DE69933891T2

DE69933891T2 - Behandlung von papillomavirus-infektionen

Info

Publication number: DE69933891T2
Application number: DE69933891T
Authority: DE
Inventors: Jian Zhou; Ctr. For Immunology & Cancer Res. Ian Buranda FRAZER
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-13
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2019-12-14
Also published as: KR100617485B1; CA2353866C; US20050244433A1; JP5274737B2; NZ512850A; EP1144005A4; JP2002532434A; EP1144005A1; JP2011037902A; AUPP765398A0; ATE344053T1; EP1144005B1; DK1144005T3; CA2353866A1; WO2000035478A1; ZA997638B; DE69933891D1; US7172870B2; US6867033B1; KR20010103711A

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung richtet sich auf die Behandlung von Infektionen mit Papillomaviren
Hintergrund der Erfindung
Die Infektion der anogenitalen Haut mit humanem Papillomavirus (HPV) führt zu exophytischen oder flachen Warzen und bei Infektion mit einigen dieser Genotypen gilt es als sicher, dass sie eine vorausgehende Ursache für anogenitalen Krebs sind. Derzeitige Behandlungsarten für Genitalwarzen sind im Allgemeinen zerstörend und schließen chirurgische Eingriffe, Ausbrennen, Laserchirurgie und ätzende Chemikalien ein, wie z.B. beschrieben in Beutner et al., 1997, Am. J. Med. 102 28-37. Es gibt eine große Fehlrate bei der Behandlung und eine hohe Rückfallrate der Erkrankung im Bereich von 30 bis 70 % nach zerstörender Behandlung von exophytischen Warzen wie in Barrasso, R., 1998, J. Obstet. Gynecol. 18 S70-S71, diskutiert. Warzen verbleiben länger und treten häufiger wieder auf in immunsupprimierten Patienten, wie in Bouwes et al., 1997, Clin. Dermatol. 15 427-437, beschrieben. Dies deutet auf eine Rolle des Immunsystems bei dem Rückgang (resolution) der Läsionen hin. Eine Rolle der lokalen Immunität wird weiterhin gestützt durch die teilweise therapeutische Wirksamkeit von Interferonen, wie beschrieben in Frazer, I.H. & McMillan, N.A., in Clinical Applications of the Interferons (eds. Stuart-Harris, R. & Penny, R.W.) 79-91 (Chapmann and Hall Medical, London, 1997) und der topischen Verabreichung des Immunverstärkers Imiquimod, wie in Beutner et al., 1998, Antimicrob. Agents Chemother. 42 789-794 beschrieben. Eine Immunprophylaxe gegenüber HPV-Infektion wird vorgeschlagen, wie in Hines et al., 1998, Curr. Opin. Infect. Dis. 11 57-61 und Hagensee, M.E., 1997, Infect. Med. 14 555-556, diskutiert, insbesondere aufgrund der Assoziation einiger Genotypen des Papillomavirus (PV) mit Krebs. Die Expression des PV-Capsid-Proteins L1 oder der L1- und L2-Proteine in eukaryotischen Expressionssystemen führte zu einem Zusammenfügen dieses Proteins zu virusartigen Papillomaviruspartikeln (VLPs), wie in Zhou et al., 1991, Virology 185 251-257, Kirnbauer et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 12180-12184 und Rose et al., 1993, J. Virol. 67 1936-1944, beschrieben, die morphologisch und immunologisch dem nativen Virus ähneln. Die Immunisierung mit rekombinanten VLPs der relevanten Typen führte zu einer wirksamen Prophylaxe gegenüber einer Provokation mit Rinder-, Hunde- und Waldkaninchen-Papillomavirus in vivo, wie in Breitburd et al., 1995, J. Virol. 69 3959-3963, Kirnbauer et al., 1996, Virology 219 37-44 und Suzich et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 11553-11557, beschrieben und der Schutz korreliert mit dem Antikörpertiter und kann durch Antikörper übertragen werden (Brietbund et al., 1995, supra).
Es kann weiterhin Bezug genommen werden auf das US-Patent Nr. 5437951, das deutlich macht, dass die Fähigkeit der PV VLPs, hohe Titer an neutralisierendem Antiserum zu induzieren, diese geeignet zur Prophylaxe gegen übertragbare Papillomatose macht, bereits bekannt ist. Beispiele für geeignete Personen, die in dieser Referenz genannt sind, sind (i) Hörnertiere, die gegenüber Papillomawarzen empfänglich sind, (ii) alle Menschen für nicht-genitale HPV-Infektionen und (iii) sexuell aktive Menschen für genitale HPV-Infektionen.
US-Patent Nr. 5437951 macht weiterhin deutlich, dass eine prophylaktische Vakzinierung für produzierende PV-Läsionen, die üblicherweise L1 und L2-Capsid-Protein exprimieren, nützlich sein kann. Solche Läsionen können in benignen Infektionen, wie Warzen als laryngeale Papillomatose auftreten. Diese Referenz etabliert weiterhin, dass eine protektive Immunität gegenüber sowohl benignen als auch malignen PV-Erkrankungen durch Verabreichung einer wirksamen Menge an rekombinantem L1-Capsid-Protein an einem Individuum, das ein Risiko für PV-Infektionen hat, induzieren kann. Ein das Capsid-Protein umfassendes Vakzin kann direkt entweder parenteral oder lokal gemäß herkömmlichen Immunisierungsprotokollen verabreicht werden.
Somit sind das US-Patent Nr. 5437951, genauso wie Kirnbauer et al., 1996, supra, Breitburd et al., 1995, supra and Suzich et al., 1995, supra Referenzen, die beispielhaft sind für eine große Zahl an Referenzen, die zeigen, dass es allgemein bekannt ist, dass PV VLPs enthaltende Vakzine zur Prophylaxe oder Prävention einer Infektion von Papillomawarzen, verwendet werden können.
Es kann weiterhin Bezug genommen werden auf Kirnbauer et al., 1996, supra, aus dem entnommen werden kann, dass eine Immunisierung mit BPV L1-L2 VLPs enthaltenden Vakzinen in inkompletten Freunds-Adjuvanz bei Kälbern mit etablierten Papillomen nicht so effizient war wie die Verwendung dieser Vakzine zur Prophylaxe.
In Greenstone et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 1800-1805, wird weiterhin angemerkt, dass während PV VLPs vielversprechende prophylaktische Vakzinkandidaten zur Verhinderung von HPV-Infektionen sind, sie wahrscheinlich keine therapeutischen Wirkungen aufzeigen, da die Virion-Capsid-Proteine nicht in proliferierenden Zellen von infizierten Epithel oder in cervikalen Karzinomen nachgewiesen wurden. In dieser Referenz wurde weiterhin gefunden, dass eine Injektion von chimerem HPV16L1/L2-HP16 E7 VLPs in Mäuse, diese Mäuse vor einer Tumorprovokation selbst in Abwesenheit eines Adjuvanz schützt. Allerdings waren HPV16L1/L2 VLPs in diesem Zusammenhang nicht wirksam, ein nicht unerwartetes Ergebnis, da der Tumor ein E7 tragender Tumor war.
Ein ähnliches Ergebnis wurde in Peng et al., 1998, Virology 240 140-157 gefunden, darin induzierten hybrid oder chimäre VLPs gebildet aus HPVL1, das weiterhin ein einzelnes HPV16 E7cytotoxisches T-Lymphocyt (CTL)-Epitop und ein einzelnes HIV gp 160 CTL Epitop eingebaut wurde, eine starke CTL-Antwort nach Immunisierung. Bezug wird weiterhin genommen auf die WO 98/28003, die über die Studien über die Entwicklung eines therapeutischen Vakzins zur Behandlung von Papillomavirus-Infektionen bei Waldkaninchen berichtet. Diese Daten unterstützen die Prämisse, dass E-Proteine die wesentliche Komponente eines wirksamen therapeutischen Vakzins sind.
Dieser Glaube in die Notwendigkeit für verschiedene E-Proteine zur Formulierung eines therapeutischen PV-Vakzins führte zu einer klinischen Untersuchung für ein HPV6-Genitalwarzentherapeutikum basierend auf L2E7 absorbiert an Alhydrogel (Thomson et al., (1999) für Phase 1 Sicherheit und Antigenizität von TA-GW, einen rekombinanten HPV5 L2E7-Vakzin zur Behandlung von Genitalwarzen (Vaccine 17 40-49).
Obwohl in den meisten Studien verschiedene Adjuvanzien als eine Formulierungskomponente eingebaut wurden, wurde ihre Wichtigkeit interessanterweise bisher noch nicht bestimmt. In diesem Zusammenhang kann Bezug genommen werden auf Shirmbeck et al., 1996, Intervirology 39 111-119, die weiterhin zeigten, dass die Injektion von 100 ng bis 1 μg nativen Hepatitis B Virus Oberflächenantigen (HBsAg) VLPs ohne Adjuvanz wirksam MHC Klasse 1 beschränkte CTL-Antworten anregen und dass dieses zeigt, dass solche VLPs immunogen sein können.
Unerwarteter Weise wurde nun durch die Erfinder festgestellt, dass eine Behandlung von bestehenden PV-Infektionen einschließlich der Genitalwarzen durch Vakzine enthaltend PV VLPs ohne irgendein E-Protein oder Adjuvanz erreicht werden kann. Dies ist unzweifelhaft überraschend insbesondere im Lichte der Beobachtung von Greenstone et al., 1998, supra und Kirnbauer et al., 1996, supra. Kirnbauer et al., 1996, supra und Peng et al., 1998, supra, etablierten weiterhin das, obwohl die Verwendung von prophylaktischen PV-Vakzinen ohne Adjuvanz wirksam sein kann, diese Schlussfolgerung nur auf chimäre VLPs anwendbar sind. Während Schirmbeck et al., 1998, supra, etablierte, dass HBsAg VLPs ohne Adjuvanz immunogen sein können, konnte eine ähnliche Schlussfolgerung nicht auf PV VLPs unter Berücksichtigung der anderen oben genannten Referenzen angewendet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von bestehenden PV-Infektionen bereit zu stellen, das bei Verwendung wirksam ist.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Behandlung einer bestehenden PV-Infektion bereit, dass den Schritt der Verabreichung von PV VLPs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PV L1 VLPs and PV L1/L2 VLPs an einem Patienten, der an einer PV-Infektion leidet, umfasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere anwendbar auf bestehende Genitalwarzen hervorgerufen durch die HPV-Arten 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55. Die Warzen, die insbesondere relevant für die Behandlung sein können, sind solche hervorgerufen durch HPV6 und HPV11.
Bevorzugt sind die PV-Infektionen Epithelläsionen und bevorzugter sind solche Läsionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Handwarzen, Fußsohlenwarzen, anogenitalen Warzen, Flach- und Planwarzen der Haut und schleimartiger Oberflächen, CIN, pferdeartige, fleischähnlicher (equine sarcoid) oder replizierender oder vegetativer PV-Infektion.
Bevorzugt kann im Verlauf der Behandlung ein vorhandener Patient untersucht werden auf die Ursache seiner oder ihrer Infektion und diesem Zusammenhang kann eine Biopsie zur PV-Typisierung genommen werden. Entsprechend wird PV-Typisierung durch auf Antikörper-basierende oder Nukleinsäure-basierende Techniken durchgeführt, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Bevorzugt wird die PV-Typisierung durch Nukleinsäure-Amplifikationstechniken, wie PCR, durchgeführt.
Die relevanten VLPs können durch Standardverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, z.B. beschrieben in Qi et al., 1996, Virology 216 35-45. Solche Standardverfahren sind weiterhin beschrieben in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO93/02184, australisches Patent Nr. 683220, Yamada et al., Dec. 1995, J. Virol. 7743-7753, U.S.-Patent Nr. 5437951, U.S.-Patent Nr. 5744142, Rose et al., 1993, supra, Kirnbauer et al. 1993, J. Virol. 67(12) 6929-6936, Sasegawa et al., 1995, Virology 206 126-135 und Schiller und Roden, 1995, Papillomavirus Report 6(5) 121-128.
Auf die obigen Offenbarungen wird nur beispielhaft Bezug genommen, und es ist klar, dass VLPs durch eine große Vielzahl von Verfahren hergestellt werden können, diese schließt grundsätzlich ein Klonieren von L1 (oder L1 und L2)-Gen in einen geeigneten Vektor und Expression der korrespondierenden konformativ kodierenden Sequenz für diese Proteine in einer eukaryotischen Zelle, die durch diesen Vektor transformiert ist, ein. Anschließlich sollte die gesamte für die Capsid-Protein kodierende Sequenz exprimiert werden und damit sollte im Wesentlichen die gesamte Capsid-kodierende Sequenz kloniert sein. Insektenzellen sind bevorzugte Wirtszellen, obwohl Hefezellen ebenfalls verwendet werden können, wenn notwendig.
In ähnlicher Art und Weise können andere eurkaryotische und prokarotische Systeme zur Expression von L1 oder L1 und L2-Proteinen verwendet werden, vorausgesetzt die exprimierten Proteine fügen sich selbst zu VLPs zusammen.
Bevorzugt wird ein Baculovirus-Expressionssystem verwendet, bei dem die L1 oder L1 und L2-Gene in einen Baculovirus-Expressionsvektor enthaltend flankierende Baculovirus-Sequenzen insertiert sind, um ein Genkonstrukt auszubilden und die rekombinante DNA wird mit Wildtyp Baculovirus-DNA in Sf-9-Insektenzellen co-transfiziert.
Bezug genommen wird auf den folgenden experimentellen Abschnitt, bei dem humane Patienten mit HPV6b VLPs ohne Adjuvanz behandelt wurden. Es ist aus der internationalen Publication Nr. WO93/02184 klar, dass L1 ORF monoton in allen bekannten Fällen konserviert ist und daher hat die Erfindung eine breite Anwendung auf alle PV-Arten. Unterstützung für diese Schlussfolgerung kann aus den folgenden Referenzen gezogen werden, nämlich

(a) Carl C. Baker Appendix „Sequence Analysis of Papillomavirus Genomes" in „The Papovaviridiae: Volume 2, the Papillomaviruses", editors N.P. Salzman and P.M. Howley, Plenum Press (1987);
(b) Thomas R. Broker, 1987, "Structure an Genetic Analysis of Expression of Papillomaviruses", Obstetrics and Gynecology Clinics of North America 14(2) 329-348;
(c) Isabelle Giri and Olivier Danos, 1986, "Papillomavirus genomes: from sequence data to biological properties", 2 Trends Genet 2 227-232; and
(d) A review by Syrjanen K. et al., in "Papillomaviruses and Human Diseases", Springer Verlag, 1987.

Es wird angenommen, dass die PV VLPs in einem geeigneten physiologischen Vehikel einschließlich Salzlösung, Wasser, PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) gelöst werden kann. Eine geeignete Konzentration an PV VLPs sind 0,5 bis 20 μg und bevorzugter 1 bis 10 μg. Die Dosierungen können 3 bis 6 Mal über einen Zeitraum von 8 bis 16 Wochen oder bevorzugter 2 bis 4 Wochen sein.
Wie im experimentellen Teil im Folgenden gezeigt, wird weiterhin deutlich, dass die Immunisierung mit HPV6 und genauer mit HPV6b VLPs Immunantworten ergibt, die kreuzreaktiv mit HPV11, aber nicht mit HPV16 sind. Daher kann eine Immunisierung mit HPV6 VLPs ein Schutz gegenüber HPV11-Infektionen und umgekehrt bereitstellen, d.h. eine Immunisierung mit HPV11 VLPs kann einen Schutz gegenüber HPV6-Infektionen bereitstellen. In Immunisierungsprotokollen können ähnliche Konzentrationen oder Dosierungen an VLPs, wie sie oben beschrieben sind, angepasst sein und die Verwendung von irgendeinem physiologischen Vehikel kann genutzt werden. Irgendeine geeignete Route der Verabreichung kann vorgenommen werden, die parenterale Verabreichung und insbesondere die intramuskuläre Verabreichung ist bevorzugt.
Experimente
MATERIALIEN UND METHODEN
Patienten
Personen, die ihre Zustimmung gegeben haben (d.h. insgesamt 36) wurden zum Zwecke dieser klinischen Untersuchung rekrutiert. Diese Personen waren gesund und hatten Genitalwarzen. Sie waren alle im Alter zwischen 16 und 55 und hatten mindestens eine sichtbare äußere Warze. Die Personen hatten in den letzten vier Wochen vor Immunisierung keine Behandlung gegen ihrer Warzen erhalten und zugestimmt, dass sie während des Zeitraums der Immuntherapie auf andere Behandlungen verzichten. Die Dauer der Erkrankungen mit Genitalwarzen und die bisherige Behandlungsgeschichte wurden aufgenommen, aber nicht als Determinante für die Auswahl einer Beteiligung verwendet, da bei den Patienten Unsicherheit bestand, wie lange die Erkrankung vorliegt und welche Art die vorherigen topischen Behandlungen gewesen sein könnten. Patienten wurden ausgeschlossen, die innerhalb der letzten vier Wochen wegen ihrer Warzen behandelt wurden, wenn sie eine medikamentöse Behandlung einer systemischen Erkrankung unterlagen, wenn andere, durch Sexualkontakt übertragene Infektionen behandelt werden mussten oder wenn cervikale Displasie, die behandelt werden musste, in einen PAP-Ausstrich nachgewiesen wurden. Internalisierte Genitalwarzen waren für die Teilnahme keine Contraindikation. Eine Biopsy wurde aus der ausgewählten Warze zum Zeitpunkt der Aufnahme entnommen, um eine HPV-Typisierung mittels PCR durchzuführen und alle Warzen waren HPV-6b/11-positiv bei der PCR. Ein HIV-1-Test wurde nicht routinemäßig in dieser Studie durchgeführt, da nur fünf Fälle einer HIV-Infektion in überwachten Studien zum Zeitpunkt dieser Studie nachgewiesen wurden. Die durchschnittliche Zeit zwischen erster Vorstellung mit Warzen und erster Behandlung mit Vakzinen bei geeigneten Patienten betrugt eine Woche. Das Blut für die HPV VLP-Antikörperstudien wurde weiterhin von geeigneten Labormitarbeitern genommen, die mit dem Alter der Patienten übereinstimmten und die bisher keine Genitalwarzen hatten.
Herstellung des Materials zur Vakzinierung
VLPs wurden unter „good laboratory practice" Bedingungen unter Verwendung eines HPV6bL1 rekombinanten Baculovirus (L1rBV), der in Qi et al., 1996, Virology 216 35-45 beschrieben wurde, hergestellt. Die Kulturen der SF9-Zellen in SF900-II-Medium (Sigma) wurden mit L1rBV mit einem MOI von 10 infiziert. Nach 48 Stunden wurden die Kulturen geerntet und die Zellpellets gepoolt, auf L1 mittels Immunoblot und auf VLPs mittels Elektronenmikroskopie untersucht und bei –80 °C für die weitere Verwendung eingefroren. Aufgetaute Zellpellets wurden weiter durch diskontinuierliche Sucrosegradientenzentrifugation und durch kontinuierliche Cesiumchloridgradientenzentrifugation aufgereinigt und auf den VLP-Gehalt untersucht, wie in Qi et al., 1996, supra und Park et al., 1993, J. Virol. Methods 45 303-318, beschrieben. Das Material mit einer Dichte von 1,26–1,30 g/cm³, bei dem es sich um > 80 % HPV6bL1-Protein aufgrund der Gelanalyse handelt und im Wesentlichen komplette Viruspartikel gemäß EM (VLPs) enthält, wurden bei einer umfassenden Dialyse gegen Phosphat gepufferter 0,9 % NaCl mit Calcium und Magnesium (PBS) unterworfen und mit 50 μg Protein/100 μl in Glasröhrchen aliquotiert. Eine zufällige Auswahl von 10 % dieser Röhrchen wurden einer Untersuchung auf Sterilität, Pyrogenität und annormaler Toxizität in Kaninchen unterworfen. Das Material war steril und für Pyrogene negativ, und es wurde keine Toxizität beobachtet. Am Ende der Studie, ein Jahr, nachdem der Pool an Zelllysat hergestellt wurde, wurde ein Röhrchen auf VLP-Gehalt mittels Immunoblot und Elektronenmikroskopie überprüft, um die Produktstabilität zu bestätigen.
Immunisierung
Die Personen wurden alle zwei Wochen untersucht und die Warzen wurden bei jedem Besuch inspiziert und im Allgemeinen fotografiert. Kolposkopie mit Visualisierung der Vagina und des Gebärmutterhalses wurde bei jedem Besuch durchgeführt. In den Wochen 0, 4 und 8 wurden die Patienten mit HPV VLPS, 1, 5 oder 10 μg, intramuskulär ohne Adjuvanz immunisiert. Die Aufteilung der Dosis war zunächst nacheinander, die ersten fünf Patienten erhielten 1 μg, die nächsten fünf 5 μg und die weiteren fünf 10 μg. Anschließend wurden die Patienten eingeteilt, dass sie abwechselnd 10, 5 oder 1 μg erhielten. Wenn die Warzen nicht nach 12 Wochen verschwanden, wurden weitere VLP-Immunisierungen in der Woche 12 angeboten und wenn die Warzen nicht verschwanden, nach 16 Wochen und 20 Wochen. Vier Personen (2 × 5 μg; 2 × 10 μg) erhielten vier Immunisierungen, zwei Personen (1 × 5 μg; 1 × 10 μg) erhielten fünf Immunisierungen und sechs Personen (1 × 1 μg; 2 × 5 μg; 3 × 10 μg) erhielten sechs Immunisierungen. Ein Patient, der anfänglich 1 μg erhielt und der keinen Rückgang oder DTH gegenüber VLPs nach 10 Wochen mit dieser Dosis aufzeigte, erhielt drei weitere Vakzinierungen mit 10 μg und die Daten dieses Patienten wurden mit der 10 μg Behandlungsgruppe analysiert. Sonst wurden weitere Immunisierungen der gleichen Dosis an VLPs wie die anfänglich gegebenen, verabreicht. Die zur Verfügung stehenden Personen (n = 34) wurden in der Woche 20 auf das Ergebnis hin untersucht, und die Personen wurden klassifiziert aufgrund der Evaluierung, wenn sie mindestens drei Immunisierungen erhalten haben und zu diesem Zeitpunkt erschienen.
Sicherheit und Toxizität
Eine Kohorte von fünf Patienten, die 10 μg VLPs erhielten, wurden einer rountinemäßigen Hämatologie unterworfen (FBE, differenzierte Zählung der weißen Zellen) und Biochemie (AST, ALT, Bilirubin, alkalische Phosphatase, Gesamtprotein, Albumin, Globuline, Glukose, Harnstoff, Kreatinin, Harnsäure) zu Beginn, nach drei Tagen, 1, 2, 4, 8 und 12 Wochen nach der ersten Immunisierung. Die Proben der Personen wurden mit einem 12-Kanal automatisierten chemischen Analysator (Beckmann CX4) und einem 6-Kanal Coulter-Hämatologie-Analysator (Coulter T-540) untersucht.
Alle Personen wurden auf Nebenwirkungen nach Vakzinierung beobachtet und wurden bei jedem Besuch über irgendwelche Unverträglichkeitsereignisse, die zwischen den Besuchen auftraten, befragt einschließlich Unannehmlichkeiten an der Stelle der Immunisierung oder bei den Warzen und systemische Symptome einschließlich Fieber, Schüttelfrost, Muskelschmerz, Kopfschmerzen und Hauterkrankungen.
Antikörper gegen VLPs
Serum wurde vor und alle 2 Wochen während der Studie gesammelt, um auf VLP-spezifische Antikörper mittels ELISA zu testen. ELISA-Platten (Flow Laboratories) wurden mit HPV6b, HPV11 oder HPV16 VLPs (10 μg/ml) in PBS-Puffer über Nacht beschichtet und mit fettfreier Magermilch blockiert. Die Test- und Kontrollseren wurden mit einer 1:100-Verdünnung hinzugefügt und ein Binden wurde durch HRP-konjugiertes Anti-Human-IgG (Sigma) oder HRP-konjugiertes Anti-Human-IgG, A, M (Silenius) nachgewiesen. Die durchschnittliche Reaktivität von jedem Serum mit entfetteter Magermilch, die im Bereich von 0,001 bis 0,113 (Durchschnitt 0,032) lag, wurde bei jedem Fall abgezogen. Zum Vergleich wurde das komplette Set an Seren in einem einzelnen Assay getestet und drei unabhängige Assays von jedem Serumset wurde durchgeführt mit stark korrelierenden Ergebnissen (r² > 0,95).
DTH-Testung
VLP-Vakzinmaterial wurde als Antigen für die DTH-Testung verwendet. Die DTH-Testung wurde bei 32 Personen nach Beendigung der ersten drei Dosen der Immunisierung und dem Testprotokoll für die Antikörper in den Wochen 10 bis 12 durchgeführt. 20 μl (10 μg) VLP-Suspension wurden intradermal auf der Innenseite des Unterarms verabreicht. Die Biopsien wurden visuell 48 Stunden als 0 (keine Induration), 1 (1–3 mm Induration), 2 (4–10 mm Induration und 3 (> 10 mm Induration) bewertet. Bei 28 Personen wurden die DTH-Stellen unter Verwendung einer 3 mm Loch-Biopsy bei 1 % Lignocain lokaler Betäubung biopsiert. Die Biopsien wurden in neutral gepuffertem Formalin fixiert und für routinemäßige H + E-Schnitte verarbeitet und für Immunohistochemie wie in Pettit et al., 1997, J. Immunol. 159 3681-3691, beschrieben.
Immunohistochemie
Die Schnitte der Biopsien wurden in neutral gepuffertem Formalin fixiert und routinemäßig verarbeitet und in Paraffin eingebettet, wurden deparaffiniert und einer Hochtemperatur-Antigen-Retrieval (121 °C, 10 Minuten) unter Verwendung von 10 mM EDTA, pH 7,5 Puffer unterworfen. Doppelte Immunfärbung mit Kombinationen von CD1a/HLA-DR, CD1a/CD68, CD3/CD68, CD3/CD8, CD68/HLA-DR, CD3/HLA-DR und CD3/CD20 wurden durchgeführt. Anschließend wurde ein Blockieren mit 10 Schweineserum/10 % FBS in TBS, pH 7,6 für 1 Stunde durchgeführt. Die Schnitte wurden bei Raumtemperatur in feuchten Kammern mit den primären Antikörpern Maus-Anti-Human CD1a (Immunotech-Coulter, Clon BL-6, vorverdünnt), Kaninchen-Anti-Human CD3 (1:250) und Maus-anti-Human CD8 (Clon C8/144B), CD68 (Clon PG-M1), HLA-DR (Clon TAL-1B5) und CD20 (Clon L26) (DAKO, Dänemark) alle in 1:50-Verdünnungen für 60 Minuten inkubiert. Die Schnitte wurden mit biotyniliertem Kaninchen-anti-Maus oder Schwein-anti-Kaninchen (1:200) Sekundärantikörper und mit Streptavidin konjugierter Meerrettichperoxidase (DAKO, Dänemark) (1:300) behandelt. Für Doppelfärbungen wurden die Schnitte weiter mit einem zweiten Primärantikörper gefolgt von entsprechend biotynilierten zweiten Sekundärantikörpern behandelt. Streptavidin ABC/alkalische Phosphatase-Konjugat (DAKO, Dänemark) wurden als Markierung des zweiten Antikörpers verwendet. Die ersten und zweiten Antikörper wurde anschließend nachgewiesen durch Entwickeln mit Substrat-Chromogen-Kits unter Verwendung von DAB (braun) und Fast-red (rot) (DAKO, Dänemark). Die Schnitte wurden mit Myers Hämatoxylin gegengefärbt.
Statistische Analyse
Univariante und multivariante Analyse wurde mit Hilfe des Statistica Version 5.0 Programms (Statsoft, Ok., USA) durchgeführt.
ERGEBNISSE
Vakzinierung und Nebenreaktionen
Wie oben ausgeführt, wurden 36 Personen für die Studie rekrutiert und 34 Personen wurden mit 1, 5 oder 10 μg HPV6bL1 VLPs bei 3 oder mehr Gelegenheiten immunisiert und nahmen auch an der Evaluierung nach 20 Wochen teil (Tabelle 1). Die Mehrzahl der Personen hatten über 2 Monate oder länger Warzen (Tabelle 2) und hatten mindestens eine vorherige Behandlung mit Ausbrennung/Ätzung ihrer Warzen. Keine lokalen oder läsionalen, systemischen Nebenreaktionen wurden von den Personen nach Immunisierung beobachtet oder berichtet (evaluierbar oder anders), abgesehen von einem sofortigen unangenehmen Gefühl assoziiert mit der Injektion. Alle biochemischen und hämatologischen Untersuchungen waren in den lokalen Referenzbereichen bei jedem Besuch, und es war kein Trend für eine Veränderung über die Zeit zu erkennen. Von diesen Patienten mit zurückgehenden Warzen war keine besondere lokale Reaktion in den zurückgehenden Warzen beobachtet oder berichtet worden und es schien so, als ob die Warzen ohne lokale Entzündung in den immunisierten Personen zurückgingen, wie es allgemein beschrieben wird für die spontane Regression von Genitalwarzen. 33 Personen, die 3 oder mehrfach immunisiert wurden und die an dem sich anschließenden Besuch nach 20 Wochen teilgenommen haben, wurden als evaluierbar für die Immunantwort gegenüber dem Vakzin und für dessen Ergebnis angesehen.
DTH gegenüber HPV6bL1 VLPs
Die VLP spezifische DTH wurde unter Verwendung einer einzelnen intradermalen Injektion von VLPs zu verschiedenen Zeitpunkten nach der zweiten oder dritten Immunisierung gemessen. Die DTH wurde nicht vor anfänglicher Immunisierung getestet, im Wesentlichen um einen Immunisierungseffekt des DTH Hauttestes zu vermeiden. Die Mehrzahl der Patienten, unabhängig von der Dosis an VLPs oder der Zeit nach Immunisierung, hatten eine klinische 2+ bis 3+ DTH-Antwort und alle Patienten hatten eine sichtbare Antwort. Bei 28 Personen wurden die DTH-Reaktionen mit Hilfe einer 3 mm Hautausstechnadel biopsiert und histologischen Analysen einschließlich detaillierten immunhistochemischen Untersuchungen bei 5 Biopsien unterworfen. Typische DTH-Reaktionen einschließlich lymphoider und monozytärer Infiltration wurden um die Gefäße und subkutan beobachtet (1). Die Infiltrate bei den so untersuchten 5 Biopsien schlossen CD1a positive Langerhans-Zellen, CD4 und CD8 positive T-Zellen und DR positive Makrophagen ein. Eine 5-Punkt-Skala wurde zur histologischen Beurteilung der DTH-Reaktionen verwendet gemäß dem Ausmaß des inflammatorischen Infiltrats um die Blutgefäße und subkutan, der Zahl der involvierten Gefäße und des Vorhandenseins von nicht lymphoiden inflammatorischen Zellen, einschließlich Eosinophilen. Die Mehrzahl der Biopsien hatte einen hohen Wert und der DTH-Wert war unabhängig von der VLP-Dosis oder der Zahl an Immunisierungen. Genauer wurden CD1a positive Langerhans-Zellen in der Epidermis gesehen und seltener in der Dermis und einige CD1a positive Zellen co-exprimierten HLA-DR. Die perivaskulären mononukleären inflammatorischen Infiltrate waren vorherrschend CD3 positive T-Zellen mit CD68 positive Makrophagen und wenigen CD20 positive B-Zellen. Ca. 8 bis 10 % der CD3 positiven T-Zellen waren CD8 positiv. Eine Vielzahl von HLA-DR+/CD3+ aktivierten T-Zellen und einige CD68+/DR+ Makrophagen waren in der Dermis und in tieferem Gewebe nachweisbar.
Antikörper gegen VLPs
Vor der Immunisierung wurde eine signifikante Seroreaktivität gegen HPV6b, definiert als OD-Reaktivität > 3 S.D. von dem durchschnittlich gepoolten Normalserum, bei 9 von 32 Studienobjekten beobachtet und die Reaktivität gegenüber HPV16 wurde in zwei Personen (2A und 2B) beobachtet. Im Gegensatz war eine Seroreaktivität gegenüber HPV6b in 0 von 38 Kontrollpersonen messbar und Antikörper gegen HPV16 VLPs in 2 von 38 Kontrollpersonen. Es war eine Zunahme in der Reaktivität von HPV6b nach Immunisierung mit Ausnahme von einer Person bei allen Studienobjekten beobachtbar (2D). Die durchschnittliche Zunahme betrug 0,190 OD-Einheiten +/– S.D. 0,110. Die Zunahme an VLP-spezifischer Reaktivität mit HPV6bL1 VLPs in der Woche 20 war größer bei Personen, die 5 μg (0,227 +/– 0,028) und 10 μg (0,220 +/– 0,035) Dosen von VLPs erhielten, als bei denen, die 1 μg (0,085 +/– 0,022) Dosen erhielten und war nicht signifikant größer in den Personen, die 5 oder 10 μg erhielten, bei denen, die mehr als 3 Immunisierungen (0,242 +/– 0,042, n = 11) als bei denen, die 3 erhielten (0,209 +/– 0,021, n = 13). Zwei Wochen nach der ersten VLP-Immunisierung wurde die größte Zunahme an HPV6bL1 VLP-spezifischen IgG-Antikörpertiter bei den Personen beobachtet, die anfänglich geringe HPV6bL1 reaktive Sera aufwiesen, dies liegt nahe, dass diese Personen bereits gegenüber HPV6b geprimt waren (2C). Die Endniveaus der IgG-Antikörper gegenüber HPV6bL1 VLPs waren durch die anfänglichen Niveaus an VLP-spezifischen Antikörper (r² = 0,53; p = 0,005) vorhersehbar, die nach drei Immunisierungen beobachtete Zunahme der VLP-Reaktivität korrelierte allerdings nicht signifikant mit der anfänglichen VLP-Reaktivität (2C). Die Seren wurden auf Reaktivität mit VLPs von anderen HPV-Arten getestet. Keine Zunahme wurde in der HPV16L1 VLP-Reaktivität nach Immunisierung in 32 Seren beobachtet (durchschnittliche Zunahme 0,009 +/– S.D. 0,043). Von den auf Reaktivität auf HPV11 L1 VLPs getesteten 11 Personen, die anfänglich reaktiv waren gegenüber HPV6b, oder die eine Reaktivität gegenüber HPV6b nach Immunisierung erworben haben, erwarben 10 eine Reaktivität ähnlicher Größe gegenüber HPV11 VLPs (r² = 0,75) (2E).
Klinisches Ergebnis
Ein Zweck dieser Studie war festzustellen, ob die Verwendung von auf VLP-basierten prophylaktischen Vakzinen die Entwicklung einer bestehenden HPV-Infektion negativ beeinflusst. In dieser Studie betrugt die komplette Regressionsrate für sichtbare Warzenerkrankungen nach 20 Wochen (3A) 25 von 33 evaluierten Patienten (76 %) oder 25 von 36 Personen (69 %), wenn die erhaltenen Daten auf Basis der Behandlungsintension analysiert wurden. Von den 8 evaluierten Personen mit verbleibender Erkrankung nach 20 Wochen hatten 5 eine substantielle Teilregression (> 50 % Warzen-Clearance). Über die sich anschließend weiteren 9 Monate hatte keine Person mit kompletter Clearance ein Wiederaufkommen der Erkrankung und 2 weitere Personen hatten eine komplette Regression, eine nach anschließender destruktiver Behandlung und eine spontane. Die Regression der Warzen unter den evaluierten Personen, die 5 und 10 μg Dosis zur Vakzinierung erhalten hatten, war ähnlich (3B), während die Regression bei den Patienten, die 1 μg erhielten, früher nach der Immunisierung auftrat.
Die Zahl der Warzen zu Beginn der Studie reichte von 1 bis 15, ein Rückgang (Auflösung) der Warzen über den Zeitraum der Beobachtung war häufiger bei denen, die weniger Warzen aufwiesen (Tabelle 2). Personen, bei denen ein Rückgang der Warzen während der Studie auftrat, hatten durchschnittlich 3,8 Warzen zum Zeitpunkt des Starts, während solche, bei denen kein Rückgang (Auflösung) der Warzen auftrat, durchschnittlich 6,8 Warzen hatten (ANOVA: F = 6,07 für die Warzenanzahl als Anzeichen der Auflösung. 1 d.f; p = 0,019). Die Warzenfläche zu Beginn reichte von 25 bis 950 mm². Die durchschnittliche Warzenfläche zu Beginn unter den Personen, die keine vollständige Clearance ihrer Warzen während der Studie aufzeigten, betrug 520 mm +/– 120, während die durchschnittliche Fläche bei den Personen mit Clearance der Warzen 260 mm +/– 47 mm betrug (F = 5,84; d.f. = 1; p = 0,02). Die multivariante Analyse zeigte, dass die Unterschiede in der Warzenzahl und Größe zwischen den unterschiedlich dosierten Gruppen für die Unterschiede der Clearance-Rate zwischen den Gruppen verantwortlich sein können (Tabelle 1). Die Zahl der Warzen zu Beginn war kein Anzeichen für die Regressionszeit oder des anfänglichen VLP-spezifischen Antikörpertiters. Die berichtete Dauer der Warzen vor dem Beginn der Immuntherapie reichte von 1 bis 20 Monaten mit einem durchschnittlichen Wert von 2 Monaten. Die vorherige Dauer der Erkrankung mit Warzen war kein Anzeichen für den Ausgang der Erkrankung (F = 0,32; 1 d.f., p = 0,57), der Zeit der Regression oder des anfänglichen VLP-spezifischen Antikörpertiters (F = 0,89; 4 d.f.; p = 0,47). Von den 33 Personen hatten 15 eine vorherige destruktive Behandlung mit Diathermie. Eine vorherige Behandlung erlaubte nicht, den Ausgang, die Zeit der Regression oder den Antikörpertiter zu Beginn der Studie vorherzusagen. Das Alter der Patienten reichte von 18 bis 56 (durchschnittlich 33) mit 27 Frauen und 6 Männern und weder das Alter noch das Geschlecht sagten die Regression der Warzen oder die Zeit der Regression voraus (Tabelle 3).
Korrelation der Immunität mit dem Ausgang
Es wurden Korrelationen gesucht zwischen der Warzenregression und der Antwort auf die VLP-Immunisierung. Es gab keine Korrelation zwischen dem Niveau oder dem Vorhandensein von bereits vorher vorhandenen VLP-spezifischen Antikörper oder der Höhe der DTH-Reaktion und dem letztendlichen Ausgang bei den Warzen oder der Zeit des Regression (Tabelle 3). Die Größe der Antikörper-Zunahme nach Immunisierung war negativ korreliert mit dem Ausgang. Dies mag das Design der Studie reflektieren, dahingehend, dass Personen, bei denen sich die Warzen nicht auflösten, weiter immunisiert wurden, obwohl die Zahl der Dosierungen von erhaltenen Vakzinen nicht den Umfang der beobachteten Antikörperzunahme vorhersagen.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die Regression der HPV6b positive Genitalwarzen wurde über 20 Wochen in der vorliegenden Studie bei 76 % der HPV6b VLP immunisierten Personen beobachtet. Im Gegensatz dazu betrug die Regressionsrate von Genitalwarzen über den gleichen Zeitraum in Kontrollgruppen von veröffentlichten Studien zur Therapie von Genitalwarzen 0 bis 29 % (3A). Damit hat die HPV6bL1 VLP-Verabreichung nicht nur keinen negativen Effekt auf den natürlichen Prozess der Auflösung der HPV6b assoziierten Warzen, sondern es gibt auch gute Beweise dafür, dass die Behandlung eine beschleunigte Auflösung bewirken kann. Ein zelluläres inflammatorisches Filtrat und insbesondere in Anwesenheit von IL-12 sekretierenden T-Zellen, wie von Coleman et al., 1994, Am. J. Clin. Pathol. 102 768-774 beschrieben, ist mit dem Prozess der Auflösung der Genitalwarzen assoziiert und die Abwesenheit einer zellvermittelten Immunität ist assoziiert mit einem Fehlen der Regression. Diese Beobachtungen legen eine Schlüsselrolle der zellulären Immunität in der Warzenregression nahe, genauso wie für andere virale Infektionen.
PV virale Capsidproteine einschließlich L1 werden in Warzen exprimiert. Obwohl nachweisbares L1-Protein mehr mit den an der Oberfläche liegenden Schichten der Epidermis bei Warzen begrenzt ist, wahrscheinlich als Konsequenz einer L1 mRNA-Instabilität, wie von Sokolowski et al., 1998, J. Virol. 72 1504-1515 beschrieben, sind Zellen, die nicht nachweisbare kleine Mengen von L1 exprimieren, nichtsdestotrotz empfänglich gegenüber einer L1-spezifischen T-Zell-vermittelten Lyse wie von De Bruijn et al., 1998, Virology 250 371-376, beschrieben. Somit können selbst die geringeren Mengen an L1 exprimierten Zellen der tieferen Schichten der Warze ausreichend sein, die mit replizierenden HPV-infizierten parabasalen Keratinozyten in einer Warze sensitiv gegenüber einer T-Zell-vermittelten Lyse zu machen. Da die Verabreichung von VLPs ohne Adjuvanz bei Tieren VLP-spezifische zytotoxische T-Zellen induzieren, wie von Peng et al., 1998, supra und Greenstone et al., 1998, supra, beschrieben, kann eine VLP-Immuntherapie den Ausgang von humanen Genitalwarzen durch Induktion von PV proteinspezifischen CTL, die mit replizierenden HPV-infizierte, parabasale Keratinozyten lysiert, ändern, um eine Warzenpersistenz zu ermöglichen.
Passive spezifische Immuntherapie von CMV und EBV-Infektion mit virusspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) stellt eine wirksame Immuntherapie bei immunsupprimierten Personen, die nicht in der Lage sind, eine wirksame natürliche Immunantwort gegenüber diesen Viren aufzubringen, dar, wie gezeigt in Sing et al., 1997, Blood 89 1978-1986, und Walter et al., 1995, N. Engl. J. Med. 333 1038-1044, beschrieben. Dies bestätigt eine Rolle der CTLs als Immuneffektoren zur Reduktion einer Infektion im Menschen. Die Immunisierung zur Induktion zellvermittelter Immunität wurde als aktive spezifische Immuntherapie für Herpes Simplex Viren und dem humanen Immunodefizienzvirus vorgeschlagen; Phase 1-Versuche haben aber bisher fehlgeschlagen, klinische Vorteile aufzuzeigen, dieses wird der Art der Immunantwort induziert durch die derzeitigen Immunisierungsbehandlungspläne zugeschrieben. Die natürlich vorkommende Papillomavirus-Infektion ist gering immunogen, vermutlich weil die Viren Zellproliferation ohne lokale Immunisierung induzieren und nur die Oberflächenschicht der Haut infizieren, wie in Frazer, I.H., 1996, Curr. Opin. Immunol. 8 484-491, gezeigt. Von der spezifischen Immuntherapie für die PV-Infektion mit VLPs in Menschen wird erwartet, dass sie einen besseren klinischen Ausgang aufzeigen, als eine durch Infektion induzierte Immunantwort, wie offensichtlich in dieser Studie gezeigt. Die Papillomavirus-Infektion sollte daher ein guter Kandidat für Untersuchungen zur Wirksamkeit von neuen Vakzinen-Delivery-Systemen, entworfen zur Herstellung von wirksamer zellvermittelten Immuntherapie im Menschen, sein.
Zusätzlich zu der Rolle als Immuntherapie bei Warzen sollte die zellvermittelte Immunität gegenüber HPV-Proteinen ein wünschenswertes Merkmal für ein prophylaktisches HPV-Vakzin sein, um irgendwelche mit HPV infizierten Zellen zu eliminieren, die eine Neutralisation durch VLP-spezifische Antikörper entkommen sind. Das Aufzeigen von DTN gegenüber VLPs bei Personen mit Genitalwarzen, gezeigt in der vorliegenden Studie, ist im Einklang mit der Fähigkeit von ohne Adjuvanz verabreichten VLPs bei Mäusen zellvermittelte Immunantworten einschließlich spezifischer CTL zu induzieren, wie in Greenstone et al., 1998, supra, Peng et al., 1998, supra und Dupuy et al., 1997, Microb. Pathog. 22 219-225, beschrieben. Es muss noch bestimmt werden, ob die Verwendung von Adjuvanz, das selektiv zelluläre Immunität stimulieren kann, die Wirksamkeit dieses therapeutischen Vakzins weiter fördert. Da ein DTH-Testen selbst eine Immunität induziert haben kann und die Verabreichung von VLP keine lokale Reaktion in den Ohren der nicht immunisierten Tiere induziert (Daten nicht gezeigt), wurden keine Preimmunisierungs-DTH-Tests in dieser Studie durchgeführt, anschließend die Schlussfolgerung, dass HPV6bL1 spezifisches DTH eine Konsequenz der Immunisierung war. Allerdings hatten nur eine Minderheit von Personen vorher Antikörper gegen HPV VLPs, im Einklang mit der durchschnittlichen Lag-Zeit von 6 Monaten, aufgezeigt zwischen dem Erwerben der HPV16-Infektion und dem Auftauchen von HPV16 spezifischen Antikörpern in Gruppenuntersuchungen wie in Carter et al., 1996, J. infect. Dis. 174 927-936, beschrieben. Daher ist es möglich, dass die DTH-Reaktivität der vorliegenden Studie allgemein als Ergebnis der Immunisierung erworben wurde.
Eine signifikante Zunahme an VLP-spezifischen Antikörpertiter wurde in der vorliegenden Studie bei der Mehrzahl der nicht immunen Personen nach drei Immunisierungen beobachtet und ein Teil der immunen Personen nach einer Immunisierung. Somit scheint offensichtlich die Verabreichung von VLPs bei Patienten mit HPV-Infektion Immunität gegenüber den gleichen Epitopen zu induzieren, die immunogen im Laufe einer natürlichen Infektion sind. Selbst 1 μg oder weniger VLPs sind hoch immunogen in Mäusen, Kaninchen, Hunden und Rindern, egal, ob sie mit oder ohne Adjuvanz gegeben werden, wie in Breitburd et al., 1995, supra, Kirnbauer et al., 1996, supra und Christensen et al., 1994, J. Virol. 70 960-965, beschrieben. Murine Langerhanszellen (LC) können α6β1-Integrine exprimieren, wie in Price et al., 1997, J. Exp. Med. 186 1725-1735, beschrieben. Diese wurden vor kurzem als Kandidat für ein Rezeptormolekül für Papillomavirus, wie in Evander et al., 1997, J. Virol. 71 2449-2456, beschrieben. Dieses legt nahe, dass eine direkte Aufnahme der PV VLPs durch LC diese nicht durch Adjuvanz unterstützte Immunogenizität erklären. Die Verabreichung von HPV6b VLPs führte zu einer humoralen Immunantwort, die mit HPV11 kreuzreaktiv war, aber nicht mit HPV16, dies bestätigt, dass eine VLP-Immunisierung Antikörper mit Kreuzreaktivität zwischen nahen verwandten PV-Arten induziert und ein Fehlen einer Kreuzreaktivität zwischen weiter entfernten Arten, wie beschrieben bei der natürlichen Infektion, beschrieben in Bernard et al., 1994, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186 33-54, Christensen et al., 1994, Virology 205 329-355 und Rose et al., 1994, J. Gen Virol. 75 2445-2449. Diese Beobachtung ist für die prophylaktischen Vakzine bei Papillomavirus signifikant.
Die vorliegenden Daten unterstützen das Konzept, dass HPVL1 VLPs ein guter Kandidat für therapeutische Vakzine gegen die HPV-Infektion ist.
Tabelle 3, Vorhersagemöglichkeiten einer Auflösung (eines Rückgangs) von Warzen über den Beobachtungszeitraum
LEGENDE
Tabelle 3

A bewertet von 0 bis 3 wie in Abschnitt Methoden beschrieben
B OD-Einheiten für Serum bei 1:100 Verdünnung, getestet gegen HPV6b VLPs im ELISA

1
Immunhistochemische Analyse des Biopsiematerials von DTH-Reaktion gegenüber HPV VLPs, gesammelt von immunisierten Personen drei Wochen nach der letzten Dosis des VLP-Vakzins und 48 Stunden nach intradermaler Injektion mit 10 μg HPV6b VLPs.

Obere Abbildung: CD3 positive T-Zellen (braun) und CD8 positive T-Zellen (rot)
Untere Abbildung: CD3 positive Zellen (braun) und DR positive Zellen (rot)

2
Antikörper gegen HPV6b (A) und HPV16L1 (B) Capsid-Protein wurden in einer Serumverdünnung von 1:100 im ELISA-Assay unter Verwendung von VLPs hergestellt mit rekombinantem Baculovirus gemessen. Die Ergebnisse von Personen unmittelbar vor der Immunisierung (schraffiert) und zum Zeitpunkt der Woche 20 (ausgefüllt), sind gezeigt.

(C) Zunahme an HPV6b VLP-spezifischer IgG-Reaktivität in der Woche 2 bei Personen immunisiert mit HPV6b VLPs ist aufgetragen als Funktion der anfänglichen HPV6bL1 VLP-spezifischen Reaktivität. Die unterschiedlichen Symbole zeigen die verabreichte Dosis an VLPs an.
(D) Zunahme der HPV6b VLP-spezifischen Reaktivität zum Zeitpunkt der Woche 20 bei Personen immunisiert mit HPV6b VLPs ist aufgetragen als Funktion der anfänglichen HPV6bL1 VLP-spezifischen Reaktivität. Die nicht ausgefüllten Symbole sind für Personen, die genau drei Immunisierungen erhielten und die ausgefüllten Symbole für solche, die mehr als drei Immunisierungen erhielten. Die unterschiedlichen Symbole zeigen die verabreichten Dosierungen bei der Immunisierung an.
(E) Korrelation der Reaktivität von verschiedenen Seren mit HPV6b und HPV11. Die Seren vor Immunisierung sind als Kreise dargestellt und die der Woche 20 als Quadrate.

3
Kaplan Meier-Analyse der Zeit für die Warzen-Clearance bei Personen immunisiert mit HPV VLPs.

(A) Alle Studienteilnehmer.
(B) Studienteilnehmer stratifiziert aufgrund der zur Vakzinierung verabreichten Dosis.

Claims

Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, umfassend eine menschliche Papillomavirus (HPV) Komponente, welche aus der Gruppe, bestehend aus HPV L1 VLPs und HPV L1/L2 VLPs, ausgewählt ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer existierenden HPV-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass der therapeutische Impfstoff HPV E-Protein ausschließt.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die HPV-Infektion durch die Gegenwart von Epithel-Läsionen gekennzeichnet ist.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei die Epithel-Läsionen aus der Gruppe, bestehend aus Handwarzen, Fußsohlenwarzen, anogenitalen Warzen, Flach- und Planwarzen der Haut und schleimartiger Oberflächen, CIN und replizierender oder vegetativer HPV-Infektion, ausgewählt sind.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die HPV-Infektion durch HPV 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachte Genitalwarzen ist.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei die Genitalwarzen durch HPV 6 und HPV 11 verursacht sind.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die VLPs durch Klonieren des HPV L1-Gens in einen geeigneten Vektor und Exprimieren des korrespondierenden konformativ kodierenden Sequenz für L1 in einer durch den Vektor transduzierten Wirtszelle hergestellt sind.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die VLPs durch Klonieren der HPV L1- und L2-Gene in einen geeigneten Vektor und Exprimieren der korrespondierenden konformativ kodierenden Sequenz für L1 und L2 in einer durch den Vektor transduzierten Wirtszelle hergestellt sind.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 6 oder 7 beansprucht, wobei das L1-Gen oder die L1- und L2-Gene in einen Expressionsvektor eingefügt sind, welcher flankierende Sequenzen enthält, um ein Gen-Konstrukt zu bilden und die resultierenden rekombinante DNA mit Wildtyp Baculovirus-DNA in eine permissive Zelllinie kotransfiziert ist.
Verwendung einer therapeutischen Zelllinie, wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei die Zelllinie Sf9 Insekten-Zellen ist und der Expressionsvektor ein Baculovirus-Expressionsvektor ist.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 6 oder 7 beansprucht, wobei die Zelllinie eine prokaryotische Zelllinie ist.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht, wobei die dem Patienten zu verabreichende Konzentration von HPV VLPs 0,5 bis 20 μg beträgt.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei die Konzentration 1 bis 10 μg beträgt.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht, wobei Dosierungen von HPV VLPs 3 bis 6 Mal über einen Zeitraum von 8 bis 16 Wochen zu geben sind.
Verwendung eines therapeutischen Impfstoffs, wie in Anspruch 13 beansprucht, wobei Dosierungen von HPV VLPs 3 bis 6 Mal über einen Zeitraum von 2 bis 4 Wochen zu geben sind.