CN115835883A - 用以筛选抗体片段的方法、由此制备的重组抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用以筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法。根据本发明内容的某些实施方式，所述流感病毒可为A型流感病毒或B型流感病毒。本发明也提供筛选出来的抗体、由所述抗体制备的重组抗体，以及其用以诊断流感病毒感染的用途。

Description

用以筛选抗体片段的方法、由此制备的重组抗体及其用途
发明背景
1.技术领域
本发明涉及一种用以筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法，以及筛选出的抗体片段用于诊断流感病毒感染的用途。
2.背景技术
酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)以及侧流式免疫测定法(lateral flow immunoassay,LFIA)为快速进行分子定量/半定量监测的技术。所述免疫测定平台可作为用以预防/治疗疾病、保障食品安全、监测免疫原及控制环境污染的工具。具体而言，LFIA符合世界卫生组织(World Health Organization,WHO)，对于ASSURED(可负担、灵敏、特异、便于操作、快速且准确、不需设备以及可交付)的要求，可作为未经训练的人员在资源缺乏而亟需健康照护及对感染性疾病控制时的疾病诊断工具
在研发ELISA及LFIA的应用时，经常遭遇不同的挑战。上述两种免疫测定平台的关键组分为与抗体相关的亲和性试剂，所述试剂多来自免疫(immunized)动物的单株或是多株抗体。这些来自动物的抗体作为亲和性试剂有三个缺点：第一，发现及研发动物抗体的时间至少需耗费16-24个月，时间长于一般预防主要疾病恶化的关键时期(例如，人类的流行性感染疾病的爆发)；第二，动物B细胞对于一抗原的反应通常取决于所述抗原少数的用于免疫的B细胞抗原决定簇，造成作为亲和性试剂的动物抗体选择受限；第三，即使已获得可作为亲和性试剂的动物抗体，也无法保证所述抗体具有分辨高度相似的抗原的能力，且最终产品经常不易分辨有毒病原株及与其相关但不具毒性的病原株。
流感病毒因其快速变异、基因漂变(genetic drift)及基因组重组(genomereassortment)的特性，导致新型流感病毒株的出现，使其可跨越物种的限制感染多种宿主，像是1997年的H5N1、2013年的H7N9、H10N8及H6N1以及2014年的H5N6。快速监测所述新兴的流感病毒株是解决流感大规模爆发及季节性流感对人类社会及经济所造成的威胁的关键方法。用以监测流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)的快速流感诊断测试(Rapidinfluenza diagnostic test,RIDT)，可协助健康照护的专业人员做出立即且有效的治疗决策，并且避免非必要的抗生素及抗病毒药物的处方。LFIA测定法相关的检测A型流感病毒(influenza virus type A,IAV)及B型流感病毒(influenza virus type B,IBV)的测试，已经可以RIDT的形式被广泛地取得，但是所述测试的灵敏度因为落在40％至70％的范围内，无法涵盖持续增加且多样的流感病毒株。
综上所述，在本发明相关领域亟需一种能高效制备抗体的方法，其中所述抗体具有足够的特异性及亲和力，可分辨流感病毒的亚型，以建立用以预防及/或治疗感染的诊断平台。
发明内容
本发明的目的是提供本发明内容的简化摘要，以使阅读者对本发明内容具备基本的理解。此发明内容并非本发明内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组分或限定本发明的范围。其唯一目的是以简化的概念形式呈现本发明内容的一些概念，以作为呈现在后文中更详细描述的序言。
如本文的实施方式及广泛的描述，本发明内容的一方面是关于一种用于筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法。根据本发明内容的实施方式，所述方法包含以下步骤：
(a)提供一由噬菌体展示的单链可变片段(single-chain variable fragment,scFv)抗体库，其包含复数个由噬菌体展示的scFv，其中每个由噬菌体展示的scFv的重链可变区(heavy chain variable domain,VH domain)对蛋白A具有结合亲和力，以及每个由噬菌体展示的scFv的轻链可变区(light chain variable domain,VL domain)对蛋白质L具有结合亲和力；
(b)将步骤(a)所述的由噬菌体展示的scFv抗体库曝露于一个目标核蛋白中，所述目标核蛋白包含一选自：由SEQ ID NO:1-6所组成的组中的氨基酸序列；
(c)自步骤(b)所述的由噬菌体展示的scFv抗体库筛选出第一复数个噬菌体，其分别表达与所述目标核蛋白具有结合亲和力的scFv；
(d)在具有至少一扰乱核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情况下，将步骤(c)挑选的所述第一复数个噬菌体曝露于所述目标核蛋白中，其中所述扰乱核蛋白包含一选自：由SEQ ID NO:1-6所组成的组中的氨基酸序列，且所述扰乱核蛋白的氨基酸序列与所述目标核蛋白的氨基酸序列不同；
(e)自步骤(d)的所述第一复数个噬菌体挑选一第二复数个噬菌体，其中在扰乱核蛋白存在的情况下，所述第二复数个噬菌体分别表达与所述目标蛋白具有结合亲和力的scFv；
(f)分别使步骤(e)挑选的所述第二复数个噬菌体展示复数个可溶性scFv；
(g)使步骤(f)的所述复数个可溶性scFv曝露于所述目标核蛋白中；
(h)确认步骤(g)中所述复数个可溶性scFv与所述目标蛋白单独结合的亲和力；以及
(i)基于步骤(h)的结果，挑选一可溶性scFv作为抗体片段，其中相较于所述复数个可溶性scFv中其他的可溶性scFv，所述作为抗体片段的可溶性scFv与所述目标蛋白具有较优异的亲和性。
根据本发明的某些实施方式，流感病毒为IAV。根据某些实施方式，流感病毒为IBV。在某些示例性的实施方式中，流感病毒为IAV亚型(如，H1N1、H3N2或H5N1)。
根据上述方法选择的抗体片段适用于制备一重组抗体，其中所述重组抗体用以监测流感病毒的感染，例如：IAV或IBV的感染。根据本发明的某些实施方式，25个抗体片段分别为“NP1”至“NP25”，是选自：由噬菌体展示的scFv的抗体库，且根据所述抗体片段制备25个重组抗体。本发明内容的第二方面是关于一种重组抗体或抗体片段(例如，scFv)，其结构包含一VL结构域和一VH结构域，其中所述VL结构域包含一第一轻链互补决定区(complementarity determining region,CDR-L1)、一第二轻链CDR(CDR-L2)以及一第三轻链CDR(CDR-L3)，且所述VH结构域包含一第一重链CDR(CDR-H1)、一第二重链CDR(CDR-H2)以及一第三重链CDR(CDR-H3)。
根据某些实施方式，抗体片段NP1的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:7-12的氨基酸序列；抗体片段NP2的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:13-18的氨基酸序列；抗体片段NP3的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:19-24的氨基酸序列；抗体片段NP4的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:25-3的氨基酸序列；抗体片段NP5的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:31-36的氨基酸序列；抗体片段NP6的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:37-42的氨基酸序列；抗体片段NP7的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:43-48的氨基酸序列；抗体片段NP8的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:49-54的氨基酸序列；抗体片段NP9的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQID NO:55-60的氨基酸序列；抗体片段NP10的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:61-66的氨基酸序列；抗体片段NP11的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:67-72的氨基酸序列；抗体片段NP12的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:73-78的氨基酸序列；抗体片段NP13的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:79-8的氨基酸序列；抗体片段NP14的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:85-90的氨基酸序列；抗体片段NP15的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:91-96的氨基酸序列；抗体片段NP16的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:97-102的氨基酸序列；抗体片段NP17的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:103-108的氨基酸序列；抗体片段NP18的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:109-114的氨基酸序列；抗体片段NP19的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:115-120的氨基酸序列；抗体片段NP20的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:121-126的氨基酸序列；抗体片段NP21的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:127-132的氨基酸序列；抗体片段NP22的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:133-138的氨基酸序列；抗体片段NP23的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:139-144的氨基酸序列；抗体片段NP24的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:145-150的氨基酸序列；以及抗体片段NP25的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3分别包含SEQ ID NO:151-156的氨基酸序列。
根据某些实施方式，抗体片段NP1的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQID NO:157及158具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP2的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:159及160具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP3的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:161及162具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP4抗体片段NP3的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:163及164具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP5的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:165及166具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP6的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:167及168具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP7的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ IDNO:169及170具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP8的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:171及172具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP9的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:173及174具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP10的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:175及176具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP11的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:177及178具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP12的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:179及180具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP13的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:181及182具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP14的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:183及184具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP15的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:185及186具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP16的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:187及188具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP17的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:189及190具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP18的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:191及192具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP19的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:193及194具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP20的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:195及196具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP21的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:197及198具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP22的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:199及200具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP23的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:201及202具有至少85％同一性的氨基酸序列；抗体片段NP24的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:203及204具有至少85％同一性的氨基酸序列；以及抗体片段NP25的所述VL结构域及所述VH结构域分别包含一与SEQ ID NO:205及206具有至少85％同一性的氨基酸序列。
本发明内容的其他方面是涉及一种由一个体分离的生物样本来诊断所述个体是否受到一流感病毒感染的方法。所述方法包含以下步骤：利用本发明内容的抗体片段或重组抗体监测生物样本中是否存在流感病毒的核蛋白，其中所述生物样本存在所述核蛋白表示所述个体受到所述流感病毒的感染。根据某些实施方式，所述流感病毒为IAV或IBV。在某些特定实施例中，所述流感病毒为H1N1、H3N2或H5N1。
据此，经过训练的人员或临床的操作者可及时为一亟需的个体提供适当的治疗。具体来说，当一个体的生物样本中有所述核蛋白存在，可施予所述个体有效量的抗病毒治疗(例如，奥司他韦(oseltamivir)、瑞乐沙(Zanamivir)、帕拉米韦(peramivir)、巴洛沙韦玛波西酯(baloxavir marboxil)、金刚胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)或其组合)，以舒缓及/或改善流感病毒相关的感染。
所述个体为哺乳类动物；较佳为人类。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识的人可轻易了解本发明的基本原理及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方面。
附图说明
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图说明如下：
图1A至1C为LFIA的结果阐述抗-NP IgG1对特定NP的监测极限。图1A为25种抗-NPIgG1及阳性对照组抗体(x-轴)对固定于NC膜上的AL2C(阳性对照组)、NPB1、NPA1以及NPA2(y-轴)的辨认结果。将相应的IgG以每100微升1微克的量加至各LFIA的样品垫(samplepad)上。图1B显示将AL2C(阳性对照组)、NP17、NP1及NP16固定于NC膜上(y-轴)作为捕捉试剂，且以胶体金(colloidal gold)标记的NP17作为监测试剂结合于共轭垫(conjugatepad)，用以监测加至样品垫的NP(100微升的10-7M NP)(x-轴)的三明治LFIA的结果。图1C显示NPA1的监测极限，其中藉由将10倍连续稀释的NPA1溶液(x-轴)加至如图1B所述的三明治LFIA的条带上测定所述监测极限。
具体实施方式
为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以构建与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，也可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
I.定义
为了便于说明，此处完整性地说明本说明书、实施例以及后附的申请专利范围中所记载的特定术语。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖所述名词的复数型；而所用的复数名词也涵盖所述名词的单数型。具体而言，除非本说明书令另有定义，此处及申请专利范围中使用的单数型“一”涵盖其复数型；“至少一”(at least one)以及“一或多”(one or more)具有相同涵义且包含一、二、三或更多。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于两端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
本发明内容中，“抗体”(antibody)是以最广泛的意义来使用，具体涵盖单株抗体(包括全长的单株抗体)、多株抗体、多重特异性抗体(例如，双特异性抗体)及抗体片段，只要其展现出想要的生物学活性即可。“抗体片段”(antibody fragments)包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或变异区。抗体片段的实例包含，抗原结合区(fragmentantigen-binding,Fab)、Fab’、F(ab’)2、单链可变片段、双体(diabodies)、线性抗体(linear antibodies)、单链抗体分子以及由抗体片段所形成的多重特异性抗体。
本发明内容中，“抗体库”(antibody library)是指一群经表达的抗体及/或抗体片段，用以筛选及/或组合成完整抗体。抗体及/或抗体片段可以表达于核糖体(ribosome)、噬菌体或细胞表面(特别是酵母菌细胞表面)。
在本发明内容中，“单链可变片段”(single-chain variable fragment或scFv)是指包含一免疫球蛋白的重链可变区(variable domain of the heavy chain,VH)及轻链可变区(variable domain of the light chain,VL)的融合蛋白，其中所述VH及VL是共价偶连以形成一VH:VL异二聚体(heterodimer)。所述VH及VL可直接连结或透过一由肽编码的连接肽连接，其中所述连接肽可连接VH的N端及VL的C端，或是连接VH的C端及VL的N端。连接肽通常为包含多个能增加可挠性的甘氨酸(glycine)及多个能增加溶解性的丝氨酸(serine)或苏氨酸(threonine)。即使移除抗体的恒定域且插入连接肽，scFv蛋白仍保有原免疫球蛋白的特异性。可由包含用以编码VH及VL序列的核酸来表达scFv多肽抗体。
在本发明内容中，“EC50”是指一抗体或其抗原结合区域的浓度，所述浓度在活体外或活体试验中可引发一反应，其为最大反应的一半量(即最大反应及基准值的中间量)。
在本发明内容中，“互补决定区”(complementarity determining region,CDR)是指抗体的高度变异区域，其形成与结合的抗原的三维结构互补的表面。每个抗体重链及轻链从N端到C端共包含3个CDR(CDR-1、CDR-2及CDR-3)。HLA-DR的抗原结合位总共包含6个CDR，其中3个CDR(也即，CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)源自重链的可变区域，以及3个CDR(也即，CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)源自轻链的可变区域。CDR的氨基酸残基与结合的抗原紧密接触，其中和抗原最紧密接触的通常与重链的CDR3有关。
在本发明内容中，“噬质体”(phagemid)一词在本发明内容是指一结合细菌噬菌体及质体特性的载体。细菌噬菌体是指任何一种可感染细菌的病毒。
此处针对多肽序列所述的“序列同一性百分比”(Percentage(％)sequenceidentity)系指候选序列的氨基酸残基与参考多肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比；在进行上述比对时，可将所述的候选多肽片段与所述的特定多肽片段并排，并于必要时引入间隙，以使两序列形成最高的序列同一性；在计算同一性时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基。相关领域已有多种方法可用以进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，两多肽序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(Nation Center forBiotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析数据库Blastp来进行。候选多肽序列A相较于参考多肽序列B的氨基酸序列同一性(在本说明书中也称之为多肽序列A与多肽序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列同一性)的计算方式如下：
Figure BDA0003988411120000121
其中X是利用BLAST序列并排步骤对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B两序列中较短者的氨基酸残基总数。
本发明内容及请求保护的发明概念也包含抗体的氨基酸序列的微小变异，其中氨基酸序列的变异维持至少85％序列同一性，例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。可藉由特定修饰来改变抗体的特性，而不影响其生理活性。举例来说，可改变及/或删除某些氨基酸而不影响本发明抗体的生理活性(即，其中和流感病毒的能力)。特别是，保留性氨基酸取代也包含于其中。保留性取代为具有相似/相关侧链之氨基酸间的相互取代。一般来说，由基因编码的氨基酸可分为四大类：(1)酸性氨基酸，即天冬氨酸(aspartate)、谷氨酸(glutamate)；(2)碱性氨基酸，即赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)、组氨酸(histidine)；(3)非极性氨基酸，即丙氨酸(alanine)、缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)、色氨酸(tryptophan)；以及(4)非带电极性氨基酸，即甘氨酸(glycine)、天冬酰胺(asparagine)、谷氨酰胺(glutamine)、半胱氨酸(cysteine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、酪氨酸(tyrosine)。较佳的分类是：丝氨酸及苏氨酸系属脂肪羟基(aliphatic-hydroxy)类；天冬酰酸及谷氨酰胺系属含酰胺(amide-containing)类；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸系属脂肪类；而苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸则属芳香(aromatic)类。举例来说，当可想见若以异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、以谷氨酸取代天门冬氨酸、以丝氨酸取代苏氨酸，或是以一结构相似的氨基酸取代另一氨基酸时，并不会造成分子结合或蛋白特性的显著改变，特别是当所述取代位置不是位于骨架区域时，氨基酸之间的取代更不会影响上述特性。可藉由检测抗体衍生物的特定活性来了解一氨基酸的改变是否可形成一具功能性的抗体。可利用本发明所属技术领域具有通常知识者所知的方法来制备抗体片段或类似物。抗体片段或类似物的较佳的胺基及羧基末端是邻近功能域的边界。
在本发明内容中，“个体”(subject)一词是指包含人类的动物，其可接受本发明方法的治疗。除非特定指出，否则“个体”一词同时意指男性及女性。
II.发明说明
本发明内容的第一方面是关于一种用以筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法。根据本发明内容的实施方式，所述方法包含以下步骤：
(a)提供一由噬菌体展示的scFv抗体库，其包含一复数个由噬菌体展示的scFv，其中每个由噬菌体展示的scFv的VH结构域对蛋白质A具有结合亲和力，以及每个由噬菌体展示的scFv的VL结构域对蛋白质L具有结合亲和力；
(b)将步骤(a)的所述由噬菌体展示的scFv抗体库曝露于一目标核蛋白中，所述目标核蛋白包含一选自由SEQ ID NO:1-6所组成的组中的氨基酸序列；
(c)自步骤(b)的所述由噬菌体展示之scFv抗体库筛选出一第一复数个噬菌体，其分别表达与所述目标核蛋白具有结合亲和力的scFv；
(d)在具有至少一扰乱核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情况下，将步骤(c)挑选的所述第一复数个噬菌体曝露于所述目标核蛋白中，其中所述扰乱核蛋白包含一选自由SEQ ID NO:1-6所组成的组中的氨基酸序列，且所述扰乱核蛋白的氨基酸序列与所述目标核蛋白的氨基酸序列不同；
(e)自步骤(d)的所述第一复数个噬菌体挑选一第二复数个噬菌体，其中在扰乱核蛋白存在的情况下，所述第二复数个噬菌体分别表达与所述目标蛋白具有结合亲和力的scFv；
(f)使步骤(e)挑选的所述第二复数个噬菌体分别表达复数个可溶性scFv；
(g)将步骤(f)的所述复数个可溶性scFv曝露于所述目标核蛋白中；
(h)确认步骤(g)中所述复数个可溶性scFv与所述目标蛋白单独的结合亲和力；以及
(i)基于步骤(h)的结果，挑选一可溶性scFv作为抗体片段，其中相较于所述复数个可溶性scFv中其他的可溶性scFv，所述作为抗体片段的可溶性scFv与所述目标蛋白具有较优异的亲和性。
本发明方法可用以筛选对流感病毒具有结合亲和力及/或特异性的抗体片段，据以提供一种可监测不同流感病毒亚型的方法，其中所述流感病毒具有高度抗原同一性。根据本发明的某些实施方式，经筛选出来的抗体片段可用以监测A型流感病毒(也即，IAV)或B型流感病毒(也即，IBV)。非限制的IAV实例包含，H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N7。在一特定实施例中，流感病毒为H1N1、H3N2或H5N1。
在步骤(a)中，提供一由噬菌体展示的scFv抗体库。根据本发明的某些实施方式，所述由噬菌体展示的scFv抗体库的骨架为人类IGKV1-NL1*01/IGHV3-23*04生殖细胞系序列，并以特定引物利用PCR反应来多样化其CDR序列，包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。经蛋白A及蛋白L筛选后，制备由噬菌体展示的scFv抗体库(以下称为“GH2抗体库”，包含本发明中的GH2-5、GH2-6、GH2-7、GH2-8、GH2-9、GH2-10、GH2-11、GH2-12、GH2-13、GH2-14、GH2-16、GH2-18、GH2-20、GH2-22及GH2-24抗体库)，其中每个由噬菌体展示的scFv具有一可结合蛋白A之VH结构域，以及一可结合蛋白L的VL结构域。本领域技术人员可根据美国专利公告第10,336,815B2号或美国专利公告第10,336,816B2号以及Ing-ChienChen等人所发表的公开文献(High throughput discovery of influenza virusneutralizing antibodies from phage-displayed synthetic antibody libraries,Scientific Reports 7,Article number:14455(2017))所述的方法来构建所述由噬菌体展示的scFv抗体库。所述申请案及文献在此一并纳入本发明内容，以供参照。
在步骤(b)中，将GH2抗体库曝露于一目标蛋白中，其是选自由(1)NPA1：源自H3N2的重组核蛋白，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；(2)NPA2：源自H1N1的重组核蛋白，包含SEQID NO:2的氨基酸序列；(3)NPA3：源自H1N1的重组核蛋白，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；(4)NPA4：源自H1N1的重组核蛋白，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(5)NPA5：源自H5N1的重组核蛋白，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及(6)NPB1：源自IBV的重组核蛋白，包含SEQID NO:6的氨基酸序列。根据某些实施方式，是将所述目标核蛋白固定于基质(比如琼脂榶树脂或聚丙烯酰胺)上，之后再与本发明GH2抗体库混合。
在步骤(c)中，是由GH2抗体库中筛选出复数个噬菌体(也即，一第一复数个噬菌体)，其中经筛选出的噬菌体会分别表达对目标核蛋白具有结合特异性的scFv。具体来说，以酸性冲提缓冲溶液(例如pH 2.2的甘氨酸溶液)处理步骤(b)的产物，藉以破坏目标核蛋白与噬菌体展示的scFv之间的结合。据此，收集复数个分别表达对目标蛋白具有结合亲和力的scFv的噬菌体。
在步骤(d)中，为了增加对目标蛋白具有结合特异性之scFv的群体，在具有至少一扰乱核蛋白存在的情形下，将步骤(c)选出的复数个噬菌体(也即，第一复数个噬菌体)加至目标核蛋白中，且每个扰乱核蛋白包含与所述目标核蛋白不同的氨基酸序列。根据某些实施方式，所述目标核蛋白为NPA1蛋白，其被固定于一基质(像是琼脂糖树脂或聚丙烯酰胺)上，之后在具有至少一扰乱核蛋白存在的情形下与本发明GH2抗体库混合，其中所述扰乱核蛋白是选自由NPA2-NPA5及NPB1蛋白所组成的组中。在一例示性的实施方式中，所述目标核蛋白NPA1在具有5种扰乱蛋白(包含NPA2-NPA5以及NPB1蛋白)的情形下，与本发明GH2抗体库混合。根据某些实施方式，所述目标核蛋白为NPA2蛋白，其被固定于一基质上，之后在具有至少一扰乱核蛋白存在的情形下与本发明GH2抗体库混合，其中所述扰乱核蛋白是选自由NPA1、NPA3-NPA5及NPB1蛋白所组成的组中。在一例示性的实施方式中，所述目标核蛋白NPA2在具有5种扰乱蛋白(包含NPA1、NPA3-NPA5及NPB1蛋白)的情形下，与本发明GH2抗体库混合。根据某些实施方式，所述目标核蛋白为NPA3蛋白，其被固定于一基质上，之后在具有至少一扰乱核蛋白存在的情形下与本发明GH2抗体库混合，其中所述扰乱核蛋白是选自由NPA1、NPA2、NPA4、NPA5及NPB1蛋白所组成的组中。在一例示性的实施方式中，所述目标核蛋白NPA3在具有5种扰乱蛋白(包含NPA1、NPA2、NPA4、NPA5及NPB1蛋白)的情形下，与本发明GH2抗体库混合。根据某些实施方式，所述目标核蛋白为NPA4蛋白，其被固定于一基质上，之后在具有至少一扰乱核蛋白存在的情形下与本发明GH2抗体库混合，其中所述扰乱核蛋白是选自由NPA1-NPA3、NPA5及NPB1蛋白所组成的组中。在一例示性的实施方式中，所述目标核蛋白NPA3在具有5种扰乱蛋白(包含NPA1-NPA3、NPA5及NPB1蛋白)的情形下，与本发明GH2抗体库混合。根据某些实施方式，所述目标核蛋白为NPA5蛋白，其被固定于一基质上，之后在具有至少一扰乱核蛋白存在的情形下与本发明GH2抗体库混合，其中所述扰乱核蛋白是选自由NPA1-NPA4及NPB1蛋白所组成的组中。在一例示性的实施方式中，所述目标核蛋白NPA5在具有5种扰乱蛋白(包含NPA1-NPA4及NPB1蛋白)的情形下，与本发明GH2抗体库混合。根据某些实施方式，所述目标核蛋白为NPB1蛋白，其被固定于一基质上，之后在具有至少一扰乱核蛋白存在的情形下与本发明GH2抗体库混合，其中所述扰乱核蛋白是选自由NPA1-NPA5蛋白所组成的组中。在一例示性的实施方式中，所述目标核蛋白NPB1在具有5种扰乱蛋白(包含NPA1-NPA5蛋白)的情形下，与本发明GH2抗体库混合。
接着，在步骤(e)中，自所述第一复数个噬菌体(其在具有扰乱核蛋白存在的情况下，分别表达对目标核蛋白具有结合特异性的scFv)筛选复数个噬菌体(也即，第二复数个噬菌体)。在类似步骤(c)方法中，以酸性冲提缓冲溶液(例如pH 2.2的甘氨酸溶液)处理步骤(b)的产物，藉以破坏目标核蛋白与噬菌体展示的scFv之间的结合。藉此，收集分别表达与目标核蛋白具有结合特异性的scFv之第二复数个噬菌体。
接着，在步骤(f)中，将步骤(e)筛选出的第二复数个噬菌体置于使其能产生复数个可溶性scFv的环境中。本发明所属技术领域具有通常知识者可根据已知的方法完成此步骤。根据本发明的某些实施方式，VH结构域及VL结构域的表达是由一乳糖操纵组(lactoseoperon或lac operon)所驱动；如本发明所属领域具有通常知识者所熟知，可藉由添加异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactoside,IPTG)诱导所述乳糖操纵组表达，而驱动下游基因(也即，编码VH结构域及VL结构域的基因)表达。产生的scFv因此会分泌至培养液的上清液中，并可由此收集所述scFv。
在步骤(g)中，分别将步骤(f)中制造的所述可溶性scFv与所述目标核蛋白混合，以形成蛋白-scFv复合体。
之后，在步骤(h)中，利用本发明所属领域具有通常知识者所知的用于分析两分子间结合亲和力(例如，一抗体与一抗原的结合亲和力)的方法，测定在步骤(g)中形成的蛋白-scFv复合体的含量；举例来说，ELISA、西方墨点法(western blotting,WB)、流式细胞仪或LFIA。一般而言，蛋白-scFv复合体的含量和scFv与目标核蛋白的结合亲和力呈正比。根据一特定实施例，以ELISA测定蛋白-scFv复合体的含量(也即，所述可溶的scFv与目标核蛋白的结合亲和力)。
最后，在步骤(i)中，基于步骤(h)测定的结合亲和力筛选抗体片段。更具体来说，自复数个可溶的scFv中筛选出一可溶的scFv作为抗体片段，所述可溶的scFv对目标核蛋白展现出优于其他可溶的scFv的结合亲和力。
由本发明scFv抗体库筛选的所述抗体片段可用于制备一重组抗体(例如：一重组IgG抗体)。可依照本发明领域具有通常知识者所熟知的方法来制备源自scFv的重组抗体，举例来说，美国专利公开第10,336,815 B2号或美国专利公开第10,336,816 B2号所述的方法。
根据本发明的某些实施方式，制备由本发明方法筛选的25个抗体片段。所述抗体片段/重组抗体的CDR序列(包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)对应的序列识别号(sequence identifier)分别总结于表1。
表1特定抗体CDR序列对应的序列识别号(SEQ ID NO)
Figure BDA0003988411120000191
根据本发明内容某些例示性实施方式，NP1至NP25抗体的VL结构域及VH结构域分别包含总结于表2的氨基酸序列。
表2特定抗体的VL及VH序列对应的序列识别号
Figure BDA0003988411120000201
当可理解，可对VL及VH结构域的序列(例如：骨架序列)进行变异(例如，以保留性或非保留性氨基酸取代)，而不影响本发明抗体的结合亲和力及/或特异性。较佳地，以一或多个具有相似特性的氨基酸对VL及VH结构域的序列进行保留性取代；举例来说，以异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或色氨酸(一非极性氨基酸残基)来取代白氨酸(另一非极性氨基酸残基)；以谷氨酸(一酸性氨基酸残基)来取代天冬氨酸(另一酸性氨基酸残基)；或是以精氨酸或组氨酸(一碱性氨基酸残基)来取代赖氨酸(另一碱性氨基酸残基)。据此，本发明内容也包含在VL及VH结构域的序列具有微小变异的抗体(也即，NP1至NP25抗体)中。
根据某些实施方式，以某些保留性氨基酸取代NP1抗体的VL及/或VH结构域的骨架的氨基酸(也即，保留性替换)。保留性替换是本发明领域所熟知的技术，因此本领域技术人员可选择合适的氨基酸来置换抗体NP1的VL及/或VH结构域的骨架，且不影响其活性。在所述实施方式中，抗体NP1的VL结构域可包含与SEQ ID NO:157具有至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，及/或抗体NP1的VL结构域可包含与SEQ ID NO:158具有至少85％同一性的氨基酸序列。较佳地，抗体NP1的VL结构域可包含与SEQ ID NO:157具有至少90％同一性的氨基酸序列，及/或抗体NP1的VL结构域可包含与SEQ ID NO:158具有至少90％同一性的氨基酸序列。更佳地，抗体NP1的VL结构域可包含与SEQ ID NO:157具有至少95％同一性的氨基酸序列，及/或抗体NP1的VL结构域可包含与SEQ ID NO:158具有至少95％同一性的氨基酸序列。
当可理解，在不影响抗体活性(例如，对抗原的结合亲和力及/或特异性)的情况下，保留性替换可选择性地置入抗体NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24或NP25的VL及/或VH结构域的骨架中。根据某些例示性的实施方式，抗体NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VL结构域分别包含与SEQ ID NO:159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203及205具有至少85％同一性的氨基酸序列，及/或抗体NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VH结构域分别包含与SEQ ID NO:160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206具有至少85％同一性的氨基酸序列。较佳地，抗体NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VL结构域分别包含与SEQ ID NO:159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203及205具有至少90％同一性的氨基酸序列，及/或抗体NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VH结构域分别包含与SEQ ID NO:160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206具有至少90％同一性的氨基酸序列。最佳地，抗体NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VL结构域分别包含与SEQ ID NO:159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203及205具有至少95％同一性的氨基酸序列，及/或抗体NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25的VH结构域分别包含与SEQ ID NO:160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206具有至少95％同一性的氨基酸序列。
根据本发明内容某些实施例，抗体NP1至NP25皆可用于监测流感病毒，据此可作为诊断是否受到流感病毒感染的监测试剂。
因此，本发明内容的其他方面是关于用于监测一个体是否受到流感病毒感染的试剂盒。所述试剂盒至少包含一盒子，以及本发明内容任一方面或实施方式的一抗体(也即，一第一抗体)。可选择地，所述试剂盒可更包含一说明，用以指示如何使用所述抗体监测流感病毒的感染。
根据本发明的某些实施方式，所述抗体为NP16，其系作为用以捕捉NPA(源自IAV的核蛋白)的捕捉试剂，以及在监测测定(像是ELISA、WB测定、流式细胞仪或LFIA)中用以监测NPA的监测试剂。根据本发明的某些实施方式，所述抗体为NP17，其是作为用于监测IAV感染的捕捉试剂及监测试剂。
可选择地，所述试剂盒可更包含一第二抗体，其中在一监测测定中，所述第一抗体及所述第二抗体其中之一是作为捕捉试剂，而另一个则是作为监测试剂。根据某些实施方式，所述试剂盒包含NP16抗体作为监测试剂，以及NP1、NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP17、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25其中之一作为捕捉试剂。根据可选的实施方式，所述试剂盒包含NP17抗体作为监测试剂，且NP1、NP2、NP3、NP4、NP5、NP6、NP7、NP8、NP9、NP10、NP11、NP12、NP13、NP14、NP15、NP16、NP18、NP19、NP20、NP21、NP22、NP23、NP24及NP25其中之一作为捕捉试剂。
本发明也包含一藉由分离自一个体的生物样本来测定所述个体是否受到流感病毒感染的方法。所述方法包含利用本发明内容的抗体片段、重组抗体或试剂盒监测一生物样本中是否具有所述流感病毒的核蛋白，若有所述核蛋白存在表示所述个体受到所述流感病毒的感染。
一般而言，所述生物样本是取自所述个体呼吸道的样本；较佳地，为所述个体的上呼吸道。适用于本发明方法的所述生物样本的非限制性实例，包含分离自所述个体的口腔、鼻腔、气管、支气管或肺的肌肉组织、液体或分泌液(例如：痰)。
具有通常知识者或临床操作者可基于在诊断的结果，给予受到流感病毒感染的个体适当的治疗(像是抗病毒治疗)，以改善及/或缓解流感病毒感染的相关症状。适用于本发明方法的抗病毒治疗的实例包含，但不限于，奥司他韦、瑞乐沙、帕拉米韦、巴洛沙韦玛波西酯、金刚胺、金刚乙胺及其组合。
可接受本发明方法诊断及/或治疗的个体为一哺乳动物，举例来说，所述个体为一人类、小鼠、大鼠、猴子、绵羊、羊、猫、狗、马或猩猩。较佳的，所述个体为一人类。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以使得本发明所属技术领域中具有通常知识者实现本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。因此，本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，充分利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。
实施例
材料与方法
制备重组核蛋白
制备本研究中的5个代表性A型流感病毒的NP以及1个B型流感病毒的NP，包含NPA1(登录号：AY210236；源自IAV株A/Taiwan/1/72(H3N2)的NP)、NPA2(登录号：AF306656；源自IAV株A/WSN/1933(H1N1)的NP)、NPA3(登录号：CY083913；源自IAV株A/Aalborg/INS132/2009(H1N1)的NP)、NPA4(登录号：CY025384；源自IAV株A/Alabama/UR06-0455/2007(H1N1)的NP)、NPA5(登录号：CY098574；源自IAV株A/Anhui/1/2005(H5N1)的NP)以及NPB1(登录号：CY018304；源自IBV株B/Houston/B720/2004的NP)。具体而言，优化NP基因的编码区域使其适合以E.coli表达，并连接至以Nde I及Xho I限制酶截切后呈线形的表达载体pET15b上；所述重组NP蛋白包含一位于其序列上游的His6-标签及凝血酶截切序列。于16℃下，添加0.5毫摩尔浓度IPTG以诱导BL21(DE3)细胞过量表达所述NP载体。以Ni2+带电螯合琼脂管柱(用以结合His6-标签)、肝素管柱(用以结合不含RNA的NP)以及粒径筛析分离(缓冲溶液：40毫摩尔浓度Tris，pH 7.5；600毫摩尔浓度NaCl)纯化由E.coli表达的所述NP重组蛋白。利用RNaseA(每毫升20微克)处理E.coli的细胞裂解液，以得到不含RNA的NP蛋白，并接续纯化步骤。以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确认纯化的NP蛋白。据此获得的NP蛋白分别具有SEQ ID NO:1(NPA1)、SEQ ID NO:2(NPA2)、SEQ ID NO:3(NPA3)、SEQ ID NO:4(NPA4)、SEQID NO:5(NPA5)以及SEQ ID NO:6(NPB1)的氨基酸序列。
细胞株
将MDCK(Madin-Darby canine kidney,ATCC CCL-34)上皮细胞培养于包含非必需氨基酸(non-essential amino acid,NEAA)、2毫摩尔浓度L-谷氨酰胺及10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的MEM培养基中，置于37℃之5％ CO2的潮湿培养箱中。293-T细胞(ATCC CRL-3216)培养于包含10％ FBS及青霉素-链霉素(100x)的DMEM培养基中。将悬浮的293-F细胞培养于不含血清的293表达培养基中，置于37℃的以110rpm转速摇晃的8％CO2培养箱中。
病毒株
六种于本研究中使用的A型流感病毒，包含(1)H1N1布里斯本(A/Brisbane/59/2007(H1N1/H1B))；(2)H1N1猪(一源自A/California/07/2009(H1N1/H1S)的重组病毒NYMCX-181)；(3)H3N2布里斯本(A/Brisbane/10/2007(H3N2/H3B))；(4)H3N2威斯康辛(A/Wisconsin/67/2005(H3N2/H3W))；(5)H5N1越南(一源自A/VietNam/1194/2004(H5N1/H5V)的重组病毒NIBRG-14)；以及(6)Flu B(B/Brisbane/60/2008(fluB))。利用10天大的胚胎蛋汁尿囊腔来扩增病毒原液，培养60小时后，收集病毒液，以超高速离心(25,000xg，2小时)进行浓缩后，重新悬浮于磷酸缓冲溶液中(phosphate-buffered saline,PBS)。利用MDCK细胞来测定病毒效价及TCID50。简单来说，所述病毒原液以感染缓冲液(包含TPCK处理的胰蛋白酶(每毫升1微克)及0.3％牛血清白蛋白的MEM-NEAA培养液)进行10倍稀释。经稀释的病毒样本与经PBS洗涤的MDCK细胞(于96孔盘，每孔洞1×104细胞)，反应1小时；再以PBS洗涤MDCK细胞2次，以移除病毒悬浮液。将受感染的MDCK细胞置于新鲜的感染缓冲液中培养3天(H1N1 Swine,H3N2 Brisbane and H3N2Wisconsin)或5天(H1N1 Brisbane,H5N1 Vietnamand Flu B)。利用冰甲醇-丙醇(1：1(v/v))固定存活的MDCK细胞，并以0.5％结晶紫进行染色，并计算TCID50。
辨认由噬菌体展示的合成scFv抗体库中筛选的IgG1
根据美国专利公告第10,336,815B2号或美国专利公告第10,336,816B2号以及Ing-Chien Chen等人所发表的公开文献(High throughput discovery of influenzavirus neutralizing antibodies from phage-displayed synthetic antibodylibraries,Scientific Reports 7,Article number:14455(2017))所述的方法来构建以及辨认所述由噬菌体展示的合成scFv抗体库。根据美国专利公告第10,336,815B2号或美国专利公告第10,336,816B2号所述的实验方法来筛选由噬菌体展示的抗体库、筛选可与由噬菌体展示的scFv结合的抗原、以ELISA辨认结合至同源抗原及蛋白A/L的scFv、将scFv重塑为IgG1、表达及纯化IgG1以及利用ELISA确认抗体-抗原交互作用的EC50。
IgG结合至来自受病毒感染的MDCK细胞之NP
将MDCK细胞(每孔洞3×104细胞)种在96孔盘中，培养16小时后，以PBS洗涤2次，接着以100x TCID50的病毒溶液进行感染。将经感染的MDCK细胞培养24小时后，以甲醇-丙酮(1：1(v/v))固定。以2倍连续稀释的抗-流感病毒核蛋白IgG抗体，以及偶连山葵过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗-人类IgG-Fc抗体(1：5000稀释)或偶连HRP的山羊抗-小鼠抗体(1：1000稀释)，来监测病毒核蛋白的表达量。加入3,3'5,5'-四甲基联苯胺(3,3'5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)受质(每孔洞100微升)，反应5分钟，接着以1N HCl(每孔洞100微升)中止反应后，以比色法测量病毒核蛋白的含量。各稀释IgG的浓度重复三次后，测量波长450纳米时的吸光值，并计算EC50。
以三明治ELISA(sandwich ELISA)监测源自裂解的流感病毒的NP
以HRP偶连试剂盒将HRP与监测抗体连接。将200微克纯化的IgG以摩尔比(molarratio)IgG：HRP＝1：2的比例加至HRP混合液中，并依照制造商的操作说明中止反应。以涂覆有经纯化的捕捉IgG(每孔洞1微克)的96孔盘进行三明治ELISA，于4℃反应过夜。利用裂解缓冲溶液(包含PBS、0.1％ Tween-20及0.1％N-月桂酰肌氨酸)裂解流感病毒1小时，使流感病毒的NP释放至溶液中。将自病毒中裂解出的NP于120V下，在12％ NuPAGE Bis-Tris凝胶中分离3小时，以定量所述NP。接着以考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)进行胶体染色。再以软件定量所述NP，并计算出考马斯亮蓝的强度与纯化的重组NP之浓度间的关联性。将源自裂解流感病毒且经定量的NP加至每个涂覆有捕捉抗体的孔洞中，并反应1小时。经洗涤后，于每个孔洞中加入每毫升0.1微克与HRP偶连的监测IgG(每孔洞100微升)。接着在每个孔洞中加入TMB(每孔洞100微升)呈色5分钟，并以1N HCl(每孔洞100微升)中止反应，最后测量波长450纳米时的吸光值，并计算EC50。
制备与胶体金(colloidal gold)偶连的AL2C及IgG
100微升的2M K2CO3(pH 11.5)与10毫升胶体金溶液(pH5-6)混合，以调整pH值(最终pH 9)，接着加入500微升的IgG(每毫升1毫克)或50毫升的AL2C(每毫升3.35毫克)至胶体金溶液中，于室温反应40分钟。加入1毫升的阻断缓冲溶液(10％ BSA溶于20毫摩尔浓度硼酸钠，pH9.3)于室温反应15分钟，接着以15,000g于4℃离心30分钟。去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于10毫升洗涤缓冲溶液(1％BSA溶于20毫摩尔浓度硼酸钠，pH9.3)，再以15,000g于4℃离心30分钟。重复洗涤2次后，将沉淀物重新悬浮于1毫升溶于20毫摩尔浓度硼酸钠的1％ BSA溶液(pH9.3)中，用以制备共轭垫。
组装LFIA条带
以注射输液泵驱动的横向流动分配器，将PBS缓冲溶液中1微克的捕捉抗体、抗原或AL2C，在NP膜上以每公分为间隔形成条带。制备其他具有固定的抗原或捕捉抗体的NC膜、共轭垫与样品垫以及组装LFIA条带的步骤，接依照前述方法。
实施例1在数据库中对NP序列进行谱系分析，筛选出代表性的流感NP作为用于寻找抗-NP抗体的目标抗原
为了研发出可作为亲和试剂，且可辨认源自IVA及IVB的多种病毒株的主要NP的抗体，因此建立一组尽可能广泛地代表自然界中的NP作为目标抗原。利用软件自流感研究数据库(Influenza Research Database)收集26,207种流感病毒的NP序列，且所述序列同一性的阈值为95％(数据未显示)。由算法产生的48种群集中，其中前5种NPA(A型流感病毒NP)的群集涵盖所有NPA序列的91％，以及1种NPB(B型流感病毒NP)的群集涵盖数据库中所有NPB序列(数据未显示)。此结果与先前发表的谱系分析一致，表示NPA序列可以谱系分为少数几个主要的群集。在NCBI蛋白序列数据库中将前几种NPA及NPB的一致性序列群集搜寻代表性NP序列。筛选出6种代表性NP(包含NPA1至NPA5以及NPB1)，并且在包含所述化学合成的相应基因的E.coli中，分别表达所述重组蛋白，接着纯化95％以上的纯度，以进行后续筛选由噬菌体展示的抗体。总结6种NP之间两序列的同一性于表3。
表3特定蛋白或病毒的NP序列之间两序列同一性
Figure BDA0003988411120000291
实施例2一种用以产生一组对各代表性NP具有不同特异性的抗-NP IgG抗体的筛选步骤
建立一组与各代表性流感病毒的NP分别具有特殊结合模式的抗体，以分辨流感病毒的亚型。在本发明内容中使用一种新型的步骤开发，用以筛选适用于三明治ELISA及LFIA的抗体，其具有监测及分辨源自不同IAV病毒株的NP的能力。具体来说，分别利用16种GH合成抗体库进行3循环标准噬菌体展示筛选，开始每个目标NP(也即，NPA1、NPA2、NPA3、NPA4、NPA5或NPB1)的抗体筛选步骤。构建由噬菌体展示的GH合成抗体库、标准噬菌体展示抗体库筛选以及筛选重组抗原的详细技术内容皆已被记载，例如，请参见美国专利号10,336,815B2或美国专利号10,336,816B2描述方法。经过2或3筛选循环后，培养液中包含分泌的多株scFv的噬菌体展示的抗体库，其在ELISA测定中对相应抗原显示阳性反应，被预期含有较大量与相应抗原结合的候选scFv。混合所述由噬菌体展示的scFv抗体库作为另外2循环的噬菌体展示筛选的输入(input)，其中在噬菌体颗粒与目标NP结合的过程中，加入过量固定于固定相目标NP以外的其他重组NP于溶液相中。进行额外2循环的噬菌体展示筛选的目的是为了增加在溶液相中，只会与目标NP结合的scFv的含量。自前述两次筛选循环的输出(output)抗体库中随机选择可溶性单株scFv抗体，以ELISA筛选可与蛋白A、蛋白L及相应目标NP结合的抗体；将与蛋白A、蛋白L及同源NP具有阳性结合讯号的scFv重塑至具有人类IgG1骨架IgG中。以哺乳类表达系统表达所述IgG，并以蛋白A管柱纯化，接着以ELISA及LFIA测试与抗原结合的特异性以及亲和力。
实施例3从噬菌体展示的合成抗体库选择及筛选出分别对不同NP的具有特异性的抗体相关的亲和性试剂
由前述筛选方法获得753种抗-NP的阳性单株scFv抗体(ELISA OD450纳米>0.5，与蛋白A、蛋白L及相应目标NP的结合)。753种单株抗体中每种抗体皆与6种NP分别进行交叉结合测试；热点图(heat map)的数据显示753种scFv与6种NP结合的ELISA的结果(OD450纳米)(数据未显示)。热点图根据scFv(热点图的y-轴)与6种NP(热点图的x-轴)的交叉结合模式的分组呈现。基于scFv-NP结合模式的分组选出25个scFv代表scFv的主要群组。所述scFv的CDR序列及VL与VH序列分别总结于表1及表2。以293-F表达系统将25个scFv重塑至人类IgG1中，并且以蛋白A管柱纯化，接着利用SDS-PAGE进行分析。
实施例4抗-NP IgG1分别以不同特异性及高度亲和力与重组NP结合
以半最大效应浓度EC50定量测量25个抗NP IgG1对6个NP的结合特异性及亲和力，并将市售老鼠单株抗-NP抗体作为阳性对照组与其进行特异性及亲和力的比较。如总结于表4的数据，与相应重组NP具有次纳米摩尔浓度(subnanomolar)EC50的抗体具有最高的结合亲和力，其是经由上述步骤筛选自噬菌体展示的GH合成抗体库中，并且未经过更进一步的亲和力改进步骤。相较于阳性对照组的抗体(MAB8251)对NPA具有广泛的特异性，NP16及NP17展现可比拟阳性对照组抗体的亲和力及广泛特异性(表4)。更重要的是，GH IgG1与单一的NPA1-NPA5及NPB1具有特异的亲和力(例如：NP24-NPB1、NP3-NPA1、NP18-NPA2、NP15-NPA2/NPA4、NP8-NPA3/NPA2以及NP13-NPA4/NPA5(表4))，可基于亲合性试剂分析源自IAV/IBV的未知病毒株中NP。
表4自25个抗NP的IgG1与特定重组蛋白结合的S形结合曲线衍生的EC50(纳摩尔浓度)
NPA1 NPA2 NPA3 NPA4 NPA5 NPB1
NP1 NC
NP2 1.37
NP3 0.09
NP4 0.19 10.11 0.37
NP5 1.69 0.13
NP6
NP7 0.79
NP8 2.14 0.07
NP9 4.38 1.12
NP10 0.36 NC NC 0.28
NP11 0.27 0.06
NP12 9.07
NP13 9.36 0.07 0.09
NP14 0.19 0.08 19.71 1.70
NP15 NC 0.45 0.35
NP16 0.09 0.96 0.18 0.09
NP17 0.08 0.06 0.03 0.17
NP18 0.20
NP19 0.11 NC
NP20 0.04
NP21 0.12 28.63
NP22 0.27
NP23 0.06
NP24 0.05
NP25 0.10
MAB8251 0.12 0.13 0.13 3.68 0.16 NC
ab47876 0.13
NBP2-23514 0.11
MAB8259 0.27
空白：以每毫升10微克的IgG进行ELISA监测，无讯号。
NC：不符合曲线(不收敛，中断)
实施例5以所述组抗-NP IgG1区分病毒感染的MDCK细胞中的IAV亚型的NP
为了测试所述组抗-NP的25个IgG区分来自IAV及IBV的NP的能力，以ELISA测定法监测及区分受5种IAV疫苗株及1种IBV疫苗株感染的MDCK细胞表达的相似的NP。在5种IAV疫苗株中发现2种群组的NP：第1群包含A/Brisbane/59/2007(H1N1/H1B)及A/Brisbane/10/2007(H3N2/H3B)的NP，其具有相同氨基酸序列，且与NPA4仅有1个残基的差异(99.7％同一性；表3)；第2群包含A/Wisconsin/67/2005(H3N2/H3W)、A/California/07/2009(H1N1/H1S)以及A/VietNam/1194/2004(H5N1/H5V)的NP，其氨基酸序列之间具有最多4个残基的差异。第2群的NP与NPA2具有约97％的序列同一性(表3)。IBV疫苗株(B/Brisbane/60/2008(fluB))的NP与NPB1具有1个氨基酸残基的差异(99.7％同一性；表3)。
在被固定的MDCK细胞中检测25个抗-NP的IgG与NP的结合，其中所述MDCK细胞分别以5种IAV及1种IBV疫苗株预感染，结果总结于表5。尽管并不预期由病毒感染的MDCK细胞表达的NP的NP-RNA复合体以及同元聚合物(homo-polymer)会与纯化的重组NP相似，仍将表5与表4的数据进行比较。在受病毒感染的MDCK细胞中，相应NP具有最高亲和力的抗-NP的IgG1和阳性对照组抗体的EC50相当，代表25种抗-NP的IgG1中至少一种子集(subset)可与阳性对照组抗体一样有效地结合至受流感病毒感染的MDCK细胞中的NP(表5)。然而，25种抗-NP的IgG1对受到H1B及H3B感染的MDCK细胞中的NP的特异性无法与其对重组NPA4的特异性相比(表5)，尽管NPA4与H1B及H3B的NP的序列只有1个氨基酸残基的差异(99.7％序列同一性)。具体而言，NP15及NP16一致性地以高亲和力辨认重组NPA4及受H1B及H3B感染的MDCK细胞表达的NP；但NP13及NP17没有展现相似的一致性，其具有辨认重组NPA4的高亲和力，却无法与受H1B及H3B感染的MDCK细胞表达的NP有明显的结合亲和力(表5)。此外，NP3、NP9、NP12、NP14及NP19与NPA4皆无明显的亲和力(表4)，却与受H1B及H3B感染的MDCK细胞表达的NP具有明显的亲和力(表5)。
表5由25种抗-NP的IgG1与受流感病毒感染的MDCK细胞中特定NP结合的S形结合曲线衍生的EC50(纳摩尔浓度)
Figure BDA0003988411120000341
空白：以每毫升10微克的IgG进行ELISA监测，无讯号。
NC：不符合曲线(不收敛，中断)
抗-NP IgG1-NP结合模式可用以区分表达于MDCL细胞中相似的NP(表5)。不仅所述抗-NP IgG1与NP的结合模式可将IAV与IBV的NP区分开来，也可根据IgG1-NP的结合模式区分源自IAV亚型的NP(表5)，据此，可正确地将具有100％序列同一性的A/Brisbane/59/2007(H1N1/H1B)与A/Brisbane/10/2007(H3N2/H3B)的NP以及具有99.7％序列同一性的A/Wisconsin/67/2005(H3N2/H3W)与A/Viet Nam/1194/2004(H5N1/H5V)的NP进行分群(表3)。两个群组间的序列同一性约为93％，其正确地反应出基于抗-NP IgG1与NP的结合模式的NP分群(数据未显示)。然而，基于抗体结合模式的A/California/07/2009(H1N1/H1S)分群与基于序列同一性的分群之间的差异显示出，尝试以抗体-NP结合模式区分相似的NP(约99.3％序列同一性)的限制。
实施例6基于所述组抗-NP IgG1的三明治ELISA可用以监测及区分源自裂解的IAV的NP亚型，其监测极限约为1纳米摩尔浓度
为了更进一步探究抗-NP IgG1对裂解的IAV中的NP的特异性与亲和力，使用选自所述25种抗-NP IgG1中的抗体作为捕捉及监测抗体，以三明治ELISA测量病毒NP的EC50。同样地，并不预期在形成NP-RNA复合体及同元聚合物的部分，来自裂解的IAV的NP会与纯化的重组NP及受IAV感染的MDCK细胞中的NP相似，因此，在三明治ELISA中，用以定量监测裂解的IAV中NP的含量所使用的捕捉-监测的抗体对需凭经验判断。将25种抗-NP的IgG1分别作为捕捉抗体，以偶连HRP的NP16或NP17在三明治ELISA中作为监测抗体，监测源自裂解的IAV的NP。分析结果分别总结于表6(以NP16作为监测抗体)及表7(以NP17作为监测抗体)。表6及表7高度相似的数据证实，NP16及NP17皆可作为用以辨认源自裂解的IAV的NP的监测抗体。NP17及NP16可同时作为捕捉及监测抗体监测NP，是因为可形成NP同元聚合物。以三明治ELISA监测源自裂解的流感病毒的NP的监测极限约为1奈摩尔浓度的病毒NP。此外，基于ELISA结合模式区分的IAV亚型的NP，与所述疫苗株的NP的谱系分析大致相同(数据未显示)。所述这些结果证实，以三明治ELISA及抗体相关的亲和试剂作为捕捉/监测抗体用以监测来自裂解的流感病毒的NP的含量及亚型的可行性。
表6源自以偶连HRP的NP16作为监测抗体，25种抗-NP IgG作为捕捉抗体的三明治ELISA的S型结合曲线的病毒NP的EC50(纳摩尔浓度)
Figure BDA0003988411120000361
Figure BDA0003988411120000371
空白：以每毫升10微克的IgG进行ELISA监测，无讯号。
NC：不符合曲线(不收敛，中断)
表7源自以偶连HRP的NP17作为监测抗体，25种抗-NP IgG作为捕捉抗体的三明治ELISA的S型结合曲线的病毒NP的EC50(纳摩尔浓度)
Figure BDA0003988411120000372
空白：以每毫升10微克的IgG进行ELISA监测，无讯号。
NC：不符合曲线(不收敛，中断)
源自裂解的IAV的NP仅在一定程度上类似于在受病毒感染的MDCK细胞或E.coli中表达的相应的NP。比较表4、表6及表7的结果发现，NP13、NP15、NP16以及NP17一致性地以高亲和力辨认重组NPA4及源自H1B及H3B的病毒NP。然而，NP3、NP4、NP5、NP7、NP10、NP19及NP21与NPA4不具有明显的亲和力(表4)，但于三明治ELISA却可以高度亲和力辨认来自H1B及H3B的病毒NP(表6及表7)。另一方面，NP3、NP15、NP16及NP19可辨认源自裂解的病毒及受病毒感染的MDCK细胞的NP，尽管如此，NP9、NP12及NP14可辨认受H1B-及H3B-感染的MDCK细胞中的NP，但与裂解的IAV中的相应NP不具有明显的亲和力(表4)，于三明治ELISA却以高度亲和力辨认源自H1B及H3B的病毒NP(表6及表7)。尽管，鉴于NP15及NP16可辨认源自三种制备方式的相应NP，所述NP应具有相同的抗原决定位，前述的辨认差异也凸显了因不同表达宿主产生的抗原差异。
实施例7源自GH合成抗体库的抗体可用与发展LFIA装置
为了测试源自噬菌体展示的GH合成抗体库的抗-NP IgG1于LFIA的应用性，利用LFIA监测所述IgG1-NP。每个呈现于第1A图的LFIA都将阳性对照组(AL2C：一种蛋白A及蛋白L的融合蛋白，已知可与由人类变异域IGHV3及IGKV1的基因编码产生的人类IgG1结合)及各NP(NPB1、NPA1及NPA2)点于膜上形成条带。所述共轭垫包含以胶体金标示的AL2C，将包含NP1-25 IgG1及控制组IgG的溶液分别加至样品垫。每个测试条带中的特征讯号(signaturesignal)的强度代表相应的抗体-抗原交互作用的表达，其与抗-NP IgG1及控制组IgG的特异性强度一致(数据未显示)。
为了说明以三明治LFIA监测NP的监测极限及特异性，在硝化纤维膜上设置4个条带以构建LFIA，所述条带分别为：阳性对照组(AL2C)用以结合IgG1；NP17、NP1以及NP16作为捕捉抗体(图1B及1C)，且将标示有胶体金的NP17加至共轭垫作为监测抗体。基于图1A的结果，选择与NPA1-5具有特异性及亲和力的IgG1。将NPA1至NPA5的溶液分别加至样品垫。抗原与标示金的监测抗体于共轭垫结合后，继续移动至测试条带上，与相应的捕捉抗体形成三明治免疫-复合体，并于测试条带上产生紫色比色讯号。NP17及NP16如预期地都以高亲和力对测试的NPA1至NPA5具有广泛的特异性(图1B)，如表6及表7结果所示。如同三明治ELISA的结果(表7)，以NP17作为捕捉及监测抗体可形成NP的同元聚合物，因此可用以监测NPA。值得一提的是，虽然基于ELISA测量的结果仅预期NP1会与NPA1具有几乎无法监测的亲和力(表4)，且基于LFIA检测结果仅预期会与NPA1及NPA2具有极低的亲和力(图1A)，但NPA1与除了NPA2以外的所有NP结合，且与另外2个IgG1具有相当强度的亲和力。
图1C的数据显示以10倍连续稀释的NPA1测试三明治LFIA监测极限的结果。在LFIA中以NP16及NP17监测NPA1的监测极限约为1纳摩尔浓度，其与IgG1在三明治ELISA中监测相似NP的监测极限相当(总结于表6及表7)。尽管基于ELISA的NP1-NPA1交互作用的EC50与NP16-NPA1及NP17-NPA1交互作用的EC50相比约少了4个量级，NP1仍与另外2个IgG1结合以相当的亲和力与NPA1结合(图1B)。综上所述，所述结果显示，虽然抗体-抗原的交互作用可以ELISA及LFIA量化，但ELISA及LFIA中适用的抗体之间不一定相关；因此，需根据LFIA的需求凭经验挑选适用于LFIA的抗体，而非仅基于ELISA定性的结果。
综上所述，本研究内容揭示许多选自GH合成抗体库的抗体(例如，25个抗-NP的抗体)以相应的亲和力及特异性，与6个代表性流感NP(包含5种源自IAV病毒株的NP及1种源自IBC病毒株的NP)结合。许多挑选出来的抗体与相应NP的最佳亲和力的EC50低于1纳摩尔浓度，不需进一步进行亲和力成熟。所述亲和力强度与源自鼠类免疫系统的阳性对照组的老鼠抗体相当。挑选出来的抗体组具有不同的特异性，可用以区分具有超过90％同一性的NP序列。所述源自GH抗体库的GH抗体不需更进一步的亲和力成熟，即可用于三明治ELISA及LFIA中监测源自流感病毒的相应NP，其监测检体中NP的监测极限为1纳摩尔浓度。所述监测极限已接近一般用以监测流感病毒的RIDT可接受的监测极限。本发明内容显示在一般步骤中发展诊断用抗体的可行性，且所述抗体无法从动物相关的抗体技术中获得。
应当理解的是，前述实施方式的描述仅是以实施例的方式给出，且本发明所属技术领域中具有通常知识者可进行各种修改。以上说明书、实施例及实验结果提供本发明的例示性实施方式的结构与用途的完整描述。虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种改动与修饰，因此本发明的保护范围以权利要求保护范围限定为准。
序列表
<110> 台湾地区“中央研究院”
<120> 用以筛选抗体片段的方法、由此制备的重组抗体及其用途
<130> P4108-PCT
<150> US63036143
<151> 2020-06-08
<160> 206
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NPA1
<400> 1
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
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Ile Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
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Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
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65 70 75 80
Glu His Pro Ser Thr Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Lys Arg Val Asp Gly Arg Trp Met Arg Glu Leu Val Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
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Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Ile Gly Thr Met Val Met Glu
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Leu Ile Arg Met Val Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
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Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Leu Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val
340 345 350
Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Ile Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Asp Asn Met Gly Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Gly
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Ala Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Glu Lys Ser Thr Val Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
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Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Ala Glu Ile Ile Arg Met Met
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Glu Gly Ala Lys Pro Glu Glu Val Ser Phe Arg Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe
485
<210> 2
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NPA2
<400> 2
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
20 25 30
Ile Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
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Tyr Lys Arg Val Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
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Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
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Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
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Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Ile Gly Thr Met Val Met Glu
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Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
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Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu
245 250 255
Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
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Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
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Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val
340 345 350
Ile Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Glu Thr Met Gly Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
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Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
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Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe
485
<210> 3
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NPA3
<400> 3
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asp Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
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Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Asp Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu
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Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
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Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
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Tyr Arg Arg Ile Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Val Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Ile Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
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Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Ile Ala Met Glu
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Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
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Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
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Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
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Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
His Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
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Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Val Ser Leu Met Arg Pro Asn Glu
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Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Lys Lys Val
340 345 350
Ile Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
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370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Lys
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Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Val Met Ala Ala Phe Ser Gly Asn
420 425 430
Asn Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Val Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Leu Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
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Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
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Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe
485
<210> 4
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NPA4
<400> 4
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
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Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
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Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
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Leu Asn Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
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Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
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Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
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Tyr Lys Arg Val Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Val Leu Tyr Asp
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Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Ile Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
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Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Leu Glu
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Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
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Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
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Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Val Asp Pro Phe
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
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435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Glu Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Arg Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe
485
<210> 5
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NPA5
<400> 5
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
20 25 30
Val Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
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Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu
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Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
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145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
His Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
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Val Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Glu Thr Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
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Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
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Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
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Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Lys Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Leu Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Asn Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe
485
<210> 6
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NPB1
<400> 6
Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys
1 5 10 15
Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile
20 25 30
Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn
35 40 45
Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Asp Asp Val Gly Arg
50 55 60
Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr
65 70 75 80
Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys
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Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala His
100 105 110
Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu
115 120 125
Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu
130 135 140
Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp
145 150 155 160
Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser
180 185 190
Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys
195 200 205
Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu
210 215 220
Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Ile Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg
245 250 255
Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys
260 265 270
Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys
275 280 285
Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg
290 295 300
Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser
305 310 315 320
Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile
325 330 335
Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr
340 345 350
Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro
355 360 365
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Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu
385 390 395 400
Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys
405 410 415
Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala
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Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser
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Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala
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Phe Phe Phe Gly
545
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP1-CDR-L1
<400> 7
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Asp Asp Val Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP1-CDR-L2
<400> 8
Ser Gly Ala Thr Trp Leu Tyr Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP1-CDR-L3
<400> 9
Gln Gln Tyr Phe Ser Trp Pro Ile Thr
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP1-CDR-H1
<400> 10
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Gly Trp Ile His
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<223> 合成_NP1-CDR-H2
<400> 11
Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP1-CDR-H3
<400> 12
Ala Arg Trp Ser Ser Asp Tyr
1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP2-CDR-L1
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Asp Val Tyr Gly Tyr Val Ala
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<220>
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Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Trp Tyr Val Ala
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP9-CDR-H2
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Gly Ile Gly Pro Tyr Trp Gly Phe Thr Ser Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP9-CDR-H3
<400> 60
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20
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP10-CDR-L1
<400> 61
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Trp Ser Val Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP10-CDR-L2
<400> 62
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP10-CDR-L3
<400> 63
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1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP10-CDR-H1
<400> 64
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Asn Gly Ser Ile His
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<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP10-CDR-H2
<400> 65
Trp Ile Trp Pro Phe Gly Gly Ser Thr Ser Tyr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP10-CDR-H3
<400> 66
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP11-CDR-L1
<400> 67
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Trp Val Ala
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP11-CDR-L2
<400> 68
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP11-CDR-L3
<400> 69
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1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP11-CDR-H1
<400> 70
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP11-CDR-H2
<400> 71
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP11-CDR-H3
<400> 72
Ala Arg Gly Tyr Phe Trp Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP12-CDR-L1
<400> 73
Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Gly Asn Val Ala
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP12-CDR-L2
<400> 74
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP12-CDR-L3
<400> 75
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP12-CDR-H1
<400> 76
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP12-CDR-H2
<400> 77
Ser Ile Trp Pro Ser Trp Gly Ser Thr Tyr Tyr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP12-CDR-H3
<400> 78
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP13-CDR-L1
<400> 79
Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Tyr Trp Val Ala
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP13-CDR-L2
<400> 80
Ser Ser Ala Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP13-CDR-L3
<400> 81
Gln Gln Gly Trp Asp Trp Pro Ile Thr
1 5
<210> 82
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP13-CDR-H1
<400> 82
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asn Tyr Gly Ile His
1 5 10
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP13-CDR-H2
<400> 83
Ser Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP13-CDR-H3
<400> 84
Ala Arg Phe Gly Tyr Phe Asn Trp Leu Asp Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP14-CDR-L1
<400> 85
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP14-CDR-L2
<400> 86
Tyr Gly Pro Arg Gly Leu Tyr Ser
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP14-CDR-L3
<400> 87
Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP14-CDR-H1
<400> 88
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Asn Gly Gly Ile His
1 5 10
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP14-CDR-H2
<400> 89
Ser Ile Trp Pro Ser Trp Gly Ser Thr Ser Tyr
1 5 10
<210> 90
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP14-CDR-H3
<400> 90
Ala Arg Phe Asn Phe Gly Val Phe Gly Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP15-CDR-L1
<400> 91
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Asn Asn Val Ala
1 5 10
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP15-CDR-L2
<400> 92
Ser Tyr Ser Thr Gly Leu Tyr Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP15-CDR-L3
<400> 93
Gln Gln Tyr Trp Asn Tyr Pro Ile Thr
1 5
<210> 94
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP15-CDR-H1
<400> 94
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Trp Tyr Ile His
1 5 10
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP15-CDR-H2
<400> 95
Gly Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 96
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP15-CDR-H3
<400> 96
Ala Arg Phe His Trp Asp His Leu His Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP16-CDR-L1
<400> 97
Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ser Tyr Val Ala
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<210> 98
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP16-CDR-L2
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Ser Trp Thr Thr Gly Leu Tyr Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP16-CDR-L3
<400> 99
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1 5
<210> 100
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP16-CDR-H1
<400> 100
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1 5 10
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP16-CDR-H2
<400> 101
Trp Ile Gly Pro Tyr Trp Gly Phe Thr Ser Tyr
1 5 10
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<211> 13
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP16-CDR-H3
<400> 102
Ala Arg Phe Gly Asn His Trp His Leu Phe Met Asp Tyr
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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Ser Gly Ala Ser Gly Leu Tyr Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP20-CDR-L3
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 129
Gln Gln Tyr Ser Asn Phe Pro Val Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP21-CDR-H1
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Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Tyr Gly Ile His
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP21-CDR-H2
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Gly Ile Trp Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP21-CDR-H3
<400> 132
Ala Arg Phe Tyr Asn Asn His Gly Gly Ile Met Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP22-CDR-L1
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Arg Ala Ser Gln Asp Val Phe Ser Trp Val Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP22-CDR-L2
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Ser Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP22-CDR-L3
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Gln Gln Ser Trp Asp Tyr Pro Ile Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP22-CDR-H3
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Ala Arg Gly Phe Tyr Ser Trp Phe Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP23-CDR-L1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP23-CDR-L2
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Ser Gly Ala Arg Trp Leu Tyr Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP23-CDR-L3
<400> 141
Gln Gln Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP23-CDR-H1
<400> 142
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Tyr Phe Ile His
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP23-CDR-H2
<400> 143
Ser Ile Gly Pro Phe Gly Gly Phe Thr Ser Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP23-CDR-H3
<400> 144
Ala Gly Tyr Gly Phe His Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP24-CDR-L1
<400> 145
Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ser Ser Val Ala
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP24-CDR-L2
<400> 146
Phe Tyr Thr Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP24-CDR-L3
<400> 147
Gln Gln Gly Trp Asp Ser Pro Val Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP24-CDR-H1
<400> 148
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Asp Trp Tyr Ile His
1 5 10
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP24-CDR-H2
<400> 149
Gly Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP24-CDR-H3
<400> 150
Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 151
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP25-CDR-L1
<400> 151
Arg Ala Gly Gln Asp Val Ser Ser Gly Val Ala
1 5 10
<210> 152
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP25-CDR-L2
<400> 152
Ser Trp Thr Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP25-CDR-L3
<400> 153
Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Ile Thr
1 5
<210> 154
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP25-CDR-H1
<400> 154
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Gly Gly Phe Ile His
1 5 10
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP25-CDR-H2
<400> 155
Ser Ile Trp Pro Tyr Trp Gly Phe Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP25-CDR-H3
<400> 156
Ala Arg Gly Ser Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr
1 5 10
<210> 157
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP1-VL
<400> 157
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp
20 25 30
Asp Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Gly Ala Thr Trp Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Ser Trp
85 90 95
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 158
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP1-VH
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Gly
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115
<210> 159
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP2-VL
<400> 159
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Tyr
20 25 30
Gly Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Phe
85 90 95
Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 160
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP2-VH
<400> 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Trp Pro Tyr Trp Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Trp His Gly Asn Leu Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 161
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP3-VL
<400> 161
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly
20 25 30
Trp Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Thr Thr Gly Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr
85 90 95
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 162
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP3-VH
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Trp Pro Phe Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Trp Asn Asp His Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 163
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP4-VL
<400> 163
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly
20 25 30
Trp Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Gly Pro Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Asn Tyr
85 90 95
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 164
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP4-VH
<400> 164
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Ser His Asn Ser Tyr Tyr Ser Tyr Ser His Tyr Gly
100 105 110
Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Ala Ala Ala
130
<210> 165
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP5-VL
<400> 165
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly
20 25 30
Trp Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ser Arg Trp Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asn Gly
85 90 95
Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 166
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP5-VH
<400> 166
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Gly
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Trp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ile Asn Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Ala Ala Ala
115
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP6-VL
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Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Tyr
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35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Asn Trp
85 90 95
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP6-VH
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asp Gly
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Pro Phe Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Phe
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Gly Trp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Ser Tyr Ser Ala Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Gly
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Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP8-VH
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Phe
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Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Trp
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Phe Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asn Gly
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
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Ser Trp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Ser Tyr
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<220>
<223> 合成_NP13-VH
<400> 182
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asn Tyr
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Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP14-VL
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP14-VH
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 185
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP15-VL
<400> 185
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP15-VH
<400> 186
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP16-VL
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<210> 188
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP16-VH
<400> 188
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Asn Ser
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP17-VL
<400> 189
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP17-VH
<400> 190
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP18-VL
<400> 191
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP18-VH
<400> 192
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<220>
<223> 合成_NP19-VL
<400> 193
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Asn Phe
85 90 95
Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 194
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP19-VH
<400> 194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Pro Phe Trp Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Val Asp Asn Tyr Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 195
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP20-VL
<400> 195
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly
20 25 30
Tyr Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Gly Ala Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe
85 90 95
Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 196
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP20-VH
<400> 196
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Phe Gly Phe Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115
<210> 197
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP21-VL
<400> 197
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Tyr
20 25 30
Phe Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ser Arg Trp Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Phe
85 90 95
Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 198
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP21-VH
<400> 198
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Trp Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Asn Asn His Gly Gly Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115 120 125
<210> 199
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP22-VL
<400> 199
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Phe
20 25 30
Ser Trp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asp Tyr
85 90 95
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 200
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP22-VH
<400> 200
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Trp
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Trp Pro Tyr Trp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Tyr Ser Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115 120
<210> 201
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP23-VL
<400> 201
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp
20 25 30
Asp Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Gly Ala Arg Trp Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Phe
85 90 95
Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 202
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP23-VH
<400> 202
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Gly Pro Phe Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Gly Phe His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115
<210> 203
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP24-VL
<400> 203
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly
20 25 30
Ser Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Phe Tyr Thr Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Trp Asp Ser
85 90 95
Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 204
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP24-VH
<400> 204
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Asp Trp
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115 120
<210> 205
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP25-VL
<400> 205
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Asp Val Ser
20 25 30
Ser Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Ser Trp Thr Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr
85 90 95
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 206
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成_NP25-VH
<400> 206
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Gly Gly
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Trp Pro Tyr Trp Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ala
115 120

Claims (10)

1.一种用以筛选对流感病毒具有特异性的抗体片段的方法，包含：
(a)提供一由噬菌体展示的单链可变片段(single-chain variable fragment,scFv)抗体库，其包含复数个由噬菌体展示的scFv，其中每个由噬菌体展示的scFv的重链可变区(heavy chain variabledomain,VH domain)对蛋白A具有结合亲和力，以及每个由噬菌体展示的scFv的轻链可变区(light chain variabledomain,VL domain)对蛋白质L具有结合亲和力；
(b)将步骤(a)的所述由噬菌体展示的scFv抗体库曝露于一目标核蛋白中，所述目标核蛋白包含一选自由SEQ ID NO:1-6所组成的组中的氨基酸序列；
(c)自步骤(b)的所述由噬菌体展示之scFv抗体库筛选出一第一复数个噬菌体，其分别表达与所述目标核蛋白具有结合亲和力的scFv；
(d)在具有至少一扰乱核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情况下，将步骤(c)挑选的所述第一复数个噬菌体曝露于所述目标核蛋白中，其中所述扰乱核蛋白包含一选自由SEQ ID NO:1-6所组成的组中的氨基酸序列，且所述扰乱核蛋白的氨基酸序列与所述目标核蛋白的氨基酸序列不同；
(e)自步骤(d)的所述第一复数个噬菌体挑选一第二复数个噬菌体，其中在扰乱核蛋白存在的情况下，所述第二复数个噬菌体分别表达与所述目标蛋白具有结合亲和力的scFv；
(f)使步骤(e)挑选的所述第二复数个噬菌体分别表达复数个可溶性scFv；
(g)将步骤(f)的所述复数个可溶性scFv曝露于所述目标核蛋白中；
(h)确认步骤(g)中所述复数个可溶性scFv与所述目标蛋白单独的结合亲和力；以及
(i)基于步骤(h)的结果，挑选一可溶性scFv作为抗体片段，其中相较于所述复数个可溶性scFv中其他的可溶性scFv，所述作为抗体片段的可溶性scFv与所述目标蛋白具有较优异的亲和性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述流感病毒为A型或B型流感病毒。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述A型流感病毒为H1N1、H3N2或H5N1。
4.一种重组抗体或片段，包含一VL结构域以及一VH结构域，其中所述VL结构域包含一第一轻链互补决定区(complementarity determining region,CDR-L1)、一第二轻链CDR(CDR-L2)及一第三轻链CDR(CDR-L3)，且所述VH结构域包含一第一重链CDR(CDR-H1)、一第二重链CDR(CDR-H2)及一第三重链CDR(CDR-H3)，其中
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:7-12的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:13-18的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:19-24的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:25-30的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:31-36的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:37-42的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:43-48的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:49-54的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:55-60的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:61-66的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:67-72的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:73-78的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:79-84的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:85-90的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:91-96的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:97-102的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:103-108的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:109-114的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:115-120的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:121-126的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:127-132的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:133-138的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:139-144的氨基酸序列；
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:145-150的氨基酸序列；或是
所述CDR-L1、所述CDR-L2、所述CDR-L3、所述CDR-H1、所述CDR-H2以及所述CDR-H3分别包含SEQ ID NO:151-156的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的重组抗体，其中
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:157及158具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:159及160具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:161及162具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:163及164具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:165及166具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:167及168具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:169及170具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:171及172具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:173及174具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:175及176具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:177及178具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:179及180具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:181及182具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:183及184具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:185及186具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:187及188具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:189及190具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:191及192具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:193及194具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:195及196具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:197及198具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:199及200具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:201及202具有至少85％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:203及204具有至少85％同一性的氨基酸序列；或
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:205及206具有至少85％同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的重组抗体，其中
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:157及158具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:159及160具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:161及162具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:163及164具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:165及166具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:167及168具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:169及170具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:171及172具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:173及174具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:175及176具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:177及178具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:179及180具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:181及182具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:183及184具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:185及186具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:187及188具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:189及190具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:191及192具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:193及194具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:195及196具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:197及198具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:199及200具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:201及202具有100％同一性的氨基酸序列；
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:203及204具有100％同一性的氨基酸序列；或
所述VL结构域及所述VH结构域分别包含与SEQ ID NO:205及206具有100％同一性的氨基酸序列。
7.一种由一个体分离的生物样本来诊断所述个体是否受到一流感病毒感染的方法，包含利用如权利要求4所述的重组抗体监测所述生物样本中是否存在所述流感病毒的核蛋白，其中所述生物样本存在所述核蛋白表示所述个体受到所述流感病毒的感染。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述流感病毒为A型或B型流感病毒。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述A型流感病毒为H1N1、H3N2或H5N1。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述个体为人类。
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