TWI700294B - 由噬菌體呈現之抗體庫及其用途 - Google Patents
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Abstract
本揭示內容是關於由噬菌體呈現之單鏈變異片段抗體庫，其係包含複數個單鏈變異片段，其中各單鏈變異片段之各CDR分別具有特定胺基酸序列。利用本發明單鏈變異片段抗體庫可有效製備對流感病毒之H1血球凝集素具有高度結合親和力的各式不同抗體。據此，本揭示內容可依據實驗研究及/或臨床應用的需求，即時製備對抗原具有專一性的不同抗體。
Description
本揭示內容是關於抗體庫的領域。更具體來說，本揭示內容是關於由噬菌體呈現之單鏈變異片段(single chain variable fragment,scFv)抗體庫，其係包含複數個對H1N1流感血球凝集素之抗原決定位具有結合親和力及專一性的scFv。
多數對流感病毒血球凝集素(hemagglutinin,HA)莖柄部(stem)具有專一性且具有中和流感病毒感染力之抗體會藉由其重鏈變異(VH)區域結合至HA，其中該VH區域是源自人類IGHV1-69胚原基因(germline gene)，且伴隨些許體細胞突變(somatic mutations)。以目前已知結合HA莖柄部的中和抗體為例，HA能活化由具有IGHV1-69胚原VH胺基酸序列編碼產生之以IgM形式存在的B細胞受器，除了互補決定區域H3(complementarity determining region H1,CDR-H3)之外，只需要位
於CDR-H1的2處突變及位於框架區域3(framework region 3，位於CDR-H2與CDR-H3之間，FR3)的5處突變，即可促使前驅IgG親和力成熟(affinity maturation)，據以重建一完全成熟之廣泛中和性抗體(broadly neutralizing antibody,bnAb)的活性。由半合成噬菌體呈現抗體庫篩選的bnAb會顯著地偏向胚原IGHV1-69胺基酸序列，顯示除了位於CDR-H2之二個主要由胚原編碼的胺基酸殘基(Ile53及Phe54；本發明是使用Kabat編碼來標示抗體胺基酸殘基位置)及位於CDR-H3之Tyr98外，一位於CDR-H2之Ile52Ser突變及另一位於CDR-H1之突變可回復由胚原IGHV1-69胺基酸序列編碼之非活化前驅IgG異亞型的中和活性，意即IGHV1-69-bnAb可有效地由IGHV1-69編碼之B細胞受器進行活化。近期對源自同一捐贈者之不同抗莖柄部IGHV1-69-bnAb之形成路徑分析證實，Phe54及Tyr98於多數IGHV1-69-bnAb之初始生成階段，扮演著關鍵的角色。然而最令人訝異的是，在由IGHV1-69編碼之前驅IgG中，僅2~3組位於CDR-H1及CDR-H2的突變(Ser30Arg-Pro52Ala或Thr28Pro-Ser30Ile-Ile53Val)即可產生異亞型中和活性，且其他特定胺基酸的突變可取代Phe54及Tyr98芳香族側鏈的關鍵角色，該結果暗示這些不同IGHV1-69-bnAb的親和力成熟路徑具有重複性。由這些結果可推知，抗體基因的達爾文演化會促使與人類流感
病毒共存的含有IGHV1-69胚原基因的抗體達到最佳化。
IGHV1-69-bnAb與HA的複合結構顯示其具有一高度保守性之抗體-抗原交互作用面。抗體VH區域會透過CDR-H2中由胚原編碼的Phe54以及鄰近CDR-H3中Tyr98的作用結合至HA莖柄部的高度保守性區塊(patch)；CDR-H1則會透過不同的構形與HA的莖柄部作用；在複合結構中，抗體VL區域與HA間的接觸不顯著。與SC1918/H1 HA或Viet04/H5 HA形成複合結構的CR6261抗體，會與HA之抗原決定位(epitope)的二個區塊交互作用：位於膜遠端的區塊是由HA2(HA在蛋白質熟成過程中會被酵素切開形成兩個以雙硫鍵鏈接的次蛋白，分別稱為HA1及HA2)的A螺旋C端的疏水性側鏈，以及HA1之N及C端鄰近的疏水性側鏈所組成，該區塊會與抗體CDR-H1之Pro28及Phe29，以及FR3之Phe74交互作用；位於膜近端的區塊則是由HA2具有高度保守性之Gly20、Trp21、Tyr22及Ile/Val45，以及HA1中具有次等程度保守性之His18及His38(於第I群HA中具有高保守性)所組成，該區塊會與由IGHV1-69胚原胺基酸序列之位於CDR-H2的Ile53及Phe54，以及CDR-H3之Tyr98作用；其中HA胺基酸殘基編號標示是基於蛋白質結構資料庫編號3GBN的複合結構中的HA胺基酸殘基編號。CDR-H1具有一非規範內的(non-canonical)環狀結構，使Phe29的側鏈不管是否與抗原結合其構形
皆相同。該些交互作用使CR6261(一種第I群A型流感病毒的bnAb)能藉由抑制病毒外套膜與宿主細胞膜的融合來中和病毒感染。在另一複合結構中，CR9114(一種A型與B型流感病毒的IGHV1-69-bnAb)會利用與CR6261幾乎相同的作用方式，以CDR-H2的環狀結構及CDR-H3之Tyr98來辨識HA抗原決定位的膜近端區塊。但CR9114主要是以FR3之Phe74與抗原決定位的膜遠端疏水性區塊形成交互作用，而不是以類似CR6261之非極性側鏈構形，亦即傳統第I型CDR-H1規範結構與抗原決定位的膜遠端疏水性區塊形成交互作用。F10(另一種第I群A型流染病毒的IGHV1-69-bnAb)亦以相似的CDR-H1~3環狀構形辨識共通的IGHV1-69-bnAb抗原決定位，亦即F10與HA高度保守之膜近端抗原決定位區塊是以與CR6261相似的抗原結合位(paratope)構形進行辨識，不過F10以具有第I型規範結構的CDR-H1環狀構形與膜遠端抗原決定位區塊交互作用時，胚原編碼Phe29並沒有參予抗原結合，同時，以Ser之小親水性側鏈取代位於FR3之Phe74的芳香族側鏈進行交互作用。與在三種IGHV1-69-bnAb中，由IGHV1-69胚原編碼之Phe54與具高度保守性之HA2之Trp21及HA1之His18及His38之間的芳香基團作用不同，膜遠端疏水性抗原決定位區塊和bnAb CDR-H1/FR3之間的作用會隨著複合結構、CDR-H1胺基酸序列及局部構形的不同而有所差異。在HA及F10或CR6261的複合結構中，
已知膜遠端及膜近端的抗原決定位/抗原結合位置；表1比對了28,627條源自所有宿主之A型流感病毒的HA及其亞型胺基酸序列中，位於膜遠端抗原決定位及膜近端抗原決定位的胺基酸殘基。
由HA與IGHV1-69-bnAb形成複合結構而可精確到原子等級的交互作用以及疫苗注射vaccination)或感染過程中bnAb的熟成路徑來設計主動免疫療法，藉以產生可對抗流感病毒感染的bnAb，而其他基於抗體療法及載體免疫預防(vectored immunoprophylaxis)的免疫治療策略則需要知道bnAb的胺基酸序列，藉以進行抗體胺基酸序列的最佳化。雖然如定義所述，bnAb可跨亞型辨識流感病毒的HA，基於不同亞型HA間具有不同的胺基酸序列及局部構形，因此單一bnAb胺基酸序列可對不同亞型病毒株之HA都具有相似的結合能力亦即對不同亞型流感病毒株都具有相似的中和能力是不可以預期的。更合理的預期應該是基於bnAb-HA辨識原則進行抗體庫的製備，以特定病毒株HA為對象得到相對應病毒株的最佳化中和性抗體。藉由抗體重鏈CDR結合至位於HA頭部之受器結合區(receptor-binding pocket)或是藉由抗體重鏈CDR結合至前述HA莖柄部可以了解bnAb-HA的辨識原則。雖然前述兩個抗原決定位都可以找到bnAb，但H1亞型是流感病毒傳染的重要亞型，而且由表1分析結果顯示H1亞型HA莖柄部抗原決定位保守性很高，因此本發明只針對H1亞型HA。因此，可以合理預期的是本發明的
抗體庫可應用於部分的H1亞型流感病毒。
為探討對莖柄部具有專一性之抗體與HA的辨識原則，本發明首先利用一噬菌體呈現合成抗體庫，針對BS/07 H1 HA來最佳化bnAb的CDR-H2胺基酸序列，藉以了解CDR-H2環狀結構與位於HA莖柄部之膜近端抗原決定位的高度保守性胺基酸區域之間的最佳化交互作用。再依序利用已固定最佳化CDR-H2胺基酸殘基的噬菌體呈現抗體庫設計來了解CDR-H1及CDR-H3環狀結構的最佳化胺基酸序列。該結果顯示，源自IGHV1-69胚原序列的IGHV1-69-bnAb已具備幾近最佳化之CDR-H2胺基酸序列，特別是F10的CDR-H2胺基酸序列。在最佳化的CDR-H3胺基酸序列中，CDR-H3之Tyr98為高保守性胺基酸，可增加CDR-H2辨識抗原決定位。然而，對CDR-H1而言，或許基於其環狀構形的靭性(flexibility)，因此無法定義出CDR-H1的必要性胺基酸序列，可能與CDR-H1所對應位於HA莖柄部之較不具保守性的膜遠端抗原決定位有關。整體而言，IGHV1-69-bnAb主要利用已大致上最佳化之CDR-H2來辨識位於HA莖柄部之高度保守性抗原決定位區塊，而位於CDR-H1的體細胞後天突變則可對應於不同HA病毒株的胺基酸序列變異。
本研究利用前述發現設計一新抗體庫(命名為F10-CDRH123)，旨在製備能標的所有H1流感病毒株之HA的相對應莖柄部抗原決定位的特定中和性抗體。為檢測抗體庫設計，本研究利用另一種H1 HA：
CA/09 H1 HA篩選由噬菌體呈現之F10-CDRH123抗體庫，可得到超過1,000種scFv抗體，所有scFv皆能結合至共通的IGHV1-69-bnAb抗原決定位，且對CA/09及BS/07 H1N1流感病毒的最大中和效力約為F10的3~7倍(IC50)。據此推測由噬菌體呈現之F10-CDRH123抗體庫可製備對其它H1流感病毒HA之莖柄部抗原決定位具有專一性的對應中和抗體。
基於H1N1流感病毒感染持續對人類造成重大威脅，相關領域亟需一種新穎之用以製備抗體的方法，據以廣泛地抑制不同H1N1流感病毒株的感染。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的第一態樣是關於一種由噬菌體呈現之單鏈變異片段(single-chain variable fragment,scFv)抗體庫，其包含複數個由一噬菌體所呈現且對一蛋白抗原具有結合親和力及專一性的scFv。
依據本揭示內容一實施方式，該scFv抗體庫包含複數個scFv，其中各scFv包含至少一選自以下組合的多肽：一第一互補決定區域(complementarity
determining region,CDR)，其係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得，一第二CDR，其係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得，以及一第三CDR，其係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
依據本揭示內容另一實施方式，該scFv抗體庫包含複數個scFv，其中各scFv包含：一第一重鏈互補決定區域(first complementarity determining region of the heavy chain,CDR-H1)，其係由一包含序列編號：4之核苷酸序列的第一多核苷酸編碼而得，一第二重鏈互補決定區域(second complementarity determining region of the heavy chain,CDR-H2)，其係由一包含序列編號：5之核苷酸序列的第二多核苷酸編碼而得，以及一第三重鏈互補決定區域(third complementarity determining region of the heavy chain,CDR-H3)，其係由一包含序列編號：6之核苷酸序列的第三多核苷酸編碼而得。
依據本揭示內容某些實施方式，該噬菌體是M13噬菌體或T7噬菌體；較佳地，該噬菌體是M13噬菌體。在其他實施方式中，該蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素。
本揭示內容的第二態樣是關於一種由上述
scFv抗體庫篩選一scFv的方法。依據本揭示內容之實施方式，該方法包含以下步驟：(a)使本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫與蛋白抗原進行反應，其中該由噬菌體呈現之scFv抗體庫包含複數個由噬菌體呈現之scFv；(b)對步驟(a)之產物投予一酸處理，藉以製備複數個由噬菌體呈現之scFv，其於酸處理前能分別與該蛋白抗原結合；(c)對步驟(b)製備之複數個由噬菌體呈現之scFv投予一鹼處理；以及(d)至少重複一輪步驟(b)及(c)，每次使用前一輪步驟(c)之產物作為噬菌體抗體庫，將其與該蛋白抗原進行反應，直到得到對該蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之由噬菌體表現的scFv。
依據本揭示內容實施方式，該蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素。
本揭示內容的第三態樣是關於一種由本發明scFv抗體庫篩選之由噬菌體呈現的scFv。
在某些實施方式中，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含至少一選自以下組合的多肽：一第一CDR，其係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得，一第二CDR，其係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得，以及
一第三CDR，其係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
在其他實施方式中，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含：CDR-H1，其係由一包含序列編號：4之核苷酸序列的第一多核苷酸編碼而得，CDR-H2，其係由一包含序列編號：5之核苷酸序列的第二多核苷酸編碼而得，以及CDR-H3，其係由一包含序列編號：6之核苷酸序列的第三多核苷酸編碼而得。
本揭示內容的第四態樣是關於一種由本發明噬菌體呈現之scFv抗體庫製備一重組抗體的方法。該方法包含：(1)使本發明之由噬菌體呈現之scFv抗體庫與蛋白抗原進行反應，其中該由噬菌體呈現之scFv抗體庫包含複數個由噬菌體呈現之scFv；(2)篩選會表現對該蛋白抗原具有結合親和力及專一性之scFv的噬菌體；(3)將步驟(2)篩選之由噬菌體呈現的scFv表現為可溶形式；(4)由步驟(3)篩選對該蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之可溶性scFv；(5)萃取一噬質體DNA，其係對應於步驟(4)所篩選之可溶性scFv；
(6)以步驟(5)之噬質體DNA作為模板，利用PCR分別擴增一用以編碼一第一多肽的第一核酸序列，其中該第一多肽包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及一用以編碼一第二多肽的第二核酸序列，其中該第二多肽包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(7)分別將該第一及第二核酸序列插入一包含一第三及一第四核酸序列的表現載體，其中該第三核酸序列是用以編碼一包含一免疫球蛋白之重鏈恒定區域的第三多肽，且該第四核酸序列是用以編碼一包含該免疫球蛋白之輕鏈恒定區域的第四多肽；以及(8)將步驟(7)之包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至一宿主細胞中，以製備對該抗原蛋白具有專一性的重組抗體。
依據本揭示內容一實施方式，該第一核酸序列是位於該第三核酸序列的上游，且該第二核酸序列是位於該第四核酸序列的上游。依據本揭示內容另一實施方式，該免疫球蛋白是選自由免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白D(immunoglobulin D,IgD)、免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)及免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)所組成的群組。依據本揭示內容另一實施方式，該宿主細胞是一哺乳動物細胞。在一特定實施例中，該蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素。
本揭示內容的第五態樣是關於一種用以治
療或預防一個體體內流感病毒感染的方法。
依據本揭示內容某些實施方式，該方法包含對該個體投予一有效量之重組抗體，其中該重組抗體包含至少一選自以下組合的多肽：一第一CDR，其係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得，一第二CDR，其係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得，以及一第三CDR，其係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
依據本揭示內容其他實施方式，該方法包含對該個體投予一有效量之重組抗體，其中該重組抗體包含：CDR-H1，其係由一包含序列編號：4之核苷酸序列的第一多核苷酸編碼而得，CDR-H2，其係由一包含序列編號：5之核苷酸序列的第二多核苷酸編碼而得，以及CDR-H3，其係由一包含序列編號：6之核苷酸序列的第三多核苷酸編碼而得。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：圖1A及1B 選自F10-CDRH2噬菌體呈現抗體庫之具有結合親和力及中和效力比值之scFv變異株的胺基酸序列組合標誌(sequence LOGO)。圖1A所示是以0.3作為BS/07 H1 HA標準化結合親和力的閾值，挑選出95條CDR-H2胺基酸序列，並以簡併密碼子(degenerate codon)NNK為背景概率(background probability)計算所得的胺基酸序列組合標誌，其中左圖表示y軸為0到7位元(bit)之胺基酸序列組合標誌，而右圖則為左圖的放大圖，用以表示介於0到0.5位元的胺基酸序列組合標誌。圖1B所示是以0.3之作為BS/07 H1 HA之標準化中和效力比值的閾值，挑選出41條CDR-H2胺基酸序列，並以簡併密碼子NNK為背景概率計算所得的胺基酸序列組合標誌，其中左圖表示y軸為0到7位元之胺基酸序列組合標誌，而右圖則為左圖的放大圖，用以表示介於0到0.5位元的胺基酸序列組合標誌。表2總結了代表性變異株的數據。
圖2A及2B 選自F10-CDRH1噬菌體呈現抗體庫之具有結合親和力(圖2A)及中和效力比值(圖2B)之scFv變異株的胺基酸序列組合標誌。分別挑選62條(圖2A)或37條(圖2B)CDR-H1胺基酸序列以簡併密碼子NNK為背景概率計算得到各自的胺基酸序列組合標誌。如圖1A及1B所述，其中左圖表示y軸為0到7位元之
胺基酸序列組合標誌，而右圖則為左圖的放大圖，用以表示介於0到0.5位元的胺基酸序列組合標誌。表4總結了代表性變異株的數據。
圖3A及3B 選自F10-CDRH3噬菌體呈現抗體庫之具有結合親和力(圖3A)及中和效力比值(圖3B)之scFv變異株的胺基酸序列組合標誌。分別挑選140條(圖3A)或77條(圖3B)CDR-H2胺基酸序列以簡併密碼子NNK為背景概率計算得到各自的胺基酸序列組合標誌。如圖1A及1B所述，其中左圖表示y軸為0到7位元之胺基酸序列組合標誌，而右圖則為左圖的放大圖，用以表示介於0到0.5位元的胺基酸序列組合標誌。表5總結了代表性變異株的數據。
圖4A及4B 選自F10-CDRH1~3噬菌體呈現抗體庫之scFv變異株之結合親和力與中和效力比值的相關性。圖4A所示是由圖1A、2A及3A分別隨機挑選6、10及14個scFv變異株，以其對CA/09 H1 HA(y軸)及BS/07 H1 HA(x軸)分別測量所得的標準化結合親和力相關性分析。圖4B所示為前述scFv變異株的標準化中和效力比值與其標準化結合親和力的相關性分析。在圖4A及4B中，各數據測量點至少重覆三次以計算誤差範圍(error bar)。相關性計算是以微軟Excel試算表軟體以Student’s t試驗計算得到皮爾生相關係數(Pearson’s correlation coefficient,r)及其p值(p-value,p)。
圖5A及5B 選自F10-CDRH123噬菌體呈現抗
體庫之具有結合親和力(圖5A)及中和效力比值(圖5B)之scFv變異株的胺基酸序列組合標誌。圖5A顯示由976條標準化結合親和力大於0.3之CDR-H123胺基酸序列以簡併密碼子NNK為背景概率計算得到的胺基酸序列組合標誌，其中左圖表示y軸為0到7位元之胺基酸序列組合標誌，而右圖則為左圖的放大圖，用以表示介於0到0.5位元的胺基酸序列組合標誌。圖5B顯示由750條標準化中和效力大於0.3之CDR-H123胺基酸序列以簡併密碼子NNK為背景概率計算得到的胺基酸序列組合標誌，其中左圖表示y軸為0到7位元之胺基酸序列組合標誌，而右圖則為左圖的放大圖，用以表示介於0到0.5位元的胺基酸序列組合標誌。表7總結了代表性變異株的數據。
圖6設計及建構合成抗體庫。以F10為基底模板(核苷酸序列編號：7；胺基酸序列編號：65)，F10 scFv之VH區域胺基酸殘基位置以Kabat編號表示，其中FR1、FR2、FR3及FR4分別定義為F10 scFv之VH區域的框架區1(framework region 1)、框架區2(framework region 2)、框架區3(framework region 3)及框架區4(framework region 4)；而CDRH1、CDRH2及CDRH3則分別定義為F10 scFv之VH區域的互補決定區H1(complementarity determining region H1)、互補決定區H2(complementarity determining region H2)及互補決定區H3(complementarity determining
region H3)。用以建構各抗體庫之核苷酸引子標示於VH胺基酸序列的下方：在建構F10-CDRH1抗體庫時，先利用模板_1引子(序列編號：8)以基底模板建構CDRH1具有轉譯中止密碼子(TAA)的模板，再利用引子F10-CDRH1_1(序列編號：9)使含有轉譯中止密碼子的CDRH1模板產生多樣性；在建構F10-CDRH2抗體庫時，是利用模板_2引子(序列編號：10)以基底模板建構CDRH2具有轉譯中止密碼子的模板，再利用引子F10-CDRH2_1(序列編號：11)使含有轉譯中止密碼子的CDRH2模板產生多樣性；在建構F10-CDRH3抗體庫時，是利用模板_3引子(序列編號：12)以基底模板建構CDRH3具有轉譯中止密碼子的模板，再利用引子F10-CDRH3_1(序列編號：13)使含有轉譯中止密碼子的CDRH3模板產生多樣性；在建構F10-CDRH123抗體庫時，是同時利用模板_1~3引子(序列編號：8、10及12)以基底模板建構CDRH1、CDRH2、CDRH3皆具有轉譯中止密碼子的模板，再利用引子F10-CDRH123_1~3(序列編號：14-16)使CDRH1、CDRH2、CDRH3皆具有轉譯中止密碼子的模板產生多樣性。以底線標示與基底模板不同的核苷酸序列，其中TAATAAGAATTC(序列編號：73)是(中止密碼子)-(中止密碼子)-(EcoR I限制酶辨識切點的核苷酸序列)，且NNK為20種胺基酸中的任一種。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學
與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
在本揭示內容中，「抗原」(antigen或Ag)一詞是指一能誘發免疫反應的分子。該免疫反應可包含產生抗體、活化特定免疫勝任細胞(immunologically-competent cell)或二者。本所屬領域習知技藝人士當可了解任何大分子(包含蛋白或胜肽)皆可作為抗原。此外，抗原可源自重組或基因體DNA。本所屬領域習知技藝人士當可了解任何DNA皆可編碼本揭示內容所述之「抗原」(antigen)，其中該DNA包含用以編碼一蛋白的核酸序列或部分核酸序列，且該蛋白能誘發免疫反應。此外，本所屬領域習知技藝人士當可了解抗原不必然是由單一基因之全長核酸序列編碼所產生，而是能由一個以上基因的部分核酸序列(該些核酸序列可以不同組合排列以產生特定免疫反應)編碼而得。此外，本所屬領域習知技藝人士當可了解抗原不必然是由一「基因」(gene)編碼而得；而是能藉由合成或生物檢體來製得抗原。該生物檢體包含，但不限於組織檢體、腫瘤檢體、細胞或生物體液。
在本揭示內容中，「抗體」(antibody)一詞是以最廣泛的定義來解釋，且可涵蓋具有特定生物活性的單株抗體(包含全長單株抗體)、多株抗體、多效抗體(例如雙效抗體)及抗體片段。「抗體片段」(Antibody
fragment)包含一部分的全長抗體，一般來說為全長抗體的抗原結合或變異區域。例示性的抗體片段包含Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙抗體(diabodies)；線性抗體(linear antibodies)；單鏈變異片段(single-chain variable fragment,scFv)；單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule)；以及由多個抗體片段製得的多效抗體。
「抗體庫」(antibody library)是指一群抗體及/或抗體片段，其表現可用以篩選及/或組成完整的抗體。可將抗體及/或抗體片段表現於核醣體(ribosome)、噬菌體或細胞表面(特別是酵母菌細胞表面)。
在本揭示內容中，「單鏈變異片段」(single-chain variable fragment或scFv)是指一包含一免疫球蛋白重鏈變異區域(VH)及輕鏈變異區域(VL)的融合蛋白，其中該VH及VL是共價連結以形成一VH：：VL異二聚體。VH及VL可直接連接或由可用以編碼胜肽之連結子連接，其中該連結子是連接VH的N端及VL的C端，或是連接VH的C端及VL的N端。連結子通常包含多個具靭性的甘胺酸(glycine)，以及具高水溶性的絲胺酸(serine)或蘇胺酸(threonine)。即使移除恒定區域並導入鏈結寡胜肽，scFv蛋白仍保留原免疫球蛋白的專一性。可由包含用以編碼VH及VL之序列的核酸來表現單鏈Fv多肽抗體。
在本揭示內容中，「互補決定區域」
(complementarity determining region,CDR)是指一抗體分子的高變異區域，其可形成一與結合抗原之三維表面相互互補的表面。由N端到C端，各抗體的重鏈及輕鏈分別包含三個CDR(CDR 1、CDR 2及CDR3)。因此，一HLA-DR抗原結合位置共包含6個CDR，其係包含三個位於重鏈變異區域的CDR及三個位於輕鏈變異區域的CDR。CDR的胺基酸殘基會與結合抗原緊密接觸，其中與抗原最緊密接觸的位置通常與重鏈CDR3相關。
在本揭示內容中，是利用Kabat系統(一種為習知技藝人士所熟知且廣泛使用的系統)來識別本發明的框架區域及CDR(可參見Sequences of Proteins of Immunological Interest,E.Kabat et al.,U.S.Department of Health and Human Services,5th edition(1991))。識別Kabat框架為習知技藝人士所熟知且慣用的流程。Kabat等人排列比對各亞型(subclass)抗體的多條胺基酸序列，及該亞型中各胺基酸殘基位置最常出現之胺基酸。Kabat等人利用一種方法對抗體胺基酸序列中的每個胺基酸進行編號，而該方法已成為本所屬領域編號抗體胺基酸殘基時所採用的標準流程。藉由與Kabat等人所列之抗體共通性胺基酸序列進行比對，即可將Kabat等人對抗體胺基酸殘基編號的方法延伸應用至其他抗體。利用Kabat等人的編號系統可識別不同抗體中的等效位置(equivalent position)胺基酸。舉例來說，位於人類抗體L50位置的胺基酸與
小鼠抗體L50位置的胺基酸具有等效位置。
在本揭示內容中，「半效應濃度」(EC50)是指一抗體或其抗原結合部位能於活體外或活體內試驗中引發50%最大反應的濃度，即介於最大反應及基礎量的中間值。
在本揭示內容中，「半最大抑制濃度」(IC50)是指一抑制劑(例如一抗體或抗體片段)能於試驗中抑制一半反應(即將反應抑制至介於最大反應及基礎量的中間量)的濃度。半最大抑制濃度表示能減少50%反應的抗體濃度。
在本揭示內容中，「結合速率常數」(association rate constant,kon)是指一數值，用以表示抗體與其標的抗原間的結合強度(程度)，通常是以抗原-抗體反應的動力學來測定該數值。「解離速率常數」(dissociation rate constant,koff)在本說明書是指一數值，用以表示抗體與其標的抗原間的解離強度，通常是以抗原-抗體反應的動力學來測定該數值。將「解離速率常數」(dissociation rate constant,koff)除以「結合速率常數」(association rate constant,kon)即可得到「離解常數」(dissociation constant,Kd)。該些常數可作為表示抗體對其抗原之親和力及中和該抗原之活性的指標。
「噬質體」(phagemid)一詞在本說明書是指一結合細菌噬菌體及質體特性的載體。細菌噬菌體是指任何一種可感染細菌的病毒。
「核酸序列」(nucleic acid sequence)、「多核苷酸」(polynucleotide)或「核酸」(nucleic acid)在本說明書中可交替使用，可指一雙股去氧核糖核酸(deoxyribonuclic acid,DNA)、一單股DNA或所述DNA之轉錄產物(例如核糖核酸分子，ribonucleic acid，RNA)。需知本揭示內容無關乎自然界或自然狀態下的基因多核苷酸序列。能用以分離或純化(或部份純化)本發明之核酸、多核苷酸或核苷酸序列的方法包含，但不限於離子交換色層分析(ion-exchange chromatography)、分子篩選色層分析(molecular size exclusion chromatography)或是可用於基因工程技術諸如擴增(amplification)、扣除雜交法(subtractive hybridization)、選殖(cloning)、次選殖(sub-cloning)、化學合成(chemical synthesis)或其組合等基因工程技術。
本發明亦包含所有簡併核苷酸序列(degenerate nucleotide sequence)，其係用以編碼於生物體中具有特定活性或功能的胜肽/多肽/蛋白(例如本發明的CDR)。「簡併核苷酸序列」(degenerate nucleotide sequence)是指包含一或多個簡併密碼子(degenerate codon；與可編碼一多肽之參考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。簡併密碼子可包含不同的核苷酸三聯體(triplet)，卻是用以編碼相同的胺基酸殘基(例如GAU及GAC等核苷酸三聯體皆係用以編碼天門冬胺酸(aspartic acid,Asp))。
「編碼序列」(coding sequence)及「編碼區域」(coding region)在本說明書中可交替使用，係是包含RNA及DNA的核苷酸序列及及核酸序列，其係可用以編碼合成RNA、蛋白、部分RNA或部分蛋白時需要的基因訊息。「外來核苷酸序列」(foreign nucleotide sequence)、「異源性核苷酸序列」(heterologous nucleotide sequences)或「外源性核苷酸序列」(exogenous nucleotide sequences)是指特定生物體基因組之自然產物以外的核苷酸序列。「異源性蛋白」(Heterologous proteins)是指由外來、異源性或外源性核苷酸編碼之蛋白，該些蛋白通常不會表現於細胞中。分離後重新導入相同種類之生物體的核苷酸序列不會被視為特定生物體基因組自然產生的產物，而會視為異性或外源性核苷酸序列。
「相似」(similar或similarity)在本說明書是指不同核酸或胺基酸序列間的關聯性，其中該些序列之部分序列相同，或是序列中一或多個區域具有相似性。相似的胺基酸殘基可以是不同胺基酸序列間相同的胺基酸殘基，或是不同序列間保守性置換的胺基酸取代。
「有效量」(effective amount)一詞於此是指一種足以產生一期望治療反應的成份的使用量。一有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。具體的有效量取決於多種因素，如所欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物種類、治療持續時
間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。亦或是，有效量可以醫藥組合物中活性成份的濃度來表示，例如莫耳濃度(molar concentration)、重量濃度(mass concentration)、體積濃度(volume concentration)、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、重量分率(mass fraction)及混合比例(mixing ratio)。習知技藝者可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
除非另有所指，否則一重組蛋白的「治療有效量」(therapeutically effective amount)是指在治療一疾病或病狀時足以提供治療效益的劑量，或是足以延緩或減少一或多種與該疾病或病狀相關之病徵的劑量。一重組蛋白的治療有效量是指在治療疾病或病狀時治療藥劑(不論是單獨投予或與其他藥劑共同投予)能提供治療效益的劑量。「治療有效量」(therapeutically effective amount)一詞可包含一能改善整體療效、減少或避免一疾病或病狀之病徵或病因，或是能增加另一治
療藥劑之治療功效的劑量。
除非另有所指，否則一重組蛋白的「預防有效量」(prophylactically effective amount)是指足以抑制一疾病或病狀、一或多種與該疾病或病狀相關之病徵，或是抑制其發生的劑量。一重組蛋白的預防有效量是指在抑制疾病或病狀時預防藥劑(不論是單獨投予或與其他藥劑共同投予)能提供預防效益的劑量。「預防有效量」(prophylactically effective amount)一詞可包含一能改善整體預防功效或能增加另一預防藥劑之預防功效的劑量。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其係依據本揭示內容之方法，能接受本揭示內容之融合蛋白的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性。
(i)由噬菌體呈現之scFv抗體庫包含複數個抗體，其中各抗體具有至少一多肽，且該多肽是選自分別由序列編號：1、2及3所編碼之CDR所組成的群組
本揭示內容提供之第一種由噬菌體呈現的scFv抗體庫包含複數個scFv，其中各scFv是由一噬菌體所表現，且對一蛋白抗原具有結合親和力及專一性。在該種由噬菌體呈現之scFv抗體庫中，各scFv包含至少一選自以下組合的多肽：一第一CDR，其係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得，
一第二CDR，其係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得，以及一第三CDR，其係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
依據本揭示內容一實施方式，噬菌體可以是M13噬菌體或T7噬菌體；較佳地，噬菌體是M13噬菌體。
依據本揭示內容另一實施方式，蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素；舉例來說，蛋白抗原可以是流感病毒的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18血球凝集素。在一操作例中，蛋白抗原是流感病毒的H1血球凝集素；較佳地，H1血球凝集素是源自BS/07 H1N1病毒株(H1N1 A/Brisbane/59/2007)。在另一特定實施例中，蛋白抗原是流感病毒的H1血球凝集素，其係源自CA/09 H1N1病毒株(H1N1 A/California/7/2009)。
依據某些實施方式，在本發明由噬菌體呈現的scFv抗體庫中，各scFv可廣泛地結合至且中和不同的流感病毒株；舉例來說，BS/07 H1N1(H1N1 A/Brisbane/59/2007)或CA/09 H1N1(H1N1 A/California/7/2009)。
可由本發明噬菌體呈現之scFv抗體庫中篩選對蛋白抗原具有高結合親和力及專一性之由噬菌體呈現的scFv。依據某些實施方式，由本發明噬菌體呈現
之scFv抗體庫篩選一種由噬菌體呈現之scFv的方法，包含以下步驟：(a)使本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫與蛋白抗原進行反應，其中該由噬菌體呈現之scFv抗體庫包含複數個由噬菌體呈現之scFv；(b)對步驟(a)之產物投予一酸處理，藉以製備複數個由噬菌體呈現之scFv，其於酸處理前能分別與該蛋白抗原結合；(c)對步驟(b)製備之複數個由噬菌體呈現之scFv投予一鹼處理；以及(d)至少重複一輪步驟(b)及(c)，每次使用前一輪步驟(c)之產物作為噬菌體抗體庫，將其與該蛋白抗原進行反應，直到得到對該蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之由噬菌體表現的scFv。
在步驟(a)中，使本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫(其係包含複數個由噬菌體呈現之scFv)與蛋白抗原進行反應。較佳的方式是先將蛋白抗原固定在一支持性基質(supporting substrate)上，舉例來說，樹脂(resin)、酵素免疫吸附分析盤(plate)、玻片(slide)、酵素免疫吸附分析條(strip)或微珠(bead)。依據本揭示內容一實施方式，是將蛋白抗原固定在一酵素免疫吸附分析條上。用以將蛋白抗原固定於支持性基質的方法包含，但不限於，共價固定(covalent immobilization)，例如胺基化學(amine chemistry)、硫醇基化學(thiol chemistry)、羧基化學(carboxyl chemistry)、環氧
基化學(epoxy chemistry)、光活化化學(photoactive chemistry)、特定位置固定(site specific immobilization)、狄爾斯-阿德環加成反應(diels-alder cycloaddition)、鏈接化學(click chemistry)及胜肽接合(peptide ligation))；生物親和力固定(bioaffinity immobilization)，例如卵白素-生物素系統(avidin-biotin system)、組胺酸標記系統(His-tag system)、DNA引導固定(DNA-directed immobilization)、蛋白A/蛋白G媒介固定(protein G/protein A-mediated immobilization)及物理固定(physical immobilization)等。
在步驟(b)中，是藉由對步驟(a)之產物投予一酸處理來分離scFv及與其結合之蛋白抗原。依據某些實施方式，是利用pH 2.2之沖提緩衝液(例如鹽酸/甘胺酸溶液)來沖提步驟(a)之產物，以破壞蛋白抗原及由噬菌體呈現之scFv之間的作用。
接著，在步驟(c)中，是利用一鹼性溶液來中和步驟(b)所製備之由噬菌體呈現的scFv。依據本揭示內容某些實施方式，該鹼性溶液的pH值為9.0(例如包含三羥甲基氨基甲烷-鹼(Tris-base)的溶液)。
為篩選對蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之scFv，至少重複一輪步驟(b)及(c)，每次使用前一輪製備之經酸沖提暨鹼中和處理之由噬菌體呈現的scFv作為新一輪起始噬菌體抗體庫，據以與蛋白抗原進
行親和力篩選，直到得到對該蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之由噬菌體表現的scFv。
非必要地，可進一步於宿主細胞中擴增步驟(c)所製備之經酸沖提暨鹼中和處理之由噬菌體呈現的scFv；舉例來說，將經酸沖提暨鹼中和處理後之scFv的噬菌體感染大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)，藉以於大腸桿菌中擴增含有該蛋白抗原結合能力的scFv及呈現該scFv的噬菌體。之後，使經擴增之的scFv或呈現該scFv的噬菌體與蛋白抗原進行反應，並重複步驟(b)及(c)，直到得到對該蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之由噬菌體表現的scFv。
依據本揭示內容的實施方式，本發明方法使用的蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素；舉例來說，流感病毒的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18血球凝集素。在一操作例中，蛋白抗原是流感病毒的H1血球凝集素；較佳地，該H1血球凝集素是源自BS/07 H1N1病毒株(H1N1 A/Brisbane/59/2007)。在另一實施例中，蛋白抗原是源自CA/09 H1N1病毒株(H1N1 A/California/7/2009)的H1血球凝集素。
依據本揭示內容一實施方式，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含至少一選自以下組合的多肽：一第一CDR，其係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得，一第二CDR，其係由序列編號：2之核苷酸序列編
碼而得，以及一第三CDR，其係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
依據一實施例，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含一第一CDR，其係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得；在該實施方式中，第一CDR包含scFv的CDR-H1及分別位於CDR-H1之N端及C端的框架序列。依據另一實施方式，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含一第二CDR，其係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得；在該實施方式中，第二CDR包含scFv的CDR-H2及分別位於CDR-H2之N端及C端的框架序列。依據再另一實施方式，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含一第三CDR，其係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得；在該實施方式中，第三CDR包含scFv的CDR-H3。
依據一實施方式，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含第一及第二CDR，其係分別由序列編號：1及2之核苷酸序列編碼而得。依據另一實施方式，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含第二及第三CDR，其係分別由序列編號：2及3之核苷酸序列編碼而得。依據再另一實施方式，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含第一及第三CDR，其係分別由序列編號：1及3之核苷酸序列編碼而得。
依據一實施方式，篩選出之由噬菌體呈現的scFv包含第一、第二及第三CDR，其係分別由序列
編號：1、2及3之核苷酸序列編碼而得。
此外，可利用本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫來製備對蛋白抗原具有高結合親和力及專一性的重組抗體。由本發明噬菌體呈現之scFv抗體庫製備重組抗體的方法包含以下步驟：(1)使本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫與蛋白抗原進行反應，其中該由噬菌體呈現之scFv抗體庫包含複數個由噬菌體呈現之scFv；(2)篩選會表現對該蛋白抗原具有結合親和力及專一性之scFv的噬菌體；(3)將步驟(2)篩選之由噬菌體呈現的scFv表現為可溶形式；(4)由步驟(3)篩選對該蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之可溶性scFv；(5)萃取一噬質體DNA，其係對應於步驟(4)所篩選之可溶性scFv；(6)以步驟(5)之噬質體DNA作為模版，利用PCR分別擴增一用以編碼一第一多肽的第一核酸序列，其中該第一多肽包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及一用以編碼一第二多肽的第二核酸序列，其中該第二多肽包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(7)分別將(6)之第一及第二核酸序列插入一包含一第三及一第四核酸序列的表現載體，其中該第三核酸序列是用以編碼一包含一免疫球蛋白之重鏈恒定區域的第三多肽，且該第四核酸序列是用以編碼一包含該免疫球蛋白
之輕鏈恒定區域的第四多肽；以及(8)將步驟(7)之包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至一宿主細胞中，以製備對該抗原蛋白具有專一性的重組抗體。
在步驟(1)中，使本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫(其係包含複數個由噬菌體呈現之scFv)與蛋白抗原進行反應。與上述步驟(a)相似的篩選方法，可先將蛋白抗原固定於一支持性基質(例如樹脂、酵素免疫吸附分析盤、玻片、酵素免疫吸附分析條或微珠)上，再與本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫混合。依據本揭示內容實施方式，蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素；舉例來說，流感病毒的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18血球凝集素。在一特定實施例中，蛋白抗原是流感病毒的H1血球凝集素。依據一較佳實施方式，H1血球凝集素是源自BS/07 H1N1(H1N1 A/Brisbane/59/2007)或CA/09 H1N1(H1N1 A/California/7/2009)。
在步驟(2)中，篩選該些會表現對蛋白抗原具有結合親和力及專一性之scFv的噬菌體。一般來說，可依據前述步驟(b)及(c)所述方法來篩選該些噬菌體。更具體來說，先對步驟(1)之產物(即該些會表現對蛋白抗原具有結合親和力及專一性之scFv的噬菌體)投予一酸處理(例如pH值為2.2之HCl/甘胺酸溶液)，再投予鹼性溶液(例如pH值為9.0的包含Tris-鹼溶液)進行處
理。依據本揭示內容一實施方式，所篩選出之噬菌體表現之scFv與其蛋白抗原的KD約為10-7-10-9M。
在步驟(3)中，為排除與蛋白抗原的結合是由噬菌體(而非scFv)所造成，將步驟(2)篩選之由噬菌體呈現的scFv表現為可溶形式。依據本揭示內容實施方式，在本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫中，各scFv的CDR區域是由一乳糖操縱組(lactose operon,lac operon)所趨動；如所屬領域具有通常知識者所熟知，添加異丙基-硫代β-D-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactoside,IPTG)可誘發乳糖操縱組表現，進而趨動下游基因(即第二及第三核酸序列)表現。產生的scFv會因此分泌至培養液中，習知技藝人士經由離心可由離心上清液收集該些可溶性scFv。
在步驟(4)中，利用與步驟(2)相似的方法來篩選步驟(3)所製備之可溶性scFv，再將其與預先固定於支持性基質(例如樹脂、酵素免疫吸附分析盤、玻片、酵素免疫吸附分析條或微珠)之蛋白抗原混合，之後投予一酸處理以分離scFv及蛋白抗原。進一步對製備的scFv投予一鹼處理。依據本揭示內容一實施方式，篩選出之可溶性scFv對蛋白抗原具有最高的結合親和力及專一性。在該實施例中，篩選出之可溶性scFv與其蛋白抗原的KD為80-100pM。依據一特定實施例，可溶性scFv與其蛋白抗原的KD為91pM。
在步驟(5)中，將步驟(4)篩選之會表現可
溶形式之scFv的噬菌體溶解後，萃取其噬質體DNA。可利用任何習知技藝人士所熟知的DNA萃取技術來溶解及萃取噬質體DNA；舉例來說，酚/三氯甲烷萃取法及清潔劑(例如十二烷基硫酸鈉、妥文-20、NP-40及氚核X-100)/乙酸萃取法。
在步驟(6)中以步驟(5)萃取的噬質體DNA作為模版，以分別擴增用以編碼CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第一核酸序列，以及用以編碼CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的第二核酸序列。
在步驟(7)，將擴增的第一及第二核酸序列插入表現載體中，其係包含第三及第四核酸序列，其中第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白蛋白之重鏈恒定區域，而該第四核酸序列則係用以編碼該免疫球蛋白蛋白之輕鏈恒定區域。依據本揭示內容一實施方式，第一核酸序列是位於第三核酸序列的上游，而第二核酸序列則是位於第四核酸序列的上游。當可想見，該免疫球蛋白蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在本揭示內容一較佳實施方式中，該免疫球蛋白蛋白是IgG；據此，利用本發明方法所製備的重組抗體包含四條肽鏈：二條相同的重鏈二條相同的輕鏈，其係以雙硫鍵相連接，且排列呈現Y型。
在步驟(8)中，是將步驟(7)建構的表現載體轉染至宿主細胞，以製備本發明重組抗體。常用的宿主細胞為哺乳動物細胞，例如HEK293 Freestyle細胞。可利用習知技藝人士熟知的方法進行轉染，包含化學方法
(例如磷酸鈣、微脂體(liposome)及陽離子聚合物(cationic polymer))、非化學方法(例如電穿孔法、細胞擠壓法(cell squeezing)、聲孔法(sonoporation)、光轉染(optical transfection)、原生質體融合(protoplast fusion)及流體動力傳遞(hydrodynamic delivery))、顆粒法(例如基因槍(gene gun)、磁轉染(magnetofection)及穿刺轉染(impalefection))，以及病毒法(例如腺病毒載體(adenoviral vector)、辛得比斯病毒載體(sindbis viral vector)、及慢病毒載體(lentiviral vector))。製得的重組抗體會分泌到培養液之上清液中，習知技藝人士可利用任何熟知的方法由上清液中純化重組抗體；舉例來說，可利用抗體與蛋白A或蛋白G的結合親和力來進行純化。
基於製備的重組抗體可結合並中和不同的流感病毒株，其可用以治療或預防流感病毒感染。因此，本揭示內容亦提供一種用以治療或預防一個體體內流感病毒感染的方法。依據本揭示內容的實施方式，該方法包含對該個體投予一有效量(例如一治療有效量或一預防有效量)之重組抗體，其中該重組抗體包含至少一選自以下組合的多肽：一第一CDR，其係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得，一第二CDR，其係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得，以及
一第三CDR，其係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
具體來說，本發明重組抗體可包含一CDR，其係由序列編號：1、2或3之核苷酸編碼而得。或者是，本發明重組抗體可包含二個CDR，其係分別由序列編號：1及2、2及3，或是1及3之核苷酸編碼而得。或者是，本發明重組抗體可包含三個CDR，其係分別由序列編號：1、2及3之核苷酸編碼而得。
在本揭示內容實施方式中，序列編號：1、2及3之核苷酸是皆是依據所屬領域習知技藝人士熟知之生物化學國際單位(international unit of biochemistry,IUB)編碼來表示，其中N代表A、T、C或G中任一核苷酸；而K則代表核苷酸G或T。
(ii)由噬菌體呈現之scFv抗體庫包含複數個抗體，其中各抗體具有分別由序列編號：4、5及6編碼之CDR
基於數個位於CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3區域的胺基酸殘基可媒介蛋白抗原及本發明由噬菌體呈現之scFv之間的作用，本揭示內容提供了另一種由噬菌體呈現之scFv抗體庫。如(i)部分所述之由噬菌體呈現的scFv抗體庫，第二種由噬菌體呈現之scFv抗體庫亦包含複數個scFv，其中各scFv是由一噬菌體所表現，且對一蛋白抗原具有結合親和力及專一性。依據本揭示內容一實施方式，各scFv包含：CDR-H1，其係由一包含序列編號：4之核苷酸序列
的第一多核苷酸編碼而得，CDR-H2，其係由一包含序列編號：5之核苷酸序列的第二多核苷酸編碼而得，以及CDR-H3，其係由一包含序列編號：6之核苷酸序列的第三多核苷酸編碼而得。
依據本揭示內容一實施方式，噬菌體是M13噬菌體或T7噬菌體；較佳地，噬菌體是M13噬菌體。依據本揭示內容另一實施方式，蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素；舉例來說，是流感病毒的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18血球凝集素。在一操作例中，蛋白抗原是流感病毒的H1血球凝集素。依據一較佳實施例，蛋白抗原是源自BS/07 H1N1(H1N1 A/Brisbane/59/2007)或CA/09 H1N1(H1N1 A/California/7/2009)之H1血球凝集素。
如(i)部分所述之由噬菌體呈現的scFv抗體庫，在本發明第二種由噬菌體呈現之scFv抗體庫中，各scFv可用以廣泛地結合至及中和不同的流感病毒株；例示性之流感病毒株包含BS/07 H1N1(H1N1 A/Brisbane/59/2007)及CA/09 H1N1(H1N1 A/California/7/2009)。
依據(i)部分所述之方法，可利用本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫來製備對蛋白抗原(例如流感病毒的血球凝集素)具有高結合親和力及專一性之由噬菌體呈現的scFv。製備之由噬菌體呈現的scFv包含：
CDR-H1，其係由一包含序列編號：4之核苷酸序列的第一多核苷酸編碼而得，CDR-H2，其係由一包含序列編號：5之核苷酸序列的第二多核苷酸編碼而得，以及CDR-H3，其係由一包含序列編號：6之核苷酸序列的第三多核苷酸編碼而得。
此外，依據(i)部分所述之方法，可利用本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫來製備一重組抗體。藉由篩選不同的第三及第四核酸序列，重組抗體可表現為IgG、IgA、IgD、IgE及IgM形式。在一實施例中，是將重組抗體表現為IgG形式。
依據本揭示內容其他實施方式，本發明重組抗體的IC50約為每毫升230-270奈克。本發明重組抗體的EC50約為每毫升2.5-2.9奈克。本發明重組抗體對流感病毒H1血球凝集素的KD約為91pM。
基於製備的重組抗體可結合至並中和不同的流感病毒株，其可用以治療或預防流感病毒感染。因此，本揭示內容進一步提供一種用以治療或預防一個體體內流感病毒感染的方法。該方法包含對該個體投予一有效量(例如一治療有效量或一預防有效量)之重組抗體，其中該重組抗體包含：CDR-H1，其係由一包含序列編號：4之核苷酸序列的第一多核苷酸編碼而得，CDR-H2，其係由一包含序列編號：5之核苷酸序列的第二多核苷酸編碼而得，以及
CDR-H3，其係由一包含序列編號：6之核苷酸序列的第三多核苷酸編碼而得。
在本揭示內容實施方式中，序列編號：4-6之核苷酸是皆是依據所屬領域習知技藝人士熟知之生物化學國際單位(international unit of biochemistry,IUB)編碼來表示，其中N代表A、T、C或G中任一核苷酸；而K則代表核苷酸G或T。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
某些與本發明相關之內容已發表於Scientific Reports(Chao-Ping Tung et al.；2015,5：15053；Discovering neutralizing antibodies targeting the stem epitope of H1N1 influenza hemagglutinin with synthetic phage-displayed antibody libraries)。在此一併納入該發表文獻以供參照之用。
材料及方法
細胞株及病毒
將馬丁達比犬腎臟(Madin-Darby
canine kidney,MDCK)上皮細胞株培養於包含非必需胺基酸(non-essential amino acid,NEAA)、2mM L-麩胺酸(L-glutamine)及10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的伊格氏最小必需培養液(Minimum Essential Medium Eagle,MEM)中，並將其培養於37℃、含有5%二氧化碳的潮溼細胞培養箱中。本研究是使用由台灣疾病管制署取得之A型流感病毒BS/07 H1N1(A/Brisbane/59/2007)及CA/09 H1N1(一種重組病毒NYMC X-181，HA源自A/California/07/2009)。利用10天大的胚胎尿囊腔製備病毒原液，超高速離心濃縮後重新懸浮於磷酸緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline,PBS)中。依據Reed及Muench，以TCID50(50%組織培養感染劑量，50% tissue culture infectious dose)檢測MDCK細胞中病毒的效價。
建構由噬菌體呈現之合成抗體庫
以包含序列編號：7之核苷酸序列的起始F10模板作為模板，利用特定引子進行寡核苷酸定位突變(oligonucleotide directed mutagenesis，亦稱為特定位點突變(site-specific mutagenesis)或定位點突變(site-directed mutagenesis))來建構本發明由噬菌體呈現之scFv抗體庫，其係包含CDR-H1抗體庫、CDR-H2抗體庫、CDR-H3抗體庫及CDR-H123抗體庫。
CDR-H1抗體庫
為建構CDR-H1抗體庫，利用具有序列編號：8之核苷酸序列的模板_1引子來突變起始F10模板之CDR-H1區域。經過突變的F10模板於CDR-H1區域中具有二個中止密碼子(two stop codons,TAA)。之後，再以具有序列編號：9之核苷酸序列的引子F10-CDRH1_1利用庫克爾方法(Kunkel method)使CDR-H1區域突變的含有二個中止密碼子的F10模板產生多樣性，並將其建構至噬質體pCantab5E中，以製備CDR-H1抗體庫。
CDR-H2抗體庫
為建構CDR-H2抗體庫，利用具有序列編號：10之核苷酸序列的模板_2引子來突變起始F10模板之CDR-H2區域。經過突變的F10模板於CDR-H2區域中具有二個中止密碼子。之後，再以具有序列編號：11之核苷酸序列的引子F10-CDRH2_1利用庫克爾方法(Kunkel method)使CDR-H2區域突變的含有二個中止密碼子的F10模板產生多樣性，並將其建構至噬質體pCantab5E中，以製備CDR-H2抗體庫。
CDR-H3抗體庫
為建構CDR-H3抗體庫，利用具有序列編號：12之核苷酸序列的模板_3引子來突變起始F10模板之CDR-H3區域。經過突變的F10模板於CDR-H3區域中具有二個中止密碼子。之後，再以具有序列編號：13之核苷酸序列的引子F10-CDRH3_1利
用庫克爾方法(Kunkel method)使CDR-H3區域突變的含有二個中止密碼子的F10模板產生多樣性，並將其建構至噬質體pCantab5E中，以製備CDR-H3抗體庫。
CDR-H123抗體庫
為建構CDR-H123抗體庫，利用序列編號：8、10及12之核苷酸序列的引子(模板_1、模板_2及模板_3)同時突變起始F10模板之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3區域。經過突變的F10模板分別於CDR-H1，CDR-H2及CDR-H3區域中皆具有中止密碼子。之後，同時利用具有序列編號：14-16之核苷酸序列的引子F10-CDRH123_1、F10-CDRH123_2及F10-CDRH123_3，以庫克爾方法(Kunkel method)同時使CDR-H1，CDR-H2及CDR-H3區域皆皆突變的含有中止密碼子的F10模板產生多樣性，並將其建構至噬質體pCantab5E中，以製備CDR-H123抗體庫。
培養載有噬質體抗體庫之大腸桿菌(菌株ER2738)來製備以pIII-融合蛋白形式呈現scFv之重組M13噬菌體抗體庫，利用輔助噬菌體M13KO7來拯救(rescue)噬質體，藉以製備該重組M13噬菌體。以聚乙二醇/氯化鈉(PEG/NaCl)沉澱會表現scFv抗體庫之重組噬菌體，再將其懸浮於PBS中以進行後續之篩選-擴增循環。藉由滴定每毫升之菌落形成單位(colony forming units per mL,CFU/mL)及隨機對載有噬質
體之大腸桿菌進行定序分析來評估由噬菌體呈現之scFv抗體庫的品質。滴定結果指出，所有合成的由噬菌體呈現之抗體庫的複雜度皆大於109；而抗體庫變異株的胺基酸序列組合標誌(結果未顯示)則指出，噬菌體抗體庫的製備大致上沒有使變異序列之表現產生特定偏好。
利用噬菌體呈現scFv抗體庫來篩選抗-HA抗體
依據先前流程，利用以HA蛋白(每孔洞1微克/100微升之PBS)塗佈之Maxisorp八孔洞之酵素免疫吸附分析條(Nunc)來篩選抗-HA抗體。簡單來說，將塗佈溶液加入孔洞中，於室溫下震盪混合2小時，藉以將HA塗佈於孔洞。再以阻斷溶液(5%之溶於包含0.1%妥文-20之磷酸緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline with 0.1% tween-20,PBST)的脫脂牛奶)於室溫處理被HA塗佈之孔洞1小時。以阻斷溶液將重組噬菌體稀釋至每毫升1012CFU後，加入經HA塗佈之孔洞，震盪混合1小時。以PBST劇烈洗滌10次後，再以PBS洗滌6次，以移除非專一結合的噬菌體。以0.1M甘胺酸/鹽酸溶液(pH 2.2)沖提結合的噬菌體10分鐘後，立即以2M Tris-鹼緩衝液(pH 9.0)中和沖提溶液。使噬菌體於37℃感染大腸桿菌菌株ER2738(OD600 
0.6)30分鐘後；投予胺苄青黴素(ampicillin)處理30分鐘以移除未感染的大腸桿菌。之後，加入輔助噬菌體M13KO7培養1小時。在包含康黴素(kanamycin)的環境下，於37℃隔夜劇烈震盪培
養，藉以擴增於大腸桿菌中篩選的噬菌體。以PEG/NaCl沉澱經篩選擴增的噬菌體，再將其重新懸浮於PBS中以進行下一輪的篩選-擴增流程。
細胞培養上清液中無噬菌體之可溶性scFv的結合及濃縮分析
將大腸桿菌菌株ER2738培養於2YT細菌培養液(每公升16公克之胰化蛋白(tryptone)、每公升10公克之酵母菌萃取物及每公升5公克之NaCl，pH 7.0)中，待達到中間對數期(mid-log phase)後，以噬質體中包含經篩選之scFv基因的單菌落噬菌體進行感染。於37℃震盪培養1小時後，加入最終濃度為每毫升100微克的胺苄青黴素。待培養液之OD600達到1.0-1.2時，加入最終濃度為每毫升1微克的IPTG。將細胞培養盤置於37℃隔夜劇烈震盪培養。離心培養液中的細菌後，以具有0.45微米之GHP膜的AcroPrep 96過濾盤(PN5054,Pall corporation)過濾包含無噬菌體之可溶性scFv(會表現與其C端融合之E-標識胜肽)的上清液，藉以移除細菌，以進行後續微量中和試驗。
在進行可溶性scFv結合試驗時，是藉由修改先前方法來執行酵素免疫吸附分析試驗(ELISA)。簡單來說，以BS/07或CA/09 H1 HA(每孔洞0.5微克/100微升之PBS)塗佈96-孔洞Maxisorp酵素免疫吸附分析盤(Nunc)中，於室溫震盪混合2小時。以300微升之阻斷溶液處理1小時後，將50微升之包含分泌scFv的過濾上清液與50微升之阻斷溶液均勻混合，
再加入經塗佈之酵素免疫吸附分析盤中，震盪混合1小時。加入HRP接合之山羊抗-E-標識胜肽抗體(以阻斷溶液1：4000稀釋，目錄編號：AB19400，Abcam)，震盪混合1小時。每孔洞加入100微升之SureBlue TMB過氧化酶受質，然後每孔洞加入100微升之1N鹽酸中止反應後，以光譜儀測量450奈米的吸光值。對各scFv之過濾上清液進行三重複試驗。
以點漬分析(dot-blot)檢測過濾上清液中scFv的濃度：將以甲醇溼潤並以PBS緩衝液處理之PVDF膜，固定於點漬Bio-Dot裝置組合(Bio-Rad)。將包含分泌scFv之培養液檢體加入各孔洞。加入連續稀釋之已知濃度的F10-E-標識胜肽scFv，以建立標準對照。以阻斷溶液處理點漬膜後，利用與HRP接合之抗E-標識胜肽抗體(Abcam)進行反應，之後加入顯色之TMB過氧化酶受質處理。
以濃度定量除以ELISA讀值後，利用F10對照組進行標準化處理(即(ES/QS)/(EF10/QF10))，藉以得到各scFv之標準化結合親和力，其中ES及EF10分別為檢體及F10對照組的ELISA讀值，而QS及QF10則分別為檢體及F10對照組的濃度定量。以多重測量(multiple measurement)計算標準化結合親和力的平均值及標準差。
對流感病毒感染進行微-中和試驗
將MDCK細胞(每孔洞3×104個細胞)置於96孔細胞培養盤培養16個小時至適當滿度。將過濾
後的scFv與100 TCID50新鮮稀釋的病毒溶液混合後，於37℃靜置30分鐘。之後將此病毒-scFv混合溶液加入經PBS洗滌之MDCK細胞進行感染，於37℃靜置1小時。吸附後，移除病毒-scFv混合溶液，並以PBS洗滌二次後加入培養基培養已被感染的MDCK細胞，再於感染24小時後以甲醇-丙酮(1：1(體積比))進行固定。固定後，以含有0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)之PBS的處理MDCK細胞5分鐘，再投予阻斷溶液處理1小時。以小鼠抗-A型流感病毒核蛋白IgG抗體(以阻斷溶液1：2000稀釋，目錄編號：MAB8251，Millipore)為第一抗體，以HRP接合之山羊抗-小鼠抗體為第二抗體(目錄編號：12-349，Millipore)，然後以TMB過氧化酶受質進行呈色來偵測病毒核蛋白的新合成。對經過濾之各scFv進行四重複試驗。
將僅有病毒對照組的ELISA讀值設定為0%，並將負對照組(沒有病毒亦沒有scFv)的ELISA讀值設定為100%。計算加入scFv所造成之病毒感染的ELISA讀值減少量以得到中和百分比。將中和百分比除以scFv之定量濃度後，以同時培養的F10 scFv進行標準化處理(即(NS/QS)/(NF10/QF10))，藉以得到標準化中和效力，其中NS及NF10分別為檢體scFv及F10 scFv對照組的中和百分比，而QS及QF10則分別為檢體scFv及F10 scFv對照組的濃度定量。以多重測量計算標準化中和效力的平均值及標準差。
序列組合標誌(sequence LOGO)
以下列公式計算共通序列LOGO中位於j之胺基酸種類i的大小R ji (半位元單位)：
C ji 為包含位置j之與HA結合之CDR序列的M j 數值中，位於j之胺基酸i的數值；p i 為由NNK簡併密碼子編碼之胺基酸i的背景概率；公式中M j 的平方根為偽數值，當C ji 為零時可防止奇異點(singularity)。修飾原立式以得到公式(1)。
特定位置得分矩陣(Position specific score matrix,PSSM)及胚原序列分數
以貝氏預測偽數法(Bayesian prediction pseudo-count method)計算特定位置得分矩陣(position specific score matrix,PSSM)W ji ，並以半位元單位來表示：
，其中W ji 為抗體之CDR中位置j之胺基酸i的偏好；C ji 為包含位置j之與HA結合之CDR序列的M數值中，位於j之胺基酸i的數值；p i 為由NNK簡併密碼子編碼之胺基酸i的背景概率；公式中M的平方根為偽數值，
當C ji 為零時可防止奇異點。
以上述PSSM計算胚原CDR序列與一組M抗體CDR序列的比對分數。以IMGT(http：//www.imgt.org/)擷取胚原序列。先以已知方法確認各胚原序列之CDR H1及CDR H2；比對分數為完整CDR序列中W ji (公式(2))的總和，其中i為CDR序列中位於對應位置j的胚原胺基酸種類。
HA序列分析
由流感研究資料庫(Influenza Research database，截至2014 12月)下載全部的全長HA序列。由所有宿主收集總共28,627條A型流感病毒及其亞型的序列，以確認膜近端抗原決定位及膜遠端抗原決定位的胺基酸保守性。利用HMMER包裝以Hidden Markov模式由Pfam蛋白家族資料庫比對各亞型之HA序列。將統計結果總結於表1中。
於昆蟲細胞表現及純化血球凝集素
將對應於A/Brisbane/59/2007(H1N1；登錄號：ACA28844.1，BS/07 H1 HA)之HA胞外區段(ectodomain)之第18-528個胺基酸殘基及A/California/07/2009(H1N1；登錄號：ACP41953.1，CA/09 H1 HA)之第18-529個胺基酸殘基的cDNA進行密碼子最佳化，以於真核細胞表現，並如先前方法利用PCR將其與N端gp67訊息胜肽(MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADLAS，序列編號：17)及C端凝血酶切割
位(thrombin cutting site)、三聚合結構區(trimerization domain)及His6-標識胜肽(ASLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH，序列編號：18)融合。將該些HA表現基因組插入桿狀病毒轉移載體pFastBac-1(Invitrogen)中。以MOI為5的重組桿狀病毒感染懸浮Sf9細胞(每毫升3×106細胞)(Invitrogen)，並於26℃以110rpm的轉速震盪培養72小時。將細胞培養液離心二次(於4℃以1,000×g離心10分鐘及12,000×g離心30分鐘)。於4℃以PBS(pH 7.2)隔夜透析含有HA的培養上清液。以0.8微米孔徑的過濾膜過濾已透析的含有HA的培養上清液，與經Ni2+處理之IMAC管柱(GE Healthcare Life Sciences)進行鎳螫合親合性管柱層析，鎳螫合親合性管柱層析中咪唑(imidazole)的濃度梯度從40mM到500mM，基礎溶液是TS溶液(Tris-HCl,10mM,NaCl 50mM,pH 8.0)。將包含HA的分餾液以Q管柱(GE Healthcare Life Sciences)進行陰離子管柱層析，陰離子管柱層析中的氯化納的濃度梯度從40mM到1000mM，基礎溶液是Tris-HCl,10mM,pH 8.0。濃縮含有HA的分餾液後，注入Superdex200 10/300 GL管柱(GE Healthcare Life Sciences)進行分子篩管柱層析(size exclusion chromatography)，以TS溶液為基礎溶液。收集包含HA的分餾液，加入蛋白酶抑制混合劑後保存於4℃或-80℃。
表現及純化scFv
稍為修改先前方法以表現及純化scFv。簡單來說，將scFv編碼區域次轉殖到pET-32表現載體，藉以編碼一融合蛋白，其N端帶有硫醇氧化還原蛋白(thioredoxin)，C端則是次轉殖的scFv。該融合蛋白在硫醇氧化還原蛋白之後與scFv之前有TEV蛋白酶切割位及的六個組胺酸形成的標識胜肽，scFv的C末端接有一Avitag寡胜肽(GLNDIFEAQKIEWHE，序列編號：19，Avidity Inc.，美國)，藉以於活體體內進行生物素化反應(biotinylation)。將由噬菌體篩選之包含scFv編碼區域的scFv基因由SfiI及NotI等兩個限制酶切點次轉殖至pET-32表現載體中。將含有scFv基因片段的表現載體轉殖至大腸桿菌Rosetta-gami B(DE3)(Novagen)菌株後，將該菌株培養於含有胺苄青黴素(每公升200微克)、四環素(tetracycline，每公升12.5微克)及氯黴素(chloramphenicol，每公升37.5微克)的2X YT培養液(每公升16公克之胰化蛋白、每公升10公克之酵母菌萃取物及每公升5公克之NaCl)中，37℃震盪培養直到OD600達到1.0，於16℃冷卻震盪培養2小時後，加入最終濃度為0.2mM的IPTG，繼續過夜震盪培養。離心後將沉澱細胞重新懸浮於分解緩衝液(Tris-HCl,50mM,pH 8.0,150mM NaCl,30mM咪唑)中，再以Microfluidizer(Microfluidics,MA)擊碎懸浮細胞，以鎳螫合色層分析利用經0.1M NiSO4溶液處理之IMAC預包裝管柱(GE Healthcare
Life Sciences)純化重組硫醇氧化還原蛋白-scFv融合蛋白。收集包含融合蛋白的分餾液，再以Tris-HCl(50mM，pH 7.5；sc-dsFv的理論pI值為5.82)於4℃隔夜透析，或是利用相同緩衝液以HiPrep 26/10去鹽管柱(GE Healthcare Life Sciences)去除鹽類。再將蛋白溶液進行離子交換層析(ion-exchanged chromatography，預包裝Q管柱，GE Life Healthcare Sciences)。收集包含硫醇氧化還原蛋白-scFv融合蛋白的分餾液，再以含有His6-標識胜肽之TEV蛋白酶(A280比值為50：1)於30℃處理至少5小時(最多不超過8小時)。以鎳螫合親合性管柱移除含有His6-標識胜肽之硫醇氧化還原蛋白的TEV切割片段及His6-標識胜肽之TEV蛋白酶。進一步以SEC緩衝液(Tris-HCl,50mM,pH 7.5,400mM NaCl,10%甘油)及Superdex75分子篩管柱層析管柱(GE Healthcare Life Sciences)純化scFv，製得的可溶性scFv蛋白具有95%的純度。將純化的sc-dsFv保存於4℃，至少一週內不會影響其親和力。
建構及表現IgG
分別利用PCR以序列編號：17-20的引子來擴增VH及VL DNA片段。將擴增的VH及VL DNA片段重組至載體中，藉由pIgG表現系統(美國專利編號：5736137)及Gibson組合轉殖套組(NEB)表現IgG1。利用293-F細胞表現IgG。將293-F細胞以每毫升1-1.5×106個細胞的最終濃度培養於Gibco®
FreeStyleTM 293表現培養液(Invitrogen，目錄編號：12338)中，於37℃培養2-4小時(8%二氧化碳，轉速為110rpm)。依據使用者操作說明，利用PEI(Polysciences Inc.，目錄編號：24765)將各IgG構建體轉染至293-F細胞。於轉染後7-9天或直到細胞存活率降至60%以下前，收集表現的IgG。依據使用者操作說明回溶及組裝已接合蛋白A瓊脂糖凝膠(Protein A Sepharose，GE Healthcare，目錄編號：17-0780-01)管柱。離心293-F細胞培養，並以0.22微米過濾器進行過濾。以蛋白A管柱純化IgG，利用0.2M甘胺酸/鹽酸緩衝液(pH 2.5)進行沖提，再以1M Tris緩衝液(pH 9.0)中和沖提產物。
以表面電漿子共振(surface plasmon resonance)檢測抗體-抗原之作用親和力及動力學
利用BIAcore T200(GE Healthcare)儀器來檢測IgG及HA蛋白間的結合親和力及動力學參數。以胺類耦合套組(amine coupling kit,GE Healthcare)將溶於10mM醋酸緩衝液(pH 5.0)的HA固定於CM5感應晶片上，反應單位(response unit,RU)為1000。以HBS-EP+緩衝液(將流速設定為每分鐘30微升)來測量IgG及HA之間作用的結合(k on)及解離(k off)常數。在注入新IgG前，以50mM HCl及0.05%表面活性劑P20再生感應表面，將測得的訊號值減去參照通道(未以配體(ligand，這裡指HA蛋白)塗佈)測得的訊號值。以全面擬合至1：1結合模式利
用Biaevaluation軟體(GE Healthcare)來分析結合動力學。
測量IC
50
檢測半最大抑制濃度(half of maximal inhibitory concentration,IC50)以評估IgG的中和能力。將MDCK細胞種植於96-孔洞盤中，接著培養16小時至適當滿度。以感染緩衝液新鮮稀釋病毒原液。以PBS稀釋經之純化IgG後，與100 TCID50的病毒溶液混合以進行中和反應。將病毒-IgG混合物加入經PBS洗滌之MDCK細胞，以感染該細胞。待病毒吸附後，移除病毒-scFv混合物，接著以PBS洗滌MDCK細胞並將MDCK細胞培養於新鮮配製之感染緩衝液中，感染24小時後，利用甲醇-丙酮(1：1(體積/體積))固定細胞。固定後，對MDCK細胞投予0.5%之溶於PBS之氚核X-100處理，再加入阻斷緩衝液。以小鼠抗-A型流感病毒核蛋白IgG抗體(目錄編號：MAB8251，Millipore)、與HRP接合之山羊抗-小鼠抗體(目錄編號：12-349，Millipore)及TMB過氧化酶受質來偵測抗體處理時的病毒繁殖程度。將稀釋後的IgG以不同濃度進行六重複試驗。依據Stewart及Watson法計算IC50(奈克/毫升)。
實施例1 全面檢測源自F10之HA結合抗體的CDR-H2序列可發現僅能與IGHV1-69*01基因相容的序列偏好
以F10 scFv作為模式抗體分子，藉以了
解位於CDR-H2之H52到H56胺基酸殘基(Chothia所定義的CDR-H2區域)的序列空間。本研究目的旨在探討全面最佳化之CDR-H2序列，其係能標的至HA之高度保守性膜近端抗原決定位(表1)。即使已知CR6261可以噬菌體呈現scFv之形式進行表現，基於F10的VH-VL scFv能成功表現為由M13噬菌體呈現的scFv及位於大腸桿菌培養上清液中無噬菌體之可溶性scFv，本實驗利用F10 scFv作為模板。以F10模板(圖6)建構由噬菌體呈現的合成抗體庫(F10-CDRH2)，其中利用簡併密碼子NNK(N：A/G/T/C and K：G/T)使CDR-H2區域產生多樣性，藉以涵蓋共20種天然胺基酸類型。利用寡核苷酸定位突變(Oligonucleotide directed mutagenesis)來建構複雜度大於109(相當於抗體庫之理論基因多樣性(326))之由噬菌體呈現的F10-CDRH2抗體庫。利用固定之重組BS/07 H1 HA對F10-CDRH2抗體庫進行三輪篩選-擴增噬菌體呈現循環，藉以篩選出由噬菌體呈現的scFv。再將篩選出的scFv表現為會分泌於培養上清液之無噬菌體的可溶性scFv，進一步測試其對重組BS/07 H1 HA的結合能力，以及於微-中和試驗中對BS/07 H1N1(H1N1 A/Brisbane/59/2007)及CA/09 H1N1(H1N1 A/California/7/2009)病毒感染MDCK細胞的影響(表2闡述了代表性變異株)。
表1 在流感研究資料庫中，源自A型流感病毒所有亞型之HA序列之膜近端抗原決定位及膜遠端抗原決定
位的胺基酸保守性
在噬菌體呈現篩選/擴增循環過程中，關鍵點之一是確保能以沖提緩衝液將結合最佳化之scFv抗體(對HA莖柄部具有專一性結合之抗體，與中和病毒感染機制相關)由抗原分離出來，以進一步進行擴增。pH值為2.2的沖提緩衝液(方法)足以改變抗體-抗原表面之實際電荷相關的靜電作用，其係藉由移除抗體-抗原複合體中天門冬胺酸(aspartic acid)及麩胺酸(glutamic acid)的電荷及增加抗體-抗原複合體中組胺酸(histidine)的實際電荷來改變抗體-抗原的交互作用。如此一來，即使無法保證該沖提條件能沖提所有結合scFv抗體及其噬菌體，卻可將多數與被固定的抗原結合之scFv抗體及其噬菌體沖提出來。低於5的pH值可消除處於中性pH值(pH8到pH6)之F10 scFv-HA的交互作用，其中多數位於抗體-抗原結合面的組胺酸帶有電荷，可基於實際電荷靜電作用來減弱結合能量。雖然已知
對莖柄部具有專一性之中和性抗體會在胞內體(endosome)的酸性環境中與HA結合以防止HA構形改變，然而該結果卻顯示，F10的中和效力不必然需要在pH值低於5的環境下持續性地與HA結合。整體來說，該沖提條件足以篩選至少一部分對HA具有中和效力的scFv，據以進行擴增反應；然而需以實驗檢測篩選出之scFv的中和能力，以確認在對選自噬菌體呈現之抗體庫之scFv的結合親和力及中和效力進行最佳化時，噬菌體呈現篩選/擴增循環的效力。
由篩選/擴增循環篩選出之由噬菌體呈現的scFv確實可中和相對應之流感病毒，但該些篩選出之scFv的結合親和力與中和效力不具顯著的相關性。即使篩選出之scFv變異株對HA的最大結合親和力較F10 scFv對HA的最大結合親和力高數倍，然而相較於F10 scFv，該些scFv變異株對BS/07及CA/09 H1N1病毒的中和效力卻未具有顯著的優勢。由F10-CDRH2抗體庫篩選出之108個scFv的結合親和力與其對相對應之病毒的中和效力並無顯著的線性相關性(r2<0.01)(結果未顯示)。共分析108個scFv變異體。表2總結了代表性scFv變異株的序列及結合/中和數據。該些結果指出，F10 CDR-H2胺基酸序列已大致達到最佳化，可中和二種H1N1流感病毒。
F10 CDR-H2的胚原胺基酸殘基明顯與具有高結合親和力及高中和效力之scFv變異株的胺基酸殘基偏好相容。圖1A及1B分別總結了該些具有高結合親和力及高中和效力之scFv變異株的胺基酸殘基，其中標準化結合親和力分數大於0.3(n=95，圖1A)，而標準化中和效力分數亦大於0.3(n=41，圖1B)。比對該些胺基酸殘基及進行篩選/擴增循環前隨機篩選之F10-CDRH2 scFv的胺基酸殘基可發現(結果未顯示)，圖1A及1B的胺基酸殘基分佈反應出結合及中和所需要的胺基酸殘基條件。由於挑選進行折疊穩定分析之scFv的CDR不具任何顯著的胺基酸殘基偏好，因此已排除由結構條件所造成的胺基酸殘基偏好。圖1A及1B之胺基酸殘基分佈的相似度指出，結合的胺基酸殘基組成與中和的胺基酸殘基組成一致。此外，保守性胺基酸殘基(S-P-M/L-F-N-Q，序列編號：69及70)與F10 CDR-H2胺基酸殘基(S-P-M-F-G-T，序列編號：71)的相似度極高，特別是位於H52~H54位置的胺基酸殘
基，該結果再次顯示F10 CDR-H2的胺基酸序列已大幅達到全面中和效力最佳化，可標的至位於HA莖柄部之IGHV1-69-bnAb之高度保守性膜近端抗原決定位。利用源自圖1A及1B所述之胺基酸殘基LOGO中scFv變異株於特定位置之胺基酸殘基的得分矩陣(position specific scoring matrices,PSSMs)計算所有人類胚原CDR-H2胺基酸序列的擬合分數(fitness score)(方法)。IGHV1-69基因的CDR-H2胺基酸序列似乎為唯一與PSSM正向相容的人類胚原CDR-H2胺基酸序列(表3)，該結果解釋了具有少數後天突變之IGHV1-69胚原基因的CDR-H2環狀結構可對HA莖柄部之高度保守性抗原決定位區塊(表1)進行最佳辨識。
實施例2 全面檢測源自F10之HA結合抗體的CDR-H1胺基酸序列可得到能與許多人類胚原VH基因相容之未明確定義的胺基酸殘基偏好
進一步以F10-CDRH1抗體庫探討在F10模板中，位於CDR-H1之H24至H32胺基酸殘基的分佈。基於在第I型規範結構中，H24之側鏈會與H26之側鏈緊密相鄰，進而影響CDR-H1環狀結構的局部構形，因此除了由Chothia所定義之CDR-H1區域(H26~H32)外，亦同時發現二個額外的胺基酸殘基位置(H24~H25)。已知已最佳化F10之CDR-H2胺基酸序列(參照上文)，僅利用NNK簡併密碼子來使F10-CDRH1抗體庫中位於H24到H32之胺基酸殘基產生多樣性，其複雜度大於109(圖6)；基於噬菌體抗體庫的製備流程，隨機挑選之F10-CDRH1 scFv的胺基酸殘基並不具顯著的偏好(結果未顯示)。F10-CDRH1抗體庫的複雜度限制並不足以涵蓋實驗設計的理論基因多樣性(329)。依然，109的複雜度足以探討在9個由NKK所編碼的胺基酸殘基中，高達任4種胺基酸殘基的協同組合(cooperative combination)(324×9！/5！/4！)。假設多數局部序列特徵是關於一或二個協同相關性胺基酸殘基(如於緊密轉角(tight turn)及鹽橋(salt bridge))，此抗體庫複雜度應可支持本研究主旨，據以大範圍地探討IGHV1-69-bnAb之可辨識HA抗原決定位的全面最佳化CDR-H1胺基酸序列。
選自F10-CDRH1抗體庫之scFv變異株
對BS/07 H1 HA的最大結合親和力較F10 scFv對BS/07 H1 HA的最大結合親和力高數倍；數個scFv變異株對BS/07及CA/09 H1N1病毒的中和效力則較F10 scFv對BS/07及CA/09 H1N1病毒的中和效力略高。再其次，選自F10-CDRH1抗體庫之78個scFv變異株的結合親和力與其對相對應之流感病毒的中和效力不具明顯的線性相關性(r2<0.2)；基於實驗準確度的限制，對二種H1N1流感病毒之中和效力並不具明顯相關性(結果未顯示)。共分析78個scFv變異株。表4總結了代表性scFv變異株的胺基酸序列及結合/中和數據。
分別如圖2A及2B所述，在經篩選之具高度結合親和力及高度中和效力之scFv變異株的胺基
酸序列中，所有位置皆不具有強烈胺基酸殘基偏好。在該些圖式中，標準化結合親和力分數大於0.3(n=62，圖2A)，而標準化中和效力分數亦大於0.3(n=37，圖2B)。最具保守性的胺基酸殘基位置為H29，推測其芳香族/疏水性側鏈可藉由與VH區域之上方疏水性核心聚集來穩定CDR-H1環狀結構之第I型規範結構。另一具保守性之胺基酸殘基位置為H32，其芳香族/親水性側鏈會接觸HA莖柄部之膜遠端抗原決定位。整體來說，胺基酸殘基間的相似度指出結合的胺基酸殘基條件與中和的胺基酸殘基條件一致，然而如圖2A及2B所示，CDR-H1缺乏胺基酸偏好則與CDR-H2具有明確定義的胺基酸偏好(圖1A及1B)形成強烈對比。依F10-HA複合結構中Thr28、Ser30及Ser31側鏈間廣泛的分子間氫鍵以及Val27及Phe32側鏈間疏水性/芳香族作用判斷，發明人意外地發現CDR-H1區域缺乏明顯的胺基酸偏好。推測造成該差異的原因為在F10-HA複合結構中，H3 HA結構可能未反映出本研究F10及H1 HA之間的結構交互作用。然而，表4所示之scFv變異株的最大親和力指出，許多替代性胺基酸殘基交互作用同樣足以提供有利的結合能量，藉以取代F10 CDR-H1提供的結合能量。
圖2A及2B所述之胺基酸偏好無法與IGHV1-69-bnAb的CDR-H1胚原胺基酸殘基相容。許多其他人類胚原CDR-H1的胺基酸殘基會與源自經篩選之scFv變異株的PSSM更為相容，圖2A及2B闡述了該些scFv變異株的胺基酸序列。該些結果與先前結論
一致，即F10 CDR-H1局部結構較具靭性，可容納大量能有效與HA莖柄部之相對應抗原決定位結合的替代性胺基酸殘基；據此，CDR-H1的各胺基酸對相對應之抗原決定位中的HA突變具有專一性。CDR-H1的靭性將有利於接受在HA莖柄部之抗原決定位中較不具保守性的膜遠端區塊(表1)。
實施例3 全面檢測F10之CDR-H3胺基酸殘基可發現Tyr98及Pro96可輔助CDR-H2辨識保守性HA莖柄部抗原決定位
以複雜度大於109之F10-CDRH3抗體庫檢測F10模板中位於CDR-H3之H96至H100E之間胺基酸殘基的分佈；基於噬菌體抗體庫的製備方法，隨機挑選之F10-CDRH3 scFv不具任何顯著的胺基酸偏好(結果未顯示)。本研究旨在發現全面最佳化的CDR-H3胺基酸序列，其可與IGHV1-69-bnAb的HA抗原決定位接觸。再次地，由F10-CDRH3抗體庫篩選之scFv變異株的最大結合親和力較F10 scFv的最大結合親和力高數倍；數個scFv變異株對BS/07及CA/09 H1N1病毒的中和效力則較F10 scFv的中和效力略高。由F10-CDRH3抗體庫篩選之201個scFv變異株的結合親和力與其對相對流感病毒的中和效力並無明顯的線性相關性(r2<0.1)；在考量實驗誤差條件下，對二種流感病毒的中和效力最多僅具些微相關性(r2=0.41)(結果未顯示)。共分析201個scFv變異株。表5總結了代表性scFv變異株的胺基酸序列及結合/中
和數據。圖3A及3B總結了具高結合親和力及高中和效力之scFv變異株的胺基酸序列，其中標準化結合親和力分數大於0.3(n=140，圖3A)，而標準化中和效力分數亦大於0.3(n=77，圖3B)。推測保守性胺基酸殘基位置Tyr98的芳香族側鏈可藉由接觸HA2之Thr41及Ile45的脂肪族原子(aliphatic atom)來增加CDR-H2辨識HA莖柄部之高度保守性抗原決定位。Pro96亦為高度保守性胺基酸殘基。該胺基酸殘基不會與抗原接觸，且可支持CDR-H3環狀結構的剛性(rigidity)，該CDR-H3環狀結構進而支撐Tyr98側鏈的接觸位置。已排除Pro96及Tyr98的胺基酸偏好是由噬菌體抗體庫的製備偏好(結果未顯示)及結構偏好所導致。其他CDR-H3位置不會與HA接觸，因此未預期對其胺基酸偏好進行明確定義。然而，發明人意外地發現即使抗原辨識通常需要CDR-H3中的雙硫鍵，F10之雙硫鍵Cys100-Cys100E卻不具有保守性。該結果指出，只要關鍵胺基酸殘基Tyr98能與相對之抗原決定位正確接觸(或許需要Pro96的輔助)，F10 CDR-H3局部結構亦可具有靭性，藉以容納替代性胺基酸序列。
實施例4 選自F10-CDRH1~3抗體庫之與H1 HA結合的scFv會結合至H1 HA，而不會與H3 HA或其他人類抗原產生交叉結合反應
選自抗體庫F10-CDRH1~3之scFv的標準化結合親和力與對CA/09 H1 HA及BS/07 H1 HA的結合具有顯著的線性相關性，然而改善對二種病毒的親和力不必然與增加對二種病毒的中和效力相關。圖4A闡述了隨機選自三種合成抗體庫之scFv對二種H1 HA的標準化結合親和力具有顯著的相關性；該結果解釋了對二種H1 HA之標準化結合親和力的比值主要是集中在1~2(圖4B，y軸)。然而，對二種流感病毒株之標準化中和效力的比值則分佈於0到2之間(圖4B，x軸)，該結果指出改善一抗體對一病毒株的結合親和力及中和效力可能會改善對另一病毒株的結合親和力，卻不必然能改善對其的中和效力。
選自F10-CDRH1~3合成抗體庫的scFv僅對H1 HA具有專一性。合成的抗體不是由免疫系統負向挑選(negative selection)而得，因此可與不相關的抗原產生交叉反應。為探討選自F10-CDRH1~3 scFv抗體庫之scFv的交叉反應，發明人分別由表4、2
及5隨機挑選10、6及14個scFv，並檢測該些scFv對H1 HA、H3 HA、其他不同人類蛋白及DNA的結合程度。在篩選出的scFv中，沒有任何scFv會與CA/09 H1 HA及BS/07 H1 HA以外的抗原結合(結果未顯示)，該結果指出選自F10-CDRH1~3 scFv抗體庫的scFv僅對H1 HA具有專一性。該專一性與起始模板F10的專一性一致，其僅能與第I群HA(例如H1 HA)結合，而不會與第II群HA(例如H3 HA)結合。由於是利用固定之BS/07 H1 HA來篩選具代表性之scFv，因此該些scFv對BS/07 H1 HA的平均結合親和力較對CA/09 H1 HA的平均結合親和力高。
實施例5 由與BS/07 H1 HA結合之抗體設計的抗體庫可用以研發具有潛力之中和性抗體，其係能標的至CA/09 H1 HA上相對莖柄部抗原決定位
由上述結果(圖1-4)可知，一抗體庫設計旨在製備具專一性及最佳化之中和性抗體，藉以標的至不同病毒株之H1 HA的相對莖柄部抗原決定位。圖6闡述了F10-CDRH123抗體庫設計，其中CDR-H2是固定Ser52、Pro52A、Met53及Phe54等胺基酸殘基(胺基酸序列編號：72)及固定CDR-H3的Pro96及Tyr98等胺基酸殘基以最佳化結合至位於HA莖柄部之高度保守性膜近端抗原決定位區塊。Met53及Phe54是主要與HA抗原決定位接觸的胺基酸殘基(圖1A及1B)。Ser52不會與抗原接觸，但羥側鏈會與Tyr98的框架羧基形成氫鍵，藉以穩定核心抗原結合位置的結構。IGHV1-69
胚原基因中的Pro52A，其與維持CDR-H2環狀結構的剛性相關。固定Phe29以穩定CDR-H1第I型規範結構；固定Pro30以與位於HA莖柄部之主要為疏水性的膜遠端抗原決定位區塊作用，並減少與抗原決定位結合後CDR-H1環狀結構之構形熵損失(conformational entropy penalty)；固定F32以增加與H1 HA之膜遠端抗原決定位的疏水性胺基酸殘基作用。推測CDR-H1中H27、H28、H31位置的胺基酸殘基會與較不具保守性之膜遠端抗原決定位接觸，因此以簡併密碼子NNK使其產生多樣性。基於與固定胺基酸殘基之位置相鄰且可能與HA莖柄部之抗原決定位進行交互作用(即使僅為些微作用)，亦使其他未固定位置之胺基酸殘基產生多樣性。此外，將F10-CDRH123抗體庫中的CDR-H3長度固定為12個胺基酸殘基(如CR6261及CR9114)，而不加入雙硫鍵(如F10)。推測雙硫鍵不會影響抗原辨識，如上述結果所述(圖3A及3B)。F10-CDRH123抗體庫旨在研發全面最佳化胺基酸序列，意圖辨識不同病毒株之HA中的IGHV1-69-bnAb之抗原決定位。
建構由噬菌體呈現的F10-CDRH123抗體庫(圖6)，該抗體庫的複雜度大於109，且基於噬菌體抗體庫的製備方法，該抗體庫不具有顯著的偏好(結果未顯示)。檢測抗體庫以分析抗CA/09 H1N1流感病毒的中和性抗體。設計實驗以測試由一病毒株之H1 HA(BS/07，圖1~3)設計的抗體庫能同樣應用於研發可抗其他病毒株之H1 HA(在本研究為CA/09)的最佳化結
合抗體及中和性抗體。在經過三輪噬菌體呈現篩選-擴增循環後，可發現超過1000個scFv，其係能結合至固定的CA/09 H1 HA。所有篩選出的scFv皆可與F10 scFv競爭結合至HA，意即該些scFv會結合至IGHV1-69-bnAb之共通的抗原決定位。在篩選出的scFv中，大部分scFv的結合親和力會較F10 scFv的結合親和力高數倍。不像由F10-CDRH1~3抗體庫所得到的結果，由F10-CDRH123抗體庫得到之scFv變異株的結合親和力與其抗CA/09 H1N1流感病毒的中和效力具有特定程度的相關性(r2=0.39,p值=10-29)，該結果指出位於關鍵CDR位置的恒定性胺基酸殘基可部分減少構形的不確定性。相較於圖1-3所述之些微改善中和效力，大部分篩選出之scFv變異株對CA/09 H1N1病毒的中和效力會優於F10 scFv對CA/09 H1N1病毒的中和效力(結果未顯示)。該些結果指出，需同時使所有CDR胺基酸殘基產生多樣性以協同性地最佳化結合親和力及中和效力。
進一步檢測經純化之scFv的EC50及IC50；如表6所示，由於表現及純化scFv(材料及方法)以及測量EC50及IC50(材料及方法)需要相當多的人力及資源，因此僅檢測少量scFv的EC50及IC50。然而，隨機挑選之scFv對CA/09 H1 HA的EC50及對CA/09 H1N1病毒的IC50具有些微的相關性(表6)。
圖5A及5B總結了篩選出之scFv變異株的胺基酸序列資料，其中標準化結合親和力分數大於0.3(n=976，圖5A)，而標準化中和效力分數亦大於0.3(n=750，圖5B)。共分析1049個scFv變異株。表7總結了代表性scFv變異株的胺基酸序列及結合/中和數據。基於與膜遠端疏水性抗原決定位區塊的疏水性作用，推測位於H27及H31的胺基酸殘基為中度保守性疏水性胺基酸殘基。H100為Pro的偏好與之前實驗結果相似。與圖1-3所述結果相似，在圖5A及5B中，其餘CDR位置的胺基酸序列偏好最多具有中和保守性，該結果確認了該些位置的胺基酸類型並未侷限為抗原辨識的特定類型。
由選自F10-CDRH123之scFv變異株中篩選最佳的scFv以建構IgG，依據H1N1病毒株的不同，製備的IgG對流感病毒可增加3-7倍的中和效力。在所有篩選的scFv中，H123#437 scFv(以粗體標示於表6)具有最佳的標準化結合親和力(5.2±0.5)及第二高的標準化中和效力(3.5±0.9)。利用H123#437 scFv建構之H123#437 IgG中和CA/09 H1N1感染的IC50為每毫升269±4奈克，其效力約為F10 IgG對相同H1N1病毒感染中和效力(IC50=每毫升810±110奈克)的3倍，該結果確認了預期改善H123#437 scFv的中和效力。此外，H123#437 IgG中和BS/07 H1N1感染的IC50為每毫升232±1奈克，該效力約為F10 IgG對相同H1N1病毒感染中和效力(IC50=每毫升1847±311奈克)的7倍。透過自然親和力成熟，F10 IgG已具有次奈米-M親和力，因此該改善係為顯著的。該些結果指出，可藉由修飾關鍵CDR胺基酸殘基附近的
胺基酸序列來進一步使對病毒株之抗原HA具有專一性之F10的中和效力達到最佳化；不同的H1N1病毒株需要不同周邊胺基酸的組合，以微調其中和效力及結合親和力。
F10 IgG及H123#437 IgG對BS/07 H1 HA及CA/09 H1 HA的結合親和力約為相同。EC50為每毫升2.5到2.9奈克。以BIAcore測量F10 IgG結合至CA/09 H1 HA的解離常數為46pM(kon=2.40×105(1/Ms)；koff=1.11×10-5(1/s))，該數值略優於H123#437 IgG結合至相同抗原的解離常數(KD=91pM；kon=3.86×105(1/Ms)；koff=3.52×10-5(1/s))。雖然在實驗誤差範圍內KD測量結果與EC50測量結果一致，但該些結果與以下測量數據不相符：H123#437 scFv之標準化結合親和力為F10 scFv之標準化結合親和力的5倍。位於scFv及IgG之VH區域的微小結構差異會造成H123#437 IgG的koff值較預期快數倍。
結果指出一對對二病毒株之HA具有相似結合親和力的中和性抗體對二種對應之流感病毒株可具有不同的中和效力。二抗體(F10 IgG及H123#437 IgG)的胺基酸序列具有高度相關性，且會以相似之EC50結合至CA/09 H1 HA及BS/07 H1 HA上相同的抗原決定位，H123#437 IgG對二流感病毒株的中和效力(IC50)卻為F10 IgG之3-7倍，該結果指出雖然結合親和力及中和效力具有某種程度的正向線性相關性，
但親和力-功能相關性並無共通應用性，即僅使親和力達到最佳化不必然可產生功能性最佳化之IgG抗體。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
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<160> 73
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> CDR-H1資料庫
<220>
<221> variation
<222> 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26,28,29,31,32,34,35
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 1
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> CDR-H2資料庫
<220>
<221> variation
<222> 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 2
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> CDR-H3資料庫
<220>
<221> variation
<222> 4,5,7,8,10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26,28,29,31,32
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> CDR-H1
<220>
<221> variation
<222> 4,5,7,8,16,17
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 4
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> CDR-H2
<220>
<221> variation
<222> 13,14,16,17
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 5
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> CDR-H3
<220>
<221> variation
<222> 4,5,10,11,13,14,16,17,19,20
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 6
<210> 7
<211> 360
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> F10模板
<400> 7
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> 模板_1引子
<400> 8
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> F10-CDRH1_1引子
<220>
<221> variation
<222> 23,24,26,27,29,30,32,33,35,36,38,39,41,42,44,45,47,48
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 9
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> 模板_2引子
<400> 10
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> F10-CDRH2_1引子
<220>
<221> variation
<222> 22,23,25,26,28,29,31,32,34,35,37,38
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 11
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> 模板_3引子
<400> 12
<210> 13
<211> 75
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> F10-CDRH3_1引子
<220>
<221> variation
<222> 24,25,27,28,30,31,33,34,36,37,39,40,42,43,45,46,48,49,51,52
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 13
<210> 14
<211> 64
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> F10-CDRH123_1引子
<220>
<221> V_region
<222> 28,29,31,32,40,41
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 14
<210> 15
<211> 55
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> F10-CDRH123_2引子
<220>
<221> variation
<222> 26,27,29,30
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 15
<210> 16
<211> 62
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> F10-CDRH123_3引子
<220>
<221> variation
<222> 23,24,29,30,32,33,35,36,38,39
<223> /note="n is any of A,T,C,or G"
<400> 16
<210> 17
<211> 43
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> gp67訊息胜肽
<400> 17
<210> 18
<211> 45
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> C端凝血酶切割位置、三聚合域及His6-標記蛋白
<400> 18
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> Avitag寡胜肽
<400> 19
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> 正向VL引子
<400> 20
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> 反向VL引子
<400> 21
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> 正向VH引子
<400> 22
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> 反向VH引子
<400> 23
<210> 24
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H2-143變異株
<400> 24
<210> 25
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H2-165變異株
<400> 25
<210> 26
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-143變異株
<400> 26
<210> 27
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H2-26變異株
<400> 27
<210> 28
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H2-55變異株
<400> 28
<210> 29
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H2-181變異株
<400> 29
<210> 30
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H2-167變異株
<400> 30
<210> 31
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H2-63變異株
<400> 31
<210> 32
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-142變異株
<400> 32
<210> 33
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H2-64變異株
<400> 33
<210> 34
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H1-62變異株
<400> 34
<210> 35
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-141變異株
<400> 35
<210> 36
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-132變異株
<400> 36
<210> 37
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H1-74變異株
<400> 37
<210> 38
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H1-82變異株
<400> 38
<210> 39
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H1-81變異株
<400> 39
<210> 40
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H1-80變異株
<400> 40
<210> 41
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H1-83變異株
<400> 41
<210> 42
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-136變異株
<400> 42
<210> 43
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-139變異株
<400> 43
<210> 44
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-268變異株
<400> 44
<210> 45
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-48變異株
<400> 45
<210> 46
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-188變異株
<400> 46
<210> 47
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-172變異株
<400> 47
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-49變異株
<400> 48
<210> 49
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-61變異株
<400> 49
<210> 50
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-205變異株
<400> 50
<210> 51
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-182變異株
<400> 51
<210> 52
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-219變異株
<400> 52
<210> 53
<211> 124
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H3-186變異株
<400> 53
<210> 54
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H123#437變異株
<400> 54
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 1101-178變異株
<400> 55
<210> 56
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 3rd_0.5_4_09H
<400> 56
<210> 57
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 3rd_0.5_2_2A
<400> 57
<210> 58
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 1101-181
<400> 58
<210> 59
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> H123#425
<400> 59
<210> 60
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 3rd_1-4-B-02
<400> 60
<210> 61
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 1101-150
<400> 61
<210> 62
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 1026B52
<400> 62
<210> 63
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 1026B77
<400> 63
<210> 64
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 1101-170
<400> 64
<210> 65
<211> 120
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> F10 template
<400> 65
<210> 66
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 1026R66
<400> 66
<210> 67
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 3rd_0.5-4-09H
<400> 67
<210> 68
<211> 121
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 3rd_0.5-2-2A
<400> 68
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 保守性胺基酸序列-1
<400> 69
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> 保守性胺基酸序列-2
<400> 70
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> F10 CDR-H2胺基酸序列
<400> 71
<210> 72
<211> 4
<212> PRT
<213> 人為序列
<220>
<223> F10-CDRH123 CDR-H2
<400> 72
<210> 73
<211> 12
<212> DNA
<213> 人為序列
<220>
<223> codon for Stop-Stop-E-F
<400> 73
Claims (12)
- 一種由噬菌體呈現之單鏈變異片段(single-chain variable fragment,scFv)抗體庫，其係包含複數個由一噬菌體所表現的scFv，其中各scFv之重鏈包含：一第一互補決定區域(complementarity determining region,CDR)，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第21-35個胺基酸殘基，且係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得，一第二CDR，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第49-60個胺基酸殘基，且係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得，以及一第三CDR，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第99-112個胺基酸殘基，且係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
- 如請求項1所述之由噬菌體呈現之scFv抗體庫，其中該噬菌體是M13噬菌體或T7噬菌體。
- 如請求項1所述之由噬菌體呈現之scFv抗體庫，其中該複數個scFv之至少一scFv對流感病毒的血球凝集素具有結合親和力及專一性。
- 一種由請求項1所述之由噬菌體呈現之 scFv抗體庫於活體外篩選一由噬菌體呈現之scFv的方法，其中該由噬菌體呈現之scFv對一蛋白抗原具有高親和力及專一性，該方法包含：(a)使請求項1所述之由噬菌體呈現之scFv抗體庫與蛋白抗原進行反應，其中該由噬菌體呈現之scFv抗體庫包含複數個由噬菌體呈現之scFv；(b)對步驟(a)之產物投予一酸處理，藉以製備複數個由噬菌體呈現之scFv，其於酸處理前能分別與該蛋白抗原結合；(c)對步驟(b)製備之複數個由噬菌體呈現之scFv投予一鹼處理；以及(d)至少重複一輪步驟(b)及(c)，每次使用前一輪步驟(c)之產物作為噬菌體抗體庫，將其與該蛋白抗原進行反應，直到得到對該蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之由噬菌體表現的scFv。
- 如請求項4所述之方法，其中該蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素。
- 一種由請求項1所述之由噬菌體呈現之scFv抗體庫篩選之由噬菌體呈現的scFv，其重鏈包含：一第一CDR，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第21-35個胺基酸殘基，且係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得， 一第二CDR，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第49-60個胺基酸殘基，且係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得，以及一第三CDR，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第99-112個胺基酸殘基，且係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
- 一種由請求項1所述之由噬菌體呈現之scFv抗體庫於活體外製備一重組抗體的方法，其中該重組抗體對一蛋白抗原具有結合親和力及專一性，該方法包含：(a)使請求項1所述之由噬菌體呈現之scFv抗體庫與蛋白抗原進行反應，其中該由噬菌體呈現之scFv抗體庫包含複數個由噬菌體呈現之scFv；(b)篩選會表現對該蛋白抗原具有結合親和力及專一性之scFv的噬菌體；(c)將步驟(b)篩選之由噬菌體呈現的scFv表現為可溶形式；(d)由步驟(c)篩選對該蛋白抗原具有最高結合親和力及專一性之可溶性scFv；(e)萃取一噬質體DNA，其係對應於步驟(d)所篩選之可溶性scFv；(f)以步驟(e)之噬質體DNA作為模板，利用PCR分別擴增一用以編碼一第一多肽的第一核酸序列，其中該第一多肽包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；以及 一用以編碼一第二多肽的第二核酸序列，其中該第二多肽包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；(g)分別將該第一及第二核酸序列插入一包含一第三及一第四核酸序列的表現載體，其中該第三核酸序列是用以編碼一包含一免疫球蛋白之重鏈恒定區域的第三多肽，且該第四核酸序列是用以編碼一包含該免疫球蛋白之輕鏈恒定區域的第四多肽；以及(h)將步驟(g)之包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至一宿主細胞中，以製備對該抗原蛋白具有專一性的重組抗體。
- 如步驟7所述之方法，其中該第一核酸序列是位於該第三核酸序列的上游，且該第二核酸序列是位於該第四核酸序列的上游。
- 如步驟7所述之方法，其中該免疫球蛋白是選自由免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白D(immunoglobulin D,IgD)、免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)及免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)所組成的群組。
- 如步驟7所述之方法，其中該宿主細胞是一哺乳動物細胞。
- 如步驟7所述之方法，其中該蛋白抗原是流感病毒的血球凝集素。
- 一種由請求項7所述方法製備之重組抗體於製備一藥物的用途，其中該藥物可用以治療或預防一個體體內流感病毒感染，其中該重組抗體之重鏈包含：一第一CDR，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第21-35個胺基酸殘基，且係由序列編號：1之核苷酸序列編碼而得，一第二CDR，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第49-60個胺基酸殘基，且係由序列編號：2之核苷酸序列編碼而得，以及一第三CDR，其包含序列編號：47、50或52之胺基酸序列的第99-112個胺基酸殘基，且係由序列編號：3之核苷酸序列編碼而得。
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Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2016
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- 2016-08-10 US US15/232,819 patent/US10336815B2/en active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 2009年02月22日，Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses，Sul J，Nat Struct Mol Biol. 2009 Mar;16(3):265-73. * |
| 2014年05月，Molecular signatures of hemagglutinin stem-directed heterosubtypic human neutralizing antibodies against influenza A viruses，Avnir Y，PLoS Pathog. 2014 May 1;10(5):e1004103 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US20170044239A1 (en) | 2017-02-16 |
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