CN115279793A - 抗pd-l1抗体和抗pd-l1/il10融合蛋白 - Google Patents

抗pd-l1抗体和抗pd-l1/il10融合蛋白 Download PDF

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陈鸿森
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Abstract

本公开内容提供了抗体，包括抗体融合物，其特异性结合至人PD‑L1蛋白(huPD‑L1)并能够降低、抑制和/或完全阻断由PD‑L1介导的免疫调控作用，如在肿瘤微环境中结合至免疫检查点分子PD‑1。此外，抗体包括与细胞因子抑制性因子IL10的融合物，其能够在肿瘤微环境中补充和/或活化CD8+T细胞的细胞毒作用。本公开内容还提供了使用抗体(及其组合物)来治疗对降低、抑制和/或阻断由PD1与PD‑L1结合介导的免疫调控功能或活性有应答的疾病和病况的方法。

Description

抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求2020年5月14日提交的美国临时专利申请系列号63/024,855的权益，其整体在此并入本文以作为参考。
技术领域
本公开内容涉及结合至PD-L1蛋白的抗体和融合蛋白，以及使用此类抗体和融合蛋白的方法。
序列表的引用
序列表的正式副本与说明书同时以ASCII格式文档经由EFS-Web提交，其文件名为“09793-006WO1_SeqList_ST25.txt”，创建日期为2021年5月12日，且大小为234,722字节。经由EFS-Web提交的序列表是说明书的部分，且于此通过引用全部并入。
背景技术
癌症代表一大类疾病，这些疾病涉及异常的细胞生长，有可能侵入或扩散到身体的其他部位，并且构成死亡的主要原因。因为癌细胞从正常细胞转化(致癌)，所以癌细胞呈递的抗原性表面蛋白和/或糖蛋白与宿主生物体中正常、非肿瘤细胞上存在的抗原相同或高度相似。因此，宿主生物体的免疫系统可能难以检测和区分癌细胞与正常细胞。此外，癌细胞可以采用另一种机制来避免宿主免疫系统的检测。
程序性死亡配体(PD-L1)是一种跨膜蛋白，其结合至抑制性检查点分子PD1，从而抑制妊娠、自身免疫性疾病和其他疾病状态(如肝炎)期间的适应性免疫应答。此外，PD-L1在癌组织中高度表达，并且已发现其表达水平与肿瘤侵袭性密切相关。PD-L1的过表达及其与其受体蛋白PD1的结合被认为对于癌细胞避免被宿主生物体的免疫系统破坏的机制至关重要。
白介素10或“IL10”(也称为细胞因子合成抑制因子、CSIF、IL-10、IL10A、GVHDS或TGIF)是一种在免疫调节和炎症中具有多种作用的细胞因子。已知IL10可下调巨噬细胞上Th1细胞因子、MHC II类抗原和共刺激分子的表达。还已知IL10可增强B细胞存活、增殖和抗体产生。IL10可以阻断NF-κB活性，并参与JAK-STAT信号转导通路的调控。IL10能够抑制由巨噬细胞和Th1 T细胞等细胞产生的促炎性细胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF的合成。其还显示出抑制抗原呈递细胞的抗原呈递能力的强大能力；然而，其也刺激某些T细胞(Th2)和肥大细胞，并刺激B细胞成熟和抗体产生。
IL10已被公认为肿瘤转移的潜在抑制剂和可用于免疫肿瘤学治疗的免疫刺激剂。在转基因小鼠中，已观察到IL10的表达或IL10的给药可控制原发性肿瘤生长并减少转移负荷。已显示PEG化形式的重组小鼠IL10在小鼠模型中诱导IFNγ和CD8+T细胞依赖性抗肿瘤免疫。已显示PEG化重组人IL10可增强细胞毒性分子颗粒酶B和穿孔素的CD8+ T细胞分泌，并增强T细胞受体依赖性IFNγ分泌。在临床试验中，已发现PEG化重组人IL10(PEG-rHuIL-10，AM0010)具有显著的抗肿瘤有效性，引发免疫刺激细胞因子IFNγ、IL-18、IL-7、GM-CSF和IL-4的剂量可滴定诱导。接受治疗的患者还显示出表达活化标志物的外周CD8+ T细胞增加，如PD1、淋巴细胞活化基因3(LAG3)+和增加的Fas配体(FasL)，以及血清TGFβ的减少。这些发现提示，IL10治疗在人类中产生主要的免疫刺激作用。
发明内容
本公开内容提供了以高亲和力特异性结合人PD-L1的抗PD-L1抗体。抗体能够降低、抑制和/或完全阻断由PD-L1结合至免疫检查点分子PD1介导的免疫调节作用。本公开内容还提供了抗PD-L1抗体与一个或两个IL10多肽的融合物。本公开内容的这些抗PD-L1/IL10融合蛋白能够提供阻断由PD-L1与PD1结合介导的免疫调节作用和提供由IL10介导的免疫刺激作用的联合治疗作用。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其包含(i)第一轻链互补决定区(CDR-L1)、第二轻链互补决定区(CDR-L2)和第三轻链互补决定区(CDR-L3)，和/或(ii)第一重链互补决定区(CDR-H1)、第二重链互补决定区(CDR-H2)和第三重链互补决定区(CDR-H3)，其中：
(a)CDR-H1包含选自SEQ ID NO：49、57、65、87、93、99、105、119和124的氨基酸序列；
(b)CDR-H2包含选自SEQ ID NO：50、58、66、88、94、100、106、110、115、120和125的氨基酸序列；
(c)CDR-H3包含选自SEQ ID NO：51、59、67、89、95、101和111的氨基酸序列；
(d)CDR-L1包含选自SEQ ID NO：53、61和69的氨基酸序列；
(e)CDR-L2包含选自SEQ ID NO：54、62和70的氨基酸序列；
(f)CDR-L3包含选自SEQ ID NO：55、63、71、91、97、103、108、113、117和122的氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其中：
(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列；
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列；
(e)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列；
(f)CDR-H1包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列；
(g)CDR-H1包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列；
(h)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列；
(i)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列；
(j)CDR-H1包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列；或
(k)CDR-H1包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列和CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其中：
(a)CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列；
(b)CDR-L1包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列；
(c)CDR-L1包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列；
(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列；
(e)CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列；
(f)CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列；
(g)CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列；
(h)CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列；
(i)CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列；或
(j)CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其中：
(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列；
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列；
(e)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列；
(f)CDR-H1包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列；
(g)CDR-H1包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列；
(h)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列；
(i)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列；
(j)CDR-H1包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列；或者
(k)CDR-H1包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：52、60、68、90、96、102、107、112、116、121和126的序列具有至少90％同一性；和/或轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：56、64、72、92、98、104、109、114、118和123的序列具有至少90％同一性；任选地，其中：
(a)所述抗体包含与SEQ ID NO：52具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQID NO：56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(b)所述抗体包含与SEQ ID NO：60具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQID NO：64具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(c)所述抗体包含与SEQ ID NO：68具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQID NO：72具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(d)所述抗体包含与SEQ ID NO：90具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQID NO：92具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(e)所述抗体包含与SEQ ID NO：96具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQID NO：98具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(f)所述抗体包含与SEQ ID NO：102具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ ID NO：104具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(g)所述抗体包含与SEQ ID NO：107具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ ID NO：109具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(h)所述抗体包含与SEQ ID NO：112具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(i)所述抗体包含与SEQ ID NO：116具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ ID NO：118具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(j)所述抗体包含与SEQ ID NO：121具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ ID NO：123具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；或者
(k)所述抗体包含与SEQ ID NO：126具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ ID NO：56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其中所述抗体包含重链(HC)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：149、150、152、154、155、156、157、158、159、160和161的序列具有至少90％同一性，和/或轻链(LC)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：128、130、132、134、136、138、140、142、151和153的序列具有至少90％同一性；任选地，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO：149的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：150的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：151的所述LC氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：152的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：153的所述LC氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：154的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：128的所述LC氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：155的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：130的所述LC氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：156的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：132的所述LC氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO：157的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：134的所述LC氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：158的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：136的所述LC氨基酸序列；
(i)SEQ ID NO：159的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：138的所述LC氨基酸序列；
(j)SEQ ID NO：160的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：140的所述LC氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：161的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其中所述抗体包含通过接头与选自IL2、IL7、IL10、IL12、IL15、IL21或IFN-α的细胞因子融合的重链(HC)；任选地，其中所述接头包含选自SEQ ID NO：74、75、76、77、78和79的氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，所述抗PD-L1抗体包含通过接头与细胞因子融合的HC，所述细胞因子是IL10；任选地，其中：
(a)融合至所述IL10多肽的所述HC包含HC-IL10融合物氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：83、84、85、127、129、131、133、135、137、139和141的序列具有至少90％同一性；
(b)所述IL10包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列；和/或
(c)所述IL10是天然存在的或保留其细胞因子活性的IL10的工程化变体；
(d)所述IL10是保留其细胞因子活性的IL10的合成修饰的形式；和/或
(e)所述IL10包含一条、两条或四条IL10多肽。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其包含通过接头融合至IL10多肽的HC，其中所述抗体包含(i)第一轻链互补决定区(CDR-L1)、第二轻链互补决定区(CDR-L2)和第三轻链互补决定区(CDR-L3)，以及(ii)第一重链互补决定区(CDR-H1)、第二重链互补决定区(CDR-H2)和第三重链互补决定区(CDR-H3)，其中：
(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列；
(e)CDR-H1包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列；
(f)CDR-H1包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列；
(g)CDR-H1包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列；
(h)CDR-H1包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列；
(i)CDR-H1包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列；
(j)CDR-H1包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列；
(k)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列；
(l)CDR-H1包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列；
(m)CDR-H1包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列；
(n)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列；
(o)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列；
(p)CDR-H1包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列；或
(q)CDR-H1包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其包含通过接头融合至IL10多肽的HC，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)氨基酸序列，所述重链可变结构域氨基酸序列具有与选自SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、90、96、102、107、112、116、121和126的序列具有至少90％同一性的序列；和/或轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，所述轻链可变结构域氨基酸序列具有与选自SEQ ID NO：8、16、24、32、40、48、56、64、72、92、98、104、109、114、118和123的序列具有至少90％同一性的序列；任选地，其中：
(a)所述抗体包含与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(b)所述抗体包含与SEQ ID NO：12具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：16具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(c)所述抗体包含与SEQ ID NO：20具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：24具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(d)所述抗体包含与SEQ ID NO：28具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：32具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(e)所述抗体包含与SEQ ID NO：36具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：40具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(f)所述抗体包含与SEQ ID NO：44具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：48具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(g)所述抗体包含与SEQ ID NO：52具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(h)所述抗体包含与SEQ ID NO：60具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：64具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(i)所述抗体包含与SEQ ID NO：68具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：72具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(j)所述抗体包含与SEQ ID NO：90具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：92具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(k)所述抗体包含与SEQ ID NO：96具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(l)所述抗体包含与SEQ ID NO：102具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ ID NO：104具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(m)所述抗体包含与SEQ ID NO：107具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：109具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(n)所述抗体包含与SEQ ID NO：112具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(o)所述抗体包含与SEQ ID NO：116具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：118具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(p)所述抗体包含与SEQ ID NO：121具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：123具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；或
(q)所述抗体包含与SEQ ID NO：126具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和/或与SEQ ID NO：56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体，其包含通过接头融合至IL10多肽的HC，其中所述抗体包含HC-IL10融合物氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：80、81、82、83、84、85、127、129、131、133、135、137、139和141的序列具有至少90％同一性，和轻链(LC)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148的序列具有至少90％同一性；任选地，其中
(a)SEQ ID NO：80的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：144的所述LC氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：81的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：146的所述LC氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：82的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：148的所述LC氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：83的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：84的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：151的所述LC氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：85的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：153的所述LC氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO：127的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：128的所述LC氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：129的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：130的所述LC氨基酸序列；
(i)SEQ ID NO：131的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：132的所述LC氨基酸序列；
(j)SEQ ID NO：133的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：134的所述LC氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：135的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：136的所述LC氨基酸序列；
(l)SEQ ID NO：137的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：138的所述LC氨基酸序列；
(m)SEQ ID NO：139的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：140的所述LC氨基酸序列；或
(n)SEQ ID NO：141的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种抗PD-L1抗体其中：
(a)所述抗体以1x10-8M或更低、1x10-9M或更低、1x10-10M或更低的结合亲和力结合至人PD-L1；任选地，其中所述结合亲和力是通过与SEQ ID NO：174的huPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)测量的；
(b)所述抗体以1x10-8M或更低、1x10-9M或更低、1x10-10M或更低的结合亲和力结合至食蟹猴PD-L1；任选地，其中所述结合亲和力是通过与SEQ ID NO：176的cynoPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)测量的；
(c)所述蛋白使MC/9细胞增殖增加至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％或更多；
(d)所述蛋白使由活化的CD8 T细胞产生的IFNγ和颗粒酶B增加至少25％、至少50％、至少100％或更多；和/或
(e)所述抗体使在28天时在同基因小鼠肿瘤模型中测量的肿瘤体积减小至少25％、至少50％、至少75％或更多，其中所述小鼠肿瘤模型选自：CT26结肠癌、EMT6乳腺癌。
本公开内容还提供了本文公开的抗PD-L1抗体的实施方式，包括实施方式其中：(i)所述抗体是人、人源化或嵌合抗体；(ii)所述抗体包含与重组蛋白的融合物；任选地，与IL10多肽的融合物；(iii)所述抗体是IgG类别的全长抗体，任选地，所述IgG类别抗体具有选自以下的同种型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；(iv)所述抗体包含Fc区变体，任选地改变效应功能的Fc区变体和/或改变抗体半衰期的变体；(v)所述抗体是抗体片段，其任选地选自以下：F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、单域抗体(VHH)和scFv；(vi)所述抗体包含免疫缀合物，任选地，其中所述免疫缀合物包含用于治疗PD-L1介导的疾病或病况的治疗剂；或(vii)所述抗体是多特异性抗体，任选地双特异性抗体。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种分离的多核苷酸或载体，其编码本公开内容的抗PD-L1抗体。在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种分离的宿主细胞，其包含编码本公开内容的抗PD-L1抗体的多核苷酸或载体。在至少一个实施方式中，本公开内容还提供了一种生产本公开内容的抗PD-L1抗体的方法，包括培养包含编码抗PD-L1抗体的多核苷酸或载体的宿主细胞，从而生产抗体。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种药物组合物，其包含本公开内容的抗PD-L1抗体和药学上可接受的载体；任选地，其中所述组合物还包含IL10多肽、化学治疗剂和/或包含对免疫检查点分子特异性的抗体。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种在受试者中治疗PD-L1介导的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开内容的抗PD-L1抗体，或向所述受试者施用治疗有效量的本公开内容的药物组合物；任选地，其中所述疾病是癌症；任选地，其中所述癌症选自结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌和口腔癌。
在至少一个实施方式中，本公开内容提供了一种用于在受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用PD-L1拮抗剂和IL10激动剂；任选地，其中所述PD-L1拮抗剂包含抗PD-L1抗体、shRNA、siRNA、miRNA、PD-L1的小分子抑制剂或其组合；任选地，其中所述IL10激动剂是IL-10、IL10受体结合蛋白或其组合；任选地，其中所述PD-L1拮抗剂是本公开内容的抗PD-L1抗体；任选地，其中所述PD-L1拮抗剂和所述IL10激动剂包含具有通过接头融合至IL10多肽的HC的抗PD-L1抗体；任选地，其中所述方法还包括向所述受试者施用T细胞疗法。
附图说明
图1A、图1B和图1C描述了如实施例1中所述产生、克隆、表达和纯化的全长IgG形式的示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白的SDS-PAGE凝胶图像。图1A：阿维鲁单抗，阿维鲁单抗/IL10的SDS-PAGE图像。图1B：德瓦鲁单抗和德瓦鲁单抗/IL-10的SDS-PAGE图像。图1C：抗PD-L1抗体：PHS102、PHS206、PHS219和抗PD-L1/IL10融合物：PHS102/IL10、PHS206/IL10和PHS219/IL10的SDS-PAGE图像。N：非还原性，R：还原性。
图2A、图2B和图2C描述了竞争性ELISA研究的结果图，显示了示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白阻断人PD-L1与人PD1特异性结合的能力。将重组人PD-L1(1μg/mL)固化在微量滴定孔上，添加生物素缀合的人PD1，并使用ELISA通过链霉亲和素检测，如在实施例2中所述。为检测竞争活性，添加了抗PD-L1或抗PD-L1/IL10融合蛋白的系列稀释液。图2A：阻断示例性抗PD-L1抗体阿特朱单抗、PHS102、PHS206和PHS219表现出的PD1与PD-L1的结合。图2B：阻断示例性抗PD-L1/IL10融合物、阿特朱单抗/IL10、PHS102/IL10、PHS206/IL10和PHS219/IL10表现出的PD1与PD-L1的结合。图2C：阻断示例性抗PD-L1/IL10融合物、阿维鲁单抗/IL10和德瓦鲁单抗/IL10表现出的PD1与PD-L1的结合。
图3A和图3B描述了示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白与过表达人PD-L1的稳定F293细胞(“F293/hPDL1”)的结合的流式细胞术研究的结果图，所述细胞的产生是通过将全长人PD-L1表达构建体转染至F293细胞中，然后筛选对选择药物的抗性，如实施例3中所述。图3A显示了用按实施例1制备的抗PD-L1抗体系列稀释液孵育的细胞的结果。图3B显示了细胞与如实施例1中制备的相应抗PD-L1/IL10融合蛋白的系列稀释液一起孵育的结果。通过流式细胞术分析细胞表面结合并以几何MFI表示。
图3C和图3D描述了流式细胞术研究的结果图，显示了示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白阻断人PD1与过表达人PD-L1的稳定F293细胞(“F293/hPDL1”)特异性结合的能力。通过将全长人PD-L1表达构建体转染到F293细胞中然后筛选对选择药物的抗性来产生F293/hPDL1表达细胞，如实施例3中所述。将F293/hPDL1细胞与生物素缀合的hPD1(20μg/mL)和示例性抗PD-L1抗体(图3C)或抗PD-L1/IL10融合蛋白(图3D)的系列稀释液在冰上孵育1h。通过链霉亲和素检测PD1的细胞表面结合，并通过流式细胞术分析。
图4A和图4B描述了如实施例4中所述的示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白抑制PD1信号转导的结果图。测定了示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白阻断由U2OS PD-L1细胞系共培养物介导的PD1活化的能力。将U2OS PD-L1细胞用系列稀释的抗PD-L1抗体(图4A)或抗PD-L1/IL10融合蛋白(图4B)处理1小时，然后用Jurkat PD1信号转导细胞室温下刺激2小时。
图5A和图5B描述了显示示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白在CD4 T细胞-DC-混合淋巴细胞反应(MLR)中增强T细胞活化的能力的研究结果图。图5A：在0.67μg/mL抗PD-L1抗体或IgG对照存在下，将CD4 T细胞与同种异体成熟树突状细胞(DC)共培养。图5B：在0.2μg/mL的各种抗PDL1/IL10融合蛋白(或IL10-Fc对照)存在下，将CD4 T细胞与同种异体成熟树突状细胞(DC)共培养。2天后，取上清液通过ELISA分析IL-2的产生。以平均值±SD显示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F描述了在研究中获得的数据图，所述研究显示了如实施例6中所述的示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白诱导MC/9细胞增殖。将MC/9细胞与IL10-Fc和本公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白共培养3天。通过CellTiter-Glo测定测量细胞增殖。
图7A和图7B描述了在研究中获得的数据图，所述研究显示了示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白增强从活化的CD8 T细胞产生的IFNγ和粒酶B，如实施例7中所述。使用抗CD3和抗CD28活化分离的CD8 T细胞3天。活化的CD8 T细胞用IL10-Fc或抗PDL1/IL10融合蛋白处理3天，并用抗CD3触发4小时。通过ELISA测量IFNγ(图7A)和细胞毒性蛋白颗粒酶B(图7B)的水平。
图8A描述了在研究(在实施例8中描述)中获得的数据图，所述研究显示了本公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白在同源小鼠CT26肿瘤模型中起到控制肿瘤负荷的作用。一旦CT26肿瘤达到50-100mm3对小鼠进行随机分组，随后以PBS对照、IL10-Fc(3mg/kg)、抗PD-L1/TGFβR(5.8mg/kg)、抗PD-L1(4.9mg/kg)、抗CSF1R/IL10(36mg/kg)或抗PD-L1/IL10(6mg/kg)每周给药两次，共3周。测量小鼠从第0天植入肿瘤细胞后随时间变化的肿瘤体积。n＝每组7只小鼠。以平均值±SEM显示。***p<0.001，****p<0.0001。
图8B描述了在研究(在实施例8中描述)中获得的数据图，所述研究显示了公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白在同源小鼠EMT6肿瘤模型中起到控制肿瘤负荷的作用。一旦EMT6肿瘤达到50-100mm3对小鼠进行随机分组，随后以PBS对照、抗PDL1(5mg/kg)、IL10-Fc(3mg/kg)、抗PDL1/TGFβR(6mg/kg)或抗PDL1/IL10(6mg/kg)每周给药两次，共3周。测量小鼠从第0天植入肿瘤细胞后随时间变化的肿瘤体积。n＝每组7只小鼠。以平均值±SEM显示。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
本公开内容提供了抗体，包括人源化抗体，其以高亲和力特异性结合PD-L1，从而抑制、减少和/或完全阻断PD-L1的功能，其作为参与免疫调控的蛋白配体，特别是PD-L1作为免疫检查点分子PD1的配体的功能。据信，抑制PD-L1/PD1免疫检查点信号转导能够增强抗肿瘤T细胞应答。在临床试验中，PD-L1抑制剂作为单独药物施用时对患者的抗肿瘤作用有限，据信需要将这些抑制剂与其他抗肿瘤治疗方法联合使用。IL10是一种具有抗炎和CD8+ T细胞活化性质的细胞因子。强IL-10信号能够促进肿瘤特异性CD8+ T细胞增殖，使耗竭的T细胞恢复活力，从而增加T细胞的细胞毒性。本公开内容涉及抗PD-L1抗体与IL10激动剂组合的用途，包括作为与人IL10多肽融合的抗PD-L1抗体。如本文所公开的，联合抑制PD-L1以减少PD-L1/PD1信号免疫抑制，以及浓缩剂量的IL10以增强TME中的CD8+ T细胞的细胞毒性，可以为癌症治疗提供改进的治疗方法。
因此，预期包含本公开内容的抗PD-L1抗体(包括融合至IL10多肽的抗PD-L1抗体)的组合物或制剂的任一个可作为治疗由PD-L1或其靶受体蛋白PD1的功能介导的疾病(如癌症)的治疗剂。此外，预期本公开内容的抗PD-L1抗体可作为组合其他治疗剂(如活化CD8+ T细胞的抗体，和/或其他靶免疫检查点分子，包括但不限于，PD1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR和ICOS)的治疗剂。
术语和技术的概述
对于本文的说明书及所附的权利要求，单数形式“一(a/an)”及“一个(a/an)”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一蛋白”包括一个以上的蛋白，提及“一化合物”指一个以上的化合物。还应注意的是，权利要求可撰写成排除任何任选要素。因此，该陈述旨在作为与权利要求要素的陈述结合使用排他性术语如“唯一”、“仅”等，或使用“负”限制的先行基础。“包含(复数动词)”、“包含(单数动词)”、“包含(动名词)”、“包括(复数动词)”、“包括(单数动词)”以及“包括(动名词)”的使用是可互换的，且不意图进行限制。应进一步理解的是，在各种实施方式的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在某些特定情况下，实施方式可以使用“基本上由……组成”或“由……组成”的语言来替代地描述。
在提供值的范围的情况下，除非上下文另有明确规定，应理解的是该范围的上限与下限之间的该值的每个中间整数以及该值的每个中间整数的每十分之一(除非上下文另有明确规定)，以及该规定范围内的任何其他规定或中间值，都包含于本发明内。这些较小范围的上限与下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含于本发明内，但受该规定范围内的任何特别排除的限制。在该规定范围包括这些限值中的一个或两个的情况下，排除这些包括的限值中的(i)任一或(ii)两者的范围也包括在本发明中。例如，“1至50”包括“2至25”、“5至20”、“25至50”、“1至10”等。
通常，本文使用的命名法及本文描述的技术和程序包括本领域技术人员充分理解和通常使用的这些，例如Sambrook等人，分子克隆-实验室指南(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第2版)，第1-3卷，冷泉港(Cold Spring Harbor)实验室，冷泉港，纽约，1989年(以下称“Sambrook”)；分子生物学现行规范(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等人编辑，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons,Inc.联合企业(补充至2011年)(以下称“Ausubel”)；抗体工程 (Antibody Engineering)，第1和2卷，R.Kontermann和S.Dubel编辑，Springer-Verlag，柏林与海德堡(2010年)；单克隆抗体：方法与规范(Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols)，V.Ossipow和N.Fischer编辑，第2版，Humana出版社(2014年)；治疗性抗体：从 实验室至临床(Therapeutic Antibodies:From Bench to Clinic)，Z.An编辑，J.Wiley&Sons,Hoboken，N.J.(2009年)；以及噬菌体展示技术(Phage Display)，Tim Clackson和Henry B.Lowman编辑，牛津大学出版社，英国(2004年)中描述的常用技术及方法。
本发明中引用的所有出版物、专利、专利申请以及其他文献出于所有目的通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文献被单独指出出于所有目的通过引用在此并入。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术及科学术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。应当理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式，而非意图是限制性的。出于解释本公开的目的，以下对术语的描述将适用，并且在适当的情况下，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。
如本文所用，“PD-L1”(或“PDL1”)指跨膜蛋白、程序性死亡配体1，并且如本文所用，涵盖人、食蟹猴、小鼠的PD-L1蛋白和这些蛋白的任何亚型。各种示例性PD-L1蛋白的氨基酸序列在本领域中是公知的，并且在下表1和所附序列表中提供。
如本文所用，“PD-L1介导的病况”或“PD-L1介导的疾病”包括与PD-L1同受体和免疫检查点分子PD1(或“PD-1”)特异性结合相关的任何医学病况。例如，PD-L1与T细胞上的PD1的特异性结合可以作为免疫应答的一部分抑制其活化。因此，PD-L1介导的疾病可以包括但不限于由PD-L1和/或PD1的拮抗剂或抑制剂介导和/或响应的任何疾病或病况，包括但不限于癌症。
如本文所用，“IL10”或“IL-10”指细胞因子白介素10，其也称作细胞因子合成抑制性因子(CSIF)，并且旨在还包括保留其细胞因子功能的白介素10的天然变体、工程化变体和/或合成修饰形式。下表2和所附序列表中提供了各种示例性IL10多肽和重组IL10融合构建体的氨基酸序列。保留细胞因子功能的其他示例性工程化和/或修饰的IL10多肽是本领域公知的(参见例如，US 7,749,490 B2；US 2017/0015747 A1；Naing,A.等，“PEGylatedIL-10(Pegilodecakin)Induces Systemic Immune Activation,CD8+ T CellInvigoration and Polyclonal T Cell Expansion in Cancer Patients.”Cancer Cell34,775-791.e3(2018)；Gorby,C.等，“Engineered IL-10 variants elicit potentimmunomodulatory effects at low ligand doses.”Sci Signal 13,(2020)；Yoon,S.I.等，“Epstein-Barr virus IL-10 engages IL-10R1 by a two-step mechanism leadingto altered signaling properties.”J Biol Chem 287,26586-26595(2012)。
如本文所用，“融合蛋白”指以非天然存在的构型连接(或“融合”)的两个或更多个蛋白和/或多肽分子。本公开内容的示例性融合蛋白包括“IL10-Fc”融合蛋白，其包含通过在其C末端的多肽接头序列与免疫球蛋白Fc区多肽共价连接的IL10多肽。本公开内容的融合蛋白还包括“抗体融合物”，其包含全长IgG抗体(具有重链和轻链多肽)，其通过在其重链C末端的多肽接头序列共价连接至IL10多肽。
如本文所用，“多肽接头”或“接头序列”指由两个或更多个氨基酸组成的链，该链的每一端共价连接到不同的多肽分子，从而起到缀合或融合不同多肽的作用。通常，多肽接头包含5至30个氨基酸的多肽链。广泛的多肽接头在本领域中是公知的，并且可以用于本公开内容的组合物和方法中。在本公开内容的组合物和方法中包括的示例性多肽接头包括(GGGGS)n、(SSSSG)n、(GGGG)(SGGGG)n、(EAAAK)n、(XP)n、ENLYFQ(-G/S)，通常，其中n为2至6，以及如在本文其他地方公开的其他特定接头序列。
如本文所用，“抗体”指包含一个或多个多肽链的分子，其特异性结合特定抗原或与特定抗原具有免疫反应性。本公开内容的示例性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体、多特异性抗体(如，双特异性抗体)、单价抗体(如，单臂抗体)、多价抗体、抗原结合片段(如，Fab'、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)和合成抗体(或抗体模拟物)。
“抗PD-L1抗体”或“结合PD-L1的抗体”指以足够的亲和力结合PD-L1的抗体，使得该抗体可用作靶向PD-L1的治疗和/或诊断剂。在一些实施方式中，抗PD-L1特异性抗体与不相关的非PD-L1抗原的结合程度小于该抗体与PD-L1的结合的约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％，如通过例如放射免疫测量法(RIA)或表面等离子体共振法(SPR)测量的。在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体具有<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<1pM(如，10-8M或以下，如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”在本文中可互换使用，指具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“抗体融合物”指与多肽或蛋白共价缀合(或融合)(通常经由抗体轻链(LC)或重链(HC)末端的接头)的抗体。本公开内容的示例性抗体融合物包括通过从抗体重链的C末端到IL10多肽的N末端的15个氨基酸多肽接头(例如，SEQ ID NO：74)与重组IL10多肽融合的抗PD-L1抗体。抗体融合物在本文中用“抗体/多肽”命名法标记以指示融合组分，如“Ab/IL10”或“抗PD-L1/IL10”。如本文别处所述，本公开内容的抗体融合物可以包含全长IgG抗体，其包含重链-轻链对的二聚复合物，其中每个重链C末端通过多肽接头序列连接至IL10多肽。
“抗体片段”指全长抗体的一部分，其能够与全长抗体结合相同的抗原。抗体片段的实例包括但不限于，Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab’)2、双体抗体、线性抗体、单价或单臂抗体、单链抗体分子(如，scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类别”指其重链具有的恒定域或恒定区的类型。有五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的结构域，其参与抗体与抗原的结合。天然抗体的重链及轻链的可变域(分别VH及VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)及三个高变区(HVR)(参见，如Kindt等，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合该抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库(参见，如Portolano等，J.Immunol.150:880-887(1993年)；Clarkson等，Nature 352:624-628(1991年))。
如本文所用，“高变区”或“HVR”指抗体可变域的各区域，其在序列中是高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然抗体包含具有六个HVR的四条链；在重链可变域中三个，VH(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)，和在轻链可变域中三个，VL(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基。多种高变区划界正在使用中，并涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性，且是最常使用的(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991年))。Chothia相反地指结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987年))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并由Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件使用。“接触”高变区是基于对可得的复合晶体结构的分析。下表列出在这些系统下定义的高变区残基范围。
Figure BDA0003824125300000271
Figure BDA0003824125300000281
除了上述系统之外，可使用国际ImMunoGeneTics信息系统识别HVR和CDR，该系统称作IMGT/V-Quest，描述于Brochet,X.等人，Nucl.Acids Res.36，W503-508(2008年)，PMID：18503082；且在www.imgt.org/IMGT_vquest/input上可供在线使用。IMGT/V-Quest使用IMGT独特编号分析与最接近种系V基因可变区核苷酸序列的比对，以识别HVR和CDR。
如本文所用，高变区(HVR)可包括如下的延伸或可选高变区：VH结构域中的27-32、27-36、24-34或24-38(HVR-L1)；50-52、54-56、50-56或54-60(HVR-L2)；89-97或93-101(HVR-L3)；26-33、26-35或31-35(HVR-H1)；51-58、50-61或50-66(H2)；以及97-110、97-112、99-110或99-112(H3)。针对这些定义的每一者，可变域残基依据Kabat等人(同上)编号。
如本文所用，“互补决定区”或“CDR”指可变域的HVR内具有最高序列变异性和/或参与抗原识别的区域。通常，天然抗体包含具有6个CDR的四条链；在重链可变域中三个，VH(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，和在轻链可变域中三个，VL(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。示例性CDR存在于以下可变域氨基酸残基位置处：24-34、27-32、27-36、24-38(CDR-L1)；50-56、50-52、54-56或54-60(CDR-L2)；89-97或93-101(CDR-L3)；31-35或26-33(CDR-H1)；50-66或51-58(CDR-H2)；以及99-112、99-110、97-112或97-110(CDR-H3)。
“框架区”或“FR”指HVR残基之外的可变域残基。可变域的FR通常由四个结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
除非另有说明，在HVR、CDR、FR和可变结构域中的其他残基的残基位置在本文中依据Kabat等人(同上)编号。
“天然抗体”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链所组成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称作可变重链结构域或重链可变域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称作可变轻链结构域或轻链可变域，接着是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体的轻链可分配为两种类型中的一种，称作kappa(κ)和lambda(λ)。
如本文所用，“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体外(例如，变体抗体含有天然发生的突变或在单克隆抗体的产生过程中产生的突变，并且通常以少量存在)。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，术语“单克隆”表示抗体如从基本上同质的抗体群体获得的特征，并且不解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，待使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于，杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了制备单克隆抗体的此类方法以及其他示例性方法。
“嵌合抗体”指其中一部分重链和/或轻链源自特定来源或物种，而该重链和/或轻链的其余部分源自不同的来源或物种的抗体。
“人源化抗体”指包含来自非人类HVR的氨基酸序列和来自人类FR的氨基酸序列的嵌合抗体。在特定实施方式中，人源化抗体包含至少一个，且通常两个可变域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR对应于非人抗体的那些HVR，且全部或基本上全部FRs对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(如非人抗体)的“人源化形式”指已经历人源化的抗体。
“人抗体”指具有对应于由人或人细胞产生的，或源自使用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义特别地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列是选自可变域序列的亚组。通常，该序列亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIHPublication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方式中，针对VL，该亚组为如Kabat等人(同上)中的亚组κI。在一个实施方式中，针对VH，该亚组为如Kabat等人(同上)中的亚组III。
如本文所用，“受体人框架”为包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或可包含氨基酸序列变化。在一些实施方式中，氨基酸变化的数量为10或以下、9或以下、8或以下、7或以下、6或以下、5或以下、4或以下、3或以下或者2或以下。在一些实施方式中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“Fc区”指包含免疫球蛋白重链的C端多肽序列的二聚体复合物，其中C端多肽序列为可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体而获得的序列。Fc区可包含天然或变体Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可以变化，但人IgG重链Fc序列通常定义为从大约Cys226位的氨基酸残基或从大约Pro230位延伸至Fc序列的羧基末端。然而，Fc序列的C端赖氨酸(Lys447)可存在或不存在。免疫球蛋白的Fc序列通常包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域。
“Fc受体”或“FcR”指结合抗体Fc区的受体。在一些实施方式中，FcR为天然人类FcR。在一些实施方式中，FcR为结合IgG抗体(γ受体)的FcR，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列，主要差别在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见，例如Daeron，Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997年))。如本文所用，FcR也包括新生受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.1 17:587(1976年)及Kim等，J.Immunol.24:249(1994年))和调控免疫球蛋白的内稳态。FcR综述于诸如，Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991年)；Capel等，Immunomethods 4:25-34(1994年)；以及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995年)中。
“多特异性抗体”为具有至少两个不同结合位点的抗体，每个位点具有不同结合特异性。多特异性抗体可为全长抗体或抗体片段，且不同结合位点可各自结合不同抗原，或不同结合位点可结合同一抗原的两个不同表位。
“Fv片段”指含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。这一区域由紧密结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成，该紧密结合在性质上可为共价的，例如在scFv中。在此构形中，每一可变域的三个HVR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个HVR或其子集共同赋予该抗体抗原结合特异性。然而，即使单一可变域(或包含仅三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)具有识别与结合抗原的能力，虽然通常其亲和力低于整个结合位点。
“Fab片段”指含有轻链的可变和恒定结构域及重链的可变域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。“F(ab’)2片段”包含一对Fab片段，其通常通过其之间的铰链半胱氨酸在羧基端附近共价连接。抗体片段的其他化学偶联在本领域中也是已知的。
如本文所用，“抗原结合臂”指具有特异性结合感兴趣的靶分子的能力的抗体组分。通常，抗原结合臂为免疫球蛋白多肽序列(如，免疫球蛋白轻链和重链的HVR和/或可变域序列)的复合物。
“单链Fv”或“scFv”指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。
“亲和力”指分子(如，抗体)的单个结合位点与其结合伴体(如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。“结合亲和力”指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(如，抗体和抗原)之间的1：1相互作用。分子X对其伴体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量结合亲和力的具体说明性及示例性实施方式以下描述。
“特异性地结合”或“特异性结合”指抗体与抗原以不超过约1×10-7M的亲和力值的结合。在一些实施方式中，抗体对其特异性结合的抗原以外的抗原可具有二级亲和力，其中“二级亲和力”通常指如本文另外所述的抗体与二级抗原以大于约10nM的亲和力值结合。在抗体可对二级抗原具有二级亲和力的情况下，这种抗体仍与一级抗原特异性结合。
“分离的抗体”指与其自然环境的组分分离的抗体。在一些实施方式中，抗体纯化至纯度大于95％或99％，如通过例如电泳法(如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析法(如，离子交换或反相HPLC)测定的。有关用于抗体纯度评估的方法的综述，参见，例如Flatman等，J.Chromatogr.B 848:79-87。
“效应功能”是指归因于抗体Fc区的生物学活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
“免疫缀合物”指与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“治疗(名词)”、“治疗(动词)”或“治疗(动名词)”指试图改变所治疗个体的病症的自然进程的临床干预，并可进行用于预防或在临床病理学过程中进行。期望的治疗结果可包括，但不限于，预防病症的发生或复发、减轻症状、减少病症的任何直接或间接的病理后果、预防转移、降低进展速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。例如，治疗可包括对受试者施用治疗有效量的包含抗PD-L1抗体的药物制剂，以延迟通过PD-L1和/或其与PD1或其他配体的结合介导的疾病或病症或者其中PD-L1可在病理发生和/或进展中发挥作用的疾病或病症的发生或减慢其进展。
“药物制剂”指允许活性成分的生物学活性有效的形式的制备物，且其不含对施用该制剂的受试者具有毒性的另外的组分。药物制剂可包括一种或多种活性剂。例如，药物制剂可包括抗PD-L1抗体作为制剂的唯一活性剂，或可包括抗PD-L1抗体及一种或多种另外的活性剂、免疫激活剂(如IL10)或免疫检查点分子的抑制剂。
如本文所用的，“唯一活性剂”指药物制剂中的活性剂，其为提供或预期提供相关药理作用以治疗受试者的所治疗病症的该药物制剂中存在的仅有活性剂。包含唯一活性剂的药物制剂不排除在该制剂中存在一种或多种非活性剂，例如，药学上可接受的载体。“非活性剂”为预期不提供或以另外的方式明显有助于旨在治疗受试者病症的相关药理学作用的药剂。
“药学上可接受的载体”指药物制剂中活性成分以外的成分，其对所施用的受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“免疫检查点分子”指功能在于调节免疫系统途径并由此防止其不必要地攻击细胞的分子。许多免疫检查点分子(抑制性和共刺激性)是用于治疗癌症和病毒感染的免疫疗法(如，以阻断抗体阻断免疫抑制或以激动剂促进免疫刺激)的靶标。癌症免疫疗法所靶向的示例性免疫检查点分子包括但不限于，PD1、PD-L1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、ICOS。
“治疗上有效量”指实现期望的治疗或预防结果(例如，治疗或预防受试者的疾病、障碍或病症)的活性成分或活性剂(如，药物制剂)的量。在PD-L1介导的疾病或病症的情况中，治疗剂的治疗有效量是在一定程度上减轻、预防、抑制和/或缓解与疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状的量。对于癌症治疗，体内功效可以，例如，通过评估原发性肿瘤的生长、继发性肿瘤的发生和/或生长、转移的发生和/或数量、症状的持续时间、严重程度和/或复发、反应率(RR)、反应持续时间和/或生活质量来测量。
如本文所用，“同时”指施用两种或更多种治疗剂，其中至少一部分施用在时间上重叠。因此，同时施用包括在停止施用一种或多种其他药剂后继续施用一种或多种药剂的给药方案。
“个体”或“受试者”指哺乳动物，包括但不限于，驯养的动物(如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(如，人类和非人类灵长动物，如猴子)、兔和啮齿动物(如，小鼠和大鼠)。
各个实施方式的详细描述
I.PD-L1和PD1
人PD-L1(本文也称为“huPD-L1”或“hPD-L1)的序列和注释可在UniProt条目Q9NZQ7中找到，hPD-L1的全长290个氨基酸的亚型1序列如SEQ ID NO：173中所示。在本文他处所述的实施例中，使用SEQ ID NO：174的更短重组人PD-L1.ECD区段。
食蟹猴PD-L1(本文中也称为“cynoPD-L1”)的序列和注释可见NCBI参考序列XP_015292694.1/XP_014973151.1。在本文他处所述实施例的结合测定中使用SEQ ID NO：176的更短重组cyno PD-L1.ECD区段。
人PD1(其为人PD-1的同源受体)的序列和注释可见UniProt条目Q8IX89。本文他处所述实施例中使用SEQ ID NO：175的更短重组人PD1.ECD区段。
下表1提供了本公开内容使用的PD-L1和PD1蛋白和重组构建体的序列，以及其序列标识符的概述。序列还包含在所附的序列表中。
表1：PD-L1和PD1序列
Figure BDA0003824125300000351
II.IL10
人IL10细胞因子是两个178个氨基酸多肽亚基的同源二聚体蛋白。IL10通过由两个IL10受体1(IL-10Rα亚基)和两个IL10受体2(IL-10Rβ亚基)蛋白组成的受体复合物发出信号。因此，功能性受体由四个IL10受体分子组成。IL10与IL-10Rα的结合通过JAK1和Tyk2对IL10受体的胞质尾部的磷酸化来诱导STAT3信号转导。IL10主要由单核细胞产生，在较小程度上由淋巴细胞产生，即II型T辅助细胞(TH2)、肥大细胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞以及某些活化的T细胞和B细胞亚群。IL10可由单核细胞在PD1触发时产生。下表2提供了本发明实施例中使用的人IL10多肽和重组IL10-Fc融合构建体的氨基序列及其序列标识符的概述。序列还包含在所附的序列表中。
表2：重组IL10多肽和多肽接头
Figure BDA0003824125300000361
除了天然存在的人IL10之外，本领域已知多种保留IL10的细胞因子功能的工程化和/或合成修饰的IL10多肽。聚乙二醇化的IL10，Pegilodecakin，已被证明保留了天然存在的人类IL10的抗肿瘤免疫监视功能。参见，Naing,A.等，“PEGylated IL-10(Pegilodecakin)Induces Systemic Immune Activation,CD8+ T Cell Invigorationand Polyclonal T Cell Expansion in Cancer Patients.”Cancer Cell 34,775-791.(2018)。工程化的IL-10变体R5A11已被证明对IL10R2具有更高的亲和力，在人CD8+ T细胞中表现出增强的信号活性，并增强了CAR-T细胞的抗肿瘤功能。参见，Gorby,C.等，“Engineered IL-10variants elicit potent immunomodulatory effects at lowligand doses.”Sci Signal 13,(2020)。来自爱泼斯坦-巴尔病毒的IL-10与IL-10R1的结合较弱，但保留了人IL10的免疫抑制细胞因子活性，同时失去了对某些细胞诱导免疫刺激活性的能力。参见，Yoon,S.I.等，“Epstein-Barr virus IL-10 engages IL-10R1 by atwo-step mechanism leading to altered signaling properties.”J Biol Chem 287,26586-26595(2012)。US 7,749,490 B2和US 2017/0015747 A1描述了在MC/9细胞增殖测定中表现出较低免疫刺激活性的工程化IL10突变体(例如，F129S-IL10)。通常，预期保留一些IL10细胞因子功能的任何工程化或修饰形式的IL10多肽可用于本公开内容的任何抗PD-L1/IL10融合蛋白组合物和方法。
III.抗PD-L1抗体
在一些实施方式中，本公开内容提供了抗PD-L1抗体的结构，包括各种众所周知的免疫球蛋白特征(例如，CDR、FR、VH、VL结构域和全长重链和轻链)的氨基酸和编码核苷酸序列。下表3提供了本公开内容的抗PD-L1抗体序列的概述，包括抗体融合物，及其序列标识符。序列还包含在所附的序列表中。
表3：抗PD-L1抗体(包括抗体融合物)序列
Figure BDA0003824125300000371
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Figure BDA0003824125300000391
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1.抗PD-L1抗体结合亲和力和功能特征
在一些实施方式中，本文提供的抗PD-L1抗体以<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(如，10-8M或以下，10-8M至10-13M，如，10-9M至10-13M)的平衡解离常数(KD)结合PD-L1。
预期如本文所公开产生的各种抗PD-L1抗体包括能够与huPD-L1、cynoPD-L1以及huPD-L1和cynoPD-L1两者高亲和力结合的抗体。更具体地，在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体以1x10-8M或以下、1x10-9M或以下、1x10-10M或以下或者1x10-11M或以下的结合亲和力结合huPD-L1。在一些实施方式中，结合亲和力测量为结合SEQ ID NO：174的huPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)。在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体以1x10-8M或以下、1x10-9M或以下、1x10-10M或以下或者1x10-11M或以下的结合亲和力结合cynoPD-L1。在一些实施方式中，结合亲和力测量为结合SEQ ID NO：176的cynoPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)。在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体以1x10-8M或以下、1x10-9M或以下、1x10-10M或以下或者1x10-11M或以下的结合亲和力结合huPD-L1和cynoPD-L1两者。在一些实施方式中，结合亲和力测量为结合SEQ ID NO：174的huPD-L1多肽和SEQ ID NO：176的cynoPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)。
通常，可使用多种测定方法中的任一者测定配体与其受体的结合亲和力，并以多种定量值表示。本文实施例中公开了可用于确定抗体亲和力的特定PD-L1结合试验。此外，抗原结合试验为本领域已知，且可用于本发明中，包括但不限于，使用诸如蛋白质印迹法、放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、“夹心”免疫测定法、基于表面等离子体共振的试验(如WO2005/012359所述的BIAcore测定法)、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法、流式细胞术和荧光激活细胞分选(FACS)测定法等的技术的任何直接或竞争性结合试验。
因此，在一些实施方式中，结合亲和力以KD值表示，且反映出固有结合亲和力(如，以最小化的亲合力效应)。本公开内容的抗PD-L1抗体对SEQ ID NO：174的huPD-L1多肽呈现强的结合亲和力，例如，呈现出KD值介于10nM与1pM之间。因此，本公开内容的抗PD-L1抗体可与对PD-L1的相同或重叠表位具有较低亲和力的抗体竞争。
在一些实施方式中，本文提供的抗PD-L1抗体减少、抑制和/或完全阻断PD1与PD-L1的结合，以及由PD1与PD-L1的结合所介导的免疫调节和/或免疫信号传导，包括在肿瘤微环境(TME)中T细胞活化的抑制。利用已知的基于细胞的分析，包括本公开内容的实施例中所描述的那些试验，可在体外测定抗体抑制这些由PD1与PD-L1的结合所介导的免疫调节和免疫信号传导途径的能力。
此外，本文提供的抗PD-L1抗体包含与IL10的抗体融合物，且因此可提供由IL10激动剂活性介导的作用，包括活化肿瘤微环境中的CD8+ T细胞。与IL10的抗PD-L1抗体融合物提供IL10激动剂作用的能力可利用已知的基于细胞的分析在体外进行测定，包括本公开内容的实施例所描述的那些基于细胞的分析。
因此，在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体特征在于一项或多项下列基于减少、抑制和/或完全阻断由PD-L1所介导的细胞内信号传导的能力的功能性质。
在至少一个实施方式中，抗PD-L1抗体以1x10-8M或以下、1x10-9M或以下、1x10-10M或以下的结合亲和力结合人PD-L1；任选地其中结合亲和力通过对SEQ ID NO：174的huPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)测量。
在至少一个实施方式中，抗PD-L1抗体以1x10-8M或以下、1x10-9M或以下、1x10-10M或以下的结合亲和力结合食蟹猴PD-L1；任选地其中结合亲和力通过对SEQ ID NO：176的cynoPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)测量。
在至少一个实施方式中，抗PD-L1/IL10融合蛋白使MC/9细胞增殖增加至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％或更多。
在至少一个实施方式中，抗PD-L1/IL10融合蛋白使活化的CD8T细胞中IFNγ和颗粒酶B的产生增加至少25％、至少50％、至少100％或更多。
在至少一个实施方式中，抗PD-L1抗体在第28天测量的同源小鼠肿瘤模型中减少肿瘤体积达至少25％、至少50％、至少75％或更多，其中所述小鼠肿瘤模型选自：CT26结肠癌和EMT6乳腺癌。
2.抗PD-L1抗体片段
在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体可以是抗体片段。本公开内容的可用于结合决定簇的抗体片段包括但不限于，Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab’)2、Fv、scFv片段、单价、单结构域抗体、一臂或单臂抗体及本文所述的和本领域已知的其他片段。因此，在本公开内容的抗PD-L1抗体的一些实施方式中，抗体是选自以下的抗体片段：F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、单结构域抗体(VHH)、单臂抗体和scFv。
对于各种抗体片段的综述，参见，例如如Hudson等，Nat.Med.9:129-134(2003年)。对于scFv片段的综述，参见，例如Pluckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，vol.113，Rosenburg和Moore eds.(Springer-Verlag，New York)，pp.269-315(1994年)；也参见，WO93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。针对包含挽救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的说明，参见美国专利号5,869,046。其他单价抗体形式说明于，例如WO2007/048037、WO2008/145137、WO2008/145138和WO2007/059782中。单价、单臂抗体说明于，例如WO2005/063816中。双体抗体为具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可为双价或双特异性的(参见，例如EP0404097；WO93/01161；Hudson等，Nat.Med.9:129-134(2003年)；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993年))。
在一些实施方式中，抗体片段为单结构域抗体，其包含抗体的重链可变域的全部或一部分或者轻链可变域的全部或一部分。在一些实施方式中，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516)。
抗体片段可利用各种技术制造，包括但不限于，完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
3.嵌合、人源化和人抗PD-L1抗体
在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体是嵌合抗体。(参见，例如，美国专利号4,816,567所描述的嵌合抗体；以及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984年))。在一个实施方式中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长动物如猴子的可变区)及人恒定区。在一些实施方式中，嵌合抗体为“类别转换”的抗体，其中类别或亚类从亲本抗体的类别或亚类发生改变。预期嵌合抗体可包括其抗原结合片段。
在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体是人源化抗体。通常，非人抗体进行人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR、CDR(或其部分)是源自非人抗体，且FR(或其部分)是源自人抗体序列。人源化抗体任选地也包含至少一部分的人恒定区。在一些实施方式中，人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如，CDR残基来源的抗体)的相应残基置换，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于，如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008年)，且进一步说明于，如Riechmann等，Nature 332:323-329(1988年)；Queen等，Proc.Nat
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Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989年)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36:25-34(2005年)(描述SDR(a-HVR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28:489-498(1991年)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等，Methods 36:43-60(2005年)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等，Methods 36:61-68(2005年)和Klimka等，Br.J.Cancer,83:252-260(2000年)(描述FR改组的“指导选择”途径)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于，使用“最适化(best-fit)”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等J.Immunol.151:2296(1993年))；源自特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体共有序列的框架区(参见，例如，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992年)；以及Presta等，J.Immunol,151:2623(1993年))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008年))；以及源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997年)及Rosok等，J.Biol.Chem.271:2261 1-22618(1996年))。
在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体可以是人抗体。可以使用本领域公知的各种技术生产人抗体。人抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001年)及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008年)中。可通过对转基因动物施用免疫原制备人抗体，该转基因动物经修饰以响应于抗原性攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常被灭活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125(2005年)。亦参见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584中的XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429中的
Figure BDA0003824125300000581
技术；美国专利号7,041,870中的K-M
Figure BDA0003824125300000582
技术；以及美国专利申请公开号2007/0061900中的
Figure BDA0003824125300000583
技术。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可进一步修饰，如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法产生。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系已有描述。参见，例如，Kozbor J.Immunol,133:3001(1984年)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.，New York，1987年)；以及Boerner等，J.Immunol.,147:86(1991年)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006年)中。另外的方法包括描述于，例如，美国专利号7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)中的那些。人杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)还描述于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005年)及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005年)中。
还可通过分离Fv克隆可变域序列(其选自人来源的噬菌体展示文库)产生人抗体。此类可变域序列可随后与所需的人恒定域组合。从抗体文库选择人抗体的技术描述如下。
4.文库来源的抗PD-L1抗体变体
在至少一个实施方式中，通过筛选组合文库中具有所需改善的功能特性(如，结合亲和力或交叉反应性)的抗体，可分离改善的抗PD-L1抗体的变体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库和筛选此类文库中具有改善的结合特性的变体抗体的多种方法。其他用于产生此类文库来源的抗体的方法可于，如Hoogenboom等，Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等编著，Humana Press，Totowa，NJ，2001年)；McCafferty等，Nature 348:552-554；Clackson等，Nature 352:624-628(1991年)；Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992年)；Marks和Bradbury，m Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ，2003年)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004年)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004年)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004年)；以及Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2):1 19-132(2004年)中发现。
5.多特异性抗体和抗体融合物
在至少一个实施方式中，考虑到本公开内容的抗PD-L1抗体可为多特异性抗体，如，双特异性抗体。在一些实施方式中，多特异性抗体具有至少两个不同的结合位点，每一个具有对不同抗原的结合特异性，其中至少一个特异性地结合PD-L1。在至少一个实施方式中，考虑到多特异性抗体为包含对PD-L1的特异性和对另一介导免疫调节、免疫信号传导和/或在癌症或肿瘤细胞上表达的抗原的特异性的双特异性抗体。例如，另一特异性可针对免疫检查点分子，如PD1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR或ICOS。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，例如，Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983年)、WO93/08829和Traunecker等，EMBOJ.10:3655(1991年))。“杵-臼(Knob-in-hole)”工程还可用于产生可用于本公开内容的抗PD-L1抗体的双特异性抗体。杵-臼工程的技术为本领域中已知，且描述于，如美国专利号5,731,168中。
多特异性抗体还可通过对有利于形成Fc杂二聚体抗体分子而非同型二聚体的“静电转向(electrostatic steering)”效应工程化(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等，Science,229:81(1985年))；利用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol,148(5):1547-1553(1992年))；利用“双体抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993年))；利用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如，Gruber等，J.Immunol,152:5368(1994年))；或三特异性抗体(参见，例如，Tutt等，J.Immunol.147:60(1991年))来制备。
在至少一个实施方式中，本文提供的抗PD-L1抗体可以包含与蛋白的抗体融合物。抗体融合物或融合蛋白的制备和使用方法在本领域中是众所周知的，并且在包括实施例在内的本文其他地方进行了描述。通常，抗体通过多肽接头(包含5-30个氨基酸的链)与蛋白共价缀合(或融合)。通常，接头与抗体重链(HC)恒定区的C末端缀合，但是，也可以通过N末端缀合，或者与抗体轻链(LC)的任一端缀合。还可以用各种抗体片段制备抗体融合物，其中这些片段包含与抗原特异性结合所需的CDR。
在至少一个实施方式中，本公开内容的抗体融合物可以包括在轻链或重链末端缀合至多肽接头序列的全长抗PD-L1抗体，所述多肽接头序列在其另一端缀合至T细胞活化或免疫刺激细胞因子。细胞因子可以包括，但不限于，IL2、IL7、IL10、IL12、IL15、IL21或IFN-α。此类抗PD-L1抗体融合物可以阻断PD-L1/PD1信号介导的活性，并提供免疫刺激性细胞因子效应。此类抗PD-L1/细胞因子抗体融合物提供免疫刺激细胞因子效应的能力可以使用已知的与细胞因子相关的基于细胞的测定法在体外测定，包括实施例中描述的那些。
如本文其他地方所述，本公开内容的抗体融合物可以包括全长IgG抗体，其包含重链-轻链对的二聚复合物，其中每条重链的C末端通过多肽接头序列连接至IL10多肽。在一个示例性实施方式中，本公开内容的抗体融合物可以包含通过从抗体重链的C末端到IL10多肽的N末端的15个氨基酸多肽接头(例如，SEQ ID NO：74)与重组IL10多肽融合的抗PD-L1抗体。在实施例中进一步描述和表征了许多此类示例性抗PD-L1/IL10抗体融合物的PD-L1结合和免疫刺激性IL10效应。
6.抗PD-L1抗体的变体
在一些实施方式中，预期本公开内容的抗PD-L1抗体的变体具有改善的特性，如抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。可通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备变体。此类修饰包括，例如，在抗体的氨基酸序列内残基的删除和/或插入和/或置换。可进行删除、插入和置换的任意组合以得到最终的构建体，只要该最终的构建体具有所需的PD-L1抗原结合的特性。
A.置换、插入和缺失变体
在一些实施方式中，除了本文所述的那些，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗PD-L1抗体变体。用于诱变的位点可包括HVR和FR。典型的“保守”氨基酸置换和/或基于共同的侧链类别或性质的置换为本领域中公知的，且可在本公开内容的实施方式中使用。本公开内容还考虑基于非保守氨基酸置换的变体，其中氨基酸侧链类别之一的成员交换为另一类别的氨基酸。氨基酸侧链通常依据下列类别或共同特性进行分组：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、正亮氨酸；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)链取向影响：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。本领域公知用于将氨基酸置换到抗体中和随后筛选所需功能的技术，例如，保持/改善的抗原结合、降低的免疫原性或者改善的ADCC或CDC。
氨基酸置换变体也可包括具有在亲本抗体的高变区中一个或多个置换的变体。通常，相对于亲本抗体，选择用于进一步研究的所得变体具有特定生物学特性的改变(如，亲和力增加、免疫原性降低)，和/或保留亲本抗体的特定生物学特性。示例性的置换变体为亲和力成熟的抗体，其可利用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基发生突变，且变体抗体在噬菌体上展示并针对特定生物学活性(如，结合亲和力)进行筛选。
用于鉴定可靶向用于诱变的抗体残基或区域的一种有用的方法为“丙氨酸扫描诱变”(参见，例如，Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085)。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(如，带电的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(如，Ala或聚丙氨酸)替代以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在表明对初始置换的功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的置换。可选地或另外地，可确定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可被靶向或消除以作为置换的候选。可筛选变体以确定其是否包含所需的特性。
可制备的氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合体，其长度范围为一个残基至含有一百个或以上残基的多肽，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体可包括抗体的N末端或C末端与酶或多肽(其增加抗体血清半衰期)的融合物。
可在HVR中进行其他残基置换以改善抗体亲和力。此类改变可在“热点”中进行，即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008年))，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。在一个实施方式中，可以通过构建并从二级文库中再筛选进行亲和力成熟(参见，例如，Hoogenboom等，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等编著，Human Press，Totowa，NJ(2001年))。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向途径，其中将数个HVR残基(如，一次4-6个残基)随机化。利用诸如丙氨酸扫描诱变或建模，可特别地鉴定出参与抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向HVR-H3和HVR-L3。通常，可在一个或多个HVRs内进行置换、插入或删除，只要此类改变不实质上降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(如，本文提供的保守性置换)。此类改变可在HVR“热点”之外。
在一些实施方式中，考虑到本文所述的抗PD-L1抗体可在特定非HVR位置以半胱氨酸残基置换，从而产生反应性巯基。此类工程化的“thioMAbs”可用于将抗体与，如，药物部分或接头-药物部分缀合，从而产生免疫缀合物，如本文他处所述。半胱氨酸工程抗体的产生可如在例如美国专利号7,521,541中所述。在一些实施方式中，下列抗体残基中的任一个或多个可以用半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。
B.糖基化变体
在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体经改变以增加或减少该抗体糖基化的程度。通过改变氨基酸序列可进行抗体糖基化位点的添加或删除，从而产生或移除一个或多个糖基化位点。在其中抗体包含Fc区的实施方式中，可改变连接至Fc区的糖。通常，由哺乳动物细胞产生的天然抗体包含分支的双触角寡糖，该寡糖通过N-连接附接于Fc区CH2结构域的约297位的天冬酰胺(“N297”)(参见，例如，Wright等，TIBTECH 15:26-32(1997年))。寡糖可包括各种碳水化合物，如甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中连接至GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方式中，抗体Fc区寡糖的修饰可产生具有某些改善的特性的变体。
在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体可为包含缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的糖结构的变体。例如，岩藻糖在这种抗体中的量可为约1％至约80％、约1％至约65％、约5％至约65％或约20％至约40％。岩藻糖的量可通过计算相对于N297处连接的所有糖-结构(如复杂、杂合和高级甘露糖结构)的总和，连接至残基N297的糖链中岩藻糖的平均量而确定，如通过MALDI-TOF质谱测量的(参见，例如，WO 2008/077546)。
在一些实施方式中，岩藻糖基化变体可提供变体抗体的改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US 2003/0157108或US 2004/0093621。“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺失”抗体的实例及制备其的相关方法公开于，例如，US2003/0157108；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2000/61739；WO2001/29246；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004年)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004年)。可用于产生去岩藻糖基化抗体的细胞系包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Led 3 CHO细胞(参见例如，Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986年)；US2003/0157108和WO2004/056312)，及敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004年)；Kanda,Y.等，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
C.Fc区变体
在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体在Fc区中可包含一个或多个氨基酸修饰(即Fc区变体)。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸残基位置处含有氨基酸置换的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。本领域已知的可用于本公开内容的抗PD-L1抗体的广泛Fc区变体说明如下。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体为具有改变的效应功能的Fc区变体。在一些实施方式中，效应功能改变的抗体具有一些(但并非全部的)效应功能，具有降低的效应功能，或没有亲本抗体的任何一种效应功能(例如，无效应子)。针对其中效应功能(如ADCC)不需要或有害的和/或抗体的体内半衰期重要的特定应用，更需要无效应Fc区变体。具有降低的效应或无效应功能的Fc区变体抗体可由下列Fc区位置的一个或多个处的氨基酸置换所得到：238、265、269、270、297、327和329(参见，例如，美国专利号6,737,056)。此类Fc区变体可包括在位置265、269、270、297和327的两个或更多个处的氨基酸置换。此类Fc区变体也可包括残基265和297两者置换为丙氨酸的置换(参见，例如，美国专利号7,332,581)。
一些Fc区变体能够提供改善或减弱的对FcR的结合(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001年))。一些能提供改善的ADCC的Fc区变体包含一个或多个氨基酸置换，如Fc区的位置298、333和/或334(基于EU编号)处。具有改变的(即，改善或减弱的)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的Fc区变体如，例如，美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie等，J.Immunol.164:4178-4184(2000年)中描述。
一些Fc区变体能提供增加的半衰期和对新生Fc受体(FcRn)的改善的结合，公开于例如，US2005/0014934A1(Hinton等)中。此类Fc区变体包含位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424和434的一个或多个处的氨基酸置换。其他具有增加的半衰期的Fc区变体包括在位置252、254和256处的YTE突变组(即，M252Y/S254T/T256E)，例如，US 7658921B2(Dall’Acqua等)中描述的。Fc区变体的额外实例可在，例如，美国专利号5,648,260和5,624,821；以及WO94/29351中找到。
通常，可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认Fc区变体中CDC和/或ADCC活性的降低/耗减。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom等，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986年))及Hellstrom等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985年)；5,821,337(参见，Bruggemann,M.等，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987年))中。或者，可使用非放射性测定法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.，Mountain View，CA；以及
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非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI)。此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或另外地，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如，在动物模型中，如Clynes等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998年)中公开的。也可进行Clq结合测定以确认抗体无法结合Clq，从而缺乏CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的Clq和C3c结合ELISA。为评估补体激活，可进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202:163(1996年)；Cragg,M.S.等，Blood101:1045-1052(2003年)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie，SW 103:2738-2743(2004年))。FcRn结合和体内清除率/半衰期的测定可利用本领域中已知的方法进行(参见，例如，Petkova等，Intl.Immunol.18(12):1759-1769(2006年))。
D.非蛋白抗体衍生物-免疫缀合物
在一些实施方式中，本公开的抗PD-L1抗体可进一步用非蛋白质部分修饰(即，衍生化)。适合于抗体衍生化的非蛋白质部分包括但不限于，水溶性聚合物，例如：聚乙二醇(PEG)、乙二醇和丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸均聚物或无规共聚物及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。在一些实施方式中，可利用甲氧基-聚乙二醇丙醛进行抗体的修饰。聚合物可为任何分子量的，且可为分支或非分支的。连接于抗体的聚合物的数量可变化，且如果连接超过一个聚合物，其可为相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于包括但不限于以下的考虑因素确定：抗体的特定性质或功能，例如，抗体衍生物是否在规定的条件下用于治疗。
在一些实施方式中，本公开内容的抗PD-L1抗体也可为免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含与一个或多个细胞毒性剂缀合的抗PD-L1抗体。本公开内容考虑的合适细胞毒性剂包括化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。在一些实施方式中，免疫缀合物为抗体-药物缀合物(ADC)，其中本文所述的抗PD-L1抗体与一个或多个药物缀合。在一些实施方式中，本公开内容的免疫缀合物包含缀合至用于治疗PD-L1介导的疾病或病症的药物或治疗剂的本文所述的抗PD-L1抗体。
在一些实施方式中，本文所述的抗PD-L1抗体可缀合至酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆素素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类。
在一些实施方式中，本公开内容的免疫缀合物包含缀合至放射性同位素的本文所述的抗PD-L1抗体(即，放射缀合物)。许多放射性同位素可用于产生此类放射缀合物。实例包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素。在一些实施方式中，免疫缀合物可包含用于闪烁显影检测的放射性同位素，或用于NMR检测或MRI的自旋标记。适合的放射性同位素或自旋标记可包括例如123I，131I，111In，13C，19F，15N，17O，Gd、Mn和Fe的各种同位素。
抗PD-L1抗体与细胞毒性剂的免疫缀合物可使用适合于与蛋白质缀合的多种公知双功能试剂和化学作用制造。此类试剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚胺基硫烷(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(例如，二甲基己二亚酰胺化物HQ)、活性酯类(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(例如，戊二醛)、双叠氮基化合物(例如，双-(对叠氮基苯甲酰基)-己二胺)、双重氮衍生物(例如，双-(对重氮基苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如，甲苯-2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。用于制备本公开内容免疫缀合物的试剂也可包括市售“交联”试剂，例如：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(参见例如，Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
IV.重组方法和组合物
本公开内容的抗PD-L1抗体可使用抗体生产领域中公知的重组方法和材料产生。在一些实施方式中，本公开内容提供编码抗PD-L1抗体的分离的核酸。该核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方式中，提供一个或多个包含编码本公开内容的抗PD-L1抗体的核酸序列的载体(例如，表达载体)。在一些实施方式中，提供包含编码本公开内容的抗PD-L1抗体的核酸序列的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞用包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸序列的载体转化。在另一实施方式中，宿主细胞用包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体转化。
在重组方法的一些实施方式中，所使用的宿主细胞为真核细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20)。在一个实施方式中，提供制备抗PD-L1抗体的方法，其中该方法包括在适于抗体表达的条件下培养如前面所提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
简言之，通过分离编码抗体的核酸(例如，本文所述的)并将此核酸插入一个或多个载体中用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达来进行抗PD-L1抗体的重组产生。此类核酸易于使用本领域公知的常规程序分离和测序(例如，通过利用能够特异性地结合编码所需抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞和培养方法为本领域中公知的，且包括原核或真核细胞。通常，在表达之后，抗体可在可溶部分中从细胞浆分离，并进一步纯化。除了原核生物以外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)为用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径经“人源化”的真菌与酵母菌株，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体(参见，例如，Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004年)，及Li等，Nat.Biotech.24:210-215(2006年))。
适合于表达本公开内容的糖基化抗PD-L1抗体的宿主细胞也可源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定出许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。植物细胞培养物也可作为宿主(参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548和7,125,978)。
可用于产生本公开内容的抗PD-L1抗体的哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(参见，例如，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980年))；骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0；由SV40转化的猴肾CVl细胞系(COS-7)；人胚胎肾细胞系(293或如，例如，Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977年)所述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(TM4细胞，如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980年)所述的)；猴肾细胞(CVl)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TR1细胞(参见，例如，Mather等，Annals N Y.Acad.Sci.383:44-68(1982年)及US 6,235,498)；医学研究委员会5(MRC 5)细胞(例如，可获自ATCC的那些，也称作CCL-171)；以及Foreskin4(FS-4)细胞(参见，例如，Vilcek等，Ann.N.Y.Acad.Sci.284:703-710(1977年)，Gardner&Vilcek.J.Gen.Virol.44:161-168(1979年)，及Pang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:5341-5345(1980年))。对于适用于抗体产生的有用哺乳动物宿主细胞系的一般综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，pp.255-268(2003年)。
V.抗PD-L1抗体的药物组合物和制剂
本公开内容还提供了包含抗PD-L1抗体的药物组合物和药物制剂。在一些实施方式中，本公开内容提供包含本文所述的抗PD-L1抗体和药学上可接受的载体的药物制剂。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体为药物组合物的唯一活性剂。可通过混合抗PD-L1抗体(其具有所需纯度)与一种或多种药学上可接受载体制备此类药物制剂。通常，此类抗体制剂可制成水性溶液(参见，例如，国专利号6,171,586和WO2006/044908)或冻干制剂(参见，例如，6,267,958)。
药学上可接受的载体通常在使用的剂量和浓度下对接受者无毒。广泛的此类药学上可接受的载体为本领域中公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编著，(1980年))。可用于本公开内容制剂的示例性药学上可接受载体可包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(如EDTA)；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
可用于本公开内容制剂的药学上可接受的载体也可包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)(参见，例如，美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968)，如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白(例如，rHuPH20或
Figure BDA0003824125300000711
Baxter International,Inc.)。
也考虑本文公开的制剂可含有除了抗PD-L1以外的活性成分，如对于施用该制剂的受试者中所治疗的特定适应症必要的。优选地，任何附加的活性成分具有与抗PD-L1抗体活性互补的活性，且所述活性不会不利地彼此影响。
如本文其他处(包括实施例)所公开的，已证明本公开内容的抗PD-L1抗体可结合IL10多肽使用以在癌症治疗中提供改善的治疗效果。因此，在一些实施方式中，本公开内容提供一种可用于治疗癌症的药物组合物或制剂，其包含PD-L1拮抗剂(如，抗PD-L1)和IL10激动剂(如IL10)。此外，将本公开内容抗PD-L1抗体用作此类药物制剂或组合物中的PD-L1拮抗剂，还考虑可以使用其他拮抗剂，包括但不限于shRNA、siRNA、miRNA、PD-L1的小分子抑制剂或其组合。可用于此类药物组合物或制剂中的PD-L1的小分子抑制剂可包括临床开发中的已知化合物，包括但不限于，AUNP12(Aurigene)、CA-170(Aurigene/Curis)和BMS-986189(Bristol-Myers Squibb)。除了本公开内容的抗PD-L1抗体外，可用于与IL10的这种组合药物组合物或制剂中的其他已知抗PD-L1抗体可包括结合PD-L1的任何已知抗体，包括癌症治疗的临床开发中的那些，如阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、洛达泊单抗、FAZ053(BAP058-hum13)和MDX-1105，在本文其他地方对其进行了描述。
如本文其他处所述的，在一些实施方式中，本公开内容提供用于组合治疗的药物组合物或制剂，其包含PD-L1拮抗剂和IL10激动剂。在一些实施方式中，此组合可作为单一药物组合物或制剂提供，其包含具有通过多肽接头(如，SEQ ID NO：74、75、76、77、78或79的接头序列)与IL10共价融合的抗PD-L1抗体的抗PD-L1抗体融合物。本文另外提供了证明此类抗PD-L1抗体融合物(例如，PHS102/IL10)及其在药物组合物中减少多种同基因小鼠癌症模型的肿瘤体积的用途的实例。
在一些实施方式中，药物组合物包含抗PD-L1抗体和用于癌症治疗的另外的活性剂，如免疫检查点抑制剂。可用于此类实施方式的免疫检查点抑制剂包括但不限于，包含对作为免疫检查点分子的抗原的特异性的第二抗体。在一些实施方式中，第二抗体包含对免疫检查点分子的特异性，该免疫检查点分子选自PD1、PD-L1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、ICOS。在至少一个实施方式中，药物组合物包含抗PD-L1抗体和另外的活性剂，其中另外的活性剂为包含对免疫检查点分子PD1的特异性的抗体。可用于本文公开的药物组合物实施方式中的包含对PD1的特异性的示例性抗体包括但不限于，派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、多塔利单抗(dostarlimab)和HX008。
在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中，活性成分可分别包埋在，例如，通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编著(1980年)中。
在一些实施方式中，制剂可为抗体和/或其他活性成分的持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有该抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型物品的形式，例如，薄膜或微胶囊。
通常，待向受试者施用的本公开内的制剂是无菌的。无菌制剂可易于使用熟知的技术制备，例如，通过无菌滤膜过滤。
VI.治疗的用途和方法
预期含有本公开内容的抗PD-L1抗体的任何组合物或制剂可用于任何方法或用途，例如，利用其特异性结合PD-L1蛋白的能力从而抑制、降低和/或完全阻断PD-L1作为参与免疫调节或信号传导的功能(特别是PD-L1特异性地结合免疫检查点分子PD1的功能)的治疗方法，从而在肿瘤微环境(TME)中抑制抗肿瘤免疫反应(例如，T细胞活化)，并促进肿瘤生长和进展。
通过抑制、降低和/或完全阻断PD-L1的免疫调节和/或免疫信号转导活性，特别是PD-L1对肿瘤进展的影响，可以潜在地治疗一系列疾病、病症和病况。疾病、病症和病况包括但不限于癌症，包括但不限于结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌或口腔癌。预期包含本公开内容的抗PD-L1抗体的任何组合物或制剂，包括与IL10多肽的抗PD-L1抗体融合物，可用于治疗任何上文所列的癌症的方法或用途。在一些实施方式中，癌症选自结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌或口腔癌。在一些实施方式中，本公开内容提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开内容的抗PD-L1抗体或者向受试者施用治疗有效量的包含本公开内容的抗PD-L1抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
如本文所公开的，包括在以下实施例中，本公开内容的抗PD-L1抗体具有降低、抑制和/或阻断PD1与PD-L1结合的能力，从而改变PD1与由PD-L1介导的免疫信号转导通路的相互作用。因此，在一些实施方式中，本公开内容提供了一种在受试者中治疗PD-L1介导的疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开内容的抗PD-L1抗体或者向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本公开内容的抗PD-L1抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。类似地，在一些实施方式中，本公开内容提供了一种在受试者中治疗通过与细胞上表达的PD-L1结合介导的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开内容的抗PD-L1抗体或者向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本公开内容的抗PD-L1抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
依据治疗方法施用抗PD-L1抗体、组合物或药物制剂提供抗体诱导的治疗效果，其保护受试者免于PD-L1介导的疾病进展和/或治疗受试者的PD-L1介导的疾病进展。在一些实施方式中，治疗方法可进一步包括施用本领域技术人员已知的一种或多种另外的治疗剂或治疗以预防和/或治疗PD-L1介导的疾病或病症。包括施用一种或多种另外的药剂的此类方法可包括组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)及单独施用，在该情况中，抗体组合物或制剂的施用可在施用另外的治疗剂之前、同时和/或之后进行。
细胞因子IL10表现出抗炎及CD8+ T细胞活化特性。强的IL-10信号可促进肿瘤特异性CD8+ T细胞增殖，使耗竭的T细胞恢复活力，从而增加T细胞的细胞毒性。因此，在至少一个实施方式中，本公开内容考虑使用PD-L1拮抗剂(例如，抗PD-L1抗体)与IL10激动剂组合的治疗方法。在至少一个实施方式中，这种组合治疗可以使用与IL10多肽的抗PD-L1抗体融合物进行。如本文所公开的，结合PD-L1抑制以降低其与PD1结合的免疫抑制作用与TME附近的集中IL10信号以增强T细胞细胞毒性可以提供改进的癌症治疗。因此，在使用本公开内容抗PD-L1抗体治疗PD-L1介导的疾病(例如，癌症)的方法的任一实施方式中，考虑抗PD-L1抗体可为如本文其他处所公开的与IL10多肽的抗体融合物(或融合蛋白)。
也考虑其他PD-L1或PD1拮抗剂可用于与IL10的这一组合治疗，包括但不限于，shRNA、siRNA、miRNA或PD-L1的小分子抑制剂，或其组合。可用于这种方法的PD-L1的小分子抑制剂可包括临床开发中的已知PD-L1抑制剂化合物，如AUNP12(Aurigene)、CA-170(Aurigene/Curis)和BMS-986189(Bristol-Myers Squibb)。此外，其他已知的PD-L1拮抗剂抗体可用于与IL10的这一组合治疗中，包括已知的阻断PD-L1的抗体，包括用于癌症治疗的临床开发中的那些，如阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、洛达泊单抗、FAZ053(BAP058-hum13)和MDX-1105。
在本公开内容的治疗方法的一些实施方式中，抗PD-L1抗体或包含抗PD-L1抗体的药物制剂通过系统性地递送药剂的任何施用方式向受试者施用，或施用至所需的靶组织。系统性施用通常指在除了直接施用至所需的靶位点、组织或器官中以外的位点处将抗体施用到受试者中的任一施用方式，以使得抗体或其制剂进入受试者的循环系统，且因此经历代谢及其他类似过程。
因此，可用于本公开内容治疗方法的施用方式可包括但不限于，注射、输注、滴注和吸入。注射施用可包括静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、脑室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、椎管内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体的药物制剂经配制，使得保护抗体免于在肠道中失活。因此，治疗方法可包括口服施用制剂。
在一些实施方式中，还提供包含本公开内容的抗PD-L1抗体的组合物或制剂作为药物的用途。此外，在一些实施方式中，本公开内容还提供包含抗PD-L1抗体的组合物或制剂在制造或制备药物，特别是用于治疗、预防或抑制PD-L1介导的疾病的药物中的用途。在进一步的实施方式中，药物用于治疗、预防或抑制PD-L1介导的疾病的方法中，包括向具有PD-L1介导的疾病的个体施用有效量的药物。在特定实施方式中，药物进一步包含有效量的至少一种另外的治疗剂或治疗。在至少一个实施方式中，另外的治疗剂或治疗为IL10激动剂，如IL10多肽，其组合抗PD-L1抗体(而非作为抗体融合物)施用。
如本文其他处所公开的，还考虑，可在具有本公开内容抗PD-L1抗体的这种药物中使用的另外治疗剂或治疗可包括但不限于，包含对免疫检查点分子的特异性的治疗性抗体，该免疫检查点分子如PD1、PD-L1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、ICOS。包含对免疫检查点分子的特异性的示例性抗体包括但不限于抗PD1抗体，其选自派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、多塔利单抗(dostarlimab)和HX008。
在进一步的实施方式中，药物用于治疗、抑制或预防受试者的PD-L1介导的疾病，如癌症，包括向受试者施用有效量的药物以治疗、抑制或预防PD-L1介导的疾病。
本公开内容的组合物和制剂中包含的抗PD-L1抗体的适宜剂量(当单独或结合一种或多种另外的治疗剂使用时)取决于所治疗的特定疾病或病症、疾病的严重程度与病程、是出于预防还是治疗目的而施用抗体、先前施用于患者的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应，及主治医师的判断。包括于本文所述的组合物和制剂中的抗PD-L1抗体可一次或通过一系列治疗适当地施用于患者。本文考虑各种给药时间表，包括但不限于，在各个时间点上的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
取决于疾病的类型和严重程度，本公开内容制剂中约1μg/kg至15mg/kg的抗PD-L1抗体为用于施用于人类受试者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。通常，抗体的施用剂量范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。在一些实施方式中，可对患者施用一个或多个约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的剂量。
剂量施用可维持数天或更久，其取决于受试者的状况，例如，施用可持续直到PD-L1介导的疾病得到充分治疗，如通过本领域已知方法确定的。在一些实施方式中，可施用初始的较高负荷剂量，接着施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。可通过常规技术和测定法监测剂量施用的治疗效果的进展。
因此，在本公开内容的方法的一些实施方式中，抗PD-L1抗体的施用包括约1mg/kg至约100mg/kg的每日剂量。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体的剂量包括至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约20mg/kg或至少约30mg/kg的每日剂量。
实施例
本公开内容的各种特征及实施方式在以下列代表性实施例中说明，其旨在说明而非限制。本领域技术人员将易于理解，特定实施例仅为如随附的权利要求中更充分描述的本发明的说明。本申请中所描述的每一实施方式和特征应理解为可与本申请内包含的每一实施方式互换和组合。
实施例1：抗PD-L1抗体和IL10融合物的产生和结合分析
本实施例说明了噬菌体展示抗体文库技术的用途，以产生本公开内容的示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白，其特异性地结合至人PD-L1和/或IL10R，并阻断PD-L1结合至PD-1的能力。
A.从噬菌体展示抗体文库中选择抗PD-L1 scFv结合物
淘选(panning)程序简述如下。首先，将人PD-L1/ECD抗原(每孔5μg，SinoBiological)在96孔板(NUNC Maxisorb免疫板)中的PBS缓冲液(pH 7.4)中在4℃下包被过夜，然后用在PBST中的5％脱脂牛奶封闭[0.1％(v/v)吐温20]1h。封闭后，将100μL浓缩噬菌体文库(PBS缓冲液中1013cfu/mL)与100μL封闭缓冲液混合，然后在轻轻摇动1h下加入每个孔中。使用PBST洗板12次，使用PBS洗板3次。结合的噬菌体每孔以100μL的0.1M HCl/甘氨酸(pH 2.2)洗脱，立即以20μL 1M Tris-碱缓冲液(pH 9.0)中和。将洗脱的噬菌体在37℃下与1mL大肠杆菌ER2738(A600 nm＝0.6)混合30min；添加氨苄西林以消除未感染的细菌。在使用氨苄西林处理30分钟后，将细菌培养基在37℃下以100μL M13KO7辅助噬菌体(共计～1011CFU)感染1h，然后加入50mL含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄西林的2X YT培养基，在37℃下剧烈摇晃过夜。挽救的噬菌体文库用20％聚乙二醇/NaCl沉淀，并重新悬浮在PBS中。将浓缩的噬菌体溶液用于下一轮淘选。
经过3-4轮选择-扩张循环后，将单个菌落随机选入96孔深培养板(板A：分泌型scFv)；每孔含有950μL 2YT(100μg/mL氨苄西林)。在37℃下振荡孵育3h后，将50μL细菌培养物转移至新鲜的96孔深板(板B：噬菌体形式)的相应孔中；每个孔含有0.8mL2YT和100μg/mL氨苄西林。同时，将50μL M13KO7(共计～5×1010CFU)添加到板B的每个孔中。孵育1h后，将100μL含有IPTG(10mM)的2YT添加到板A的每个孔中；向板B的每个孔中添加100μL含有卡那霉素(500μg/mL)的2YT。在37℃下剧烈摇动孵育过夜后，将培养物在4℃下以3000g离心10min。将板B储存用于进一步的测序测定。对于分泌型scFv培养板(板A)，将100μL培养基和100μL 5％PBST牛奶添加到预先包被有蛋白L(0.1μg/孔)、人CD36(0.5～1μg/孔)和牛血清白蛋白(BSA)(2μg/孔)，分别用5％PBST牛奶封闭。在室温下孵育1h后，使用PBST洗板3次。将100μL蛋白A-HRP(Thermo Scientific)添加到蛋白L包被的免疫板的每个孔中；将100μL抗-E-标签-HRP(ICL Inc.)添加到人PD-L1.ECD抗原包被板和BSA包被板的每个孔中。孵育1h后，将板用PBST缓冲液洗涤3次，以PBS洗涤2次，并以3,3’,5,5’-四甲基-联苯胺过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Laboratories)显色3分钟，以1.0M HCl淬灭，并在450nm处以分光光度计读取。
通过以下标准选择阳性克隆：针对人PD-L1.ECD抗原包被的孔(抗原结合阳性)，ELISA OD450>0.2；针对BSA包被的孔(非特异性结合阴性)，OD450<0.05；针对蛋白L包被的孔，OD450>0.5(可溶性scFv结合至蛋白L和蛋白A两者，以确保在溶液中的适当折叠)，随后进行DNA测序。
由噬菌体展示淘选获得的示例性抗PD-L1抗体PHS102(SEQ ID NO：162)、PHS206(SEQ ID NO：163)和PHS219(SEQ ID NO：164)的scFv的多核苷酸序列提供在表3和随附的序列表中。
为进一步增加抗PDL1抗体PHS102的亲和性，针对PHS102的个别CDR突变，建立了6个噬菌体展示文库。在第一轮淘选之后，从CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3筛选出38个独特的CDR，并组装以作为用于解离筛选的新文库。为选择具有改善的scFv解离率的噬菌体，在淘选期间通过与10、100或1000倍的hPDL1.ECD蛋白共培养以进行解离筛选。对这些由衍生自抗PD-L1抗体PHS102的变体CDR序列组成的噬菌体展示文库的进一步淘选得到以下八种示例性抗PD-L1抗体(scFv多核苷酸序列)：YT6D(SEQ ID NO：165)、YP11F(SEQ ID NO：166)、YT10H(SEQ ID NO：167)、YT7A(SEQ ID NO：170)、YT7H(SEQ ID NO：171)、YP7G(SEQ IDNO：172)、HSYPP31F(SEQ ID NO：168)和HSYPP411C(SEQ ID NO：169)。这八种抗PD-L1抗体的CDR、VH、VL、重链和轻链的氨基酸序列也列于表3和随附的序列表中。
B.全长抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合物的产生
scFv重排(reformatting)和克隆：将噬菌体展示淘选所筛选出的scFv的PD-L1结合决定子重组成全长IgG抗体，其是通过将片段的VH与VL结构域克隆至人IgG1-N297A重链载体和人κ轻链载体中，并分别使用限制性酶位点MluI/NheI和BsiWI/DraIII。使用以下正向和反向寡核苷酸引物对扩增VH和VL结构域：(1)PhageLib_VL_Fw：5’-AATCACgATgTgATATTCAAATgACCCAgAgCCCgAgC-3’(SEQ ID NO：177)，(2)PhageLib_VL_Rv：5’-AATCgTACgTTTgATTTCCACTTTggTgCCTTg-3’(SEQ ID NO：178)，(3)PhageLib_VH_Fw：5’-AATACgCgTgTCCTgTCCgAAgTgCAgCTggTggAATCg-3’(SEQ ID NO：179)，和(4)PhageLib_VH_Rv：5’-AATgCTAgCCgAgCTCACggTAACAAg-3’(SEQ ID NO：180)。
抗PD-L1/IL10融合蛋白的产生：重组-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：86)的设计是以遗传学方法将IL-10(SEQ ID NO：73)融合至人IgG1-Fc的N末端，其中以15个氨基酸的接头序列-GGGGSGGGGSGGGGS-(SEQ ID NO：76)分开。重组抗PD-L1/IL10融合蛋白的设计是以遗传学方法将IL-10融合至抗体重链的C末端，其中以氨基酸接头序列-LGGGGSGGGGSGGGG-(SEQID NO：74)分开。其他有用的接头序列提供在表2中。所需的基因片段，签名是重组蛋白的分泌所需的IL-2分泌序列，由Thermo基因合成服务获得，并且在哺乳动物表达载体中克隆以进行转染和在ExpiCHO-S细胞中表达。
全长抗PD-L1抗体、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、洛达泊单抗、FAZ053和MDX-1105是利用Thermo基因合成服务获得的，并克隆至哺乳动物表达载体以进行转染和在ExpiCHO-S细胞中表达。多肽序列提供在表3和随附序列表中。
全长抗体和融合蛋白的表达：将用重排的抗PD-L1抗体或抗PD-L1/IL10融合基因克隆的载体在ExpiCHO-S细胞(Thermo Scientific)中瞬时表达。在指数生长期过程中，利用ExpiFectamine CHO转染试剂盒(Thermo Scientific)，使用20μg载体，瞬时转染6x106个ExpiCHO-S细胞。转染后18-22小时，将ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHO Feed添加到瓶中。将细胞培养8天，将各培养物上清液离心，随后过滤通过0.45μm滤器。
全长抗体和融合蛋白的纯化和SDS-PAGE表征：抗体和Ab/IL10融合蛋白用蛋白ASepharose Fast Flow珠子(GE Healthcare)从转染的细胞上清液中纯化。用20个柱体积的PBS洗涤负载抗体的柱子，然后用3个珠体积的0.1M甘氨酸(pH 2.5)直接洗脱到1/10体积的1M Tris缓冲液(pH 9.0)中。将包含抗体的级分混合，并以PBS透析。在存在或不存在还原剂的条件下，使用SDS-PAGE确定纯化的抗PD-L1抗体和融合蛋白的质量。
SDS-PAGE结果：对图1A和图1B中描述的SDS-PAGE图像的检查表明，克隆、表达和纯化产生了全长IgG形式的纯化抗PD-L1抗体，以及与IL10多肽融合的抗PD-L1。
实施例2：抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白的特异性结合测定
该实施例说明了ELISA和BLI研究显示抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合物的特异性抗原结合和阻断功能。
A.利用全长抗体和融合蛋白的抗原特异性结合的ELISA
以在包被溶液(SeraCare)中1μg/ml的浓度，将重组人PD-L1-mFc融合蛋白(1μg/mL)、重组食蟹猴PD-L1(1μg/mL；Sino Biological)或IL10Rα-Fc融合蛋白(1μg/mL，R&DSystems)固化在96孔微量滴定板上，在4℃下过夜。用洗涤溶液(含0.05％吐温20的咪唑缓冲盐水)洗涤孔并用1％BSA封闭。将抗PD-L1或抗PD-L1/IL10融合蛋白的系列稀释物添加到孔中。在37℃下孵育1hr后，使用洗涤溶液洗涤孔。将过氧化物酶缀合的山羊抗人κ轻链抗体(Sigma)应用于每个孔，在37℃下孵育1h。对于PD-1/PD-L1竞争性ELISA，添加生物素缀合的PD-1-Fc蛋白(30μg/mL,Biolegend)。通过链霉亲和素-HRP检测PD-1的结合。洗涤后，将孔用TMB底物在室温下显色5-10min，然后用1N HCl终止。此后，在450nm和650nm处测量吸光度。使用GraphPad Prism7计算EC50和IC50值。
结果
ELISA测定的EC50值显示了由本公开内容的示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合物表现出的对人PD-L1的特异性结合活性，如下表4所示。
表4：对人PD-L1蛋白的特异性结合活性
抗PD-L1抗体 EC<sub>50</sub>(M)
PHS102 0.784E-10
PHS206 0.525E-10
PHS219 2.043E-10
抗PD-L1/IL10融合物
阿特朱单抗/IL10 0.865E-10
阿维鲁单抗/IL10 1.835E-10
阿维鲁单抗/TGFβR 1.067E-10
德瓦鲁单抗/IL10 1.207E-10
PHS102/IL10 0.798E-10
PHS206/IL10 0.629E-10
PHS219/IL10 1.643E-10
ELISA测定的EC50值显示了由本公开内容的示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合物表现出的对食蟹猴PD-L1的特异性结合活性，如下表5所示。
表5：对食蟹猴PD-L1蛋白的特异性结合活性
抗PD-L1抗体 EC<sub>50</sub>(M)
阿特朱单抗 0.140E-09
PHS102 0.216E-09
PHS206 0.187E-09
ELISA测定的EC50值显示了由本公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合物表现出对IL10R的特异性结合活性，如下表6所示。
表6：对人IL10Rα的特异性结合活性
抗PD-L1/IL10融合物 EC50(M)
阿特朱单抗/IL10 8.725E-08
阿维鲁单抗/IL10 2.591E-08
德瓦鲁单抗/IL10 3.755E-08
PHS102/IL10 9.426E-08
PHS206/IL10 6.194E-08
PHS219/IL10 6.626E-08
通过竞争性ELISA获得的结合数据图显示在图2A、图2B和图2C中。IC50值显示了由本公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合物表现出对PD-1与PD-L1结合的阻断的特异性活性，如下表7所示。
表7：对hPD-1和hPD-L1的阻断相互作用的特异性活性
IC50(M)
抗PD-L1抗体
阿特朱单抗 0.239E-09
PHS102 0.182E-09
PHS206 0.083E-09
PHS219 3.8900E-05
抗PD-L1/IL10融合物 IC50(M)
阿特朱单抗/IL10 0.124E-09
阿维鲁单抗/IL10 0.559E-09
德瓦鲁单抗/IL10 0.188E-09
PHS102/IL10 0.061E-09
PHS206/IL10 0.116E-09
PHS219/IL10 1.204E-09
B.抗PD-L1结合动力学的BLI分析
使用AHC(抗hIgG Fc捕获)生物传感器(ForteBio)进行生物层干涉仪(BLI)(ForteBio Octet RED96)测定以捕获每种抗PD-L1抗体(5μg/mL)，以获得0.5nm偏移，然后将生物传感器浸入在含有PBS-吐温20(0.1％)，BSA(0.1％)的运行缓冲液中的不同浓度(即，0、1.5625、3.125、6.25、4.94、12.5、25、50和100nM)的重组人PD-L1-His中。通过具有2.5分钟结合和5分钟解离相互作用时间的结合反应的曲线拟合分析(1:1Langmuir模型)计算速率常数。
结果：针对示例性抗PD-L1抗体与抗原PD-L1的特异性结合，利用BLI测定解离常数KD和动力学速率常数ka和kd，如下表8所示
表8：抗PD-L1抗体与hPD-L1的特异性结合动力学
抗PD-L1 Ab K<sub>D</sub>(M) k<sub>a</sub>(1/Ms) k<sub>d</sub>(1/s)
PHS102 1.44E-08 4.73E+05 6.79E-03
YT6D 2.16E-09 3.30E+05 7.13E-04
YP11F 1.84E-09 3.34E+05 6.15E-04
YT10H 1.92E-09 3.50E+05 6.70E-04
HSYPP31F 1.88E-09 2.88E+05 5.42E-04
HSYPP411C 2.03E-09 3.21E+05 6.53E-04
YT7A 1.99E-09 3.03E+05 6.03E-04
YT7H 6.16E-09 2.03E+05 1.25E-03
YP7G 5.51E-09 2.47E+05 1.36E-03
实施例3：抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白的细胞结合测定
该实施例说明了流式细胞术研究，显示了本公开内容的示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白与表达PD-L1的F293细胞的特异性结合。
材料和方法
A.表达PD-L1的F293细胞的制备：使用Thermo基因合成服务获得编码全长人类PD-L1的基因片段，并克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.4中。Freestyle 293-F细胞(ThermoScientific)通过聚乙烯亚胺(PEI)方法转染PD-L1表达载体，并用Geneticin(ThermoScientific)选择以建立稳定的表达PD-L1的F293细胞系。
B.流式细胞术：使用抗PD-L1抗体或抗PD-L1/IL10融合蛋白在4℃下孵育F293细胞或过表达PD-L1的F293细胞30min。使用FACS缓冲液(含2％FBS的PBS)洗涤后，使用抗人IgG–Alexa Fluor647将细胞染色并通过Attune NxT流式细胞仪(Thermo Scientific)分析，并且细胞表面结合以几何MFI表示。
C.PD-1阻断测定：将F293/hPD-L1细胞抗PD-L1抗体或抗PD-L1/IL10融合蛋白的系列稀释物在冰上孵育30min。添加20μg/ml生物素缀合的人PD1.ECD蛋白(SEQ ID NO：175)并在冰上孵育60min。使用FACS缓冲液(含2％FBS的PBS)洗涤后，使用链霉亲和素-AlexaFluor 647将细胞染色，并通过Attune NxT流式细胞仪(Thermo Scientific)分析。
结果
如图3A和图3B中所述的流式细胞术数据图所示，示例性抗PD-L1抗体(PHS102、PHS206、PHS219和阿特朱单抗)以及相应的抗PD-L1/IL10融合蛋白(PHS102/IL10、PHS206/IL10、PHS219/IL10和阿特朱单抗/IL10)显示出对在F293细胞表面上表达的人PD-L1的特异性结合活性。
如图3C和图3D中所示的流式细胞术数据图所示，示例性抗PD-L1抗体(PHS102、PHS206、PHS219和阿特朱单抗)以及相应的抗PD-L1/IL10融合蛋白(PHS102/IL10、PHS206/IL10、PHS219/IL10和阿特朱单抗/IL10)显示出对人PD-1与在F293细胞表面上表达的人PD-L1的结合的特异性阻断。
实施例4：PD-1/PD-L1细胞信号转导阻断的测定
该实施例说明了对本公开内容的示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白阻断PD-1/PD-L1细胞信号传导能力的研究。
材料和方法
使用
Figure BDA0003824125300000851
PD-1信号转导生物测定试剂盒(Eurofins)进行PD-1/PD-L1阻断生物测定。将示例性抗PD-L1抗体或抗PDL1/IL10融合蛋白的系列稀释物与存在PD-L1的U2OS生物测定细胞(1×104个细胞/孔)在37℃下预孵育1小时。将Jurkat PD-1信号转导细胞(2×104个细胞/孔)添加到存在PD-L1的细胞中，并且在室温下孵育2小时，随后添加检测试剂。
结果
如图4A和图4B中绘制的阻断测定数据以及表9中列出的IC50值所示，示例性抗PD-L1抗体(PHS102、HSYPP31F、HSYPP411C、YT7A、YT7H、YP10H)和抗PD-L1/IL10融合蛋白(PHS102/IL10、YT7A/IL10、YT7H/IL10、YP10H/IL10)能够阻断由PD-1与PD-L1结合介导的细胞信号转导。
表9：阻断PD-1/PD-L1信号转导的特异性活性
IC50(nM)
抗PD-L1抗体
PHS102 3.178
HSYPP31F 3.563
HSYPP411C 3.741
YT7A 6.07
YT7H 3.478
YP10H 3.381
抗PD-L1/IL10融合物
PHS102/IL10 4.221
YT7A/IL10 4.867
YT7H/IL10 2.471
YP10H/IL10 2.492
实施例5：抗PD-L1抗体和融合蛋白增强T细胞活化
该实施例说明了对本公开内容的示例性抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL10融合蛋白在混合淋巴细胞反应(MLR)中增强T细胞活化能力的研究。
材料和方法
人外周血取自健康供体。使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)通过密度梯度离心立即分离外周血单核细胞(PBMC)。为作为同种异体抗原呈递细胞(APC)，首先使用抗人CD14缀合的磁珠(Miltenyi Biotec)从供体A中分离CD14+单核细胞。对于未成熟树突状细胞(DC)的分化，在补充有10％FBS的RPMI1640中用GM-CSF(20ng/mL)和IL-4(20ng/mL)培养单核细胞6天。对于成熟DC的产生，用LPS(500ng/mL)处理未成熟的DC 24hr。将成熟的DC在37℃下以40μg/mL丝裂霉素C处理30min，然后与T细胞共培养。
使用抗人CD4缀合的磁珠(Miltenyi Biotec)从供体B中分离CD4+ T细胞。将应答物CD4 T细胞以4×106个细胞/mL重悬于培养基中，并将50μL T细胞添加到所有孔中，除了仅含DC的孔以外。将刺激物DC以4×106个细胞/mL重悬于培养基中，并将50μL DC添加到所有孔中，除了仅含CD4 T的孔以外。将另外100μL含有0.1-2μg IL10-Fc或抗PD-L1/IL10融合蛋白的培养基添加到96孔U形底板中的CD4 T-DC培养物中。在37℃下孵育共培养物。根据生产厂商的说明书，通过ELISA(Biolegend)测定共培养2天后细胞培养基中IL-2的浓度。
结果
如在图5A和图5B中绘制的测定数据所示，示例性抗PD-L1抗体(PHS102、PHS206、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗)和抗PD-L1/IL10融合蛋白(阿维鲁单抗/IL10、PHS102/IL10、YT7A/IL10、YT10H/IL10、HSYPP31F/IL10、HSYPP411C/IL10、YT7H/IL10、YP7G/IL10、YP11F/IL10)在MLR中相对于hIgG或IL10-Fc对照能够增强T细胞活化。
实施例6：抗PD-L1/IL10融合蛋白刺激MC/9细胞增殖
该实施例说明了与本公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白连接的IL10多肽刺激MC/9细胞增殖的能力的研究。
材料和方法
通过使用增殖测定确定IL10的生物活性。在补充了2mM L谷氨酰胺、0.05nM 2-巯基乙醇、10％大鼠T-STIM(Becton Dickenson)和10％FBS的DMEM(GIBCO)中培养MC/9(ATCC,CRL-8306)小鼠肥大细胞。在增殖测定中，在IL10-Fc或示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白存在下，将MC/9细胞以每孔1×104接种在200μl测定培养基(含有10％FBS的DMEM)中的96孔板中。72小时刺激后，使用CellTiter-Glo测定测量MC/9细胞增殖。
结果
如在图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F中绘制的测定数据以及下表10中列出的EC50值所示，示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白(阿特朱单抗/IL10、阿维鲁单抗/IL10、德瓦鲁单抗/IL10、PHS102/IL10、PHS206/IL10、YT7A/IL10、YT10H/IL10、HSYPP31F/IL10、HSYPP411C/IL10、YT6D/IL10、YT7H/IL10、YP7G/IL10、YP11F/IL10)相对于IL10-Fc蛋白能够以增强的水平刺激MC/9增殖。
表10：刺激MC/9增殖的特异性活性
EC50(nM)
IL10-Fc 0.4781
抗PD-L1/IL10融合物
阿特朱单抗/IL10 0.0191
阿维鲁单抗/IL10 0.0197
德瓦鲁单抗/IL10 0.1309
PHS102/IL10 0.0689
PHS206/IL10 0.0626
PHS102/IL10 0.04972
YT7A/IL10 0.04662
YT10H/IL10 0.05056
PHS102/IL10 0.0515
HSYPP31F/IL10 0.02683
HSYPP411C/IL10 0.04183
PHS102/IL10 0.05331
YT6D/IL10 0.008582
YT7H/IL10 0.02209
PHS102/IL10 0.04052
YP7G/IL10 0.0561
YP11F/IL10 0.009712
实施例7：抗PD-L1/IL10融合蛋白活化CD8 T细胞
该实施例说明了与本公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白连接以激活CD8 T细胞的IL10多肽的研究。
材料和方法
通过使用CD8磁珠(Miltenyi Biotec)从PBMC中分离人CD8 T细胞。将分离的CD8 T细胞(在6孔板中1×107个细胞/3mL/孔)在AIM-V培养基(Thermo Scientific)中培养，并使用T Cell TransAct(Miltenyi Biotec)活化3天。活化后，然后洗涤CD8 T细胞，并以每孔4×105个细胞在96孔板中铺板，并以抗PD-L1/IL10融合蛋白处理3天。在以抗PD-L1/IL10融合蛋白处理后，将细胞以1μg/mL可溶性抗CD3(Biolegend)再刺激4h。根据生产厂商的说明书，通过ELISA(Biolegend)细胞培养基中IFN-γ和颗粒酶B的浓度。
结果
如通过在图7A和图7B中绘制的测定以及在下表11中列出的EC50值所示，示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白(阿维鲁单抗/IL10，PHS102/IL10)相对于IL10-Fc蛋白能够以增强的水平活化CD8 T细胞(如通过IFNγ和颗粒酶B水平所测定的)。
表11：CD8 T细胞的活化
Figure BDA0003824125300000891
实施例8：在同源肿瘤模型中抗PD-L1/IL10融合蛋白的抗肿瘤活性
该实施例说明了本公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白在两种同源肿瘤模型CT26和EMT6中的抗肿瘤活性的研究。
材料和方法
将BALB/c小鼠(6-8周龄，雌性)皮下植入5×105个CT26细胞(ATCC CRL-2638)或5×105个EMT6细胞(ATCC CRL-2755)。8天后，当肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分配至治疗组。然后，每周两次向小鼠腹腔注射PBS对照、3mg/kg IL10-Fc(92kDa)、4.9mg/kg抗PD-L1抗体(阿维鲁单抗)(150kDa)、36mg/kg抗CSF1R/IL10融合物(185.5kDa)、5.8mg/kg抗PD-L1/TGFβR融合物(M7824)(177kDa)或6mg/kg抗PD-L1/IL10融合蛋白(阿维鲁单抗/IL10)(185.5kDa)。通过卡尺测量，每周两次测量肿瘤体积，直到研究结束。
结果
如在图8A和图8B中绘制的肿瘤体积数据所示，本公开内容的示例性抗PD-L1/IL10融合蛋白在研究过程中表现出非常强的抗肿瘤活性，在CT26和EMT6肿瘤模型中显示出所有治疗中最小的肿瘤体积。
尽管有所附权利要求，本文阐述的公开内容也由以下条款定义，这些条款单独或与一个或多个其他原因或实施方式组合可能是有益的。在不限制前述描述的情况下，提供了如下编号的本公开内容的某些非限制性条款，其中单独编号的条款中的每一个可以与任何前述或以下条款一起使用或组合。因此，这旨在为所有此类组合提供支持，不一定限于以下明确提供的特定组合：
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在以下权利要求中阐述了本发明的其他实施方式。
出于所有目的，此处引用的所有出版物、专利申请、专利或其他文件的公开内容皆明确地通过引用而全文并入本文中，其程度与单独地指明每一此类单独的出版物、专利、专利申请或其他文件基于所有目的通过引用全文并入本文相同，并在此全文提出。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括指定的术语)为准。
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Claims (18)

1.一种抗PDL1抗体，其特征在于，包含(i)第一轻链互补决定区(CDR-L1)、第二轻链互补决定区(CDR-L2)和第三轻链互补决定区(CDR-L3)，以及(ii)第一重链互补决定区(CDR-H1)、第二重链互补决定区(CDR-H2)和第三重链互补决定区(CDR-H3)，其中：
(a)CDR-H1包含选自SEQ ID NO：49、57、65、87、93、99、105、119和124的氨基酸序列；
(b)CDR-H2包含选自SEQ ID NO：50、58、66、88、94、100、106、110、115、120和125的氨基酸序列；
(c)CDR-H3包含选自SEQ ID NO：51、59、67、89、95、101和111的氨基酸序列；
(d)CDR-L1包含选自SEQ ID NO：53、61和69的氨基酸序列；
(e)CDR-L2包含选自SEQ ID NO：54、62和70的氨基酸序列；
(f)CDR-L3包含选自SEQ ID NO：55、63、71、91、97、103、108、113、117和122的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中：
(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列；
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列；
(e)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列；
(f)CDR-H1包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列；
(g)CDR-H1包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列；
(h)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列；
(i)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列；
(j)CDR-H1包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列；或者
(k)CDR-H1包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列、CDR-H2包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列、CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列、CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列、CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：52、60、68、90、96、102、107、112、116、121和126的序列具有至少90％同一性；和/或轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：56、64、72、92、98、104、109、114、118和123的序列具有至少90％同一性；任选地，其中：
(a)所述抗体包含与SEQ ID NO：52具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(b)所述抗体包含与SEQ ID NO：60具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：64具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(c)所述抗体包含与SEQ ID NO：68具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：72具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(d)所述抗体包含与SEQ ID NO：90具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：92具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(e)所述抗体包含与SEQ ID NO：96具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：98具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(f)所述抗体包含与SEQ ID NO：102具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：104具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(g)所述抗体包含与SEQ ID NO：107具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：109具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(h)所述抗体包含与SEQ ID NO：112具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：114具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(i)所述抗体包含与SEQ ID NO：116具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：118具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(j)所述抗体包含与SEQ ID NO：121具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：123具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；或者
(k)所述抗体包含与SEQ ID NO：126具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链(HC)氨基酸序列，其与选自SEQID NO：149、150、152、154、155、156、157、158、159、160和161的序列具有至少90％同一性，和/或轻链(LC)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：128、130、132、134、136、138、140、142、151和153的序列具有至少90％同一性；任选地，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO：149的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：150的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：151的所述LC氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：152的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：153的所述LC氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：154的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：128的所述LC氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：155的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：130的所述LC氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：156的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：132的所述LC氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO：157的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：134的所述LC氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：158的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：136的所述LC氨基酸序列；
(i)SEQ ID NO：159的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：138的所述LC氨基酸序列；
(j)SEQ ID NO：160的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：140的所述LC氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：161的所述HC氨基酸序列，和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含通过接头与选自IL2、IL7、IL10、IL12、IL15、IL21或IFN-α的细胞因子融合的重链(HC)；任选地，其中所述接头包含选自SEQ ID NO：74、75、76、77、78和79的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述细胞因子是IL10；任选地，其中：
(a)所述IL10包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列；和/或
(b)所述IL10是天然存在的或保留其细胞因子活性的IL10的工程化变体；
(c)所述IL10是保留其细胞因子活性的IL10的合成修饰的形式；和/或
(d)所述IL10包含一条、两条或四条IL10多肽。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述抗体包含通过接头融合至IL10多肽的重链(HC)，其中所述HC-IL10融合物氨基酸序列具有与选自SEQ ID NO：83、84、85、127、129、131、133、135、137、139和141的序列至少90％的同一性；和轻链(LC)，所述轻链具有与选自SEQID NO：128、130、132、134、136、138、140、142、151和153的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；任选地，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO：83的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：84的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：151的所述LC氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：85的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：153的所述LC氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：127的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：128的所述LC氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：129的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：130的所述LC氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：131的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：132的所述LC氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO：133的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：134的所述LC氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：135的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：136的所述LC氨基酸序列；
(i)SEQ ID NO：137的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：138的所述LC氨基酸序列；
(j)SEQ ID NO：139的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：140的所述LC氨基酸序列；或者
(k)SEQ ID NO：141的所述HC-IL10融合物氨基酸序列，和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列。
8.一种抗PD-L1抗体，其特征在于，包含通过接头融合至IL10的重链(HC)，其中所述抗体包含(i)第一轻链互补决定区(CDR-L1)，第二轻链互补决定区(CDR-L2)和第三轻链互补决定区(CDR-L3)，以及(ii)第一重链互补决定区(CDR-H1)，第二重链互补决定区(CDR-H2)和第三重链互补决定区(CDR-H3)，其中：
(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列；
(e)CDR-H1包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列；
(f)CDR-H1包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列；
(g)CDR-H1包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列；
(h)CDR-H1包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列；
(i)CDR-H1包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列；
(j)CDR-H1包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列；
(k)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列；
(l)CDR-H1包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列；
(m)CDR-H1包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列；
(n)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列；
(o)CDR-H1包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列；
(p)CDR-H1包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列；或
(q)CDR-H1包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列和CDR-L3包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)氨基酸序列，所述重链可变结构域氨基酸序列具有与选自SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、90、96、102、107、112、116、121和126的序列具有至少90％同一性的序列；和/或轻链可变结构域(VL)氨基酸序列，所述轻链可变结构域氨基酸序列具有与选自SEQ ID NO：8、16、24、32、40、48、56、64、72、92、98、104、109、114、118和123的序列具有至少90％同一性的序列；任选地，其中：
(a)所述抗体包含与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：8具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(b)所述抗体包含与SEQ ID NO：12具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：16具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(c)所述抗体包含与SEQ ID NO：20具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：24具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(d)所述抗体包含与SEQ ID NO：28具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：32具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(e)所述抗体包含与SEQ ID NO：36具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：40具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(f)所述抗体包含与SEQ ID NO：44具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：48具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(g)所述抗体包含与SEQ ID NO：52具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(h)所述抗体包含与SEQ ID NO：60具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：64具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(i)所述抗体包含与SEQ ID NO：68具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：72具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(j)所述抗体包含与SEQ ID NO：90具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：92具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(k)所述抗体包含与SEQ ID NO：96具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：98具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(l)所述抗体包含与SEQ ID NO：102具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：104具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(m)所述抗体包含与SEQ ID NO：107具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：109具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(n)所述抗体包含与SEQ ID NO：112具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：114具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(o)所述抗体包含与SEQ ID NO：116具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：118具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(p)所述抗体包含与SEQ ID NO：121具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：123具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；或
(q)所述抗体包含与SEQ ID NO：126具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；和与SEQ IDNO：56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体包含HC-IL10融合物氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：80、81、82、83、84、85、127、129、131、133、135、137、139和141的序列具有至少90％同一性，和轻链(LC)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148的序列具有至少90％同一性；任选地，其中
(a)SEQ ID NO：80的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：144的所述LC氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：81的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：146的所述LC氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：82的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：148的所述LC氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：83的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：84的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：151的所述LC氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：85的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：153的所述LC氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO：127的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：128的所述LC氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：129的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：130的所述LC氨基酸序列；
(i)SEQ ID NO：131的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：132的所述LC氨基酸序列；
(j)SEQ ID NO：133的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：134的所述LC氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：135的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：136的所述LC氨基酸序列；
(l)SEQ ID NO：137的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：138的所述LC氨基酸序列；
(m)SEQ ID NO：139的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：140的所述LC氨基酸序列；或
(n)SEQ ID NO：141的所述HC-IL10融合物氨基酸序列和SEQ ID NO：142的所述LC氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体，其中：
(a)所述抗体以1x 10-8M或更低、1x 10-9M或更低、1x 10-10M或更低的结合亲和力结合至人PD-L1；任选地，其中所述结合亲和力是通过与SEQ ID NO：174的huPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)测量的；
(b)所述抗体以1x 10-8M或更低、1x 10-9M或更低、1x 10-10M或更低的结合亲和力结合至食蟹猴PD-L1；任选地，其中所述结合亲和力是通过与SEQ ID NO：176的cynoPD-L1多肽的平衡解离常数(KD)测量的；
(c)所述蛋白使MC/9细胞增殖增加至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％或更多；
(d)所述蛋白使由活化的CD8 T细胞产生的IFNγ和颗粒酶B增加至少25％、至少50％、至少100％或更多；和/或
(e)所述抗体使在28天时在同基因小鼠肿瘤模型中测量的肿瘤体积减小至少25％、至少50％、至少75％或更多，其中所述小鼠肿瘤模型选自：CT26结肠癌和EMT6乳腺癌。
12.一种分离的多核苷酸或载体，其特征在于，编码权利要求1-11中任一项所述的抗体；或者一种分离的宿主细胞，其包含所述寡核苷酸或载体；任选地，其中所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0)、猴肾细胞(COS-7)、人胚肾系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(例如，TM4)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞、TR1细胞、医学研究委员会5(MRC 5)细胞和FS4细胞。
13.一种生产抗体的方法，其特征在于，包括培养权利要求12所述的分离的宿主细胞，以生产抗体。
14.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-11中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体；任选地，其中所述组合物还包含IL10、化学治疗剂和/或包含对免疫检查点分子特异性的抗体。
15.一种在受试者中治疗PD-L1介导的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-11中任一项所述的抗体，或者向所述受试者施用治疗有效量的权利要求14所述的药物组合物；任选地，其中所述疾病是癌症；任选地，其中所述癌症是结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌或口腔癌。
16.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，其特征在于，包括向所述受试者施用PD-L1拮抗剂和IL10激动剂；任选地，其中所述PD-L1拮抗剂包含抗PD-L1抗体、shRNA、siRNA、miRNA、PD-L1的小分子抑制剂或其组合；任选地，其中所述IL10激动剂是IL-10、IL10受体结合蛋白或其组合；任选地，其中所述PD-L1拮抗剂是权利要求1-12中任一项所述的抗PD-L1抗体；任选地，其中所述PD-L1拮抗剂和所述IL10激动剂包含具有通过接头融合至IL10多肽的重链的抗PD-L1抗体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症是结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌或口腔癌。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用T细胞疗法。
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