CN104379170B - 粘膜免疫刺激剂及hpv感染症治疗用经口药物组合物 - Google Patents

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Abstract

粘膜免疫刺激剂含有具有滋养强壮作用的中药及粘膜佐剂。HPV感染症治疗用经口药物组合物至少含有HPV的E7多肽和具有滋养强壮作用的中药。

Description

粘膜免疫刺激剂及HPV感染症治疗用经口药物组合物
技术领域
本发明涉及一种粘膜免疫刺激剂及HPV感染症治疗用经口药物组合物，更详细而言，涉及一种含有粘膜佐剂和具有滋养强壮作用的中药的粘膜免疫刺激剂以及含有HPV疫苗和具有滋养强壮作用的中药的HPV感染症治疗用经口药物组合物。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)为DNA病毒，至今报道有100种以上不同的类型。皮肤(例如HPV-1、HPV-2)或粘膜表面(例如HPV-6、HPV-11)感染上述HPV，由此形成以几个月至几年为单位存在的良性肿瘤(疣)。
进而，粘膜长期间感染上述HPV的一部分(例如HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33)，由此引起恶性肿瘤。
作为女性特有的癌，关于次于乳癌而患病率高的子宫颈癌，其大约100％通过上述HPV对生殖器的长期间感染而发病，在世界上每年报道50万人，在日本每年报道1万5千人的新患者。
子宫颈癌引起的一年的死亡者数在世界上达到27万人，在日本达到3,500人。
理论上，只要可以将上述HPV的感染的全部防患于未然，则可以完全根除上述子宫颈癌。
得知上述HPV的感染除上述子宫颈癌以外，与外阴癌、肛门癌、口腔癌、阴道癌、阴茎癌、咽喉癌以及尖锐湿疣(生殖器疣)也相关，为了预防这些癌及性感染症，针对上述HPV的感染的预防疫苗认为是有效的。
在上述HPV中，特别是HPV16和HPV18占日本人女性的上述子宫颈癌的发病原因的约65％，特别是在年过20岁，占子宫颈癌的发病原因的约90％。
已知上述HPV16和上述HPV18也占上述外阴癌中先行出现的外阴上皮内肿瘤的高度病变的发病原因的不足50％，进而也与有可能发展成上述阴道癌的阴道上皮内肿瘤的发病的85％相关。
当今，作为HPV感染预防疫苗，特别是针对上述子宫颈癌的预防疫苗，可使用对上述HPV16和上述HPV18中特异的2价疫苗(商标名：Cervarix)(参照专利文献1)和除上述HPV16、上述HPV18之外对占尖锐湿疣的发病原因的约90％的HPV6及HPV11中也特异的4价疫苗(商标名：Gardasil)(参照专利文献2)。这2种疫苗均含有来自上述HPV的L1蛋白质病毒样粒子。
但是，针对更广范围的上述HPV的预防疫苗被开发，其只要不100％适用于世界中的上述HPV未感染的青春期女性，则不能期待不存在具有上述子宫颈癌及其癌前病变的患者。因此，目前仅子宫颈部细胞诊断的成本，也变得巨大。
在体外，由于上述HPV的E7蛋白质具有与Rb蛋白质的结合能力并与上述Rb蛋白质结合，而阻碍转录因子E2F和上述Rb蛋白质的结合。其结果，处于从上述Rb蛋白质中游离的状态的上述E2F被活化，使细胞的细胞周期从G1期向S期转移。
另一方面，由于上述HPV的另一种蛋白质，E6蛋白质，与p53蛋白质结合而促进遍在蛋白化，从而上述p53蛋白质被分解。
由此，通过上述E7蛋白质及上述E6蛋白质的功能，上述HPV感染的细胞避免细胞周期检查点的机制或上述p53蛋白质控制的凋亡，从而预料直至癌化。
实际上，在子宫颈癌细胞中，HPV的E7及E6的mRNA经常高表达。
另外，通过反义等抑制子宫颈癌细胞中的HPV的E6、E7的表达时，上述子宫颈癌细胞的增殖活性得到抑制。
进一步，也显示通过反义等抑制E6及E7的表达的上述子宫颈癌细胞即使移植于小鼠，也失去其致肿瘤能力。
由以上可知，上述HPV的E6及E7功能上与上述子宫颈癌及其它HPV相关癌的病态或发癌过程高度相关。
许多作为上述HPV感染引起的上述子宫颈癌的癌前病变的子宫颈部上皮内肿瘤(Cervicalintraepithelialneoplasia；CIN)发生在被称为子宫的结合带的部分。在上述结合带中，在子宫的阴道部分(子宫颈部的下一半，凸出于阴道的部分)产生糜烂时的修复时引起扁平上皮化生(阴道内的储备细胞的扁平上皮化)。此时，对产生的上皮的基底细胞的HPV感染认为是子宫颈癌的起源。
被上皮的基底细胞感染的上述HPV的DNA在每1个细胞中有数十至一百个拷贝水平，而上述E6、上述E7的表达少。
在通常的上述HPV的感染初期的上述E6、上述E7的表达低的状态下，含有属于上述子宫颈癌的发病的高危群的上述HPV，其中许多上述HPV成为潜伏状态，并且上述HPV的增殖停止。
美国疾病预防管理中心报道了，在子宫颈部HPV感染中，发展成浸润癌的为其中的0.13％以下。
另一方面，在上述子宫颈癌的发生过程中，认为向基底细胞的上述HPV的增殖直至持续状态，产生作为低水平的上述E6和上述E7的表达持续地提高这样的变化。
确认上述E6和上述E7的表达在CIN1(轻度异型增生)中非常低，与此相对，在CIN2(中度异型增生)和CIN3(高度异型增生)中高表达，因此认为，在上述CIN1的阶段引起上述E6和上述E7的表达的持续提高。
也报道有，认为上述HPV的感染被控制是宿主的免疫应答引起的，实际上，在HIV感染者或脏器移植患者等免疫应答降低的女性中，上述子宫颈癌的发病率高。
针对HPV等病毒的宿主免疫应答存在通过NK细胞或巨噬细胞等细胞群或干扰素起作用，从感染之后立即工作的被称为自然免疫的非特异机制，以及与其不同的病毒抗原特异的免疫应答，即被称为获得免疫的机制。
上述获得免疫为在感染后数日后起作用的免疫机制，可分为体液免疫和细胞性免疫。
与HPV的感染消除有关的免疫应答认为是以上述NK细胞和与上述细胞性免疫有关的细胞毒性T细胞(CTL)引起的细胞性的应答为主体。
上述NK细胞为在上述HPV的感染的初期工作的免疫细胞。
另一方面，关于HPV特异的细胞免疫，显示：针对上述HPV16的上述E7蛋白质的延迟型过敏反应与CIN退化相关，以及上述E7中特异的辅助T细胞在控制上述HPV的感染方面担负重要的功能(参照非专利文献1)。
如上所述，上述HPV的上述E6蛋白质和上述E7蛋白质，其中特别是上述E7蛋白质，认为在针对HPV相关癌的治疗用疫苗的开发中是有魅力的靶标。
迄今为止，虽然已经开发了几种以上述HPV的上述E7蛋白质为抗原的上述治疗用疫苗，但是，它们没有显示消除患者子宫颈部的癌前病变(上述CIN)或癌细胞，因而强烈地期望实际上具有治疗效果的疫苗的开发(参照非专利文献2～4)。
最近，本发明人等发现，在上述HPV16的上述E7蛋白质中，使将参与与上述Rb蛋白质的结合的第21位的Asp、第24位的Cys及第26位的Glu全部置换为Gly的变异型E7蛋白质在干酪乳杆菌中表达，将通过热处理而死菌化，并且干燥、粉末化的疫苗(LacE7)经口给药于小鼠，由此显示：不仅在脾脏，而且在粘膜中也可以诱导E7特异的细胞性免疫应答(参照非专利文献5)。
进而，本发明人等关于制剂化LacE7实施了针对上述子宫颈癌的上述癌前病变(CIN)的探索性临床试验，并且对安全性的评价和病理学的有效性进行了研究。
另外，对子宫颈部淋巴细胞、末梢血中的E7特异的细胞性免疫的诱导也进行了分析。
HPV16阳性的癌前病变(CIN3)患者7人中，将1个胶囊(250mg)1天1次5天经口给药作为1轮，1个胶囊/天给药组(n＝1)、2个胶囊/天给药组(n＝3)、4个胶囊/天给药组(n＝3)中，在第1、2、4、8周合计4轮，实施LacE7制剂的给药。
其结果，上述1个胶囊/天给药组及上述2个胶囊/天给药组在试验结束后成为圆锥切除，但上述4个胶囊/天给药组中，上述CIN3完全消失，也没有看到其后的恶化。
在免疫学的分析中，在上述子宫颈部淋巴细胞中看到针对上述HPV16的上述E7特异的细胞性免疫的诱导(E7特异的IFN-γ产生细胞、E7特异的Granzyme B产生细胞的诱导)。
病理学上也看到在给药前的上述癌前病变中没有看到的向上述癌前病变内的显著的淋巴细胞的浸润。
因此，本发明人等开发的上述LacE7期待成为针对上述癌前病变(CIN3)患者的首次的治疗疫苗。
但是，作为不仅针对上述癌前病变患者，而且针对子宫颈癌患者也具有充分的临床效果的治疗用HPV疫苗，满意的疫苗还没有被发现是现状。
即，依然存在如下问题：没有提供对子宫颈癌患者也具有充分的临床效果的治疗用HPV疫苗。
另外，也存在如下问题：没有开发通过更少量、短期间的上述LacE7的经口给药或上述LacE7以外的HPV疫苗的经口给药，也有效地诱导针对上述HPV的获得免疫的方法，特别是粘膜中的HPV特异的细胞性免疫诱导方法。
由于含有上述HPV或HIV等病毒的许多病原体经由粘膜侵入宿主而形成感染，因此认为，存在于局部粘膜的粘膜免疫系统在宿主的感染防御机制中发挥重要的作用。
关于上述局部粘膜中的体液免疫，分泌型的IgA抗体发挥重要的作用。
上述IgA抗体通过B细胞或T细胞、由巨噬细胞分泌的转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素(IL)-4或IL-6等细胞因子控制其产生，这些体液因子的功能在上述粘膜中的上述体液免疫的维持、调节中是重要的。
近年来，得知：作为上述局部粘膜中的免疫，在消化道或生殖器的粘膜中诱导以细胞毒性T细胞(CTL)为中心的细胞性免疫应答。在抗原特异的上述CTL的活化中干扰素(IFN)-γ等参与。
作为中药的十全大补汤和补中益气汤及粘膜佐剂作为在粘膜中将获得免疫之一的体液免疫刺激的粘膜免疫刺激剂已经得知。
在中药(和中药生药)中，如中医学中的“伤寒论”中存在的那样，存在也用于感染症的治疗的一组生药。
在现代，在感冒或流感、病毒性肝炎、幽门螺旋菌感染等各种感染症或感染症相关疾病的治疗中使用上述中药，也显示有效性。其作用大多是通过不仅针对原因病毒或原因细菌的直接作用，而且经由免疫调节作用的生态防御机制的增强进行的。
在现代医疗中，在细菌感染症的治疗中使用抗生素，在病毒感染症的预防中一般使用疫苗。与此相对，已知有上述中药的一部分具有提高宿主侧的免疫能力而具有感染防御效果。
例如在流感感染中，没有看到葛根汤对流感病毒的直接的增殖抑制效果，取而代之，产生解热效果或肺炎的改善效果、死亡率的降低等治疗效果。
小鼠中经鼻感染上述流感病毒时，血清中的IFN的量上升，接着，IL-1α的量上升，脑内环氧化酶活性上升，由此，前列腺素E2的量上升而发热。
阿司匹林抑制上述环氧化酶，与此相对，上述葛根汤通过抑制由上述IFN诱导的上述IL-1α的产生而呈现解热效果。
十全大补汤或补中益气汤为用于因术后、病后、产后、慢性疾病导致的消耗、疲劳的蓄积、夏天消瘦等而衰弱时的全身倦怠感、食欲不振等治疗的中药。上述十全大补汤也用于贫血等，与此相对，上述补中益气汤用于长时间感冒时，虚弱的人感冒时的微热、咳嗽、盗汗、心悸等症状的改善或体质的改善。
上述十全大补汤或上述补中益气汤均显示在肠道或气管的粘膜中活化B细胞的体液免疫机制(参照专利文献3及非专利文献6)。即，得知：十全大补汤及补中益气汤为刺激粘膜的体液免疫的粘膜免疫刺激剂。
此外，认为小柴胡汤或小青龙汤等也用于感染症的治疗或预防，它们也使宿主的免疫机制活化。
在免疫学中一般被称为佐剂的试剂为通过与抗原同时注射而用于抗原性的增强(免疫促进)的试剂，可考虑通过使上述抗原不溶化而较长地滞留，使上述抗原缓慢地长时间游离，或通过在给药上述抗原的部分引起炎症而巨噬细胞聚集，上述抗原容易被吞噬，由此促进抗原呈递，或使免疫细胞活化等，这些作用机制为各种各样，也大多为不清楚的作用机制。
上述葛根汤、十全大补汤、补中益气汤、小柴胡汤、小青龙汤等具有所谓的滋养强壮作用的中药也在具有体液免疫的增强效果方面可以说是广义的佐剂。
作为粘膜佐剂，众所周知的是来自细菌的霍乱毒素(choleratoxin：CT)和毒素原性大肠菌的易热性毒素(heat-labileenterotoxin：LT)、肠道出血性大肠菌的Vero毒素-(verotoxin：VT)、白喉毒素(diphteriatoxin：DT)、百日咳毒素(pertussistoxin：PT)，它们在免疫原性强的实验上为最有效的佐剂。
虽然来自细菌的上述粘膜佐剂均在粘膜及全身发挥优异的佐剂效果，但是，得知呈现视神经麻痺等严重的副作用，因此，不能直接用于人的治疗。
因此，最近，新开发了可以避免上述副作用的变异型粘膜佐剂，并可以利用。
另外，除来自细菌的野生型和变异型的上述粘膜佐剂以外，作为没有副作用且临床中可使用的粘膜佐剂，可使用作为合成神经酰胺的αGalCer(α-galactosylceramide)、CpG低聚核苷酸、作为由磷脂和载脂蛋白质构成的生物表面活性剂的肺表面活性剂蛋白质-C(pulmonarySurfactantProtein-C，SP-C、别名：SURFACTEN)、肺表面活性剂蛋白质-B(SP-B)、野生型或变异型IFN-α、双链RNA以及活性增强型TNF变异体等(参照专利文献4～6及非专利文献7～11)。
但是，在上述HPV等病毒及细菌的感染防御或感染症的治疗中，作为与针对上述病毒及上述细菌的疫苗并用给药的粘膜免疫刺激剂，还没有发现满意的粘膜免疫刺激剂是现状。
即，依然存在如下问题：提供一种在粘膜中在细胞性免疫的刺激方面具有充分的效果、可以与HPV疫苗等病毒疫苗及细菌疫苗并用给药的粘膜免疫刺激剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/078455号小册子
专利文献2：国际公开第2000/045841号小册子
专利文献3：日本专利公开第2006-070217号公报
专利文献4：国际公开第2007/018152号小册子
专利文献5：国际公开第2004/028561号小册子
专利文献6：日本专利公开第2005-097267号公报
非专利文献
非专利文献1：R.Hopfletal.，Lancet，2000，vol.356，pp.1985-1986
非专利文献2：C.L.TrimbleandI.H.Frazer，LancetOncol.，2009，vol.10，pp.975-980
非专利文献3：H.Pooetal.，IntJ.Cancer，2006，vol.119，pp.1702-1709
非专利文献4：N.G.Cortess-Perezetal.，Vaccine，2007，vol.25，pp.6581-6588
非专利文献5：K.Adachietal.，Vaccine，2010，vol.28，pp.2810-2817
非专利文献6：H.Kiyoharaetal.，Evid.BasedComplement.Alternat.Med.，2006，vol.3，pp.459-467
非专利文献7：A.Dalpkeetal.，Immunology，2001，vol.204，pp.667-676
非专利文献8：D.Mizunoetal.，Vaccine，2011，vol.29，pp.5368-5378
非专利文献9：H.Kayamuroetal.，Biomaterials，2009，vol.30，pp.5869-5876
非专利文献10：H.Fujitaetal.，J.Immunol.，2009，vol.183，pp.254-260
非专利文献11：Y.Morishimaetal.，Eur.J.Immunol.，2005，vol.35，pp.2803-2814
发明内容
本发明的课题在于，解决现有的上述各种问题，达到以下的目的。即，本发明的目的也在于，提供一种在粘膜中的细胞性免疫的刺激上具有充分的效果、可以与HPV疫苗等病毒疫苗及细菌疫苗并用给药、含有具有滋养强壮作用的中药和粘膜佐剂的粘膜免疫刺激剂，以及可以在子宫颈癌或外阴癌、肛门癌、口腔癌、阴道癌、阴茎癌、咽喉癌和其癌前病变及尖锐湿疣的治疗中使用、含有作为HPV疫苗的HPV的E7多肽和具有滋养强壮作用的中药的HPV感染症治疗用经口药物组合物。
解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明人等进行了潜心研究，结果得到以下的见解。
即，本发明人等新发现：通过将上述HPV疫苗和作为中医佐剂已知有体液免疫增强效果的上述十全大补汤或上述补中益气汤等具有滋养强壮作用的中药并用给药，脾脏中的上述HPV疫苗特异的细胞性免疫得到增强。进而还新发现：通过将上述HPV疫苗、上述十全大补汤或上述补中益气汤等具有滋养强壮作用的中药和粘膜佐剂并用给药，粘膜部分中的上述HPV疫苗特异的细胞性免疫应答得到增强。含有上述十全大补汤或上述补中益气汤等具有滋养强壮作用的中药和粘膜佐剂的粘膜免疫刺激剂不仅作为针对HPV疫苗的有效的粘膜免疫刺激剂起作用，而且可期待作为针对其它病毒疫苗及细菌疫苗的粘膜免疫刺激剂的效果。
本发明是基于本发明人等的上述见解完成的发明，用于解决上述课题的手段如下所述。即，
本发明的粘膜免疫刺激剂的特征在于，含有具有滋养强壮作用的中药和粘膜佐剂。
本发明的HPV感染症治疗用经口药物组合物的特征在于，含有HPV的E7多肽和具有滋养强壮作用的中药。
发明的效果
根据本发明，解决现有的上述各种问题，可以达到上述目的，可以提供一种在粘膜中的细胞性免疫的刺激上具有充分的效果、可以与HPV疫苗等病毒疫苗及细菌疫苗并用给药、含有具有滋养强壮作用的中药和粘膜佐剂的粘膜免疫刺激剂，以及可以在子宫颈癌或外阴癌、肛门癌、口腔癌、阴道癌、阴茎癌、咽喉癌和其癌前病变及尖锐湿疣的治疗中使用、含有作为HPV疫苗的HPV的E7多肽和具有滋养强壮作用的中药的HPV感染症治疗用经口药物组合物。
附图说明
图1是表示在LacE7经口给药中同时给药十全大补汤(JTT)或补中益气汤(HET)引起的对全身性及粘膜中的1型T细胞应答的影响的图。
图2是表示在LacE7经口给药中同时给药十全大补汤(JTT)或补中益气汤(HET)和LTB引起的对全身性及粘膜中的1型T细胞应答的影响的图。
图3A是表示在LacE7经口给药中同时给药十全大补汤(JTT)或补中益气汤(HET)和LTB引起的对全身性的体液免疫应答的影响的图。
图3B是表示在LacE7经口给药中同时给药十全大补汤(JTT)或补中益气汤(HET)和LTB引起的对粘膜中的体液免疫应答的影响的图。
图4A是表示在LacE7经口给药中同时给药十全大补汤(JTT)或补中益气汤(HET)和LTB引起的对粘膜中的1型细胞应答的影响的图。
图4B是表示在LacE7经口给药中同时给药十全大补汤(JTT)或补中益气汤(HET)和LTB引起的对粘膜中的2型T细胞应答的影响的图。
图5是表示在LacE7经口给药中同时给药补中益气汤(HET)和α半乳糖神经酰胺(αGalCer)或LTB引起的对粘膜中的E7特异的1型T细胞应答的影响的图。
图6是表示通过LacE7经口给药而在肠道粘膜上内皮中诱导E7特异的CTL的图。
图7是表示通过LacE7经口给药而在肠道粘膜上内皮中诱导E7特异的CTL的图。
具体实施方式
(粘膜免疫刺激剂)
本发明的免疫刺激剂至少含有具有滋养强壮作用(免疫增强作用)的中药(免疫增强中药)和粘膜佐剂，含有根据需要适当选择的其它成分。
＜免疫增强中药＞
作为具有滋养强壮作用(免疫增强作用)的上述免疫增强中药，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如：葛根汤、十全大补汤、补中益气汤、小柴胡汤、小青龙汤等。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
其中，优选十全大补汤和补中益气汤。
＜＜十全大补汤＞＞
上述十全大补汤为中药的一种，由黄芪(オウギ)、人参(ニンジン)、桂皮(ケイヒ)、当归(トウキ)、川芎(センキュウ)、芍药(シャクヤク)、熟地黄(ジオウ)、苍术(ソウジュツ)或白术(ビャクジュツ)、茯苓(ブクリョウ)及甘草(カンゾウ)构成。例如，可以在总量7.5g中含有将日本药典黄芪3.0g、日本药典人参3.0g、日本药典桂皮3.0g、日本药典当归3.0g、日本药典川芎3.0g、日本药典芍药3.0g、日本药典熟地黄3.0g、日本药典苍术3.0g、日本药典茯苓3.0g及日本药典甘草1.5g混合成的混合生药5.0g，进一步除上述混合生药以外，可以添加日本药典硬脂酸镁和日本药典乳糖水合物等。
作为上述十全大补汤，可以为市售品，作为该市售品，可列举例如Tsumura十全大补汤提取物颗粒(识别编码：Tsumura/48)等。
＜＜补中益气汤＞＞
上述补中益气汤为中药的一种，由黄芪、人参、苍术或白术、当归、甘草、柴胡(サイコ)、陈皮(チンピ)、大枣(タイソウ)、生姜(ショウキョウ)及升麻(ショウマ)构成。例如，可以在总量7.5g中含有将日本药典黄芪4.0g、日本药典人参4.0g、日本药典苍术4.0g、日本药典当归3.0g、日本药典甘草1.5g、日本药典柴胡2.0g、日本药典陈皮2.0g、日本药典大枣2.0g、日本药典生姜0.5g及日本药典升麻1.0g混合成的混合生药5.0g，进一步除上述混合生药以外，可以添加日本药典硬脂酸镁和日本药典乳糖水合物等。
作为上述补中益气汤，可以为市售品，作为该市售品，可列举例如Tsumura补中益气汤提取物颗粒(识别编码：Tsumura/41)等。
＜粘膜佐剂＞
作为上述粘膜佐剂，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，优选进一步增强来自病毒或细菌等的蛋白质的经口疫苗特异的获得免疫的粘膜佐剂。可列举例如：细菌毒素、合成神经酰胺(αGalCer)、CpG低聚核苷酸、SP-C(SURFACTEN)、SP-B、IFN-α(野生型或变异型)、双链RNA及活性增强型TNF变异体，它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在从前作为粘膜佐剂频繁地使用方面，优选来自细菌毒素的佐剂(细菌毒素佐剂)。
在不来自细菌毒素方面，优选合成神经酰胺(αGalCer)、CpG低聚核苷酸、SP-C(SURFACTEN)、SP-B、IFN-α(野生型或变异型)、双链RNA及活性增强型TNF变异体等佐剂，其中，在确认针对人的佐剂效果方面，更优选上述合成神经酰胺(αGalCer)。
在已知有针对多个抗原的佐剂效果方面，优选上述细菌毒素和上述合成神经酰胺(αGalCer)。
＜＜细菌毒素佐剂＞＞
作为上述细菌毒素佐剂，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如来自CT、LT、VT、DT、PT等的多肽。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
其中，优选以在向人的经口给药中不产生严重的副作用的方式预先导入有变异的变异型细菌毒素佐剂。
-变异型细菌毒素佐剂-
作为上述变异型细菌毒素佐剂，只要在向人的经口给药中不产生严重的副作用，就没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如：变异型CT、变异型LT、变异型VT、变异型DT、变异型PT等。
作为变异型CT、变异型LT、变异型VT、变异型DT、变异型PT，可列举例如已经在文献(国际公开第98/042375号、国际公开第00/037609号、国际公开第2006/100108号、国际公开第1996/006627号)中记载的那些。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
--LTB多肽--
作为上述来自LT的多肽，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但优选LTB多肽。上述LTB多肽除来自LT的B亚单元(LTB)、具有粘膜佐剂效果以外，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如作为全长的LTB蛋白质等。
上述LTB以LT的A亚单元(LTA)和二聚体(海参毒素)的形式显示毒性，但上述LTB单独不具有毒性。
尽管如此，通过经口或经鼻给药，显示上述LTB蛋白质单独在粘膜中作为佐剂起作用(国际公开第99/026654号)。
因此，在向人给药的经口疫苗的制造中，可以将上述LTB多肽作为粘膜佐剂使用。
作为上述LTB多肽，可以为市售品，作为该市售品，可列举例如西格玛奥尔德里奇株式会社的来自大肠菌的易热性肠毒素B亚单元(LTB)(目录编号：E8656)等。
＜＜合成神经酰胺(αGalCer)＞＞
通过在使用胆癌小鼠的体内分析中显示抗肿瘤效果的天然化合物的筛选，来自海绵的AGELIFERIN类被分离。进一步，作为抗肿瘤效果更强的上述AGELIFERIN类的衍生物，取得了上述合成神经酰胺(αGalCer)。在其后的研究中，在上述合成神经酰胺(αGalCer)摄入抗原呈递细胞之后，与具有NK细胞和T细胞这两者的特性的NKT细胞会合，诱导IFN-γ及IL-4的产生，因此，显示为所谓的佐剂。报道有上述合成神经酰胺(αGalCer)通过经鼻给药，可以在鼻中诱导IgA产生，因此，也为粘膜佐剂。
作为上述合成神经酰胺(αGalCer)，可以为市售品，作为该市售品，可列举例如协和发酵麒麟株式会社的α半乳糖神经酰胺(KRN7000)等。
＜其它成分＞
作为上述其它成分，没有特别限制，可以在不损害本发明的效果的范围内根据目的适当选择，可列举例如医药上可接受的载体等。
＜＜载体＞＞
作为上述载体，没有特别限制，例如，可根据后述的上述粘膜免疫刺激剂的剂型等适当选择。另外，作为上述粘膜免疫刺激剂中的上述其它成分的含量，也没有特别限制，可以根据目的适当选择。
-剂型-
作为上述剂型，除可以经口给药以外，没有特别限制，可列举例如经口固体剂(片剂、包覆片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等)、经口液体剂(内服液体剂、糖浆剂、酏剂等)等。
＜用途＞
上述粘膜免疫刺激剂可以对患者经口给药。此时，上述粘膜免疫刺激剂在患者的粘膜中刺激对其前后或同时给药的抗原特异的细胞性免疫。
＜＜抗原＞＞
作为针对上述粘膜免疫刺激剂、在其前后或同时经口给药的上述抗原，除为来自病毒或细菌、可以作为疫苗使用的肽以外，没有特别限制。上述抗原可以单独使用1种，也可以并用2种以上。在针对子宫颈癌等HPV相关癌的治疗用途中，作为抗原，优选来自HPV的多肽(HPV多肽)。
-HPV多肽-
作为上述HPV多肽，只要是具有抗原性，就没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以为HPV蛋白质的全长。另外，上述HPV多肽可以具有缺失、置换或添加1至数个氨基酸的变异。上述HPV多肽可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
作为用于将上述HPV多肽作为疫苗使用的制造方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如使用化学合成或基因重组技术的制造方法等。
在这些制造方法中，在成本等方面，优选使用利用转化细菌的基因重组的制造方法。
作为用于上述宿主的细菌，没有特别限制，可以根据目的选择，可列举例如：酵母、大肠菌、枯草菌、乳酸菌等，但优选乳酸菌，在乳酸菌中，更优选乳杆菌(Lactobacillus)属，在确认辅助T细胞1型(Th1)细胞的诱导能力方面，特别优选干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)。
可以适当选择适于宿主细菌中表达的表达载体。
可以使用含有编码上述HPV多肽的核酸的表达载体(HPV多肽表达载体)，用根据目的适当选择的转化方法将上述宿主细菌进行转化。
上述HPV多肽通过适当选择上述表达载体，可以在上述宿主细菌的细胞表面或细胞内表达，或分泌于细胞外。
作为用上述HPV多肽表达载体转化的宿主细菌(HPV多肽表达宿主细菌)的培养方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。
为了作为疫苗使用，可以从培养后的上述HPV多肽表达宿主细菌的培养物中将上述HPV多肽多肽进行精制，也可以将上述HPV多肽表达宿主细菌直接作为疫苗使用。
在将上述HPV多肽表达宿主细菌直接作为疫苗使用时，可以根据目的将菌体进行热处理等而进行死菌化。
在将死菌化的上述HPV多肽表达宿主细菌从培养基中回收之后，可以进行干燥并做成粉体状，作为疫苗使用。
在使用之前，可以将上述进行干燥并做成粉体状的细菌在低温下保存。
另外，也可以在使干酪乳杆菌死菌化的粉体中添加上述HPV多肽，作为疫苗使用。
--HPV的E7多肽--
作为上述HPV多肽，优选上述HPV的E7多肽。作为上述HPV的E7多肽，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如更优选来自选自由属于与癌有关的高危群的HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82、HPV26、HPV53及HPV63构成的组中的至少1种HPV的E7多肽。
其中，特别优选来自HPV16及HP18的至少任一种HPV的E7多肽，最优选来自HPV16的E7的多肽。
上述HPV的E7多肽只要具有抗原性即可，例如，可以为全长E7蛋白质。
作为上述E7多肽，除来自野生型E7之外，可以使用来自变异型E7的变异型E7多肽。
---变异型E7多肽---
作为上述变异型E7多肽，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如通过缺失、置换或添加1至数个氨基酸而失去与Rb蛋白质的结合性的变异型E7多肽等。上述变异型E7多肽可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在这些变异型E7多肽中，优选将相当于HPV16的野生型E7蛋白质(序列号1)中的第21位的Asp、第24位的Cys及第26位的Glu的、参与与E7蛋白质的Rb蛋白质的结合的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基的变异型E7多肽。例如，作为将HPV16的野生型E7蛋白质(序列号1)的上述第21位的Asp、第24位的Cys及第26位的Glu的全部置换为Gly的变异型E7多肽，可列举HPV16的变异型E7蛋白质(序列号2)。
本发明的粘膜免疫刺激剂在作为免疫原经口给药的病毒抗原或与细菌抗原等疫苗共同经口给药的情况下，将对上述疫苗特异的获得免疫，特别是细胞性免疫增强。
(HPV感染症治疗用经口药物组合物)
本发明的HPV感染症治疗用经口药物组合物至少含有HPV的E7多肽和具有滋养强壮作用(即免疫增强效果)的中药(免疫增强中药)，含有根据需要适当选择的其它成分。
＜HPV的E7多肽＞
作为上述HPV的E7多肽，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，优选来自选自由属于与癌有关的高危群的HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82、HPV26、HPV53及HPV63构成的组中的至少1种HPV的E7多肽。
其中，更优选来自HPV16及HP18的至少任一种HPV的E7多肽，特别优选来自HPV16的E7多肽。
上述HPV的E7多肽只要具有抗原性即可，例如，可以为全长E7蛋白质。
作为上述E7多肽，除来自野生型E7的述E7多肽之外，可以使用来自变异型E7的变异型E7多肽。
＜＜变异型E7多肽＞＞
作为上述变异型E7多肽，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如通过缺失、置换或添加1至数个氨基酸而失去与Rb蛋白质的结合性的变异型E7多肽等。上述变异型E7多肽可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在这些变异型E7多肽中，优选将相当于HPV16的野生型E7蛋白质(序列号1)中的第21位的Asp、第24位的Cys及第26位的Glu的、参与与E7蛋白质的Rb蛋白质的结合的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基的变异型E7多肽。例如，作为将HPV16的野生型E7蛋白质(序列号1)的上述第21位的Asp、第24位的Cys及第26位的Glu的全部置换为Gly的变异型E7多肽，可列举HPV16的变异型E7蛋白质(序列号2)。
作为用于将上述E7多肽作为疫苗使用的制造方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如使用化学合成或基因重组技术的制造方法等。
在这些制造方法中，在成本等方面，优选使用利用转化细菌的基因重组的制造方法。
作为用于上述宿主的细菌，没有特别限制，可以根据目的选择，可列举例如：酵母、大肠菌、枯草菌、乳酸菌等，但优选乳酸菌，在乳酸菌中，更优选乳杆菌(Lactobacillus)属，在确认辅助T细胞1型(Th1)细胞的诱导能力方面，特别优选干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)。
可以适当选择适于宿主细菌中表达的表达载体。
可以使用含有编码上述E7多肽的核酸的表达载体(E7表达载体)，用根据目的适当选择的转化方法将上述宿主细菌进行转化。
上述E7多肽通过适当选择上述表达载体，可以在上述宿主细菌的细胞表面或细胞内表达，或分泌于细胞外。
作为用上述E7表达载体转化的宿主细菌(E7表达宿主细菌)的培养方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。
为了作为疫苗使用，可以从培养后的上述E7表达宿主细菌的培养物中将上述E7多肽多肽进行精制，也可以将上述E7表达宿主细菌直接作为疫苗使用。
在将上述E7宿主细菌直接作为疫苗使用时，可以根据目的将菌体进行热处理等而进行死菌化。
在将死菌化的上述E7表达宿主细菌从培养基中回收之后，可以进行干燥并做成粉体状，作为疫苗使用。
在使用之前，可以将上述进行干燥并做成粉体状的细菌在低温下保存。
另外，也可以在使干酪乳杆菌死菌化的粉体中添加上述E7多肽，作为疫苗使用。
＜免疫增强中药＞
作为具有滋养强壮作用(免疫增强作用)的上述免疫增强中药，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如：葛根汤、十全大补汤、补中益气汤、小柴胡汤、小青龙汤等。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
其中，优选十全大补汤和补中益气汤。
＜＜十全大补汤＞＞
关于上述十全大补汤，如上所述。
＜＜补中益气汤＞＞
关于上述补中益气汤，如上所述。
＜其它成分＞
作为上述其它成分，没有特别限制，可以在不损害本发明的效果的范围内根据目的适当选择，可列举例如粘膜佐剂、医药上可接受的载体等。另外，作为上述药物组合物中的上述其它成分的含量，也没有特别限制，可以根据目的适当选择。
＜＜粘膜佐剂＞＞
作为上述粘膜佐剂，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，优选与上述十全大补汤或上述补中益气汤协同进一步增强上述HPV的上述E7多肽等的经口疫苗特异的体液免疫和细胞性免疫的粘膜佐剂。可列举例如：细菌毒素、合成神经酰胺(αGalCer)、CpG低聚核苷酸、SP-C(SURFACTEN)、SP-B、IFN-α(野生型或变异型)、双链RNA及活性增强型TNF变异体，它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
在从前作为粘膜佐剂频繁地使用方面，优选细菌毒素佐剂。
在不来自细菌毒素方面，优选合成神经酰胺(αGalCer)、CpG低聚核苷酸、SP-C(SURFACTEN)、SP-B、IFN-α(野生型或变异型)、双链RNA及活性增强型TNF变异体等佐剂，其中，在确认针对人的佐剂效果方面，更优选上述合成神经酰胺(αGalCer)。
在已知有针对多个抗原的佐剂效果方面，优选上述细菌毒素和上述合成神经酰胺(αGalCer)。
关于上述HPV感染症治疗用经口药物组合物，上述粘膜佐剂不是必需的成分，但在可以显著地增强上述HPV感染症治疗用经口药物组合物的效果方面，优选通过添加而含有
-细菌毒素佐剂-
作为上述细菌毒素佐剂，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如来自CT、LT、VT、DT、PT等的多肽。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
其中，优选以在向人的经口给药中不产生严重的副作用的方式预先导入有变异的变异型细菌毒素佐剂。
--变异型细菌毒素佐剂--
作为上述变异型细菌毒素佐剂，只要在向人的经口给药中不产生严重的副作用，就没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如：变异型CT、变异型LT、变异型VT、变异型DT、变异型PT等。
作为变异型CT、变异型LT、变异型VT、变异型DT、变异型PT，可列举例如已经在文献(国际公开第98/042375号、国际公开第00/037609号、国际公开第2006/100108号、国际公开第1996/006627号)中记载的那些。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
---LTB多肽---
作为上述来自LT的多肽，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但优选LTB多肽。关于上述LTB多肽，如上所述。
-合成神经酰胺(αGalCer)-
关于上述合成神经酰胺(αGalCer)，如上所述。
＜＜载体＞＞
作为上述载体，没有特别限制，例如，可根据后述的上述粘膜免疫刺激剂的剂型等适当选择。
-剂型-
作为上述剂型，除可以经口给药以外，没有特别限制，可列举例如经口固体剂(片剂、包覆片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等)、经口液体剂(内服液体剂、糖浆剂、酏剂等)等。
＜用途＞
上述HPV感染症治疗用经口药物组合物可以在子宫颈癌癌前病变患者及子宫颈癌患者等患者的粘膜中用于刺激对HPV的E7多肽(HPV疫苗)特异的细胞性免疫。
实施例
以下，对本发明的实施例进行说明，但本发明受这些实施例任何限定。
(实施例1)
＜用于体内分析的小鼠的免疫＞
利用小鼠的LacE7制剂的经口免疫按照K.Adachietal.，Vaccine，2010，vol.28，pp.2810-2817中记载的方法进行。此时，根据需要，向小鼠经口给药十全大补汤(以下称为“JTT”)和补中益气汤(以下称为“HET”)，进一步根据需要向小鼠经口给药LTB多肽或合成神经酰胺(αGalCer)。
＜＜LacE7制剂的制造＞＞
LacE7制剂按照公知的方法制造(PooH.etal.，Int.J.Immunol.，2006，vol.119，pp.1702-1709)。简而言之，在确认辅助T细胞1型(Th1细胞)的诱导能力的干酪乳杆菌中使用表达载体导入来自HPV16的变异型E7蛋白质(由序列号2所示的氨基酸序列构成，野生型E7蛋白质的Rb结合部位的3个氨基酸残基被置换)。培养后的重组体(LacE7)通过热进行死菌化。将由培养基精制的LacE7用蒸馏水清洗几次后，进行干燥、粉体化(LacE7制剂)，在使用之前，在4℃下保存。上述LacE7制剂在水性溶剂中为不溶性。
＜＜向小鼠的LacE7制剂的经口给药＞＞
通过对6周龄的雌性SPFC67BL小鼠(日本克莱尔株式会社)经口给药上述LacE7制剂而进行免疫。
在第1周、第2周、第4周及第6周合计4轮，每1只给药1.0mg的上述LacE7制剂。将在200μL的PBS中悬浮有上述LacE7制剂的物质使用经胃管在每周连续5天、1日1次3小时的绝食后进行全部的给药。
＜＜向小鼠的十全大补汤和补中益气汤的经口给药＞＞
将每1日1只40mg的JTT(Tsumura株式会社制)或HET(Tsumura株式会社制)，在与5g的粉末饲料中混合的状态下，使放入1个笼子中的5只小鼠分别完全摄取。在给药LacE7制剂的6周(第1周～第6周)之间，每日摄取JTT或HET的任一种。
＜＜向小鼠的LTB多肽经口给药＞＞
LTB多肽与上述LacE7制剂一起，每1只10μg，在每轮的第3天进行经口给药。作为LTB多肽，使用西格玛奥尔德里奇株式会社的来自大肠菌的易热性肠毒素B亚单元(LTB)(目录编号：E8656)。
＜＜向小鼠的αGalCer经口给药＞＞
合成神经酰胺(αGalCer)与上述LacE7制剂一起，每1只2μg，在每轮的第3天进行经口给药。作为合成神经酰胺(αGalCer)，使用协和发酵麒麟株式会社的α半乳糖神经酰胺(KRN7000)。
＜脾脏、肠清洗液、末梢血试样及粘膜组织的回收＞
在从上述LacE7制剂最后接种1周后(从接种开始至第7周)，回收淋巴细胞、血清及肠清洗液。
将接种有上述LacE7制剂的5只小鼠解剖，获取脾脏、肠及末梢血。用HBSS(Hanks’Balanced Salt Solution)清洗上述脾脏。上述肠在除去排泄物之后，用加入有蛋白酶抑制剂的HBSS 10mL清洗肠道内部，将回收的液体作为肠清洗液。回收的血清和肠清洗液在-80℃下保存。
同样地，解剖接种有上述LacE7制剂的25只小鼠，作为粘膜组织回收肠道上皮。将上述肠道上皮在含有4％对甲醛的磷酸缓冲生理食盐水(PBS)中在室温下固定1小时后，用PBS冲洗，在OCT化合物(Tissue-Tek(注册商标)，SakuraFinetek，Zoeterwoude，荷兰)中包埋样品并冻结，在-80℃下保存。使用低温恒温器(CM1510S、Leica)制作冻结切片(厚度6μm)，载置于载玻片上用于进行免疫组织学分析。
＜小鼠的脾脏细胞及粘膜淋巴细胞的制备＞
将肠沿纵向切开，在添加有10质量％FBS、100单位/mL青霉素及100μg/mL链霉素的RPMI1640(含有10质量％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、50mM2-巯基乙醇)培养基中，在37℃下激烈地振荡30分钟。对于回收的细胞悬浮液，用BDFalcon(商标)细胞过滤器(BD生物科学株式会社，美国)除去组织残屑，接着，进行使用层叠有70质量％和40质量％的Percoll PLUS的15mL管的不连续浓度梯度离心。在上面层叠约107个～108个细胞，将600×g在室温下离心20分钟，由此，在70质量％和40质量％的PercollPLUS的界面聚集粘膜淋巴细胞(存活率95％)。
脾脏细胞通过在PBS中将脾脏缓慢地破裂而得到。通过离心分离除去块状的残屑。
约5×106个～10×106个粘膜淋巴细胞和约107个脾脏细胞分别由各小鼠得到。
＜ELISPOT分析＞
将肠粘膜淋巴细胞或脾脏细胞(5×106个细胞/mL)的悬浮液50μL在37℃与抗原呈递细胞共同温育24小时。关于50μL的脾脏细胞(5×106个细胞/mL)，用丝裂霉素进行处理之后，用PBS清洗3次。按照小鼠IFN-γ用ELISPOT试剂盒(MABTEC AB，瑞典)的制造商协议，在用抗小鼠IFN-γ抗体包被的96孔板(例如ELIIP板，Millipore株式会社，USA)上滴加在HPV16的E7蛋白质(序列号1)中作为CTL表位进行了报道的、由E7蛋白质的第49位至第57位的氨基酸序列构成的10μL的合成肽(1μg/mL)、分裂素(卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯40ng/mL+离子霉素4μg/mL)或仅培养基(对照)。对96孔板上的IFN-γ阳性的点数进行分析。此时，使用KS ELISPOT(Carl Zeiss vision公司，德国)的计算机完全辅助视频成像分析系统。
＜ELISA分析＞
将血清中的IgG及肠清洗液中的IgA使用针对小鼠IgG或小鼠IgA的ELISA定量试剂盒(Bethyl Laboratories公司，美国)进行定量。对HPV16的E7蛋白质特异的IgG和IgA的量，将附加有His标签的E7蛋白质作为抗原进行定量。方法按照制造商协议。
简而言之，通过将96孔板(例如免疫板，NUNC公司，丹麦)用100ng/孔His标签-E7(悬浮于50mM碳酸盐-碳酸氢盐pH9.6的包被缓冲液)在4℃下放置一夜而包被。其后，对进行了阻断处理的上述板，适用进行了2倍稀释的血清或肠清洗液。清洗后，作为2次抗体，在各孔中加入过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体或抗小鼠IgA抗体(分别稀释1：60，000倍、1：20，000倍)，在37℃下温育1小时。在清洗、显色处理后，测定450nm吸光度。将非免疫小鼠的血清及肠清洗液设为阴性对照。抗E7抗体效价作为抗E7IgG/总IgG或抗E7IgA/总IgA(相对值)表示。
＜细胞因子浓度的测定＞
就肠清洗液中的细胞因子浓度而言，将5只小鼠的肠清洗液进行合并，使用小鼠Th1/Th2ELISA Ready SET Go(注册商标)试剂盒(BD生物科学株式会社，美国)进行测定。作为Th1细胞表达的细胞因子，将IFN-γ用于测定，作为Th2细胞表达的细胞因子，将IL-4用于测定。关于各样品，至少重复3次相同的测定。
＜统计分析＞
用平均值±标准偏差表示ELISPOT及ELISA的数据。这些值或相对值在免疫组(各组为5只小鼠)间进行比较。此时，进行双侧学生t-检验。p值＜0.05的情况下，看作有意义。
＜免疫组织学的分析＞
使用T-Select mouse MHC Tetramer(株式会社医学生物学研究所制)研究经口给药LacE7的小鼠中的E7蛋白质特异的细胞毒性T细胞(E7特异的CTL)的诱导及其组织内浸润。按照制造商协议，将MCH及E7肽复合体进行生物素化，利用藻红蛋白标记化链霉亲和素将其进行四聚体(テトラマー)化，由此制作E7特异的MHC四聚体。作为E7肽，使用在HPV16的E7蛋白质(序列号1)中作为CTL表位进行了报道的、由E7蛋白质的第49位至第57位的氨基酸序列构成的合成肽(1μg/mL)。
如上所述，由经口给药LacE7的小鼠制作肠道上皮的切片，进行使用上述E7特异的MHC四聚体的E7肽识别MHC的检测，或使用上述E7特异的MHC四聚体及抗CD8抗体的二重染色。具体而言，将上述肠道上皮的切片试样使用含有0.1质量％Triton-X100的PBS渗透处理30分钟后，冲洗试样，用含有5质量％脱脂乳的PBS浸透30分钟。将它们与上述E7特异的MHC四聚体(稀释率1：25)及根据情况以1：50稀释的抗CD8抗体(Rat Anti-Mouse CD8a/Lyt-2FITC(Clone53-6.7)、Beckman Coulter，Inc.)一起在4℃下温育一夜。对于各工序，将上述E7特异的MHC四聚体及抗体用含有1质量％脱脂乳及0.1质量％TritonX100的PBS进行稀释。用DAPI(4’,6-Diamidine-2-phenylindoledihydrochloride，Roche)将核染色之后，将切片置于PBS/甘油(1/1)中，利用荧光显微镜(LSM700，Zeiss)进行观察。
＜E7特异的1型T细胞应答中的中药的佐剂效果＞
在通过HPV的E6蛋白质和E7蛋白质的表达而永生化的细胞的清除中，产生IFN-γ的CD4+辅助T细胞和识别HPV的E7蛋白质的CD8+CTL的、E7特异的T细胞应答(以下，称为“1型T细胞应答”)为必需的。
因此，为了研究针对E7特异的上述1型T细胞应答的LacE7疫苗和中药的经口给药的影响，通过ELISPOT分析，研究粘膜淋巴细胞及脾脏细胞中的IFN-γ产生细胞的数(图1)。
对各组5只小鼠经口给药LacE7单独、或LacE7和JTT或HET。在从最后的免疫1周后，获取肠道粘膜淋巴细胞及脾脏细胞，研究上述JTT和上述HET对粘膜及全身性免疫的的效果。
HPV16的E7的第49位～第57位的氨基酸残基部分作为由C57BL/6小鼠的CD4+及CD8+T细胞识别的E7-CTL表位是已知的。因此，在针对上述HPV16的上述E7蛋白质的上述1型T细胞应答的ELISPOT分析中，使用由相当于上述E7-CTL表位部位的氨基酸序列构成的合成肽。
与不进行免疫的小鼠相比，在用LacE7免疫的小鼠中，在粘膜淋巴细胞和脾脏这两者中，E7特异的IFN-γ产生细胞的数增加。与脾脏相比，利用LacE7的经口免疫在粘膜淋巴细胞中更显著(大约1.5倍～2倍)，使E7特异的IFN-γ产生细胞的水平上升。
更令人吃惊地，通过将上述LacE7与上述JTT或上述HET同时给药，脾脏中的E7特异的1型T细胞应答显著地上升(图1)。
关于上述JTT和上述HET，通过作为预防疫苗佐剂使用，暗示使体液免疫增强的效果。
但是，至今未知上述JTT和上述HET使全身性的细胞性免疫增强，这为本发明人等的新的发现。
另一方面，关于粘膜中的1型T细胞应答，没有观察到上述JTT或上述HET的、与LacE7的同时经口给药引起的显著的效果(图1)。
＜中药及LBT多肽对粘膜免疫反应的佐剂效果＞
为了将针对E7蛋白质的粘膜细胞的免疫应答性最适化，认为除上述JTT或上述HET以外，需要研究使用佐剂。
因此，将LTB多肽在LacE7经口给药期间中与上述JTT或上述HET同时给药。
与LacE7单独给药相比，通过LacE7和LTB多肽的同时给药，小鼠中的E7特异的1型T细胞应答的水平在粘膜淋巴细胞及脾脏中上升1.5倍～2倍(图2)。将JTT或HET与上述LacE7及上述LTB多肽同时给药时，与上述LacE7和上述LTB多肽的同时给药相比，全身性的1型T细胞应答水平上升。其效果在HET中特别显著。
进一步，如期待的那样，与LacE7和LTB的同时给药相比，粘膜中的1型T细胞应答也通过追加同时给药JTT或HET而上升2倍～2.5倍(图2)。
即，得知：通过JTT及HET与LTB同时给药，使经口疫苗的全身性及粘膜中的1型T细胞应答显著地上升。
＜中药佐剂的针对E7的体液免疫应答的增强效果＞
接着，研究了接受LacE7的经口给药的小鼠中同时给药中药、LTB、或其两者对针对HPV16的E7的体液免疫应答的影响(图3A、图3B)。对各组5只小鼠经口给药LacE7单独、或LacE7和JTT或HET，关于在从最后的免疫1周后获取肠道粘膜淋巴细胞及脾脏细胞的上述小鼠，最终在免疫后第1周也获取血液及肠清洗液。关于上述LacE7的经口给药引起的全身性及粘膜中的体液免疫，用夹心ELISA研究了血清中的抗E7IgG抗体及肠清洗液中的抗E7IgA抗体的量(图3A、图3B)。为了避免取样中的偏差，抗E7抗体效价用相对于样品中的总IgG及总IgA量的相对值表示。
相对于总IgG或总IgA量的抗E7抗体的量比(抗E7IgG/总IgG、抗E7IgA/总IgA)分别表示针对E7蛋白质的全身性及粘膜中的体液免疫应答。将没有用LacE7免疫的小鼠的上述量比设为1，用相对于其的比表示。
在单独经口给药LacE7的小鼠中，血清中的抗E7IgG抗体效价上升7倍以上。在将LTB与LacE7同时给药的情况下，LBT对上述抗E7IgG抗体效价几乎不产生影响。
与此相对，在与LacE7及LTB同时给药HET的小鼠中，与LacE7单独以及LacE7和LTB同时给药的小鼠相比，血清中的抗E7IgG的抗体效价上升2倍。
另一方面，即使将JTT与LacE7、LTB同时给药，也对抗E7IgG的抗体效价几乎没有影响(图3A)。
关于肠清洗液中的抗E7IgA，也在HET与LacE7和LTB同时给药的情况下，观察到显著的抗体效价的上升(图3B)。
这些结果强烈地暗示：HET和LBT协同使经口疫苗引起的全身性及粘膜中的体液免疫提高。
＜中医佐剂对LacE7引起的粘膜中的细胞因子产生的影响＞
研究了将中药与LacE7同时经口给药引起的、促进粘膜组织中的1型T细胞应答的细胞因子及促进Th2细胞引起的细胞应答(以下称为“2型T细胞应答”)的细胞因子的产生。
将由经口给药LacE7的小鼠得到的肠清洗液中的IFN-γ和IL-4的水平分别作为上述1型T细胞应答及上述2型T细胞应答的指标。
与没有免疫的小鼠相比，在用LacE7免疫的小鼠中，肠清洗液中的上述IFN-γ和上述IL-4两者的量显著地上升。在同时给药LacE7和JTT的情况下，IFN-γ、IL-4两者的量上升3倍。另一方面，在同时给药上述LacE7和上述HET或上述LTB的情况下，没有看到与仅单独给药上述LacE7的情况显著的差异。
在同时给药LTB加上LacE7和JTT或HET的情况下，IFN-γ的量上升至6倍～8倍，IL-4的量上升至3倍～4倍(图4A、图4B)。
即，得知：以细胞因子产生为指标的情况下，在经口疫苗引起的粘膜中的1型细胞应答中，JTT比HET具有更强的效果；通过将LTB一起使用，JTT和HET的效果进一步提高；以及1型T细胞应答和2型T细胞应答两者显示相同的倾向。
另外，在脾脏中，1型T细胞应答及2型T细胞应答分别诱导细胞性免疫及体液免疫，与其不同，在JTT、HET的粘膜中的细胞性免疫及体液免疫的诱导效果与1型T细胞应答及2型T细胞应答之间没有看到显著的相互相关性。
这暗示：在粘膜中，不仅Th1和Th2，而且Th17等其它T细胞也可能参与细胞性免疫及体液免疫的诱导。
＜中药及合成神经酰胺对粘膜免疫反应的佐剂效果＞
研究了在与E7蛋白质、中药和粘膜佐剂的同时给药中，在使用作为临床上可使用的粘膜佐剂的αGalCer的情况下，是否也观察到粘膜中的1型T细胞应答的上升。
因此，取代LTB多肽，将αGalCer在LacE7经口给药期间中与上述JTT同时给药，通过ELISPOT分析研究E7特异的1型T细胞应答的水平。
如在图2中也观察到的那样，小鼠的粘膜淋巴细胞中的E7特异的1型T细胞应答的水平与LacE7单独给药相比，通过LacE7和LTB多肽的同时给药而上升，进一步将HET与上述LacE7及上述LTB多肽同时给药时，与上述LacE7和上述LTB多肽的同时给药相比，观察到上升的倾向(图5)。
得知：在E7蛋白质、中药和粘膜佐剂的同时给药中，在使用αGalCer代替HET作为粘膜佐剂的情况下，也与使用HET的情况相同程度或在其以上，使小鼠的粘膜淋巴细胞中的E7特异的1型T细胞应答的水平显著地上升(图5)。注意，仅LacE7和αGalCer的同时给药为与LacE7同等的应答(数据没有显示)。
即，得知：通过αGalCer与LTB同时给药，使经口疫苗引起的粘膜中的1型T细胞应答显著地上升。
＜LacE7引起的E7特异的CTL的诱导及组织内浸润＞
在经口给药LacE7的小鼠的粘膜组织中，通过免疫组织学分析研究诱导E7蛋白质特异的细胞毒性T细胞(E7特异的CTL)。其结果，在作为粘膜组织的肠道上皮的粘膜面及粘膜固有层中，检测到E7肽特异的MHC。因此，可看到E7特异的CTL的诱导，进一步得知E7特异的CTL浸润于粘膜组织内。
该结果显示：LacE7的经口给药诱导E7特异的粘膜免疫。
由以上的结果看，含有十全大补汤及补中益气汤的任一种的LacE7疫苗，可以充分期待不仅对CIN3患者，而且对子宫颈癌患者，进一步其它HPV相关癌的患者及上述HPV相关癌的癌前病变患者也具有治疗效果的可能性。
进一步含有适当的免疫佐剂的、含有十全大补汤及补中益气汤的任一种的LacE7疫苗可以期待具有更优异的治疗效果。
工业上的可利用性
本发明的粘膜免疫刺激剂适于通过与HPV疫苗等病毒疫苗及细菌疫苗并用而刺激粘膜免疫。
本发明的HPV感染症治疗用经口药物组合物通过给药于HPV感染症的患者，适于作为其治疗用疫苗使用。
作为本发明的方式，例如如下所述。
＜1＞一种粘膜免疫刺激剂，其特征在于，含有具有滋养强壮作用的中药和粘膜佐剂。
＜2＞如上述＜1＞所述的粘膜免疫刺激剂，其中，具有滋养强壮作用的中药为十全大补汤及补中益气汤的至少任一种。
＜3＞如上述＜1＞～＜2＞中任一项所述的粘膜免疫刺激剂，其中，粘膜佐剂为选自由来自霍乱毒素(CT)、大肠菌易热性毒素(LT)、Vero毒素(VT)、白喉毒素(DT)及百日咳毒素(PT)的野生型多肽或变异型多肽构成的组中的多肽以及合成神经酰胺(αGalCer)之中的至少1种。
＜4＞如上述＜3＞所述的粘膜免疫刺激剂，其中，粘膜佐剂为LT的B亚单元(LTB)多肽及合成神经酰胺(αGalCer)的任一种。
＜5＞如上述＜1＞～＜4＞中任一项所述的粘膜免疫刺激剂，其在经口给药的情况下，在患者的粘膜中，刺激对其前后或同时经口给药的抗原特异的细胞性免疫。
＜6＞如上述＜5＞所述的粘膜免疫刺激剂，其中，抗原为来自人乳头瘤病毒(HPV)的多肽。
＜7＞如上述＜6＞所述的粘膜免疫刺激剂，其中，来自HPV的多肽具有缺失、置换或添加1至数个氨基酸的变异。
＜8＞如上述＜6＞～＜7＞中任一项所述的粘膜免疫刺激剂，其中，来自HPV的多肽含有在使表达来自HPV的多肽的干酪乳杆菌的重组体死菌化的粉体中或添加于使干酪乳杆菌死菌化的粉体中。
＜9＞如上述＜6＞～＜8＞中任一项所述的粘膜免疫刺激剂，其中，来自HPV的多肽为HPV的E7多肽。
＜10＞如上述＜9＞所述的粘膜免疫刺激剂，其中，HPV的E7多肽来自HPV16。
＜11＞如上述＜10＞所述的粘膜免疫刺激剂，其中，HPV的E7多肽由序列号2所示的氨基酸序列构成。
＜12＞一种HPV感染症治疗用经口药物组合物，其特征在于，含有HPV的E7多肽和具有滋养强壮作用的中药。
＜13＞如上述＜12＞所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，具有滋养强壮作用的中药为十全大补汤及补中益气汤的至少任一种。
＜14＞如上述＜12＞～＜13＞中任一项所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其进一步含有粘膜佐剂。
＜15＞如上述＜12＞～＜14＞中任一项所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，HPV的E7多肽来自HPV16。
＜16＞如上述＜12＞～＜15＞中任一项所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，HPV的E7多肽具有缺失、置换或添加1至数个氨基酸的变异。
＜17＞如上述＜16＞所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，HPV的E7多肽由序列号2所示的氨基酸序列构成。
＜18＞如上述＜12＞～＜17＞中任一项所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，HPV的E7多肽含有在使表达HPV的E7多肽的干酪乳杆菌的重组体死菌化的粉体中或添加于使干酪乳杆菌死菌化的粉体中。
＜19＞如上述＜12＞～＜18＞中任一项所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其在患者的粘膜中，刺激HPV的E7多肽特异的细胞性免疫。
＜20＞如上述＜19＞所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，患者为子宫颈癌癌前病变患者及子宫颈癌患者的任一种。
＜21＞如上述＜14＞～＜20＞中任一项所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，粘膜佐剂为选自由来自CT、LT、VT、DT、及PT的野生型多肽或变异型多肽构成的组中的多肽以及合成神经酰胺(αGalCer)之中的至少1种。
＜22＞如上述＜21＞所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，粘膜佐剂为LTB多肽及合成神经酰胺(αGalCer)的任一种。

Claims (8)

1.一种粘膜免疫刺激剂，其特征在于，其在患者的粘膜中刺激人乳头瘤病毒(HPV)16E7多肽特异的细胞性免疫，其含有
HPV16 E7多肽；
具有滋养强壮作用的中药；和
粘膜佐剂，
其中所述具有滋养强壮作用的中药为十全大补汤及补中益气汤的至少任一种，
其中所述粘膜佐剂是来自大肠菌易热性毒素的B亚单元(LTB)的多肽或αGalCer，并且
其中所述HPV16 E7多肽包含在使表达HPV16 E7多肽的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的重组体死菌化的粉体中或添加于使干酪乳杆菌死菌化的粉体中。
2.根据权利要求1所述的粘膜免疫刺激剂，其中，所述具有滋养强壮作用的中药为十全大补汤。
3.根据权利要求1所述的粘膜免疫刺激剂，其在经口给药的情况下，在患者的粘膜中，刺激对其前后或同时经口给药的所述HPV16 E7多肽特异的细胞性免疫。
4.根据权利要求1所述的粘膜免疫刺激剂，其中，HPV16 E7多肽由序列号2所示的氨基酸序列构成。
5.一种HPV感染症治疗用经口药物组合物，其特征在于，其在患者的粘膜中刺激HPV16E7多肽特异的细胞性免疫，其含有
所述HPV16 E7多肽；
具有滋养强壮作用的中药；和
粘膜佐剂，
其中所述具有滋养强壮作用的中药为十全大补汤及补中益气汤的至少任一种，
其中所述粘膜佐剂是来自大肠菌易热性毒素的B亚单元(LTB)的多肽或αGalCer，并且
其中所述HPV16 E7多肽包含在使表达HPV16 E7多肽的干酪乳杆菌的重组体死菌化的粉体中或添加于使干酪乳杆菌死菌化的粉体中。
6.根据权利要求5所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，具有滋养强壮作用的中药为十全大补汤。
7.根据权利要求5所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，HPV16 E7多肽由序列号2所示的氨基酸序列构成。
8.根据权利要求5所述的HPV感染症治疗用经口药物组合物，其中，患者为子宫颈癌癌前病变患者及子宫颈癌患者的任一种。
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