ES2573456T3 - Vectores adenovirales quiméricos y ARNbc como agonista de TLR3 - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión adenoviral quimérico, comprendiendo dicho vector un casete de expresión que comprende los siguientes elementos: (a) un primer promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un agonista de receptor 3 tipo Toll (TLR-3), en el que el agonista de TLR-3 es ARNbc heterólogo y en el que el ácido nucleico que codifica el agonista de TLR-3 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 y 12; y (b) un segundo promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo inmunogénico.

Description

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basándose en los parámetros de programa.
Una “ventana de comparación”, como se usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas de aproximadamente 10 a aproximadamente 500, aproximadamente 25 a aproximadamente 200, 50 a aproximadamente 150, en la que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alineen óptimamente. Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son muy conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda del método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)).
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento múltiple de secuencias de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos por pares progresivos para mostrar relación y porcentaje de identidad de secuencias. También representa un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupación usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng & Doopoco, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de
5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple empieza con el alineamiento por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación se alinea entonces con la siguiente secuencia más relacionada o agrupación de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias están alineadas por una simple extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se logra por una serie de alineamientos por pares progresivo. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y designando los parámetros de programa. Usando PILEUP, una secuencia de referencia se compara con otras secuencias de prueba para determinar la relación del porcentaje de identidad de secuencias usando los siguientes parámetros: peso por hueco por defecto (3,00), peso por longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos de extremos ponderados. PILEUP puede obtenerse del paquete de software de análisis de secuencias GCG, por ejemplo, versión 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984).
Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:33893402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. El software para realizar los análisis de BLAST está públicamente disponible del Centro Nacional para Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que tanto coinciden como cumplen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de la palabra de vecindad (Altschul et al., arriba). Estos éxitos de palabra de vecindad inicial actúan de semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contienen. Los éxitos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan largo como las puntuaciones de alineamiento acumulado puedan aumentarse. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos de correspondencia; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no de correspondencia; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. Los éxitos de extensión de la palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulada disminuye la cantidad X de su máximo valor logrado; la puntuación acumulada tiende a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra de 3, y esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineamientos (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se produciría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.
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Están comercialmente disponibles varios análogos químicamente sintetizados para ARN bicatenario. Éstos incluyen poli-inosina-ácido policitidílico (poli I:C), ácido poliadenílico-poliuridílico (poli A:U), y poli I:poli C. Anticuerpos (o reticulación de anticuerpos) para TLR-3 también pueden conducir a la producción de IFN-beta o citocinas proinflamatorias [Matsumoto et al, Biochem. Biophys. Res. Common. 24:1364 (2002), de Bouteiller et al, J Biol. Chem. 18:38133-45 (2005)]. También pueden obtenerse segmentos de ARNip comercialmente disponibles de cualquier secuencia mediante fuentes tales como Invitrogen.
IV. Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los vectores descritos en el presente documento también pueden contener otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Los polipéptidos pueden, pero no necesitan, conjugarse con otras macromoléculas como se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N.º 4.372.945 y 4.474.757. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse generalmente para fines profilácticos y terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas pueden estar compuestas de métodos para proteger contra la degradación del estómago de forma que el vector adenoviral quimérico administrado pueda llegar a las localizaciones deseadas. Para el entorno oral, varias de éstas están disponibles, que incluyen los sistemas de liberación Eudragit y TimeClock, además de otros métodos específicamente diseñados para adenovirus [Lubeck et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 86(17), 6763-6767 (1989); Choraasia y Jain, J Pharm Pharm Sci, 6(1), 33-66 (2003)]. También se han descrito ya varios métodos para la microencapsulación de ADN y fármacos para administración oral (véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE.UU. N.º 2004043952). En algunas realizaciones, el sistema Eudragit se usará para administrar el vector adenoviral quimérico al intestino delgado inferior. Sin embargo, también debería funcionar la administración a otras localizaciones del intestino delgado.
Como se observa anteriormente, los vectores adenovirales quiméricos de la invención pueden administrarse usando cualquier sistema de administración conocido para aquellos expertos habituales en la materia. Numerosos técnicas de administración génica son muy conocidas en la técnica, tales como aquellas descritas por Rolland (1998) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, y referencias citadas en su interior.
Será evidente que una composición inmunogénica puede contener sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos heterólogos (por ejemplo, polipéptidos inmunogénicos). Tales sales pueden prepararse a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, que incluyen bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio). Algunos ejemplos de sales particulares incluyen solución salina tamponada con fosfato y solución salina para inyección.
Puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido para aquellos expertos habituales en la materia en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera, un tampón, un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio, o microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato-poliglicolato). Microesferas biodegradables adecuadas se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N.º 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883. El polipéptido inmunogénico y/o virus portador pueden encapsularse dentro de la microesfera biodegradable o asociarse a la superficie de la microesfera.
Tales composiciones también pueden comprender tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que convierten la formulación en isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, espesantes y/o conservantes. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado. Los compuestos también pueden encapsularse dentro de liposomas usando tecnología muy conocida.
En algunas divulgaciones, las composiciones comprenden además un adyuvante. Adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, los lípidos y compuestos no de lípido, toxina del cólera (CT), subunidad B de CT, derivado de CT CTK63, enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT), derivado de LT LTK63, Al(OH)3 y ácidos orgánicos poliiónicos como se describen en, por ejemplo, el documento WO 04/020592, Anderson y Crowle, Infect. Immun. 31(1):413-418 (1981), Roterman et al, J. Physiol. Pharmacol, 44(3):213-32 (1993), Arora y Crowle, J. Reticuloendothel. 24(3):27186 (1978), y Crowle y May, Infect. Immun. 38(3):932-7 (1982)). Ácidos orgánicos poliiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, ácido 6,6'-[3,3'-dimetil[l,r-bifenil]-4,4'-diil]bis(azo)bis[4-amino-5-hidroxi-1,3-naftaleno-disulfónico] (azul de Evans) y ácido 3,3'-[1,1'bifenil]-4,4'-diilbis(azo)bis[4-amino-1-naftalenosulfónico] (rojo Congo). Se apreciará por aquellos expertos en la materia que los ácidos orgánicos poliiónicos pueden usarse para cualquier método de vacunación genética conjuntamente con cualquier tipo de administración.
Otros adyuvantes adecuados incluyen inmunomoduladores tópicos tales como miembros de la familia de las imidazoquinolinas tales como, por ejemplo, imiquimod y resiquimod (véase, por ejemplo, Hengge et al, Lancet Infect. Dis. 1(3):189-98 (2001). También podrían usarse agonistas de TLR-3 expresados (por ejemplo, ARNbc) y agonistas
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de TLR-7 (por ejemplo, ARNmc).
Adyuvantes adecuados adicionales están comercialmente disponibles como, por ejemplo, adyuvantes basados en alumbre adicionales (por ejemplo, Alhydrogel, Rehydragel, fosfato de aluminio, Algammulin); adyuvantes basados en aceite (adyuvante incompleto de Freund y adyuvante completo (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA50 o Seppic MONTANIDE ISA 720); adyuvantes basados en copolímeros de bloque no iónicos, citocinas (por ejemplo, GM-CSF o ligando de Flat3); adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N. J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos catiónicamente o aniónicamente derivatizados; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y Quil A. Citocinas, tales como GM-CSF o interleucina-2, -7, o -12, también son adyuvantes adecuados. También pueden usarse hemocianinas (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana) y hemoeritrinas en la invención. Adyuvantes de polisacárido tales como, por ejemplo, quitina, quitosano y quitina desacetilada también son adecuados como adyuvantes. Otros adyuvantes adecuados incluyen muramil dipéptido (MDP, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina), peptidoglicanos bacterianos y sus derivados (por ejemplo, treonil-MDP y MTPPE). También puede usarse BCG y esqueleto de la pared celular de BCG (CWS) como adyuvantes, con o sin dimicolato de trehalosa. El dimicolato de trehalosa puede usarse él mismo (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º 4.579.945). También son útiles endotoxinas desintoxicadas como adyuvantes solos o en combinación con otros adyuvantes (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.º 4.866.034; 4.435.386; 4.505.899; 4.436.727; 4.436.728; 4.505.900; y 4.520.019. Las saponinas QS21, QS17, QS7 también son útiles como adyuvantes (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º5.057.540; documentos EP 0362 279; WO 96/33739; y WO 96/11711). Otros adyuvantes adecuados incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, Calif., Estados Unidos), ISCOEM (CSL), MF-59 (Chiron), la serie SBAS de adyuvantes (por ejemplo, SBAS-2, SBAS-4 o SBAS-6 o variantes de los mismos, disponibles de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa, Hamilton, Mont.) y RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont).
También se contemplan superantígenos para su uso como adyuvantes en la presente divulgación. Los superantígenos incluyen exoproteínas de Staphylococcus, tales como las enterotoxinas ,  y  de S. aureus y S. epidermidis, y las exotoxinas de E. coli , ,  y . Enterotoxinas de Staphylococcus comunes se conocen como enterotoxina estafilocócica A (SEA) y enterotoxina estafilocócica B (SEB), describiéndose las enterotoxinas hasta E (SEE) (Rott et al., 1992). Streptococcus pyogenes B (SEB), enterotoxina de Clostridium perfringens (Bowness et al., 1992), proteína asociada a la membrana citoplásmica (CAP) de S. pyogenes (Sato et al, 1994) y toxina 1 de síndrome de choque tóxico (TSST 1) de S. aureus (Schwab et al., 1993) son superantígenos útiles adicionales.
Dentro de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento, la composición de adyuvante puede diseñarse para inducir, por ejemplo, una respuesta inmunitaria predominantemente del tipo Th1 o Th2. Altos niveles de citocinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias celulares a un antígeno administrado. A diferencia, altos niveles de citocinas tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales. Tras la administración oral de una composición que comprende un polipéptido inmunogénico como se ha proporcionado en el presente documento, normalmente se provocará una respuesta inmunitaria que incluye respuestas del tipo Th1 y Th2.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que efectúa una liberación lenta de compuesto tras la administración). Tales formulaciones pueden prepararse generalmente usando tecnología muy conocida (véase, por ejemplo, Coombes et al. (1996) Vaccine 14:1429-1438). Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo dispersado en una matriz portadora y/o contenido dentro de un depósito rodeado por una membrana de control de la velocidad.
Los vehículos para su uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferentemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de componente activo. Tales vehículos incluyen micropartículas de poli(lactida-co-glicolida), además de poliacrilato, látex, almidón, celulosa y dextrano. Otros vehículos de liberación retardada incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrófilo no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico (véanse, por ejemplo, los documentos WO 94/20078; WO 94/23701; y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de la liberación, y la naturaleza de la afección que va a tratarse o prevenirse.
Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, tales como ampollas o viales sellados. Tales recipientes están preferentemente herméticamente sellados para preservar la esterilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones pueden almacenarse como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos. Alternativamente, una composición farmacéutica puede almacenarse en una condición liofilizada que requiere solo la adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes de uso.
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V. Usos terapéuticos de la invención
Un aspecto de la presente invención implica las composiciones inmunogénicas para su uso en un método de tratamiento que provoca una respuesta inmunitaria específica de antígeno de un sujeto o paciente con una enfermedad tal como, por ejemplo, una infección viral, infección bacteriana, una infección parasítica, una infección fúngica, o cáncer. Como se usa en el presente documento, un “sujeto” o un “paciente” se refiere a cualquier animal de sangre caliente, tal como, por ejemplo, un roedor, un felino, un canino o un primate, preferentemente un ser humano. Las composiciones inmunogénicas pueden usarse para tratar cualquier etapa de la enfermedad, es decir, en las etapas de pre-cáncer, cáncer o metastásicas, o para prevenir la enfermedad. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para tratar una enfermedad viral tal como VIH o hepatitis o para la prevención o tratamiento de cáncer. Dentro de tales métodos, las composiciones farmacéuticas normalmente se administran a un paciente. El paciente puede o puede no estar afectado por la enfermedad o trastorno (por ejemplo, una infección viral, una infección bacteriana, o cáncer). Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas anteriores pueden usarse para prevenir el desarrollo de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, una infección viral, una infección bacteriana, o cáncer) o para tratar un paciente aquejado con la enfermedad o trastorno (por ejemplo, una infección viral, una infección bacteriana, o cáncer). La enfermedad o trastorno puede diagnosticarse usando criterios generalmente aceptados en la materia. Por ejemplo, la infección viral puede diagnosticarse por la medición del título viral en una muestra del paciente, la infección bacteriana puede diagnosticarse detectando las bacterias en una muestra del paciente, y el cáncer puede diagnosticarse detectando la presencia de un tumor maligno. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse tanto antes de como tras la eliminación quirúrgica de tumores primarios y/o tratamiento tal como administración de radioterapia o fármacos quimioterapéuticos convencionales.
La inmunoterapia normalmente es inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmunitario del huésped endógeno para reaccionar contra, por ejemplo, tumores o células bacterianamente o viralmente infectadas, con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (composiciones que comprenden ácidos nucleicos que codifican polipéptidos inmunogénicos como se proporciona en el presente documento).
La frecuencia de administración de las composiciones profilácticas o terapéuticas como se describe en el presente documento, además de la dosificación, variará de individuo a individuo, y puede establecerse fácilmente usando técnicas convencionales. Frecuentemente pueden administrarse entre 1 y 10 dosis durante un periodo de 52 semanas. Normalmente se administran 3 dosis, a intervalos de 1 mes, más normalmente, se administran 2-3 dosis cada 2-3 meses. Es posible que los intervalos sean más probablemente una vez al año para ciertas terapias. Las vacunaciones de refuerzo pueden administrarse periódicamente a partir de aquí. Protocolos alternos pueden ser apropiados para pacientes individuales y enfermedades y trastornos particulares. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, es capaz de promover, por ejemplo, una respuesta inmunitaria antitumoral, antiviral, o una antibacteriana, y está al menos el 10-50 % por encima del nivel basal (es decir, sin tratar). Tal respuesta puede monitorizarse midiendo los anticuerpos antitumorales en un paciente o por generación dependiente de vacuna de linfocitos T citolíticos capaces de destruir, por ejemplo, las células tumorales del paciente, las células viralmente infectadas del paciente, o las células bacterianamente infectadas del paciente in vitro. Tales vacunas también deben ser capaces de causar una respuesta inmunitaria que conduzca a un desenlace clínico mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes, completas o parciales, o supervivencia libre de enfermedad más larga) en pacientes vacunados en comparación con pacientes no vacunados. Normalmente, la cantidad de los títulos virales estará entre 1,0x104 ufp/animal y 1,0x1015 ufp/animal. Tamaños de dosis adecuada variarán con el tamaño del paciente, pero normalmente oscilarán de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml, más normalmente de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 7,5 ml, lo más normalmente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 ml. Aquellos expertos en la materia apreciarán que el tamaño de dosis puede ajustarse basándose en el paciente particular o la enfermedad o trastorno particular que está tratándose. Para administración por vía oral, el vector adenoviral quimérico puede formularse convenientemente en una píldora.
En general, una dosificación apropiada y pauta de tratamiento proporciona el (los) compuesto(s) activo(s) en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. Una respuesta tal puede monitorizarse estableciendo un desenlace mejorado {por ejemplo, remisiones más frecuentes, supervivencia libre de enfermedad completa o parcial, o más larga) en pacientes tratados en comparación con pacientes no tratados. Tales respuestas inmunitarias pueden evaluarse generalmente usando ensayos de proliferación, citotoxicidad o citocinas estándar descritos anteriormente, que pueden realizarse usando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.
Por ejemplo, la detección de inmunocomplejos formados entre polipéptidos inmunogénicos y anticuerpos en líquido corporal que son específicos para polipéptidos inmunogénicos puede usarse para monitorizar la eficacia de terapia, que implica un polipéptido inmunogénico particular, para una enfermedad o trastorno en la que el polipéptido inmunogénico está asociado. Muestras de líquido corporal tomadas de un individuo antes de y posterior al inicio de la terapia pueden analizarse para los inmunocomplejos por las metodologías descritas anteriormente. Brevemente, se compara el número de inmunocomplejos detectados en ambas muestras. Un cambio sustancial en el número de inmunocomplejos en la segunda muestra (inicio post-terapia) con respecto a la primera muestra (pre-terapia) refleja
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terapia satisfactoria.
A. Administración de las composiciones de la presente invención
Según la composición para su uso en métodos de la presente invención, una composición que comprende el vector adenoviral quimérico se administra por vía oral, intranasalmente, o mucosamente, mediante, por ejemplo, la vagina, pulmones, glándulas salivales, fosas nasales, intestino delgado, colon, recto, amígdalas o parches de Peyer. La composición puede administrarse sola o con un adyuvante como se ha descrito anteriormente. En algunas divulgaciones, los adyuvantes están codificados por una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica IL-2, GM-CSF, IL-12, de flagelina bacteriana). En algunas divulgaciones, el adyuvante se administra al mismo tiempo que la composición. En otras divulgaciones, el adyuvante se administra después de la composición, por ejemplo, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 o 72 horas después de la administración de la composición.
B. Detección de una respuesta inmunitaria a antígenos de interés
Una respuesta inmunitaria al polipéptido heterólogo puede detectarse usando cualquier medio conocido en la materia que incluye, por ejemplo, detectar activación específica de linfocitos T CD4+ o CD8+ o detectar la presencia de anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido.
La activación específica de linfocitos T CD4+ o CD8+ asociados a una respuesta inmunitaria mucosa, humoral o celular puede detectarse en una variedad de formas. Métodos de detección de la activación específica de linfocitos T incluyen, pero no se limitan a, detectar la proliferación de linfocitos T, la producción de citocinas (por ejemplo, linfocinas), o la generación de actividad citolítica (es decir, generación de linfocitos T citotóxicos específicos para el polipéptido inmunogénico). Para linfocitos T CD4+, un método preferido de detección de la activación específica de linfocitos T es la detección de la proliferación de linfocitos T. Para linfocitos T CD8+, un método preferido de detección de la activación específica de linfocitos T es la detección de la generación de actividad citolítica usando ensayos de liberación de 51Cr (véase, por ejemplo, Brossart y Bevan, Blood 90(4): 1594-1599 (1997) y Lenz et al., J. Exp. Med. 192(8):1135-1142 (2000)).
La detección de la proliferación de linfocitos T puede llevarse a cabo mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de linfocitos T puede detectarse midiendo la tasa de síntesis de ADN. Los linfocitos T que se han estimulado para proliferar presentan una elevada tasa de síntesis de ADN. Una forma típica de medir la tasa de síntesis de ADN es, por ejemplo, por cultivos de linfocitos T de marcado por pulsos con timidina tritiada, un precursor de nucleósidos que se incorpora en ADN recientemente sintetizado. La cantidad de timidina tritiada incorporada puede determinarse usando un espectrofotómetro de centelleo líquido. Otras formas de detección de la proliferación de linfocitos T incluyen medir aumentos en la producción de interleucina-2 (IL-2), flujo de Ca2+ o captación de colorante, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. Alternativamente, puede medirse la síntesis de linfocinas (por ejemplo, interferón-gamma) o puede cuantificarse el número relativo de linfocitos T que pueden responder al polipéptido inmunogénico.
Las respuestas inmunitarias de anticuerpos (también conocidas como respuestas inmunitarias humorales o respuestas de linfocitos B), que incluyen respuestas de anticuerpos de la mucosa, pueden detectarse usando inmunoensayos conocidos en la técnica [Tucker et al., Mol Therapy, 8, 392-399 (2003); Tucker et al., Vaccine, 22, 2500-2504 (2004)]. Inmunoensayos adecuados incluyen la técnica de inmunoensayo de sándwich de anticuerpo monoclonal doble de David et al. (patente de EE.UU. N.º 4.376.110); ensayos de sándwich de anticuerpo monoclonal-policlonal (Wide et al., en Kirkham y Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. y S. Livingstone, Edinburgh (1970)); el método de “transferencia Western” de Gordon et al. (patente de EE.UU. N.º 4.452.901); inmunoprecipitación de ligando marcado (Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-4983); enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) como se describen, por ejemplo, por Raines et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:5154-5160; técnicas inmunocitoquímicas, que incluyen el uso de fluorocromos (Brooks et al. (1980) Clin. Exp. Immunol. 39:477); y neutralización de actividad (Bowen-Pope et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400). Además de los inmunoensayos descritos anteriormente, están disponibles varios otros inmunoensayos, que incluyen aquellos descritos en las patentes de EE.UU. N.º 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; y 4.098.876.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, la presente invención.
Ejemplo 1: Construcción de un vector adenoviral quimérico (DS1)
Para demostrar que los agonistas de TLR-3 pueden mejorar las respuestas inmunitarias adaptativas a antígenos expresados de interés, se construyeron varios vectores adenovirales quiméricos diferentes que comprendían secuencias de ácidos nucleicos que codificaban varios antígenos de interés diferentes. En este ejemplo, el ácido nucleico que codifica gp120 (del NIH AIDS Reagent and Reference Reagent Program) se puso bajo el control de un promotor del CMV con un pequeño intrón justo en la dirección 5’ del codón de iniciación en el vector lanzadera
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Claims (1)

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