KR20060115345A

KR20060115345A - 점막 면역을 유도할 수 있는 보강제를 함유한 신규한 백신

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Publication number: KR20060115345A
Application number: KR1020067002870A
Authority: KR
Inventors: 히데키 하세가와; 다케시 구라타; 데츠타로우 사타; 마사미 모리야마; 신-이치 다무라; 다케후미 다니모토
Original assignee: 사이단호진한다이비세이부쯔뵤우겐큐우카이; 국립감염증연구소장이 대표하는 일본국; 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2003-08-11
Filing date: 2004-08-10
Publication date: 2006-11-08
Also published as: JP4817625B2; KR101280094B1; EP1666059A4; JP2005097267A; AU2004263037A1; CN1867355A; RU2006107537A; EP1666059A1; CN103446582A; RU2390351C2; WO2005014038A1; US20070219149A1; AU2004263037B2

Abstract

종래의 보강제에 비해 우수한 보강제 능력을 지니고, 여러 균주에 대하여 방어 반응을 일으킬 수 있는 보강제. 상기 보강제는, 이중 가닥 RNA (예를 들어, Poly(I:C) 를 서브유닛 항원과 함께 사용할 경우 예상 밖으로 상기 능력을 가진다는 발견을 기초로 개발되었다. 따라서, 이중 가닥 RNA (A) 및, 병원체로서 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원 (B) 를 포함하는 점막 투여용 백신이 제공된다.

Description

점막 면역을 유도할 수 있는 보강제를 함유한 신규한 백신 {NOVEL VACCINE CONTAINING ADJUVANT CAPABLE OF INDUCING MUCOSAL IMMUNITY}

본 발명은 신규한 백신 조성물에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 보강제로서 이중-가닥 RNA 를 이용한 신규 백신에 관한 것이다.

현재 이용가능한 승인된 백신은 다음과 같은 한계를 지닌다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 (특히 타입 A 인플루엔자 바이러스) 에 있어서, 항원 돌연변이가 상당히 발생하여, 이전에 투여된 백신 (즉, 기존에 얻은 감염) 에 의해 생성된 항체로는 중화되지 않는 바이러스가 빈번하게 출현한다; 백신 효과는 종종 오로지 한 시즌 동안만 지속된다. 또한, 표면 당단백질 (헤마글루티닌 [HA] 및 뉴라미니다제(neuraminidase) [NA]) 을 암호화하는 유전자에서의 점 돌연변이 (항원 소변이) 및 항원 대변이로 인하여 면역학적으로 상이한 신규 균주가 종종 출현한다. 이 경우, 내부 단백질은 불연속적으로 변이된 균주 및 연속적으로 변이된 균주에서 조차도 비교적 높은 수준으로 보존된다는 점을 유의해야한다. 현재 이용가능한 백신을 이용한 면역화는 세포성 면역을 기초로 한 이종 균주 간의 공통적 면역(common immunity) 보다는 균질 균주 간의 체액성 면역만을 유도하므로, 유행성 균주(epidemic strain) 및 백신 균주가 서로 상이할 경우 백신 효과가 떨어지 게 된다.

다른 결점은, 인플루엔자 바이러스의 우세한 풍토성 균주 (endemic strain) 에 한 해로부터 그 다음 해에 이르기까지 상당한 항원 대변이 또는 항원 소변이가 일어나지 않더라도, 항체 역가가 감소하므로 면역화 작업을 매년마다 실시해야한다는 점이다. 혈구응집억제 (HI) 및 중화를 위한 항체는 수개월 내지 수년간 지속된 다음 서서히 감소된다고 보고되었다. 그러나, 그러한 감소가 일어나지 않더라도, 1년에 한 번씩 접종할 것을 권고하고 있다. 이는 백신 접종 후 1년 이내에 항체 역가가 감소할 수 있기 때문이다.

백신의 효능을 개선할 여지가 있다. 이는, 다음 시즌의 백신은 다음 유행성 균주를 예측하는 데 달려있기 때문이다. 그러므로, 상기 예측은 부정확성할 수 있으며, 백신에 사용되는 균주와 실제로 외부에 유행하는 균주 사이에 불일치가 일어날 수 있다. 또한, 신종 균주가 출현할 경우, 예비된 백신은, 예를 들어 1992 및 1993 년 인플루엔자 유행기 사이에 출현한 신종 H3N2 균주 (A/Beijing/92) 에 대하여 종종 무력화된다. 신종 바이러스는 종종 인플루엔자 유행기의 후반기까지는 임상적으로 불분명하고, 기존의 백신을 이용한 방어는 승인된 백신의 생산 및 준비 작업에 소요되는 시간으로 인해 종종 만족스럽지 못하다. 백신 균주와 유행성 균주가 서로 잘 일치하는 경우라도, 승인된 백신은 어린이와 성인의 약 70% 및 노인 인구의 30 내지 40% 의 질병 만을 예방하는 것으로 알려져 있다.

종래의 백신으로는, 점막 (예컨대, 비강) 면역화를 수행하기가 거의 불가능 하다; 특히, 인플루엔자 바이러스용 백신 접종의 주류를 대표하는 피하 접종 유형의 현재 이용가능한 사백신, 성분 백신 (component vaccine) 등은 점막 면역을 생성할 수 없다고 알려져 있다; 그러한 점막 면역을 일으킬 수 있는 백신 조성물이 강하게 요구된다.

또한, 종래의 백신은 상이한 균주 사이에도 교차 면역을 생성시킬 수 없으므로, 최소한 상이한 균주 간 또는 상이한 아형 간에 교차 면역을 생성시킬 수 있는 백신의 개발 또한 강하게 요구된다. 두 종류의 타입 A 균주 및 한 종류의 타입 B 균주의 혼합물이 주류인 인플루엔자 백신의 경우, 특히 풍토성 균주의 예측 필요성을 제거하거나 최소한 축소시키는 백신의 개발이 강하게 요구된다.

더욱이, 편리한 백신 접종 방법인 점막 접종에 효과적인 백신 또한 매우 필요하다. 이는 인플루엔자 바이러스 등에 있어서는 이루어지지 않았으므로, 특히 대량 면역 접종 또한 촉진하기 위한 해결 방안이 요구된다. 다르게는, 항체의 지속성을 증가시키는 백신에 대한 요구 또한 상당하다.

비-특허 문헌 1 (J. Clinical Investigation, 110(8), 1175-l184 (2002)) 은 보강제로서 Poly(I:C) 와 함께 UV-불활성화된 전(whole) 인플루엔자 바이러스를 기도 경로를 통해 투여한 것을 개시하였다. 그러나, Poly(I:C) 를 첨가하든 첨가하지 않든 IgG 항체 상승에 차이가 없다는 사실이 비-특허 문헌 1 의 도 2 에 나타나있다. 그러므로, Poly(I:C) 는 보강제로서 그다지 효과적이지 않은 것으로 추정되었다. 상기 문헌은 또한 항체 수준 상승을 위한 단쇄 인지질과의 조합을 기술하고 있다.

비-특허 문헌 2 (Invest. Ophthalmol., 10(10), 750-759 (1971)) 및 비-특허 문헌 3 (Invest. Ophthalmol., 10(10), 760-769 (1971)) 은 불활성화된 우두 바이러스를 보강제로서 Poly(I:C) 와 함께 비강 접종하는 것을 기술하고 있다. 그러나, 비-특허 문헌 2 는 눈물 내 IgA 항체 생성의 증가를 기술하고 있으나 감염 예방 (infection-preventive) 효과에 대해서는 언급하고 있지 않다.

특허 문헌 1 (일본 특허 심사 공개 공보 No. SHO-50-2009 (US3906092), Merck & Co.) 은 폴리뉴클레오티드 (Poly(I:C) 포함) 를 흡착식 보강제에 첨가함으로써 인플루엔자 백신의 항체 반응이 강화된다는 것을 개시하고 있다. 그러나, 위 특허 문헌 1 은 감염 예방 효과에 대해서 언급하고 있지 않다.

비-특허 문헌 4 (Veterinary Microbiology, 88(4), 325-338 (2002)) 는 사백신을 보강제로서 Poly(I:C) 와 함께 복강내 접종한 후 IgG 및 IgM 수준이 상당히 증가하였음을 보고하고 있지만, 비강 등에 점막 투여함에 의한 효과를 보여주지는 못하며, 더욱이 감염 예방 효과에 대하여 언급하고 있지 않다.

비-특허 문헌 5 (Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 133, 334-338 (1970)) 는 양(sheep) 적혈구를 보강제로서 Poly(I:C) 와 함께 정맥내 주사하여 면역시킬 경우 혈액내 항체 수준이 상승함을 보고하고 있으나, 감염 예방 효과에 관하여는 언급하고 있지 않다.

비-특허 문헌 6 (The Journal of Immunology, 149, 981-988 (1992)) 은 보강제로서 콜레라 독소의 가능성을 기술하고 있으나, 이중-가닥 RNA 에 관해서는 전혀 언급하고 있지 않다.

특허 문헌 1: 일본 특허 심사 공개 공보 No. SHO-50-2009

비-특허 문헌 l: J. Clinical Investigation, 110(8), 1175-1184 (2002)

비-특허 문헌 2: Invest., Ophthalmol., 10(10), 750-759 (1971)

비-특허 문헌 3: Invest., Ophthalmol., 10(10), 760-769 (1971)

비-특허 문헌 4: Veterinary Microbiology, 88(4), 325-338 (2002)

비-특허 문헌 5: Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 133, 334-338 (1970)

비-특허 문헌 6: The Journal of Immunology, 149, 981-988 (1992)

본 발명의 해결 과제

상술한 상황에서, 본 발명은 임의의 종래 보강제에 비해 더 큰 보강제 잠재력을 나타내고, 점막 투여시 상이한 균주 간에 방어 반응을 일으킬 수 있는 보강제를 제공하고자 한다.

과제 해결 방안

상기 과제는 서브유닛 항원과 함께 사용했을 때 뜻밖에 상술한 잠재력을 나타내는 이중-가닥 RNA (예컨대, Poly(I:C)) 를 발견함으로써 해결되었다.

비록 현재 이용가능한 불활성화된 인플루엔자 HA 백신이 앞서 설명한 바와 같이 효과적인 백신이긴 하나, 인플루엔자 바이러스의 유입 경로인 호흡기 점막 상피에서의 IgA 항체 유도 정도는 낮다; 따라서, 상기 유도를 향상시켜서 그 효과를 더 증강시키는 것이 고려된다.

이를 고려하여, 본 발명자들은 인플루엔자 마우스 모델에서 비강내 백신을 보강제와 함께 이용하여, 기도 점막에 대해 높은 교차 반응성을 보이는 분비성 IgA 항체의 생산을 시도하였다. 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB*) 을 보강제로 사용했을 때 좋은 결과를 얻었다. 그러나, 인간에게 비강내 투여를 한다는 점을 고려하자면, 콜레라 독소는 안면 신경 마비와 같은 부작용을 일으키는 것으로 보고되었다; 따라서, 콜레라 독소를 함유하지 않는 보강제를 이용하여 IgG 항체를 유도할 수 있다면, 백신의 안전성이 더 커질 것으로 생각된다. IgA 는 보체계의 제2 경로를 활성화하고, 점막 감염시 국부적 면역 반응에 있어서 중요한 역할을 한다; IgA 그 자체는 반감기 5 내지 6일의 혈장에 의해 대사되므로, 예컨대 눈물 내 IgA 가 증가하더라도 감염 예방 효과를 예측하기는 불가능한 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명자들은 신체 내의 미생물 성분을 인지하고 선천적 면역 시스템을 자극하는 톨-유사 수용체 (TLR: Toll-like receptor) 에 대한 리간드가 점막 백신을 위한 매우 안전하고 강력한 보조제로서의 잠재력을 가지고 있는지 여부를 확인하고자 조사하였고, 예상 밖의 감염 방어 효과를 갖는 점막 투여용 백신을 수득하였다.

따라서, 본 발명은 하기를 제공한다:

(1) 하기를 포함하는 점막 투여용 백신:

A) 이중-가닥 RNA; 및

B) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원.

(2) 상기 (1) 에 있어서, 상기 점막이 비점막 (nasal mucosa) 을 포함하는 백신.

(3) 상기 (1) 에 있어서, 상기 병원체를, 수두 바이러스(varicella virus), 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 폴리오바이러스(poliovirus), 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes virus), 풍진 바이러스, 중증급성호흡기증후군 바이러스 (SARS virus), 인간면역결핍 바이러스 (HIV), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 b, 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae), 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 중에서 선택하는 백신.

(4) 상기 (1) 에 있어서, 상기 병원체가 인플루엔자 바이러스인 백신.

(5) 상기 (1) 에 있어서, 상기 서브유닛이 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 백신.

(6) 상기 (1) 에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 분비성 IgA 를 생성하기에 충분한 농도로 존재하는 백신.

(7) 상기 (1) 에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 0.1 내지 10 mg/ml 농도로 존재하는 백신.

(8) 상기 (1) 에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 의 크기가 10² 내지 10⁸ bp 인 백신.

(9) 상기 (1) 에 있어서, 상기 서브유닛이 최소한 NA 또는 HA 를 포함하는 백신.

(10) 상기 (1) 에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 백신.

(11) 하기를 1 회 이상 점막 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질병의 예방 방법:

A) 하기를 포함하는 점막 투여용 백신:

a) 이중-가닥 RNA; 및

b) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원.

(12) 상기 (11) 에 있어서, 상기 백신을 2 회 이상 투여하는 방법.

(13) 상기 (11) 에 있어서, 상기 백신을 1 주 이상, 더욱 바람직하게는 3 주 이상의 간격으로 투여하는 방법.

(14) 상기 (11) 에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 방법.

(15) 하기를 포함하는, 감염성 질병의 예방용 백신 키트:

A) 하기를 포함하는 점막 투여용 백신:

a) 이중-가닥 RNA; 및

b) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원; 및

B) 상기 백신을 1 회 이상 점막 투여하라는 내용의 설명서.

(16) 상기 (15) 에 있어서, 상기 백신을 2 회 이상 투여하는 키트.

(17) 상기 (15) 에 있어서, 상기 백신을 1 주 이상, 더욱 바람직하게는 3 주 이상의 간격으로 투여하는 키트.

(18) 상기 (15) 에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 키트.

(19) 백신의 점막 투여를 위한 이중-가닥 RNA 의 용도.

(20) 상기 (19) 에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 것인 용도.

(21) 점막 투여용 백신의 제조를 위한 이중-가닥 RNA 의 용도.

(22) 상기 (21) 에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 것인 용도.

발명의 효과

본 발명은 점막 투여에 의해 백신 접종을 용이하게 하고 교차 면역을 획득할 수 있게 하는 백신 형태를 제공한다. 상기 백신으로 인하여, 예를 들어 인플루엔자 바이러스의 경우, 유행성 균주를 예측하지 않고도 효과적인 백신을 제조할 수 있으며, 따라서 효과적인 예방 방법이 될 수 있다.

발명의 실시를 위한 최적의 형태

이하 본 발명을 더 자세히 설명하겠다. 전체 명세서에 걸쳐서, 어떠한 단수 형태의 표현이라도 다르게 설명되지 않는 한 이의 다수의 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 다르게 설명되지 않는 한 당업계에 통상 사용되는 의미로 사용된 것으로 이해된다.

(정의)

"백신" 이란 용어는 본원에서, 보통 감염성 인자 또는 감염성 인자의 일부를 포함하는 항원성 현탁액 또는 용액으로서, 체내에 투여할 경우 활성 면역성을 일으키는 것을 일컫는다. 백신을 구성하는 항원성 부분으로는, 미생물체 (예를 들어, 바이러스 또는 세균 등) 또는 미생물체로부터 정제된 천연 물질, 합성 또는 유전자 조작 단백질, 펩티드, 다당류 또는 유사 물질이 될 수 있다. 생백신의 예로는, BCG, 천연두 백신, 소아마비, 수두, 홍역, 풍진, 유행성 이하선염, 우역(rinderpest), NDV, 마렉병(Marek's disease) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 사백신에는, 백일해, 디프테리아 (톡소이드), 파상풍균 (톡소이드), 인플루엔자, 일본 뇌염 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본원의 "불활성화된 항원" 이란 용어는 감염성이 제거된 항원으로서 백신 항원으로 사용되는 항원을 말한다; 그러한 항원에는, 완전 바이러스 입자 (complete virus particle) 인 비리온, 불완전 바이러스 입자, 비리온-구성 입자, 바이러스 비(非)-구성 단백질, 감염을 방지하는 항원, 중화 반응 에피토프 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본원의 "불활성화된 항원" 이란 용어는 감염성은 제거되었으나 면역원성은 보유하는 항원을 말한다; 그러한 항원이 백신으로 사용될 때, 이를 "사백신" 이라 부른다. 그러한 불활성화된 항원의 예에는, 물리적 (예컨대, X-선 조사, 열, 초음파), 화학적 (포르말린, 수은, 알코올, 염소) 또는 기타 방법에 의해 불활성화된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 서브유닛 항원 그 자체 또한 불활성화된 항원의 정의에 포함되는데, 이는 이것이 보통은 감염성을 잃기 때문이다. 다르게는, 죽은 바이러스를 사용할 수도 있다.

본원의 "서브유닛 항원" 이란 용어는 "성분" 으로도 불린다; 상기 서브유닛 항원은 자연 발생적 바이러스와 같은 병원체로부터 정제되거나, 또는 합성 또는 재조합 기술로 제조될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있고 통상적으로 이용되며, 시판되는 장비, 시약, 벡터 등을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 경우, 서브유닛 항원은 바람직하게는 입자의 표면에 노출된 분자, 예컨대 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 매트릭스 (M1, M2), 비-구조물 (non-structures, NS), 폴리머라제 (PB1, PB2: 염기성 폴리머라제 1 과 2, 산성 폴리머라제 (PA)), 및 핵 단백질 (NP) 이다. 현재, HA 는 15 종류로 나타나고, NA 는 9 종류로 나타난다고 알려져 있으며, 그 종류가 변하면 신균주가 발생될 수 있다.

본원에서 "보강제" 란 용어는 투여된 면역원과 함께 혼합할 경우, 면역 반응을 증가 내지는 변화시키는 물질을 일컫는다. .

본원에서 "CT" 또는 "콜레라 독소" 란 용어는 비브리오 콜레라에 의해 생성되는 외독소를 말하며, 이는 비브리오 콜레라 감염으로 인한 설사 증상의 원인 물질이다. 콜레라 독소가 효과적인 보강제로 사용되긴 하나, 그 독성 때문에 임상적 적용 방법은 발견되지 않았다. 따라서, CT 는 보통 효과적인 백신용 보강제를 찾을 때 양성 대조군으로서 이용된다.

본원에서 "이중-가닥 RNA" 란 용어는 임의로 선택된 이중-가닥 RNA 를 말한다. 그 크기는, 예를 들어 겔 전기영동법 등으로 측정할 수 있다. 전통적으로, 이중-가닥 RNA 를 백신용 보강제로 사용하려는 시도가 있었지만, 백신이 감염으로부터의 보호에 효과적이었다는 보고는 거의 없었다. 그러한 이중-가닥 RNA 에는, Poly(I:C), Poly(A:U), Poly(G:C) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본원의 "Poly(I:C)" 란 용어는 폴리이노신산 (pI) 및 폴리시티딜산 (pc) 을 포함하는 이중-가닥 RNA 를 말하며, 상술한 이중-가닥 RNA 의 범위에 포함된다.

본원에서, 임의의 불활성화된 항원 및 서브유닛 항원을 항원으로서 사용가능하다.

본원의 "점막 투여" 란 용어는 점막을 통한 투여 형태를 말한다. 본원에서 "점막" 이란 용어는 속이 빈 기관, 특히 척추 동물의 위창자 기관, 호흡기 기관, 또는 비뇨생식 기관 등과 같이 신체 외부와 소통하는 기관의 내벽을 말한다. 따라서, 상기 점막 투여 경로의 예에는, 비강내 투여 (비강 투여), 구강내 투여, 질내 투여, 상기도 투여, 폐포 투여 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 비강내 투여가 유리하다. 이는, 비강이 또한 호흡기 감염성 질병, 특히 인플루엔자 바이러스의 감염 경로이므로, 점막 투여에 의해 IgA 반응을 유발할 수 있기 때문이다.

본원의 "비강 투여" 란 용어는 비점막을 통한 투여 방법을 말한다.

본원의 "병원체" 란 용어는 숙주에서 질병 또는 장애를 일으킬 수 있는 유기체를 말한다. 인간 병원체의 예에는, 바이러스, 박테리아, 원생동물, 리케차, 클라미디아, 진균 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 백신으로 효과를 볼 수 있는 병원체에는, 통상적으로 바이러스, 박테리아 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본원에서 타깃으로 하는 바이러스는 임의의 종류일 수 있고, DNA 바이러스, RNA 바이러스 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

인간에게 병원성인 바이러스의 예에는, 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 풍진 바이러스, SARS 바이러스 (일종의 코로나바이러스), 및 HIV 가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다.

본 발명에서 타깃으로 하는 박테리아는 임의의 박테리아일 수 있으며, 그람-양성 박테리아 및 그람-음성 박테리아가 포함되나 이에 한정되지 않는다.

인간에 병원성인 박테리아에는, 보르데텔라 페르투시스, 나이세리아 메닝기티디스, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b, 폐렴구균, 비브리오 콜레라 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본원의 "인플루엔자 바이러스" 란 용어는 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 단일-가닥 RNA 바이러스를 말한다. 상기 바이러스는 지질 이중막 외피를 가지며, 이는 M1 (막 단백질) 과 맞닿아 있고, 상기 막에는 막 특징적 (membrane characteristic) 막 단백질, 예컨대 M2, HA (헤마글루티닌), NA (뉴라미니다제) 및 M2 당단백질이 파묻혀있다. RNA 는 8 개 절편으로 나타나고, 이는 핵 단백질과 함께 RNP 복합체 (리보뉴클레오시드 캡시드) 를 형성하여, 외피-지지 (envelop-backing) 단백질 M1 에 약하게 결합한다.

인플루엔자 바이러스 단백질 중에서, HA 및 NA 는 소포체 막에 파묻힌 상태로 생성되고, 골지체를 통해 세포 표면에 노출된다. 따라서, HA 또는 NA 또는 둘 다 훌륭한 면역원이고, 백신 제조를 위한 주요 출발 물질로 이용된다.

본원의 "분비성 IgA 를 생성하기에 충분한 농도" 란 표현은 보강제 또는 백신 그 자체의 능력, 즉 투여 후 면역 반응의 개시시에 분비성 IgA 를 생성시키는 보강제 또는 백신 그 자체의 농도를 말한다. 상기 농도는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 달성할 수 있다.

본원의 "분비성 IgA" 란 용어는 분비되는 IgA 를 일컫는다. IgA 는 외분비액 내의 주요 면역글로불린으로서, 점막 표면 상의 감염을 막는 데 도움이 된다. 상기 IgA 는 타액, 콧물, 및 장, 기관(氣管) 등에서 분비된 체액, 또는 초유에서 풍부하게 발견되지만, 혈청에도 존재한다. 따라서, 분비성 IgA 는, 예컨대 면역확산법에 의해 측정될 수 있으나, 이를 제한적으로 간주해서는 안된다; 바람직하게 이용가능한 방법의 예로서 실시예에 기재된 것을 언급할 수 있다.

(본 발명에 이용가능한 일반적인 생화학적 기술의 설명)

(백신 제조법)

본 발명에서, 백신에 함유된 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을, 상술한 바와 같이 불활성화, 정제 등에 의해 천연 물질로부터 제조하거나, 또는 유전자 조작 기술 또는 합성에 의해 폴리펩티드를 제작하여 인공적으로 제조할 수 있다. 보통, 발생된 난황 등을 이용하여 바이러스 등을 생장시키고, 생장된 바이러스 등을 불활성화하거나 그로부터 성분을 분리 및 정제함으로써 본 발명의 백신을 제조할 수 있다.

본원에서, 본 발명의 백신을 완전히 밀폐된 유리병, 주사기, 분무기(atomizer) 등 또는 가열 밀봉된 앰풀 안의 액체 또는 건조 형태로 제공할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 백신을 제조할 때, 하기 방법이 이용되나 이를 한정적으로 간주해서는 안된다.

바람직한 인플루엔자 바이러스 균주의 예에는, A/Beijing/352/89(H3N2); A/Texas/36/91(H1N1); B/Panama/45/90; A/Georgia/03/93; A/New Caledonia/20/99(H1N1), A/Panama/2007/99(H3N2); B/Shangdong/7/97; B/Johannesburg/5/99 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

이들 바이러스는, 예컨대 난황의 발생 9 내지 11 일째 배아에서 이동 배양(passage incubation) 에 의해, 그리고 필요한 경우, 배양 세포 (예컨대, MDCK 세포) 에서 배양된다. 바이러스를 Massicot 등의 방법 (Virology 101, 242-249 (1980)) 또는 이의 변형법으로 정제할 수 있다. 간단히, 바이러스 현탁액을 8000 rpm 에서 원심분리 (예를 들어, Sorvall RC5C centrifuge, GS-3 rotor) 한 후, Beckman 19 model rotor 를 이용하여 18,000 rpm 에서 2 시간 원심분리하여 펠렛화함으로써 맑아지게 할 수 있다.

상기 펠렛화된 바이러스를 STE (0.1M NaCl, 20mM Tris, pH 7.4, 1mM EDTA) 에서 재현탁하고, 4,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하고 (Hermle Z360K centrifuge), 응집물을 제거한다. 2 ml 의 상청액을 2 ml 의 60% 수크로스 및 7 ml 의 상단 STE-완충된 30% 수크로스로 이루어진 불연속 수크로스 구배 상에 놓고, 36,000 rpm (SW-40 rotor, Beckman) 에서 90 분간 원심분리한다.

바이러스 밴드를 경계면에서 수합하여, STE 로 10배 희석하고, 30,000 rpm 에서 2 시간 펠렛화하였다 (Beckman Ti45 rotor). 이어서, 펠렛화된 바이러스를 -70℃ 에서 동결시켰다.

재조합 DNA 기술을 이용한 배양 (예를 들어, CHO-K1 세포) 으로 바이러스의 서브유닛 항원을 제조할 수 있다. 사용가능한 발현 벡터는 pCXN (Matsunami K. 등, (Clinical & Experimental Immunology 126(1), 165-172 (2001)) 등이나 이에 한정되지 않는다. 형질전환된 세포를 가용화 완충액 (8% Triton X-100, 2M KCl, 10mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)) 등에 용해시키고, 동일 부피의 PBS 를 첨가하여 현탁시킨 다음, 예를 들어, 360,000 rpm 에서 원심분리하여 (예를 들어, Beckman XL-70 centrifuge Type 55.1Ti rotor), 가용성 분획을 회수한다. 회수된 가용성 분획을 어피니티 칼럼에 흡착시킬 수 있는 바, 여기서 단일클론 항체 또는 다클론 항체와 같이 그에 결합되는 목적 항원 또는 펩티드 서열에 특이적 친화력이 있는 단백질, 펩티드 등을 담체에 커플링시키고, 0.1M 글리신-HCl 또는 0.1% Tween 80 (pH 2.7) 과 같이, pH 변화 또는 기타 변화에 의해 결합력을 약화시키는 용액을 이용하여 용출 및 정제한다. 또한, 용매 추출법, 황산암모늄 침전에 의한 염석 담수화(salting-out desalinization) 법, 유기 용매를 이용한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-Sepharose 또는 DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Corporation) 와 같은 수지를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, 부틸-Sepharose 또는 페닐-Sepharose 와 같은 수지를 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔 여과법, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 법, 및 등전점 집속(isoelectric focusing) 법 등과 같은 기술 또한 이용가능하다. 정제된 항원을 PBS 등의 완충액을 이용하여 투석하고, 예를 들어, -70℃ 에서 동결시킬 수 있다.

상기 형태로, 백신을 제조할 수 있다.

(보강제)

보강제란 용어는 항원과 혼합할 경우 항체 생성을 증가시키고, 면역 반응을 증강시키는 물질을 총칭하여 일컬으며; 더 바람직한 구현예에서는, 조절가능하거나 또는 효과적인, 비독성 보강제를 사용한다. 더 신속하거나, 더 강력한 또는 지속적인 반응을 유발하기 위해서는 보강제를 통상의 백신 항원과 함께 사용할 것이 요구된다. 따라서, 항원 공급이 제한되거나 또는 항원 생산에 비용이 많이 드는 경우에도 보강제는 유용하다.

보강제는, 예를 들어, 무기물, 박테리아성, 식물성, 합성 물질, 또는 숙주 물질로 분류된다.

보강제의 첫 번째 종류는 무기질 보강제, 예컨대 알루미늄 화합물이다. 알루미늄 화합물의 보강제로서의 최초 용도는 1926 년에 기술되었다. 그 이후, 알루미늄 화합물과 공침전된 항원 또는 미리 형성된 알루미늄 화합물과 혼합되거나 그에 흡착된 항원을 동물 및 인간의 면역 반응을 증강시키는 데 사용하여 왔다. 알루미늄 화합물 및 유사 보강제는 다음과 같은 기작에 의해 작용하는 것으로 추측된다. 알루미늄은 항원과 물리적으로 결합하여 입자를 형성하고, 주사 후에 항원이 조직에 흡수되는 속도를 늦춰서, 항원과 항원-제시 세포 (예컨대, 대식세포 또는 여포성-수지상 세포) 사이의 상호작용 기간을 연장시킨다. 다르게는, 보조제는 그와 같은 상호작용을 더 활발하게 한다. 알루미늄 입자는 면역 후 7일째에 토끼의 림프절에서 국지적으로 나타나며, 다른 중요한 기능에 의해 항원을 림프절 자체 내의 T-세포-함유 구역으로 이끌 수 있다고 입증되었다. 보강제 효능은 관련 림프절의 활성화와 관계있는 것으로 보인다. 다수의 연구 결과 알루미늄과 함께 투여된 항원이 체액성 면역을 활성화하는 것으로 나타났지만, 세포성 면역은 미미하게 증가하는 것으로 나타났다. 알루미늄은 또한 보체의 경로를 활성화하는 것으로 기술되었다. 상기 기작은 국지적 염증 반응 및 면역글로불린 기억에 있어서 일정 역할을 담당할 수 있다.

알루미늄 화합물은 현재 인간에 사용되는 거의 유일하게 안전한 보강제이다. 그러나, 알루미늄-함유 백신은 일부의 경우 국지적 반응을 유발한다. 알러지 유발이 보통은 임상적으로 중요한 사건은 아니지만, 알루미늄 화합물은 T-세포-의존적 기작에 의해 호산구를 주사 부위로 이동시켜서, 초회 항원자극(priming) 후에 IgE 반응을 유발하고, IgE 반응을 위한 보조 기능을 갖는 특정 세포 집단을 활성화하는 것으로 알려져 있다.

박테리아에서 유래된 보강제는 최근에 정제 및 합성되었다 (예를 들어, 뮤라닐디펩티드, 지질 A). 또한, 숙주-유래의 면역학적 활성 단백질이 클로닝되었다 (인터루킨 1 및 인터루킨 2). 근래에, 보르데텔라 페르투시스, 지질다당류 및 프로인트 완전 보강제 (Freund's complete adjuvant, FCA) 가 실험실 수준에서 사용되기 시작했다.

다른 다양한 물질도 보강제로서 사용되기 시작했다. 이에는, 사포닌과 같은 식물성 물질, 키틴과 같은 동물성 물질, 및 다수의 합성 화학 물질이 포함된다.

본원에서, 이중-가닥 RNA 가 보강제로 이용된다. 상기 이중-가닥 RNA 는 상술한 핵산 분자의 제조법에 따라 제조할 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 그러한 방법의 예로서, Sigma Aldrich Japan, YAMASA Corporation, Fluka 등으로부터 입수 가능한 키트를 사용할 수 있다.

Poly(I:C) 또한 당업계에 공지된 방법으로 제조가능하다. 그러한 방법은 비-특허 문헌 1 내지 3 등에 기재되어 있고, 바람직한 방법의 예로는, pH 7.0 의 인산염-완충 용액 (0.006 mol 인산나트륨, 0.15 mol 염화나트륨) 에서 두 가지 선택된 단독중합체를 등몰 농도로 혼합하는 것 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 복합체는 혼합 후 즉시 형성될 수 있다.

(컴퓨터 스크리닝)

단백질 형태 데이타 스크리닝을 위해, 인자 (예를 들어, 항원 또는 불활성화된 항원, 항체), 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산 분자를 사용할 수 있다. 상기 스크리닝은, 시험관내, 생체내 또는 기존 물질을 이용한 다른 시스템을 이용하거나, 또는 컴퓨터 (in silico) 스크리닝 (컴퓨터-기재 시스템) 시스템을 이용하여 제조된 라이브러리를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서, 스크리닝에 의해 수득되는, 목적 활성을 지닌 화합물 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해된다. 또한 본 발명에서, 컴퓨터 모델링에 의해 설계된 약물은 본 발명의 개시를 기초로 제공되는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 스크리닝에 의해 수득된 약물도 본 발명의 백신을 위한 성분으로서 이용될 수 있다.

(질병)

본원에서 본 발명이 표적으로 할 수 있는 질병에는, 백신 투여로 예방가능한 임의 선택된 질병이 포함된다. 그러한 질병에는, 세균성 질병, 바이러스성 질병, 알레르기성 질병 등이 포함되나 이에 한정되지 않으며; 그 예에는, 수두, 홍역, 유행성 이하선염, 소아마비, 로타(rota), 인플루엔자, 풍진, 중증급성호흡기증후군 (SARS), 백일해, 뇌막염 및 콜레라, RS (호흡기 융합체 (respiratory syncytium) 바이러스성 감염, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b, 폐렴구균 감염, 후천성 면역결핍증 (AIDS) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

(치료적 활성 또는 예방적 활성의 입증)

본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물을 인간에 사용하기 전에, 바람직하게는 시험관내, 그 후 생체내, 및 동물 수준에서 이의 목적하는 치료적 활성 또는 예방적 활성에 대해 테스트하였다. 당업자에 공지된 기술을 이용하여 세포 균주 및/또는 조직 샘플에 대한 상기 화합물 또는 조성물의 효과를 측정할 수 있다. 본 발명에 따라서 특정 화합물의 투여의 표시 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 시험관내 검정으로서, 항원-항체 결합의 관찰 등을 언급할 수 있다. 동물-수준 테스트에서, 시험 백신을 인간에서와 같이 투여하고, 항체 역가의 증가량 (예를 들어, ELISA 로 측정), 또는 세포독성 T 세포 활성화 등을 확인함으로써 판단할 수 있다.

(예방을 위한 투여 및 조성물)

본 발명의 조성물, 백신 등에 사용가능한 약학적으로 허용가능한 담체에는, 항산화제, 방부제, 착색제, 방향약, 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전재, 벌킹제(bulking agent), 완충제, 전달용 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 보강제가 포함되나 이제 한정되지 않는다. 통상적으로, 본 발명의 약물을, 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 백신 또는 이의 변형체(modification) 또는 유도체를 포함하는 조성물 형태로 투여한다. 예를 들어, 적절한 비히클은 주사용수, 생리적 용액, 또는 인공 뇌척수액일 수 있고, 여기에 비경구 전달용 조성물에 흔히 사용되는 기타 물질을 보충할 수 있다.

본원에 사용되는 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 수용체에 대하여 비독성이고, 바람직하게는 사용량 및 사용 농도에서 불활성이다; 그 예에는, 포스페이트, 시트레이트, 또는 기타 유기산; 아스코르브산, α-토코페롤; 저분자량 폴리펩티드; 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 친수성 중합체 (예를 들어, 폴리비닐피롤리돈); 아미노산 (예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제 (예를 들어, EDTA); 당 알코올 (예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨); 염-형성 짝이온 (예를 들어, 나트륨); 및/또는 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween, 플루로닉(pluronic) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

적절한 담체의 예로서, 중화 완충된 생리식염수, 또는 혈청 알부민과 혼합된 생리식염수를 언급할 수 있다. 바람직하게, 상기 생성물은 적절한 부형제 (예컨대, 수크로스) 를 이용하여 동결건조 생성물로 제형화된다. 기타 표준 담체, 희석제 및 부형제는 필요에 따라 함유될 수 있다. 다른 대표적인 조성물들은 pH 7.0-8.5 의 Tris 버퍼 또는 pH 4.0-5.5 의 아세테이트 버퍼를 함유하며, 이들은 소르비톨 또는 적절한 대체제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 일반적 제조 방법은 하기에 서술된다. 동물 의약 조성물, 유사 약물, 수산 양식용 (aquaculture) 의약 조성물, 식품 조성물 및 미용 조성물 등 또한 공지된 제조 방법에 의해 제조할 수 있음을 언급한다.

본 발명의 백신 등을 약학적으로 허용가능한 담체와 블렌딩하여 비경구적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제를, 필요에 따라 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Japanese Pharmacopoeia XIV 또는 이의 최신판, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990 등을 참조) 및 목적하는 수준의 순도를 지닌 당쇄 조성물을 혼합하여 수용액 또는 동결건조된 케익 (cake) 형태로 제조 및 보존할 수 있다.

다양한 약물 전달 시스템이 공지되어 있는데, 본 발명에서는 점막 투여하고자 한다. 본 발명의 화합물을 투여하는 데 이용되는 기술의 예로서, 리포솜, 미립자, 마이크로캡슐 등을 언급할 수 있다. 이의 도입 방법에는, 비강, 질내, 하기도, 구강, 직장 점막 및 장 점막 경로 등의 점막 경로가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 이 경우, 본 발명의 화합물을 다른 생물학적 활성 약물과 함께 투여할 수 있다. 상기 투여는 전신적 또는 국부적일 수 있다. 점막 투여의 경우, 예컨대 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸제를 이용한 제형물을 사용함으로써 폐 투여할 수 있다.

특정 구현 형태에서, 본 발명의 조성물 또는 화합물을 투여 부위의 점막 표면 뿐만 아니라 IgA 분비가 증가될 수 있는 다른 조직의 점막 표면에 국소 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 예방 방법에 사용되는 조성물의 양은, 사용 목적, 대상 질병 (그 종류 등), 환자 연령, 체중, 병력 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 있어서 대상체 (또는 환자) 에의 투여 빈도 또한, 사용 목적, 대상 질병 (그 종류, 경중도 등), 환자 연령, 체중, 병력, 경과 등을 고려하여 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 투여 빈도의 예로서, 매일 내지 수개월마다 투여 (예를 들어, 매주 내지 매월), 또는 매 전염병 유행기 전에 한 번 투여 등을 언급할 수 있다. 경과를 살피면서 매주 내지 매월 투여를 실시하는 것이 바람직하고, 최소한 약 1 주 간격으로 추가 면역을 실시하는 것이 유리하다. 추가 면역 간격은 약 3 주 이상이 더 바람직하다.

본 발명의 백신 등의 투여량은 대상체의 연령, 체중, 증상 또는 투여 방법 등에 따라 다르며, 한계가 있는 것은 아니지만, 성인에 경구 투여시 보통 1 일 10 mg 내지 1 g 일 수 있다. 점막 투여의 경우 (예컨대, 비강), 투여량은 0.001 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 0.1 mg 내지 1 mg 일 수 있다.

본원에서 "투여" 란 용어는 본 발명의 백신 등 또는 이를 함유한 약학적 조성물을 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 치료 대상 숙주에 공급하는 것을 의미한다. 상기 조합물을, 예컨대 혼합 상태로 동시에, 분리하여 동시에 또는 함께; 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 이는, 상기 병용 약물을 치료 혼합물로서 함께 투여하는 제시 방법을 포함하며, 또한 병용 약물을 분리하여 동시에 투여하는 방법도 포함한다 (예를 들어, 별도의 점막을 통해 동일 개체에 투여). "병용" 투여에는, 처음 주어진 후 이어서 두 번째로 주어지는 화합물 또는 약물 중 하나를 별도로 투여하는 것이 추가로 포함된다.

본원에서 "설명서" 란 용어는, 본 발명의 약제 등의 투여 방법 또는 내과의사 또는 환자와 같이 투여를 수행하는 사람, 및 진단을 수행하는 사람 (환자일 수 있음) 을 위한 진단 등의 방법에 대한 정보를 담고 있는 문서를 말한다. 상기 설명서는 본 발명의 진단약, 예방약, 약제 등의 투여 절차에 관한 안내를 담고 있다. 상기 설명서는 본 발명이 실시되는 국가의 감독 기관 (예를 들어, 일본 후생노동성, 미국 식품의약청 (FDA) 등) 이 정한 약식에 따라 제조되고, 감독 기관으로부터 승인을 얻었음을 명시한다. 상기 설명서는 제품첨부서(package insert)라 불리는 것으로, 보통 서면으로 제공되나 이에 한정되지 않는다; 설명서는, 예컨대 약병에 붙인 필름, 또는 전자 매체 (예컨대, 인터넷, 이메일을 통해 제공되는 홈페이지 (웹사이트)) 형태로 제공될 수도 있다.

본 발명의 방법에 의한 예방적 치료의 완료 여부에 대한 판단은 시판되는 검정 방법 또는 장치를 이용하여 유도된 항체를 확인함으로써 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물 중 하나 이상의 성분을 포함하는 하나 이상의 용기(vessel)를 갖춘 약학적 패키지 또는 키트를 제공한다. 상기 용기에는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의하여 정해진 형식으로 된 통지서가 임의로 부착되어 있을 수 있는데, 이는 정부 기관에 의해 인간에의 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매를 승인함을 명시한다.

(바람직한 구현 형태의 설명)

본 발명의 바람직한 구현 형태를 이하 설명하겠다. 하기 구현 형태에 대한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 설명에 의해 제한되는 것으로 이해되어서는 안된다. 따라서, 당업자라면 적절한 경우 본원의 내용을 고려하여, 본 발명의 범위 내에서 어떠한 구현 형태라도 변형할 수 있음이 명백하다.

한 측면에서, 본 발명은 점막 투여용 백신을 제공한다. 이 백신은 A) 이중-가닥 RNA; 및 B) 바이러스의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함한다. 여기서, 상기 이중-가닥 RNA 및 바이러스성 서브유닛 항원 및 불활성화된 항원을 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 점막 투여를 위한 적절한 형태는 당업계에 공지되어 있으며, 그 예에는, 액체, 또는 분무 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명은, 이중-가닥 RNA 와 바이러스성 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 조합함으로써, 기도 점막의 분비성 IgA 역가를 상승시키고, 실질적으로 감염-방어 효과를 가지는 것으로 입증되었다. 상기 효과는, 이중-가닥 RNA 가 보강제로서 항체를 생성하지만 실질적인 감염-방어 효과는 없다는 다수의 보고가 있었다는 점을 고려할 때 예상 밖의 획기적인 효과로 생각된다.

본 발명의 백신이 점막 투여에 의해 주목할만한 효과를 달성하므로, 점막에 의한 투여 (예를 들어, 비강 투여, 구강 투여 등) 인 한, 임의의 경로를 이용할 수 있으나; 바람직한 구현 형태에서는 비강 경로를 이용할 수 있다.

바람직한 구현 형태에서, 본 발명의 백신이 타깃으로 하는 병원체는, 예를 들어 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 풍진 바이러스, SARS 바이러스, HIV, 보르데텔라 페르투시스, 나이세리아 메닝기티디스, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b, 폐렴구균 및 비브리오 콜레라로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 병원체는 인플루엔자 바이러스이다. 본 발명은 역사상 실질적으로 처음으로 인플루엔자 바이러스 타입 (타입 A, 타입 B) 내의 균주 (예를 들어, H1N1 등) 내의 아형 간의 교차 반응성을 나타내는 백신을 제공하는 탁월한 효과를 가진다. 본 발명은 일부의 경우 타입 간 장벽을 넘어서는 교차 반응성을 나타내므로, 본 발명은 선행 기술로는 성취되지 못했던 효과를 가진다. 인플루엔자 바이러스의 유행 패턴은, 바이러스 자체의 변화를 수반하며 매년 변하므로, 해마다 유행할 가능성이 있는 패턴을 예측하고 인플루엔자 바이러스를 위한 적절한 백신을 준비하는 것이 통상적인 관례였다. 그러나, 본 발명은 상이한 균주 및 아종 간의 교차 반응성을 달성하여, 유행 패턴을 예측하지 않고도 효과적인 인플루엔자 백신의 준비를 가능케하는 효과를 가진다. 게다가, 예측의 필요성을 제거하여 장기간 유지되는 백신을 사용할 수 있게 한다.

바람직한 구현 형태에서, 본 발명에 사용되는 병원체 서브유닛은 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2 로 이루어진 군에서 선택된 서브유닛을 포함한다. 더 바람직하게, 표면에 제시된 서브유닛 (예를 들어, HA, NA) 을 사용한다. 더 바람직하게는, 상기 표면-제시된 서브유닛을 다수 (예를 들어, HA 및 NA) 사용하는 것이 유리하다. 이는, 표면-제시된 서브유닛이 더 효과적인 항원-항체 반응을 유발하여, 중화 항체를 유도할 수 있게 하기 때문이다.

바람직하게, 이중-가닥 RNA 는 분비성 IgA 를 생성하기에 충분한 농도로 존재한다. 그러한 이중-가닥 RNA 농도는, 예를 들어, 0.1 내지 10 mg/ml, 더 바람직하게는 0.5 내지 2 mg/ml, 보다 더 바람직하게는 약 1 mg/ml (예를 들어, 0.8 내지 1.2 mg/ml) 이다.

바람직하게, 이중-가닥 RNA 는 분비성 IgA 를 생성하기에 충분한 크기로 제공된다. 그러한 크기의 예로는, 바람직하게 0 내지 3x10⁶ bp 크기 범위내에서, 10² bp 이상, 더 바람직하게는 300 bp 이상이 포함되나 이를 제한적으로 간주해서는 안된다. 본 발명의 이중-가닥 RNA 크기의 상한에는 제한이 없다; 크기 상한의 예는, 10⁸ bp 이나 제한적인 것은 아니다.

바람직한 구현 형태에서, 본 발명의 백신에 사용되는 서브유닛은 최소한 NA 또는 HA 를 포함하는 것이 유리하다. 이는, 이들 중 하나, 더욱 바람직하게는 둘 다를 포함하면, 중화 항체를 효율적으로 유도할 수 있어서 항바이러스 효과를 얻을 수 있기 때문이다.

이중-가닥 RNA 가 바람직하게는 Poly(I:C) 를 포함하긴 하나, 다른 이중-가닥 RNA (예를 들어, Poly(A:U), Poly(G:C)), 이의 혼합물 등이 사용될 수도 있다. Poly(I:C) 는, 뉴클레오티드가 변형되었든 그렇지 않든 간에 임의의 타입일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 감염성 질병의 예방 방법을 제공한다. 이 방법은, a) 이중-가닥 RNA (바람직하게는 Poly(I:C)); 및 b) 바이러스의 서브유닛 항원을 포함하는 A) 점막 투여용 백신을 최소한 1회 이상 점막 투여하는 단계를 포함한다. 상기 백신의 점막 투여를 투여 부위에 따라 적절한 형태로 수행할 수 있다. 비강 투여의 경우, 분무, 코팅, 또는 백신액의 직접적인 점적과 같은 다양한 방법을 이용할 수 있다.

백신 투여는 바람직하게는 2회 이상 수행할 경우 효과적이다. 이런 방식의 면역화를 일부의 경우 추가 면역이라고 부른다. 추가 면역을 실시하면 더 큰 감염-방어 효과를 얻을 수 있다.

백신 투여를 여러 번 실시할 경우, 그 간격은 1 주 이상, 바람직하게는 3 주 이상인 것이 바람직하다. 본원에서 상술한 바와 같이 이중-가닥 RNA, Poly(I:C), 항원 등의 형태를 이용할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 감염성 질병의 예방을 위한 백신 키트를 제공한다. 상기 키트에는, A) a) 이중-가닥 RNA; 및 b) 바이러스의 서브유닛 항원을 포함하는 점막 투여용 백신; 및 B) 상기 백신을 1 회 이상 점막 투여하라는 내용의 설명서가 제공된다. 상기 키트는 패키지 상태의 약제로서 판매될 수 있다. 상기 설명서에는 후생노동성과 같은 감독 기관으로부터의 승인서 및 키트 사용 방법에 대한 안내가 포함된다. 상기 백신의 제조 및 투여 방법은 상술한 바와 같다.

(인플루엔자 백신 서브유닛 항원의 폴리펩티드 형태)

한 측면에서, 본 발명은 예방적, 치료적 또는 예후적 유효량의 인플루엔자 백신 서브유닛 항원, 또는 이의 절편 또는 변형체, 및 이중-가닥 RNA 를 포함하는, 감염성 질병에서의 질병, 장애 또는 상태의 예방, 치료 또는 예후를 위한 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 예방적, 치료적 또는 예후적 유효량은 다양한 요인을 고려하여, 당업자에 공지된 기술을 이용하여 결정할 수 있다; 예를 들어, 사용 목적, 대상 질병 (그 종류, 경중도 등), 환자의 연령, 체중, 병력 등을 고려하여, 당업자라면 용이하게 그 양을 결정할 수 있다 (예를 들어, "Vaccine Handbook", edited by the Researcher's Associates (Gaku-yuu-kai) of The National Institute of Health (1994); "Manual of Prophylactic Inoculation, 8th edition", edited by Mikio Kimura, Munehiro Hirayama, and Harumi Sakai, Kindai Shuppan (2000); "Minimum Requirements for Biological Products", edited by the Association of Biologicals Manufacturers of Japan (1993) 등 참조).

도 1 은 실시예에 예시된 Poly(I:C) 의 보강제 효과를 보여주는 자료를 나타낸다. 왼쪽 패널은 투여량 형태를 나타내고; 가운데 패널은 비강 세척물 (nasal washings) 내의 IgA 함량을 나타내며; 오른쪽 패널은 혈청 내 IgA 함량을 나타낸다.

도 2 는 실시예에 예시된 Poly(I:C) 의 보강제 효과를 보여주는 자료를 나타낸다. 왼쪽 패널은 투여량 형태를 나타내고; 오른쪽 패널은 바이러스 생존 상태를 나타낸다.

도 3 은 다양한 바이러스성 균주에 대한, 본 발명의 백신 접종에 의한 IgA-생성 효과를 보여주는 그림이다.

도 4 는 다양한 바이러스성 균주에 대한, 본 발명의 백신 접종에 의한 바이러스 생장 억제 효과를 보여주는 그림이다.

도 5 는 뇌내 투여에 있어서 본 발명의 백신 접종의 독성을 보여주는 그림이다. 상단 패널은 본 발명의 Poly(I:C) 에 대한 자료를 나타내고; 하단 패널은 양성 대조군인 CTB* 에 대한 자료를 나타낸다.

도 6 은 Poly(I:C) 와 병용하여 비강내 인플루엔자 백신으로 사용된 불활성화된 바이러스 입자의 면역 효과, 즉 비강 세척물 및 혈청 내의 항-HA 및 항-NA 항체 역가를 나타낸다.

도 7 은 다양한 크기 (L, M, H) 의 Poly(I:C) 와 함께 비강내 인플루엔자 백신으로 사용된 불활성화된 바이러스 입자의 면역 효과, 즉 비강 세척물 및 혈청 내의 항-HA 및 항-NA 항체 역가를 나타낸다.

도 8 은 서브유닛 HA 과 함께 비강내 인플루엔자 백신으로 사용된 이중-가닥 RNA 또는 단일-가닥 RNA 의 면역 효과, 즉 비강 세척물 및 혈청 내의 항-HA 항체 역가를 나타낸다.

도 9 은 1 주 이상의 간격으로 2 회 이상 Poly(I:C) 와 병용 투여된, 비강내 인플루엔자 백신의 효능을 보여주는 결과이다.

도 10 은 Poly(I:C) 가 백일해 백신의 방어적 면역력 (protective immunity) 도 증가시키고, 또한 비(非)-인플루엔자성 감염용 백신의 방어적 면역력의 증강에도 효과적임을 보여주는 결과이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조로 설명하며, 실시예는 오로지 예시적 목적으로만 설명된다. 따라서, 본 발명은 오로지 실시예에 의해 한정되는 것이 아니라 청구의 범위에 의하여만 한정된다.

하기 실시예에서는, 모든 대상 환자에게서 사전 동의를 얻은 후에 실험을 수행하였다. 동물들은 오사카 대학의 국립 감염성 질병 연구소가 정한 기준에 따 라 다뤘다. 하기 실시예에서 사용된 시약은 Sigma Aldrich Japan, YAMASA Corporation, 또는 Fluka 로부터 얻었다.

(실시예 1. 합성 이중-가닥 RNA 인 Poly(I:C) 의 보강제 작용)

본 실시예에서는, 불활성화된 바이러스 또는 서브유닛 항원의 중화-항체-유도 잠재력 및 그에 따른 감염-방어 효과를, 보강제로서 합성 이중-가닥 RNA 인 Poly(I:C) 를 이용하여 확인하였다.

(재료)

마우스: BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷)

바이러스: 인플루엔자 바이러스 H1N1 (A/PR8) 균주 (National Institute of Infectious Diseases (1-23-1, Toyama, Shinjyuku-ku, Tokyo) 로부터 입수)

백신: 인플루엔자 바이러스 H1N1 (A/PR8) 균주 및 H1N1 (A/Beijing) 균주 (National Institute of Infectious Diseases); H1N1 (A/Yamagata) 균주 (National Institute of Infectious Diseases); H3N2 (A/Guizhou) 균주 (National Institute of Infectious Diseases); 에테르-불활성화된 HA 백신 (Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University, 2-9-41, Yahatacho, Kan-onji, Kagawa Prefecture)

보강제: CTB^* (양성 대조군으로서 0.1% CT (콜레라 독소) 를 함유한 CTB (콜레라 독소 B 서브유닛), Poly(I:C).

(방법)

그룹 당 5 마리의 6-주령 BALB/c 마우스 (Japan SLC, Inc., Tokyo) 를 사용하였다. 1 ㎍ 의 각 PR8HA 백신 (National Institute of Infectious Diseases; Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University) 및 각 백신에 대한 보강제로서 0.1 ㎍, 1 ㎍, 3 ㎍, 또는 10 ㎍ 의 Poly(I:C) 의 혼합물 5 마이크로리터 (5 ㎕) 를 각 동물의 비강에 접종하였다; 3 주 후, 동량의 백신을 보강제와 함께 또는 이를 제외하고 비강에 접종하였다; 2 주 후, 100 pfu 의 PR8 인플루엔자 바이러스 1.2 ㎕ 를 코 양쪽에 접종하여 감염을 일으켰다. 대조군으로, 추가 동물 그룹을 배분하여, 10 ㎍ 또는 1 ㎍ 의 단독 Poly(I:C), 단독 PR8HA 백신으로 처리하거나, 또는 미처리하였다. 감염 후 3 일째, 비강 세척물 및 혈청을 회수하였다; 비강 세척물 내 IgA 및 혈청 내 IgG 를 ELISA 방법으로 측정하고, 비강 세척물 내의 바이러스 역가를 MDCK 세포를 이용한 플라크 시험법(plaque assay)으로 측정하였다.

유사하게 비강 면역화된 마우스를 치사량이 40 LD₅₀ (10^4ㆍ7EID₅₀ (50% 의 발생된 난황에 대해 감염성을 보이는 바이러스 양의 약 50000 배) 인 바이러스 20 ㎕ 로 감염시키고, 그 생존율을 관찰하였다.

보강제로서 Poly(I:C) 를 이용한 비강 인플루엔자 백신의, 교차 감염에 대한 방어 효과를 평가하기 위해, 상이한 아형의 인플루엔자 바이러스 H1N1 (A/PR8) 균주, H1N1 (Beijing) 균주, H1N1 (A/Yamagata) 균주, 및 H3N2 (A/Guizhou) 균주의 백신을 3 ㎍ 의 Poly(I:C) 와 함께 비강에 접종하였다; 3 주 후, 각 백신만을 접종 하였다; 2 주 후, 100 pfu 의 PR8 인플루엔자 바이러스 1.2 ㎕ 를 코 양쪽에 접종하여 감염을 유발하였다. 감염 후 3 일째, 비강 세척물 및 혈청을 회수하였다; 비강 세척물 내의 IgA 및 혈청 내의 IgG 를 ELISA 방법으로 측정하고, 비강 세척물 내의 바이러스 역가를 MDCK 세포를 이용한 플라크 시험법으로 측정하였다.

(결과)

보강제로서 Poly(I:C) 를 이용한 비강 인플루엔자 백신에 의한 항체 유도 및 감염 방어

Poly(I:C) 의 점막 보강제 잠재력을 평가하였다. 6 주 전에, 각 PR8 백신 1 ㎍ 을, 다양한 양의 Poly(I:C) 0.1 ㎍ 내지 10 ㎍ 와 함께 비강내 주입하였다; 2 주 전에, 동량의 백신을 단독 또는 보강제와 함께 비강내 주입하였다. 비점막내 IgA 항체 반응 및 혈액내 IgG 반응을 도 1 에 나타내었다. Poly(I:C) 투여량에 따른 보강제 효과를 확인하기 위해, Poly(I:C) 양을 0.1 ㎍ 로부터 10 ㎍까지 단계적으로 증가시키면서 보강제 작용을 조사하였다. 그 결과, 제 1 면역시에 최소량인 0.1 ㎍ 의 Poly(I:C) 를 사용했을 때, 비점막내 IgA 반응이 관찰되었다. 비점막에서 유도된 IgA 의 양은 Poly(I:C) 양에 의존적이었다; Poly(I:C) 의 보강제 효과는 그 양이 증가함에 따라 증대되었다. 1 ㎍ 의 Poly(I:C) 를 두 번의 면역화 작업 모두에 사용한 경우, 비강 세척물에서 100 ng/ml 이상의 IgA 가 분비됨을 관찰하였다; Poly(I:C) 를 제 1 면역시에만 사용한 경우, 100 ng/ml 이상의 특정 IgA 가 3 ㎍ 의 Poly(I:C) 첨가로 유도되었다. 동시에 혈청내의 IgG 를 측정하고, IgA 분비와 연관지었다; 1 ㎍ 의 PR8 백신을 Poly(I:C) 와 함께 이용하여 4 주 간격으로 2회 면역시켰을 때, 혈액내 IgG 수준은 1.5 ㎍/ml 로 나타났다.

또한, 제 2 면역 2 주째에 동일 면역 조건 하에, 100 pfu 의 PR8 바이러스 1.2 ㎕ 를 코 양쪽에 접종하여 감염을 일으켰다. 비(非)-백신처리된 대조군의 경우, 비강 세척물에서 바이러스 역가가 10³ pfu/ml 이상인 바이러스의 생장이 관찰되었다 (도 2). 그러나, Po1y(I:C) 와 병용하여 2 회의 비강 백신접종을 받은 그룹에서는, 바이러스 생장이 완전히 억제되었다; 1 ㎍ 이상의 백신 단독으로 2 회 면역화된 그룹, 및 3 ㎍ 이상의 Poly(I:C) (제 1 면역시에만 사용) 를 받은 그룹에서는 바이러스 억제 효과가 전혀 관찰되지 않았다 (도 2).

또한, 제 1 면역시에만 병용된 1 ㎍ 또는 0.1 ㎍ 의 Poly(I:C) 를 받은 그룹에서도, 바이러스 생장이 각각 10^0.8 pfu/ml 및 10^1.6 pfu/ml 로 상당히 억제되었다. 백신만을 2회 투여받은 그룹에서는 바이러스의 생장 억제가 전혀 관찰되지 않았다.

이중-가닥 RNA 구조가 Poly(I:C) 의 보강제 작용에 있어서 중요함을 입증하기 위해, Poly(I:C) 를 100℃ 에서 5 분간 가열한 다음, 즉시 얼음에 냉각하고; 1 ㎍ 을 백신과 함께 비강내 접종하였다. 그 결과, 변성이 없을 경우에는 121 ㎍/ml 로 관찰되었던 IgA 반응이 21 ㎍/ml 로 대폭 줄어들었고, 혈액 IgG 반응도 1.5 ㎍/ml 에서 0.7 ㎍/ml 로 감소되었다.

또한, Poly(I:C) 변성 후에는 바이러스 생장 억제 효과가 더 이상 관찰되지 않았다.

다음으로, 치사량의 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 폐렴에 대한, Poly(I:C) 병용된 비강 백신 접종의 방어 효과를 조사하였다. 6 주 전에, 1 ㎍ 의 PR8 백신을 10 ㎍, 3 ㎍, 또는 1 ㎍ 의 Poly(I:C) 와 병용하여 비강 접종하였다; 2 주 전에, 백신 단독으로 추가 면역을 실시하였다; 40 LD₅₀ 의 PR8 바이러스 20 ㎕ 로 감염시킨 후, 폐렴 예방 잠재력을 조사하였다. 비-백신접종 그룹에서, 3 일 후 폐의 바이러스 역가가 10⁶ pfu 이상으로 높았으며, 5/5 마우스가 1 주 이내에 사망하였다. 그러나, 백신접종된 그룹에서는, 1 ㎍ 이상의 Poly(I:C) 가 병용 투여된 마우스 모두 생존하였다. 그 결과를 아래에 나타내었다.

백신				감염 (40 LD₅₀)	폐의 바이러스 역가 (PFU/ml;10ⁿ)	생존 마우스/시험 마우스 수치
1차		2차
PR8 (㎍)	Poly (I:C) (㎍)	PR8 (㎍)	Poly (I:C) (㎍)
1	10	1	10	A/PR8	<0*	5/5
1	10	1	-	A/PR8	N.D.	5/5
1	3	1	-	A/PR8	N.D.	5/5
1	1	1	-	A/PR8	N.D.	5/5
1	CTB*	1	CTB*	A/PR8	<0*	5/5
-	-	-	-	A/PR8	6.2±5.4	0/5

위에 나타낸 바와 같이, Poly(I:C) 는 보강제로서 감염에 대한 방어력을 제공하기에 충분한 점막 IgA 항체 반응을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

실시예 2: Poly(I:C) 와 병용된 비강 백신을 이용한, 교차 감염의 방어

Poly(I:C) 와 병용된 비강 인플루엔자 백신을 이용한 인플루엔자 바이러스의 방어와 관련하여, 교차 감염에 대한 방어 잠재력을 조사하였다. PR8 과 다른 아형의 인플루엔자 바이러스 균주, 즉 H1N1 (A/Beijing) 균주, H1N1 (Yamagata) 균주, 및 H3N2 (A/Guizhou) 균주의 각 백신을 3 ㎍ 의 Poly(I:C) 와 함께 제 1 면역 접종하였다; 4 주 후, 동일 균주만의 백신을 접종하고; 2 주 후, 동물을 100 pfu 의 H1N1 (A/PR8) 균주로 감염시켰다; 3 일 후, PR8 과 교차 반응을 보이는 비강 세척물 내의 IgA , 및 혈청 중의 IgG 를 측정하고, PR8 바이러스를 이용한 교차 감염에 대한 방어력을 측정하였다.

도 3 및 4 에 나타나듯이, 동일한 아형인 H1N1 (A/Beijing) 균주 및 H1N1 (A/Yamagata) 균주에서 IgA 및 IgG 반응 모두가 관찰되었고; 바이러스 감염은 완전히 억제되었다. 상이한 아형인 H3N2 (A/Guizhou) 균주의 경우, 소량의 IgA 및 IgG 가 교차 반응성을 나타내었고; 바이러스 감염에 대한 부분적 방어력이 관찰되었다.

따라서, Poly(I:C) 와 병용된 비강 인플루엔자 백신을 이용한, 교차 반응에 대한 방어력을 확인하였다.

실시예 3: Poly(I:C) 의 중추 신경계 안전성

Poly(I:C) 를 인간에게 비강 백신으로 사용할 경우, 비강과 뇌의 근접성으로 인해, 중추 신경계의 안전성이 중요한 문제이다. 이를 숙지하고, BALB/c 마우스에의 뇌내 접종을 시도하여 Poly(I:C) 의 안전성을 확인하였다. 0.25 ㎍, 2.5 ㎍, 또는 25 ㎍ 의 Poly(I:C) 를 25 ㎕ 의 PBS 에 용해하고, 이중 바늘 주사기로 뇌내 접종을 수행하였다. 접종 후, 체중 변화를 측정하고 생존율을 확인하였다. 대조군으로서, 25 ㎍, 10 ㎍, 또는 25 ㎍ 의 CTB* (CTB 는 0.1% CT 함유) 를 25 ㎕ 의 PBS 에 용해하고, 동일 방식으로 뇌내 접종을 실시하였다.

도 5 에 나타나듯이, 모든 Poly(I:C) 뇌내 접종 그룹의 모든 마우스가 2 주 이상 생존하였고, 25 ㎍ 접종 그룹에서 5% 체중 감소만이 나타났다. 반면에, 대조군 CTB* (0.1% CT 함유 CTB) 의 뇌내 접종된 그룹에서는, 10 ㎍ 투여된 동물의 1/5 마리 및 25 ㎍ 투여된 동물의 2/5 마리가 4 일째에 사망하였고, 체중 감소는 15% 에 달하였다.

(토의)

점막 내의 분비성 IgA 항체가 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어에 있어서 현재 이용되는 백신에 의해 유도된 IgG 항체에 비해 더 효과적이라는 점이 다수의 연구 결과로부터 명백하다. 비강 백신은 점막 내의 IgA 유도에 효과적이긴 하나, 많은 시도에도 불구하고 인간에 사용가능한 보강제가 아직 확립되지 않았다. 합성 이중-가닥 RNA 인 Poly(I:C) 가 정맥내 주사에 의해 인간에 성공적으로 주입되었고, 비강 백신에 있어서의 보강제로서 인간에 사용하기에 유용한 것으로 생각된다.

상기 실시예의 실험 결과로 판단컨대, Poly(I:C) 는 점막내 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어에 효과적인 비강 백신용 보강제로서 매우 유용하다. 더욱이, 다른 병원체용 점막 백신에 사용하는 것도 가능할 것이다.

인플루엔자와 같은 호흡기 감염에 대한 방어에 있어서, 점막에서 분비되는 특정 IgA 항체가 매우 효과적이다. 상이한 타입의 바이러스에 의한 교차 감염에 대한 방어력은 점막에서 분비되는 IgA 항체에 의해 주로 설명된다; 자연적으로 걸린(spontaneously caught) 유행성 감기로부터 회복된 인간은 그와 같이 유도된 IgA 항체를 보유하고 있고, 따라서 동일 아형의 변종 바이러스 유행기에 감염으로부터 보호받을 수 있다. 비감염된 개체를 감염으로부터 보호하는 방법으로서 백신 접종이 유용하긴 하나, 현재 이용되는 피하 접종용 백신은 점막 면역 반응을 일으키지 않는다; 교차 감염에 대한 방어 잠재력을 갖는 더 효과적인 백신의 개발이 요구된다. 항원의 비강내 접종법을 점막내 분비성 IgA 의 유도에 이용할 수는 있지만, 항원만을 접종할 경우 충분한 항체 반응이 관찰되지 않는다; 보다 효과적인 면역 반응을 일으키기 위해, 백신과 동시에 보강제를 투여할 필요가 있다.

상기 실시예에서, 본 발명자들은 비점막에서의 IgA 분비, 혈청내 IgG 반응, 및 점막 면역성을 유도하는 데 효과적인 보강제로서 Poly(I:C) (합성 이중-가닥) 를 이용한, 치사량의 인플루엔자 바이러스에 의한 감염의 예방을 논증하였다.

상기 면역 반응 결과에는 백신 균주와 상이한 아형의 바이러스에 대한 항체 유도, 및 백신 균주와 상이한 아형의 바이러스에 의한 감염으로부터의 방어가 포함되며; 교차 감염에 대한 방어 잠재력이 확인되었다. 또한, 비강 백신을 인간에 사용한다는 점을 고려하여, 보강제의 안전성도 관심의 대상이다. 본 실시예에서 이용된 투여 경로인 비강 접종에 있어서, 투여 부위가 중추 신경계에 매우 가까우므로, 마우스 당 0.25 ㎍ 내지 25 ㎍ 양의 Poly(I:C) 를 뇌내 접종하여 이의 신경계에 대한 영향력 및 안전성을 평가하였다. 그 결과, 콜레라 독소 (CTB) 대조군 (콜레라 독소 B 서브유닛에 0.1% 전(whole) 독소를 첨가하여 제조됨) 의 경우, 일부 마우스가 4 일째에 사망하고 (10 ㎍ 투여 그룹에서 1/5, 25 ㎍ 투여 그룹에서 2/5), 15% 이상의 체중 감소가 관찰된 반면, Poly(I:C) 투여 그룹에서는, 8 일째에 모든 마우스가 생존하였으며, 25 ㎍ 접종 그룹에서 일시적으로 약 5% 의 체중 감소가 관찰되었을 뿐이다; 과량의 뇌내 접종이 있었음에도, 어느 것도 사망하지 않았고, 그 안전성을 확인하였다.

비록 현재 이용가능한 불활성화된 인플루엔자 HA 백신이 효과적인 백신이긴 하나, 인플루엔자 바이러스가 신체 내로 침입하는 입구인 호흡기 점막 상피에서 이의 IgA 항체 유도 잠재력은 낮다; 따라서, 그 잠재력을 향상시켜서 백신의 효과를 더 증강시키는 것이 고려된다. 상기 실시예에서의 실험은, 현재 이용가능한 불활성화된 인플루엔자 HA 백신을, 보강제로서 첨가되는 Poly(I:C) 와 함께 비강 투여할 경우, 점막 표면 상에서 바이러스-특이적 IgA 가 효율적으로 유도된다는 것을 보여준다. 또한, 마우스 실험은, 바이러스의 침입으로 인한 치명적 감염이 예방되고, 상기 백신이 다른 바이러스 균주에 의한 침입에 대하여도 효과적임을 시사한다.

또한, 응용성과 관련하여, Poly(I:C) 는, 인플루엔자 바이러스 이외에 호흡기 및 기타 점막 경로를 통해 감염되는 병원체의 불활성화된 항원 백신용 보강제로서 유용할 수 있다 (수두 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 풍진 바이러스, SARS 바이러스, HIV, 보르데텔라 페르투시스, 나이세리아 메닝기티디스, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b, 폐렴구균 및 비브리오 콜레라 등).

실시예 4: Poly(I:C) 와 병용되는 비강내 인플루엔자 백신으로서 사용되는 불활성화된 바이러스 입자의 예방 효과

Poly(I:C) 와 병용된 비강 백신의 유용성을, 현재 이용가능한 에테르-처리된 HA (분리산물(Split-product) 백신) 뿐만 아니라, 다른 형태의 백신에 대하여도 확인하였다.

(재료)

백신: 에테르-처리된 HA 백신 (The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University 제조), 포르말린-불활성화된 전 입자 백신, A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 바이러스) (The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University 제조)

마우스: BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷)

(방법)

A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 바이러스의 포르말린-불활성화된 전 입자 백신 (0.1 ㎍) 을 비강 인플루엔자 백신의 백신 성분으로 하여 Poly(I:C) (100-l000 bp, Sigma) (0.1 ㎍) 와 함께, BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷) 에 투여하였다; 3 주 후, 동일 백신을 두 번째 투여하였다.

1 주 후, 마우스의 비강 세척물 및 혈청 내에서의 HA 및 NA 에 대한 항체 반응을 측정하여, 각각 점막 및 전신의 방어적 면역력 지표로 삼았다.

(결과)

불활성화된 전 바이러스 입자를 Poly(I:C) 와 병용하여 비강 인플루엔자 백신의 백신 성분으로 사용할 경우에도, 점막 방어적 면역력 및 전신 방어적 면역력이 증강되었다.

게다가, 각 백신 및 Poly(I:C) 를 0.1 ㎍ 의 양으로 사용한 경우에도, 그 조합물은, CTB* 와 병용된 분리산물 백신을 이용한, 바이러스 감염에 대한 완벽한 방어력을 제공할 것으로 기대되는 보강제 활성을 지닌 양성 대조군에서 관찰된 것과 동등한 반응을 일으켰다. 게다가, 상기 반응은 Poly(I:C) 와 병용된 분리산물 백신에서 관찰된 것에 비해 더 높았다. 따라서, Poly(I:C) 와 병용되는 비강 백신이, 분리산물 백신을 단독으로 사용하는 경우 뿐만 아니라, 다른 형태의 백신을 사용하는 경우에도 유용하다는 것이 명백해졌다 (도 6).

실시예 5: 비강 인플루엔자 백신용 보강제로서 Poly(I:C) 의 분자 크기

비강 인플루엔자 백신의 보강제로서 유용한 Poly(I:C) 의 분자 크기를 조사하였다.

(재료)

바이러스: A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 바이러스

Poly(I:C) 크기: (L) 10-300 bp (Fluka), (M) 100-l000 bp (Sigma), (H) >3.3x10⁶ bp (Fluka)

마우스: BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷)

(방법)

A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 바이러스의 분리산물 백신 (0.4 ㎍) 을, 다양한 크기의 Poly(I:C) (10-300 bp (Fluka), (M) 100-1000 bp (Sigma), (H) >3.3x10⁶ bp (Fluka)) 0.1 ㎍ 와 함께, BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷) 에 비강 투여하였다; 3 주 후, 동일 백신을 두 번째로 투여하였다. 1 주 후, 마우스의 비강 세척물 및 혈청 내에서의 HA 및 NA 에 대한 항체 반응을 측정하여, 각각 점막 및 전신의 방어적 면역력 지표로 삼았다.

(결과)

분자 크기가 10-300 bp 인 Poly(I:C) 를 이용한 실험 그룹에서, 다른 두 그룹에 비해 낮은 점막 면역 반응이 관찰되었다. 따라서, 분자 크기가 약 300 bp 이상인 Poly(I:C) 가 비강 인플루엔자 백신용 보강제로서 유용하다고 생각된다 (도 7).

실시예 6: 비(非)-Poly(I:C) 이중-가닥 RNA 의 보강제 작용

비강 인플루엔자 백신용 보강제로서 Poly(I:C) 의 작용을 다른 이중-가닥 RNA 인 Poly(A:U), 및 단일-가닥 RNA 인 Poly(A,U) 와 비교하였다.

(재료)

서브유닛: 정제 HA

보강제: Poly(I:C), Poly(A:U), 및 Poly(A,U).

(방법)

특정 항-HA 단일클론 항체로 커플링된 칼럼을 이용하여 A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 바이러스로부터 HA 분자를 정제하고, 상기 분자 1 ㎍ 을 Poly(A:U) (Sigma) 또는 단일-가닥 Poly(A,U) (Sigma) 1 ㎍ 와 함께, BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷) 에 비강 투여하였다; 3 주 후, HA 만을 두 번째로 투여하였다. 1 주 후, 마우스의 비강 세척물 및 혈청 내에서의 HA 에 대한 항체 반응을 측정하여, 각각 점막 및 전신의 방어적 면역력 지표로 삼았다.

(결과)

Poly(A:U) 및 단일-가닥 Poly(A,U) 의 보강제 활성도 관찰하였다. Poly(I:C) 의 보강제 활성에 비하여, Poly(A:U) 및 단일-가닥 (A,U) 는 도면에서와 같은 순서로 활성이 약했다 (도 8). 따라서, 비-Poly(I:C) 이중-가닥 RNA 또한 비강 인플루엔자 백신과 병용할 경우 보강제 활성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 7: Poly(I:C) 와 병용하여 비강 투여하는 조건 하에서, 일부 인플루엔자 바이러스 서브유닛을 이용한 방어 면역 유도

Poly(I:C) 와 병용하여 비강 투여하는 조건 하에서, 일부 인플루엔자 바이러스 서브유닛이 방어적 면역 반응을 일으킨다는 것이 확인되었다.

(재료)

서브유닛: HA, NA, M1 및 NP

보강제: Poly(I:C) (100-1000 bp, Sigma)

마우스: BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷)

(방법)

Poly(I:C) 와 함께 비강 투여된 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1 및 NP 의 방어적-효과-유도 잠재력을 비교하였다. 구체적으로, HA, NA, M1 및 NP 분자를, 특정 항-단일클론 항체로 콘쥬게이트된 칼럼을 이용하여 A/NewCaledonia/20/99 (H1N1) 바이러스로부터 정제하였다; 각 정제 산물의 1 ㎍ 부분을 1 ㎍ 의 Poly(I:C) (100-l000 bp, Sigma) 와 함께 BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷) 에 비강 투여하였다; 3 주 후, 각 분자 종을 두 번째로 투여하였다. 1 주 후, 마우스의 비강 세척물 및 혈청 내에서의 각 분자 종에 대한 항체 반응을 측정하여, 점막 및 전신의 방어적 면역력의 지표로 삼았다.

(결과)

Poly(I:C) 는 모든 서브유닛에 대하여 점막 및 전신 면역 반응을 증강시키는 것으로 나타났다. 그러나, 예방적 효과는 HA 및 NA 에 대한 체액성 면역력을 증강시킴으로써 증가되었지만, NP 에 대한 체액성 면역력을 증강시킴으로써는 예방적 효과가 증가되지 않았다. 따라서, HA 및 NA 가 강한 방어적 항원이고, 예방적 효과의 유도 잠재력은 서로 다른 서브유닛마다 상이함을 발견하였다.

실시예 8: Poly(I:C) 와 병용되는 비강 인플루엔자 백신의 효능을 증가시키는 투여 빈도 및 간격

Poly(I:C) 와 병용되는 비강 인플루엔자 백신의 효능을 증가시키는 투여 빈도 및 간격을 확인하였다.

(재료)

백신: A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 바이러스의 분리산물 백신 (1 ㎍)

보강제: Poly(I:C) [100-1000 bp, Sigma]

마우스: BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷)

(방법)

Poly(I:C) 와 병용되는 비강 인플루엔자 백신의 효능을 증가시키는 투여 빈도 및 간격을 정하기 위해, A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 바이러스의 분리산물 백신 (1 ㎍) 을 1 ㎍ 의 Poly(I:C) (100-1000 bp, Sigma) 와 함께 BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷) 에 비강 투여하였다; 1, 3, 4, 및 6 주 후에, 동일 백신을 두 번째로 투여하였다. 1 또는 2 주 후, 마우스의 비강 세척물 및 혈청 내에서의 HA 및 NA 에 대한 항체 반응을 측정하여, 각각 점막 및 전신의 방어적 면역력의 지표로 삼았다. 추가적 실험 그룹을 배분하여 1 회만 투여하고, 1 및 8 주 후에 관찰하였다.

(결과)

1 주 이상 간격으로 2 회 이상 투여한 경우, Poly(I:C) 와 병용되는 비강 인플루엔자 백신의 효능을 증가시키는 데 효과적이었다 (도 9).

실시예 9: 인간에 있어서, Poly(I:C) 와 병용되는 비강 인플루엔자 백신의 예방적 효과

인간에서의, Poly(I:C) 와 병용되는 비강 인플루엔자 백신의 효능을 항-인플루엔자 항체 반응을 기초로 확인하였다.

(재료)

백신: 현재 사용가능한 3가(trivalent) 인플루엔자 백신 [3 가지 바이러스 균주 A/NewCaledonia (H1N1), A/Panama (H3N2), 및 B/Shangdong 에서 유래된 분리산물 백신] (The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University)

보강제: Poly(I:C) (100-1000 bp, Sigma)

(대상체)

2 내지 여러 명의 건강한 인간

(방법)

400 ㎍/ml 의 3가 백신 및 700 ㎍/ml 의 PolyI:C 를 함유한 300 ㎕ (좌우 비강에 각각 150 ㎕ 씩) 의 액체를 건강한 성인에 분무 투여하였다; 4 주 후, 동일 액체를 다시 투여하였다. 재투여 한지 2 주 후, 타액과 혈청 물질을 수거하여, HA 및 NA 에 대한 항체 반응을 분석하였다. 투여 전 및 2 회 투여 후의 항체 역가를 비교함으로써, 상기 비강 백신의 항체 반응 유도 잠재력을 평가하였다.

(결과)

대상체에서, 타액내 백신 중의 3 가지 균주에 대한 IgA 항체가 증가되었음이 타액에서 관찰되었다.

또한, 일부 대상체에서는 혈청 중에서 항-NA-IgG 항체 및 HI 항체가 관찰되었다.

실시예 10: Poly(I:C) 와 함께 백일해 백신을 비강 투여함에 의한 면역 잠재력의 증강

비-인플루엔자 감염성 질병인 백일해에 대한 백신을 Poly(I:C) 와 함께 비강 투여했을 때, 면역 잠재력이 증강됨을 확인하였다.

(재료)

백신: 백일해 백신 (The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University 제조)

보강제: Poly(I:C) (100-1000 bp, Sigma)

마우스: BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷)

(방법 1)

백일해 백신 (The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University 제조) (1 내지 3 ㎍) 을, 0.1 ㎍ 내지 10 ㎍ 의 Poly(I:C) (100 내지 1000 bp, Sigma) 와 함께, BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷) 에 비강 투여하였다; 3 주 후, 동일 백신을 두 번째로 투여하였다. 두 번째 투여 후 1 주일째에, 마우스의 비강 세척물 및 혈청 내에서의 백일해 백신에 대한 항체 반응을 ELISA 법으로 측정하여, 점막 및 전신의 방어적 면역력의 지표로 삼았다.

(결과)

Poly(I:C) 는 백일해 백신에 있어서도 방어적 면역력을 증가시켰으며, 이는 비-인플루엔자 감염에 대한 백신의 방어적 면역력을 증강시키는 데에도 효과적임을 시사한다.

(방법 2)

백일해 백신 (The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University 제조) (1 내지 3 ㎍) 을, 0.1 내지 10 ㎍ 의 Poly(I:C) (100-1000 bp, Sigma) 와 함께, BALB/c 마우스 (6 주령, 암컷) 에 비강 투여하였다; 3 주 후, 동일 백신을 두 번째로 투여하였다. 두 번째 투여 후 1 주일째에, 마우스의 비강 세척물 및 혈청 내에서의 백일해 백신에 대한 항체 반응을 ELISA 법으로 측정하여, 점막 및 전신의 방어적 면역력의 지표로 삼았다. 두 번째 투여 후 2 내지 3 주째에, 독성 균주인 보르데텔라 페르투시스를 각 면역화된 마우스의 뇌 또는 비강 (분무) 에 접종하고, 14 일간 동물들을 관찰하였다; 면역화된 마우스의 생존율에 의해 효과를 판단하였다.

(결과)

마우스 생존율로 판단하건대, Poly(I:C) 는 백일해 백신에 있어서도 방어적 면역력을 증가시키고, 비-인플루엔자 감염성 질병에 대한 백신의 방어적 면역력을 증강시키는 데에도 효과적임을 확인하였다.

실시예 11: 인간에 있어서, Poly(I:C) 와 함께 비강 투여된 수두 백신의 예방적 효과

성인을 대상으로 추가 접종되는, Poly(I:C) 와 병용된 비강내 수두 생백신의 안전성 및 효능과 관련하여, 비점막 접종을 수행하고, 수두 백신만을 비강 접종받은 그룹과 체액성 면역 및 세포성 면역을 비교하였다.

(재료)

백신: 수두 생백신 (The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University 제조)

보강제: Poly(I:C) (100-1000 bp, Sigma)

건강한 인간: 그룹 당 2 내지 여러 명

(방법)

대상자 1 명 당 2 개의 수두 생백신 유리병에 주사용 생리 식염수를 가하고, 이를 분무기 (nebulizer) 를 이용하여 건강한 성인에게 비강 접종하였다. 또한, 현재 이용가능한 백신 및 Poly(I:C) (100-1000 bp, Sigma) 를 함유한 300 ㎕ (좌우 비강에 각각 150 ㎕ 씩) 의 백신액을 분무 투여하였다. 체액성 면역 및 세포성 면역을 측정함으로써, 예방적 효과를 확인하였다.

(결과)

Poly(I:C) 는 수두 생백신에 있어서도 방어적 면역력을 증가시켰으며, 이는 비-인플루엔자 감염성 질병에 대한 백신의 방어적 면역력을 증강시키는 데에도 효과적임을 시사한다.

상기 본 발명의 바람직한 구현 형태에 의해 본 발명을 예시하였으나, 본 발명의 범위는 오로지 청구의 범위에 의해 한정되는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 특허, 특허 출원 및 문헌들은, 본원에 구체적으로 기재된 바와 같이 그 내용이 본 발명의 설명에 대한 참조로 인용된 것으로 이해된다.

본 발명은 점막 투여에 의해 백신 접종을 용이하게 하고, 교차 면역을 획득할 수 있게 하는 백신 형태를 제공한다. 예컨대, 인플루엔자 바이러스에 대항하는 수단에 있어서, 이로써 약학 분야 및 기타 산업에서 유효한 예방 수단으로 폭넓게 사용될 수 있는 효과적인 백신을 제조할 수 있다.

Claims

하기를 포함하는 점막 투여용 백신:

A) 이중-가닥 RNA; 및

B) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원.
제 1 항에 있어서, 상기 점막이 비점막 (nasal mucosa) 을 포함하는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 병원체가, 수두 바이러스(varicella virus), 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes virus), 풍진 바이러스, 중증급성호흡기증후군 바이러스 (SARS virus), 인간면역결핍 바이러스 (HIV), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 b, 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 중에서 선택되는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 병원체가 인플루엔자 바이러스인 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 서브유닛이 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 분비성 IgA 를 생성하기에 충분한 농도로 존재하는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 0.1 내지 10 mg/ml 농도로 존재하는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 의 크기가 10² 내지 10⁸ bp 인 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 서브유닛이 최소한 NA 또는 HA 를 포함하는 것인 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 것인 백신.
하기를 1 회 이상 점막 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질병의 예방 방 법:

A) 하기를 포함하는 점막 투여용 백신:

a) 이중-가닥 RNA; 및

b) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원.
제 11 항에 있어서, 상기 백신을 2 회 이상 투여하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 백신을 1 주 이상의 간격으로 투여하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 것인 방법.
하기가 제공되는, 감염성 질병의 예방용 백신 키트:

A) 하기를 포함하는 점막 투여용 백신:

a) 이중-가닥 RNA; 및

b) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원; 및

B) 상기 백신을 1 회 이상 점막 투여하라는 내용의 설명서.
제 15 항에 있어서, 상기 백신을 2 회 이상 투여하는 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 백신을 1 주 이상의 간격으로 투여하는 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 키트.
백신의 점막 투여를 위한 이중-가닥 RNA 의 용도.
제 19 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 것인 용도.
점막 투여용 백신의 제조를 위한 이중-가닥 RNA 의 용도.
제 21 항에 있어서, 상기 이중-가닥 RNA 가 Poly(I:C) 를 포함하는 것인 용도.