TW202330621A - 全人源的抗ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）單鏈抗體及其應用 - Google Patents

全人源的抗ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）單鏈抗體及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明涉及特異性結合B細胞成熟抗原(BCMA)的新型抗體和抗體片段，尤其是全人源的單鏈抗體scFv。本發明還涉及編碼這些抗體的核酸、載體和表達該核酸的宿主細胞。此外，本發明也涉及包含本發明抗體的組合物、及其在治療和診斷中的用途。

Description

全人源的抗B細胞成熟抗原(BCMA)單鏈抗體及其應用
本發明涉及特異性結合B細胞成熟抗原(BCMA)的新型抗體和抗體片段，尤其是單鏈抗體(如單鏈scFv)。本發明還涉及編碼這些抗體和抗體片段的核酸、載體和表達該核酸的宿主細胞。此外，本發明也涉及包含本發明抗體的組合物、及其在治療和診斷中的用途。
B細胞成熟抗原(BCMA)，又名CD269或TNFRSF17，是腫瘤壞死因子受體家族成員。BCMA是III型跨膜蛋白，在胞外結構域(ECD)中具有TNFR家族成員所特徵性的富半胱胺酸結構域(CRD)，該結構域形成配體結合基序。BCMA與TNFR家族成員，跨膜激活物CMAL相互作用因子(TACI)和BAFF受體(BAFF-R)在功能上相關。BCMA在跨膜結構域N端的CRD中表現出與TACI具有一定的相似性。此外，人BCMA與小鼠和獼猴的BCMA在胞外結構域ECD上分別具有大約65%和85%胺基酸序列同一性。
研究表明，BCMA可以結合B細胞激活因子受體(BAFF)和B細胞增殖誘導配體(APRIL)，促進B細胞在不同發育階段的存活。而異常的信號傳導可促使B細胞異常增殖，導致自身免疫疾病和腫瘤形成。參見Rickert等人，Immunological Reviews2011，第244卷：115-133。
APRIL，又稱作G70，是TNF配體家族的成員。根據文獻報道，APRIL與前列腺癌、乳腺癌、阿爾茨海默氏病、免疫疾病、炎症、和胃腸道紊亂相關。參見Hahne等(1998),T.Exp.Med.188：1185-90。可溶性APRIL與BCMA的結合可以促進骨髓(BM)漿細胞和漿母細胞的存活(參見，BLOOD,2014年5月，123卷，20期，p3128-3138)；而與TACI的結合可以導致T細胞非依賴性的抗體反應、B細胞調節、和類型轉換重組(參見Vincent等人在Nature Reviews Rheumotology,2014第10卷：365-373)。
BAFF是另一TNF配體家族成員。BAFF與BCMA結合，可以促進漿細胞的存活。BAFF與B細胞、漿母細胞和漿細胞表面上表達的BAFF受體(BAFF-R)結合，可以促進未成熟B細胞的存活和成熟。此外，BAFF也可以與TACI結合，導致T細胞非依賴性的抗體反應、B細胞調節、和類型轉換重組(參見Vincent等人在Nature Reviews Rheumotology,2014第10卷：365-373)。
在非腫瘤細胞中，BCMA主要表達在漿細胞和成熟B細胞亞群中。而在60-70%的多發性骨髓瘤(MM)患者中，BCMA也在癌化的漿細胞表面表達。在MM患者中血清BCMA水平升高，並且升高的水平與疾病狀況、治療反應、和整體存活相關。BCMA基因缺陷小鼠有著正常的B細胞水平，但是其漿細胞的生存週期會顯著縮短。因此，BCMA是多發性骨髓瘤免疫治療的理想靶點。
單鏈scFv抗體是一種小分子的基因工程抗體，它是在DNA層級上利用基因工程方法將天然抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)連接(通常藉由一段人工合成的連接肽(或“連接子”)連接)而成的小分子重組抗體。與完整抗體分子相比，scFv單鏈抗體具有以下優點：含有完整的抗體可變區，保留原抗 體的抗原特異性和結合活性；不含有抗體分子的Fc區，因而免疫原性弱，用於人體不易產生免疫反應；分子量小，穿透性強、易於滲入組織，用於顯像診斷或治療時可以進入一般完整抗體不能達到的組織內部；不需要進行糖基化修飾即可形成有功能的抗體分子，利於原核表達系統大量生產；易於操作，適用於作為基因工程構件，製備具有新性質的其它抗原特異性結合分子，例如全長抗體、scFv-Fc等。
鑒於BCMA在B細胞惡性腫瘤，尤其是多發性骨髓瘤中作為治療靶點的有效性，本領域仍然需要新的BCMA特異性結合分子。本發明藉由提供以高靶特異性和高親合性結合BCMA，尤其是與腫瘤細胞表面上表達的BCMA結合，並具有低副作用的全人單鏈抗體，滿足了這方面的需求。本發明的全人單鏈抗體不僅適於單獨用於腫瘤和癌症的診斷或治療中，而且，更有利地的是，適於作為基因工程構件製備具有高BCMA靶向性的其它診斷和治療分子，例如各種形式的抗體、scFv-Fc以及基於抗體的融合物和綴合物等。
本發明提供了全人源抗人BCMA抗體及其編碼基因與應用。藉由基因工程手段和酵母表面展示技術，本發明人從展示在酵母表面的人抗體庫中篩選出抗人BCMA的全人源抗體，並獲得其可變區基因序列，在此基礎上構建了全人單鏈scFv抗體及其與人Fc區的融合構建體，經哺乳動物細胞表達、純化獲得scFv-hFc重組單鏈抗體分子。本發明的重組單鏈抗體分子不僅以高親和力與非膜結合型人BCMA結合，也以高親和力以細胞表面表達的BCMA結合。
因此，本發明提供特異性結合BCMA的抗體，尤其是單鏈抗體、及編碼其的核酸分子、及它們在治療和診斷中的用途。
在一個方面，本發明提供特異性地結合BCMA(較佳人BCMA蛋白質)的抗體或其抗原結合片段。在一個較佳實施方案中，本發明抗體是單鏈抗體。在一個較佳實施方案中，本發明抗體是單鏈scFv抗體。在另一較佳實施方案中，本發明抗體是scFv-Fc抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體以大約100nM至5nM的KD結合人BCMA蛋白，其中KD值按照例如生物膜層光學干涉技術(例如Fortebio檢測法)測量。在一些實施方案中，本發明的抗體以大約40nM至4nM的EC50結合細胞表面表達的人BCMA蛋白，其中EC50值按照例如流式細胞術(例如FACS)測量。在本發明的一些實施方案中，本發明提供本發明的抗BCMA抗體或其片段在治療與BCMA相關病症中的用途。
在一些實施方案中，本發明抗體包含表1所示任一抗體的VH區序列或其變體。在另一些實施方案中，本發明抗體包含表1所示任一抗體的VL區序列或其變體。在另一些實施方案中，本發明抗體包含表1所示任一抗體的VH和VL序列對、或其變體。在另一些實施方案中，本發明抗體包含表1所示任一抗體的VH區序列的一個、兩個或三個CDR(較佳三個CDR)、或其變體。在另一些實施方案中，本發明抗體包含表1所示任一抗體的VL區序列的一個、兩個或三個CDR(較佳三個CDR)、或其變體。在一些實施方案中，本發明抗體包含表1所示任一抗體的6個CDR區序列、或其變體。在一個實施方案中，抗體的CDR序列是表2所示的CDR序列。
在一些實施方案中，本發明抗體是單鏈scFv抗體。較佳地，scFv抗體包含VH序列、VL序列和連接子。較佳地scFv抗體從N端到C端包含：VL結構域-連接子-VH結構域，或VH結構域-連接子-VL結構域。
在一些實施方案中，本發明還提供由本發明單鏈scFv抗體和野生型或改變的Fc區融合形成的scFv-Fc抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體的Fc區是低或無岩藻糖基化的。在一些實施方案中，scFv抗體藉由鉸鏈區與Fc區融合。
再一方面，本發明涉及基於本發明抗體，尤其是單鏈抗體構建的融合物和綴合物。
再一方面，本發明涉及治療B細胞相關病症的方法和組合物，其中向該受試者施用有效量的本發明抗體或其抗原結合片段、或本發明的融合物或綴合物。在一些實施方案中，B細胞相關病症選自：B細胞惡性腫瘤、漿細胞惡性腫瘤、自身免疫疾病，較佳地選自：多發性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、惡性潛能不確定的B細胞增殖、淋巴瘤樣肉芽腫病、移植後淋巴增生病症、免疫調節病症、類風濕性關節炎、重症肌無力、特發性血小板減少性紫癜、抗磷脂綜合症、恰加斯病、格雷夫斯病、韋格納肉芽腫、結節性多動脈炎、舍格倫氏綜合症、尋常天皰瘡、硬皮病、多發性硬化症、ANCA相關血管炎、古德帕斯丘氏病、川崎病、自身免疫性溶血性貧血和急進性腎小球腎炎、重鏈病、原發性或免疫細胞相關的澱粉樣變性、或意義未明的單株丙種球蛋白病。在一些較佳的實施方案中，B細胞相關病症是B細胞惡性腫瘤，較佳地，多發性骨髓瘤(MM)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些實施方案中，本發明抗體分子、融合物或綴合物與其它治療劑聯用。
再一方面，本發明涉及檢測樣品中BCMA的方法和試劑盒，其中該方法包括：(a)將該樣品與本發明抗體或其抗原結合片段、融合物或綴合物接觸；和(b)檢測該抗體或其抗原結合片段、融合物或綴合物和BCMA蛋白之間複 合物的形成。在一些實施方案中，樣品來自多發性骨髓瘤(MM)患者。該檢測可以是體外的或體內的。
第1圖，藉由流式細胞術測定的，自酵母展示文庫篩選獲得的本發明示例性抗BCMA抗體與多發性骨髓瘤細胞系NCI-H929細胞的親和力。
第2圖示意性顯示本發明的示例性scFv-hFc重組單鏈抗體的表達載體選殖策略。
第3圖顯示，藉由流式細胞術測定的，本發明示例性scFv-hFc重組單鏈抗體與NCI-H929細胞的親和力。
第4圖顯示本發明抗體的示例性CDR序列。
第5圖顯示本發明抗體的示例性VH序列。
第6圖顯示本發明抗體的示例性VL序列。
第7圖顯示人BCMA抗原及其胞外結構域(ECD)的示例性胺基酸序列。
第8圖顯示用於構建本發明示例性scFv-Fc構建體和參照scFv-Fc構建體結構的連接子、鉸鏈區和Fc區的胺基酸序列和核苷酸序列。
發明詳述
除非明確指明相反，否則本發明的實施將採用本領域技術內的常規化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、遺傳學、免疫學和細胞生物學的方法。這些方法的描述可以參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001)；Sambrook等人， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,2008年7月更新)；Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning：A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊專著如Advances in Immunology。
定義
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項的任意兩項或多項。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含” 或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
在本文中，術語“抗原結合分子”是指包含能夠與靶抗原結合的抗原結合區或抗原結合部分的分子，例如蛋白質或多肽。在本發明中，當靶抗原是B細胞成熟抗原(BCMA)時，結合BCMA的抗原結合分子也稱作BCMA結合分子。抗原結合分子包括例如抗體及其抗原結合片段、單鏈scFv抗體、基於scFv構建的各種融合物和綴合物，例如scFv-Fc抗體。如本領域技術人員明瞭的，抗體的抗原結合部分通常包含來自“互補決定區”或“CDR”的胺基酸殘基。在一些情況下，根據上下文，“BCMA結合分子”與“本發明抗體”或“抗BCMA抗體”可以互換使用。
在本文中，術語“抗體”是指至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區的多肽，該免疫球蛋白可變區特異性識別並結合抗原。該術語涵蓋各種抗體結構，包括、但不限於單株抗體、多株抗體、單鏈抗體或多鏈抗體、單特異性或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全人源抗體或嵌合抗體或人源化抗體、全長抗體和抗體片段，只要它們呈現期望的抗原結合活性即可。
本領域技術人員明瞭，“全抗體”(在本文中可與“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”互換使用)包含至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。可變區是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原的結合的結構域。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示 出多種效應子功能。抗體的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列歸入兩種類型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))中的一種。抗體的重鏈可以取決於其重鏈恆定區的胺基酸序列而劃分為主要5種不同的類型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類型中的幾種可以進一步劃分成亞類，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。對應於不同抗體類型的重鏈恆定區分別稱作α、δ、ε、γ和μ。參見例如Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.編輯，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))(其為所有目的以其整體在此引作參考)。
術語“抗體片段”是指並非完整抗體的分子，其包含完整抗體中用於結合該完整抗體所結合的抗原的部分。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、單鏈Fv、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、微抗體(minibody)、單結構域抗體(sdAb)；以及從抗體片段形成的多特異性抗體。Fab片段是一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，例如，藉由木瓜蛋白酶消化完全抗體能夠獲得Fab片段。可以借連接子將Fab的輕鏈(L鏈)和重鏈(H鏈)融合構建成單一多肽鏈，即單鏈Fab(scFab)(參見例如US20070274985A1)。此外，藉由胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下面消化完全抗體可以產生F(ab')2，其為Fab’的二聚體，是二價的抗體片段。F(ab')2可以在中性條件下藉由破壞鉸鏈區中的二硫鍵而被還原，從F(ab')2二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區的Fab片段。Fv片段由抗體單臂的VL和VH結構域組成。另外，可以使用重組方法，將獨立編碼Fv片段的兩個結構域VL和VH的基因，藉由編碼連接肽(連接子)的核酸序列連接在一起，重組表達形成單鏈Fv，在該單條蛋白鏈中VH區和VL區配對提供抗原結合位 點。雙鏈抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該片段在同一多肽鏈中包含藉由短連接子連接的VL和VH。在雙鏈抗體中，由於連接子過短，同一鏈上的VH和VL兩個結構域之間無法配對，而被迫與另一鏈上的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合位點。雙鏈抗體可以是二價的或雙特異性的。雙鏈抗體的更詳細描述可以參見例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；以及Hollinger等人，PNAS USA 90：6444-6448(1993)。三鏈抗體和四鏈抗體和微抗體也描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)，和邵榮光等人(編輯)，抗體藥物研究與應用，人民衛生出版社(2013)。單結構域抗體(sdAb)通常指這樣的抗體，其中單個可變結構域(例如，重鏈可變結構域(VH)或輕鏈可變結構域(VL)、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、衍生自魚類IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR))即可賦予抗原結合，而不需要與另一可變結構域相互作用以識別靶抗原。(關於抗體片段的更詳細的描述，也可以參見：基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993)。
本文中使用的術語“單株抗體”表示，得自基本上同質的抗體群體的抗體，即，除了通常以很少量存在的可能變體抗體(例如，含有天然突變或在單株抗體製品的生產過程中產生的變體抗體)以外，構成該群體的各個抗體是相同的和/或結合相同表位。單株抗體可以藉由多種技術來製備，該技術包括、但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、酵母展示方法，和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的轉基因動物的方法。
術語“人抗體”或“全人源抗體”在本文中可以互換使用，指包括其中構架區和CDR區二者均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。而且，如果抗體含有恆定區，恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可 包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸(例如，藉由體外隨機或點特異誘變或體內體細胞突變引入的突變)，例如在CDR——尤其在CDR3中。然而，如本文所使用的，術語“人抗體”不意欲包括其中的CDR序列衍生自其他哺乳動物物種(如，小鼠)的種系而移植入人構架序列的抗體。
如本文所用，術語“重組人抗體”包括所有藉由重組方式製備、表達、產生或分離的人抗體，例如，(a)自用人免疫球蛋白基因進行轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤分離的抗體，(b)自轉化成表達人抗體的宿主細胞例如轉染瘤分離的抗體，(c)自重組、組合人抗體文庫例如酵母展示文庫分離的抗體，和(d)藉由包括剪接人免疫球蛋白基因至其他DNA序列的任意其他方式製備、表達、產生或分離的抗體。這些重組人抗體具有構架區和CDR區源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。然而，在某些實施方案中，可以對重組人抗體進行體外誘變(或使用人Ig序列轉基因動物時為體內體細胞誘變)，由此得到的重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列，儘管源自人種系VH和VL序列並與之相關、但是並不天然存在於體內的人抗體種系庫中。
術語“嵌合抗體”是指可變區序列源自一物種、恆定區序列源自另一物種的抗體，例如，其中可變區序列源自小鼠抗體、恆定區序列源自人抗體的抗體。
術語“人源化抗體”是指將源自其他哺乳動物物種例如小鼠種系的CDR序列接到人構架序列上的抗體。可以在人構架序列內進行額外的構架區修飾。
“分離的”抗體是已經與它的天然環境中的組分分離的抗體。在一些實施方案中，將抗體純化至大於95%或99%純度，該純度藉由例如電泳(例如， SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相HPLC)確定。關於評價抗體純度的方法的綜述，參見，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
表位是抗體所結合的抗原區域。表位可以由連續的胺基酸形成或者藉由蛋白的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成。
術語“BCMA”和“B-細胞成熟抗原”可互換地使用，其包括人BCMA的變體、同種型、物種同源物和與BCMA(例如人BCMA)具有至少一個相同表位的類似物。圖7顯示了一個示例性的人BCMA序列(SEQ ID NO：74)。BCMA蛋白也可包括BCMA的片段，諸如胞外結構域以及胞外結構域的片段，例如保持與本發明任何抗體結合能力的片段。
術語“特異性結合”表示抗體選擇性地或優先地結合抗原。如果在生物光干涉測量中，抗體以大約5x 10-7M或更低、大約1x 10-7M或更低、大約5x 10-8M或更低、大約1x 10-8M或更低、大約5x 10-9M或更低的KD，與人BCMA結合，則該抗體是“與人BCMA特異性結合”的抗體。
“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由平衡解離常數(KD)代表，平衡解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別是kdis和kon)的比值。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。
與結合例如BCMA的抗原的參考抗體“競爭結合的抗體”是指這樣的抗體，該抗體在競爭檢驗中阻斷對照抗體與抗原(例如BCMA)的結合達到50%或更多，並且反過來，在競爭檢驗中對照抗體也阻斷該抗體與抗原(例如 BCMA)的結合達50%或更多。示例性競爭檢驗描述於：“Antibodies”,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)。競爭結合的抗體可以與對照抗體結合相同的表位區，例如相同表位、相鄰表位或重疊表位。
本文中的術語“Fc區”用於定義含有至少一部分的恆定區的免疫球蛋白重鏈的C-末端區域。該術語包括天然序列Fc-區和變體Fc-區。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc-區從重鏈的Cys226或從Pro230延伸至羧基端。然而，Fc-區的C-端賴胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外指出，Fc-區或恆定區中的胺基酸殘基的編號根據EU編號系統，也稱為EU索引，如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。
與抗體相關的術語“變體”在本文中指，包含已經藉由至少1個，例如1至30，或1至20或1至10個，例如1或2或3或4或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的目標抗體區域(例如重鏈可變區或輕鏈可變區或重鏈CDR區或輕鏈CDR區)的抗體，其中變體基本上保持改變之前的抗體分子的生物學特性。在一方面，本發明涵蓋在本文中所述及的任何抗體的變體。在一個實施方案中，抗體變體保持改變前抗體的至少60%,70%,80%,90%，或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。在一些實施方案中，該改變不導致抗體變體喪失對抗原的結合，但視需要地可以賦予諸如提高的抗原親和力和不同的效應子功能等性質。可以理解的，抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區、或各CDR區可以單獨改變或組合改變。在一些實施方案中，在一個或多個或全部三個重鏈CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9 個或10個。在一些實施方案中，在一個或多個或全部三個輕鏈CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。在一些實施方案中，在一個或多個或全部6個CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。較佳地，該胺基酸改變為胺基酸取代，較佳保守取代。在一些實施方案中，抗體變體與親本抗體在目的抗體序列區域上具有至少80%、85%、90%或95%或99%或更高的胺基酸同一性。例如，在一個實施方案中，本發明抗體，與表1所列任一抗體相比，在重鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。在再一實施方案中，本發明抗體與表1所列任一抗體相比，在輕鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。在再一實施方案中，本發明抗體與表1所列任一抗體相比，在重鏈可變區和輕鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。
在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“序列同一性百分比”：將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例 如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。
在本發明中，就抗體序列而言，胺基酸序列同一性百分數藉由將候選抗體序列與對照抗體序列最佳比對後，在一個較佳方案中按照Kabat編號規則進行最佳比對後，予以確定。比對後，將目標抗體區域(例如，重鏈或輕鏈的整個可變區、或其部分例如一個或多個CDR區)與對照抗體的相同區域進行比較。目標抗體區域和對照抗體區域之間的序列同一性百分數為：在目標和對照抗體區域兩者中被相同胺基酸佔據的位置的數目除以兩個區域的比對位置總數(空位不計入)並乘以100得到的百分數。在本文中，在不指定目標抗體區域的情況下，將適用於在對照抗體序列的全長上進行比對。在一些實施方案中，就抗體而言，序列同一性可以分佈在整個重鏈可變區和/或整個輕鏈可變區上，或序列百分數同一性可以僅限定於構架區，而對應CDR區的序列保持100%相同。
A.本發明的BCMA結合分子和組合物
I．本發明的抗BCMA抗體
本發明一方面提供以高靶特異性和高親合性結合BCMA(尤其是膜結合性BCMA)的抗體，尤其是單鏈抗體(例如單鏈scFv抗體)。
本發明的抗體具有以下一個或多個特性：
(i)以高親和力，例如以小於100nM，例如小於50nM，例如5-30nM，較佳小於10nM的KD值，與BCMA(例如，人BCMA)結合；
(ii)以高親和力，例如以小於100nM，例如小於50nM，例如1-40nM，較佳小於20nM，更佳小於10或5nM的EC50值，與細胞表面表達的BCMA(例如人BCMA)結合；
(iii)與BCMA上，尤其是BCMA的胞外域ECD上的表位特異性結合(例如，與表1所列任一抗體識別相同或相似的表位)；
(iv)顯示與表1所列任一抗體相同或相似的結合親和力和/或特異性；
(v)抑制(例如，競爭性抑制)本文所述的抗體分子，例如表1所示的任一抗體分子，與BCMA的結合；
(vi)與表1所示的任一抗體結合相同或重疊的表位；
(vii)與表1所示的任一抗體競爭結合BCMA和/或結合BCMA上的相同表位；
(viii)結合人BCMA並且與猴BCMA交叉反應；
(ix)具有本文所述的抗體分子，例如表1所列任一抗體分子的一個或多個生物學特性；
(x)具有本文所述的抗體分子，例如表1所示任一抗體的一種或多種藥物代謝動力學特性；
(xi)抑制BCMA的一種或多種活性，從而導致例如以下一者或多者：減少表達BCMA的B細胞或漿細胞的數量、抑制該細胞的存活或增殖；
(xii)基本上不與BAFF-R或TACI結合；
(xiii)抑制或減少BCMA與其配體，例如與BAFF或APRIL或與兩者的結合。
在一些實施方案中，本發明抗BCMA抗體分子以高親和力，例如，以下述解離平衡常數(KD)與人BCMA(例如SEQ ID NO：74的多肽)結合，所述KD小於約100nM，小於或等於大約80nM、70nM、60nM、或50nM，更佳地小於或等於大約40nM、30nM或20nM，更佳地小於或等於大約10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM，例如，藉由使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量法)測定。
在一些實施方案中，本發明抗BCMA抗體分子與人BCMA(例如SEQ ID NO：74的多肽)結合的解離速率常數(Kdis)小於3×10-2、1.5×10-2、5×10-3或3×10-3s-1，例如約1.46×10-3s-1。在一些實施方案中，抗BCMA抗體分子與BCMA結合的結合速率常數(Kon)大於1×104、5×104、1×105、5×105或8×105M-1s-1，例如以約7.29×105M-1s-1的Ka與BCMA結合。
在一些實施方案中，本發明抗BCMA抗體分子以高親和力結合表達BCMA的細胞，較佳地在細胞表面表達人BCMA的多發性骨髓瘤細胞系(例如NCI-H929)，較佳地，以流式細胞術(例如FACS)測定，該抗體與細胞結合的EC50值小於大約200nM、150nM或100nM，較佳地，小於或等於大約80nM、70nM、60nM、或50nM，更佳地小於或等於大約40nM、30nM或20nM，更佳地小於或等於大約10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM。
在一個實施方案中，抗體分子與包含胺基酸序列SEQ ID NO：74的人BCMA結合。在一些實施方案中，抗體分子結合BCMA上，較佳BCMA的胞外域上的表位。
在一些實施方案中，抗體分子是全長抗體。在另一些實施方案中，抗體分子是抗體片段。例如，本發明的抗體分子可以包含或可以是Fab、scFab、 Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、單鏈scFv抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體、四鏈抗體、微抗體、或單結構域抗體(sdAb)。在一個較佳的實施方案，本發明抗體分子是單鏈scFv抗體。在一個較佳的實施方案，本發明抗體分子包含scFv及與其連接的Fc區。在一個較佳的實施方案，本發明抗體分子是全人源的。
抗體可變區
“可變區”或“可變結構域”是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原的結合的結構域。重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)可以進一步再劃分為高變區(HVR，又稱作互補決定區(CDR))，其間插有較保守的區域(即，構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些情況下，單個VH或VL結構域足以賦予抗原-結合特異性。此外，結合特定抗原的抗體可以使用來自結合該抗原的抗體的VH或VL結構域篩選互補VL或VH結構域文庫而分離(參見，例如，Portolano，S.等，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等，Nature 352(1991)624-628)。在本文中，“VH”或“VH結構域”包括全長抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab、scFab或本文公開的其它抗體片段的重鏈可變區VH。在本文中，“VL”或“VL結構域”包括全長抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab、scFab或本文公開的其它抗體片段的輕鏈可變區VL。
在一個實施方案中，本發明抗BCMA抗體分子包含：(i)與表1所列任一抗體的抗原結合區(例如，重鏈可變區和輕鏈可變區對)相同的抗原結合區；或(ii)與(i)的抗原結合區在胺基酸序列上具有例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的抗原結合區。
在再一個實施方案中，本發明抗BCMA抗體分子包含：(i)與表1所列任一抗體的重鏈可變區相同的重鏈可變區；或(ii)與(i)的重鏈可變區在胺基酸序列上具有例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的重鏈可變區；或(iii)(i)的重鏈可變區的變體，其中該變體包含至少一個且不超過30、20或10個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)，且較佳地該變體在3個重鏈互補決定區(CDR)區中包含總共不超過10個、較佳5至0個胺基酸改變(較佳胺基酸取代)。
在再一個實施方案中，本發明抗BCMA抗體分子包含：(i)與表1所列任一抗體的輕鏈可變區相同的輕鏈可變區；或(ii)與(i)的輕鏈可變區在胺基酸序列上具有例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的輕鏈可變區；或(iii)(i)的輕鏈可變區的變體，其中該變體包含至少一個且不超過30、20或10個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)，且較佳地該變體在3個輕鏈互補決定區(CDR)中包含總共不超過10個、較佳5至0個胺基酸改變(較佳胺基酸取代)。
在再一個實施方案中，本發明抗BCMA抗體分子包含重鏈可變區和輕鏈可變區，
其中該重鏈可變區選自：
(i)與表1所列任一抗體的重鏈可變區相同的重鏈可變區；或(ii)與(i)的重鏈可變區在胺基酸序列上具有例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的重鏈可變區；或(iii)(i)的重鏈可變區的變體，其中該變體包含至少一個且不超過30、20或10個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳 保守取代)，且較佳地所述變體在3個重鏈互補決定區(CDR)區中包含總共不超過10個、較佳5至0個胺基酸改變(較佳胺基酸取代)；
且其中該輕鏈可變區選自：
(i)與表1所列任一抗體的輕鏈可變區相同的輕鏈可變區；或(ii)與(i)的輕鏈可變區在胺基酸序列上具有例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的輕鏈可變區；或(iii)(i)的輕鏈可變區的變體，其中該變體包含至少一個且不超過30、20或10個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)，且較佳地所述變體在3個輕鏈互補決定區(CDR)中包含總共不超過10個、較佳5-0個胺基酸改變(較佳胺基酸取代)。
在一些實施方案中，本發明提供包含表1所列任一抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區對的胺基酸序列的抗BCMA抗體、或其變體。在一個較佳實施方案中，該抗體包含選自以下的胺基酸序列對：SEQ ID NOs：4/31、5/41、5/42、10/46、16/50、17/58、23/64、27/59、27/71、和27/72。在一個較佳實施方案中，該變體在VH和/或VL胺基酸序列上具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性，或在VH和/或VL胺基酸序列上包含至少一個且不超過30、20或10個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，該VH包含選自SEQ ID NO：4、5和6的胺基酸序列，且該VL包含選自SEQ ID NO：31、41、42和43的胺基酸序列。在一些實施方案中，在SEQ ID NO：6的胺基酸序列中，X代表任何胺基酸，較佳地代表在SEQ ID NO：4或5的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。在一些實施方案 中，在SEQ ID NO：43的胺基酸序列中，X代表任何胺基酸，較佳地代表在SEQ ID NO：41或42的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，該VH包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH和/或VL上具有至少95至99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中，本發明抗BCMA抗體包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，且該VL包含選自SEQ ID NO：41和42的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH和/VL上具有至少95至99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，該VH包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH和/或VL上具有至少95至99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中，本發明抗BCMA抗體包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH包含選自SEQ ID NO：16、17或19的胺基酸序列，且該VL包含選自SEQ ID NO：50和58的胺基酸序列。在一些實施方案中，在SEQ ID NO：19的胺基酸序列中，X代表任何胺基酸，較佳地代表在SEQ ID NO：16或17的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，該VH包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，且該VL包 含SEQ ID NO：50的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH和/或VL上具有至少95至99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，該VH包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH和/或VL上具有至少95至99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，所述VH包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH和/或VL上具有至少95至99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，該VH包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，且該VL包含選自SEQ ID NO：59、71、72和73的胺基酸序列。在一些實施方案中，在SEQ ID NO：73的胺基酸序列中，X代表任何胺基酸，較佳地代表在SEQ ID NO：71或72的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，該VH包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH和/或VL上具有至少95至99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中，本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗BCMA抗體，該VH包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，且該VL包 含SEQ ID NO：71或72的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體，例如在VH和/或VL上具有至少95至99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在上述任一實施方案中，較佳地，相對於該對照重鏈可變區胺基酸序列，本發明抗體的重鏈可變區在1個或多個CDR(較佳全部3個CDR)區域上包含不超過10個，較佳不超過5個(例如，3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。
在上述任一實施方案中，較佳地，相對於該對照輕鏈可變區胺基酸序列，本發明抗體的輕鏈可變區VL在1個或多個CDR(較佳全部3個CDR)區域上包含不超過10個，較佳不超過5個(例如，3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。
抗體CDR區
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”(在本文中與超變區“HVR”可以互換使用)，是抗體可變區中主要負責與抗原表位結合的胺基酸區域。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本領域公知多種用於在一個給定的VH或VL胺基酸序列中確定其CDR序列的方案。例如，Kabat互補決定區(CDR)是基於序列變異性確定的並且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是結構環的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中，並且由Oxford Molecular的 AbM抗體建模軟件使用。“接觸性”(Contact)HVR基於對可獲得的複雜晶體結構的分析。根據不同的CDR確定方案，這些HVR中的每一個HVR/CDR的殘基如下所述。
Figure 112112319-A0101-12-0024-1
HVR也可以是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列：
VL中的位置24至36或24至34(LCDR1)，位置46至56或50至56(LCDR2)，和位置89至97或89至96位置(LCDR3)；和VH中的位置26至35或27至35B(HCDR1)，位置50至65或49至65(HCDR2)，和位置93至102、94至102或95-102(HCDR3)。
在一個實施方案中，本發明抗體的HVR是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列：
VL中的位置24至34(LCDR1)、位置50至56(LCDR2)、和位置89至97(LCDR3)，以及VH中的位置27至35B(HCDR1)、位置50至65(HCDR2)、和位置93至102(HCDR3)。
HVR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。
除非另有說明，否則在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”或“HVR”或“HVR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的HVR或CDR序列。
除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。
在一個較佳的實施方案中，本發明抗體的HCDR1為根據AbM方案確定的CDR序列；而其餘CDR為根據Kabat方案確定的CDR序列。在另一較佳的實施方案中，本發明CDR序列如表2中所示。
具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat、Chothia、AbM和Contact方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結 合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。
在一些實施方案中，本發明的抗體包含與表1所列任一抗體的對應CDR相同的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其變體。在一些實施方案中，本發明的抗體包含與表1所列任一抗體的對應重鏈CDR相同的至少一個、兩個、或三個HCDR，或其變體。在一些實施方案中，本發明的抗體包含與表1所列任一抗體的對應輕鏈CDR相同的至少一個、兩個、或三個HCDR，或其變體。在本文中，CDR變體是已經藉由至少一個，例如1或2或3個胺基酸取代、缺失和/或插入而修飾的CDR，其中包含CDR變體的抗原結合分子基本上保持包含未修飾CDR的抗原結合分子的生物學特性，例如，保持至少60%,70%,80%,90%，或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。可以理解，各CDR可以單獨修飾或組合修飾。較佳地，胺基酸修飾為胺基酸取代，尤其是保守胺基酸取代，例如表A中列出的較佳保守胺基酸置換。
在一些實施方案中，本發明的抗體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區3(HCDR3)，該HCDR3：
(i)與表1列出的任一抗體的重鏈可變區的HCDR3相同；或
(ii)相對於(i)的HCDR3，包含至少1個且不超過5個(較佳1至3個或更佳1至2個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，且該抗體的重鏈互補決定區3(HCDR3)和輕鏈互補決定區3(LCDR3)：
(i)與表1列出的任一抗體的重鏈和輕鏈可變區序列的HCDR3和LCDR3相同；或
(ii)相對於(i)的HCDR3和LCDR3，共包含至少1個且不超過5個(較佳1至3個或更佳1至2個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2、和HCDR3：
(i)與表1列出的任一抗體的重鏈可變區的HCDR1、HCDR2、和HCDR3分別相同；或
(ii)相對於(i)的HCDR1、HCDR2和HCDR3，共包含至少1個且不超過10，較佳不超過5個(較佳1、2或3個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)，且較佳地在HCDR3區上的胺基酸改變不超過3個(例如，2、1或0個)。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR3：
(i)與表1列出的任一抗體的重鏈和輕鏈可變區的HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR3分別相同；或
(ii)相對於(i)的HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR3，共包含至少1個且不超過10個(較佳1至5個，較佳1、2或3個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1、LCDR2和LCDR3：
(i)與表1列出的任一抗體的輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別相同；或
(ii)相對於(i)的LCDR1、LCDR2和LCDR3，共包含至少1個且不超過10個(較佳1至5個，較佳1、2或3個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR3：
(i)與表1列出的任一抗體的輕鏈和重鏈可變區的LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR3分別相同；或
(ii)相對於(i)的LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR3，共包含至少1個且不超過10個(較佳1-5個，較佳1、2或3個)胺基酸改變(較佳取代、更較佳保守取代)。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該抗體：
(i)包含表1所列任一抗體的重鏈和輕鏈可變區的全部6個CDR區的序列；或
(ii)相對於表1所列任一抗體，在全部6個CDR區上包含不超過10個，較佳不超過5個(例如，3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。
在一個實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含：
(i)如SEQ ID NO：4或5所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：31或41或42所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者
(ii)如SEQ ID NO：10所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：46所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者
(iii)如SEQ ID NO：16或17所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：50或58所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者
(iv)如SEQ ID NO：23所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：64所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列，或者
(v)如SEQ ID NO：27所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO：59或71或72所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列。
在一個較佳的實施方案中，本發明抗體或抗原結合片段包含選自以下的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的HCDR1、2和3序列和LCDR1、2和3序列：
(i)SEQ ID NO：4的VH和SEQ ID NO：31的VL；
(i)SEQ ID NO：5的VH和SEQ ID NO：41的VL；
(iii)SEQ ID NO：5的VH和SEQ ID NO：42的VL；
(iv)SEQ ID NO：10的VH和SEQ ID NO：46的VL；
(v)SEQ ID NO：16的VH和SEQ ID NO：50的VL；
(vi)SEQ ID NO：17的VH和SEQ ID NO：58的VL；
(vii)SEQ ID NO：23的VH和SEQ ID NO：64的VL；
(viii)SEQ ID NO：27的VH和SEQ ID NO：59的VL；
(ix)SEQ ID NO：27的VH和SEQ ID NO：71的VL；
(x)SEQ ID NO：27的VH和SEQ ID NO：72的VL。
在一些實施方案中，本發明提供選自SEQ ID NO：3、9、13、14、15、22、和26的HCDR3、和包含該HCDR3的抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中，本發明提供選自以下的HCDR3和LCDR3序列組合、和包含該組合的抗體或抗原結合片段：(i)SEQ ID NO：3的HCDR3，和選自SEQ ID NO：30、38、39和40的LCDR3；或(ii)SEQ ID NO：9的HCDR3，和SEQ ID NO：45的LCDR3；或(iii)選自SEQ ID NO：13、14和15的HCDR3，和選自SEQ ID NO：49和55的LCDR3；或(iv)SEQ ID NO：22的HCDR3，和SEQ ID NO：63的LCDR3；或(v)SEQ ID NO：26的HCDR3，和選自SEQ ID NO：56、68、69、和70的LCDR3。本發明也提供該CDR組合的變體，例如在該CDR上共包含至少一個且不超過20、10或5個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的變體。本發明也提供包含該變體的抗BCMA抗體或抗原結合片段。
在另一些實施方案中，本發明提供選自以下的CDR序列組合、以及包含該組合的抗體或抗原結合片段：(i)SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、和SEQ ID NO：3的HCDR3；(ii)SEQ ID NO：7的HCDR1、SEQ ID NO：8的HCDR2、和SEQ ID NO：9的HCDR3；(iii)SEQ ID NO：11的HCDR1、SEQ ID NO：12的HCDR2、和SEQ ID NO：13或14或15的HCDR3；(iv)SEQ ID NO：20的HCDR1、SEQ ID NO：21的HCDR2、和SEQ ID NO：22的HCDR3； (v)SEQ ID NO：24的HCDR1、SEQ ID NO：25的HCDR2、和SEQ ID NO：26的HCDR3。在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：11的HCDR1、SEQ ID NO：12的HCDR2、和SEQ ID NO：13或14的HCDR3。
在再一實施方案中，本發明提供選自以下胺基酸序列組合的重鏈CDR組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NOs：1/2/3、7/8/9、11/12/13、11/12/14、20/21/22、和24/25/26。本發明也提供該重鏈CDR組合的變體，在一個較佳實施方案中，該變體在該三個CDR區上共包含至少一個且不超過20、10或5個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。本發明也提供包含該重鏈CDR組合或該變體的抗BCMA抗體。
在一些實施方案中，本發明提供選自以下的CDR組合、以及包含該組合的抗體或抗原結合片段：(i)SEQ ID NO：28的LCDR1、SEQ ID NO：29的LCDR2、和SEQ ID NO：30的LCDR3；(ii)SEQ ID NO：32或33或34的LCDR1、SEQ ID NO：35或36或37的LCDR2、和SEQ ID NO：38或39或40的LCDR3；(iii)SEQ ID NO：32的LCDR1、SEQ ID NO：44的LCDR2、和SEQ ID NO：45的LCDR3；(iv)SEQ ID NO：47的LCDR1、SEQ ID NO：48的LCDR2、和SEQ ID NO：49的LCDR3；(v)SEQ ID NO：51的LCDR1、SEQ ID NO：54的LCDR2、和SEQ ID NO：55的LCDR3；(vi)SEQ ID NO：61的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：63的LCDR3；(vii)SEQ ID NO：52的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：56的LCDR3；(viii)SEQ ID NO：65或66或67的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：68或69或70的LCDR3。
在再一實施方案中，本發明提供具有選自以下胺基酸序列組合的輕鏈CDR組合(按順序分別為LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NOs：28/29/30、32/35/38、33/36/39、32/44/45、47/48/49、51/54/55、61/62/63、52/62/56、65/62/68、和66/62/69。本發明也提供該輕鏈CDR組合的變體，在一個較佳實施方案中，該變體在該三個CDR區上共包含至少一個且不超過20、10或5個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。本發明也提供包含該輕鏈CDR組合或該變體的抗BCMA抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中，本發明提供選自以下的CDR組合、以及包含該組合的抗體或抗原結合片段：(i)SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、和SEQ ID NO：3的HCDR3、SEQ ID NO：28的LCDR1、SEQ ID NO：29的LCDR2、和SEQ ID NO：30的LCDR3；(ii)SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、和SEQ ID NO：3的HCDR3、SEQ ID NO：32或33或34的LCDR1、SEQ ID NO：35或36或37的LCDR2、和SEQ ID NO：38或39或40的LCDR3；(iii)SEQ ID NO：7的HCDR1、SEQ ID NO：8的HCDR2、和SEQ ID NO：9的HCDR3、SEQ ID NO：32的LCDR1、SEQ ID NO：44的LCDR2、和SEQ ID NO：45的LCDR3；(iv)SEQ ID NO：11的HCDR1、SEQ ID NO：12的HCDR2、和SEQ ID NO：13或14或15的HCDR3、SEQ ID NO：47的LCDR1、SEQ ID NO：48的LCDR2、和SEQ ID NO：49的LCDR3；(v)SEQ ID NO：11的HCDR1、SEQ ID NO：12的HCDR2、和SEQ ID NO：13或14或15的HCDR3、SEQ ID NO：51的LCDR1、SEQ ID NO：54的LCDR2、和SEQ ID NO：55的LCDR3；(vi)SEQ ID NO：20的HCDR1、SEQ ID NO：21的HCDR2、和SEQ ID NO：22的HCDR3、SEQ ID NO：61的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO： 63的LCDR3；(vii)SEQ ID NO：24的HCDR1、SEQ ID NO：25的HCDR2、和SEQ ID NO：26的HCDR3、SEQ ID NO：52的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：56的LCDR3；(viii)SEQ ID NO：24的HCDR1、SEQ ID NO：25的HCDR2、和SEQ ID NO：26的HCDR3、SEQ ID NO：65或66或67的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：68或69或70的LCDR3。
在再一實施方案中，本發明提供選自以下胺基酸序列組合的重鏈和輕鏈CDR組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NOs：1/2/3/28/29/30、1/2/3/32/35/38、1/2/3/33/36/39、7/8/9/32/44/45、11/12/13/47/48/49、11/12/14/51/54/55、20/21/22/61/62/63、24/25/26/52/62/56、24/25/26/65/62/68、和24/25/26/66/62/69。本發明也提供該CDR組合的變體，在一個較佳實施方案中，該變體在該六個CDR區上共包含至少一個且不超過20、10或5個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。本發明也提供包含該重鏈和輕鏈CDR組合或該變體的抗BCMA抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、和SEQ ID NO：3的HCDR3、SEQ ID NO：28的LCDR1、SEQ ID NO：29的LCDR2、和SEQ ID NO：30的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、和SEQ ID NO：3的HCDR3、SEQ ID NO：32的LCDR1、SEQ ID NO：35的LCDR2、和SEQ ID NO：38的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、和SEQ ID NO：3的HCDR3、SEQ ID NO：33的LCDR1、SEQ ID NO：36的LCDR2、和SEQ ID NO：39的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：7的HCDR1、SEQ ID NO：8的HCDR2、和SEQ ID NO：9的HCDR3、SEQ ID NO：32的LCDR1、SEQ ID NO：44的LCDR2、和SEQ ID NO：45的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：11的HCDR1、SEQ ID NO：12的HCDR2、和SEQ ID NO：13的HCDR3、SEQ ID NO：47的LCDR1、SEQ ID NO：48的LCDR2、和SEQ ID NO：49的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：11的HCDR1、SEQ ID NO：12的HCDR2、和SEQ ID NO：14的HCDR3、SEQ ID NO：51的LCDR1、SEQ ID NO：54的LCDR2、和SEQ ID NO：55的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：20的HCDR1、SEQ ID NO：21的HCDR2、和SEQ ID NO：22的HCDR3、SEQ ID NO：61的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：63的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：24的HCDR1、SEQ ID NO：25的HCDR2、和SEQ ID NO：26的HCDR3、SEQ ID NO：52的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：56的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：24的HCDR1、SEQ ID NO：25的HCDR2、和SEQ ID NO：26的HCDR3、SEQ ID NO：65的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：68的LCDR3。
在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：24的HCDR1、SEQ ID NO：25的HCDR2、和SEQ ID NO：26的HCDR3、SEQ ID NO：66的LCDR1、SEQ ID NO：62的LCDR2、和SEQ ID NO：69的LCDR3。
在一些實施方案中，SEQ ID NO：15中的X代表任何胺基酸殘基，較佳在SEQ ID NO：13或14的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基，較佳S或R或其保守取代殘基。在一些實施方案中，SEQ ID NO：34中的X代表任何胺基酸殘基，較佳地在SEQ ID NO：32或33的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。在一些實施方案中，SEQ ID NO：37中的X代表任何胺基酸殘基，較佳地在SEQ ID NO：35或36的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。在一些實施方案中，SEQ ID NO：40中的X代表任何胺基酸殘基，較佳地在SEQ ID NO：38或39的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。在一些實施方案中，SEQ ID NO：67中的X代表任何胺基酸殘基，較佳地在SEQ ID NO：65或66的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。在一些實施方案中，SEQ ID NO：70中的X代表任何胺基酸殘基，較佳地在SEQ ID NO：68或69的相應位置處的胺基酸殘基或其保守取代殘基。
在本發明抗體的上述實施方案中，“保守性取代”是指導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸的胺基酸改變。提供功能上相似胺基酸的保守 性置換表是本領域熟知的。在本發明任一實施方案中，在一個較佳的方面，保守取代殘基來自以下的保守替代表A，較佳地為表A中所示較佳置換殘基。
Figure 112112319-A0101-12-0036-2
示例性抗體序列
本發明提供了如實施例中分離並表徵的特異性結合BCMA(例如人BCMA)的全人源抗體。下表1中列出了本發明這些示例性抗體的可變區序列。下表2中給出這些抗體的示例性CDR序列(也見第4圖)。
Figure 112112319-A0101-12-0037-3
Figure 112112319-A0101-12-0038-4
本發明也提供上述抗體的變體。在一個實施方案中，抗體的胺基酸序列或編碼胺基酸序列的核酸已經被突變，但仍與表1中描述的序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高同一性。一些實施方 案，抗體包括突變的可變區胺基酸序列，其中與表1所示的可變區序列相比時，可變區中已突變了不多於1、2、3、4、5或10個胺基酸，但保留基本相同的抗原結合活性。
此外，由於上述抗體每一個都可以與BCMA結合，故可以“混合並匹配”VH和VL(胺基酸序列和編碼所述胺基酸序列的核苷酸序列)以產生結合BCMA的本發明其他抗體。可以使用本領域已知的結合測定法(例如，ELISA，和實施例部分中描述的其他測定法)測試這類“混合和匹配的”抗體與BCMA的結合。在混合和匹配這些鏈時，較佳地，將來自具體VH/VL配對的VH序列替換為結構相似的VH序列。同樣，來自特定VH/VL配對的VL序列較佳地替換為結構上相似的VL序列。
在另一方面，本發明也提供上述抗體的變體。在一個實施方案中，抗體在一個或多個或全部6個CDR區的胺基酸序列或編碼該胺基酸序列的核酸上已經被突變。在一些實施方案中，突變的CDR區的胺基酸序列，與表1的對應CDR區相比時，已突變了不多於1、2、3、4或5個胺基酸，但保留基本相同的抗原結合活性。
此外，鑒於表1抗體的每一者均可以與BCMA結合且抗原結合特異性主要由CDR1、2和3區提供，故可以將VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列“混合並匹配”(即，可以混合並匹配來自不同抗體的CDR，不過每種抗體較佳地含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3)，以產生結合BCMA的本發明其他分子。可以使用本領域已知的結合測定法(例如，ELISA、SET、Biacore)和實施例中描述的那些測定法，測試這類“混合和匹配的”抗體與BCMA的結合。當混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3 序列較佳地替換為結構上相似的CDR序列。同樣，當混合並匹配VL CDR序列時，來自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列較佳地替換為結構上相似的CDR序列。本領域技術人員明瞭，也可以藉由將一個或多個VH和/或VL CDR區序列置換為來自本文中所示抗體的結構上相似的CDR序列，以產生本發明的其它抗體。除前述之外，在一個實施方案中，本文所述抗體的抗原結合片段可以包含VH CDR1、2和3，或VL CDR1、2和3，其中該片段以單域形式與BCMA結合。
II.單鏈scFv抗體
在一個較佳方面，本發明抗體是單鏈scFv抗體。
在本文中，“單鏈scFv抗體”或“scFv”或“單鏈scFv”是指，包含免疫球蛋白或抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的單個多肽鏈，在該單條蛋白鏈中VH區和VL區配對提供抗原結合位點。
在較佳的實施方案中，本發明單鏈scFv抗體的VH區和VL區藉由連接肽例如柔性連接肽共價連接在一起。術語“柔性連接肽”是由胺基酸組成的肽連接子。藉由這樣的肽連接子可以連接抗體中的各個可變結構域，例如VH和VL區。肽連接子通常富含表現柔性的甘胺酸以及表現溶解性的絲胺酸或蘇胺酸。例如可以單獨或組合使用甘胺酸和/或絲胺酸殘基。柔性連接肽或肽連接子的非限定性例子公開於Shen等人，Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008)、WO2012/138475和WO2014/087010，將其內容全文併入作為參考。如本領域已知的，在scFv的構建中，較佳，連接子將利於促使VH和VL配對，且不干擾VH和VL對形成功能有效的抗原結合位點。
在一些實施方案中，本發明scFv單鏈抗體包含由肽鍵連接的胺基酸殘基組成的柔性連接肽或肽連接子。在某些實施方案中，該胺基酸選自二十種天然胺基酸。在某些其他實施方案中，一個或多個胺基酸選自甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺和賴胺酸。在一個較佳實施方案中，一個或多個胺基酸選自Gly,Ser,Thr,Lys,Pro，和Glu。
在一些實施方案中，連接子的長度是約1至30個胺基酸、或約10個至約25個胺基酸、約15個至約20個胺基酸或約10個至約20個胺基酸或者任意介於中間的胺基酸長度。在較佳實施方案中，連接子具有15至25個胺基酸殘基長度，在更較佳實施方案中，具有15至18個胺基酸殘基的長度。在一些實施方案中，連接子的長度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或者更多個胺基酸。
可以用於本發明的肽連接子的實例包括：甘胺酸聚合物(G)n；甘胺酸-絲胺酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是至少1、2、3、4或5的整數；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；以及本領域已知的其它柔性連接子。本領域技術人員可以理解，在一些實施方案中，VH和VL之間的連接子可以完全由柔性連接肽組成，或者連接子可以由柔性連接肽部分以及賦予較小柔性結構的一個或多個部分組成。
在一個較佳實施方案中，肽連接子是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：93)。在一個實施方案中，編碼胺基酸序列SEQ ID NO：93的核苷酸序列在SEQ ID NO：94中給出。在一個實施方案中，編碼胺基酸序列SEQ ID NO：93的核苷酸序列在SEQ ID NO：97中給出。
在一個實施方案中，肽連接子是Gly/Ser連接肽。在一個實施方案中，肽連接子是(GxS)n連接子，其中G=甘胺酸、S=絲胺酸，(x=3，n=8、9或10)或(x=4和n=6、7或8)，在一個實施方案中，x=4，n=6或7。在一些實施方案中，連接子可以包括胺基酸序列(G4S)n，其中n是等於或大於1的整數，例如，n是1至7的整數。在一個較佳實施方案中，x=4，n=7。在一個實施方案中，連接子是(G4S)3。在一個實施方案中，連接子是(G4S)4。在一個實施方案中，連接子是(G4S)6G2。
其它示例性連接子包括但不限於下述胺基酸序列：GGG；DGGGS；TGEKP(參見，例如，Liu等人，PNAS5525-5530(1997))；GGRR(Pomerantz等人.1995，同上)；(GGGGS)n，其中n=1、2、3、4或5(Kim等人，PNAS 93,1156-1160(1996)；EGKSSGSGSESKVD(Chaudhary等人，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(Bird等人，1988,Science242：423-426)，GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；LRQKD(GGGS)2ERP。可選地，可以使用能夠模建DNA-結合位點和肽自身的計算機程序(Desjarlais&Berg,PNAS 90：2256-2260(1993),PNAS91：11099-11103(1994))，或者藉由噬菌體或酵母展示方法，合理地設計柔性連接子。
本發明單鏈scFv抗體中VH和VL可以取任一方向。在一些實施方案中，scFv從N端到C端包含：VH-連接子-VL；或VL-連接子-VH。在一個較佳實施方案中，本發明單鏈scFv抗體從N端到C端包含：VL-連接子-VH。在一個較佳實施方案中，VL以其C末端經由連接子共價連接VH的N末端。
在一些實施方案中，除了連接子，VL和VH結構域之間也可以插入具有特定功能的其它多肽片段，例如具有調節免疫反應功能的多肽片段、或具有引起細胞溶劑或細胞殺傷的多肽片段。
在一些實施方案中，可以藉由在scFv中引入二硫鍵以穩定單鏈抗體。例如，可以藉由引入鏈內或鏈間二硫鍵而連接scFv的VH和VL的構架區。在一個實施方案中，可以藉由將抗體VH和VL的各1個胺基酸殘基突變為半胱胺酸，例如根據Kabat編號系統，VH的44位和VL的100位，或者VH的105位和VL的43位。
本發明的單鏈scFv多肽抗體可以由包括VH-和VL-編碼序列的核酸表達，如Huston等人所述(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879~5883，1988)。還可參見美國專利號5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美國專利公開號20050196754和20050196754。在一些實施方案中，本發明的單鏈scFv抗體在真核細胞中表達，例如酵母細胞、哺乳動物細胞如H293細胞或CHO細胞。在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：99的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：99具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：100的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需 要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：4所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：31所示序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：4所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：31所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：3的HCDR3和SEQ ID NO：30的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：1的VH CDR1、SEQ ID NO：2的VH CDR2、和SEQ ID NO：3的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：28的VL CDR1、SEQ ID NO：29的VL CDR2、和SEQ ID NO：30的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：1的VH CDR1、SEQ ID NO：2的VH CDR2、和SEQ ID NO：3的VH CDR3，以及SEQ ID NO：28的VL CDR1、SEQ ID NO：29的VL CDR2、和SEQ ID NO：30的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：102的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：102具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：103的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：41的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：5所示序列的胺基酸的VH和包括具有SEQ ID NO：41所示序列的胺基酸的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：5所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：41所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：3的HCDR3和SEQ ID NO：38的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：1的VH CDR1、SEQ ID NO：2的VH CDR2、和SEQ ID NO：3的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：32的VL CDR1、SEQ ID NO：35的VL CDR2、和SEQ ID NO：38的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：1的VH CDR1、SEQ ID NO：2的VH CDR2、和SEQ ID NO：3的VH CDR3，以及SEQ ID NO：32的VL CDR1、SEQ ID NO：35的VL CDR2、和SEQ ID NO：38的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：105的抗原結合區或其變體，並特異性 結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：105具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：106的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：42的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的VH和包括具有SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：5所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：42所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：3的HCDR3和SEQ ID NO：39的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：1的VH CDR1、SEQ ID NO：2的VH CDR2、和SEQ ID NO：3的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：33的VL CDR1、SEQ ID NO：36的VL CDR2、和SEQ ID NO：39的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：1的VH CDR1、SEQ ID NO：2的VH CDR2、和SEQ ID NO：3的VH CDR3、 以及SEQ ID NO：33的VL CDR1、SEQ ID NO：36的VL CDR2、和SEQ ID NO：39的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：108的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：108具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：109的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：46的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：10所示序列的胺基酸的VH和包括具有SEQ ID NO：46所示序列的胺基酸的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：10所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：46所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：9的HCDR3和SEQ ID NO：45的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：7的VH CDR1、 SEQ ID NO：8的VH CDR2、和SEQ ID NO：9的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：32的VL CDR1、SEQ ID NO：44的VL CDR2、和SEQ ID NO：45的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：7的VH CDR1、SEQ ID NO：8的VH CDR2、和SEQ ID NO：9的VH CDR3、以及SEQ ID NO：32的VL CDR1、SEQ ID NO：44的VL CDR2、和SEQ ID NO：45的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：111的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：111具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：112的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：50的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：16所示序列的胺基酸的VH和包括具有SEQ ID NO：50所示序列的胺基酸的VL。 在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：16所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：50所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：13的HCDR3和SEQ ID NO：49的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：11的VH CDR1、SEQ ID NO：12的VH CDR2、和SEQ ID NO：13的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：47的VL CDR1、SEQ ID NO：48的VL CDR2、和SEQ ID NO：49的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：11的VH CDR1、SEQ ID NO：12的VH CDR2、和SEQ ID NO：13的VH CDR3、以及SEQ ID NO：47的VL CDR1、SEQ ID NO：48的VL CDR2、和SEQ ID NO：49的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：114的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：114具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：115的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：58的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：17所示序列的胺基酸的VH和包括具有SEQ ID NO：58所示序列的胺基酸的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：17所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：58所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：14的HCDR3和SEQ ID NO：55的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：11的VH CDR1、SEQ ID NO：12的VH CDR2、和SEQ ID NO：14的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：51的VL CDR1、SEQ ID NO：54的VL CDR2、和SEQ ID NO：55的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：11的VH CDR1、SEQ ID NO：12的VH CDR2、和SEQ ID NO：14的VH CDR3、以及SEQ ID NO：51的VL CDR1、SEQ ID NO：54的VL CDR2、和SEQ ID NO：55的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：120的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：120具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：121的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性 的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：64的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：23所示序列的胺基酸的VH和包括具有SEQ ID NO：64所示序列的胺基酸的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：23所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：64所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：22的HCDR3和SEQ ID NO：63的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：20的VH CDR1、SEQ ID NO：21的VH CDR2、和SEQ ID NO：22的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：61的VL CDR1、SEQ ID NO：62的VL CDR2、和SEQ ID NO：63的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：20的VH CDR1、SEQ ID NO：21的VH CDR2、和SEQ ID NO：22的VH CDR3、以及SEQ ID NO：61的VL CDR1、SEQ ID NO：62的VL CDR2、和SEQ ID NO：63的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：117的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：117具有至少90%、92%、95%、 97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：118的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：59的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：27所示序列的胺基酸的VH和包括具有SEQ ID NO：59所示序列的胺基酸的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：27所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：59所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：26的HCDR3和SEQ ID NO：56的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：24的VH CDR1、SEQ ID NO：25的VH CDR2、和SEQ ID NO：26的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：52的VL CDR1、SEQ ID NO：62的VL CDR2、和SEQ ID NO：56的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：24的VH CDR1、SEQ ID NO：25的VH CDR2、和SEQ ID NO：26的VH CDR3、以及SEQ ID NO：52的VL CDR1、SEQ ID NO：62的VL CDR2、和SEQ ID NO：56的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：123的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：123具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：124的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：71的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：27所示序列的胺基酸的VH和包括具有SEQ ID NO：71所示序列的胺基酸的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：27所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：71所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：26的HCDR3和SEQ ID NO：68的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：24的VH CDR1、SEQ ID NO：25的VH CDR2、和SEQ ID NO：26的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：65的VL CDR1、SEQ ID NO：62的VL CDR2、和SEQ ID NO：68的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：24的VH CDR1、SEQ ID NO：25的VH CDR2、和SEQ ID NO：26的VH CDR3、以及SEQ ID NO：65的VL CDR1、SEQ ID NO：62的VL CDR2、和SEQ ID NO：68的VL CDR3。
在某些實施方式中，本發明的抗體是抗BCMA scFv或其抗原結合片段，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：126的抗原結合區或其變體，並特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)。在一些實施方案中，變體與SEQ ID NO：126具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中，抗BCMA scFv由SEQ ID NO：127的核苷酸編碼。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv抗體包括：包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含SEQ ID NO：72的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區，以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連接子，例如連接子肽。在某些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：72的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括具有SEQ ID NO：27所示序列的胺基酸的VH和包括具有SEQ ID NO：72所示序列的胺基酸的VL。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括SEQ ID NO：27所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO：72所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施 方案中，抗BCMA scFv包含SEQ ID NO：26的HCDR3和SEQ ID NO：69的LCDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：24的VH CDR1、SEQ ID NO：25的VH CDR2、和SEQ ID NO：26的VH CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包括：SEQ ID NO：66的VL CDR1、SEQ ID NO：62的VL CDR2、和SEQ ID NO：69的VL CDR3。在某些實施方式中，抗BCMA scFv包含：SEQ ID NO：24的VH CDR1、SEQ ID NO：25的VH CDR2、和SEQ ID NO：26的VH CDR3、以及SEQ ID NO：66的VL CDR1、SEQ ID NO：62的VL CDR2、和SEQ ID NO：69的VL CDR3。
III．scFv-Fc抗體
具有Fc區的抗體具有若干優勢，包括，但不限於：可以藉由Fc區介導效應子功能，例如CDC和ADCC免疫學活性；藉由Fc區的二聚化功能形成二價抗體，可以提供強的抗原結合親和力，和/或改變血漿半衰期和腎臟清除率；二價抗體可以以不同於單價Fab或scFv抗體的速率內化，改變免疫功能或載體功能。例如，α發射體不需要內化來殺傷靶細胞，但許多藥物和毒素將受益於免疫複合物的內化。
因此，在一個較佳的實施方案中，提供本發明單鏈scFv抗體與抗體Fc區融合形成的scFv-Fc抗體。在一些實施方案中，所述抗體包含本發明的單鏈scFv抗體和野生型或改變的Fc區。在一個較佳實施方案中，所述抗體從N端到C端包含：Fc-VH-連接子-VL或Fc-VL-連接子-VH；或較佳地VH-連接子-VL-Fc或VL-連接子-VH-Fc。在一個較佳實施方案中，Fc藉由鉸鏈區連接到可變區(VH或VL)上。在一些實施方案中，Fc為來自人免疫球蛋白的Fc區，較佳人IgG1或IgG4 Fc區。在一個較佳實施方案中，Fc區具有SEQ ID NO：132所示 的胺基酸序列、或相對於SEQ ID NO：132的胺基酸序列包含至少一個，兩個或三個，但不超過20個，10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：132的胺基酸序列具有至少95-99%同一性的序列。在一些實施方案中，本發明的單鏈scFv抗體藉由鉸鏈區連接到Fc區上。在一個實施方案中，鉸鏈區為C8鉸鏈區，例如包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列、或相對於SEQ ID NO：95的胺基酸序列包含至少一個，兩個或三個，但不超過5個胺基酸改變的胺基酸序列。
在一些較佳的實施方案中，本發明提供這樣的抗體，其特異性結合BCMA多肽(例如，具有胺基酸序列SEQ ID NO：74的BCMA多肽或其片段)，並且包含選自SEQ ID NO：101、104、107、110、113、116、119、122、125、和128的胺基酸序列、或相對於其包含至少一個，兩個或三個，但不超過20個，10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
下表3中列出了本發明一些示例性ScFv-Fc抗體的胺基酸序列及用於構建其的單鏈scFv的胺基酸序列和核苷酸序列。表3也顯示了基於US20170226216A1的描述構建的對照scFv-Fc重組單鏈抗體的胺基酸序列和核苷酸序列。這些scFv-Fc抗體中所用的連接子和鉸鏈的胺基酸序列和核苷酸序列示於第8圖中。
Figure 112112319-A0101-12-0057-5
在一些實施方案中，本發明的scFv-Fc抗體具有效應子功能。術語“效應子功能”是指，可歸因於抗體的Fc-區的那些生物活性，其隨抗體類別而改變。存在五種主要的抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些中的一些可以進一步分為亞類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。抗體的效應子功能包括例如但不限於：C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性的細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)的下調；和B-細胞激活。在一些實施方案中，本 發明的scFv-Fc抗體藉由效應細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性而阻斷、抑制表達BCMA的細胞(尤其是MM細胞)的生長、和/或殺死該細胞。
在某些實施方案中，Fc區可以包含具有一個或多個提高ADCC活性的胺基酸置換的Fc-區，例如，Fc-區的位置298、333和/或334的置換(殘基的EU編號)。在一些實施方案中，也可以對Fc-區進行改變，以導致改變的(即，提高的或降低的)C1q結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)(參見，例如，US6,194,551、WO99/51642和Idusogie，E.E.等，J.Immunol.164(2000)4178-4184)。
在另一些實施方案中，可以對Fc進行改變以增加或降低其糖基化程度和/或改變其糖基化模式。對Fc的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。舉例而言，可實施一或多種胺基酸取代以消除一或多個糖基化位點，由此消除該位點處的糖基化。可製備具有改變類型的糖基化的抗體，例如具有減小量的岩藻糖基殘基的低或無岩藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。這類改變的糖基化模式已顯示可增加抗體的ADCC能力。
因此，在一些較佳實施方案中，本發明提供這樣的抗體，其Fc區是低或無岩藻糖基化的，從而可以顯著地增加抗體Fc結構域與效應細胞上表達的Fcγ受體(如FcγRIIIa)的結合親和力，由此導致抗體具有增強的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性。例如，抗體中岩藻糖的量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。可以藉由MALDI-TOF質譜法測量，相對於與Asn 297連接的所有糖結構(例如複合型、雜合型及高甘露糖型結構)的總和，計算在Asn297處糖鏈內的岩藻糖的平均量，由此確定岩藻糖的量，例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位於Fc區中大約位置297處(Fc區殘基的EU 編號)的天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中微小的序列變化，Asn297也可能位於位置297上游或下游約±3個胺基酸位置，即位置294與300之間。參見例如US2003/0157108；US2004/0093621。與“去岩藻糖基化”或“低岩藻糖基化”抗體變體有關的公佈實例還包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki，A.等，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)614-622。可以在能夠產生去岩藻糖基化或低岩藻糖基化抗體的細胞系中產生此類抗體變體。此類細胞的實例包括蛋白質岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO細胞(Ripka，J.等，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)：533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是實施例11)；及基因剔除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8剔除的CHO細胞(參見，例如Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)614-622；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。再例如，細胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基轉移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基轉移酶)，從而可以在Ms704、Ms705及Ms709細胞系中表達缺乏岩藻糖的抗體。此外，EP 1,176,195也描述了具有功能受破壞的FUT8基因的細胞系，在這類細胞系中表達的抗體展現低岩藻糖化。備選地，還可使用岩藻糖苷酶切除抗體的岩藻糖殘基；舉例而言，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體去除岩藻糖基殘基(Tarentino等人(1975)Biochem.14：5516-23)。
此外，本發明也考慮具有平分型(bisected)寡糖的抗體變體，例如，其中與Fc區連接的雙觸角寡糖被GlcNAc平分的抗體。這些抗體變體可具有降低的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。這些抗體變體的實例描述於例如WO 2003/011878；US6,602,684；和US 2005/0123546。本發明也考慮在與Fc區連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。這些抗體變體可具有提高的CDC功能。這些抗體變體描述於例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
評價目標分子的ADCC活性的體外測定試驗的非限制性實例描述於US5,500,362(參見，例如Hellstrom，I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(參見Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者，可採用非放射性測定方法(參見例如用於流式細胞術的ACTITM非放射性細胞毒性測定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)和CytoTox96®非放射性細胞毒性測定(Promega，Madison，WI))。適用於這些測定的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。備選地或另外地，可以在體內評價目標分子的ADCC活性，例如，在如Clynes，R.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公開的動物模型中評價。為評價補體活化，可進行CDC測定(參見，例如Gazzano-Santoro，H.等，J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg，M.S.等，Blood101(2003)1045-1052；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。也可進行C1q結合測定，以確定抗體的C1q結合和CDC活性。參見例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。
在某些實施方案中，本發明也考慮具有一些但非所有效應子功能的抗體變體，這使其成為某些應用的理想候選物，在所述應用中抗體的體內半衰期是重要的，但某些效應子功能(如補體和ADCC)是不必要或有害的。可進行如上所述的體外和/或體內測定試驗，以確認CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可進行Fc受體(FcR)結合測定以確保抗體缺乏FcγR結合(因此很可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn結合能力。例如，Fc區可以包含消除或減弱效應子功能的突變，例如具有突變P329G和/或L234A和L235A的人IgG1 Fc區，或具有突變P329G和/或S228P和L235E的人IgG4 Fc區。
在一些實施方案中，本發明的scFv-Fc區抗體可以藉由Fc區的二聚化作用而形成二價抗體，從而可以進一步具有增加的抗體總親和力和穩定性、或形成多特異性如雙特異性。例如Fc區可以包含i)人IgG1亞類的同二聚Fc-區，或ii)人IgG4亞類的同二聚Fc-區，或iii)異二聚Fc-區，其中a)一個Fc-區多肽包含突變T366W，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A和Y407V，或b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C，或c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C，而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一些實施方案中，本發明scFv-Fc重組抗體可以借組於Fc區部分而直接融合或綴合其它分子，包括但不限於，螢光染料、細胞毒素、放射性同位素等，例如，用於抗原定量研究、將抗體固定化用於親和力測量、用於治療劑的靶向輸送、使用免疫效應細胞的Fc-介導的細胞毒性測試以及許多其他用途。
B．多核苷酸和宿主
在一個方面，本發明提供基本上純化的核酸分子，該核酸分子編碼包含上述結合BCMA的抗體鏈的區段或結構域的多肽。在一些實施方案中，本發明核酸分子編碼結合BCMA的抗體鏈(例如本發明的任何抗體，包括單鏈scFv抗體和scFv-Fc抗體，及其片段)。
本發明的一些核酸包含編碼表1所示任一抗體的重鏈可變區或其變體的核苷酸序列，和/或表1所示相應抗體的輕鏈可變區或其變體的核苷酸序列。在一個具體實施方案中，核酸分子是表1中列出的DNA VH序列和/或DNA VL序列。本發明的一些其他核酸分子包含與表1中所示的核酸分子的核苷酸序列基本上相同(例如，至少65%、80%、95%、或99%同一性)的核苷酸序列。從適宜的表達載體表達時，由這些多核苷酸編碼的多肽能夠顯示BCMA抗原結合能力。
本發明中還提供多核苷酸，該多核苷酸編碼來自上文所述的結合BCMA的抗體的重鏈VH或輕鏈VL序列的至少一個CDR區和通常全部三個CDR區。一些進一步的實施方案中，多核苷酸編碼上文所述的結合BCMA的抗體的重鏈和/或輕鏈的完整或基本上完整可變區序列。
如本領域技術人員明瞭的，因為密碼子簡併性，每一個抗體或多肽胺基酸序列可以由多種核酸序列編碼。
本發明的一些核酸序列包含編碼重鏈VH的核苷酸序列，其包含：(i)選自SEQ ID NOs：75至82的核苷酸序列或與其具有例如，至少80%、90%或99%同一性的核苷酸序列。一些其他核酸序列包含編碼輕鏈VL的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：83-92的核苷酸序列或與其具有例如，至少80%、90%或99%同一性的核苷酸序列。
在一些實施方案中，本發明的核酸序列編碼本發明的上述任何單鏈scFv抗體。在一些實施方案中，編碼scFv抗體的本發明核酸序列包含選自以下的編碼重鏈VH序列的核苷酸序列和編碼輕鏈VL序列的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO：75的序列或與其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：83的序列或或與其基本相同的序列，
(ii)SEQ ID NO：76的序列或與其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：84或85的序列或或與其基本相同的序列，
(iii)SEQ ID NO：77的序列或與其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：86的序列或或與其基本相同的序列，
(iv)SEQ ID NO：78的序列或與其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：87的序列或或與其基本相同的序列，
(v)SEQ ID NO：79的序列或與其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：88的序列或或與其基本相同的序列，
(vi)SEQ ID NO：80的序列或與其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：89的序列或或與其基本相同的序列，
(v)SEQ ID NO：81的序列或與其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：90的序列或或與其基本相同的序列，
(vi)SEQ ID NO：82的序列或與其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：91或92的序列或或與其基本相同的序列。
在一個較佳實施方案中，編碼scFv抗體的本發明核酸還包含編碼連接子的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：94中所示的序列或與其基本相同的序列。
在一個更較佳的實施方案中，編碼scFv抗體的本發明核酸包含選自SEQ ID NO：100、103、106、109、112、115、118、121、124、和127的序列，或與其基本相同的序列。
在上述任一實施方案中，在一個較佳方面，“基本相同”的核苷酸序列是指與參考核苷酸序列在序列上具有至少80%、85%、90%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同一性的序列。核苷酸序列的同一性可以使用本領域公知的各種序列比對方法確定。例如可以從NCBI(National Center for Biotechnology Information,Bethesda,MD)的網站上獲得BLAST序列比對檢索工具。典型地，百分比同一性採用NCBI Blast的默認參數進行。
可以藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼結合BCAM的抗體或其結合片段的現有序列(例如，表1至3中所示的序列)，產生這些多核苷酸序列。核酸的直接化學合成可以藉由本領域已知的方法完成，如Narang等人，1979,Meth.Enzymol.68：90的磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981的二乙基磷醯亞胺法；和美國專利號4,458,066的固相支持法。藉由PCR向多核苷酸序列引入突變可以如同例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編著)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編著)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；and Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991中所述那樣進行。
C．抗體的製備
抗體可以使用重組方法和組合物進行生產，例如US 4,816,567中所述。
在一個實施方案中，提供了包含編碼本文所述結合BCMA的抗體的分離核酸的載體。此核酸可以編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和/或包含抗體的VH的胺基酸序列。在進一步的實施方案中，載體為表達載體。在進一步的實施方案中，本發明提供包含此核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞包含(例如已經用以下載體轉化)：(1)包含編碼含有抗體VL的胺基酸序列和含有抗體VH的胺基酸序列的核酸的載體，或(2)包含編碼含有抗體VL的胺基酸序列的核酸的第一載體和包含編碼含有抗體VH的胺基酸序列的核酸的第二載體。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HEK293細胞、或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施方案中，提供製備抗BCMA抗體的方法，其中所述方法包括在適於抗體表達的條件下培養如上文提供的包含編碼抗體的核酸的宿主細胞，且視需要從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。
對於抗BCMA抗體的重組生產，可以分離編碼抗體的核酸，例如如上所述的核酸，並且插入一個或多個載體內用於進一步克隆和/或在宿主細胞中表達。此核酸可以使用常規程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重和輕鏈可變區的基因特異性結合的寡核苷酸探針)容易地分離和測序。
多種表達載體可以用來表達編碼結合BCMA的抗體鏈(例如本發明的任何抗體，包括scFv抗體和全長抗體)的多核苷酸。基於病毒的表達載體和非病毒表達載體都可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體和系統包含質粒、游離型載體和人工染色體，一般含有用於表達蛋白質或RNA的表達盒(參見，例如，Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。有用的病毒載體包括 基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒的載體，基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒載體和Semliki Forest病毒(SFV)的載體。參見，Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；和Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表達載體的選擇依賴於待在其中表達該載體的預期宿主細胞。一般，表達載體含有與編碼結合BCMA的抗體鏈或多肽的多核苷酸有效連接的啟動子。除啟動子之外，也可能要求或需要其他調節元件用於高效表達結合BCMA的抗體鏈或片段。這些元件通常包括ATG起始密碼子和鄰近核糖體結合位點或其他序列。此外，可以藉由納入適用於所用細胞系統的增強子增強表達的效率(參見，例如，Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；和Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。例如，SV40增強子或CMV增強子可用於提高哺乳動物宿主細胞中的表達。
表達載體還可以提供分泌信號序列以形成含有BCMA結合多肽的融合蛋白。或者，也可以將BCMA結合抗體/多肽序列在插入載體之前與信號序列連接。在一個較佳實施方案中，信號肽包含如SEQ ID NO：133所示的胺基酸序列。用於接受編碼結合BCMA的抗體輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的序列的載體有時還可以編碼恆定區或其部分。此類載體允許將可變區表達為與恆定區的融合蛋白，由此導致完整抗體或其片段的產生。通常，此類恆定區是人的恆定區例如人IgG1 Fc區。在一個較佳實施方案中，與可變區融合的Fc區包含如SEQ ID NO：132所示的胺基酸序列。
用於載體的選殖或表達的合適宿主細胞包括原核或真核細胞。例如，特別是當不需要糖基化和Fc效應子功能時，抗體可以在細菌中生產。對於抗體片段和多肽在細菌中的表達，參見例如US 5,648,237、US5,789,199和 US 5,840,523。(還參見Charlton,K.A.，見：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編輯)，Humana Press，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中的表達)。在表達後，抗體可以在可溶級分中與細菌細胞糊分離且可以進一步純化。除了原核生物外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母是用於抗體編碼載體的合適選殖或表達宿主，包括糖基化途徑已被“人源化”的真菌和酵母菌株，這導致具有部分或完全人糖基化模式的抗體的生產。參見Gerngross，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等，Nat.Biotech(2006)24：210-215。用於糖基化抗體表達的合適宿主細胞也可以源自多細胞生物(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了眾多杆狀病毒株，其可以與昆蟲細胞結合使用，特別用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染。植物細胞培養物也可以用作宿主。參見，例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用於在轉基因植物中生產抗體的PLANTIBODIESTM技術)。可以用作宿主的脊椎動物細胞包括，例如，懸浮生長適應化的哺乳動物細胞系可以是有用的。有用的哺乳動物宿主細胞系的其他實例是SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293或例如Graham,F.L.等，J.Gen Virol.36(1997)59中描述的293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞爾托利細胞(例如Mather,J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-251中描述的TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝細胞(BRL 3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，例如Mather,J.P.等，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的；MRC 5細胞；和FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細 胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub,G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤細胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。對於適合於抗體生產的一些哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo.B.K.C.(編輯)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)pp.255-268。在一些較佳的實施方案中，哺乳動物宿主細胞用來表達並產生結合BCMA的本發明抗體多肽。
D．抗體的篩選、鑒定和表徵
可以藉由本領域已知的各種試驗，針對其物理/化學特性和/或生物活性，篩選、鑒定、或表徵本文中提供的抗BCMA抗體。
可以從表達人抗體的酵母展示文庫中選擇與所關注的目標抗原以高親合力結合的酵母。已有多種在酵母表面呈遞或展示抗體或抗體片段以及篩選文庫的方法，參見例如US20110076752A1,US9845464B2,Boder and Wittrup,1997,Nat.Biotechnol.,15,553-557；Blasie等2004,Gene,342,211-218；Sazinsky等2008,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105,20167-20172；Tasumi等2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,106,12891-12896；Kontermann和Dubel,2010,Antibody Engineering,Springer Protocols；Kuroda和Ueda 2011,Biotechnol.Lett.,33,1-9；Rakestraw等2011,PEDS,24,525-530；邵榮光等人(編輯)，抗體藥物研究與應用，人民衛生出版社(2013)。可以例如藉由以下非限制性方式進行酵母展示文庫篩選：首先可以藉由磁珠分選(MACS)進行篩選。例如可以將呈遞IgG或抗體片段的酵母群接觸生物素化的靶抗原一段時間、之後洗滌、與鏈黴親和素磁珠(可獲自Miltenyi；Biotec)孵育，藉由在LS磁柱(可獲自Miltenyi；Biotec)上捕獲而富集與靶抗原結合的酵母細胞。之後，可以藉由FACS技術進行多輪富集。在FACS分選中，可以將酵母群體接 觸降低濃度的生物素化的靶抗原(以篩選高親和力抗體)或來自不同物種的抗原同源物(以篩選具有不同物種交叉反應性傾向的抗體)後，洗滌細胞，重懸在二標溶液(例如，包含鏈黴親和素-PE和抗人LC-FITC的混合物)中冰上孵育，洗滌細胞後重懸在緩衝液如FACS洗滌緩衝液中，在流式細胞儀例如FACSAria(BD Bioscience)上分選LC-FITC陽性(IgG呈遞)和鏈黴親和素-PE陽性(靶結合)表型的酵母細胞，用於進一步增殖和選擇。在FACS分選中，也可以使用負選擇試劑，例如Xu等人(Protein Engineering,Design & Selection,2013,Vol 26,No.10,pp663-670)中描述的多特異性試劑(PSR)，替代靶抗原與IgG呈遞酵母進行孵育，藉由上述相同的二標和FACS分選，以消弱抗體的非特異性結合及後續的成藥性問題。
對於抗體的鑒定，可以就其抗原結合活性，例如藉由已知方法，如ELISA、αLISA、蛋白質印跡、抗體或反相陣列等、以及實施例中所述的方法，鑒定或表徵本發明的抗體。
例如，可以將抗體點在玻璃或硝基纖維素芯片上。用含有BCMA的溶液阻斷並孵育載玻片，洗滌以除去未結合的抗體，並用螢光標記的相應二抗檢測結合的抗體。藉由螢光載玻片掃描儀測量螢光信號。相似地，對於反相陣列，將重組BCMA、細胞上清液、細胞或組織裂解液、體液等，點在玻璃或硝基纖維素芯片上。封閉載玻片並用針對BCMA上特定表位的抗體孵育陣列。洗掉未結合的抗體，並用螢光標記的相應二抗檢測結合的抗體。螢光信號藉由螢光載玻片掃描儀來測量(Dernick,G.等，J.Lipid Res.，52(2011)2323-2331)。
也可以採用ForteBio測定法，檢測抗體。ForteBio親和力測定可以按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：p.270-8)進行。例如，可以將AHQ傳感器在分析緩衝液中線下平衡30分鐘，然後線上檢測60秒建立基線。之後，將在線加載了經純化的抗體的AHQ傳感器，暴露於100nM抗原作用5分鐘，將傳感器轉移至分析緩衝液進行5分鐘的線下測量。使用1：1結合模型進行動力學分析。
也可以藉由流式細胞術檢測抗體與表面表達BCMA的細胞的結合。例如，可以將表達BCMA的H929細胞與系列稀釋的抗體在PBS 1% BSA中在冰上孵育一段時間(例如30分鐘)。之後與二抗(例如藻膽色素標記的二抗)在PBS 1% BSA中在冰上避光孵育一段時間(例如30分鐘)。洗滌細胞後藉由流式細胞術分析細胞。流式細胞術可以在Accuri C6系統(BD Biosciences)上進行，並利用Graphpad軟體計算EC50值。
E．融合物和綴合物
再一方面，本發明提供包含本發明抗體的融合物或綴合物。可以藉由將本發明抗體融合或綴合於異源分子而產生融合物或綴合物。在一些實施方案中，本發明抗體多肽可以與一個或多個異源分子融合或綴合，其中所述異源分子包括但不限於蛋白/多肽/肽、標記物、藥物、和細胞毒性劑。蛋白質、多肽或肽或化學分子與抗體融合或綴合的方法是本領域已知的。參見，例如，美國專利號5,336,603、5,622,929和EP 367,166。
在一個實施方案中，本發明抗體與異源蛋白或多肽或肽重組融合而形成融合蛋白。在再一實施方案中，本發明抗體與蛋白分子或非蛋白分子綴合而產生綴合物。
在一些實施方案中，本發明抗體可以以全長抗體或抗體片段的形式與異源分子融合或綴合。在一個較佳的實施方案中，本發明單鏈scFv抗體用於融合或綴合。在進一步較佳的實施方案中，提供包含本發明單鏈scFv的融合蛋白。這樣的融合蛋白可以容易地藉由本領域已知的重組方法進行製備。在再一較佳的實施方案中，提供包含本發明單鏈scFv的綴合物，例如，包含本發明的scFv與非蛋白藥物分子的綴合物。
連接子可以用於共價連接本發明融合物和/或綴合物中的不同實體。連接子包括化學連接子或單鏈肽連接子。在一些實施方案中，本發明單鏈抗體，例如scFv抗體，藉由肽連接子融合到其它肽段或蛋白質上。在一些實施方案中，本發明單鏈抗體，例如scFv抗體，藉由化學連接子綴合到其它分子例如標記物或藥物分子上。
可以用於形成本發明的肽連接子包括由胺基酸殘基組成的肽。這樣的連接子肽通常是柔性的，允許與之連接的抗原結合部分如scFv獨立地移動。連接子肽的長度可以是由本領域技術人員根據實際情況而容易地確定，例如長至少4至15個胺基酸，或者更長，例如大約20至25個胺基酸。
可以用於形成本發明的化學連接子，包括，例如，各種偶聯劑。偶聯劑的實例有N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞胺基硫烷(IT)、亞胺酸酯的雙官能衍生物(如己二亞胺酸二甲基酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(如戊二醛)、二疊氮化合物(如二(對疊氮基苯甲醯)己二胺)、雙-重氮衍生物(如雙-(對二重氮苯甲醯)-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯)、以及雙活性氟化合物(如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。此外，連接子可以是利於多肽在遞送至靶 位點後釋放的“可裂解連接子”。例如，可以使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫化物的連接子(Chari等，Cancer Research 52(1992)127-131；US 5,208,020)。
F．用於診斷和檢測的方法和組合物
在一方面，本發明提供本發明抗BCMA抗體、融合物或綴合物在診斷和檢測中的用途。本文中提供的任何抗BCMA抗體、融合物或綴合物均可以用於檢測生物樣品中人BCMA的存在。本文中使用的術語“檢測”包括定量或定性檢測。示例性的檢測方法包括但不限於，免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如，FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如，RT-PCR)。在一些實施方案中，生物樣品包括體液、細胞或組織。在某些實施方案中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。
在一個實施方案中，提供了抗BCMA抗體、融合物或綴合物用於診斷或檢測方法。在進一步的方面中，提供了檢測生物樣品中BCMA存在的方法。在一些實施方案中，該方法包括將生物樣品在允許抗BCMA抗體、融合物或綴合物與BCMA結合的條件下接觸本文中所述的抗BCMA抗體、融合物或綴合物，並且檢測抗BCMA抗體、融合物或綴合物和BCMA之間是否形成了複合物。這樣的方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，將抗BCMA抗體、融合物或綴合物用於選擇適宜使用抗BCMA抗體治療的受試者，例如，當BCMA是用於患者選擇的生物標誌物時。可以使用本發明的抗體、融合物或綴合物診斷的示例性病症包括，B細胞相關病症，例如多發性骨髓瘤。在一些實施方案中，提供了用本發明的抗體、融合物或綴合物對多發性骨髓瘤(MM)患者進行分層的方法，該方法包括確定該患者的B細胞、較佳惡性B細胞是否在該B細胞 的表面上表達BCMA蛋白，其中該B細胞在其表面上表達BCMA蛋白，則該患者將可能響應並使用以BCMA為靶點的治療劑(例如抗-BCMA抗體)進行治療。在一些實施方案中，抗BCMA抗體可以與診斷劑或可檢測劑綴合。在一些實施方案中，本發明提供用於診斷或檢測的試劑盒，其包含本發明的任何抗BCMA抗體、融合物或綴合物。
G．用於治療的方法和組合物
再一方面，本發明涉及治療B細胞相關病症的方法，包括向該受試者施用有效量的本發明抗體或其抗原結合片段、或本發明的融合物或綴合物。
術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，受試者是人。
術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。
B細胞相關病症是與異常B細胞活性相關的病症，包括，但不限於，B細胞惡性腫瘤、漿細胞惡性腫瘤、自身免疫疾病。可以使用BCMA抗體治療的示例性病症包括例如，多發性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、惡性潛能不確定的B細胞增殖、淋巴瘤樣肉芽腫病、移植後淋巴增生病症、免疫調節病症、類風濕性關節炎、重症肌無力、特發性血小板減少性紫癜、抗磷脂綜合症、恰加斯病、格雷夫斯病、韋格納肉芽腫、結節性多動脈炎、舍格倫氏綜合症、尋常天皰瘡、硬皮病、多發性硬化症、ANCA相關血管炎、古德帕斯丘氏病、川崎病、自身免 疫性溶血性貧血和急進性腎小球腎炎、重鏈病、原發性或免疫細胞相關的澱粉樣變性、或意義未明的單株丙種球蛋白病、全身性紅斑狼瘡、風濕性關節炎。
如實施例中所示，本發明人基於篩選自人抗體庫的抗體序列而構建本發明的抗體。因此，有利地，在一些實施方案中，本發明抗體是包含全人源的VH區和全人源的VL區胺基酸序列的全人抗體，例如表1中所示的抗體、以及表3所示的單鏈scFv及由其構建的包含人hFc片段的scFv-Fc抗體。在一些實施方案中，本發明綴合物和融合物是包含全人抗體，例如全人單鏈scFv的綴合物和融合物。因此，在一個較佳的方面，本發明的抗體、融合物和綴合物尤其適用於人的治療應用。在一些較佳的實施方案中，本發明抗體、融合物和綴合物用於治療人的B細胞相關病症，如B細胞惡性腫瘤，較佳地，多發性骨髓瘤(MM)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些實施方案中，本發明抗BCMA抗體、融合物和綴合物的抗腫瘤作用，包括但不限於例如，減少腫瘤體積、減少腫瘤細胞數目、減少腫瘤細胞增殖或減少腫瘤細胞存活。
多發性骨髓瘤是成熟漿細胞的B細胞惡性腫瘤。骨髓中純株性漿細胞異常增生，並且可侵襲鄰近的骨，以及有時侵襲血液。多發性骨髓瘤的變體形式包括：顯性多發性骨髓瘤、冒煙型多發性骨髓瘤、漿細胞白血病、非分泌型多發性骨髓瘤、IgD型多發性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性漿細胞瘤以及髓外漿細胞瘤。(參見，例如Braunwald等人(編輯)，Harrison’s Principles of Internal Medicine，第15版(McGraw-Hill 2001))。
存在多種不同類型的非霍奇金淋巴瘤。例如，非霍奇金淋巴瘤可以分為侵襲性的(快速生長的)和惰性的(緩慢生長的)。非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括：伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性 大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤以及套細胞淋巴瘤。發生於骨髓或乾細胞移植之後的淋巴瘤通常為B細胞非霍奇金淋巴瘤。
可以理解，可將本發明的BCMA抗體、融合物和綴合物與其它治療形式組合施用，用於上述疾病例如腫瘤的治療。該其它治療形式包括治療劑、放療、化療、移植、免疫療法等。在一些實施方案中，本發明抗體分子、融合物和綴合物與其它治療劑聯合使用。示例性的治療劑包括細胞因子、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗炎劑、化療劑、放療劑、治療性抗體或者其它活性劑和輔助劑，例如抗腫瘤藥物。
H．組合物和製劑
本發明還考慮包含本文任一種或多種BCMA結合抗體分子、融合物和綴合物、多核苷酸、載體、或宿主細胞的組合物。組合物包括但不限於藥物組合物。藥物組合物可以用於向細胞或動物單獨施用或者與一種或多種其它治療形式組合施用。
可以製備本發明抗體、融合物和綴合物的藥物製劑，例如藉由使具有所需純度的抗體、融合物和綴合物，與一種或多種視需要的藥學可接受的載體(Remington’s Pharmaceutical Science，第16版，Osol，A.(編輯)(1980))混合，以凍乾製劑或水溶液的形式製備。藥學可接受的載體在採用的劑量和濃度下對接受者一般是無毒的，並且包括但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(如十八基二甲基苄基氯化銨；氯己雙銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯例如對羥基苯甲酸甲或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲 酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚(乙烯吡咯烷酮)；胺基酸，如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡合物(例如Zn-蛋白質絡合物)；和/或非離子型表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。
示例性凍乾抗體製劑描述於US 6,267,958。水性抗體製劑包括US 6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，後面的製劑包括組胺酸-醋酸鹽緩衝液。
本文中的製劑還可以針對所治療的特定適應症按照需要含有一種以上的活性成分，較佳具有互補活性且不會不利地彼此影響的那些。此類活性成分適於以對於預期目的有效的量組合存在。
描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。
實施例
實施例1. 酵母展示技術篩選抗BCMA全人源抗體
利用酵母展示技術，從總的多樣性大於1×108的6個合成抗體庫中篩選特異性結合BCMA的全人源抗體(庫的設計和構建可以參見WO 2009036379，WO2010105256，WO2012009568)。簡言之，篩選過程如下：首先，第一輪篩選藉由磁珠分選方法(MACS)並利用生物素標記的、與Fc融合的重組人BCMA篩選6個不同的合成抗體庫來完成；第二輪篩選基本按照Chao et al.Nature Protocols,2006的方法，藉由流式細胞分選技術(FACS)並利用與Fc融合的猴源 及鼠源的BCMA完成；第三輪篩選中，藉由FACS技術，基本按照Xu et al.Protein Engineering,Design & Selection,2013描述的，使用多特異性試劑(PSR)負向選擇抗體庫種中的抗體，以消弱抗體的非特異性結合及後續的成藥性問題；第四輪篩選藉由FACS技術利用His標簽的人源BCMA單體蛋白完成；最後一輪篩選是藉由FACS技術分別富集人源、猴源和鼠源BCMA特異性抗體。
批量優化是初步篩選步驟中的常規環節。簡言之，藉由分離初始篩選所富集的抗體群體的重鏈區(本階段的多樣性在103到104之間)並將其與酵母菌中的天然人輕鏈序列庫重新組合來完成。這一過程被稱為輕鏈批通量重組(light chain batch shuffle，LCBS)，最終製備具有人源BCMA結合傾向的、重鏈/輕鏈配對多樣性在107到108之間的抗體庫。該抗體庫進一步經過如上段落中描述的一輪磁珠篩選和四輪流式篩選，進一步富集人源、猴源和鼠源BCMA特異性抗體。如上所述的，此過程中分別使用人源、猴源和鼠源的BCMA與Fc的融合蛋白，以及His標簽的人源BCMA單體蛋白作陽性篩選，PSR作陰性篩選。
完成上述篩選過程後，將富集的含有特異抗體序列的酵母群體塗在瓊脂平板上，能夠得到包含特定抗體基因的酵母單株菌落。挑取純株，利用sanger法對其可變區進行測序，大約有460個序列獨特的H3：L3抗體(即，具有獨特的重鏈CDR3區和輕鏈CDR3區對的抗體)被鑒定出來。然後藉由酵母表達並使用蛋白A親和層析的方法純化獲得了一些抗體。
經進一步測試這些抗體與多種重組BCMA蛋白及BCMA穩定轉染的CHO-S細胞系及BCMA陽性腫瘤細胞系NCI-H929的結合能力，最終獲得了10株與NCI-H929親和力較好的選植株作進一步分析。這些抗體也表現出與猴BCMA具 有一定的交叉反應性。此10株抗體分子的胺基酸序列以及對應的核苷酸序列在上表1中給出。
實施例2. 酵母表達抗體與NCI-H929細胞的親和力驗證
藉由流式細胞術，對上述10株與NCI-H929親和力較好的酵母表達抗體及一株與NCI-H929無親和力的抗體(ADI-34819)(作為負對照)作進一步細胞結合驗證。具體方法如下：
1.取人NCI-H929(ATCC，CRL-9068)細胞，調整細胞密度為2x106/ml，在96孔微孔板中每孔加入100μl，400G離心5min，去上清。
2.將抗BCMA抗體從400nM濃度起始，在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中以3倍梯度連續稀釋共12個點，每孔加入100μl稀釋的抗體，4℃孵育30min；
3.400G離心5min，加入PBS洗兩次，之後每孔加入100μl稀釋在PBS(1%BSA)中的二抗(藻膽色素蛋白(Phycoerythrin，PE)標記的羊抗人IgG抗體，SoutherBiotech，終濃度5μg/ml)，4℃孵育30min(避光)；
4.400G離心5min，加入PBS洗兩次，每孔用100μl PBS重懸細胞。在Accuri C6系統(BD Bioscience)上進行流式細胞術，檢測PE陽性信號，並基於C6軟體計算MFI。用GraphPad軟件計算EC50值。
檢測結果如第1圖和下表4所示。由實驗結果可以確認，10株抗體在400nM濃度下都與NCI-H929細胞有比較強的親和力，並隨著抗體濃度的稀釋，其與NCI-H929的親和力也逐步降低。
Figure 112112319-A0101-12-0079-6
實施例3. scFv-hFc重組單鏈抗體表達載體的構建
為驗證scFv形式候選抗體與靶標的親和力，分別構建了上述10株抗體的單鏈抗體可變區(scFv)與人Fc片段的重組蛋白表達載體。同時，也構建了ADI-34819抗體的重組單鏈抗體表達載體(作為負對照)、以及基於US20170226216 A1中公開的huBCMA-10序列的重組單鏈抗體表達載體(作為標準品對照)。所構建的這些scFv-Fc重組蛋白的胺基酸序列及其對應的編碼核苷酸序列見上表3。
構建表達表3中所列scFv-Fc重組蛋白的表達載體。簡言之，藉由限制內切酶酶切帶有鼠源κ輕鏈信號肽(METDTLLLWVLLLWVPGSTG，SEQ ID NO：133；編碼序列ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTCCTGCTGC TGTGGGT GCCCG GATCCACAGGA,SEQ ID NO：134)和人IgG1 Fc編碼序列(SEQ ID NO：132)的pDD1-hFc載體(pDD1-hFc載體基於pTT5載體、藉由插入該信號肽和hFc編碼基因而構建)，並藉由同源重組的方法將合成的scFv序列選殖至輕鏈信號肽和hFc的編碼基因之間形成融合表達。第2圖中顯示了載體構建的示意圖。
實施例4. scFv-hFc重組單鏈抗體的表達
1.根據所需轉染體積傳代HEK293細胞，轉染前一天將細胞密度調整至1.2x106/ml。
2.取3mL OptiMEM培養基(Gibco，31985-070)作為轉染緩衝液，分別上述相應攜帶scFv-hFc重組單鏈抗體編碼基因的質粒30μg，混勻後過濾靜置5min。
3.加90μL的1mg/mL聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences，23966)到質粒-OptiMEM混合液中，混勻後室溫孵育15min。將混合物輕柔倒入細胞，36.5℃，8% CO2培養。
4.20h後補加0.6mL的200g/L的FEED(大豆蛋白腖Phytone Peptone(BD，211906)與植物蛋白腖Phytone(BD，210931)等比例)，0.3mL的200g/L的葡萄糖母溶液，30μL的2.2M丙戊酸鈉鹽(VPA)(Sigma，P4543)。
5.繼續培養至活力低於60%，收集上清，過濾後作親和層析純化。
實施例5. 蛋白A法純化scFv-hFc重組單鏈抗體
1.用超純水沖洗填料及重力管柱，去除填料保護液。
2.用0.1M NaOH將重力管柱及填料浸泡2h。每根重力管柱添加300μL蛋白A親和層析介質(Mabselect sure)(GE Healthcare，17-5438-03)填料。
3.細胞料液以8000r/min離心40min，再使用0.45μm濾器過濾，4℃保存備用。
4.用大量超純水沖洗重力管柱和填料，去除鹼液。
5.純化前用10ml結合/清洗緩衝液(20mM Tris+150mM NaCl(pH 7.2))平衡填料。
6.上樣，將需要純化的上清通過管柱。
7.洗滌，用5至10ml結合/清洗緩衝液(20mM Tris+150mM NaCl(pH 7.2))沖洗填料，去除非特異性結合蛋白。
8.洗脫，用1mL的洗脫緩衝液(100mM檸檬酸鈉/檸檬酸緩衝液，pH 3.5)沖洗填料，收集特異性結合蛋白。
9.在收集液中按85μl/ml的比例加入中和緩衝液(2M Tris)，調節pH至6至7。
實施例6. scFv-hFc重組單鏈抗體的Fortebio檢測
基於光纖生物傳感器的生物膜層光學干涉技術(BLI)，測定抗體分子的動力學常數。
BLI的基本原理是：當生物分子結合到傳感器表面就形成了一層生物膜，生物膜對透過傳感器的光的波形造成干涉現象，干涉現象以相位移動的方式被檢測，從而可以檢測結合到傳感器分子數量的變化；根據實時響應值的變化擬合出動力學曲線，並計算出結合常數(Kon)、解離常數(Kdis)、親和力(KD)。
實驗中所選用的Fortebio設備型號為Octet Red96，ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：p.270-8)進行。具體流程為：
1.實驗開始前半個小時，根據樣品數量，取合適數量的AHC Sensor浸泡於SD buffer(50ml PBS+0.1% BSA+0.05% Tween-20)中。
2.取100μl的SD buffer、scFv-hFc抗體、人BCMA-His抗原(ACRO BIOSYSTEMS，BCA-H522Y)，分別加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板中。
3.根據樣品位置布板，選擇傳感器位置，設置運行步驟及時間：Baseline、Loading~1nm、Baseline、Association和Dissociation時間取決於樣品結合、解離速度；轉速為1000rpm，溫度為30℃。
4.10個scFv-hFc重組單鏈抗體與人BCMA-His親和力檢測結果詳見表5。
Figure 112112319-A0101-12-0083-7
 *對照scFv-Fc為根據US20170226216 A1的BCMA-10序列中scFv構建的scFv-hFc重組蛋白(參見實施例3，SEQ ID NO；131)的親和力水平。
由上表數據可見，10株單鏈抗體與單價人源BCMA(BCMA-His)的親和力(KD值)均與對照單鏈抗體與BCMA-His的親和力相當。其中，ADI-34857和ADI-34860兩株單鏈抗體與BCMA-His的親和力，與對照單鏈抗體的最為接近。
實施例7. scFv-hFc重組單鏈抗體與NCI-H929親和力的檢測
scFv-hFc融合抗體製備完成後，進一步對其與NCI-H929的親和力作了驗證。具體方法如下：
1.取人NCI-H929(ATCC，CRL-9068)細胞，調整細胞密度為2x106/ml，在96孔微孔板中每孔100μl,400G離心5min，去上清。
2.將scFv-hFc抗體從400nM濃度起始，在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中以3倍梯度連續稀釋共12個點，每孔加入100μl稀釋的抗體，4℃孵育30min；
3.400G離心5min，加入PBS洗兩次，每孔加入100μl稀釋在PBS(1% BSA)中的二抗((藻膽色素蛋白(Phycoerythrin，PE)標記的羊抗人IgG抗體，SoutherBiotech，終濃度5μg/ml)，4℃孵育30min(避光)；
4.400G離心5min，加入PBS洗兩次，每孔100μl PBS重懸細胞。在Accuri C6系統(BD Bioscience)上進行流式細胞術，檢測PE陽性信號，並基於C6軟體計算MFI。用GraphPad軟體計算EC50值。
檢測結果如第3圖和下表6所示。由圖中結果可見，除ADI-34846單鏈抗體外，其它單鏈抗體與NCI-H929細胞的親和力(EC50值)都優於對照單鏈抗體與NCI-H929細胞的親和力。
Figure 112112319-A0101-12-0085-8

Claims (25)

  1. 一種分離的特異性結合B細胞成熟抗原(BCMA)的抗體或其抗原結合片段，該抗體包含
    (a)SEQ ID NO：11所示的HCDR1胺基酸序列，SEQ ID NO：12所示的HCDR2胺基酸序列，SEQ ID NO：14所示的HCDR3胺基酸序列，SEQ ID NO：51所示的LCDR1胺基酸序列，SEQ ID NO：54所示LCDR2包含的胺基酸序列，和SEQ ID NO：55所示的LCDR3胺基酸序列；或
    (b)SEQ ID NO：20所示的HCDR1胺基酸序列，SEQ ID NO：21所示的HCDR2胺基酸序列，SEQ ID NO：22所示的HCDR3胺基酸序列，SEQ ID NO：61所示的LCDR1胺基酸序列，SEQ ID NO：62所示的LCDR2胺基酸序列，和SEQ ID NO：63所示的LCDR3胺基酸序列；或
    (c)SEQ ID NO：7所示的HCDR1胺基酸序列，SEQ ID NO：8所示的HCDR2胺基酸序列，SEQ ID NO：9所示的HCDR3胺基酸序列，SEQ ID NO：32所示的LCDR1胺基酸序列，SEQ ID NO：44所示的LCDR2胺基酸序列，和SEQ ID NO：45所示的LCDR3胺基酸序列；或
    (d)SEQ ID NO：11所示的HCDR1胺基酸序列，SEQ ID NO：12所示的HCDR2胺基酸序列，SEQ ID NO：13所示的HCDR3胺基酸序列，SEQ ID NO：47所示的LCDR1胺基酸序列，SEQ ID NO：48所示LCDR2包含的胺基酸序列，和SEQ ID NO：49所示的LCDR3胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區VH，該VH包含选自SEQ ID NOs：17、23、10和16的胺基酸序列。
  3. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含輕鏈可變區VL，該VL選自包含SEQ ID NOs：58、64、46和50的胺基酸序列。
  4. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中
    (a)VH包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列；或者
    (b)VH包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列；或者
    (c)VH包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列；或者
    (d)VH包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，VL包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有以下一個或多個特性：
    (i)以小於100nM的KD值，與人BCMA結合；
    (ii)以小於100nM的EC50值，與細胞表面表達的人BCMA結合；
    (iii)與人BCMA結合的解離速率常數(Kd)小於3×10-2；
    (iv)與人BCMA的胞外域ECD上的表位特異性結合；
    (v)阻斷、抑制表達人BCMA的細胞的生長、和/或殺死所述細胞。
  6. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是全人源抗體。
  7. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是單鏈scFv抗體。
  8. 如請求項7所述的抗體或其抗原結合片段，其中該單鏈scFv包含：從N端到C端，VL結構域-連接子-VH結構域，或VH結構域-連接子-VL結構域。
  9. 如請求項8所述的抗體或其抗原結合片段，其中該連接子包含SEQ ID NO：93的胺基酸序列。
  10. 如請求項7的抗體或其抗原結合片段，其中該單鏈scFv抗體包含選自SEQ ID NO：114、120、108和111的胺基酸序列。
  11. 如請求項7所述的抗體或其抗原結合片段，其中該單鏈scFv與Fc區連接。
  12. 如請求項11所述的抗體或其抗原結合片段，其中該單鏈scFv藉由鉸鏈區與Fc區連接。
  13. 如請求項11所述的抗體或其抗原結合片段，其中該Fc區是人IgG1或IgG4 Fc區。
  14. 如請求項13所述的抗體或其抗原結合片段，其中該Fc區是低或無岩藻糖基化的。
  15. 如請求項1項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含選自SEQ ID NO：116、122、110和113的胺基酸序列。
  16. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  17. 一種包含如請求項16所述的核酸的載體。
  18. 一種包含如請求項17所述的載體的宿主細胞。
  19. 一種製備如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的方法，包括：在適於表達該抗體或其抗原結合片段的條件下，培養包含編碼該抗體或其抗原結合片段的核酸的宿主細胞。
  20. 一種包含如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的綴合物或融合物。
  21. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或如請求項20所述的綴合物或融合物，以及藥用載體。
  22. 一種檢測樣品中BCMA的方法，包括：
    (a)將該樣品與如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或如請求項20所述的綴合物或融合物接觸；和
    (b)檢測該抗體或其抗原結合片段或該綴合物或融合物和BCMA蛋白之間複合物的形成。
  23. 一種如請求項1至15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或如請求項20所述的綴合物或融合物、或如請求項21所述的藥物組合物的用途，其用於製備治療B細胞相關病症的藥物。
  24. 如請求項23所述的用途，其中該B細胞相關病症選自：B細胞惡性腫瘤、漿細胞惡性腫瘤、和自身免疫疾病。
  25. 如請求項23所述的用途，其中該B細胞惡性腫瘤是多發性骨髓瘤(MM)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
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