagcta gagtaagtag
4981   ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgctgcagccatga gattatcaaa
5041   aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta gaaagccagtccgcagaaac ggtgctgacc
5101   ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaaaacgcaagcg caaagagaaa
5161   gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagactgggcggttt tatggacagc
5221   aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaaggttgggaagc cctgcaaagt
5281   aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgcaggggatcaa gctctgatca
5341   agagacagga tgaggat cgtttcgcatgat tgaacaagatggattgcacg caggttctcc
5401   ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggcacaacagacaa tcggctgctc
5461   tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccggttctttttg tcaagaccga
5521   cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcgcggctatcgt ggctggccac
5581   gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcactgaagcgggaa gggactggct
5641   gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatctcaccttgctc ctgccgagaa
5701   agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacgcttgatccgg ctacctgccc
5761   attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgtactcggatgg aagccggtct
5821   tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctcgcgccagccg aactgttcgc
5881   caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtcgtgacccatg gcgatgcctg
5941   cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctggattcatcgact gtggccggct
6001   gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacccgtgatattg ctgaagagct
6061   tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggtatcgccgctc ccgattcgca
6121   gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctgaattttgttaa aatttttgtt
6181   aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaacatcccttat aaatcaaaag
6241   aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaacaagagtcca ctattaaaga
6301   acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatcagggcgatggc ccactacgtg
6361   aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt cgaggtgccgtaaagctcta aatcggaacc
6421   ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagccggcgaacgtg gcgagaaagg
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6541   gcgtaaccac cacacccgcg cgcttaatgc gccgctacagggcgcgtcca ttcgccattc
6601   aggatcgaat taattcttaa t
1 taaggatccn nncctgtcct cgaccgatgc ccttgagagc cttcaacccagtcagctcct
61     tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttatgactgtcttc tttatcatgc
121    aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct gggtcattttcggcgaggac cgctttcgct
181    ggagcgcgac gatgatcggc ctgtcgcttg cggtattcggaatcttgcac gccctcgctc
241    aagccttcgt cactggtccc gccaccaaac gtttcggcgagaagcaggcc attatcgccg
301    gcatggcggc cgacgcgctg ggctacgtct tgctggcgttcgcgacgcga ggctggatgg
361    ccttccccat tatgattctt ctcgcttccg gcggcatcgggatgcccgcg ttgcaggcca
421    tgctgtccag gcaggtagat gacgaccatc agggacagcttcaaggatcg ctcgcggctc
481    ttaccagcct aacttcgatc actggaccgc tgatcgtcacggcgatttat gccgcctcgg
541    cgagcacatg gaacgggttg gcatggattg taggcgccgccctatacctt gtctgcctcc
601    ccgcgttgcg tcgcggtgca tggagccggg ccacctcgacctgaatggaa gccggcggca
661    cctcgctaac ggattcacca ctccaagaat tggagccaatcaattcttgc ggagaactgt
721    gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcgtccgccatct ccagcagccg
781    cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgggtgcgcatga tcgtgctcct
841    gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttactggttagcaga atgaatcacc
901    gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacgtctgcgacct gagcaacaac
961    atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaaacgcggaagt cagcgccctg
1021   caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctggctaccctgtg gaacacctac
1081   atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatttttctctggt cccgccgcat
1141   ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaaccgggcatgtt catcatcagt
1201   aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatcattaccccca tgaacagaaa
1261   ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaaaaaccgccct taacatggcc
1321   cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaactcaacgagct ggacgcggat
1381   gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctgatgagcttta ccgcagctgc
1441   ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacacatgcagctccc ggagacggtc
1501   acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagcccgtcagggcgc gtcagcgggt
1561   gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgtagcgatagcgg agtgtatact
1621   ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagtgcaccatatg cggtgtgaaa
1681   taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcgctcttccgct tcctcgctca
1741   ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggtatcagctcac tcaaaggcgg
1801   taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaagaacatgtga gcaaaaggcc
1861   agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggcgtttttccat aggctccgcc
1921   cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagaggtggcgaaac ccgacaggac
1981   tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgtgcgctctcct gttccgaccc
2041   tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcgggaagcgtggcg ctttctcaat
2101   gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcgctccaagctg ggctgtgtgc
2161   acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccggtaactatcgt cttgagtcca
2221   acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccactggtaacagg attagcagag
2281   cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtggcctaactac ggctacacta
2341   gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagttaccttcgga aaaagagttg
2401   gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcggtggttttttt gtttgcaagc
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cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgactgtggccggct
gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattgctgaagagct
tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctcccgattcgca
gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attttgttaaaatttttgtt
aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa catcccttataaatcaaaag
aatagaccgc gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtccactattaaaga
acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggcccactacgtg
aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt cgaggtgccg taaagctctaaatcggaacc
ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtggcgagaaagg
aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcggtcacgctgc
gcgtaaccac cacacccgcg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccattcgccattc
aggatcgaat taattcttaa ttaacatcatc aataatatac cttattttgg
attgaagcca atatgataat gagggggtgg agtttgtgac gtggcgcggg
gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag tgtgatgttg
caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt
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gcggatgttg tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt
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agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggca
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cgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcaga
gctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctcc
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aggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaa
ctgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctg
cctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGA
GGTCGACGGTATcgatgcca ccATGGAGAA AATCGTCCTG TTGCTCGCTA
TTGTGTCTCTAGTGAAGAGC GATCAAATTT GTATCGGCTA CCATGCCAAT
AACTCAACAGAGCAGGTCGA TACTATCATG GAGAAAAACG TAACAGTTAC
TCATGCCCAA
GACATCTTGG AAAAGACCCA CAACGGCAAA CTTTGCGACC TGGATGGAGT
GAAGCCCCTG ATCCTCCGGG ACTGTTCAGT CGCTGGTTGG CTGCTCGGGA
ACCCTATGTG TGATGAGTTT ATCAACGTGC CTGAATGGTC TTACATTGTG
GAGAAGGCTA ACCCTACCAA TGACCTCTGC TATCCTGGGT CATTTAACGA
TTACGAGGAA CTGAAACACC TGTTGTCTAG AATTAACCAC TTTGAAAAGA
TACAGATTAT ACCCAAGTCT AGTTGGAGTG ATCACGAAGC CTCCTCAGGC
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ggggtgagta ctccctctga aaagcgggca tgacttctgc gctaagattgtcagtttcca
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7201   gggcgcagta gtccagggtt tccttgatga tgtcatacttatcctgtccc ttttttttcc
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7621   tgcggaaggg tcccggcacc tcggaacggt tgttaattacctgggcggcg agcacgatct
7681   cgtcaaagcc gttgatgttg tggcccacaa tgtaaagttccaagaagcgc gggatgccct
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ggggtgagta ctccctctga aaagcgggca tgacttctgc gctaagattgtcagtttcca
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25021  ttaacctacc ccccaaggtc atgagcacag tcatgagtgagctgatcgtg cgccgtgcgc
25081  agcccctgga gagggatgca aatttgcaag aacaaacagaggagggccta cccgcagttg
25141  gcgacgagca gctagcgcgc tggcttcaaa cgcgcgagcctgccgacttg gaggagcgac
25201  gcaaactaat gatggccgca gtgctcgtta ccgtggagcttgagtgcatg cagcggttct
25261  ttgctgaccc ggagatgcag cgcaagctag aggaaacattgcactacacc tttcgacagg
25321  gctacgtacg ccaggcctgc aagatctcca acgtggagctctgcaacctg gtctcctacc
25381  ttggaatttt gcacgaaaac cgccttgggc aaaacgtgcttcattccacg ctcaagggcg
25441  aggcgcgccg cgactacgtc cgcgactgcg tttacttatttctatgctac acctggcaga
25501  cggccatggg cgtttggcag cagtgcttgg aggagtgcaacctcaaggag ctgcagaaac
25561  tgctaaagca aaacttgaag gacctatgga cggccttcaacgagcgctcc gtggccgcgc
25621  acctggcgga catcattttc cccgaacgcc tgcttaaaaccctgcaacag ggtctgccag
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25981  ttatcggtac ctttgagctg cagggtccct cgcctgacgaaaagtccgcg gctccggggt
26041  tgaaactcac tccggggctg tggacgtcgg cttaccttcgcaaatttgta cctgaggact
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26161  ccgcctgcgt cattacccag ggccacattc ttggccaattgcaagccatc aacaaagccc
26221  gccaagagtt tctgctacga aagggacggg gggtttacttggacccccag tccggcgagg
26281  agctcaaccc aatccccccg ccgccgcagc cctatcagcagcagccgcgg gcccttgctt
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26581  acaacctccg ctcctcaggc gccgccggca ctgcccgttcgccgacccaa ccgtagatgg
26641  gacaccactg gaaccagggc cggtaagtcc aagcagccgccgccgttagc ccaagagcaa
26701  caacagcgcc aaggctaccg ctcatggcgc gggcacaagaacgccatagt tgcttgcttg
26761  caagactgtg ggggcaacat ctccttcgcc cgccgctttcttctctacca tcacggcgtg
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26881  ggcagcggca gcggcagcaa cagcagcggc cacacagaagcaaaggcgac cggatagcaa
26941  gactctgaca aagcccaaga aatccacagc ggcggcagcagcaggaggag gagcgctgcg
27001  tctggcgccc aacgaacccg tatcgacccg cgagcttagaaacaggattt ttcccactct
27061  gtatgctata tttcaacaga gcaggggcca agaacaagagctgaaaataa aaaacaggtc
27121  tctgcgatcc ctcacccgca gctgcctgta tcacaaaagcgaagatcagc ttcggcgcac
27181  gctggaagac gcggaggctc tcttcagtaa atactgcgcgctgactctta aggactagtt
27241  tcgcgccctt tctcaaattt aagcgcgaaa actacgtcatctccagcgg ccacacccggc
27301  gccagcacct gtcgtcagcg ccattatgag caaggaaattcccacgccct acatgtggag
27361  ttaccagcca caaatgggac ttgcggctgg agctgcccaagactactcaa cccgaataaa
27421  ctacatgagc gcgggacccc acatgatatc ccgggtcaacggaatccgcg cccaccgaaa
27481  ccgaattctc ttggaacagg cggctattac caccacacctcgtaataacc ttaatccccg
27541  tagttggccc gctgccctgg tgtaccagga aagtcccgctcccaccactg tggtacttcc
27601  cagagacgcc caggccgaag ttcagatgac taactcaggggcgcagcttg cgggcggctt
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27721  tattcagctc aacgacgagt cggtgagctc ctcgcttggtctccgtccgg acgggacatt
27781  tcagatcggc ggcgccggcc gtccttcatt cacgcctcgtcaggcaatcc taactctgca
27841  gacctcgtcc tctgagccgc gctctggagg cattggaactctgcaattta ttgaggagtt
27901  tgtgccatcg gtctacttta accccttctc gggacctcccggccactatc cggatcaatt
27961  tattcctaac tttgacgcgg taaaggactc ggcggacggctacgactgaa tgttaagtgg
28021  agaggcagag caactgcgcc tgaaacacct ggtccactgtcgccgccaca agtgctttgc
28081  ccgcgactcc ggtgagtttt gctactttga attgcccgaggatcatatcg agggcccggc
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28201  ccagcgcccc ctgctagttg agcgggacag gggaccctgtgttctcactg tgatttgcaa
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28321  tattcccttt aactaataaa aaaaaataat aaagcatcacttacttaaaa tcagttagca
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29041  ccgatagcag tacccttact atcactgcct caccccctctaactactgcc actggtagct
29101  tgggcattga cttgaaagag cccatttata cacaaaatggaaaactagga ctaaagtacg
29161  gggctccttt gcatgtaaca gacgacctaa acactttgaccgtagcaact ggtccaggtg
29221  tgactattaa taatacttcc ttgcaaacta aagttactggagccttgggt tttgattcac
29281  aaggcaatat gcaacttaat gtagcaggag gactaaggattgattctcaa aacagacgcc
29341  ttatacttga tgttagttat ccgtttgatg ctcaaaaccaactaaatcta agactaggac
29401  agggccctct ttttataaac tcagcccaca acttggatattaactacaac aaaggccttt
29461  acttgtttac agcttcaaac aattccaaaa agcttgaggttaacctaagc actgccaagg
29521  ggttgatgtt tgacgctaca gccatagcca ttaatgcaggagatgggctt gaatttggtt
29581  cacctaatgc accaaacaca aatcccctca aaacaaaaattggccatggc ctagaatttg
29641  attcaaacaa ggctatggtt cctaaactag gaactggccttagttttgac agcacaggtg
29701  ccattacagt aggaaacaaa aataatgata agctaactttgtggaccaca ccagctccat
29761  ctcctaactg tagactaaat gcagagaaag atgctaaactcactttggtc ttaacaaaat
29821  gtggcagtca aatacttgct acagtttcag ttttggctgttaaaggcagt ttggctccaa
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29941  taaacaattc cttcctggac ccagaatatt ggaactttagaaatggagat cttactgaag
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30241  ttgccacatc ctcttacact ttttcataca ttgcccaagaataaagaatc gtttgtgtta
30301  tgtttcaacg tgtttatttt tcaattgcag aaaatttcaagtcatttttc attcagtagt
30361  atagccccac caccacatag cttatacaga tcaccgtaccttaatcaaac tcacagaacc
30421  ctagtattca acctgccacc tccctcccaa cacacagagtacacagtcct ttctccccgg
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30841  aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatctcacttaaatc agcacagtaa
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30961  ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcataccacaagcgcag gtagattaag
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31381  agacctcgca cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgttacattcggg cagcagcgga
31441  tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaaggaggtagacg atccctactg
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32101  ttctcaatat atctctaagc aaatcccgaa tattaagtccggccattgta aaaatctgct
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33421  ttattgatga tnnnnnttaa t

Claims (28)

1.嵌合腺病毒表达载体，所述载体包含表达盒，该表达盒包含以下元件：
(a)可操作地连接于编码toll样受体3(TLR-3)激动剂的核酸的第一启动子；和
(b)可操作地连接于编码异源多肽的核酸的第二启动子。
2.如权利要求1所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码TLR-3激动剂的核酸包括编码dsRNA的核酸。
3.如权利要求1所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码TLR-3激动剂的核酸包括选自SEQ ID NOS：3、4、5、8、9、10、11和12的序列。
4.如权利要求1所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述异源多肽是HIV包膜多肽。
5.如权利要求4所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述HIV包膜多肽选自gp41、gp120和gp160。
6.如权利要求1所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述异源多肽是流感HA多肽。
7.如权利要求1所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子和第二启动子相同。
8.如权利要求7所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子和第二启动子都是CMV启动子。
9.免疫原性组合物，包含权利要求1所述的表达载体和药物可接受的载体。
10.激发免疫反应的方法，所述方法包括给予哺乳动物个体免疫原性有效量的权利要求1所述的载体，其中所述免疫反应针对异源多肽，并且其中给药途径选自口腔、鼻内或粘膜。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述异源多肽在选自树突细胞、微褶细胞和肠上皮细胞的细胞中表达。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
13.免疫原性组合物，所述组合物包含：
(a)包含可操作地连接于编码异源多肽的核酸的启动子的嵌合腺病毒表达载体；
(b)TLR-3激动剂；和
(c)药物可接受的载体。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述启动子是CMV启动子。
15.如权利要求13所述的组合物，其中所述TLR-3激动剂选自dsRNA和聚肌胞苷酸。
16.如权利要求13所述的组合物，其中所述异源多肽是HIV包膜多肽。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述HIV包膜多肽选自gp41、gp120和gp160。
18.如权利要求13所述的组合物，其中所述异源多肽是流感HA多肽。
19.如权利要求13所述的组合物，其中所述TLR-3激动剂在所述异源多肽给药的48小时内给药。
20.如权利要求13所述的组合物，其中所述TLR-3激动剂是包括选自SEQ ID NOS：3、4、5、8、9、10、11和12的序列的核酸。
21.激发免疫反应的方法，所述方法包括给予哺乳动物个体
(a)包含可操作地连接于编码异源多肽的核酸的启动子的嵌合腺病毒表达载体；
(b)TLR-3激动剂，
其中所述免疫反应针对所述异源多肽。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述启动子选自CMV启动子和人β肌动蛋白启动子。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述异源多肽是HIV包膜多肽。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述HIV包膜多肽选自gp41、gp120和gp160。
25.如权利要求21所述的方法，其中所述异源多肽是流感HA多肽。
26.如权利要求21所述的方法，其中所述TLR-3激动剂是dsRNA。
27.如权利要求21所述的方法，其中所述TLR-3激动剂在所述嵌合腺病毒表达载体给药的48小时内给药。
28.包含在SEQ ID NO：1、2、3、7、14、15、16或17中描述的序列的分离的核酸。
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