KR102396817B1

KR102396817B1 - 소장 전달을 위한 제형들

Info

Publication number: KR102396817B1
Application number: KR1020167024704A
Authority: KR
Inventors: 션 터커; 조지 트래거
Original assignee: 박사르트, 인크.
Priority date: 2014-02-20
Filing date: 2015-02-20
Publication date: 2022-05-11
Also published as: JP2021038243A; CA2939581C; JP6797692B2; US20170224805A1; JP2017506265A; EP3107568A1; EA201691458A1; AU2015218769B2; EP3107568A4; CN106255508B; JP7168633B2; KR20170007726A; CA2939581A1; CN106255508A; AU2015218769A1; IL247301B; EP4353255A2; IL247301A0; EA033248B1; ZA201605787B

Abstract

인간 내에 면역원성 반응을 발생시키기 위한 조성물들 및 방법들이 여기에 제공된다. 이러한 조성물들은 (ii) 인간의 회장에 대한 면역원성 생물 작용제의 전달을 안내하는 약제에 포함되는 면역원성 생물 작용제를 포함하며, 여기서 약제 (ii)는 5.8-6.8의 문턱 pH를 가지는 장용성 코팅(예를 들면, 유드라지트®)이다. 또한, 예를 들면, 백신들을 위해 이러한 조성물들을 설계하기 위한 방법들이 제공된다.

Description

소장 전달을 위한 제형들{FORMULATIONS FOR SMALL INTESTINAL DELIVERY}

본 발명은 인간 내에 면역원성 반응을 발생시키기 위한 조성물들 및 방법들에 관한 것이다.

본 출원은 2014년 2월 20일에 출원되고, 그 개시 사항들이 전체적으로 여기에 참조로 포함되는 미국 임시 특허출원 제61/942,386호를 우선권으로 수반하는 출원이다.

백신(vaccine)들은 많은 질병들과 장애들(예를 들면, 바이러스 감염, 세균 감염 및 암)을 방지하거나 및/또는 치료하기 위한 중요한 수단들이다. 백신접종은 통상적으로 주사를 이용하여 수행되며, 이는 백신접종 장소까지의 이동 및 주사에 대한 혐오감으로 인해 참여를 감소시킨다. 또한, 백신들의 주사는 주사기들 및 바늘들과 같은 살균 키트들과 투여에 숙련된 의료인을 요구한다.

인플루엔자(influenza) 백신에 대하여, 시장의 요구를 충족시키도록 충분한 바이러스를 수확하고 처리하기 위해 충분한 수정란을 수집하는 대규모의 캠페인들이 매년 수행된다. 세포 배양 또는 식물 유래된 혈구응집소(hemagglutinin: HA)는 계란 수집과 처리의 부담을 감소시킬 수 있지만, 이러한 접근들은 여전히 생물학적 위험물로서의 폐기가 필요한 개개의 주사기 바늘들을 생성하기 위해 값비싼 살균 충전 및 완성을 요구한다. 세계적인 유행 동안에, 학교들이 휴교할 수 있고, 사회적 격리가 명령될 수 있으며, 아직 많은 인플루엔자 면역접종은 통상적으로 대상들이 주사를 위해 진료소에 대기하게 한다. 인플루엔자 또는 다른 병원체들을 위한 경구 백신들은 대부분의 사람 대 사람의 접촉을 피하도록 우편을 통해 보내질 수 있었다. 또한, 정제화는 요구되는 백신들을 주사하는 값비싼 살균 충전 및 완성을 요구하지 않는 신속하고 위생적인 과정이다.

비경구적이 아닌 방식, 예를 들면, 경구로나 점막으로 전달될 수 있는 백신들은 미국 특허 제8,222,224호에 기재되어 있다.

특히 대상의 회장(ileum)에 대한 면역원성 생물 작용제(immunogenic biological agent)의 전달을 포함하는 대상(subject)(인간 또는 비인간)의 보다 효과적인 백신접종을 위한 방법들 및 조성물들이 여기에 제공된다. 본 발명은 이에 따라 보다 효율적이고 효과적인 백신들을 제공하며, 인간들에 대한 이들의 실효성을 입증한다.

상기 대상의 회장에 대한 상기 면역원성 생물 작용제의 전달을 안내하는 약제(agent)들에 포함되는 면역원성 생물 작용제를 포함하는 대상 내에 면역 반응을 유발하기 위한 면역원성 조성물들이 여기에 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 대상은 인간이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 대상은 비인간 동물, 예를 들면, 영장류, 마우스(mouse), 랫(rat), 토끼, 말, 개, 고양이 또는 가금류이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 생물 작용제는 면역원성 폴리펩티드(immunogenic polypeptide)(예를 들면, 바이러스 유사 입자, 당단백질(glycoprotein), 인단백질(phosphoprotein)), 탄수화물 및 지질로부터 선택된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 생물 작용제는 면역원성 폴리펩티드(polypeptide)를 인코드(encode)하는 발현 벡터(expression vector)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스(adenovirus), AAV, 레트로바이러스(retrovirus) 또는 렌티바이러스(lentivirus))벡터이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 약화되거나, 복제 불능이 된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 발현 벡터는 면역원성 폴리펩티드 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터(promoter)(예를 들면, CMV, SV40 조기 또는 후기, β-액틴(actin) 등)를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 발현 벡터는 이중 가닥(dsRNA)을 더 인코드한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 dsRNA 인코딩 서열은 작동 가능하게 연결되는 프로모터, 예를 들면, 상기 면역원성 폴리펩티드를 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터로서 동일한 프로모터(내부 리보솜 결합 부위(Internal Ribosomal Entry Site: IRES))를 이용하는) 또는 상이한 프로모터이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 적어도 하나의 보조제(adjuvant), 예를 들면, TLR3 작용제(agonist)를 더 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 TLR3 작용제는 dsRNA 또는 dsRNA 모방이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 생물 작용제의 적어도 50%, 예를 들면 투여된 조성물 내에 존재하는 상기 면역원성 생물 작용제의 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상이 상기 회장에 전달(방출)된다. 일부 실시예들에 있어서, 전달을 안내하는 약제(예를 들면, 장용성 코팅(enteric coating) 또는 매트릭스(matrix))는 상기 면역원성 조성물이 상기 회장에 도달하기 전에 용해되기 시작하지만, 상기 면역원성 조성물이 상기 회장에 도달할 때까지 상기 면역원성 생물 작용제의 적어도 50% 이상을 유지한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전달을 안내하는 약제는 위장(stomach), 십이지장(duodenum) 및 공장(jejunum)을 거쳐 상기 면역원성 생물 작용제를 유지하지만, 상기 회장 내에 상기 면역원성 생물 작용제를 방출한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 전달을 안내하는 약제는 장용성 코팅이다. 즉, 상기 면역원성 생물 작용제는 장용성 코팅으로 커버된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 pH≥5에서, 예를 들면, 5.2, 5.5, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 7.0, 5.5-6.8, 5.8-6.8 등에서 분해된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 메타크릴산(methacrylic acid)-에틸 아크릴레이트(ethyl acrylate) 공중합체(copolymer)(예를 들면, 1：1), A형; 메타크릴산 공중합체, C형; 메타크릴(methacrylic) 공중합체 A형 및 C형의 혼합물; 그리고 타임 클록®(Time Clock®)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(cellulose acetate phthalate: CAP)를 포함하지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 상기 회장 내에 상기 면역원성 생물 작용제의 방출을 가져오는 두께이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 제곱센티미터 당 5.5밀리그램-10밀리그램의 커버리지를 갖는 메타크릴산 공중합체계이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전달을 안내하는 약제는 무선 조정되는 캡슐이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 폴리(poly)(메타크릴산(methacrylic acid)-코(co)-메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate)) 1：1을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®(Eudragit®) L-100을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100, 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate) 및 탈크(talc), 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 1-4파트(part)의 유드라지트®L-100, 1-2파트의 트리에틸 시트레이트 및 1-2파트의 탈크를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 장용성 코팅은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：1 및 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트 1：1의 혼합물을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1：1에 대한 폴리(메타크릴산-코(co)-메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate)) 1：1의 비율은 1：4 내지 4：1, 예를 들면, 1：3, 1：2, 1：1, 2：1, 3：1 등이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100 및 유드라지트®L100-55의 혼합물을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100 및 유드라지트®L100-55, 트리에틸 시트레이트 및 탈크, 예를 들면, 1-4파트의 유드라지트®L-100와 유드라지트®L100-55, 1-2파트의 트리에틸 시트레이트 및 1-2파트의 탈크를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：1 및 폴리(메타실산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：2를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 폴리(메타크릴산-코-메틸 아크릴레이트(methyl acrylate)) 1：2에 대한 폴리(메타실산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：1의 비율은 1：2 내지 2：1이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100 및 유드라지트®S100의 혼합물을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100 및 유드라지트®S100, 트리에틸 시트레이트 및 탈크, 예를 들면, 1-4파트의 유드라지트®L-100과 유드라지트®S100, 1-2파트의 트리에틸 시트레이트 및 1-2파트의 탈크를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：2 및 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1：1의 혼합물을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：2 및 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1：1의 비율은 1：4 내지 4：1, 예를 들면, 1：3, 1：2, 1：1, 2：1 또는 3：1이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100-55 및 유드라지트®S100의 혼합물을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100-55와 유드라지트®S100, 트리에틸 시트레이트 및 탈크, 예를 들면, 1-4파트의 유드라지트®L-100-55와 유드라지트®S100, 1-2파트의 트리에틸 시트레이트 및 1-2파트의 탈크를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 정제(tablet) 또는 캡슐(capsule)의 형태, 예를 들면, 장용성 코팅에 의해 커버되는 압축된 정제의 형태이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 젤라틴(gelatin), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose), 녹말 또는 풀루란(pullulan)을 포함하는 중합체 캡슐 내에 캡슐화된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 직경이 2㎜ 보다 작은 마이크로입자들의 형태이며, 예를 들면, 각 마이크로입자는 여기에 기재되는 바와 같은 장용성 코팅으로 덮인다.

면역원성 조성물을 대상의 회장에 전달하는 방법이 더 제공되며, 상기 방법은 상술한 바와 같은 면역원성 조성물(즉, 상기 회장에 대한 상기 면역원성 생물 작용제의 전달을 안내하는 약제에 포함되고, 보조제를 선택적으로 포함하는 면역원성 생물 작용제)을 상기 대상에 경구로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 대상은 인간이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 대상은 비인간의 동물이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 회장으로 안내되지 않은 동일한 면역원성 조성물이 투여된 대상(다른 시간에서의 동일한 대상 또는 다른 대상) 내의 면역 반응보다 적어도 10%, 예를 들면, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 100% 또는 그 이상 높은 대상 내의 면역 반응을 가져온다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 대상 내의 면역 반응은 상기 회장으로 안내되지 않은 동일한 면역원성 조성물이 투여된 대상(다른 시간에서의 동일한 대상 또는 다른 대상) 내의 면역 반응보다 적어도 1.5-폴드(fold)(예를 들면, 2-폴드, 2.5-폴드, 5-폴드 또는 그 이상) 높다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 면역원성 생물 작용제에 대해 특이적인 항체들의 증가이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역 반응은 세포 면역 반응, 예를 들면,IFN-g와 같은 시토카인(cytokine)들의 증가이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역 반응은 면역 접종(immunization)(예를 들면, 상기 대상이 상기 면역원성 생물 작용제가 유래되었던 바이러스, 박테리아 등에 의한 감염에 저항한다)이다.

대상 내에 증가된 면역 반응을 유발하는 방법들이 더 제공되며, 상기 방법들은 상술한 바와 같은 면역원성 조성물(즉, 상기 회장에 대한 상기 면역원성 생물 작용제의 전달을 안내하는 약제에 포함되고, 선택적으로는 보조제를 포함하는 면역원성 생물 작용제)을 상기 대상, 예를 들면, 인간 대상에 경구로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 회장으로 안내되지 않은 동일한 면역원성 조성물이 투여된 대상(다른 시간에서의 동일한 대상 또는 다른 대상) 내의 면역 반응에 비하여 적어도 10%, 예를 들면, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 100% 또는 그 이상 증가된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 대상 내의 면역 반응은 상기 회장으로 안내되지 않은 동일한 면역원성 조성물이 투여된 대상(다른 시간에서의 동일한 대상 또는 다른 대상) 내의 면역 반응에 비하여 적어도 1.5-폴드(예를 들면, 2-폴드, 2.5-폴드, 5-폴드 또는 그 이상) 증가된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 면역원성 생물 작용제에 대해 특이적인 항체들의 증가이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역 반응은 세포 면역 반응, 예를 들면 IFN-g와 같은 시토카인들의 증가이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역 반응은 면역 접종(예를 들면, 상기 대상이 상기 면역원성 생물 작용제가 유래되었던 바이러스, 박테리아 등에 의한 감염에 저항한다)이다.

도 1. HA에 특이적인 항체 분비 세포(ASC)들이 대상들에게 rAd-HA-dsRNA를 함유하는 무선 조정되는 캡슐이 주어졌던 후의 7일에 말초 혈액 내에서 측정되었다. 대상들은 상기 회장 또는 공장 내에 방출된 백신을 가지도록 임의 추출되었다(그룹 당 N=12). 결과들은 상기 회장에 전달된 백신을 갖는 12의 대상들의 12가 HA를 인식하는 항체 분비 B 세포들을 발생시킬 수 있었던 반면, 상기 공장에 전달된 백신을 갖는 12의 대상들의 9만이 항원 특이적 B 세포들을 발생시킬 수 있었다. IgA 및 IgG ASC들의 평균 숫자는 상기 공장보다 상기 회장에 대해 상당히 높았었다.
도 2. rAd-HA-dsRNA에 대한 T 세포 반응이 투여 후의 7일에 IFN-γ 레벨들을 검출하여 판단되었다. 회장 전달 그룹 내의 모든 개체들은 공장 전달 그룹의 75%에 비해 높은 IFN-γ의 레벨들을 나타내었다. IFN-γ 레벨의 평균 숫자 또한 회장 전달 그룹에서 상당히 높았다.
도 3. 인플루엔자 A/CA/07/2009에 대한 마이크로중화 항체(MN) 반응들이 면역 접종 후 0일 및 28일에 측정되었다. MN 역가들의 폴드 증가는 40 보다 작거나 같은 초기 MN 역가를 가졌던 각각의 대상들에 대해 도표로 도시되었다. 결과들은 공장 전달(10 중의 6)과 비교하여 면역 접종에 후속하는 증가된 MN 역가들을 가지는 대상들의 많은 부분(10 중의 9)을 가져왔던 점을 보여주었다.
도 4. 정제들은 미세결정 셀룰로오스 및 녹말을 이용하여 방사선 불투과성 물질로서 10%의 황산바륨을 갖게 만들어졌다. 이들 정제들은 유드라지트 L100®으로 장용 코팅되었고, 경구 위관으로 암컷 사이놀몰구스 마카크들에게 주어졌다. X-선들은 투여 후의 시간에 걸쳐 취해졌다. A. 정제를 향하는 화살표로써 위장 내의 정제. B. 한 시간 후, 화살표가 이를 향하는 척추 좌측에 대한 백색 반점으로써 상기 정제는 장 내에서 볼 수 있다. 이는 장 내에서 다음 두 시간 이내에 용해되었고, 볼 수 없다.
도 5. ASC들의 숫자는 각 면역 접종 후 7일 후에 7일 및 35일째에 보고된다. 0일에서 배경 ASC들은 극소였고, 도표로 도시되지 않았다. 7일 동안의 평균 반응들이 수평한 선으로 각 치료된 그룹에 대해 도시된다.
도 6. 각각의 대상들에 대해 MN 역가들의 폴드 증가. 어둡게 칠해진 칼럼들은 역가들이 28일 및 56일 사이에 상승되었던 경우를 나타내는 반면, 밝게 칠해진 칼럼들은 초기 면역 접종 후의 반응을 나타낸다. 선은 검출 가능한 중화 항체 반응을 보였단 대상들을 나타내도록 MN의 2 폴드 증가들에서 도시되었다. 플라세보 그룹에서 반응한 대상들은 없었던 반면, 낮은 투여량에서 3의 대상들 및 높은 투여량 그룹에서 7의 대상들이 면역 접종 후에 인플루엔자에 대해 2-폴드 또는 그 이상의 중화 항체 반응을 보였다. 플라세보(placebo) N=10, 낮은 투여량 및 높은 투여량 N=11.
도 7. 단일 경구 면역 접종에 후속하는 항체 반응들. A. 면역 접종 전후(각기 0일 및 28일)에 HAI 항체 역가들이 각각의 대상들에 대해 도시된다. B. 시간에 대한 HAI 기하평균 역가(GMT)들. HAI 역가들은 항체 반응의 지속성을 평가하기 위해 면역 후 0개월, 1개월 및 6개월에서 측정되었다. C. 면역 전후에 MN 역가들이 각각의 대상들에 대해 도시된다. D. 면역 접종에 후속하는 ASC 반응들. IgG 및 IgA ASC들의 숫자는 면역 접종 후의 7일에 보고된다(10⁶의 PMBC들 당).

본 발명자들은 소장의 특정 부분, 즉 회장(ileum)에 대한 면역원성 생물 작용제(immunogenic biological agent)의 전달이 약제(agent)가 표적화되지 않거나, 다른 부위를 표적으로 할 때보다 큰 치료 반응의 결과로 되는 점을 발견하였다. 이는 보다 효과적인 백신들의 설계, 물질들에 대한 감소된 비용 및 수용자에 대해 감소된 부작용들을 가능하게 한다.

I. 정의들

"면역원성(immunogenic)"이라는 용어는 숙주 내에 체액 또는 세포 매개의 면역 반응을 일으키는 약제의 능력을 언급한다. 면역원성 약제들은 통상적으로, 예를 들면, 다른 종들로부터 또는 박테리아, 바이러스 혹은 진균들로부터의 숙주에 대한 "이물질(foreign)"이다. 비-이물질 약제는, 예를 들면, 자가면역 반응의 경우에 면역원성이다. 특정한 암 세포-특이적 약제들이 면역원성 약제들로서 개발될 수 있고, 숙주의 면역 체계가 암을 공격하게 한다.

"생물 작용제(biological agent)"라는 용어는 핵산, 폴리펩티드, 당단백질(glycoprotein), 탄수화물, 지질 또는 이들의 변형된 형태(예를 들면, 메틸화, 글리코실화, 검출 가능한 표지)를 언급한다. 생물 작용제들은 이들이 화학적 합성 대신에 생물학적 과정들(재조합 기수들을 포함하는)에 의해 생성될 수 있는 점에서 작은 분자의 약물들과 구별된다. 그러나, 생물 작용제들은 화학적으로 변형될 수 있거나, 비천연의 뉴클레오티드(nucleotide)들 또는 아미노산들을 포함할 수 있다. 생물 작용제들은 또한, 예를 들면, 비자연적으로 생성되는 재조합이나 키메라 단위(entity)들 일 수 있다.

여기에 사용되는 바에 있어서, "면역원성 생물 작용제(immunogenic biological agent)"는 항원(예를 들면, T 세포 수용체 또는 항체에 의해 인식되는)으로 직접적으로 작용하는 약제, 또는 세포 내에서 발현되면 항원으로 작용하는 약제를 언급한다. 예를 들면, 면역원성 생물 작용제는 면역원성 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.

"항원(antigen)"이라는 용어는 폴리펩티드, 당단백질, 지방단백질(lipoprotein), 지질, 탄수화물 또는 T 세포 수용체 및/또는 항체에 의해 결합되는(예를 들면, "이물질"로 인식되는) 다른 약제를 언급한다. 항원들은 통상적으로 박테리아, 바이러스 또는 진균 소스들로부터 유래된다. "유래되는(derived from)"이라는 용어는 상기 항원이 존재할 때에 본질적으로 천연 항원 구조로 존재하거나, 가장 면역원성인 부분만을 포함하거나 다름 잠재적으로 유해한 연관 성분들 등이 제거되도록 특정한 조건들 하에서 발현되게 변경되었던 것을 나타낸다.

여기에 기재되는 바와 같은 조성물의 "면역원적인 유효 투여량 또는 유효량(immunogenically effective dose or amount)"은 백신접종을 위해 선택된 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 유발하거나 조절하는 양이다. 면역 반응들은 체액 면역 반응들 및 세포 매개 면역 반응들을 포함한다. 면역원성 조성물은 임의의 단계에서 질병을 치료 또는 방지하도록 치료적으로나 예방적으로 사용될 수 있다.

"체액 면역 반응들(humoral immune responses)"은 혈액의 세포가 없는 성분들, 예를 들면, 혈장 또는 혈청에 의해 매개되며; 하나의 개체로부터 다른 하나로의 혈청이나 혈장의 전달은 체액 면역을 전달한다. 체액 면역 반응들은 통상적으로, 예를 들면, B 세포 매개 항체 생산이다.

"세포 매개 면역 반응들(cell mediated immune responses)"은 항원 특이적 림프구들에 의해 매개되며, 하나의 개체로부터 다른 하나로의 항원 특이적 림프구들의 전달은 면역을 전달한다. 세포 매개 면역 반응들은 T 세포들에 의해 적어도 부분적으로 매개되며, 예를 들면, T 세포-특이적 시토카인들 또는 T 세포 성장의 증가를 검출함에 의해 검출될 수 있다

"회장(ileum)"은 십이지장(duodenum) 및 공장(jejunum)과 함께 소장을 형성하는 세 가지 분절들의 가장 긴 것이다. 이는 상기 공장과 맹장(cecum) 사이에 말단 부분을 구성한다.

장용성 코팅(enteric coating)은 상기 치료제가 내부의 위장 및 십이지장의 낮은 pH 환경(-pH 3)에서 소화되는 것을 방지하는 경구 약들에 적용되는 장벽이다.

장용성 코팅, 매트릭스(matrix) 또는 캡슐과 같은 약제는 적어도 60%, 예를 들면, 치료제의 최초 투여량의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%가 상기 약제 내에 포함되거나 내장되어 남을 때에 포함되거나 내장된 치료제를 유지하는 것으로 말해진다. 상기 약제, 예를 들면, 장용성 코팅 또는 매트릭스는 통상적으로 특정한 조건들 하에서 분해되도록 설계되며, 상기 치료제를 방출한다. 분해는, 예를 들면, 보다 두껍거나 보다 화학적으로 복잡한 코팅의 경우에 점진적이 될 수 있다. 상기 장용성 코팅은 코팅 두께가 최초 투여 두께와 비교하여 적어도 10%, 예를 들면, 적어도 25%, 50% 또는 75% 감소되면 "분해되는(disintegrate)" 것으로 말해진다. 분해는 조건들에 따라 다른 시간 과정에 걸쳐 일어날 수 있기 때문에 절대적인 용어는 아니다. 예를 들면, pH 6.5에서 5분 내에 분해되도록 설계되는 코팅은 비록 느릴지라도, pH 6에서 분해될 수 있다(예를 들면, 1시간 이내). 분해가 반드시 포함되거나 내장된 치료제가 방출되는 것을 나타내지는 않는다. 그러나, 상기 치료제는 상기 장용성 코팅 또는 매트릭스가 전체적으로 분해되기 전에 방출되기 시작할 수 있다.

예를 들면, 핵산, 단백질 또는 벡터, 에 대해 참조로 여기서 사용되는 바와 같은 "키메라의(chimeric)" 또는 "재조합의(recombinant)"이라는 용어들은 상기 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입이나 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었던 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들면, 키메라 및 재조합 벡터들은 상기 벡터의 자연(비키메라 또는 비재조합) 내에서는 발견되지 않는 핵산 서열들을 포함한다. 키메라 바이러스 발현 벡터는 이종(예를 들면, 면역원성) 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터로 언급된다.

"발현 벡터(expression vector)"는 숙주 세포 내에 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정 핵산 원소들을 갖는 재조합으로나 합성적으로 생성된 핵산 구조체이다. 상기 발현 벡터는 플라스미드(plasmid), 바이러스, 또는 핵산 조각(fragment)의 일부가 될 수 있다. 통상적으로, 상기 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결되게 전사되는 핵산을 포함한다. 바이러스 발현 벡터들은 통상적으로 복제 불능이 되거나 약화된다. 바이러스-유래된 벡터는, 이들 수반이 생략될 수 있지만, 원하는 서열의 발현을 위해 요구되는 발현 벡터의 성분들, 예를 들면, 복제 또는 다른 병원성 효과들을 포함할 수 있다.

"프로모터(promoter)" 및 "발현 대조 서열(expression control sequence)"라는 용어들은 여기에 사용되는 바에 있어서 핵산의 전사를 안내하는 핵산 대조 서열을 언급한다. 프로모터 서열들은 통상적으로 중합효소(polymerase) II형 프로모터의 경우에 TATA 요소와 같은 전사의 개시 부위에 가깝다. 프로모터는 또한 상기 전사의 개시 부위로부터 수천의 염기쌍들만큼 많이 위치할 수 있는 원위 인헨서(enhancer) 또는 리프레서(repressor) 요소들을 포함할 수 있다. 프로모터들은 구성적 및 유도 가능 프로모터들을 포함한다. "구성적(constitutive)" 프로모터는 가장 환경적이고 발달적인 조건들 하에서 활성인 프로모터이다. "유도 가능한(inducible)" 프로모터는 환경적 또는 발달적 조절 하에서 활성인 프로모터이다. "작동 가능하게 연결되는(operably linked)"이라는 용어는 핵산 발현 대조 서열(프로모터 또는 전사 인자 결합 부위들의 배열과 같은) 및 제2의 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 언급하며, 여기서 상기 발현 대조 서열은 상기 제2의 서열에 대응되는 핵산의 전사를 안내한다.

"이종(heterologous)"이라는 용어는 핵산이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 또는 그 이상의 하위 서열들을 포함하는 것을 나타내는 핵산의 부분들을 참조하여 사용될 때에 언급된다. 예를 들어, 상기 핵산은 통상적으로 재조합으로 생성되어, 새로운 기능성 핵산, 예를 들면, 하나의 소스로부터의 프로모터 및 다른 소스로부터의 코드 영역을 만들도록 정렬되는 관련되지 않은 유전자들로부터의 둘 또는 그 이상의 서열들을 가진다. 유사하게, 단백질의 이종 부분들은 상기 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 또는 그 이상의 하위 서열들(예를 들면, 융합 단백질) 포함하는 것을 나타낸다. 이종 핵산 또는 단백질은 자연에서 특정한 환경, 예를 들면, 인간 세포 내의 이종 마우스 단백질에서 발견되지 않는 것이다.

"핵산(nucleic acid)" 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"라는 용어들은 여기서는 단일 또는 이중 가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)들 또는 리보뉴클레오티드들의 중합체들을 상호 교환적으로 언급하는 데 사용된다. 상기 용어들은 유전자들, cDNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들(짧은 폴리뉴클레오티드들)을 포괄한다. 상기 용어들은 알려진 뉴클레오티드 유사체들 또는 변형된 골격 잔기들이나 연결들을 함유하는 핵산들을 포괄하며, 이들은 합성되고, 자연적으로 생성되며, 비자연적으로 생성되고 기준 핵산과 유사한 결합 성질들을 가지며, 기준 뉴클레오티드들과 유사한 방식으로 대사 작용을 한다. 이러한 유사체들의 예들은, 한정되지 않고, 포스포로티오에이트(phosphorothioate)들, 포스포라미데이트(phosphoramidate)들, 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate)들, 키랄(chiral)-메틸 포스포네이트들, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드(methyl ribonucleotide)들, 펩티드-핵산(PNA)들을 포함한다. "뉴클레오티드(nucleotide)"라는 용어는 통상적으로 핵산 단위체를 언급한다.

다르게 기재되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체들(예를 들면, 변성 코돈(codon) 치환들) 및 상보적 서열들뿐만 아니라 명확하게 나타난 서열을 포괄한다. 특히, 변성된 코돈 치환들은 하나 또는 그 이상의 선택된(또는 모든) 코돈들의 제3의 부분이 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신(deoxyinosine) 잔기들로 치환되는 서열들을 발생시켜 구현될 수 있다(Batzer 등의 "Nucleic Acid Res."(19:5081, 1991); Ohtsuka 등의 "J. Biol. Chem."(260:2605-2608, 1985); Rossolini 등의 "Mol. Cell. Probes"(8:91-98, 1994)).

여기에 기재되는 바와 같은 조성물의 "치료적 투여량(therapeutic dose)" 또는 "치료적 유효량((therapeutically effective amount)" 또는 "유효량(effective amount)"은 백신접종(예를 들면, 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 암)을 위해 선택된 항원의 소스와 연관된 질병들 및 장애들의 증상들의 중증도(severity)를 방지하거나, 완화시키거나, 약화시키거나, 감소시키는 양이다.

"항체(antibody)"라는 용어는 특히 항원과 결합하고 인식하는 면역글로불린(immunoglobulin) 유전자 또는 이의 조각들에 의해 인코드되는 폴리펩티드를 언급한다. 면역글로불린 서열들은 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변부 서열들뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변부 서열들을 포함한다. 경쇄들은 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄들은 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이들은 순차적으로 각기 면역글로불린 클래스들, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.

T 세포들은 유전자들의 패밀리에 의해 인코드되는 특정 수용체(T 세포 수용체)를 발현시키는 림프구들의 특정한 클래스를 언급한다. 상기 인식된 T 세포 수용체 유전자들은 알파, 베타, 델타 및 감마 자리들을 포함하며, 상기 T 세포 수용체들은 통상적으로(그러나 보편적이지는 않게) MHC 플러스 짧은 펩티드의 결합을 인식한다. T 세포들은 통상적으로 T 도움 세포(helper cell)들(CD4+) 및 세포독성 T 세포들(CD8+)로 넓게 분류된다. 항체들은 B 세포들, 예를 들면, 항체 분비 세포(Antibody Secreting Cell: ASC)들에 의해 자연적으로 생성된다. 성숙 B 세포들은 자연의 형질 B 세포들(활성화되고 항체를 생성하는), 기억, B-1, 가장자리 구역(marginal-zone) B 세포들, 소포성(follicular) B 세포들, 그리고 조절 B 세포들이 될 수 있다.

적응 면역 반응은 항원의 T 세포 및/또는 B 세포 및/또는 항체 인식을 언급한다.

항원 표출 세포(antigen presenting cell: APC)들은 면역 반응을 활성화하거나 향상시키도록 T 세포들에 면역원성 펩티드들 또는 이의 조각들을 표출할 수 있는 세포들이다. APC들은 수지상 세포들, 대식세포, B 세포들, 단핵구들 및 효율적인 APC로 조작될 수 있는 다른 세포들을 포함한다. 이러한 세포들은 필요하지는 않지만 T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 증진시키고, 그 자체로 항종양 효과들을 가지며 및/또는 수용자(즉, 짝지은 HLA 단상형(haplotype))와 면역학적으로 양립하도록 상기 항원을 표출시키기 위한 능력을 증가시키게 유전적으로 변현될 수 있다. APC들은 골수, 말초 혈액, 종양 및 종양 주위 조직들을 포함하는 다양한 생물체의 체액들 및 기관들의 임의의 것으로부터 분리될 수 있고, 자가, 동종이형, 동일유전자 또는 이종의 세포들이 될 수 있다. APC들은 통상적으로 T 세포들에 짧은 폴리펩티드들를 발현시키도록 주조직 적합성(major histocompatability: MHC) 유전자 자리로부터의 수용체를 활용한다.

보조제(adjuvant)는 비특이적 면역 반응 인헨서이다. 적합한 보조제들은, 예를 들면, 콜레라 독소(cholera toxin), 모노포스포릴 지질(monophosphoryl lipid) A(MPL), 프로인트 완전 보강제(Freund's Complete Adjuvant), 프로인트 불완전 보강제, 퀼(Quil) A, 그리고 Al(OH)를 포함한다. 보조제들은 또한 톨-유사(Toll-like) 수용체들, 예를 들면, 이중 가닥 RNA(dsRNA), dsRNA 유사체들, 박테리아 편모들, LPS, CpG DNA, 그리고 박테리아 지질펩티드와 같은 이차적인 신호전달 분자들을 통해 APC 활성화 및 T 세포들의 향상된 표출을 야기하는 물질들이 될 수 있다(최근에 Abreu 등의 "J Immunol"(174(8), 4453-4460, 2005))에서 검토됨).

"폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"이라는 용어들은 여기서는 아미노산들의 중합체를 상호 교환적으로 언급하는 데 사용된다. 상기 용어들은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 대응되는 자연적으로 생성되는 아미노산뿐만 아니라 아미노산 중합체들 및 비자연적으로 생성되는 아미노산 중합체에 상응하는 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체들에 적용된다.

"아미노산(amino acid)"이라는 용어는 자연적으로 생성되는 및 합성인 아미노산들뿐만 아니라 자연적으로 생성되는 아미노산들과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체들 및 아미노산 유사체들을 언급한다. 자연적으로 생성되는 아미노산들은 유전자 코드에 의해 인코드되는 것들뿐만 아니라 이후에 변형되는 것들, 예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), γ-카르복시글루타메이트(carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(phosphoserine)이다. 아미노산 유사체들은 자연적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본적인 화학적 구조를 가지는, 즉 탄소가 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합되는 화합물들, 예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르류신(norleucine), 메티오닌 술폭시드(methionine sulfoxide), 메티오닌 메틸 술포니움(methionine methyl sulfonium)을 언급한다. 이러한 유사체들은 변형된 R기들(예를 들면, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격들을 가지지만, 자연적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본적인 화학적 구조를 유지한다. 아미노산 유사체들은 아미노산의 일반적인 화학적 구조와 다른 구조를 가지지만, 자연적으로 생성되는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물들을 언급한다.

아미노산들은 여기서 이들의 공통적으로 알려진 세 가지 문자 기호들에 의하거나, IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에서 권고되는 하나의 문자 기호들에 의해 언급될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오티드들은 이들의 공통적으로 허용되는 단일 문자 코드들로 언급될 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체들(conservatively modified variants)"은 아미노산 및 핵산 서열들 모두에 적용된다. 특정한 핵산 서열들에 대하여, 보존적으로 변형된 변이체들은 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열들을 인코드하는 이들 핵산들을 언급하거나, 핵산이 아미노산 서열을 인코드하지 않는 경우에 동일한 서열들을 언급한다. 유전자 코드의 변성으로 인하여, 많은 숫자의 기능적으로 동일한 핵산들이 임의의 정해진 단백질을 인코드한다. 예를 들어, 코돈들 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 인코드한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정화되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 인코드된 폴리펩티드를 변경시키지 않고 기재되는 대응되는 코돈들의 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이체들은 보존적으로 변형된 변이체들의 하나의 종인 "침묵 변이체들(silent variations)"이다. 여기서 폴리펩티드를 인코드하는 모든 핵산 서열은 모든 가능한 핵산의 침묵 변이체도 인코드한다. 해당 기술 분야의 숙련자는 핵산 내의 각 코돈(보통은 단지 메티오닌에 대한 코돈인 AUG 및 보통은 단지 트립토판에 대한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 산출하도록 변경될 수 있는 점을 인식할 것이다. 이에 따라, 폴리펩티드를 인코드하는 핵산의 각 침묵 변이체는 각 기재되는 서열 내에 내포된다.

아미노산 서열들에 대하여, 해당 기술 분야의 숙련자는 단일 아미노산 또는 인코드된 서열 내의 아미노산의 작은 퍼센티지를 변경시키거나, 첨가하거나, 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환들, 결실들 또는 첨가들이 변경이 아마노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 가져오는 경우에 "보존적으로 변형된 변이체"인 점을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환 표들은 해당 기술 분야에서 알려져 있다. 이외에도 이러한 보존적으로 변형된 변이체들은 본 발명의 다형 변이체들, 종간 동족체들 및 대립 유전자들을 배제하지는 않는다.

다음의 여덟 개의 그룹들은 각기 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산들을 함유한다. 1) 알라닌(Alanine)(A), 글리신(Glycine)(G); 2) 아스파르트산(Aspartic acid)(D), 글루탐산(Glutamic acid)(E); 3) 아스파라긴(Asparagine)(N), 글루타민(Glutamine)(Q); 4) 아르기닌(Arginine)(I), 리신(Lysine)(K); 5) 이소류신(Isoleucine)(I), 류신(Leucine)(L), 메티오닌(Methionine)(M), 발린(Valine)(V); 6) 페닐알라닌(Phenylalanine)(F), 티로신(Tyrosine)(Y), 트립토판(Tryptophan)(W); 7) 세린(Serine)(S), 트레오닌(Threonine)(T); 그리고 8) 시스테인(Cysteine)(C), 메티오닌(M)(예를 들면, Creighton의 "Proteins"(1984) 참조).

"선택적으로(또는 특이적으로) 잡종화되는"이라는 표현은 복합 혼합물(예를 들면, 전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 내의 상보적인(또는 대체로 상보적인) 뉴클레오티드들의 결합, 이중화 또는 잡종화를 언급한다.

폴리뉴클레오티드들은 자연 서열(즉, 개개의 폴리펩티드 또는 dsRNA 또는 이의 부분을 인코드하는 내부 서열)을 포함할 수 있거나. 이와 같은 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체들은 하나 또는 그 이상의 치환들, 첨가들, 결실들 및/또는 삽입들을 함유할 수 있으므로, 인코드된 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성(예를 들면, 면역원성(immunogenicity))이 자연 항원들을 포함하는 폴리펩티드에 비해 사라지지 않는다. 폴리뉴클레오티드 변이체들은 하나 또는 그 이상의 치환들, 첨가들, 결실들 및/또는 삽입들을 포함할 수 있으므로, 인코드된 dsRNA의 보조제 활성이 치환들, 첨가들, 결실들 및/또는 삽입들을 함유하지 않는 dsRNA에 비해 사라지지 않는다. 변이체들은 바람직하게는 자연 폴리펩티드 또는 이의 부분 혹은 dsRNA를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타낸다.

둘 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 혹은 폴리펩티드 서열들의 구성에서 "동일한(identical)" 또는 퍼센트 "동일성(identity)"이라는 용어는, 후속되는 서열 비교 알고리즘들의 하나를 이용하거나 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정되는 경우에 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대의 관련성으로 비교되고 정렬될 때, 동일한(즉, 특정 영역에 걸쳐 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성) 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들의 특정 퍼센티지를 가지거나 동일한 둘 또는 그 이상의 서열들 혹은 하위 서열들을 언급한다. 그러면, 이러한 서열들은 "실질적으로 동일한(substantially identical)" 것으로 말해진다. 이러한 정의는 또한 테스트 폴리뉴클레오티드 서열의 찬사로 언급된다. 선택적으로, 동일성은 길이가 적어도 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 75, 약 30 내지 약 50인 아미노산들 또는 뉴클레오티드들인 영역에 걸쳐 존재한다.

"대조군(control)" 샘플 또는 값은 테스트 샘플과의 비교를 위한 참조, 통상적으로 알려진 참조로 기능하는 샘플을 언급한다. 예를 들면, 테스트 샘플은 테스트 조건, 예를 들면, 테스트 화합물이나 치료의 존재에서 취해질 수 있고, 알려진 조건들로부터, 예를 들면, 상기 테스트 화합물(음성 대조군(negative control))의 부존재 또는 알려진 화합물(양성 대조군(positive control))의 존재에서 샘플들과 비교될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 음성 대조군의 예는 알려진 건강한(감염되지 않은) 개체로부터의 생물학적 샘플일 수 있고, 양성 대조군의 예는 알려진 감염된 환자들로부터의 생물학적 샘플일 수 있다. 대조군은 또한 많은 테스트들이나 결과들로부터 수집된 평균값 또는 범위를 나타낼 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자는 대조군들이 임의의 숫자의 변수들의 평가를 위해 설계될 수 있는 점을 이해할 것이다. 예를 들면, 대조군은 약학적 데이터(예를 들면, 반감기) 또는 치료적 측정들(예를 들면, 유익 및/또는 부작용들의 비교)에 기초하여 치료적 유익을 비교하도록 마련된다. 대조군들은 생체 외의 적용들을 위해 설계될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자는 어떤 대조군들이 주어진 상황에서 귀중하며, 대조군 값들과의 비교에 기초하여 데이터를 분석할 수 있는 지를 이해할 것이다. 대조군들은 또한 데이터의 중요성을 결정하기 위해 가치가 있을 수 있다. 예를 들면, 주어진 변수들에 대한 값들이 대조군들 내에서 폭넓게 변화되는 경우, 테스트 샘플들 내의 변화는 중요한 것으로 간주되지 않을 것이다.

"진단(diagnosis)"이라는 용어는 대상이 감염이나 암과 같은 질환을 가지는 상대적인 확률을 언급한다. 유사하게, "예후(prognosis)"라는 용어는 대상 내에서 일어날 수 있는 특정한 미래의 결과인 상대적인 확률을 언급한다. 상기 용어들은 의료 진단의 해당 기술 분야의 숙련자에게 이해될 것인 바와 같이 절대적인 것으로 의도되지는 않는다.

"요법(therapy)", "치료(treatment)" 및 "개선(amelioration)"이라는 용어들은 증상들의 중증도(severity)에서 임의의 감소를 언급한다. 감염의 상황에서, 치료는 감염원의 감소, 감소된 증상들 등을 언급할 수 있다. 암을 치료하는 경우에서, 치료는, 예를 들면, 종양 크기, 암세포들의 숫자, 성장 속도, 전이성 활성을 감소시키고, 비암세포들의 세포 사멸을 감소시키는 등을 언급할 수 있다. "치료하다" 및 "방지하다"라는 용어들은 절대적인 용어들을 의도하는 것은 아니다. 치료 및 방지는 어떤 비교적 감소나 감염원의 분명한 부존재, 발병의 지연, 증상들의 개선, 환자 생존의 증진, 생존 시간이나 비율의 증가 등을 언급할 수 있다. 치료 및 방지는 완전하거나(감염원 또는 종양성 신생 세포들의 검출할 수 없는 레벨들) 부분적일 수 있으므로, 본 발명에 기재되는 면역원성 생물 작용제들이 없이 발생될 수 있었던 것에 비해 보다 적은 감염원이나 종양성 신생 세포들이 환자에서 발견된다. 치료의 효과는 치료를 받지 않은 개체 또는 개체들의 집단에 대해서나 치료 이전에 또는 치료 동안의 다른 시간에서 동일한 환자에 대해 비교될 수 있다. 일부 측면들에 있어서, 감염이나 질병의 중증도는, 예를 들면, 투여 전의 개체에 대해서나 치료가 수행되지 않은 대조군 개체에 대해 비교되는 경우에 적어도 10% 감소된다. 일부 측면들에 있어서, 감염이나 질병의 중증도는 적어도 25%, 50%, 75%, 80% 또는 90% 감소되거나, 일부 경우들에서, 표준 진단 기술들을 이용하여 더 이상 검출할 수 없게 된다.

"대상(subject)", "환자(patient)", "개체(individual)" 및 유사한 용어들이 상호 교환적으로 사용되며, 지정되는 경우를 제외하고는 인간 및 비인간 영장류들뿐만 아니라 토끼들, 랫들, 마우스들, 염소들, 돼지들 및 다른 포유동물 종들과 같은 포유동물들을 언급한다. 상기 용어가 상기 대상이 특정 질병으로 진단받았던 것을 반드시 나타내지는 않지만, 통상적으로 개체가 의료적 감시 하에 있는 것을 언급한다. 환자는 치료, 모니터링, 존재하는 최적 치료 계획의 조정이나 변경 등을 추구하는 개체가 될 수 있다.

Ⅱ.면역원성 생물 작용제들

면역원성 생물 작용제는 숙주, 예를 들면, 인간 숙주 내에 면역 반응을 야기하는 임의의 생물 작용제이다. 상기 면역원성 생물 작용제는 이에 따라 폴리펩티드(예를 들면, 당단백질, 인단백질 또는 다른 변형된 형태), 탄수화물, 지질, 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 크로마틴(chromatin), 메틸화 폴리뉴클레오티드 또는 다른 변형된 형태)이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 생물 작용제는 면역 반응을 직접 야기할 수 있다. 예를 들면, 상기 면역원성 생물 작용제 자체가 표적 면역원(immunogen)(항원)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 생물 작용제는 상기 표적 면역원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들면, 표적 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 항원 표출 세포(APC) 내에 발현될 때, 면역 반응이 상기 발현된 항원에 대해 시작된다. 상기 면역원성 생물 작용제는 단독으로, 제2, 제3 및/또는 제4 면역원성 생물 작용제(예를 들면, 다중 표적 예방 백신의 경우)와 결합되어 및/또는 상기 면역 반응을 증가시키는 보조제와 결합되어 투여될 수 있다.

발현 벡터들

여기에 기재되는 바와 같은 용도를 위한 발현 벡터들은 바이러스-유래 벡터들, 예를 들면, 재조합형 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 벡터들, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)들, 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector)들, 변형 백시니아 안카라(modified vaccinia Ankara: MVA) 벡터들, 그리고 렌티바이러스(lentiviral)(예를 들면, HSV-1-유래) 벡터들을 포함할 수 있다(예를 들면, Brouard 등의 "British J. Pharm."(157:153, 2009) 참조). 치료적 용도를 위한 바이러스-유래 벡터들은 통상적으로 복제 불능이 되거나 약화된다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터의 경우에, 상기 아데노바이러스 게놈은 E1 및 E3 유전자들이 제거되도록 변형된다. 생산을 위하여, 상기 복제 결핍 벡터는 상기 E1 유전자를 발현시키는 세포에 투여될 수 있으므로, 재조합 아데노바이러스(rAd)가 상기 세포에 의해 생산된다. 이러한 rAd가 수확될 수 있으며, 인코드된 폴리펩티드 항원에 면역 반응들을 유발하기 위해 포유동물의 다른 세포에 형질전환 조성물을 전달하는 감염의 단일 라운드에 대해 사용될 수 있다.

적합한 바이러스 벡터들의 예들은, 예를 들면, 상기 E1/E3 영역들이 결실된 Ad5 및 상기 E4 영역이 결실된 Ad5를 포함하여 아데노바이러스 5를 포함한다. 다른 적합한 아데노바이러스 벡터들은 균주(strain) 2, 경구로 테스트되는 균주들 4 및 7, 장용 아데노바이러스 40 및 41, 그리고 항원을 전달하고 전이유전자(transgene) 항원에 대한 적응 면역 반응을 유발하기 위해 충분한 다른 균주들(예를 들면, Ad34, Ad26 또는 Ad35)을 포함한다[Lubeck 등의 "Proc Natl Acad Sci USA"(86(17), 6763-6767, 1989); Shen 등의 "J Virol"(75(9), 4297-4307, 2001); Bailey 등의 "Virology"(202(2), 695-706, 1994)]. 상기 바이러스 벡터는 인간들로부터 분리되었을 필요는 없지만, 침팬지 아데노바이러스 3(ChAd3)과 같이 비인간으로부터 비롯될 수 있다(예를 들면, Colloca 등의 "Sci. Transl. Med."(4:115, 2012); Stanley 등의 "Nat. Med."(doi:10.1038/nm.3702) 참조). 일부 실시예들에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 살아있고 복제 불능인 아데노바이러스 벡터(E1 및 E3가 결실된 rAd5와 같은), 살아있고 약화된 아데노바이러스 벡터(E1B55K 결실 바이러스들과 같은), 또는 살아있고 야생형 복제를 갖는 아데노바이러스 벡터이다.

여기에 기재되는 바와 같이 사용되는 발현 벡터들 내의 전사 및 번역 대조 서열들은 바이러스 소스들에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 통상적으로 사용되는 프로모터들 및 인헨서들은, 예를 들면, 베타 액틴(actin), 아데노바이러스, 유인원 바이러스(SV40) 및 사람 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus: CMV)로부터 유래된다. 예를 들면, 포유동물 세포들 내의 발현에 대해 효과적인 것으로 나타난 상기 CMV 프로모터, SV40 조기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메틸로티오네인(metallothionein) 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스(murine mammary tumor virus) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터, 트랜스듀서(transducer) 프로모터, 또는 다른 프로모터들의 안내 하에서 단백질들의 발현을 가능하게 하는 벡터들이 적합하다. 추가적인 바이러스 및 비-바이러스 프로모터, 대조 및/또는 신호 서열들이 사용될 수 있고, 제공되어 이러한 대조 서열들이 전달 감염되는 숙주 세포들과 호환될 수 있다.

면역원들

여기에 기재되는 바와 같은 용도를 위한 면역원들은, 예를 들면, 바이러스 항원들, 박테리아 항원들, 암 항원들, 진균 항원들 또는 기생충 항원들(예를 들면, 여기에 기재되는 바와 같은 항원들의 리스트에 대해 미국 특허 제8,222,224호 참조)과 같은 항원들로부터 유래될 수 있다.

여기에 기재되는 바와 같이 사용될 수 있는 항원들의 특정 예들은 인플루엔자 바이러스(예를 들면, HA, NA, M1, NP), 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV)(예를 들면, gag, pol, env 등), 인유두종 바이러스(human papilloma virus: HPV)(예를 들면, L1과 같은 캡시드(capsid) 단백질들), 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan Equine Encephalomyelitis: VEE) 바이러스, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus: HSV), 인간 포진 바이러스(human herpes virus), 리노바이러스(rhinovirus)들, 코크삭키에바이러스(cocksackievirus0들, 엔테로바이러스(enterovirus)들, 간염 A, B, C, E 및 G(HAV, HBV, HCV, HEV, HGV, 예를 들면, 표면 항원), 멈프스 바이러스(mumps virus), 풍진 바이러스(rubella virus), 홍역 바이러스(measles virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 두창 바이러스(smallpox virus), 광견병 바이러스(rabies virus), 그리고 수두 대상포진 바이러스(Varicella-zoster virus)로부터 유래되는 것들이다.

적합한 바이러스 항원들은 또한 바이러스 비구조 단백질들, 예를 들면, 바이러스를 둘러싸는 캡시드 또는 단백질을 만드는 것들과 대조적으로 구조 폴리펩티드들에 대해 인코드하지 않는 바이러스 핵산에 의해 인코드되는 단백질들을 포함한다. 비구조 단백질들은, 예를 들면, 베네수엘라 말 뇌염(VEE), 동부 말 뇌염(Eastern Equine Encephalitis: EEE) 또는 셈리키 삼림열(Semliki Forest)로부터의 비구조 단백질들 1, 2, 3 및 4(각기 NS1, NS2, NS3 및 NS4)와 같이 바이러스 핵산 복제, 바이러스 유전자 발현, 또는 후번역 처리를 증진시키는 단백질들이다.

박테리아 항원들은, 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미스(Staphylococcus epidermis), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 비브리오 클로에라에(Vibrio chloerae), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 네이세리아 고노르로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 미코플라 종(Mycoplasm sp.), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리케트시아 티피(Rickettsia typhi), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 쉬겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)(예를 들면, 콜레라 독소 서브유닛(subunit) B, 콜레라 독소-상호조절 필루스(TCP)); 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylorii)(예를 들면, VacA, CagA, NAP, Hsp, 카탈라아제(catalase), 우레아제(urease)); E. 콜리(coli)(예를 들면, 이열성 엔테로톡신(enterotoxin), 난관채(fimbrial) 항원들)로부터 유래될 수 있다.

기생충 항원들은, 예를 들면, 람블 편모충(Giardia lamblia), 레이슈마니아종(Leishmania sp.), 트리파노소마종(Trypanosoma sp.), 트리코모나스종(Trichomonas sp.), 플라스모디움종(Plasmodium sp.)(예를 들면, pfs25, pfs28, pfs45, pfs84, pfs 48/45, pfs 230, Pvs25 및 Pvs28과 같은 P. 팔시파룸(falciparum) 표면 단백질 항원들); 주혈흡충종(Schistosoma sp.); 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(예를 들면, Ag85, MPT64, ESAT-6, CFP10, R8307, MTB-32 MTB-39, CSP, LSA-1, LSA-3, EXP1, SSP-2, SALSA, STARP, GLURP, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, MSP-8, MSP-9, AMA-1, 1형 내재막 단백질(integral membrane protein), RESA, EBA-175 및 DBA)로부터 유래될 수 있다.

진균 항원들은, 예를 들면, 티네아페디스(Tineapedis), 티네아코르포루스(Tineacorporus), 티네아크루리스(Tineacruris), 티네아운구이엄(Tineaunguium), 클라도스포리움카리오니(Cladosporiumcarionii), 코시디오이데심미티스(Coccidioidesimmitis), 칸디다종(Candida sp.), 아스페르킬루스푸미가투스(Aspergillusfumigatus) 및 뉴모시스티스 카리디(Pneumocystis carinii)로부터 유래될 수 있다.

암 항원들은, 예를 들면, 대장암, 위암, 췌장암, 폐암, 난소암, 전립선암, 유방암, 피부암(예를 들면, 악성 흑색종), 백혈병, 또는 림프종에서 발현되거나 과발현되는 항원들을 포함한다. 예시적인 암 항원들은, 예를 들면, HPV L1, HPV L2, HPV E1, HPV E2, 태반성 알칼리성 인산효소(placental alkaline phosphatase), AFP, BRCA1, Her2/neu, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CEA, Hcg, 우로키나아제(urokinase)형 플라스미노겐 활성화인자(plasminogen activator: Upa), 플라스미노겐 활성화인자 억제제, CD53, CD30, CD25, C5, CD11a, CD33, CD20, ErbB2, CTLA-4를 포함한다. 추가적인 암 표적들에 대해서는 Sliwkowski 및 Mellman의 "Science"(341:6151, 2013)을 참조하기 바란다.

보조제들

일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물들은 적어도 하나의 보조제를 더 포함한다. 적합한 보조제들은, 예를 들면, 지질들과 지질상 화합물들, 콜레라 독소(CT), CT 서브유닛 B, CT 유도체 CTK63, E. 콜리(coli) 이열성 엔테로톡신(LT), LT 유도체 LTK63, Al(OH)₃, 그리고 예를 들면, 국제 공개 특허 WO2004/020592, Anderson 및 Crowle의 "Infect. Immun."(31(1):413-418, 1981), Roterman 등의 "J. Physiol. Pharmacol."(44(3):213-32, 1993), Arora 및 Crowle의 "J. Reticuloendothel."(24(3):271-86, 1978) 그리고 Crowle 및 May의 "Infect. Immun."(38(3):932-7, 1982))에 기재되어 있는 바와 같은 폴리이온성(polyionic) 유기산들을 포함한다. 적합한 폴리이온성 유기산들은, 예를 들면, 6,6'-[3,3'-디메틸(demithyl)[1,1'-비페닐(biphenyl)]-4,4'-디일(diyl)]비스(bis)(아조(azo))비스(bis)[4-아미노(amino)-5-하이드록시(hydroxy)-1,3-나프탈렌(naphthalene)-디술폰산(disulfonic acid)](에반스 블루(Evans Blue)) 및 3,3'-[1,1'-비페닐]-4,4'-디일비스(아조)비스[4-아미노-1-나프탈렌술폰산](콩고 레드(Congo Red))을 포함한다. 해당 기술 분야의 숙련자라면 상기 폴리이온성 유기산들이 임의의 유형의 투여와 함께 임의의 핵산계의 백신접종 방법에 대해 사용될 수 있는 점이 이해될 것이다.

TLR-3 작용제들(예를 들면, dsRNA 및 폴리 I：C, 폴리 A：U 및 폴리 I：폴리 C와 같은 이의 유사체)도 사용될 수 있다. TLR-3 작용제들은, 예를 들면, 짧은 머리핀형(short hairpin) RNA, 바이러스 유래 RNA, 이중 가닥 또는 짧은 머리핀형 RNA 및 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 형성할 수 있는 RNA의 짧은 분절들을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 TLR-3 작용제는 바이러스 유래된 dsRNA, 예를 들면, 신드비스 바이러스(Sindbis virus)로부터 유래된 dsRNA 또는 dsRNA 바이러스 중간체들이다(Alexopoulou 등의 "Nature"(413:732, 2001)). 일부 실시예들에 있어서, 상기 TLR-3 작용제는 짧은 머리핀형 RNA이다. 짧은 머리핀형 RNA 서열들은 통상적으로 링커 서열에 의해 연결되는 두 상보적 서열들을 포함한다. 특정 링커 서열이 본 발명의 중요한 측면은 아니다. 임의의 적절한 링커 서열이 dsRNA를 형성하는 두 상보적 서열들의 결합을 방해하지 않는 한 사용될 수 있다. TLR-3 작용제들은 생체 내로 또는 생체 외로 반응자 세포(예를 들면, 수지상 세포, 말초 혈액 단핵 세포, 또는 대식세포)와 접촉될 때에 염증전 시토카인 방출(예를 들면 IL-6, IL-8, TNF-알파, IFN-알파, IFN-베타)을 일으킬 수 있다.

다른 적합한 보조제들은, 예를 들면, 이미퀴모드(imiquimod) 및 레스퀴모드(resiquimod)와 같이 이미다조퀴놀린(imidazoquinoline) 족의 원소들과 같은 국소 면역 조절제들을 포함한다(예를 들면, Hengge 등의 "Lancet Infect. Dis."(1(3):189-98, 2001) 참조).

추가적으로 적합한 보조제들은, 예를 들면, 추가적인 명반(alum)계 보조제들(예를 들면, 알히드로겔(Alhydrogel), 레히드라겔(Rehydragel), 인산알루미늄, 알감물린(Algammulin)); 오일계 보조제들들(프로인트 불완전 보강제(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 보강제(디프코 라보라토리즈(Difco Laboratories), 미시간주의 디트로이트시), 스페콜(Specol), RIBI, 티테르맥스(TiterMax), 몬타니드(Montanide) ISA50 또는 셉픽 몬타니드(Seppic MONTANIDE) ISA 720); 비이온성 블록(block) 공중합체계 보조제들들, 시토카인들(예를 들면, GM-CSF 또는 Flat3-리간드); 머크 어쥬번트(Merck Adjuvant) 65(머크 앤 캄퍼니사, 뉴저지주의 로웨이시); AS-2(스미스클라인 비첨(SmithKline Beecham), 팬실바이나주의 필라델피아시); 칼슘, 철 또는 아연의 염들; 아실화 트롭신(acylated tyrosine)의 불용성 서스펜션; 아실화 당들; 양이온성으로나 음이온성으로 유도된 다당류들; 폴리포스파젠(polyphosphazene)들; 생분해성 마이크로스피어들; 모노포스포릴 지질(monophosphoryl lipid) A 및 퀼(Quil) A와 같이 상업적으로 입수 가능하다. GM-CSF 또는 인터류킨(interleukin)-2, -7 혹은 -12과 같은 시토카인들 또한 적합한 보조제들이다. 헤모시아닌(hemocyanin)들(예를 들면, 구멍 삿갓조개(keyhole limpet) 헤모시아닌) 및 헤모에리트린(hemoerythrin)들 또한 보조제들로 사용될 수 있다. 예를 들면, 키틴(chitin), 키토산(chitosan) 및 탈아세틸화(deacetylated) 키틴과 같은 다당류 보조제들 또한 보조제들로서 적합할 수 있다. 다른 적합한 보조제들은 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide: MDP)(N 아세틸무라밀(acetylmuramyl) L 알라닐 D 이소글루타민) 박테리아 펩티도글리칸(peptidoglycan)들 및 이의 유도체들(예를 들면, 트레오닐(threonyl)-MDP 및 MTPPE)을 포함한다. BCG 및 BCG 세포벽 골격(CWS)은 트레할로스 디마이콜레이트(trehalose dimycolate)가 있거나 없이 보조제들로 사용될 수 있다. 트레할로스 디마이콜레이트는 그 자체로 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,579,945호 참조). 해독된 내독소들 또한 단독으로 또는 다른 보조제들과 결합되어 보조제들로서 유용하다(예를 들면, 미국 특허 제4,866,034호; 미국 특허 제4,435,386호; 미국 특허 제4,505,899호; 미국 특허 제4,436,727호; 미국 특허 제4,436,728호; 미국 특허 제4,505,900호; 및 미국 특허 제4,520,019호 참조). 사포닌(saponin)들 QS21, QS17, QS7 등 또한 보조제들로서 유용하다(예를 들면, 미국 특허 제5,057,540호; 유럽(EP) 특허 제0362 279호; 국제 공개 특허 WO 96/33739; 및 국제 공개 특허WO 96/11711 참조). 다른 적합한 보조제들은 몬타니드 ISA 720(셉픽, 프랑스), SAF(치론(Chiron), 미국 캘리포니아), ISCOMS(CSL), MF-59(치론), SBAS 시리즈의 보조제들(예를 들면, 벨기에의 릭센사트에 있는 스미스클라인 비첨으로부터 입수 가능한 SBAS-2, SBAS-4 또는 SBAS-6 혹은 이의 변이체들), 데톡스(Detox)(코릭사(Corixa), 몬타나주의 해밀턴시), 그리고 RC-529(코릭사, 몬타나주의 해밀턴시)를 포함한다.

초항원들 또한 본 발명에서 보조제들로서의 사용을 위해 고려된다. 초항원들은 알파, 베타, 감마 및 델타 enterotoxins from S. 아우레우스(aureus) 및 S. 에피데르미디스(epidermidis)로부터의 알파, 베타, 감마 및 델타 엔테로톡신들 그리고 알파, 베타, 감마 및 델타 E. 콜리 외독소들과 같은 스타필로코커스 엑소단백질(exoprotein)들을 포함한다. 통상적인 스타필로코커스 엔테로톡신들은 기재된 바와 같이 엔테로톡신들 쓰로(through) E(SEE)를 갖는 스타필로코커스 엔테로톡신(staphylococcal enterotoxin A: SEA) 및 스타필로코커스 엔테로톡신 B(SEB)로 알려져 있다(Rott 등의 1992). 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) B(SEB), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens) 엔테로톡신(Bowness 등의 1992), S. 피오게네스(pyogenes)로부터의 세포질막-연관 단백질(CAP)(Sato 등의 1994) 및 S. 아우레우스로부터의 독소성 쇼크 신드롬 톡소(toxic shock syndrome toxin 1: TSST 1)(Schwab 등의 1993) 또한 사용될 수 있다.

여기에 제공되는 약학 조성물(pharmaceutical composition)들을 위하여, 상기 보조제(들)가, 예를 들면, Th1 또는 Th2 형이 우세한 면역 반응들을 유도하도록 설계될 수 있다. Th1-형 시토카인들(예를 들면, IFN-감마, TNF-알파, IL-2 및 IL-12)의 높은 레벨들은 투여된 항원에 대한 세포 매개 면역 반응들의 유도를 선호하는 경향이 있다. 대조적으로, Th2-형 시토카인들(예를 들면, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)의 높은 레벨들은 체액 면역 반응들의 유도를 선호하는 경향이 있다. 여기에 제공되는 바와 같은 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 경구 전달에 후속하여, Th1-형 및 Th2-형 반응들을 포함하는 면역 반응이 통상적으로 유발될 것이다.

Ⅲ. 표적 전달 시스템

회장 전달을 위해 본 발명에 기재되는 조성물들 및 방법들은 다음에 서명되는 바와 같은 적절한 코팅들, 매트릭스들 및 장치들에 의존할 수 있다.

장용성 코팅들, 매트릭스들 및 장치들

장용성 코팅들은 위장의 낮은 pH 환경으로부터 물질들을 차단하고, 이후에 소화관 내의 원하는 표적에 도달될 때까지 감싸인 물질의 방출을 지연시키도록 사용된다. 장용성 코팅들은 알려져 있고 상업적으로 입수 가능하다. 예들은 pH-민감성 중합체들, 생분해성 중합체들, 하이드로겔(hydrogel)들, 지효성 시스템들 및 삼투 전달 시스템들을 포함한다(예를 들면, Chourasia 및 Jain의 "J. Pharm. Pharmaceutical Sci."(6:33, 2003) 참조).

위장관(GIT)의 pH는 위장 내의 매우 산성(pH:∼2)으로부터 회장 내의 보다 중성(pH: 5.8-7.0)까지 진행된다. pH 민감성 코팅들은 상기 회장 내에서나 회장 직전에 용해되게 사용될 수 있다. 예들은 유드라지트®L 및 S 폴리머들(5.5-7.0의 문턱 pH의 범위); 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(polyvinyl acetate phthalate)(pH 5.0), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트(hydroxypropyl methylcellulose phthalate) 50 및 55(각기 pH 5.2 및 5.4), 그리고 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(pH 5.0)를 포함한다. Thakral 등의 "Expert Opin. Drug Deliv."(10:131, 2013)에는 회장 전달을 위한 유드라지트®제형들, 특히 pH≤7.0에서의 전달을 보장하는 L 및 S의 결합들이 검토되어 있다. Crotts 등의 "Eur . J Pharm. Biol ."(51:71, 2001)에는 적절한 분해 성질들을 갖는 유드라지트®제형들이 기재되어 있다. Vijay 등의 "J. Mater . Sci . Mater . Med ."(21:2583, 2010)에는 pH 6.8에서 회장 전달을 위한 아크릴산(acrylic acid: AA)-메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate: MMA)계 공중합체들이 검토되어 있다.

회장 전달을 위하여, 중합체 코팅은 통상적으로 약 pH 6.8에서 용해되며, 약 40분 이내에 완전한 방출을 가능하게 한다(예를 들면, Huyghebaert 등의 "Int. J. Pharm."(298:26, 2005) 참조). 이를 구현하기 위해, 치료 물질이 다른 코팅들의 층들 내에 덮일 수 있으므로, 예를 들면, 가장 바깥의 층이 낮은 pH 조건들에 걸쳐 상기 물질을 보호하고 상기 정제가 위장을 나갈 때에 용해되며, 적어도 하나의 내부 층 상기 정제가 증가되는 pH로 진행하면서 용해된다. 말단 회장까지의 전달을 위한 층을 이룬 코팅들의 예들은, 예를 들면, 국제 공개 특허 WO 2013/148258에 기재되어 있다.

생분해성 중합체들(예를 들면, 펙틴(pectin), 아조(azo) 중합체들)은 통상적으로 상기 GIT 내에 생존하는 미생물상의 효소 활성에 의존한다. 회장에는 락토바실리(lactobacilli) 및 엔테로박테리아(enterobacteria)를 포함하여 이전의 단계들 보다 많은 숫자의 박테리아가 번식된다.

삼투 조절 방출 경구 전달 시스템들(오로스®(OROS®); 알자(Alza))은 수성 조건들에서 시간이 지나면서 분해되는 삼투 시스템의 예이다. 이러한 물질들은 특히 회장에 대해 전달되도록 다른 코팅들로나 두께를 변화시켜 조정될 수 있다(예를 들면, Conley 등의 "Curr. Med. Res. Opin."(22:1879, 2006) 참조).

상기 회장에 대한 전달을 위한 결합 중합체들은 국제 공개 특허 WO 2000/062820에 보고되어 있다. 예들은 유드라지트®L100-55(25㎎/캡슐)와 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate)(2.4㎎/캡슐) 및 포비돈(Povidone) K-25(20㎎/정제) 이후의 유드라지트®FS30D(30㎎/정제)를 포함한다. pH 민감성 중합체들은 상술한 바와 같이 상기 회장에 대한 효과적인 전달에 적용될 수 있으며, 예를 들면, 메타크릴산 공중합체들(예를 들면, 폴리(poly)(메타실산(methacylic acid)-코(co)-메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate)) 1：1), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(cellulose acetate phthalate), 프탈레이트(hydroxypropyl methylcellulose phthalate), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트(hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(polyvinyl acetate phthalate), 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트(cellulose acetate trimellitate), 카르복시메틸 에틸-셀룰로오스(carboxymethyl ethyl- cellulose), 셸락(shellac) 또는 다른 적합한 중합체(들)이다. 상기 코팅층 또한 박테리아 분해와 같이 pH보다 다른 루미날(luminal) 성분들에 민감한 필름을 형성하는 중합체들, 또는 다른 필름을 형성하는 중합체와 혼합될 때에 이와 같은 민감성을 가지는 성분으로 구성될 수 있다. 회장에 대해 지연된 방출을 제공하는 이러한 성분들의 예들은 아조 결합(들), 펙틴이나 이의 염, 갈락토만나스(galactomannans), 아밀로오스(amylose) 및 콘드로이틴(chondroitin)과 같은 다당류(polysaccharide)들, 이황화(disulphide) 중합체들 그리고 글리코시드(glycoside)들을 포함하는 중합체들이다.

변화되는 pH, 물 및 효소 민감성들을 가지는 성분들이 치료 조성물이 회장을 표적으로 하도록 결합되어 사용될 수 있다. 상기 코팅의 두께 또한 방출을 조절하는 데 이용될 수 있다. 상기 성분들은 또한 상기 치료 조성물이 내장되는 매트릭스를 형성하는 데 사용될 수 있다. 대체로, "Frontiers in Drug Design & Discovery"(Bentham Science Pub. 2009, vol.4)를 참조하기 바란다.

주파수 제어 또는 무선 조정되는 캡슐들

코팅들 및 매트릭스들을 용해시키는 선택적인 것으로서, 부위 특이적 전달이 외부에서 발생되는 신호에 따라 방출하는 캡슐들을 통할 수 있다. 초기 모델들은 Digenis 등의 "Pharm. Sci. Tech. Today"(1:160, 1996)에 개시된 바와 같이 고주파(HF) 신호에 대해 방출되었다. 최초 HF 캡슐 개념은 그 이래로 업데이트되었고, 결과물이 인텔리시트®(InteliSite®)로 시판되었다. 업데이트된 캡슐은 고주파 활성화되는 분해되지 않는 전달 체계이다. 상기 캡슐의 방사선 식별은 감마 섬광조영술(scintigraphy)을 통해 상기 GI 트랙트(tract)의 특정 영역 내부의 상기 캡슐 위치를 판단하게 한다. 상기 캡슐이 상기 GI 트랙트 내의 원하는 위치에 도달될 때, 외부 활성화가 상기 캡슐 약물 저장소에 일련의 윈도우들을 개방시킨다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 면역원성 생물 작용제가 무선 조정되는 캡슐로 둘러싸일 수 있으므로, 상기 캡슐은 추적되고, 상기 회장에 도달되면 신호가 전달된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 캡슐은 검출이나 검출이 없이 상기 캡슐이 회장에 도착한 것으로 예상될 때와 상응하는 투여 후의 정해진 시간에 신호가 전달된다.

제형들(formulations)

약학 조성물들은 여기에 기재되는 바와 같이 예방적 및 치료적 목적들을 위해 사용될 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 약학 조성물들은 위장 분해에 대해 보호되도록 제조될 수 있으므로, 투여된 면역원성 생물 작용제가 원하는 위치에 도달한다. 경구 전달을 위한 DNA 및 약물들의 마이크로캡슐화를 위한 방법들은, 예를 들면, 미국 공개 특허 제2004/043952호에 기재되어 있다.

면역원성 약학 조성물은 상기 면역원성 생물 작용제(예를 들면, 면역원성 폴리펩티드, 또는 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 약학적으로 허용 가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)들을 함유할 수 있다. 이러한 염들은 유기 염기들(예를 들면, 일차, 이차 및 삼차 아민들의 염들과 염기 아미노산들) 그리고 무기 염기들(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염들)을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 비독성의 염기들로부터 제조될 수 있다. 염들의 일부 특정한 예들은 인산 완충 식염수 및 식염수(예를 들면, 섭취, 비강 전달 또는 주사를 위한)를 포함한다.

상기 제형의 지연 방출 코팅 또는 추가적인 코팅은 약물 방출의 기술적인 원인들이나 크로노그래프(chronograph) 제어를 위해 루미날 조건들에 민감하지 않은 다른 필름을 형성하는 중합체들을 함유할 수 있다. 이러한 목적들을 위해 사용되는 물질들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 단독으로 또는 혼합물들로 사용되는 설탕, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피르롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 아세테이트(polyvinyl acetate), 하이드록시 프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(carboxymethylcellulose sodium) 및 다른 것들을 포함한다.

분산제(dispersant)들, 염색제(colorant)들, 염료(pigment)들, 추가적인 중합체들, 예를 들면, 폴리(poly)(에틸아크릴라트(ethylacrylat), 메틸메타크릴라트(methylmethacrylat)), 항-태킹제(anti-tacking agent) 및 항기포제들과 같은 첨가제들이 코팅층 내로 포함될 수 있다. 다른 화합물들이 필름 두께를 증가시키고, 코어 물질 내로의 산성의 위액들의 확산을 증가시키도록 첨가될 수 있다. 상기 코팅층들은 또한 원하는 기계적 성질들을 얻기 위해 약학적으로 허용 가능한 연화제(plasticizer)들을 포함할 수 있다. 이러한 연화제들은, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, 트리아세틴(triacetin), 시트르산 에스테르(citric acid ester)들, 프탈산 에스테르(phthalic acid ester)들, 세바스산 디부틸(dibutyl sebacate), 세일 알콜(cetyl alcohol), 폴리에틸렌 글리콜들, 글리세롤 모노에스테르(glycerol monoester)들, 폴리소르베이트(polysorbate)들 또는 다른 연화제들 그리고 이들의 혼합물들이다. 연화제들의 양은 각 처방을 위해서와 선택된 중합체(들), 선택된 연화제(들) 및 상기 중합체(들)의 적용된 양과 관련되어 최적화될 수 있다.

해당 기술 분야에서 알려진 다른 적합한 약학적 성분들이 본 발명의 약학 조성물들에 채용될 수 있다. 적합한 운반체(carrier)들은, 예를 들면, 물, 식염수, 알콜, 지방, 왁스, 완충제, 만니톨(mannitol), 락토오스(lactose), 녹말, 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 사카린 나트륨(sodium saccharine), 활석, 셀룰로오스, 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose) 그리고 탄산마그네슘, 또는 생분해성 마이크로스피어(microsphere)들(예를 들면, 폴리아세테이트 폴리글리콜레이트(polylactate polyglycolate))와 같은 고체 운반체를 포함한다. 적합한 생분해성 마이크로스피어들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호; 미국 특허 제5,075,109호; 미국 특허 제5,928,647호; 미국 특허 제5,811,128호; 미국 특허 제5,820,883호에 개시되어 있다. 상기 면역원성 폴리펩티드 및/또는 운반체 발현 벡터는 생분해성 마이크로스피어 내에 캡슐화될 수 있거나 상기 마이크로스피어의 표면과 연관될 수 있다.

이러한 조성물들은 또한 비면역원성 완충제들(예를 들면, 중성 완충 식염수 또는 인산 완충 식염수), 탄수화물들(예를 들면, 글루코오스, 만노오스(mannose), 수크로오스 또는 덱스트란(dextran)들), 만니톨, 단백질들, 폴리펩티드들 또는 글리신과 같은 아미노산들, 항산화제들, 세균 발육 저지제(bacteriostat)들, EDTA나 글루타티온(glutathione)과 같은 킬레이트제(chelating agent)들, 보조제들(예를 들면, 수산화알루미늄), 현탄제(suspending agent)들, 농조화제(thickening agent)들 및/또는 보존제(preservative)들을 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 조성물들은 리오필레이트(lyophilate)로 조제될 수 있다. 화합물들은 또한 잘 알려진 기술을 이용하여 리포솜(liposome)들 내에 캡슐화될 수 있다.

Ⅳ. 면역 반응들 및 백신들

여기에 기재되는 바와 같은 회장 전달을 위한 약학 조성물들은 상기 약학 조성물에 포함되는 면역원성 생물 작용제에 대해 특이적인 개체로부터의 면역 반응을 유발하도록 설계된다. 상기 약학 조성물은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 기생충 감염, 진균 감염 또는 암을 회피하거나 감소시키도록 백신으로서 예방적으로나 치료적으로 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물들은 임의의 단계, 예를 들면, 전암, 암 또는 전이 단계들에서 치료하거나 질병이나 감염을 방지하도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 여기에 기재되는 조성물들은 인플루엔자(influenza), 간염 또는 HIV와 같은 감염의 예방이나 치료, 혹은 암의 예방이나 치료를 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법들 내에서, 약학 조성물들은 통상적으로 질병, 장애 또는 감염으로 고통 받거나 그렇지 않을 수 있는 개체에 투여된다. 일부 실시예들에 있어서, 질병, 장애 또는 감염은, 예를 들면, 해당 기술 분야에서 일반적으로 용인된 기준을 이용하여 투여 이전에 진단된다. 예를 들면, 바이러스 감염은 환자로부터의 샘플 내의 바이러스 역가(titer)의 측정에 의해 진단될 수 있고, 박테리아 감염은 상기 환자로부터의 샘플 내의 박테리아를 검출하여 진단될 수 있으며, 암은 악성 종양의 존재를 검출하여 진단될 수 있다. 약학 조성물들은 원발성 종양들의 외과적 제거 및/또는 방사선 치료 또는 종래의 화학 요법의 약물들의 투여와 같은 치료 이전에 또는 후속하여 투여될 수 있다.

면역 치료는 통상적으로 치료가 면역 반응-조절제들(예를 들면, 면역원성 생물 작용제들)의 투여로, 예를 들면, 종양들 또는 박테리아나 바이러스 감염된 세포들에 대해 반응하는 내인 숙주 면역 체계의 생체 내 자극에 의존하는 활성 면역 치료이다.

여기에 기재되는 예방 또는 치료 조성물들뿐만 아니라 복용량의 빈도는 개체들 사이에서 변화될 것이며, 표준 기술들을 이용하여 용이하게 구현될 수 있다. 통상적으로, 1 내지 52의 투여량이 52주의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 3의 투여량이 1개월의 간격으로 투여되거나, 2-3의 투여량이 매 2-3개월마다 투여된다. 일부 실시예들에 있어서, 하나 이상의 항원의 결합이, 예를 들면, 인플루엔자의 각 아형(subtype) 또는 아형 내의 다중 클레이드(clade)들에 안내되는 개별 성분들을 함유하는 연례의 인플루엔자 백신과 동시에 또는 연속하여 투여될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 간격은, 예를 들면, 특히 현재의 균주에 기초하는 연례의 독감 백신에 보다 가깝게 일 년에 한 번이 된다. 추가 백신접종은 그 이후에 주기적으로 이루어질 수 있다. 선택적인 연구 계획이 각각의 환자들 및 특정한 질병들과 장애들을 위해 적절할 수 있다.

적합한 투여량은, 전술한 바와 같이 투여될 때, 예를 들면, 항종양, 항바이러스 또는 항박테리아, 면역 반응을 증진시킬 수 있고, 기초(치료되지 않은) 레벨 이상의 적어도 15-50%, 또는 회장을 표적으로 하지 않는 치료로부터의 레벨 이상의 적어도 5-50%(예를 들면, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 1.5-폴드, 2-폴드 또는 그 이상)인 면역원성 생물 작용제의 양이다. 이러한 반응은 환자 내의 항종양 항체들을 측정하거나, 예를 들면, 환자의 종양 세포들, 환자의 바이러스로 감염된 세포들, 또는 환자의 박테리아로 감염된 세포들을 생체 외로 죽일 수 있는 세포용해 T 세포들의 백신 의존 발생에 의해 모니터될 수 있다. 이러한 백신들은 또한 백신 접종되지 않은 환자들, 또는 회장을 표적으로 하지 않는 치료를 받은 환자들과 비교하여 백신 접종된 환자들 내의 증진된 임상적 결과(예를 들면, 완전하거나 부분적이거나 보다 긴 무병 생존, 감소된 바이러스 역가들)을 이끄는 면역 반응을 발생시킬 수 있다.

일반적으로, 적절한 복용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 유익을 제공하게 충분한 양으로 활성 화합물(들)을 제공한다. 이와 같은 반응은 회장을 표적으로 하지 않는 치료로 치료된 환자들 또는 치료되지 않은 환자들과 비교하여 치료된 환자들 내에서 증진된 임상적 결과(예를 들면, 감소되거나 음성의 바이러스 역가, 보다 빈번한 완화들, 완전하거나 부분적이거나 보다 긴 무병 생존)를 구현함에 의해 모니터될 수 있다. 이러한 면역 반응들은 일반적으로 치료 전후에 환자로부터 얻어진 샘플들을 사용하여 수행될 수 있는 표준 증식, 전술한 세포독성 또는 시토카인 분석들을 이용하여 평가될 수 있다.

예를 들면, 면역원성 폴리펩티드에 대해 특이적인 체액 내의 면역원성 폴리펩티드 및 항체들 사이에 형성되는 면역 복합체(immunocomplex)들의 검출이, 예를 들면, 상기 면역원성 폴리펩티드가 연관되는 질병이나 장애에 대한 치료의 유효성을 모니터하는 데 이용될 수 있다. 치료(예를 들면, 회장을 표적으로 하는 치료)의 개시 이전과 이후에 개체로부터 취해진 체액의 샘플들이 알려진 방법들을 이용하여 상기 면역 복합체들에 대해 분석될 수 있다. 간단히는, 양 샘플들 내에서 검출되는 면역 복합체들의 숫자가 비교된다. 제1 샘플(전-표적 치료)에 대한 제2 샘플(후-표적 치료) 내의 면역 복합체들의 숫자의 상당한 변화는 성공적인 치료를 반영한다.

Ⅴ. 실험예들

장(intestine)에 대해 작은 분자들을 전달하기 위한 약학적 방법들이 알려져 있지만, 적절한 면역 인식을 위해 장에 대해 큰 생물학적 분자들을 전달하는 능력은 제대로 이해되어 있지 않다. 마우스(mouse)들은 알약을 삼킬 수 없으며, 이에 따라 동물 모델들에서 정제들로 연구를 수행하기는 어렵다. 또한, 전이유전자 항원에 대한 반응을 유발하기 위하여 백신 벡터가 전달되는 최적의 배치의 위치가 인간들 내에서 특정화되지 않았었다. 양들에 있어서, 공장이 아데노바이러스로 인코드된 전이유전자 항원에 대한 면역 반응을 유발하기 위한 가장 효과적인 표적으로 나타났었다(Mutwari 등의 "Immunology"(97:455, 1999)). 여기서, 본 발명자들은 생물 작용제들의 전달을 위해 증진된 인간 경구 복용 형태들로 몇몇 인간 또는 비인간 영장류 연구들의 결과를 보여준다.

실험예 1

소장의 어떤 영역이 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 가장 활성인지를 판단하기 위하여, 테스트들이 인간들에서 수행되었다. 소장(공장) 내에서 조기에 또는 소장(회장) 내에 나중에 방출되는 백신을 포함하는 무선 조정되는 캡슐들이 건강한 정상적인 지원자들에게 주어졌다. 작은 분자의 약물들을 전달하기 위한 무선 조정되는 캡슐들의 사용은 기재되었지만, 백신 전달에 대해서는 그렇지 않다(Digenis 등의 "Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst."(7:309, 1991)).

상기 백신은 A/CA/04/2009(rAd-HA-dsRNA)로부터 상기 인플루엔자 항원 HA을 발현시키는 재조합 아데노바이러스로 구성될 수 있었다(예를 들면, 미국 공개 특허 제2012/0244185호 참조). 전체 10¹¹의 감염 단위(infectious unit: IU)들이 0일에 각 대상에 주어졌다. 말초 혈액 내의 순환 전-형질(pre-plasma) B 세포들의 숫자들은 상기 백신의 투여 후의 0일 및 7일에 항체 분비 세포(ASC) 분석에 의해 측정되었다. 결과들은 항원 HA를 인식하는 ASC들의 숫자만을 측정한다.

결과들은 각각의 치료된 그룹들에서 면역 접종 후의 7일에 측정될 수 있었던 점을 나타낸다(도 1). 평균 반응들은 공장 투여된 그룹보다 회장 투여된 그룹 내에서 높았다. 0일에서 배경 ASC들은 무시할 수 있었다. 상기 회장에 대하여, 340 +/- 111(표준 오차)의 IgG 및 74 +/- 18의 IgA ASC들의 평균이 7일째에 관찰되었다. 상기 공장에 대하여, 평균 및 표준 오차 반응들은 118 +/- 30의 IgG 및 28 +/- 8의 IgA ASC들이었다. 상기 회장 그룹은 플라세보(placebo)와 상당히 달랐다(IgA ASC에 대해 7일째에 P=0.03 및 IgG ASC에 대해 보다 높은 p=0.07). 양들에서의 결과와 대조적으로, 인간들에서의 결과들은 회장 전달이 공장 전달보다 IgG 또는 IgA 항체 반응을 강하게 유발하는 점을 나타낸다.

T 세포 반응들 또한 엘리스포트®(ELISPOT®) 분석을 이용하여 인터페론-γ방출(IFN-γ)를 검출함에 의해 결정되었다. 도 2는 상기 회장-투여된 그룹의 12/12가 투여 후 7일에 상기 공장-투여된 그룹의 8/12에 비해 증가된 IFN-γ을 레벨들을 가졌던 점을 나타낸다. 또한, IFN-γ 레벨들은 상기 공장-투여된 그룹에서 보다 상기 회장-투여된 그룹에서 상당히 높았다.

인플루엔자 A/CA/07/2009에 대한 마이크로중화(microneutralizing: MN) 항체 역가들이 측정되었다. 증가된 MN 항체 레벨들은 중화 항체 반응을 나타낸다. 40보다 큰 초기 중화 항체 반응을 가졌던 대상들을 배제한 후(Faix 등의 "PloS One"(7:e34581, 2012), MN 역가들의 폴드(fold) 증가들이 각각의 대상들에 대해 도표화되었다. 양의 증가를 갖는 대상들의 숫자는 공장 전달된 백신에 대해 10 중의 6에 비하여 상기 회장 전달된 백신에 대해 10 중의 9였다(도 3). 기하평균 역가(geometric mean titer: GMT)들은 두 그룹들 사이에서 비슷하였고, 상기 공장 GMT가 18로부터 90까지 상승되었던 것에 비하여 상기 회장 GMT는 22로부터 92까지 상승되었다. 결과들은 회장 방출이 인플루엔자에 대한 중화 항체 반응들을 유도하는 데 보다 신뢰성 있고, 인플루엔자에 대해 보호되는 대상들의 보다 큰 퍼센티지를 가져오는 점을 나타낸다.

실험예 2

정제들은 유동 보조제로 건식 실리카(fumed silica) 및 정제 윤활제로 스테아린산 마그네슘을 함유하는 방사선 불투과성 물질로서 10%의 황산바륨을 포함하는 미세결정 셀룰로오스(PH-101, FMC) 및 녹말(스타크(Starch) 1500, 칼러콘(Colorcon))를 사용하여 수제로 제조되었다. 7.14㎜의 직경 및 150㎎의 중량의 정제들은 상기 장용성 코팅이 첨가되었던 지 10%의 코팅 고체 중량 증가를 이용하여 팬 코터 내에서 유드라지트®L-100로 코팅되었고, 코팅 고체들은 4파트(part)의 유드라지트®중합체, 1파트의 트리에틸 시트레이트 및 1파트의 탈크를 함유하였다. 장용성 코팅 성능의 초기 테스트로서, 네 마리의 사이놀몰구스 마카크(cynomolgus macaque)들에게 경구 위관(gastric tube)을 이용하여 정제들에 주어졌다. 상기 경구 위관은 고체이고 경질이지만, 액체들을 불어넣기 위해 중심이 아래로 중공형이다. 이는 작은 정제를 제 위치에 유지할 수 있는 경질의 튜브의 앞 단부 상에 유연한 실리콘 튜브를 가진다. 튜브 및 알약 장치는 상기 앞 단부가 본문 괄약근(cardiac sphincter)을 지나 위장으로 가기까지 속박된 원숭이들의 식도에 아래로 나사형이었다. 오렌지 주스의 수세가 알약을 위장 내로 몰아넣는 데 이용되었다. X-선들은 설정된 시점들에서 취해졌고, 상기 정제의 위치와 용해가 조사되었다. 표 1에는 결과들이 요약된다.

도 4는 상기 정제들이 위장의 낮은 pH 환경에서 완전히 온전하였던 점을 내타내며; 상기 정제들의 조기 용해의 증거는 없었다. 원숭이들에게는 컸지만, 상기 정제들은 장 내로 위장관을 통과할 수 있었다. 상기 장 내에서, 이들은 충분한 속도로 용해되었고, 4마리 중 3마리의 원숭이들에서 완전히 용해되었다. 네 번째 원숭이에서, 상기 알약은 3시간 후에 일부가 위장 속에 남아 있었고, 상기 알약은 마지막 x-선의 시간에서도 용해되지 않았다. 전체적으로, 상기 정제들은 용인되는 방식으로 수행되었고, 상기 유드라지트®L-100 코팅이 향후의 인간 연구들을 위해 선택되었다.

실험예 3

H1 계절성 인플루엔자에 대한 재조합 Ad 혈청형(serotype) 5(rAd5)계 경구 백신의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위해 무작위적이고 플라세보-대조된 집단으로 페이스(phase) 1의 순차적으로 등록된 임상 연구가 완료되었다. 상기 rAd5 벡터(rAd-HA-dsRNA with HA from A/CA/04/2009)는 실험예 1에 기술되어 있었다. 연구는 대략 3개월의 활성기를 가졌고, 미국 연방 규칙들 및 의약품 국제 조화 회의 지침들에 해당되는 임상 시험 관리 지침들에 따라 수행되었다. 모든 대상들로부터 위험성에 대한 논의 후에 사전 동의를 수득하였다. IRB 승인은 대상들의 복용 이전에 주어졌다.

우수의약품 제조관리 기준(GMP)-등급의 rAd-HA-dsRNA가 론자 바이올로지컬즈(Lonza Biologicals)(휴스턴, 텍사스주)에서 웨이브®(Wave®) 백들(GE 헬스케어(Healthcare), 워케샤, 위스콘신주) 내에 생산되었다. 정화는 완충 교환이 수반되는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 정제된 벡터는 부형제(excipient)들과 혼합되었고, 감압 하에 동결 건조되었으며, 이후에 정제화하는 벌크(bulk)로서 미세결정 셀룰로오스 및 녹말을 이용하여 론자(Lonza)에서 정제화되었다. 정제들은 벡터 하이코터®(Vector HiCoater®) LDCS-5 코터(벡터 프로인트(Vector Freund), 시더래피즈, 아이오와주)를 이용하여 유드라지트®L 100(에포닉 인더스트리즈(Evonik Industries), 다름슈타트, 독일)으로 장용 코팅되었다. 최종 생성물은 하나의 로트로 방출되었고, 표준 IU 분석에 의해 적정되었다. 플라세보는 장용성 코팅 없이 150㎎의 미세결정 셀룰로오스를 함유하는 크기 및 형상이 조절된 정제들과 유사하게 제조되었다. 연구들은 전이유전자에 면역 반응을 유발하는 능력에 대하여 10⁹IU, 10¹⁰IU 및 플라세보로 치료된 대상들을 비교하였다. 대상들에게는 0일 및 28일에 정제들이 주어졌다.

말초 혈액 내의 순환 전-형질 B 세포들의 숫자들이 ASC 분석들에 의해 초기 투여량 후의 0일 및 7일 그리고, 제2의 투여량(제2의 투여량은 28일에 전달되었다) 후의 28일 및 35일에 측정되었다. 결과들은 ASC 계수들이 치료된 그룹들에서 각 면역 접종 후의 7일째에 측정될 수 있었지만, 상기 플라세보 그룹(도 5)에서는 그렇지 않았던 점을 나타낸다. 평균 반응들은 7일째에 보다 높았고, 낮은 투여량(low dose)의 그룹보다 높은 투여량(higi dose)의 그룹에서 높았다. 0일 및 28일에서의 배경 ASC들은 무시할 수 있었고, 상기 플라세보 그룹에 대해서는 모든 시점들에서 무시할 수 있었다. 높은 투여량의 그룹에 대하여, 105 +/- 33 및 27 +/- 12 ASC들의 평균이 각기 7일 및 35일에 발견되었다. 낮은 투여량의 그룹에 대하여, 평균 ASC들은 7일 및 35일에 대해 각기 41 +/- 32 및 14 +/- 8이었다. 상기 플라세보 그룹은 7일 및 35일에 각기 0.3 +/- 0.3 및 0의 평균을 가졌다. 상기 높은 투여량의 그룹은 플라세보(7일 및 35일 동안 각기 P=0.01 및 0.05)보다 상당히 높았다.

인플루엔자에 대한 중화 항체 반응들이 MN 분석에 의해 측정되었다. 결과들은 상기 플라세보 대조군에 비해 상기 치료된 그룹들에서 MN 역가들의 투여량에 의존하는 증가를 보여준다(도 6). 상기 높은 투여량의 그룹에서 적어도 2-폴드 증가를 갖는 MN 응답자들의 빈도는 상기 플라세보 그룹과 상당히 달랐던(피셔의 정확 검증(Fisher's exact test)에 의해 P=0.003) 반면, 상기 낮은 투여량이 보다 높아지는 경향이 있었지만, 플라세보(P=0.2) 보다 상당이 높지는 않았다. 40보다 큰 MN 역가들을 가졌던 대상들을 삭제한 후, 기하평균 역가(GMT)들이 남아 있는 대상들에서 계산되었다(표 2). 56일의 기하 접힘 역가 반응(Geometric Fold Titer Response: GMFR) 또한 계산되었다(표 2). 이들 결과들은 상기 높은 투여량의 그룹에서 GMT 면역 접종 후에 3-폴드보다 큰 증가로 경구 면역 접종에 의해 발생되는 점을 나타낸다. 이들 결과들은 L-100 코팅된 정제들이 장에 대한 백신 전달을 위해 사용될 수 있는 점을 보여준다.

실험예 4

본 발명자들은 변화되는 pH 및 코팅 퍼센티지로 용해 시간들을 결정하기 위해 생체 외로 장용성 코팅들에 대한 변수들을 테스트하였다. 데이터는 낮은 pH(위장 속에서와 같이)에서 위 노출 및 회장에 도달하기 이전에 증가하는 pH 변화도(십이지장 및 공장 내에 발견되는 바와 같이)를 통한 후속하는 이송에 뒤따르는 회장 전달을 위한 지침들을 제공한다.

정제 분해는 유기 용매 서스펜션(suspension)으로 유드라지트®L100, 유드라지트®L100-55 또는 L100 및 L100-55 중합체들의 1：1(w/w) 혼합물을 활용하여 전술한 바와 같이 제조되고, 8%, 10% 또는 12%의 전체 고체 중량 증가로 코팅된 150㎎의 정제들로 테스트되었다. 이중으로, 코팅 적용의 각 레벨에서 각 코팅 중합체로 제조된 정제들은 반켈 바이오 디스(VanKel Bio-Dis) 왕복 실린더 용해 시험 장치 내에서 분당 10회 담금(DPM)의 왕복 속도로 37℃에서 120분 동안 USP 모의 위액(SGF, pH 1.6, 펩신 없음)에 미리 노출되었다. 상기 정제들은 이후에 USP 모의 장액(SIF, pH 6.8, 판크레아틴(pancreatin) 없음)으로 이송되었다. 정제들은 분해에 대해 관찰되었고, 양 정제들의 분해가 완료되는 시간이 5분에 가깝게 기록되었다. 데이터는 분해 시간이 양 폴리머 조성물 및 두께에 의해 영향을 받으며, 정제들이 위장을 떠난 후에 상기 코팅들의 행동에 영향을 미치도록 코팅 조성물의 적절한 선택에 관한 기준을 제공하는 점을 나타낸다.

분해 시간에 대한 pH의 효과는 유드라지트®L100 또는 유드라지트®L100-55를 갖는 10%의 전체 고체 중량 증가까지 코팅된 150㎎의 정제들로 테스트되었다. 일련의 완충제들이 6.8의 USP 사양을 포괄하는 값들까지 USP SIF(판크레아틴 없음)의 pH를 조절하여 제조되었다. 정제들은 USP SGF(펩신 없음)에 120분 동안 37℃ 및 10DPM에서 미리 노출되었고, 이후에 pH-변경된 USP SIF 용액들로 전송되었다. 상기 정제들은 분해 동안 관찰되었고, 분해가 완료되는 시간은 5분에 가까이 기록되었다. 상기 데이터는 분해의 속도가 환경적 pH에 의해 영향을 받으며, 두 중합체들 사이에서 다른 점을 나타낸다. 다시, 결과들은 위장 및 상부 소장을 통한 약물 유지를 구현하도록 코팅 조성물의 적절한 선택을 위해 이용될 수 있다.

실험예 5

본 발명자들은 H1 계절성 인플루엔자에 대한 재조합 Ad 혈청형 5(rAd5)계 경구 백신의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위해 무작위적이고 플라세보-대조된 집단으로 페이스 1의 순차적으로 등록된 연구를 수행하였다. 상기 백신을 함유하는 정제들은 회장 내에서 용해되도록 전술한 바와 같이 코팅되었다. 데이터는 경구 정제 백신이 인플루엔자에 대한 중화 항체 반응들을 유발하는 측면에서 현존하는 백신들과 경쟁될 수 있었던 점을 보여준다.

적혈구응집 억제(Hemagglutination Inhibition: HAI) 반응들은 0일 및 28일에 측정되었다(도 7A). 혈청 변환된 플라세보로 치료된 대상은 없었지만, 하나의 플라세보 대상이 선별을 통해 탈락되었고 높은 0일째 값을 가졌다. 출발 HAI 역가＞20을 가졌던 백신 대상들은 없었다. 면역 접종 후, 백신 그룹에서 아홉의 대상들이 혈청 방어 레벨들(HAI≥40)(도 7A)에 도달하였다. 상기 그룹에 대한 기하평균 역가(GMT)는 61ㆍ1(95% CI: 30-124)이었고, 7ㆍ9의 초기 GMT(95% CI: 6-11) 이상의 7.7-폴드 기하평균 폴드 상승(GMFR)이었다. 열하나의 4-폴드 상승자들(92%) 중에서, 4-폴드를 나타내는 다른 2명의 대상들과 혈청 변환된 아홉이 5부터 20까지 HAI 역가가 증가하였다. 상기 백신 그룹은 플라세보에 비해 4-폴드의 응답자들의 숫자의 통계적으로 상당한 증가를 가졌다(피셔의 정확 검증에 의해 P＜0·0000으로 11 대 0). 상기 플라세보 대상들은 0일에 11.0의 GMT(95% CI: 5-23)에 비하여 28일에 11.9의 GMT(95% CI: 6-25)를 가졌다.

상기 항체 반응의 지속성은 면역 접종 후의 180일에 HAI 반응을 조사하여 측정되었다. 백신 면역 그룹에서, 대상들의 75%(12 중의 9)는 28일째에 혈청 보호되었고, 75%(12 중의 9)는 180일째에 여전히 혈청 보호되었다. 상기 HAI GMT가 도표로 도시되었고(도 7B), 상기 GMT의 감소는 면역 접종 후의 28일 및 180일 사이에서 28%로 발견되었다.

인플루엔자에 대한 중화 항체 반응들이 MN 분석에 의해 측정되었다. 상기 플라세보 대조군에 비해 상기 치료된 그룹에서 MN 역가들의 상당한 감소들이 관찰되었다(도 7C). 백신 치료 그룹에서 4-폴드 MN 응답자들의 빈도는 상기 플라세보 그룹과 상당히 달랐으며, 상기 플라세보 그룹에서 O명이었던 것(피셔의 정확 검증에 의해 P＜0·0000)에 비해 상기 백신 치료 그룹에서 11명의 대상들이 응답하였다.

40보다 큰 기초 MN 역가들(및 HAI 역가들)을 가졌던 대상들을 삭제한 후, 기하평균 역가(GMT)들이 다음 표에 나타낸 바와 같이 0일 및 28일에 남아 있는 대상들에서 계산되었다. 9·6의 28일 동안의 상기 플라세보 GMT에서 상승이 없었던 것(95 CI: 5-18)에 비하여 상기 백신 그룹에 대한 GMT는 247까지 상승하였다(95 CI: 89-685). 이들 계산들은 높은 초기 MN 또는 HAI 역가들을 가졌던 대상들이 없기 때문에 상기 백신 그룹에 대해 영향을 미치지 않았다. 이들 결과들은 상기 백신 치료 그룹에서 면역 접종 후에 GMT의 20-폴드보다 큰 인플루엔자에 대한 중화 항체 역가들이 경구 면역 접종에 의해 발생되는 점을 나타낸다.

HA에 대한 전체 항체 반응들을 측정하기 위하여, 말초 혈액 내의 순환 전-형질 B 세포들의 숫자들이 면역 접종 후 0일 및 7일에 ASC 분석에 의해 측정되었다. 결과들은 ASC들이 상기 백신 치료 그룹에서 7일째에 신뢰성 있게 측정될 수 있는 점을 나타낸다(도 7D). 배경 ASC들은 0일에 일반적으로 무시할 수 있었다. 상기 백신 치료 그룹에 대하여, 각기 1×10⁶의 PBMC 당 992(+/- 표준 오차 209, 95% CI: 532-1452) IgG ASC들 및 337 IgA ASC들(+/- 표준 오차 104, 95% CI: 117-580)의 평균이 7일 동안 발견되었고, 12 중의 하나의 대상만이 검출 가능한ASC 반응을 갖지 않았다. 상기 플라세보 그룹은 7일째에 IgA 반점들을 가지지 않았지만, 하나의 대상이 높은 배경 도말(smear) 및 정상적으로 관찰되었던 경우보다 작은 반점들을 갖는 측정 가능한 IgG ASC 반응을 나타내었다. 상기 치료된 그룹은 7일에 IgG 또는 IgA ASC 반응을 유발하는 능력의 측면에서 플라세보와 상당히 달랐다(T 테스트에 의해 각기 P=0ㆍ0007 및 P=0.008).

대상들은 면역 접종 전후의 이들의 항벡터 역가들에 대해 소급하여 측정되었다. 경구 면역 접종에 후속하여, 몇몇의 백신 치료된 대상들은 플라세보로 치료된 대상들 내의 1ㆍ0-폴드 GM 폴드 상승에 비하여 GM 중화 항체 역가들의 2ㆍ6-폴드 증가를 가져왔던 Ad5에 대한 중화 항체 반응들의 증가를 보였다. 상기 백신 그룹에서, HAI 및 MN 반응들은 각각의 대상들에 대해 유사한 경향을 보였다. 여덟의 대상들이 면역 접종 전에 Ad5 음성이었고, 넷이 면역 접종 전에 Ad5 양성이었다. Ad5 양성이었던 하나의 대상은 HAI 혈청 변환되지 않았지만, Ad5 양성이었던 하나의 대상이 상기 연구에서 상기 대상들의 임의의 하나의 HAI 역가들(64 폴드)의 가장 높은 증가를 보였다. 이와 같은 동일한 대상은 면역 접종 전후에 Ad5 중화 항체 역가들의 어떠한 증가 없이 362 폴드의 MN 역가들의 증가를 보였다. 상기 정제 백신으로 면역화된 대상들에 대하여 폴드 MN 반응(또는 HAI 반응)에 비해 출발 Ad5 역가들 사이의 연관성은 관찰되지 않았다.

또한, 본 발명에서 개시되는 정제 백신은 실온에서 270일 이상 동안 안정하고, 보다 높은 온도들에서 단기적인 이동을 견딜 수 있으며, 이러한 접근을 기술적으로 실현 가능하게 한다.

실험예 5: 논의

미국 군대에서 군대 인원에서 중화 항체 반응들에 대한 그들의 계절성 백신 캠페인들의 효과들을 측정하기 위해 독립적인 연구가 수행되었고, 40 이상의 MN 역가들을 가졌단 대상들을 출발로 계수한 후에, 3가의 비활성화된 백신(TIV) 주사 후의 5.6의 MN 역가 GMFR 및 살아 있고 약화된 인플루엔자 백신(LAIV) 비강 투여에 후속하는 2.2의 GMFR이 보고되었다(Faix 등의 "PloS one"(7:e34581, 2012). 다른 연구에서, H1N1에 대한 SC 비율은 45㎍의 HA 단백질의 한 번의 주사(보조제 없이)에 대해 45%로 발견되었던(Gordon 등의 "Vaccine"(30:5407, 2012) 반면, 다른 하나에서, H1N1 백신은 분할 백신의 1의 투여량 후에 관찰된 78%의 SC 비율로 높은 면역원성이었다(Greenberg 등의 361:2405, 2009).

주입된 백신들로 관찰된 가변적인 결과들과 대조적으로, 본 연구에 있어서, MN GMFR은 MN 역가들에서 4-폴드 이상의 상승을 보이는 대상들의 92%로 12의 백신 치료된 대상들에 대해 29에서 계산되었다. 본 발명의 정제 연구에서, 백신 치료된 대상들 중에서 HAI SC 비율은 HAI 역가들에서 4-폴드 상승을 가지는 대상들의 92% 이상으로 75%였다(도 7A). MN 역가들은 HAI 역가들보다 높았다. MN 분석이 보다 민감하거나, 경구 rAd계 백신이 단백질 주사된 백신들보다 헤드(head) 영역 외부에서 강한 중화 반응들을 유발하는 것이 가능하다.

HAI 반응들은 주사된 상업적 백신들로 유발되지만, HAI 역가들은 약해지는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, HIV 감염되지 않은 지원자들은 면역 접종 후의 1개월과 6개월 사이에 GMT HAI 역가들의 67%의 강하를 보였다(Crum-Cianflone 등의 "Vaccine"(29:3183, 2011). 유사하게, 혈청 보호된 대상들의 퍼센티지는 혈청 반응 음성의 HAI 역가들로 등록된 HIV 음성 대상들에 대해 75%로부터 56%까지 떨어졌다(≤1：10). 유행성 인플루엔자 백신들로의 연구들은 또한 지속성의 감소를 나타내었다. AS03 조류 인플루엔자 백신 연구에서, GMT는 2의 백신 투여량들 후에 563에 도달하였지만, 면역 접종 후의 6개월에서, GMT는 18로 96%의 감소를 나타내었다(Leroux-Roels 등의 "Vaccine"(28:849, 2010). 본 발명의 정제 백신 연구에서, 혈청 보호된 대상들의 퍼센티지는 면역 접종 후의 1개월 및 6개월에서 75%로 일정하게 남았으며, HAI GMT 역가 하강은 덜 급격하게 28%의 감소만을 보여주었다(도 7B). 하나의 가능성은 향상된 T 세포 반응들 때문에 지속성이 벡터계 백신들에 대해 보다 우수한 점이다.

실험예 5: 물질들 및 방법들

임상 연구 계획 및 등록. 대상들은 등록의 45일 이내에 적혈구응집 억제(HAI) 역가들에 대해 미리 선별되었다. ≤1：20의 초기 HAI 역가를 가져야했던 연구 참여 대상들에 대해 무시할 수 있도록 하기 위하여, 18세 내지 49세 사이의 연령 및 우수한 건강 상태에 있었다. 상기 시험의 활동기는 1년 동안 계속되는 안전성을 모니터링하기 위한 후속기로 28일에 걸쳤다.

24의 대상들이 등록되었다. 등록된 모든 대상들은 활성기를 통해서와 180일의 모니터링기를 통해서 안전성 및 면역원성 평가들을 완료하였다.

랜덤화(randomization) 및 마스킹(masking). 상기 연구는 플라세보 대조군으로 정해진 12의 대상들과 함께 1×10¹¹감염 단위(IU)들의 단일 투여량에서 12의 대상들 내의 백신(VXA-A1ㆍ1)을 평가하도록 설계되었다. 매 24시간의 한 명 보다 빈번하지 않게 투여된 각 대상으로 3명의 순차적으로 등록된 감시 백신 치료된 대상들이 있었다. 백신 연관 독성들에 대해 일주일의 모니터링 후, 치료된 집단(9) 내의 남아 있는 대상들이 12의 플라세보 대조군들과 함께 임의 추출되었다. 랜덤화는 컴퓨터로 생성된 할당으로 수행되었고, 연구 약물은 맹검되지 않은 약사에 의해 맹검된 스탭에 대해 정체를 숨기고 분배되었다. 모든 조사 부위의 스탭뿐만 아니라 면역학적 분석이 직접 수반되는 사람들 또는 임상적 안전성의 평가는 치료 평가들에 대해 맹검되게 남았다. 모든 대상들은 상기 연구에서 맹검되었다.

백신. rAd 벡터(복제하는 Ad5가 없음)는 그 발현이 별도의 프로모터에 구현되는 CMV 프로모터 및 분자 dsRNA 머리핀형에 의해 구현되는 HA(A/CA/04/2009) 전이유전자를 인코드하는 DNA를 운반한다. GMP 약물 물질은 론자 바이올로지컬즈(휴스턴, 텍사스)에서 웨이브 백들(GE 헬스케어, 워케샤, 위스콘신주) 내에 생성되었다. 정화는 완충 교환이 수반되는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 정제된 벡터는 부형제들과 혼합되었고, 감압 하에서 동결 건조되었으며, 이후에 정제화 벌크로서 미세결정 셀룰로오스 및 녹말을 사용하여 론자에서 정제화되었다. 정제들은 벡터 하이-코터 시스템(벡터 프로인트, 시더래피즈, 아이오와주)를 이용하여 유드라지트 L100®(에포닉 인더스트리즈, 다름슈타트, 독일)로 장용 코팅되었다. 최종 생성물은 하나의 로트로 방출되었고, 론자에서 표준 IU 분석에 의해 적정되었다. 플라세보는 장용성 코팅 없이 150㎎의 미세결정 셀룰로오스를 함유하는 유사하게 크기와 형상이 조절된 정제들로서 제조되었다.

종말점(endpoint)들. 이러한 연구의 일차적인 종말점은 안전성이며, 이차적인 종말점은 주로 HAI 역가들 및 HAI 혈청 전환들에 의해 활성기를 통한 면역원성이다. 추가적인 면역학적 종말점들은 MN 역가들 및 ASC들을 포함한다. 상기 플라세보 그룹에서 5의 이상 반응들이 있었고, 상기 백신 그룹에서 5의 이상 반응들이 있었으며, 이들 모두는 중증도에서 등급 1이었다. 상기 연구에서 심각한 이상 반응들은 보고되지 않았다.

PBMC 분리 및 냉동 보존. 혈액은 K₃EDTA 배큐테이너®(Vacutainer®) 튜브들(BD, 프랭클린 레이크스, 뉴저지주) 내에 수집되었고, PBMC들은 림포프렙™(Lymphoprep™) 튜브들(액시스-쉴드(Axis-Shield), 노르웨이)을 이용하여 같은 날에 분리되었다. PBMC들은 냉동되었고, 제조업자의 지시(셀룰라 테크놀로지(주)(Cellular Technology Ltd)[CTL], 셰이커하이츠, 오하이오주)에 따라 무혈청 시약들을 사용하여 해동되었다.

항체 분비 세포(ASC)들. gG 및 IgA 분비 B 세포들에 대한 효소 결합 면역 흡착(Enzyme linked immunosorbent: ELISpot) 키트들이 제조업자(맵테크(Mabtech), 마리몬트, 오하이오주)의 지시에 따라 수행되었다. 세포들은 반점들을 최적화하도록 CTL-테스트 배지 내의 삼중 웰(well)들(웰 당 1ㆍ5×10⁴내지 5×10⁵세포들 사이) 내에서 배양되었다. HA 단백질(프로테인 사이언스사(Protein Sciences Corp), 메디렌, 코네티켓주)은 바이오티닐화(biotinylation) 키트(피어스(Pierce), 록퍼드, 일리노이주)를 이용하여 바이오티닐화되었고, 양이 평가되었다.

항체 분석. HAI 및 마이크로중화(MN) 역가들이 수행되었고, MDCK 유래 A/CA/07/2009 및 계란 유래 A/CA/07/2009에 대해 각기 측정되었다. 10보다 작은 HAI 및 MN 역가들은 규제 권고에서 제시되는 바와 같이 5로 표기되었다.

통계적 분석. 쌍을 이루지 않은 스튜던츠(Students) "t" 검정들이 그룹들 사이의 중요한 차이들을 테스트하기 위해 수행되었다. 양쪽 검정의 피셔의 정확 검증이 관찰된 빈도들이 본문에 기재된 바와 같이 일부 분석들에 대해 달랐던 지를 판단하는 데 이용되었다. 양 테스트들에 대하여, ≤0.05의 p 값들이 중요한 것으로 간주되었다. 95퍼센트의 신뢰 구간들(95 CI)이 측정된 값들에 대해 제공되었다.

여기에 기재되는 실험예들과 실시예들이 예시적인 목적들만을 위한 것이고, 이들에 비추어 다양한 변경들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게 제시될 것이며, 본 출원의 사상과 범위 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 점이 이해될 것이다. 여기서 언급되는 모든 공개 특허들, 특허들, 특허 출원들, 웹사이트들 및 데이터베이스 첨가 엔트리들은 모든 목적을 위해 그 개시 사항들이 여기에 참조로 포함된다.

Claims

대상에 면역 반응을 유발하기 위한 면역원성 조성물(immunogenic composition)에 있어서,
대상의 회장(ileum)에 대해 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector)를 직접 전달하고, 방출하는 장용성 코팅(enteric coating)에 포함되는 이종 면역원성 폴리펩티드(heterologous immunogenic polypeptide)를 인코딩하는 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하며, 상기 장용성 코팅은 5.8-6.8의 문턱 pH를 가지고, 상기 장용성 코팅은 폴리(poly)(메타크릴산(methacrylic acid)-코(co)-메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate)) 1:1, 유드라지트®(Eudragit®) L-100, 유드라지트® L100-55, 폴리(poly)(메타크릴산(methacrylic acid)-코(co)-에틸 아크릴레이트(ethyl acrylate)) 1:1, 폴리(poly)(메타크릴산(methacrylic acid)-코(co)-메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate)) 1:2, 그리고 유드라지트® S100으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 5.8, 5.9, 6.0, 또는 6.1의 문턱 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 6.0의 문턱 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 pH 5.8-6.8에서 110분 내에 그 최초 두께에 비해 적어도 75%가 분해되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서, 적어도 70%의 상기 아데노바이러스 벡터가 상기 회장 내로 방출되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1:1을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100 및 유드라지트®L100-55의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100, 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate) 및 탈크(talc)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 9 항에 있어서, 1-4파트의 유드라지트®L-100, 1-2파트의 트리에틸 시트레이트 및 1-2파트의 탈크를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：1 및 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1：1의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：1에 대한 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1：1의 비율은 1：4 내지 4：1인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：1 및 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：2를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：2에 대한 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：1의 비율은 1：2 내지 2：1인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100 및 유드라지트®S100의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 1 내지 4파트의 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：1 및 폴리(메타크릴산-코-메틸 아크릴레이트) 1：2; 1 내지 2파트의 트리에틸 시트레이트; 그리고 1 내지 2파트의 탈크를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：2 및 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1：1의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1：1에 대한 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：2의 비율은 1：4 내지 4：1인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 유드라지트®L-100-55 및 유드라지트®S100의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장용성 코팅은 1 내지 4파트의 폴리(메타크릴산-코-메틸 메타크릴레이트) 1：2 및 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1：1; 1 내지 2파트의 트리에틸 시트레이트; 그리고 1 내지 2파트의 탈크를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 dsRNA를 더 인코드하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 압축된 정제(tablet)의 형태인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 5형 벡터이고, TLR3 작용제 dsRNA를 더 인코드하며, 상기 이종 면역원성 폴리펩티드는 바이러스 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
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