TW202204379A - 用以篩選抗體片段的方法、由此製備的重組抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本揭示內容是關於一種用以篩選對流感病毒具有專一性之抗體片段的方法。依據本揭示內容某些實施方式，該流感病毒可為A型流感病毒或B型流感病毒。本揭示內容亦提供篩選出來的抗體、由該抗體製備的重組抗體，以及其用以診斷流感病毒感染之用途。
Description
本揭示內容是關於一種用以篩選對流感病毒具有專一性之抗體片段的方法，以及篩選出之抗體片段於診斷流感病毒感染的用途。
酵素連結免疫吸附檢定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以及側流式免疫檢定法(lateral flow immunoassay, LFIA)為快速進行分子定量/半定量偵測的技術。該些免疫檢定平臺可作為用以預防/治療疾病、保障食品安全、偵測免疫原及控制環境汙染的工具。具體而言，LFIA符合世界衛生組織(World Health Organization, WHO)，對於ASSURED (可負擔、靈敏、專一、便於操作、快速且準確、不需設備以及可交付)的規範，可作為未經訓練的人員在資源缺乏而亟需健康照護及對感染性疾病控制時的疾病診斷工具
在研發ELISA及LFIA之應用時，經常遭遇不同的挑戰。上述兩種免疫檢定平臺的關鍵組成物為與抗體相關的親和性試劑，該試劑多來自免疫化(immunized)之動物的單株或是多株抗體。這些來自動物的抗體作為親和性試劑有三個缺點：第一，發現及研發動物抗體的時程至少需耗費16-24個月，時間長於一般預防主要疾病惡化的關鍵時期(例如，人類的流行性感染疾病的爆發)；第二，動物B細胞對於一抗原的反應通常取決於該抗原少數的免疫優勢B細胞抗原決定位，造成作為親和性試劑的動物抗體選擇受限；第三，即使已獲得可作為親和性試劑的動物抗體，也無法保證該些抗體具有分辨高度相似之抗原的能力，且最終產品經常不易分辨有毒病原株及與其相關但不具毒性的病原株。
流感病毒因其快速變異、基因漂變及基因體重組的特性，導致新穎流感病毒株的出現，使其可跨越物種的限制感染多種宿主，像是1997年的H5N1 (香港株)、2013年的H7N9 (中國株)、H10N8 (中國株)及H6N1 (臺灣株)以及2014年的H5N6 (香港株)。快速偵測該些新興的流感病毒株是反應流感大規模爆發及季節性流感對人類社會及經濟所造成之威脅的關鍵方法。用以偵測流感病毒核蛋白(nucleoprotein, NP)的快速流感診斷測試(Rapid influenza diagnostic test, RIDT)，可協助健康照護的專業人員做出立即且有效的治療決策，並且避免非必要的抗生素及抗病毒藥物之處方。LFIA檢定法相關的檢測A型流感病毒(influenza virus type A, IAV)及B型流感病毒(influenza virus type B, IBV)的測試，已經可以RIDT之型式被廣泛地取得，但是該些測試的靈敏度因為無法涵蓋持續增加且多樣的流感病毒株而落在40%至70%的範圍內。
綜上所述，在本發明相關領域亟需一種能有效率地製造一抗體的方法，其中該抗體具有足夠的專一性及親和力，可分辨流感病毒的亞型，以建立用以預防及/或治療感染的診斷平臺。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。
如本文的實施方式及廣泛的描述，本揭示內容的一態樣是關於一種用於篩選對流感病毒具有專一性之抗體片段的方法。依據本揭示內容實施方式，該方法包含以下步驟：
(a) 提供一由噬菌體表現的單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)抗體庫，其包含複數個由噬菌體表現的scFv，其中每個由噬菌體表現之scFv的重鏈變異域(heavy chain variable domain, VH domain)對蛋白A具有結合親和力，以及每個由噬菌體表現之scFv的輕鏈變異域(light chain variable domain, VL domain)對蛋白質L具有結合親和力；
(b) 將步驟(a)之該由噬菌體表現之scFv抗體庫曝露於一標的核蛋白中，該標的核蛋白包含一選自由序列編號：1-6所組成之群組的胺基酸序列；
(c) 自步驟(b)之該由噬菌體表現之scFv抗體庫篩選出一第一複數個噬菌體，其分別表現與該標的核蛋白具有結合親和力的scFv；
(d) 在具有至少一擾亂核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情況下，將步驟(c)挑選的該第一複數個噬菌體曝露於該標的核蛋白中，其中該擾亂核蛋白包含一選自由序列編號：1-6所組成之群組的胺基酸序列，且該擾亂核蛋白之胺基酸序列與該標的核蛋白之胺基酸序列不同；
(e) 自步驟(d)之該第一複數個噬菌體挑選一第二複數個噬菌體，其中在擾亂核蛋白存在的情況下，該第二複數個噬菌體分別表現與該標的蛋白具有結合親和力的scFv；
(f) 分別使步驟(e)挑選的該第二複數個噬菌體表現複數個可溶性scFv；
(g) 使步驟(f)之該複數個可溶性scFv曝露於該標的核蛋白中；
(h) 確認步驟(g)中該複數個可溶性scFv與該標的蛋白個別的結合親和力；以及
(i) 基於步驟(h)之結果，挑選一可溶性scFv作為抗體片段，其中相較於該複數個可溶性scFv中其他的可溶性scFv，該作為抗體片段的可溶性scFv與該標的蛋白具有較優異的親和性。
依據本揭示內容某些實施方式，流感病毒為IAV。依據某些實施方式，流感病毒為IBV。在某些例示性的實施方式中，流感病毒為IAV亞型(如，H1N1、H3N2或H5N1)。
依上述方法選擇的抗體片段適用於製備一重組抗體，其中該重組抗體是用以偵測流感病毒的感染，例如：IAV或IBV的感染。依據本揭示內容某些實施方式，25個抗體片段分別為「NP1」至「NP25」，是選自由噬菌體表現的scFv之抗體庫，且依據該些抗體片段製備25個重組抗體。本揭示內容的第二態樣是關於一種重組抗體或抗體片段(例如，scFv)，其結構包含一VL域及一VH域，其中該VL域包含一第一輕鏈互補決定區(complementarity determining region, CDR-L1)、一第二輕鏈CDR (CDR-L2)以及一第三輕鏈CDR (CDR-L3)，且該VH域包含一第一重鏈CDR (CDR-H1)、一第二重鏈CDR (CDR-H2)以及一第三重鏈CDR (CDR-H3)。
依據某些實施方式，抗體片段NP1的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：7-12之胺基酸序列；抗體片段NP2的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：13-18之胺基酸序列；抗體片段NP3的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：19-24之胺基酸序列； 抗體片段NP4的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：25-3之胺基酸序列；抗體片段NP5的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：31-36之胺基酸序列；抗體片段NP6的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：37-42之胺基酸序列；抗體片段NP7的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：43-48之胺基酸序列；抗體片段NP8的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：49-54之胺基酸序列；抗體片段NP9的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：55-60之胺基酸序列；抗體片段NP10的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：61-66之胺基酸序列；抗體片段NP11的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：67-72之胺基酸序列；抗體片段NP12的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：73-78之胺基酸序列；抗體片段NP13的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：79-8之胺基酸序列；抗體片段NP14的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：85-90之胺基酸序列；抗體片段NP15的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：91-96之胺基酸序列；抗體片段NP16的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：97-102之胺基酸序列；抗體片段NP17的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：103-108之胺基酸序列；抗體片段NP18的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：109-114之胺基酸序列；抗體片段NP19的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：115-120之胺基酸序列；抗體片段NP20的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：121-126之胺基酸序列；抗體片段NP21的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：127-132之胺基酸序列；抗體片段NP22的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：133-138之胺基酸序列；抗體片段NP23的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：139-144之胺基酸序列；抗體片段NP24的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：145-150之胺基酸序列；以及抗體片段NP25的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分別包含序列編號：151-156之胺基酸序列。
依據某些實施方式，抗體片段NP1的該VL域及該VH域分別包含與序列編號：157及158具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP2的該VL域及該VH域分別包含與序列編號：159及160具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP3的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：161及162具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP4抗體片段NP3的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：163及164具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP5的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：165及166具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP6的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：167及168具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP7的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：169及170具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP8的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：171及172具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP9的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：173及174具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP10的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：175及176具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP11的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：177及178具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP12的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：179及180具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP13的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：181及182具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP14的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：183及184具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP15的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：185及186具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP16的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：187及188具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP17的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：189及190具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP18的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：191及192具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP19的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：193及194具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP20的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：195及196具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP21的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：197及198具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP22的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：199及200具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP23的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：201及202具有至少85%相似度之胺基酸序列；抗體片段NP24的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：203及204具有至少85%相似度之胺基酸序列；以及抗體片段NP25的該VL域及該VH域分別包含一具有與序列編號：205及206具有至少85%相似度之胺基酸序列。
本揭示內容的其他態樣係關於一種由一個體分離之生物樣本來診斷該個體是否受到一流感病毒感染的方法。所述方法包含以下步驟：利用本揭示內容之抗體片段或重組抗體偵測生物樣本中是否存在流感病毒之核蛋白，其中該生物樣本存在該核蛋白表示該個體受到該流感病毒的感染。依據某些實施方式，該流感病毒為IAV或IBV。在某些特定實施例中，該流感病毒為H1N1、H3N2或H5N1。
據此，經過訓練的人員或臨床的操作者可及時為一亟需之個體提供適當的治療。具體來說，當一個體的生物樣本中有該核蛋白存在，可施予該個體一有效量的抗病毒治療(例如，奧司他韋(oseltamivir)、瑞樂沙(Zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)、巴羅沙韋瑪波西酯(baloxavir marboxil)、金剛胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)或其組合)，以舒緩及/或改善流感病毒相關的感染。
該個體為一哺乳類；較佳為一人類。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
I. 定義
為了便於說明，此處統整性地說明本說明書、實施例以及後附的申請專利範圍中所記載的特定術語。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，除非本說明書令另有定義，此處及申請專利範圍中使用的單數型「一」涵蓋其複數型；「至少一」 (at least one)以及「一或多」 (one or more)具有相同涵義且包含一、二、三或更多。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
本揭示內容中，「抗體」 (antibody) 是以最廣泛的意義來使用，具體涵蓋單株抗體(包括全長的單株抗體)、多株抗體、多重專一性抗體(例如，雙專一性抗體)及抗體片段，只要其展現出欲求的生物學活性即可。「抗體片段」 (antibody fragments)包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結合區或變異區。抗體片段的實例包含，抗原結合區(fragment antigen-binding, Fab)、Fab’、F(ab’)2、單鏈變異片段、雙體(diabodies)、線性抗體(linear antibodies)、單鏈抗體分子以及由抗體片段所形成的多重專一性抗體。
本揭示內容中，「抗體庫」 (antibody library) 是指一群經表現的抗體及/或抗體片段，用以篩選及/或組合成完整抗體。抗體及/或抗體片段可以表現於核糖體(ribosome)、噬菌體或細胞表面(特別是酵母菌細胞表面)。
在本揭示內容中，「單鏈變異片段」 (single-chain variable fragment或scFv) 是指包含一免疫球蛋白之重鏈變異域(variable domain of the heavy chain, VH)及輕鏈變異域(variable domain of the light chain, VL)的融合蛋白，其中該VH及VL是共價鍵結以形成一VH:VL異二聚體(heterodimer)。該VH及VL可直接連結或透過一由胜肽編碼之連接子連結，其中該連接子可連接VH的N端及VL的C端，或是連接VH的C端及VL的N端。連接子通常為包含多個能增加可撓性之甘胺酸(glycine)及多個能增加溶解性之絲胺酸(serine)或蘇胺酸(threonine)。即使移除抗體之恒定域且插入連接子，scFv蛋白仍保有原免疫球蛋白的專一性。可由包含用以編碼VH及VL序列的核酸來表現scFv多肽抗體。
在本揭示內容中，「EC50
」是指一抗體或其抗原結合區域的濃度，該濃度在活體外或活體試驗中可引發一反應，其為最大反應的一半量(即最大反應及基準值的中間量)。
在本揭示內容中，「互補決定區」 (complementarity determining region, CDR)是指抗體的高度變異區域，其形成與結合之抗原的三維結構互補的表面。每個抗體重鏈及輕鏈從N端到C端共包含3個CDR (CDR-1、CDR-2及CDR-3)。HLA-DR的抗原結合位總共包含6個CDR，其中3個CDR (亦即，CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)源自重鏈的變異區域，以及3個CDR (亦即，CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)源自輕鏈的變異區域。CDR的胺基酸殘基與結合之抗原緊密接觸，其中和抗原最緊密接觸的通常與重鏈的CDR3有關。
在本揭示內容中，「噬質體」 (phagemid)一詞在本揭示內容是指一結合細菌噬菌體及質體特性的載體。細菌噬菌體是指任何一種可感染細菌的病毒。
此處針對多肽序列所述的「序列相似度百分比」 (Percentage (%) sequence identity)係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：
%
其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
本揭示內容及請求保護之發明概念亦包含抗體之胺基酸序列的微小變異，其中胺基酸序列的變異維持至少85%序列相似度，例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似度。可藉由特定修飾來改變抗體的特性，而不影響其生理活性。舉例來說，可改變及/或刪除某些胺基酸而不影響本發明抗體的生理活性(即，其中和流感病毒的能力)。特別是，保留性胺基酸取代亦包含於其中。保留性取代為具有相似/相關側鏈之胺基酸間的相互取代。一般來說，由基因編碼的胺基酸可分為四大類：(1)酸性胺基酸，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)非帶電極性胺基酸，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的分類是：絲胺酸及蘇胺酸係屬脂肪羥基(aliphatic-hydroxy)類；天冬醯胺酸及麩醯胺係屬含醯胺(amide-containing)類；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係屬脂肪類；而苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸則屬芳香(aromatic)類。舉例來說，當可想見若以異白胺酸或纈胺酸取代白胺酸、以麩胺酸取代天門冬胺酸、以絲胺酸取代蘇胺酸，或是以一結構相似的胺基酸取代另一胺基酸時，並不會造成分子結合或蛋白特性的顯著改變，特別是當該取代位置不是位於骨架區域時，胺基酸之間的取代更不會影響上述特性。可藉由檢測抗體衍生物之特定活性來瞭解一胺基酸的改變是否可形成一具功能性的抗體。可利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的方法來製備抗體片段或類似物。抗體片段或類似物之較佳的胺基及羧基末端是鄰近功能域的邊界。
在本揭示內容中，「個體」 (subject)一詞是指包含人類的動物，其可接受本發明方法的治療。除非特定指出，否則「個體」一詞同時意指男性及女性。
II. 發明說明
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以篩選對流感病毒具有專一性之抗體片段的方法。依據本揭示內容的實施方式，該方法包含以下步驟：
(a) 提供一由噬菌體表現的scFv抗體庫，其包含一複數個由噬菌體表現的scFv，其中每個由噬菌體表現的scFv之VH域對蛋白質A具有結合親和力，以及每個由噬菌體表現之scFv的VL域對蛋白質L具有結合親和力；
(b) 將步驟(a)之該由噬菌體表現之scFv抗體庫曝露於一標的核蛋白中，該標的核蛋白包含一選自由序列編號：1-6所組成之群組的胺基酸序列；
(c) 自步驟(b)之該由噬菌體表現之scFv抗體庫篩選出一第一複數個噬菌體，其分別表現與該標的核蛋白具有結合親和力的scFv；
(d) 在具有至少一擾亂核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情況下，將步驟(c)挑選的該第一複數個噬菌體曝露於該標的核蛋白中，其中該擾亂核蛋白包含一選自由序列編號：1-6所組成之群組的胺基酸序列，且該擾亂核蛋白之胺基酸序列與該標的核蛋白之胺基酸序列不同；
(e) 自步驟(d)之該第一複數個噬菌體挑選一第二複數個噬菌體，其中在擾亂核蛋白存在的情況下，該第二複數個噬菌體分別表現與該標的蛋白具有結合親和力的scFv；
(f) 使步驟(e)挑選的該第二複數個噬菌體分別表現複數個可溶性scFv；
(g) 將步驟(f)之該複數個可溶性scFv曝露於該標的核蛋白中；
(h) 確認步驟(g)中該複數個可溶性scFv與該標的蛋白個別的結合親和力；以及
(i) 基於步驟(h)之結果，挑選一可溶性scFv作為抗體片段，其中相較於該複數個可溶性scFv中其他的可溶性scFv，該作為抗體片段的可溶性scFv與該標的蛋白具有較優異的親和性。
本發明方法可用以篩選對流感病毒具有結合親和力及/或專一性的抗體片段，據以提供一種可偵測不同流感病毒亞型的方法，其中該流感病毒具有高度抗原相似度。依據本揭示內容某些實施方式，經篩選出來的抗體片段可用以偵測A型流感病毒(亦即，IAV)或B型流感病毒(亦即，IBV)。非限制之IAV實例包含，H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N7。在一特定實施例中，流感病毒為H1N1、H3N2或H5N1。
在步驟(a)中，提供一由噬菌體表現的scFv抗體庫。依據本揭示內容某些實施方式，該由噬菌體表現之scFv抗體庫的骨架為人類IGKV1-NL1*01/IGHV3-23*04生殖細胞系序列，並以特定引子利用PCR反應來多樣化其CDR序列，包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。經蛋白A及蛋白L篩選後，製備由噬菌體表現的scFv抗體庫(以下稱為「GH2抗體庫」，包含本發明中的GH2-5、GH2-6、GH2-7、GH2-8、GH2-9、GH2-10、GH2-11、GH2-12、GH2-13、GH2-14、GH2-16、GH2-18、GH2-20、GH2-22及GH2-24抗體庫)，其中每個由噬菌體表現的scFv具有一可結合蛋白A之VH域，以及一可結合蛋白L之VL域。習知技藝人士可依據美國專利公告第10,336,815 B2號或美國專利公告第10,336,816 B2號以及Ing-Chien Chen等人所發表的公開文獻(High throughput discovery of influenza virus neutralizing antibodies from phage-displayed synthetic antibody libraries, Scientific Reports 7, Article number: 14455 (2017))所述之方法來建構該由噬菌體表現的scFv抗體庫。該申請案及文獻在此一併納入本揭示內容，以供參照。
在步驟(b)中，將GH2抗體庫曝露於一標的蛋白中，其是選自由(1) NPA1：源自H3N2的重組核蛋白，包含序列編號：1的胺基酸序列；(2) NPA2：源自H1N1的重組核蛋白，包含序列編號：2的胺基酸序列；(3) NPA3：源自H1N1的重組核蛋白，包含序列編號：3的胺基酸序列； (4) NPA4：源自H1N1的重組核蛋白，包含序列編號：4的胺基酸序列；(5) NPA5：源自H5N1的重組核蛋白，包含序列編號：5的胺基酸序列；以及(6) NPB1：源自IBV的重組核蛋白，包含序列編號：6的胺基酸序列。依據某些實施方式，是將該標的核蛋白固定於基質(像是瓊脂榶樹脂或聚丙烯醯胺)上，之後再與本發明GH2抗體庫混合。
在步驟(c)中，是由GH2抗體庫中篩選出複數個噬菌體(亦即，一第一複數個噬菌體)，其中經篩選出的噬菌體會分別表現對標的核蛋白具有結合專一性之scFv。具體來說，以酸性沖提緩衝溶液(例如pH 2.2的甘胺酸溶液)處理步驟(b)的產物，藉以破壞標的核蛋白與噬菌體表現之scFv之間的結合。據此，收集複數個分別表現對標的蛋白具有結合親和力之scFv的噬菌體。
在步驟(d)中，為了增加對標的蛋白具有結合專一性之scFv的群體，在具有至少一擾亂核蛋白存在的情形下，將步驟(c)選出的複數個噬菌體(亦即，第一複數個噬菌體)加至標的核蛋白中，且每個擾亂核蛋白包含與該標的核蛋白不同之胺基酸序列。依據某些實施方式，該標的核蛋白為NPA1蛋白，其被固定於一基質(像是瓊脂糖樹脂或聚丙烯醯胺)上，之後在具有至少一擾亂核蛋白存在的情形下與本發明GH2抗體庫混合，其中該些擾亂核蛋白是選自由NPA2-NPA5及NPB1蛋白所組成之群組。在一例示性的實施方式中，該標的核蛋白NPA1在具有5種擾亂蛋白(包含NPA2-NPA5以及NPB1蛋白)的情形下，與本發明GH2抗體庫混合。依據某些實施方式，該標的核蛋白為NPA2蛋白，其被固定於一基質上，之後在具有至少一擾亂核蛋白存在的情形下與本發明GH2抗體庫混合，其中該些擾亂核蛋白是選自由NPA1、NPA3-NPA5及NPB1蛋白所組成之群組。在一例示性的實施方式中，該標的核蛋白NPA2在具有5種擾亂蛋白(包含NPA1、NPA3-NPA5及NPB1蛋白)的情形下，與本發明GH2抗體庫混合。依據某些實施方式，該標的核蛋白為NPA3蛋白，其被固定於一基質上，之後在具有至少一擾亂核蛋白存在的情形下與本發明GH2抗體庫混合，其中該些擾亂核蛋白是選自由NPA1、NPA2、NPA4、NPA5及NPB1蛋白所組成之群組。在一例示性的實施方式中，該標的核蛋白NPA3在具有5種擾亂蛋白(包含NPA1、NPA2、NPA4、NPA5及NPB1蛋白)的情形下，與本發明GH2抗體庫混合。依據某些實施方式，該標的核蛋白為NPA4蛋白，其被固定於一基質上，之後在具有至少一擾亂核蛋白存在的情形下與本發明GH2抗體庫混合，其中該些擾亂核蛋白是選自由NPA1-NPA3、NPA5及NPB1蛋白所組成之群組。在一例示性的實施方式中，該標的核蛋白NPA3在具有5種擾亂蛋白(包含NPA1-NPA3、NPA5及NPB1蛋白)的情形下，與本發明GH2抗體庫混合。依據某些實施方式，該標的核蛋白為NPA5蛋白，其被固定於一基質上，之後在具有至少一擾亂核蛋白存在的情形下與本發明GH2抗體庫混合，其中該些擾亂核蛋白是選自由NPA1-NPA4及NPB1蛋白所組成之群組。在一例示性的實施方式中，該標的核蛋白NPA5在具有5種擾亂蛋白(包含NPA1-NPA4及NPB1蛋白)的情形下，與本發明GH2抗體庫混合。依據某些實施方式，該標的核蛋白為NPB1蛋白，其被固定於一基質上，之後在具有至少一擾亂核蛋白存在的情形下與本發明GH2抗體庫混合，其中該些擾亂核蛋白是選自由NPA1-NPA5蛋白所組成之群組。在一例示性的實施方式中，該標的核蛋白NPB1在具有5種擾亂蛋白(包含NPA1-NPA5蛋白)的情形下，與本發明GH2抗體庫混合。
接著，在步驟(e)中，自該第一複數個噬菌體(其在具有擾亂核蛋白存在的情況下，分別表現對標的核蛋白具有結合專一性的scFv)篩選複數個噬菌體(亦即，第二複數個噬菌體)。在類似步驟(c)方法中，以酸性沖提緩衝溶液(例如pH 2.2的甘胺酸溶液)處理步驟(b)的產物，藉以破壞標的核蛋白與噬菌體表現之scFv之間的結合。藉此，收集分別表現與標的核蛋白具有結合專一性之scFv之第二複數個噬菌體。
接著，在步驟(f)中，將步驟(e)篩選出的第二複數個噬菌體置於使其能產生複數個可溶性scFv的環境中。本發明所屬技術領域具有通常知識者可依據習知的方法完成此步驟。依據本揭示內容某些實施方式，VH域及VL域的表現是由一乳糖操縱組(lactose operon或lac operon)所驅動；如本發明所屬領域具有通常知識者所熟知，可藉由添加異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactoside, IPTG)誘導該乳糖操縱組表現，而驅動下游基因(亦即，編碼VH域及VL域的基因)表現。產生的scFv因此會分泌至培養液之上清液中，並可由此收集該些scFv。
在步驟(g)中，分別將步驟(f)中製造的該可溶性scFv與該標的核蛋白混合，以形成蛋白-scFv複合體。
之後，在步驟(h)中，利用本發明所屬領域具有通常知識者所知之用於分析兩分子間結合親和力(例如，一抗體與一抗原的結合親和力)的方法，測定在步驟(g)中形成的蛋白-scFv複合體的含量；舉例來說，ELISA、西方墨點法(western blotting, WB)、流式細胞儀或LFIA。一般而言，蛋白-scFv複合體的含量和scFv與標的核蛋白的結合親和力呈正比。依據一特定實施例，以ELISA測定蛋白-scFv複合體的含量(亦即，該可溶的scFv與標的核蛋白的結合親和力)。
最後，在步驟(i)中，基於步驟(h)測定的結合親和力篩選抗體片段。更具體來說，自複數個可溶的scFv中篩選出一可溶的scFv作為抗體片段，該可溶的scFv對標的核蛋白展現出優於其他可溶的scFv的結合親和力。
由本發明scFv抗體庫篩選的該抗體片段可用於製備一重組抗體(例如：一重組IgG抗體)。可依照本發明領域具有通常知識者所熟知的方法來製備源自scFv的重組抗體，舉例來說，美國專利公開第10,336,815 B2號或美國專利公開第10,336,816 B2號所述之方法。
依據本揭示內容某些實施方式，製備由本發明方法篩選的25個抗體片段。該些抗體片段/重組抗體之CDR序列(包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)對應的序列識別號(sequence identifier)分別總結於表1。
表1 特定抗體CDR序列對應之序列識別號(序列編號)
| 抗體 | 序列識別號 (序列編號) | |||||
| CDR-L1 | CDR-L2 | CDR-L3 | CDR-H1 | CDR-H2 | CDR-H3 | |
| NP1 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| NP2 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 |
| NP3 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 |
| NP4 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 |
| NP5 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 |
| NP6 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 |
| NP7 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 |
| NP8 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 |
| NP9 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 |
| NP10 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 |
| NP11 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 |
| NP12 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 |
| NP13 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 |
| NP14 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 |
| NP15 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 |
| NP16 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 |
| NP17 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 |
| NP18 | 109 | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 |
| NP19 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 |
| NP20 | 121 | 122 | 123 | 124 | 125 | 126 |
| NP21 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | 132 |
| NP22 | 133 | 134 | 135 | 136 | 137 | 138 |
| NP23 | 139 | 140 | 141 | 142 | 143 | 144 |
| NP24 | 145 | 146 | 147 | 148 | 149 | 150 |
| NP25 | 151 | 152 | 153 | 154 | 155 | 156 |
依據本揭示內容某些例示性實施方式，NP1至NP25抗體的VL域及VH域分別包含總結於表2之胺基酸序列。
表2 特定抗體的VL及VH序列對應之序列識別號
| 抗體名稱 | 域 | 序列編號 | 抗體名稱 | 域 | 序列編號 |
| NP1 | VL | 157 | NP14 | VL | 183 |
| VH | 158 | VH | 184 | ||
| NP2 | VL | 159 | NP15 | VL | 185 |
| VH | 160 | VH | 186 | ||
| NP3 | VL | 161 | NP16 | VL | 187 |
| VH | 162 | VH | 188 | ||
| NP4 | VL | 163 | NP17 | VL | 189 |
| VH | 164 | VH | 190 | ||
| NP5 | VL | 165 | NP18 | VL | 191 |
| VH | 166 | VH | 192 | ||
| NP6 | VL | 167 | NP19 | VL | 193 |
| VH | 168 | VH | 194 | ||
| NP7 | VL | 169 | NP20 | VL | 195 |
| VH | 170 | VH | 196 | ||
| NP8 | VL | 171 | NP21 | VL | 197 |
| VH | 172 | VH | 198 | ||
| NP9 | VL | 173 | NP22 | VL | 199 |
| VH | 174 | VH | 200 | ||
| NP10 | VL | 175 | NP23 | VL | 201 |
| VH | 176 | VH | 202 | ||
| NP11 | VL | 177 | NP24 | VL | 203 |
| VH | 178 | VH | 204 | ||
| NP12 | VL | 179 | NP25 | VL | 205 |
| VH | 180 | VH | 206 | ||
| NP13 | VL | 181 | |||
| VH | 182 |
當可理解，可對VL及VH域之序列(例如：骨架序列)進行變異(例如，以保留性或非保留性胺基酸取代)，而不影響本發明抗體的結合親和力及/或專一性。較佳地，以一或多個具有相似特性的胺基酸對VL及VH域的序列進行保留性取代；舉例來說，以異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸或色胺酸(一非極性胺基酸殘基)來取代白胺酸(另一非極性胺基酸殘基)；以麩胺酸(一酸性胺基酸殘基)來取代天門冬胺酸(另一酸性胺基酸殘基)；或是以精胺酸或組胺酸(一鹼性胺基酸殘基)來取代離胺酸(另一鹼性胺基酸殘基)。據此，本揭示內容亦包含在VL及VH域之序列具有微小變異的抗體(亦即，NP1至NP25抗體)中。
依據某些實施方式，以某些保留性胺基酸取代NP1抗體的VL及/或VH域之骨架的胺基酸(亦即，保留性替換)。保留性替換是本發明領域所熟知的技術，因此習知技藝人士可選擇合適的胺基酸來置換抗體NP1的VL及/或VH域的骨架，且不影響其活性。在該些實施方式中，抗體NP1的VL域可包含與序列編號：157具有至少85% (例如，85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相似度的胺基酸序列，及/或抗體NP1的VL域可包含與序列編號：158具有至少85%相似度的胺基酸序列。較佳地，抗體NP1的VL域可包含與序列編號：157具有至少90%相似度的胺基酸序列，及/或抗體NP1的VL域可包含與序列編號：158具有至少90%相似度的胺基酸序列。更佳地，抗體NP1的VL域可包含與序列編號：157具有至少95%相似度的胺基酸序列，及/或抗體NP1的VL域可包含與序列編號：158具有至少95%相似度的胺基酸序列。
當可理解，在不影響抗體活性(例如，對抗原的結合親和力及/或專一性)的情況下，保留性替換可選擇性地置入抗體NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24或NP25的VL及/或VH域的骨架中。依據某些例示性的實施方式，抗體NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VL域分別包含與序列編號：159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203及205具有至少85%相似度之胺基酸序列，及/或抗體NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VH域分別包含與序列編號：160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206具有至少85%相似度之胺基酸序列。較佳地，抗體NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VL域分別包含與序列編號：159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203及205具有至少90%相似度之胺基酸序列，及/或抗體NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VH域分別包含與序列編號：160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206具有至少90%相似度之胺基酸序列。最佳地，抗體NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VL域分別包含與序列編號：159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203及205具有至少95%相似度之胺基酸序列，及/或抗體NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VH域分別包含與序列編號：160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206具有至少95%相似度之胺基酸序列。
依據本揭示內容某些實施例，抗體NP1至NP25皆可用於偵測流感病毒，據此可作為診斷是否受到流感病毒感染的偵測試劑。
因此，本揭示內容的其他態樣是關於用於偵測一個體是否受到流感病毒感染的套組。該套組至少包含一容器，以及本揭示內容任一態樣或實施方式的一抗體(亦即，一第一抗體)。可選擇地，該套組可更包含一說明，用以指示如何使用該抗體偵測流感病毒的感染。
依據本揭示內容某些實施方式，該抗體為NP16，其係作為用以捕捉NPA(源自IAV的核蛋白)之捕捉試劑，以及在偵測檢定(像是ELISA、WB檢定、流式細胞儀或LFIA)中用以偵測NPA之偵測試劑。依據本揭示內容某些實施方式，該抗體為NP17，其係作為用於偵測IAV感染的捕捉試劑及偵測試劑。
可選擇地，所述套組可更包含一第二抗體，其中在一偵測檢定中，該第一抗體及該第二抗體其中之一是作為捕捉試劑，而另一個則是作為偵測試劑。依據某些實施方式，該套組包含NP16抗體作為偵測試劑，以及NP1、NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25其中之一作為捕捉試劑。依據替選的實施方式，該套組包含NP17抗體作為偵測試劑，且NP1、NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25其中之一作為捕捉試劑。
本發明也包含一藉由分離自一個體的生物樣本來測定該個體是否受到流感病毒感染的方法。該方法包含利用本揭示內容之抗體片段、重組抗體或套組偵測一生物樣本中是否具有該流感病毒的核蛋白，若有該核蛋白存在表示該個體受到該流感病毒的感染。
一般而言，該生物樣本是取自該個體呼吸道的樣本；較佳地，為該個體的上呼吸道。適用於本發明方法之該生物樣本的非限制性實例，包含分離自該個體的口腔、鼻腔、氣管、支氣管或肺的肌肉組織、液體或分泌液(例如：痰)。
具有通常知識者或臨床操作者可基於診斷的結果，給予受到流感病毒感染的個體適當的治療(像是抗病毒治療)，以改善及/或緩解流感病毒感染的相關症狀。適用於本發明方法的抗病毒治療的實例包含，但不限於，奧司他韋、瑞樂沙、帕拉米韋、巴羅沙韋瑪波西酯、金剛胺、金剛乙胺及其組合。
可接受本發明方法診斷及/或治療之個體為一哺乳動物，舉例來說，該個體為一人類、小鼠、大鼠、猴子、綿羊、羊、貓、狗、馬或猩猩。較佳的，該個體為一人類。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
材料與方法
製備重組核蛋白
製備本研究中的5個代表性A型流感病毒的NP以及1個B型流感病毒的NP，包含NPA1 (存取編號：AY210236；源自IAV株A/Taiwan/1/72 (H3N2)的NP)、NPA2 (存取編號：AF306656；源自IAV株A/WSN/1933(H1N1)的NP)、NPA3 (存取編號：CY083913；源自IAV株A/Aalborg/INS132/2009 (H1N1)的NP)、NPA4 (存取編號：CY025384；源自IAV株A/Alabama/UR06-0455/2007 (H1N1)的NP)、NPA5 (存取編號：CY098574；源自IAV株A/Anhui/1/2005 (H5N1)的NP)以及NPB1 (存取編號：CY018304；源自IBV株B/Houston/B720/2004的NP)。具體而言，優化NP基因的編碼區域使其適合以E. coli
表現，並連接至以Nde
I及Xho
I限制酶截切後呈線形的表現載體pET15b上；該重組NP蛋白包含一位於其序列上游的His6
-標籤及凝血酶截切序列。於16°C下，添加0.5毫莫耳濃度IPTG以誘導BL21 (DE3)細胞過量表現該些NP載體。以Ni2+
帶電螯合瓊脂管柱(用以結合His6
-標籤)、肝素管柱(用以結合不含RNA的NP)以及粒徑篩析分離(緩衝溶液：40毫莫耳濃度Tris，pH 7.5；600毫莫耳濃度NaCl)純化由E.coli
表現的該些NP重組蛋白。利用RNaseA (每毫升20微克)處理E.coli
的細胞裂解液，以得到不含RNA之NP蛋白，並接續純化程序。以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳確認純化的NP蛋白。據此獲得的NP蛋白分別具有序列編號：1 (NPA1)、序列編號：2 (NPA2)、序列編號：3 (NPA3)、序列編號：4 (NPA4)、序列編號：5 (NPA5)以及序列編號：6 (NPB1)的胺基酸序列。
細胞株
將MDCK (Madin-Darby canine kidney, ATCC CCL-34)上皮細胞培養於包含非必須胺基酸(non-essential amino acid, NEAA)、2毫莫耳濃度L-麩醯胺酸及10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的MEM培養基中，置於37°C之5% CO2
的潮濕培養箱中。293-T細胞(ATCC CRL-3216)培養於包含10% FBS及青黴素-鏈黴素(100x)的DMEM培養基中。將懸浮的293-F細胞培養於不含血清的293表現培養基中，置於37°C之以110 rpm轉速搖晃的8% CO2
培養箱中。
病毒株
六種於本研究中使用的A型流感病毒，包含(1) H1N1布里斯本(A/Brisbane/59/2007 (H1N1/H1B))；(2) H1N1豬(一源自A/California/07/2009(H1N1/H1S)的重組病毒NYMC X-181)；(3) H3N2布里斯本(A/Brisbane/10/2007(H3N2/H3B))；(4) H3N2威斯康辛(A/Wisconsin/67/2005(H3N2/H3W))；(5) H5N1越南(一源自A/VietNam/1194/2004(H5N1/H5V)的重組病毒NIBRG-14)；以及(6) Flu B (B/Brisbane/60/2008(fluB))。利用10天大的胚胎蛋汁尿囊腔來擴增病毒原液，培養60小時後，收集病毒液，以超高速離心(25,000 xg
，2小時)進行濃縮後，重新懸浮於磷酸緩衝溶液中(phosphate-buffered saline, PBS)。利用MDCK細胞來測定病毒效價及TCID50
。簡單來說，該病毒原液以感染緩衝液(包含TPCK處理的胰蛋白酶(每毫升1微克)及0.3%牛血清白蛋白的MEM-NEAA培養液)進行10倍稀釋。經稀釋的病毒樣本與經PBS洗滌之MDCK細胞(於96孔盤，每孔洞1 × 104
細胞)，反應1小時；再以PBS洗滌MDCK細胞2次，以移除病毒懸浮液。將受感染的MDCK細胞置於新鮮的感染緩衝液中培養3天(H1N1 Swine, H3N2 Brisbane and H3N2 Wisconsin)或5天(H1N1 Brisbane, H5N1 Vietnam and Flu B)。利用冰甲醇-丙醇(1：1 (v/v))固定存活的MDCK細胞，並以0.5%結晶紫進行染色，並計算TCID50
。
辨認由噬菌體表現的合成scFv抗體庫中篩選的IgG1
依據美國專利公告第10,336,815 B2號或美國專利公告第10,336,816 B2號以及Ing-Chien Chen等人所發表的公開文獻(High throughput discovery of influenza virus neutralizing antibodies from phage-displayed synthetic antibody libraries, Scientific Reports 7, Article number: 14455 (2017))所述之方法來建構以及辨認該由噬菌體表現的合成scFv抗體庫。依據美國專利公告第10,336,815 B2號或美國專利公告第10,336,816 B2號所述之實驗方法來篩選由噬菌體表現的抗體庫、篩選可與由噬菌體表現的scFv結合的抗原、以ELISA辨認結合至同源抗原及蛋白A/L的scFv、將scFv重塑為IgG1、表現及純化IgG1以及利用ELISA確認抗體-抗原交互作用的EC50
。
IgG結合至來自受病毒感染的MDCK細胞之NP
將MDCK細胞(每孔洞3 × 104
細胞)種在96孔盤中，培養16小時後，以PBS洗滌2次，接著以100x TCID50
的病毒溶液進行感染。將經感染的MDCK細胞培養24小時後，以甲醇-丙酮(1：1 (v/v))固定。以2倍連續稀釋的抗-流感病毒核蛋白IgG抗體，以及鍵結山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗-人類IgG-Fc抗體(1：5000稀釋)或鍵結HRP的山羊抗-小鼠抗體(1：1000稀釋)，來偵測病毒核蛋白的表現量。加入3,3'5,5'-四甲基聯苯胺(3,3'5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)受質(每孔洞100微升)，反應5分鐘，接著以1 N HCl (每孔洞100微升)中止反應後，以比色法測量病毒核蛋白的含量。各稀釋IgG的濃度重複三次後，測量波長450奈米時的吸光值，並計算EC50
。
以三明治ELISA (sandwich ELISA)偵測源自裂解的流感病毒的NP
以HRP鍵結套組將HRP與偵測抗體連接。將200微克純化的IgG以莫耳比(molar ratio) IgG：HRP=1：2的比例加至HRP混合液中，並依照製造商的操作說明中止反應。以塗覆有經純化的捕捉IgG (每孔洞1微克)的96孔盤進行三明治ELISA，於4°C反應過夜。利用裂解緩衝溶液(包含PBS、0.1% Tween-20及0.1% N-月桂醯肌胺酸)裂解流感病毒1小時，使流感病毒的NP釋放至溶液中。將自病毒中裂解出的NP於120V下，在12% NuPAGE Bis-Tris凝膠中分離3小時，以定量該些NP。接著以考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue)進行膠體染色。再以軟體定量該些NP，並計算出考馬斯亮藍的強度與純化的重組NP之濃度間的關聯性。將源自裂解流感病毒且經定量的NP加至每個塗覆有捕捉抗體的孔洞中，並反應1小時。經洗滌後，於每個孔洞中加入每毫升0.1微克與HRP鍵結的偵測IgG (每孔洞100微升)。接著在每個孔洞中加入TMB (每孔洞100微升)呈色5分鐘，並以1 N HCl (每孔洞100微升)中止反應，最後測量波長450奈米時的吸光值，並計算EC50
。
製備與膠態金(colloidal gold)鍵結的AL2C及IgG
100微升的2 M K2
CO3
(pH 11.5)與10毫升膠態金溶液(pH5-6)混合，以調整pH值(最終pH 9)，接著加入500微升的IgG (每毫升1毫克)或50毫升的AL2C (每毫升3.35毫克)至膠態金溶液中，於室溫反應40分鐘。加入1毫升的阻斷緩衝溶液(10% BSA溶於20毫莫耳濃度硼酸鈉，pH9.3)於室溫反應15分鐘，接著以15,000g
於4°C離心30分鐘。去除上清液，並將沉澱物重新懸浮於10毫升洗滌緩衝溶液(1% BSA溶於20毫莫耳濃度硼酸鈉，pH9.3)，再以15,000g
於4°C離心30分鐘。重覆洗滌2次後，將沉澱物重新懸浮於1毫升溶於20毫莫耳濃度硼酸鈉的1% BSA溶液(pH9.3)中，用以製備共軛墊
組裝LFIA條帶
以注射輸液磊驅動的橫向流動分配器，將PBS緩衝溶液中1微克的捕捉抗體、抗原或AL2C，在NP膜上以每公分為間隔形成條帶。製備其他具有固定的抗原或捕捉抗體的NC膜、共軛墊與樣品墊以及組裝LFIA條帶的程序，接依照前述方法。
實施例1 於資料庫中對NP序列進行譜系分析，篩選出代表性的流感NP作為用於尋找抗-NP抗體的目標抗原
為了研發出可作為親和試劑，且可辨認源自IVA及IVB的多種病毒株的主要NP之抗體，因此建立一組盡可能廣泛地代表自然界中的NP作為目標抗原。利用軟體自流感研究資料庫(Influenza Research Database)收集26,207種流感病毒的NP序列，且該序列相似度的閾值為95% (數據未顯示)。由演算法產生的48種群集中，其中前5種NPA (A型流感病毒NP)的群集涵蓋所有NPA序列的91%，以及1種NPB (B型流感病毒NP)的群集涵蓋資料庫中所有NPB序列(數據未顯示)。此結果與先前發表的譜系分析一致，表示NPA序列可以譜系分為少數幾個主要的群集。在NCBI蛋白序列資料庫中將前幾種NPA及NPB的一致性序列群集搜尋代表性NP序列。篩選出6種代表性NP (包含NPA1至NPA5以及NPB1)，並且在包含該些化學合成的相應基因之E. coli
中，分別表現該些重組蛋白，接著純化95%以上的純度，以進行後續篩選由噬菌體表現的抗體。總結6種NP之間兩序列之相似度於表3。
表 3 特定蛋白或病毒的NP序列之間兩序列相似度
| NP抗原 | NPA1 | NPA2 | NPA3 | NPA4 | NPA5 | A/Brisbane/59/2007(H1N1/H1B) | A/Brisbane/10/2007(H3N2/H3B) | A/Wisconsin/67/2005(H3N2/H3W) | A/California/07/2009(H1N1/H1S) | A/Vietnam/1194/2004(H5N1/H5V) | NPB1 | B/Brisbane/60/2008(fluB) |
| NPA1 | - | 93.5% | 89.7% | 92.5% | 90.5% | 92.3% | 92.3% | 91.5% | 91.3% | 91.9% | 34.2% | 34.4% |
| NPA2 | 93.5% | - | 92.7% | 94.3% | 94.1% | 94.1% | 94.1% | 97.1% | 96.9% | 97.1% | 34.8% | 34.9% |
| NPA3 | 89.7% | 92.7% | - | 89.9% | 94.3% | 90.1% | 90.1% | 91.5% | 91.3% | 91.7% | 34.6% | 34.8% |
| NPA4 | 92.5% | 94.3% | 89.9% | - | 92.1% | 99.7% | 99.7% | 93.3% | 93.1% | 93.1% | 35.1% | 35.3% |
| NPA5 | 90.5% | 94.1% | 94.3% | 92.1% | - | 91.9% | 91.9% | 92.9% | 92.7% | 93.1% | 34.4% | 34.6% |
| A/Brisbane/59/2007 (H1N1/H1B) | 92.3% | 94.1% | 90.1% | 99.7% | 91.9% | - | 100% | 93.3% | 93.1% | 92.9% | 35.3% | 35.5% |
| A/Brisbane/10/2007 (H3N2/H3B) | 92.3% | 94.1% | 90.1% | 99.7% | 91.9% | 100% | - | 93.3% | 93.1% | 92.9% | 35.3% | 35.5% |
| A/Wisconsin/67/2005 (H3N2/H3W) | 91.5% | 97.1% | 91.5% | 93.3% | 92.9% | 93.3% | 93.3% | - | 99.7% | 99.3% | 34.0% | 34.2% |
| A/California/07/2009\ (H1N1/H1S) | 91.3% | 96.9% | 91.3% | 93.1% | 92.7% | 93.1% | 93.1% | 99.7% | - | 99.1% | 34.0% | 34.2% |
| A/Vietnam/1194/2004 (H5N1/H5V) | 91.9% | 97.1% | 91.7% | 93.1% | 93.1% | 92.9% | 92.9% | 99.3% | 99.1% | - | 34.2% | 34.4% |
| NPB1 | 34.2% | 34.8% | 34.6% | 35.1% | 34.4% | 35.3% | 35.3% | 34.0% | 34.0% | 34.2% | - | 99.6% |
| B/Brisbane/60/2008 (fluB) | 34.4% | 34.9% | 34.8% | 35.3% | 34.6% | 35.5% | 35.5% | 34.2% | 34.2% | 34.4% | 99.6% | - |
實施例2 一種用以產生一組對各代表性NP具有不同專一性的抗-NP IgG 抗體的篩選程序
建立一組與各代表性流感病毒的NP分別具有特殊結合模式的抗體，以分辨流感病毒的亞型。在本揭示內容中使用一種新穎的程序開發，用以篩選適用於三明治ELISA及LFIA的抗體，其具有偵測及分辨源自不同IAV病毒株的NP的能力。具體來說，分別利用16種GH合成抗體庫進行3循環標準噬菌體表現篩選，開始每個目標NP (亦即，NPA1、NPA2、NPA3、NPA4、NPA5或NPB1)的抗體篩選程序。建構由噬菌體表現的GH合成抗體庫、標準噬菌體表現抗體庫篩選以及篩選重組抗原的詳細技術內容皆已被記載，例如，請參見美國專利號10,336,815 B2或美國專利號10,336,816 B2描述之方法。經過2或3篩選循環後，培養液中包含分泌的多株scFv的噬菌體表現的抗體庫，其在ELISA檢定中對相應抗原顯示陽性反應，被預期含有較大量與相應抗原結合的候選scFv。混合該些由噬菌體表現的scFv抗體庫作為另外2循環的噬菌體表現篩選的輸入(input)，其中在噬菌體顆粒與目標NP結合的過程中，加入過量固定於固定相之目標NP以外的其他重組NP於溶液相中。進行額外2循環的噬菌體表現篩選的目的是為了增加在溶液相中，只會與目標NP結合的scFv的含量。自前述兩次篩選循環的輸出(output)抗體庫中隨機選擇可溶性單株scFv抗體，以ELISA篩選可與蛋白A、蛋白L及相應目標NP結合的抗體；將與蛋白A、蛋白L及同源NP具有陽性結合訊號的scFv重塑至具有人類IgG1骨架之IgG中。以哺乳類表現系統表現該些IgG，並以蛋白A管柱純化，接著以ELISA及LFIA測試與抗原結合的專一性以及親和力。
實施例3 從噬菌體表現的合成抗體庫選擇及篩選出分別對不同NP的具有專一性的抗體相關的親和性試劑
由前述篩選方法獲得753種抗-NP的陽性單株scFv抗體(ELISA OD450 奈米
＞ 0.5，與蛋白A、蛋白L及相應目標NP的結合)。753種單株抗體中每種抗體皆與6種NP分別進行交叉結合測試；熱點圖(heat map)的數據顯示753種scFv與6種NP結合的ELISA的結果(OD450 奈米
) (數據未顯示)。熱點圖依據scFv (熱點圖的y-軸)與6種NP (熱點圖的x-軸)的交叉結合模式的分組呈現。基於scFv-NP結合模式的分組選出25個scFv代表scFv的主要群組。該些scFv的CDR序列及VL與VH序列分別總結於表1及表2。以293-F表現系統將25個scFv重塑至人類IgG1中，並且以蛋白A管柱純化，接著利用SDS-PAGE進行分析。
實施例4 抗-NP IgG1分別以不同專一性及高度親和力與重組NP結合
以半最大效應濃度EC50
定量測量25個抗NP IgG1對6個NP的結合專一性及親和力，並將市售老鼠單株抗-NP抗體作為正控制組與其進行專一性及親和力的比較。如總結於表4的數據，與相應重組NP具有次奈米莫耳濃度(subnanomolar) EC50
的抗體具有最高的結合親和力，其是經由上述程序篩選自噬菌體表現的GH合成抗體庫中，並且未經過更進一步的親和力改進步驟。相較於正控制組的抗體(MAB8251)對NPA具有廣泛的專一性，NP16及NP17展現可比擬正控制組抗體的親和力及廣泛專一性(表4)。更重要的是，GH IgG1與單一的NPA1-NPA5及NPB1具有專一的親和力(例如：NP24-NPB1、NP3-NPA1、NP18-NPA2、NP15-NPA2/NPA4、NP8-NPA3/NPA2以及NP13-NPA4/NPA5 (表4))，可基於親合性試劑分析源自IAV/IBV的未知病毒株中NP。
表4 自25個抗NP的IgG1與特定重組蛋白結合的S形結合曲線衍生的EC50
(奈米莫耳濃度)
空白：以每毫升10微克的IgG進行ELISA偵測，無訊號。
NC：不符合曲線 (不收斂，中斷)
| NPA1 | NPA2 | NPA3 | NPA4 | NPA5 | NPB1 | |
| NP1 | NC | |||||
| NP2 | 1.37 | |||||
| NP3 | 0.09 | |||||
| NP4 | 0.19 | 10.11 | 0.37 | |||
| NP5 | 1.69 | 0.13 | ||||
| NP6 | ||||||
| NP7 | 0.79 | |||||
| NP8 | 2.14 | 0.07 | ||||
| NP9 | 4.38 | 1.12 | ||||
| NP10 | 0.36 | NC | NC | 0.28 | ||
| NP11 | 0.27 | 0.06 | ||||
| NP12 | 9.07 | |||||
| NP13 | 9.36 | 0.07 | 0.09 | |||
| NP14 | 0.19 | 0.08 | 19.71 | 1.70 | ||
| NP15 | NC | 0.45 | 0.35 | |||
| NP16 | 0.09 | 0.96 | 0.18 | 0.09 | ||
| NP17 | 0.08 | 0.06 | 0.03 | 0.17 | ||
| NP18 | 0.20 | |||||
| NP19 | 0.11 | NC | ||||
| NP20 | 0.04 | |||||
| NP21 | 0.12 | 28.63 | ||||
| NP22 | 0.27 | |||||
| NP23 | 0.06 | |||||
| NP24 | 0.05 | |||||
| NP25 | 0.10 | |||||
| MAB8251 | 0.12 | 0.13 | 0.13 | 3.68 | 0.16 | NC |
| ab47876 | 0.13 | |||||
| NBP2-23514 | 0.11 | |||||
| MAB8259 | 0.27 |
實施例5 以該組抗-NP IgG1區分病毒感染的MDCK細胞中的IAV亞型之NP
為了測試該組抗-NP的25個IgG區分來自IAV及IBV的NP的能力，以ELISA檢定法偵測及區分受5種IAV疫苗株及1種IBV疫苗株感染的MDCK細胞表現的相似的NP。在5種IAV疫苗株中發現2種群組的NP：第1群包含A/Brisbane/59/2007 (H1N1/H1B)及A/Brisbane/10/2007 (H3N2/H3B)的NP，其具有相同胺基酸序列，且與NPA4僅有1個殘基的差異(99.7%相似度；表3)；第2群包含A/Wisconsin/67/2005 (H3N2/H3W)、A/California/07/2009 (H1N1/H1S)以及A/VietNam/1194/2004 (H5N1/H5V)的NP，其胺基酸序列之間具有最多4個殘基的差異。第2群的NP與NPA2具有約97%的序列相似度(表3)。IBV疫苗株(B/Brisbane/60/2008(fluB))的NP與NPB1具有1個胺基酸殘基的差異(99.7%相似度；表3)。
在被固定的MDCK細胞中檢測25個抗-NP的IgG與NP的結合，其中該MDCK細胞分別以5種IAV及1種IBV疫苗株預感染，結果總結於表5。儘管並不預期由病毒感染的MDCK細胞表現的NP的NP-RNA複合體以及同元聚合物(homo-polymer)會與純化的重組NP相似，仍將表5與表4的數據進行比較。在受病毒感染的MDCK細胞中，相應NP具有最高親和力的抗-NP的IgG1和正控制組抗體的EC50
相當，代表25種抗-NP的IgG1中至少一種子集(subset)可與正控制組抗體一樣有效地結合至受流感病毒感染的MDCK細胞中的NP (表5)。然而，25種抗-NP的IgG1對受到H1B及H3B感染的MDCK細胞中的NP的專一性無法與其對重組NPA4的專一性相比(表5)，僅管NPA4與H1B及H3B的NP的序列只有1個胺基酸殘基的差異(99.7%序列相似度)。具體而言，NP15及NP16一致性地以高親和力辨認重組NPA4及受H1B及H3B感染的MDCK細胞表現的NP；但NP13及NP17沒有展現相似的一致性，其具有辨認重組NPA4的高親和力，卻無法與受H1B及H3B感染的MDCK細胞表現的NP有明顯的結合親和力(表5)。此外，NP3、NP9、NP12、NP14及NP19與NPA4皆無明顯的親和力(表4)，卻與受H1B及H3B感染的MDCK細胞表現的NP具有明顯的親和力(表5)。
表5 由25種抗-NP的IgG1與受流感病毒感染的MDCK細胞中特定NP結合的S形結合曲線衍生的EC50
(奈米莫耳濃度)
空白：以每毫升10微克的IgG進行ELISA偵測，無訊號。
NC：不符合曲線 (不收斂，中斷)
| A/California/07/2009 (H1N1/H1S) | A/Brisbane/59/2007 (H1N1/H1B) | A/Brisbane/10/2007 (H3N2/H3B) | A/Wisconsin/67/2005 (H3N2/H3W) | A/Vietnam/1194/2004 (H5N1/H5V) | B/Brisbane/60/2008 (fluB) | |
| NP1 | NC | NC | NC | NC | 5.89 | NC |
| NP2 | NC | NC | 4.89 | |||
| NP3 | 0.55 | 0.521 | 0.301 | 0.25 | 0.393 | NC |
| NP4 | 4.02 | 14.1 | 63.1 | 4.82 | NC | NC |
| NP5 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP6 | 6.46 | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP7 | NC | NC | NC | NC | NC | |
| NP8 | NC | NC | NC | |||
| NP9 | 2.14 | 2.95 | 0.891 | 2.35 | 2.14 | NC |
| NP10 | NC | NC | NC | 1 | 14.5 | |
| NP11 | NC | NC | NC | |||
| NP12 | 6.09 | 5.09 | 0.399 | 0.333 | 0.189 | NC |
| NP13 | 1.677 | NC | NC | 5.633 | 7.17 | NC |
| NP14 | 3.43 | 0.228 | 0.246 | NC | NC | |
| NP15 | 0.249 | 0.668 | 0.563 | 0.449 | 0.525 | NC |
| NP16 | 0.239 | 0.21 | 0.21 | 0.248 | 0.501 | NC |
| NP17 | 28.7 | NC | NC | NC | NC | |
| NP18 | 0.168 | 7 | 6.82 | 0.192 | 0.292 | |
| NP19 | 0.304 | 0.295 | 0.39 | 0.215 | 0.386 | NC |
| NP20 | NC | NC | NC | NC | 4.88 | |
| NP21 | 0.73 | 4.6 | 74.1 | NC | 13.7 | NC |
| NP22 | 7.11 | NC | NC | 3.92 | ||
| NP23 | NC | NC | NC | NC | NC | |
| NP24 | NC | NC | 3.17 | |||
| NP25 | NC | 4.83 | NC | NC | NC | 2.17 |
| MAB8251 | 0.0813 | 0.08 | 0.131 | 0.085 | 0.316 | NC |
| ab47876 | NC | NC | NC | NC | 2.06 | |
| NBP2-23514 | NC | NC | NC | 3.7 | ||
| MAB8259 | NC | NC | NC | 9.09 |
抗-NP IgG1-NP結合模式可用以區分表現於MDCL細胞中相似的NP (表5)。不僅該些抗-NP IgG1與NP的結合模式可將IAV與IBV的NP區分開來，也可依據IgG1-NP的結合模式區分源自IAV亞型的NP (表5)，據此，可正確地將具有100%序列相似度的A/Brisbane/59/2007(H1N1/H1B)與A/Brisbane/10/2007(H3N2/H3B)的NP以及具有99.7%序列相似度的A/Wisconsin/67/2005(H3N2/H3W)與A/Viet Nam/1194/2004(H5N1/H5V)的NP進行分群(表3)。兩個群組間的序列相似度約為93%，其正確地反應出基於抗-NP IgG1與NP的結合模式的NP分群(數據未顯示)。然而，基於抗體結合模式的A/California/07/2009(H1N1/H1S)分群與基於序列相似度的分群之間的差異顯示出，嘗試以抗體-NP結合模式區分相似的NP (約99.3%序列相似度)的限制。
實施例6 基於該組抗-NP IgG1的三明治ELISA可用以偵測及區分源自裂解的IAV的NP亞型，其偵測極限約為1奈米莫耳濃度
為了更進一步探究抗-NP IgG1對裂解的IAV中的NP的專一性與親和力，使用選自該25種抗-NP IgG1中的抗體作為捕捉及偵測抗體，以三明治ELISA測量病毒NP的EC50
。同樣地，並不預期在形成NP-RNA複合體及同元聚合物的部份，來自裂解的IAV的NP會與純化的重組NP及受IAV感染的MDCK細胞中的NP相似，因此，在三明治ELISA中，用以定量偵測裂解的IAV中NP的含量所使用的捕捉-偵測的抗體對需憑經驗判斷。將25種抗-NP的IgG1分別作為捕捉抗體，以鍵結HRP的NP16或NP17在三明治ELISA中作為偵測抗體，偵測源自裂解的IAV的NP。分析結果分別總結於表6 (以NP16作為偵測抗體)及表7 (以NP17作為偵測抗體)。表6及表7高度相似的數據證實，NP16及NP17皆可作為用以辨認源自裂解的IAV的NP的偵測抗體。NP17及NP16可同時作為捕捉及偵測抗體偵測NP，是因為可形成NP同元聚合物。以三明治ELISA偵測源自裂解的流感病毒之NP的偵測極限約為1奈莫耳濃度的病毒NP。此外，基於ELISA結合模式區分的IAV亞型的NP，與該些疫苗株的NP的譜系分析大致相同(數據未顯示)。該些結果證實，以三明治ELISA及抗體相關的親和試劑作為捕捉/偵測抗體用以偵測來自裂解的流感病毒的NP的含量及亞型的可行性。
表 6 源自以鍵結HRP的NP16作為偵測抗體，25種抗-NP IgG作為捕捉抗體的三明治ELISA的S型結合曲線的病毒NP的EC50
(奈莫耳濃度)
空白：以每毫升10微克的IgG進行ELISA偵測，無訊號。
NC：不符合曲線 (不收斂，中斷)
| A/California/07/2009 (H1N1/H1S) | A/Brisbane/59/2007 (H1N1/H1B) | A/Brisbane/10/2007 (H3N2/H3B) | A/Wisconsin/67/2005 (H3N2/H3W) | A/Vietnam/1194/2004 (H5N1/H5V) | B/Brisbane/60/2008 (fluB) | |
| NP1 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP2 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP3 | 1.955 | 2.36 | 3.433 | 1.812 | 2.015 | NC |
| NP4 | 2.11 | 2.337 | 3.398 | 2.263 | 2.31 | |
| NP5 | 3.321 | 4.02 | 5.496 | 3.128 | 3.498 | NC |
| NP6 | 3.119 | 78.31 | NC | 2.696 | 3.037 | |
| NP7 | 2.358 | 4.133 | 8.086 | 2.26 | 2.247 | NC |
| NP8 | 2.328 | NC | NC | 2.602 | 2.636 | |
| NP9 | 53.94 | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP10 | 3.297 | 3.967 | 4.592 | 3.202 | 3.376 | |
| NP11 | NC | NC | NC | NC | NC | |
| NP12 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP13 | 168 | 135 | 59.29 | 54.1 | ||
| NP14 | NC | NC | NC | NC | NC | |
| NP15 | 2.789 | 4.608 | 6.221 | 2.525 | 2.815 | |
| NP16 | 4.408 | 4.739 | 6.247 | 4.096 | 4.333 | NC |
| NP17 | 3.277 | 4.083 | 4.406 | 3.087 | 3.251 | |
| NP18 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP19 | 5.373 | 3.368 | 4.017 | 3.876 | 3.967 | NC |
| NP20 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP21 | 2.671 | 2.71 | 3.535 | 2.882 | 2.791 | |
| NP22 | NC | 59.44 | NC | 91.4 | NC | NC |
| NP23 | NC | NC | NC | NC | NC | |
| NP24 | NC | NC | NC | NC | ||
| NP25 | NC | NC | NC | NC | NC |
表7 源自以鍵結HRP的NP17作為偵測抗體，25種抗-NP IgG作為捕捉抗體的三明治ELISA的S型結合曲線的病毒NP的EC50
(奈莫耳濃度)
空白：以每毫升10微克的IgG進行ELISA偵測，無訊號。
NC：不符合曲線 (不收斂，中斷)
| A/California/07/2009 (H1N1/H1S) | A/Brisbane/59/2007 (H1N1/H1B) | A/Brisbane/10/2007 (H3N2/H3B) | A/Wisconsin/67/2005 (H3N2/H3W) | A/Vietnam/1194/2004 (H5N1/H5V) | B/Brisbane/60/2008 (fluB) | |
| NP1 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP2 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP3 | 0.834 | 1.037 | 1.603 | 0.8276 | 0.8614 | NC |
| NP4 | 0.8618 | 0.9107 | 1.288 | 0.867 | 0.8747 | |
| NP5 | 0.9178 | 1.825 | 3.167 | 0.8789 | 0.909 | |
| NP6 | 3.07 | NC | NC | 1.983 | 2.719 | NC |
| NP7 | 0.8998 | 4.152 | 5.861 | 0.8206 | 0.8792 | |
| NP8 | 0.7521 | NC | NC | 0.8545 | 0.9226 | NC |
| NP9 | NC | NC | NC | 106.3 | NC | NC |
| NP10 | 0.7976 | 0.8732 | 1.058 | 0.8422 | 0.8602 | NC |
| NP11 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP12 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP13 | 47.88 | 27.87 | 11.03 | 35.78 | 28.95 | NC |
| NP14 | NC | NC | NC | NC | NC | |
| NP15 | 0.8056 | 0.926 | 1.133 | 0.7792 | 0.7976 | NC |
| NP16 | 0.9193 | 0.89 | 0.9594 | 0.891 | 0.8361 | NC |
| NP17 | 1.024 | 2.218 | 3.333 | 1.072 | 1.195 | |
| NP18 | NC | 66.44 | 1000 | 1000 | 1000 | NC |
| NP19 | 0.8634 | 0.8117 | 0.9426 | 0.7655 | 0.8141 | NC |
| NP20 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP21 | 0.815 | 0.81 | 1.062 | 0.8475 | 0.8791 | NC |
| NP22 | NC | 102.4 | 98.22 | 82.84 | NC | NC |
| NP23 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP24 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
| NP25 | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
源自裂解的IAV的NP僅在一定程度上類似於在受病毒感染的MDCK細胞或E.coli
中表現的相應的NP。比較表4、表6及表7的結果發現，NP13、NP15、NP16以及NP17一致性地以高親和力辨認重組NPA4及源自H1B及H3B的病毒NP。然而，NP3、NP4、NP5、NP7、NP10、NP19及NP21與NPA4不具有明顯的親和力(表4)，但於三明治ELISA卻可以高度親和力辨認來自H1B及H3B的病毒NP (表6及表7)。另一方面，NP3、NP15、NP16及NP19可辨認源自裂解的病毒及受病毒感染的MDCK細胞的NP，儘管如此，NP9、NP12及NP14可辨認受H1B-及H3B-感染的MDCK細胞中的NP，但與裂解的IAV中的相應NP不具有明顯的親和力(表4)，於三明治ELISA卻以高度親和力辨認源自H1B及H3B的病毒NP (表6及表7)。儘管，鑒於NP15及NP16可辨認源自三種製備方式的相應NP，該些NP應具有相同的抗原決定位，前述的辨認差異也凸顯了因不同表現宿主產生的抗原差異。
實施例7 源自GH合成抗體庫的抗體可用與發展LFIA裝置
為了測試源自噬菌體表現的GH合成抗體庫的抗-NP IgG1於LFIA的應用性，利用LFIA偵測該IgG1-NP。每個呈現於第1A圖的LFIA都將正控制組(AL2C：一種蛋白A及蛋白L的融合蛋白，已知可與由人類變異域IGHV3及IGKV1的基因編碼產生的人類IgG1結合)及各NP (NPB1、NPA1及NPA2)點於膜上形成條帶。該共軛墊包含以膠態金標示的AL2C，將包含NP1-25 IgG1及控制組IgG的溶液分別加至樣品墊。每個測試條帶中的特徵訊號(signature signal)的強度代表相應的抗體-抗原交互作用的表現，其與抗-NP IgG1及控制組IgG的專一性強度一致(數據未顯示)。
為了說明以三明治LFIA偵測NP的偵測極限及專一性，在硝化纖維膜上設置4個條帶以建構LFIA，該條帶分別為：正控制組(AL2C)用以結合IgG1；NP17、NP1以及NP16作為捕捉抗體(第1B及1C圖)，且將標示有膠態金的NP17加至共軛墊作為偵測抗體。基於第1A圖的結果，選擇與NPA1-5具有專一性及親和力的IgG1。將NPA1至NPA5的溶液分別加至樣品墊。抗原與標示金的偵測抗體於共軛墊結合後，繼續移動至測試條帶上，與相應的捕捉抗體形成三明治免疫-複合體，並於測試條帶上產生紫色比色訊號。NP17及NP16如預期地都以高親和力對測試的NPA1至NPA5具有廣泛的專一性(第1B圖)，如表6及表7結果所示。如同三明治ELISA的結果(表7)，以NP17作為捕捉及偵測抗體可形成NP的同元聚合物，因此可用以偵測NPA。值得一提的是，雖然基於ELISA測量的結果僅預期NP1會與NPA1具有幾乎無法偵測的親和力(表4)，且基於LFIA檢測結果僅預期會與NPA1及NPA2具有極低的親和力(第1A圖)，但NPA1與除了NPA2以外的所有NP結合，且與另外2個IgG1具有相當強度的親和力。
第1C圖的數據顯示以10倍連續稀釋的NPA1測試三明治LFIA偵測極限的結果。在LFIA中以NP16及NP17偵測NPA1的偵測極限約為1奈莫耳濃度，其與IgG1在三明治ELISA中偵測相似NP的偵測極限相當(總結於表6及表7)。儘管基於ELISA的NP1-NPA1交互作用的EC50
與NP16-NPA1及NP17-NPA1交互作用的EC50
相比約少了4個量級，NP1仍與另外2個IgG1結合以相當的親和力與NPA1結合(第1B圖)。綜上所述，該結果顯示，雖然抗體-抗原的交互作用可以ELISA及LFIA量化，但ELISA及LFIA中適用的抗體之間不一定相關；因此，需依據LFIA的需求憑經驗挑選適用於LFIA的抗體，而非僅基於ELISA定性的結果。
綜上所述，本研究內容揭示許多選自GH合成抗體庫的抗體(例如，25個抗-NP之抗體)以相應的親和力及專一性，與6個代表性流感NP (包含5種源自IAV病毒株的NP及1種源自IBC病毒株的NP)結合。許多挑選出來的抗體與相應NP的最佳親和力的EC50
低於1奈莫耳濃度，不需進一步進行親和力成熟。該親和力強度與源自鼠類免疫系統的正控制組的老鼠抗體相當。挑選出來的抗體組具有不同的專一性，可用以區分具有超過90%相似度的NP序列。該些源自GH抗體庫的GH抗體不需更進一步的親和力成熟，即可用於三明治ELISA及LFIA中偵測源自流感病毒的相應NP，其偵測檢體中NP的偵測極限為1奈莫耳濃度。該偵測極限已接近一般用以偵測流感病毒的RIDT可接受的偵測極限。本揭示內容顯示在一般程序中發展診斷用抗體的可行性，且該抗體無法從動物相關的抗體技術中獲得。
應當理解的是，前述實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本發明所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍以附隨申請專利範圍界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1A至1C圖為LFIA之結果闡述抗-NP IgG1對特定NP的偵測極限。第1A圖為25種抗-NP IgG1及正控制組抗體(x-軸)對固定於NC膜上的AL2C (正控制組)、NPB1、NPA1以及NPA2(y-軸)的辨認結果。將相應的IgG以每100微升1微克的量加至各LFIA的樣品墊(sample pad)上。第1B圖顯示將AL2C (正控制組)、NP17、NP1及NP16固定於NC膜上(y-軸)作為捕捉試劑，且以膠態金(colloidal gold)標記的NP17作為偵測試劑結合於共軛墊(conjugate pad)，用以偵測加至樣品墊的NP (100微升之10-7
M NP) (x-軸)的三明治LFIA的結果。第1C圖顯示NPA1的偵測極限，其中藉由將10倍連續稀釋的NPA1溶液(x-軸)加至如第1B圖所述之三明治LFIA的條帶上測定該偵測極限。
Claims (10)
- 一種用以篩選對流感病毒具有專一性之抗體片段的方法，包含： (a) 提供一由噬菌體表現之單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)抗體庫，其包含複數個由噬菌體表現的scFv，其中每個由噬菌體表現之scFv的重鏈變異域(heavy chain variable domain, VH domain)對蛋白A具有結合親和力，以及每個由噬菌體表現之scFv的輕鏈變異域(light chain variable domain, VL domain)對蛋白質L具有結合親和力； (b) 將步驟(a)之該由噬菌體表現之scFv抗體庫曝露於一標的核蛋白中，該標的核蛋白包含一選自由序列編號：1-6所組成之群組的胺基酸序列； (c) 自步驟(b)之該由噬菌體表現之scFv抗體庫篩選出一第一複數個噬菌體，其分別表現與該標的核蛋白具有結合親和力的scFv； (d) 在具有至少一擾亂核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情況下，將步驟(c)挑選的該第一複數個噬菌體曝露於該標的核蛋白中，其中該擾亂核蛋白包含一選自由序列編號：1-6所組成之群組的胺基酸序列，且該擾亂核蛋白之胺基酸序列與該標的核蛋白之胺基酸序列不同； (e) 自步驟(d)之該第一複數個噬菌體挑選一第二複數個噬菌體，其中在擾亂核蛋白存在的情況下，該第二複數個噬菌體分別表現與該標的蛋白具有結合親和力的scFv； (f) 使步驟(e)挑選的該第二複數個噬菌體分別表現複數個可溶性scFv； (g) 將步驟(f)之該複數個可溶性scFv曝露於該標的核蛋白中； (h) 確認步驟(g)中該複數個可溶性scFv與該標的蛋白個別的結合親和力；以及 (i) 基於步驟(h)之結果，挑選一可溶性scFv作為抗體片段，其中相較於該複數個可溶性scFv中其他的可溶性scFv，該作為抗體片段的可溶性scFv與該標的蛋白具有較優異的親和性。
- 如請求項1所述之方法，其中該流感病毒為A型或B型流感病毒。
- 如請求項2所述之方法，其中該A型流感病毒為H1N1、H3N2或H5N1。
- 一種重組抗體或片段，包含一VL域以及一VH域，其中該VL域包含一第一輕鏈互補決定區(complementarity determining region, CDR-L1)、一第二輕鏈CDR (CDR-L2)及一第三輕鏈CDR (CDR-L3)，且該VH域包含一第一重鏈CDR (CDR-H1)、一第二重鏈CDR (CDR-H2)及一第三重鏈CDR (CDR-H3)，其中 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：7-12之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：13-18之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：19-24之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：25-30之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：31-36之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：37-42之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：43-48之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：49-54之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：55-60之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：61-66之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：67-72之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：73-78之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：79-84之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：85-90之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：91-96之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：97-102之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：103-108之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：109-114之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：115-120之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：121-126之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：127-132之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：133-138之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：139-144之胺基酸序列； 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：145-150之胺基酸序列；或是 該CDR-L1、該CDR-L2、該CDR-L3、該CDR-H1、該CDR-H2以及該CDR-H3分別包含序列編號：151-156之胺基酸序列。
- 如請求項4所述之重組抗體，其中 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：157及158具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：159及160具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：161及162具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：163及164具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：165及166具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：167及168具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：169及170具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：171及172具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：173及174具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：175及176具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：177及178具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：179及180具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：181及182具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：183及184具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：185及186具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：187及188具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：189及190具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：191及192具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：193及194具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：195及196具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：197及198具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：199及200具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：201及202具有至少85%相似度之胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：203及204具有至少85%相似度之胺基酸序列；或 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：205及206具有至少85%相似度之胺基酸序列。
- 如請求項5所述之重組抗體，其中 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：157及158具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：159及160具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：161及162具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：163及164具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：165及166具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：167及168具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：169及170具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：171及172具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：173及174具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：175及176具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：177及178具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：179及180具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：181及182具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：183及184具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：185及186具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：187及188具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：189及190具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：191及192具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：193及194具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：195及196具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：197及198具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：199及200具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：201及202具有100%相似度的胺基酸序列； 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：203及204具有100%相似度的胺基酸序列；或 該VL域及該VH域分別包含與序列編號：205及206具有100%相似度的胺基酸序列。
- 一種由一個體分離之生物樣本來診斷該個體是否受到一流感病毒感染的方法，包含利用如請求項4所述之重組抗體偵測該生物樣本中是否存在該流感病毒之核蛋白，其中該生物樣本存在該核蛋白表示該個體受到該流感病毒的感染。
- 如請求項7所述之方法，其中該流感病毒為A型或B型流感病毒。
- 如請求項8所述之方法，其中該A型流感病毒為H1N1、H3N2或H5N1。
- 如請求項7所述之方法，其中該個體為人類。
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