JP2011037902A - パピローマウイルス感染の治療方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】PV L1 VLPおよびPV L1/L2 VLPから成る群より選択されるウイルス様粒子(VLP)を含み、パピローマウイルス(PV)Eタンパク質を含まない、現存するPV感染の治療方法および治療用ワクチン。
【選択図】なし
Description
いかなる便利な投与経路を採用してもよいが、腸管外投与、特に筋内投与が好ましい。
(1)PV L1 VLPsおよびPV L1/L2 VLPsから成る群より選択されたPV VLPsを、PV感染に罹患している患者に投与する工程から成る、現存するパピローマウイルス(PV)感染の治療方法。
(2)PV感染が上皮病変の存在によって特徴付けられる(1)に記載の治療方法。
(3)上皮病変が、皮膚および粘膜表面の手掌いぼ、足底いぼ、肛門性器いぼ、および扁平いぼ、CIN、ウマ類肉腫ならびに複製型または増殖型PV感染から成る群より選択される(2)に記載の治療方法。
(4)PV感染が、HPV6,11,34,39,41〜44および51〜55に起因する性器いぼである(3)に記載の治療方法。
(5)性器いぼがHPV6およびHPV11に起因するものである(4)に記載の治療方法。
(6)VLPsを、PVL1遺伝子を適当なベクターにいれてクローニングし、前記ベクターにより形質導入された真核細胞内でL1に対する高次構造的な対応コーディング配列を発現することにより生産する(1)(5)のいずれかに記載の治療方法。
(7)VLPsを、PVL1およびL2遺伝子を適当なベクターに入れてクローニングし、ベクターにより形質導入された真核細胞内でL1およびL2に対する高次構造的な対応コーディング配列を発現することにより生産する(1)〜(5)のいずれかに記載の治療方法。
(8)L1遺伝子またはL1とL2遺伝子をフランキング配列を有する発現ベクターに挿入して遺伝子構成物を形成し、結果として得られる組換えDNAを野生型バキュロウイルスDNAと共に許容的株化細胞中に同時導入する(6)または(7)に記載の方法。
(9)株化細胞がSf9昆虫細胞であり、発現ベクターがバキュロウイルス発現ベクターである請求項6または7に記載の方法。
(10)株化細胞が、原核細胞の株化細胞である請求項8に記載の方法。
(11)患者に投与するPV VLPs濃度が0.5〜20μgである(1)〜(10)のいずれかに記載の治療方法。
(12)前記濃度が1〜10μgである(11)に記載の方法。
(13)VLPsがアジュバントを除くものである(1)に記載の治療方法。
(13)PV VLPsの投与量が、8〜16週間の期間にわたり3〜6回である(11)または(12)に記載の治療方法。
(14)PV VLPsの投与量が、2〜4週間の期間にわたり3〜6回である(11)に記載の治療方法。
(15)患者へのHPV6 VLPsの投与によるHPV11感染に対する免疫化方法。
(16)HPV6b VLPsが患者に投与される請求項15に記載の方法。
(17)HPV6 VLPsの濃度が0.5〜20μgである(15)または(16)に記載の方法。
(18)HPV6 VLPsの濃度が1〜10μgである(17)に記載の方法。
(19)HPV6 VLPsの投与量が、8〜16週間の期間にわたり3〜6回である(17)または(18)に記載の方法。
(20)HPV6 VLPsの投与量が、2〜4週間の期間にわたり3〜6回である(17)または(18)に記載の方法。
(21)患者へのHPV11 VLPsの投与によるHPV6感染に対する免疫化方法。
(22)HPV11 VLPsの濃度が0.5〜20μgである(21)に記載の免疫化方法。
(23)HPV11 VLPsの濃度が1〜10μgである(22)に記載の免疫化方法。
(24)HPV11 VLPsの投与量が、8〜16週間の期間にわたり3〜6回である(22)または(23)に記載の免疫化方法。
(25)HPV11 VLPsの投与量が、2〜4週間の期間にわたり3〜6回である(22)または(23)に記載の免疫化方法。
(26)PV感染に罹患している患者に、アジュバントなしでPV VLPsを投与する工程から成る現存するPV感染の治療方法。
(27)PV VLPsがキメラである(27)に記載の治療方法。
(28)PV VLPsがEタンパク質から成る(26)に記載の治療方法。
(29)PV VLPsがアジュバントを含む(1)に記載の治療方法。
(30)アジュバントが細胞性応答を誘導するアジュバントである(29)に記載の治療方法。
(31)アジュバントが、
i)リピドAとその誘導体、
ii)キラヤサポニンとその誘導体、
iii)ミコバクテリアとその構成要素または誘導体、および
iv)IL12、GMCSF、他のTh1誘導サイトカイン、ならびに
v)酸化マンナンとその類似体
から成る群より選択される(30)に記載の治療方法。
患者
承諾している被験者(すなわち全部で36人)を、本臨床試験のために募集した。このような被験者は健康であり、性器いぼを有していた。被験者はまた16歳から55歳であり、少なくとも1つの目に見える外陰部のいぼを有していた。被験者は免疫処置前4週間いぼを治療せず、免疫療法の間、他の治療を差し控えることに同意した。性器いぼ疾患の期間と前治療歴を記録したが、疾患の期間と、前局所治療の種類ついて患者らの中であいまいな点があったために、参加適性を決定する要因として使用しなかった。この4週間のうちに、いぼを治療したことがある場合、医療管理を受けている全身性疾患を有している場合、治療を必要とする他の活動性性交渉感染症があった場合、または治療を必要とする子宮頚部形成異常がPAPスメア上で検出された場合に、患者を除外した。内部の性器いぼは参加に対する禁忌ではなかった。PCRによるHPVタイピングのために、募集時に代表的ないぼの生検材料を採取した。いぼはすべて、PCRによりHPV6b/11陽性であった。本試験時でのセンチネル研究において5症例のHIV感染しか検出されなかったので、本試験ではHIV−1試験を日常的に行わなかった。最初のいぼ提示と、適当な患者への初回ワクチン投与の間の平均期間は1週間であった。年齢が患者らと一致し、性器いぼの病歴がない関係する研究所スタッフからも、HPV VLP抗体研究用の血液を入手した。
VLPを、好適な実験実施条件下で、キ(Qi)ら,1996年,Virology 216 35−45に以前に記載されたHPV6bL1組換えバキュロウイルス(L1rBV)を用いて生成した。SF900−II培地(Sigma)中のSF9細胞培養物に、MOI10でL1rBVを感染させた。48時間後、培養物を回収し、細胞ペレットをプールし、イムノブロットによりL1について、電子顕微鏡によりVLPについてアッセイし、さらに使用するまで−80℃で凍結した。融解した細胞ペレットを、不連続ショ糖勾配遠心分離および連続塩化セシウム勾配遠心分離によりさらに精製し、キら,1996年,前掲およびパークス(Park)ら,1993年,J.Viol.Methods 45 303−318に以前に記載されたようにVLP含有量についてアッセイした。次いで、ゲル分析によりHPV6bL1が80%を超え、EMにおいて実質的に完全なウイルス粒子(VLP)を含んでいた密度1.26〜1.30g/cm3の材料を、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝化0.9%NaCl(PBS)に対して徹底的に透析し、50μgタンパク質/100μlでガラスバイアルにアリコートした。これらのバイアルの10%の無作為標本を、無菌性、発熱性、およびウサギにおける異常毒性についての試験にかけた。材料は無菌であり、発熱物質陰性であり、毒性は観察されなかった。本試験の終わりに、生成物安定性を確認するために、細胞溶解物プールを調製した1年後に、バイアルをイムノブロットおよび電子顕微鏡によりVLP含有量について調べた。
被験者を2週間毎に調べ、いぼを診察ごとに検査し、通常、いぼの写真を撮影した。膣および子宮頸を可視化するコルポスコピーを診察ごとに行った。0、4、および8週目に、患者らを、アジュバントを用いずにHPV VLP(1、5、または10μg)で筋肉内に免疫した。最初、用量の割り当ては連続的であり、最初の5人の患者には1μgを与え、次の5人には5μgを与え、次の5人には10μgを与えた。その後、10μg、5μg、または1μgを交替に与えるように、患者らを割り当てた。いぼが12週目までに消えていなかったら、さらなるVLP免疫処置を12週目に行い、いぼが消えなかったら、さらなるVLP免疫処置を16週目および20週目に行った。4人の被験者(2×5μg;2×10μg)が4回の免疫処置を受け、2人の被験者(1×5μg;1×10μg)が5回の免疫処置を受け、6人の被験者(1×1μg;2×5μg;3×10μg)が6回の免疫処置を受けた。最初に1μgを与え、その用量で10週目までに消散もVLPに対するDTHも発現しなかった1人の患者に、さらに3回の10μgのワクチン接種を行い、この患者のデータを10μg処置群と共に分析した。その他の場合は、与えた追加免疫処置は、最初に与えたものと同じVLP用量の免疫処置あった。有効な被験者(n=34)を20週目での結果について評価し、被験者が少なくとも3回の免疫処置を受け、この時点で診察された場合に評価可能として分類した。
10μgのVLPを与えた5人の患者のコホートを、初回免疫処置の前に、ならびに初回免疫処置後3日、1、2、4、8、12週目に、通常の血液学(FBE、白血球分画)試験と生化学(AST、ALT、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、総タンパク質量、アルブミン、グロブリン、グルコース、尿素、クレアチニン、尿酸)試験について試験した。被験者からの試料を、12チャンネル自動化学分析装置(Beckman CX4)および6チャンネルCoulter血液学(Coulter T−540)分析装置により試験した。
試験開始前と試験を通して2週間ごとに、ELISAによるVLP特異的抗体アッセイのために血清を収集した。ELISAプレート(Flow Laboratories)を、PBSに溶解したHPV6b、HPV11、またはHPV16 VLP(10μg/ml)でコーティングし、一晩静置し、脱脂粉乳でブロックした。試験血清および対照血清を1:100希釈で添加し、結合を、HRP結合抗ヒトIgG(Sigma)またはHRP結合抗ヒトIgG,A,M(Silenius)により検出した。その都度、各血清と脱脂粉乳との平均反応性(0.001〜0.113の範囲(平均0.032))を引いた。比較のために、血清の完全セットを一回のアッセイで試験し、その血清セットの3回独立したアッセイを行い、非常に相関する結果を収めた(r2>0.95)。
VLPワクチン材料を、DTH試験用の抗原として使用した。DTH試験を、最初3回の免疫処置後に32人の被験者に対して行い、抗体試験プロトコールは10〜12週目に完了した。20μl(10μg)のVLP懸濁液を、前腕の掌側で皮内に送達した。48時間で、生検材料を、0(硬化なし)、1(1〜3mmの硬化(duration)),2(4〜10mmの硬化)、および3(>10の硬化)として目視によりスコア付けした。28人の被験者に対して、DTH部位の生検を、1%リグノカイン局所麻酔下での3mmパンチ生検を用いて行った。生検材料を、中性緩衝化ホルマリンで固定し、Pettitら,1997,J.Immunol.159 3681−3691に以前に記載されたように、通常のH+E切片用および免疫組織化学用に処理した。
中性緩衝化ホルマリンで固定し、通常どおりに処理し、パラフィンに包埋した生検材料の切片を脱パラフィンし、10mM EDTA、pH7.5緩衝液を用いて高温抗原回復(antigen retrieval)(121℃,10分)にかけた。CD1a/HLA−DR、CD1a/CD68、CD3/CD68、CD3/CD8、CD68/HLA−DR、CD3/HLA−DR、およびCD3/CD20の組み合わせによる二重免疫染色を行った。TBS(pH7.6)に溶解した10%ブタ血清/10%FBSによる1時間のブロッキングの後、切片を、ウェットチャンバー内において室温で60分間、一次抗体:マウス抗ヒトCD1a(Immunotech−Coulter,クローンBL−6,前希釈)、ウサギ抗ヒトCD3(1:250)、ならびにすべて1:50に希釈したマウス抗ヒトCD8(クローンC8/144B)、CD68(クローンPG−M1)、HLA−DR(クローンTAL−1B5)、およびCD20(クローンL26)(DAKO,Denmark)とインキュベートした。切片を、ビオチン化ウサギ抗マウス二次抗体またはビオチン化ブタ抗ウサギ(1:200)二次抗体と、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ(DAKO,Denmark)(1:300)で処理した。二重免疫染色のために、切片を、第2の一次抗体の後に、その対応する第2のビオチン化二次抗体でさらに処理した。ストレプトアビジンABC/アルカリホスファターゼ結合体(DAKO,Denmark)を使用して、第2の抗体を標識した。その後に、DAB(茶)およびファストレッド(赤)を使用する基質色原体キット(DAKO,Denmark)で発色させることにより、第1および第2の抗体が証明された。切片を、マイヤーヘマトキシリンを用いて対比染色した。
一変量解析および多変量解析を、Statistica Version5.0(Statsoft,Ok.,U.S.A)を用いて行った。
結果
ワクチン接種および有害反応
前記のように、36人の被験者を本試験に募集した。34人の被験者が、3回以上、1、5、または10μgのHPV6bL1 VLPで免疫処置され、20週目での評価(表1)にも参加した。被験者の大多数は2ヶ月以上いぼを有し(表2)、以前に少なくとも1回、いぼを焼灼器で治療したことがあった。注射に関連する直後の不快感を超える局所有害反応も損傷性全身有害反応も観察されず、免疫処置後に(評価可能またはその他の)被験者により報告もされなかった。生化学的分析および血液学的分析はすべて、各診察時に局所参考範囲内であり、経時的に変化する傾向はなかった。治癒しているいぼを有する患者では、治癒しているいぼにおける特定の局所反応は観察も報告もされず、免疫された被験者では、性器いぼの自発的治癒について一般に記載されるように、いぼは局所炎症なく治癒するように見えた。3回以上免疫され、20週目の追跡診察に参加した33人の被験者を、ワクチンに対する免疫応答および結果について評価可能であるとみなした。
VLP特異的DTHを、第2または第3の免疫処置後、様々な時間での単回VLP皮内注射を用いて測定した。主に、DTH皮膚試験の免疫効果を避けるために、免疫処置を開始する前にDTHを試験しなかった。VLP用量または免疫処置後の時間にかかわらず、患者の大多数に2+から3+の臨床DTH応答があり、全患者に、いくらかの目に見える応答があった。28人の被験者に対して、DTH反応物の生検を3mmパンチ生検を用いて行い、組織分析にかけた(5個の生検材料に対する詳細な免疫組織化学的評価を含む)。リンパ球および単球の浸潤を含む代表的なDTH反応が血管周囲および皮下に観察された(図1A、1B)。このように評価された5個の生検材料の浸潤物は、CD1a+veランゲルハンス細胞、CD4およびCD8+ve T細胞、ならびにDR+veマクロファージを含んでいた。血管周囲および皮下の炎症浸潤物の程度、関与する血管の数、ならびに非リンパ炎症細胞(好酸球を含む)の存在に従ってDTH反応を組織学的に評価するために、5ポイントスケールを使用した。生検材料の大多数は高いスコアを付け、DTHスコアは、VLPの用量または免疫処置の数と独立していた。
免疫処置前に、HPV6bに対する有意な血清反応性(プールされた「正常」血清の平均から3S.D.を超えるOD反応性として定義された)が32人の試験被験者のうち9人で観察され、HPV16に対する反応性が2人の被験者で観察された(図2Aおよび2B)。対照に、HPV6bに対する血清反応性が38人の対照被験者のうち0人で測定可能であり、HPV16 VLPに対する抗体が38人の対照被験者のうち2人で観察された。免疫処置後のHPV6bに対する反応性が、試験被験者の1人だけを除く全員において増加した(図2D)。平均増加は、0.190ODユニット+/−S.D.0.110であった。20週目の、HPV6bL1 VLPとのVLP特異的反応性の増加は、1μg(0.085+/−0.022)用量を与えた被験者より、5μg(0.227+/−0.028)および10μg(0.220+/−0.035)のVLP用量を与えた被験者で高く、3回の免疫処置を受けた被験者(0.209+/−0.021,n=13)より、3回を超える免疫処置を受けた被験者(0.242+/−0.042,n=11)(5μgまたは10μgを与えた)において有意ではないが高かった。初回VLP免疫処置の2週間後、HPV6bL1 VLP特異的IgG抗体力価の最も大きな増加が、最初に弱くHPV6bL1に反応する血清を用いた被験者において観察された。このことは、これらの被験者が、既にHPV6bに対する初回刺激を受けていたことを示唆している(図2C)。HPV6bL1 VLPに対するIgG抗体の最終レベルが、VLP特異的抗体の初期レベルにより予測された(r2=0.53;p=0.005)。しかしながら、3回の免疫処置後に観察されたVLP反応性の増加は、初期VLP反応性と有意に相関しなかった(図2C)。血清を、他のHPVタイプのVLPとの反応性について試験した。32の血清において、免疫処置後のHPV16bL1 VLP反応性の増加は見られなかった(平均増加0.009+/−S.D.0.043)。HPV11L1 VLPに対する反応性について試験した(最初にHPV6bに反応したか、または免疫処置後にHPV6bに対する反応性を獲得した)11人の被験者のうち、10人が、HPV11L1 VLPに対する同様の大きさの反応性を獲得した(r2=0.75)(図2E)。
本試験の1つの目的は、VLPに基づく予防ワクチンの使用が、既存のHPV感染の経過に悪影響を及ぼすかを明らかにすることである。20週間にわたる本試験(図3A)での目に見えるいぼ疾患の完全治癒率は、33人の評価可能な患者のうち25人(76%)であり、結果データを、intention totreatにより分析した場合、36人の被験者のうち25人(69%)であった。20週で疾患が残っている評価可能な8人の被験者のうち5人に、実質的な部分治癒があった(>50%のいぼ除去)。9ヶ月までのさらなる追跡試験にわたって、完全に除去した被験者は疾患を再発せず、さらに2人の被験者では、1人は破壊治療後に、1人は自発的に完全な治癒があった。5μgおよび10μg用量のワクチンを与えた評価可能な被験者での、いぼの治癒は似ていたが(図3B)、1μgを与えた患者での治癒は、免疫処置後さらに早く起こった。
いぼ治癒と、VLP免疫処置に対する応答との相関を探した。既存のVLP特異的抗体のレベルまたは存在あるいはDTH反応の大きさと、いぼの最終的な結果または治癒までの時間とには相関がなかった(表3)。免疫処置後の抗体増加の大きさと結果には負の相関があった。これは、いぼを消散しなかった被験者をさらに免疫したが、与えたワクチン用量数が観察された抗体増加の大きさを予測しなかったので、臨床試験デザインを反映しているのかもしれない。
本研究では、76%のHPV6b VLP免疫化被験者において20週間にわたってHPV6b+ve性器いぼの退行を観察した。対照的に、公表されている性器いぼ治療試験のコントロール群における同じ期間にわたる性器いぼの退行率は0〜29%(図3A)の範囲である。従って、HPV6bL1 VLP投与は、HPV6b関連いぼの自然な治癒プロセスに悪影響を及ぼさないだけでなく、そのような治療が治癒を加速させ得るという良好な証拠もある。細胞炎症性浸潤物、特に、コールマン(Coleman)ら、1994、Am.J.Clin.Pathol.102 768−774に記載されたIL−12分泌T細胞の存在は、性器いぼの治癒プロセスと関連し、細胞性免疫の欠如が退行の不足と関連する。この観察は、他のウイルス感染に関するかぎりでの、いぼの退行における細胞性免疫の重要な役割を示唆している。いぼにはL1を含むPVウイルスキャプシドタンパク質が発現している。検知可能なL1タンパク質はいぼの表皮のうちのより表面側の層に限定されてはいるが、おそらくサコロウスキー(Sakolowski)ら、1998、721504−1515に記載されているようにmRNAが不安定である結果として、検知できないほどに少量のL1を発現している細胞でもデュ ブルイン(De Bruijn)ら,1998,Virology 250 371−376に記載のL1特異的T細胞媒介性溶解を受ける。従って、いぼの深い層の細胞に発現しているL1の量が少量であっても、複製型のHPV感染したいぼの基底付近のケラチン生成細胞をT細胞媒介性溶解に感作するのに十分である。アジュバントを伴わない動物へのVLPsの投与により、ペンら,1998年,前掲、およびグリーンストーンら,1998年,前掲に記載されているように、VLPs特異的細胞毒T細胞が誘導される。VLP免疫治療は、ヒトいぼの持続を許容する複製型のHPV感染した基底付近のケラチン生成細胞を溶解させる、PVタンパク質特異的CTLを誘導することにより、性器いぼの結果を変化させ得る。
本発明の別の実施形態において、PV感染に罹患している患者にPV VLPsを投与する工程から成る現存するPV感染の治療方法が与えられる。そのようなVLPsには、タンパク質E成分を含むキメラVLPsが含まれ得る。
Claims (15)
- 現存するヒトパピローマウイルス(HPV)感染を治療するための治療用ワクチンであって、PV L1 VLPおよびPV L1/L2 VLPから成る群より選択されるウイルス様粒子(VLP)を含み、パピローマウイルス(PV)Eタンパク質を含まない、前記ワクチン。
- PV感染が上皮病変の存在によって特徴付けられる、請求項1記載の治療用ワクチン。
- 上皮病変が、皮膚および粘膜表面の手掌いぼ、足底いぼ、肛門性器いぼ、および扁平いぼ、CIN、ウマ類肉腫ならびに複製型または増殖型PV感染から成る群より選択される、請求項2に記載の治療用ワクチン。
- PV感染が、HPV6,11,34,39,41〜44または51〜55に起因する性器いぼである、請求項3に記載の治療用ワクチン。
- 性器いぼがHPV6またはHPV11に起因するものである、請求項4に記載の治療用ワクチン。
- VLPが、PVL1遺伝子を適当なベクターにクローニングし、前記ベクターにより形質導入された細胞内でL1遺伝子を発現することにより生産されたものである、請求項1に記載の治療用ワクチン。
- VLPが、PV L1およびL2遺伝子を適当なベクターにクローニングし、前記ベクターにより形質導入された細胞内でL1およびL2遺伝子を発現することにより生産されたものである、請求項1に記載の治療用ワクチン。
- L1遺伝子またはL1遺伝子とL2遺伝子とをフランキング配列を有する発現ベクターに挿入して遺伝子構成物が形成され、得られる組換えDNAが野生型バキュロウイルスDNAと共に許容株化細胞に同時導入される、請求項6または7に記載の治療用ワクチン。
- 株化細胞がSf9昆虫細胞であり、発現ベクターがバキュロウイルス発現ベクターである請求項8に記載の治療用ワクチン。
- 株化細胞が、原核細胞株である請求項9に記載の治療用ワクチン。
- 一投与量として0.5〜20μgのPV VLPを含む請求項1記載の治療用ワクチン。
- 一投与量として1〜10μgのPV VLPを含む請求項11記載の治療用ワクチン。
- アジュバントを含まない、請求項1に記載の治療用ワクチン。
- 8〜16週間の期間にわたり3〜6回投与するための、請求項1に記載の治療用ワクチン。
- 2〜4週間の期間にわたり3〜6回投与するための、請求項1に記載の治療用ワクチン。
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