JP2018505677A - インフルエンザヘマグルチニンに対する結合分子及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明において用いられるとおりの用語の一部の定義を以下に示す。
本発明の第1の態様において、系統発生学的グループ2の2つの異なる亜型のHAを含む少なくとも2つのA型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン(HA)との特異的結合能を有する新規シングルドメイン抗体(sdAb)、即ち、少なくとも2つの異なるA型インフルエンザウイルス株であって、系統発生学的グループ2の2つの異なるHA亜型のHAを含む株のヘマグルチニン(HA)との特異的結合能を有するsdAbが提供される。加えて、系統発生学的グループ1の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株のHAとの結合能及び系統発生学的グループ2の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株のHAとの結合能を有するsdAbが提供される。更には、少なくとも1つのB型インフルエンザウイルス株のHAとの特異的結合能を有するsdAbが提供される。系統発生学的グループ2のA型インフルエンザウイルス株の2つの異なる亜型のHAとの特異的結合能を有するか、又は系統発生学的グループ1(H1、H2、及び/又はH5亜型のHAを含むインフルエンザウイルスなど)と系統発生学的グループ2(H3、H7及び/又はH10亜型のHAを含むインフルエンザウイルスなど)との両方のA型インフルエンザウイルス株のHAとの結合能を有するシングルドメイン抗体については、これまで記載されたことがない。加えて、B型インフルエンザウイルスのHAとの特異的結合能を有するsdAbについても依然として記載されたことがない。
配列番号227、228及び229から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号230、231及び232から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号233、234及び235から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号236、237及び238から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号239、240及び241から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号242、243及び244から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号245、246及び247から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号248、249、及び250から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号251、252及び253から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号254、255及び256から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号257、258及び259から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号260、261及び262から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号263、264及び265から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号266、267及び268から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号269、270及び271から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号272、273及び274から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号275、276及び277から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号278、279及び280から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号281、282及び283から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号284、285及び286から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号287、288及び289から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号290、291及び292から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号293、122及び123から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号124、125及び126から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号127、128及び129から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号130、131及び132から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号133、134及び135から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号136、137及び138から選択されるCDR配列の1つ以上;又は
配列番号139、140及び141から選択されるCDR配列の1つ以上
を含む。
a)配列番号227のCDR1領域、配列番号228のCDR2領域、及び配列番号229のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
b)配列番号230のCDR1領域、配列番号231のCDR2領域、及び配列番号232のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
c)配列番号233のCDR1領域、配列番号234のCDR2領域、及び配列番号235のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
d)配列番号236のCDR1領域、配列番号237のCDR2領域、及び配列番号238のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
e)配列番号239のCDR1領域、配列番号240のCDR2領域、及び配列番号241のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
f)配列番号242のCDR1領域、配列番号243のCDR2領域及び配列番号244のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
g)配列番号245のCDR1領域、配列番号245のCDR2領域、及び配列番号247のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
h)配列番号248のCDR1領域、配列番号249のCDR2領域、及び配列番号250のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
i)配列番号251のCDR1領域、配列番号252のCDR2領域、及び配列番号253のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
j)配列番号254のCDR1領域、配列番号255のCDR2領域、及び配列番号256のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
k)配列番号257のCDR1領域、配列番号258のCDR2領域、及び配列番号259のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
l)配列番号260のCDR1領域、配列番号261のCDR2領域及び配列番号262のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
m)配列番号263のCDR1領域、配列番号264のCDR2領域、及び配列番号265のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
n)配列番号266のCDR1領域、配列番号267のCDR2領域、及び配列番号268のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
o)配列番号269のCDR1領域、配列番号270のCDR2領域、及び配列番号271のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
p)配列番号272のCDR1領域、配列番号273のCDR2領域、及び配列番号274のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
q)配列番号275のCDR1領域、配列番号276のCDR2領域、及び配列番号277のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
r)配列番号278のCDR1領域、配列番号279のCDR2領域及び配列番号280のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
s)配列番号281のCDR1領域、配列番号282のCDR2領域、及び配列番号283のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
t)配列番号284のCDR1領域、配列番号285のCDR2領域、及び配列番号286のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
u)配列番号287のCDR1領域、配列番号288のCDR2領域、及び配列番号289のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
v)配列番号290のCDR1領域、配列番号291のCDR2領域、及び配列番号292のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
w)配列番号293のCDR1領域、配列番号122のCDR2領域、及び配列番号123のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
x)配列番号124のCDR1領域、配列番号125のCDR2領域及び配列番号126のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
y)配列番号127のCDR1領域、配列番号128のCDR2領域、及び配列番号129のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
z)配列番号130のCDR1領域、配列番号131のCDR2領域、及び配列番号132のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
aa)配列番号133のCDR1領域、配列番号134のCDR2領域、及び配列番号135のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
bb)配列番号136のCDR1領域、配列番号137のCDR2領域、及び配列番号138のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;及び
cc)配列番号139のCDR1領域、配列番号140のCDR2領域、及び配列番号141のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される。
a)配列番号275のCDR1領域、配列番号276のCDR2領域、及び配列番号277のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
b)配列番号284のCDR1領域、配列番号285のCDR2領域、及び配列番号286のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
c)配列番号124のCDR1領域、配列番号125のCDR2領域及び配列番号126のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
d)配列番号127のCDR1領域、配列番号128のCDR2領域、及び配列番号129のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
e)配列番号263のCDR1領域、配列番号264のCDR2領域、及び配列番号265のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;及び
f)配列番号133のCDR1領域、配列番号134のCDR2領域、及び配列番号135のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される。
a)配列番号275のCDR1領域、配列番号276のCDR2領域、及び配列番号277のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
b)配列番号284のCDR1領域、配列番号285のCDR2領域、及び配列番号286のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
c)配列番号124のCDR1領域、配列番号125のCDR2領域及び配列番号126のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
d)配列番号127のCDR1領域、配列番号128のCDR2領域、及び配列番号129のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;
e)配列番号263のCDR1領域、配列番号264のCDR2領域、及び配列番号265のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体;及び
f)配列番号133のCDR1領域、配列番号134のCDR2領域、及び配列番号135のCDR3領域を含むシングルドメイン抗体
からなる群から選択される少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つのsdAbを含む。
配列番号299のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号300のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号301のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号302のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号303のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号305のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号306のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号307のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号308のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号309のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号310のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号311のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号312のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号313のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号315のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号315のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号316のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号317のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号318のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号319のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号106のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号317のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号320のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号321のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号322のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号323のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号324のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号325のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号326のアミノ酸配列を含む1本の鎖、配列番号327のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号328のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号329のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号330のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号331のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号332のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号333のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号334のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号335のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号336のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号337のアミノ酸配列を含む1本の鎖;及び
配列番号338のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号339のアミノ酸配列を含む1本の鎖
からなる群から選択される。
配列番号301のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号302のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号310のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号311のアミノ酸配列を含む1本の鎖;
配列番号322のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号323のアミノ酸配列を含む1本の鎖;及び
配列番号330のアミノ酸配列を含む1本の鎖及び配列番号331のアミノ酸配列を含む1本の鎖
からなる群から選択される。
重鎖抗体依存性免疫応答の誘導を目的として、表1に記載するスキームに従い4匹のラマ(ラマ・グラマ(Lama glama))をフロイントアジュバントの存在下でインフルエンザウイルス抗原(市販のワクチンInflexal(登録商標)及び組換えタンパク質)によって免疫した。
Ficoll−Paque plus(GE Healthcare)を製造者の指示に従い使用して新鮮血液から末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。RT−PCRの出発物質としてPBMCから抽出した全RNAを用い、VHHコード遺伝子断片を増幅した。これらの断片をSfiI及びNotI制限部位を用いてM13ファージミドベクターpDV−LucStuffer(pDV−C06由来;国際公開第02/103012号パンフレットに記載されるとおり)にクローニングして、VHHドメインとM13ファージのpIIIタンパク質との融合物(これらの2つのタンパク質間にはアンバー終止コドンが含まれる)を作成した。ライゲートしたベクターをTG−1菌(Agilent)に形質転換し、100〜150個の単一コロニーをPCRで分析して各ライブラリの品質を決定した。挿入頻度及び完全性は典型的には95%超であった。構築したライブラリの特性を表2に示す。CTヘルパーファージを本質的に記載(国際公開第02/103012号パンフレット)のとおり使用して個々の動物からのファージライブラリを調製し、滅菌ろ過し、選択に使用した。本明細書に示されるとおり、全ての免疫ラマから複合ファージライブラリを作成することができた。
上記に記載したVHHファージディスプレイライブラリ、並びに本質的に米国特許第6,265,150号明細書、国際公開第98/15833号パンフレット、及び「Phage display,A Laboratory Manual」,T.Kuhlman,2001(これらは参照によって本明細書に援用される)に記載されるとおりの一般的なファージディスプレイ技術及びMABSTRACT(登録商標)技術を使用して、抗体断片を選択した。更に、本発明では、国際公開第02/103012号パンフレット(参照により本明細書に援用される)に記載されるとおりの方法及びヘルパーファージを使用した。
SdAb含有ペリプラズム抽出物を、哺乳類細胞のインフルエンザウイルス感染を防ぐそれらの能力に関してウイルス中和アッセイ(VNA)で分析した。そのため、MDCK細胞(ATCC、カタログ番号CCL−34)を96ウェルプレートに播種し(4E+04細胞/ウェル)、4時間後にインフルエンザウイルス(100TCID50/ウェル)の混合物と共にインキュベートし、ペリプラズム抽出物(15μL/ウェル又はその希釈物)を滅菌ろ過した。37℃及び10%CO2で3日間インキュベートした後、細胞培養上清中の新しく産生されたウイルスの量をV底プレートにおいて1%シチメンチョウ赤血球(TRBC)の血球凝集によって評価した(中和sdAbは上清中のウイルス負荷を低下させてTRBCの血球凝集の防止をもたらす)。ペリプラズム抽出物に対するsdAb入力濃度は未知であるため、試料はウイルス中和に関して陽性又は陰性のスコア化のみ行った。複数のインフルエンザ株を並行して試験して、好ましくは広域中和性のsdAbを選択した(表3aを参照のこと)。
関連性のあるsdAb配列を、Expi293懸濁細胞における使用に好適な標準的な真核細胞発現ベクターにクローニングした。産生ランは5〜6日間実施した。発現したsdAbを細胞培養培地に分泌させる。培地からグルコースを完全に枯渇させる前に、培養上清を回収し、遠心し、滅菌ろ過した。ニッケルイオンを含有する抗His樹脂(cOmplete HIS−Tagカラム;Roche、カタログ番号06781543001)を使用してsdAbを精製し、高濃度イミダゾール(300mM)を使用して溶出させた。溶出物を脱塩カラム(HiPrep 26/10脱塩カラム、GEHC カタログ番号17−5087)を使用してその最終製剤化緩衝液(20mM NaAc、75mM NaCl、5%スクロースpH5.5)と緩衝液交換し、Amicon Ultra 3Kスピンフィルタ(Millipore、カタログ番号UFC900324)を使用して濃縮した。濃度を決定した後、純sdAbアリコートをSDS−PAGE、HPSEC、SEC−MALS及びエンドトキシン測定によって更に特徴付けた。全てのコンストラクトについて、600mLのトランスフェクション容積から5mgの精製sdAbの最小収量が得られた。95%を超える単量体含有量及び正しい分子質量を有するsdAbバッチのみを更なる特徴付けに使用した。
インフルエンザウイルス中和範囲
実施例4に記載したとおりのウイルス中和アッセイを用いてインフルエンザウイルス株の大規模パネルで様々な濃度を調べることにより、精製sdAbの中和力価を評価した。力価は表4〜表7に報告する。sdAbは、その活性に基づき、A型インフルエンザグループ1(H1、H5、H2、H6、H11、H9、H8、及びH12ウイルスが含まれる)中和分子、A型インフルエンザグループ2(H3、H4、H14、H7、及びH10ウイルスが含まれる)中和分子、及びB型インフルエンザ(山形、ビクトリア、及び先行(Predecessor)/旧型(Old)ウイルスを含む)中和分子に分けることができる。興味深いことに、sdAbの一部は、グループ1及びグループ2の両方のA型インフルエンザウイルスの中和能を有した(表6)。
バイオレイヤー干渉法プラットフォームOctet Red384(Forte Bio,Pall)を使用して、特殊なセンサーの表面上における高速のディップ・アンド・リード法でタンパク質間相互作用の無標識リアルタイム結合解析を行った。機能化されたセンサーの先端で検出された質量のシフトから、組換えHAに対するsdAbの結合を調べることが可能であった。所定の濃度範囲にわたって実施することにより、全般的な結合のみならず、sdAbのKDも決定することができた。
HA上の既知のエピトープを用いたsdAb自体の間での競合及び十分に特徴付けられているモノクローナル抗体(IgG)を含めた他のHA結合タンパク質との競合に関してsdAbをスクリーニングする結合競合試験を設計した。競合が観察された場合、両方の分子がHAの表面にある同様の又は少なくとも重複するエピトープに結合すると考えられる。
一般的な種類のHAアッセイである血球凝集抑制アッセイを用いることにより、sdAbがHA頭部領域の上部近傍に結合して標的細胞、ここでは赤血球上のシアル酸受容体との相互作用を物理的に遮断する能力を試験した。十分な濃度のsdAbがシアル酸との相互作用を遮断する場合、「凝集反応」(赤血球が一体に集塊化する)が抑制される。sdAbの段階希釈物をPBS(25μL/ウェル)に調製し、25μLの8HAU/50μLウイルス希釈物を添加して混合した。37℃で1時間インキュベートした後、50μLの1%シチメンチョウ赤血球(TRBC)を添加して混合した。室温で30〜60分間インキュベートした後、凝集パターンを目視で(涙滴形の形成)スコア化する。4レプリケートの試料及び陽性対照抗体に加えて、入力ウイルスの逆滴定を取る。血球凝集抑制価、TRBC上のシアル酸受容体とのウイルスの相互作用が全て遮断されるときの最小濃度を、スピアマン−カーバーの式を用いて計算した。結果は表12に示す。全てのA型インフルエンザ結合sdAbが陰性であった(即ちHI価>50μg/mLを有する)。
茎部結合sdAbが、それらの競合抗体と同様に、HAの立体構造変化を防止し、それによりウイルス融合及び続く感染を阻止することを立証するため、低pH処理後のHA頭部(HA1)の存在及びHA1とHA2との間を結び付けているジスルフィド架橋の還元を計測するアッセイが開発されている(Brandenburg et al.2013)。
選択され且つ特徴付けられた本発明に係るsdAbの配列を表14に掲載する。CDR領域の配列を表14aに掲載する。
sdAbホモ及びヘテロ二量体の生成
sdAbホモ及びヘテロ二量体を作成するため、それらのsdAbコード配列を共にクローニングするか、或いは完全長遺伝子を直接合成し(Genscript)、真核細胞発現ベクターにライゲートした。sdAb二量体コンストラクトでは、第1のsdAb(前)のC末端を第2のsdAb(後ろ)のN末端に連結した。異なる長さ(10、15、35、及び57アミノ酸)のリンカー配列はアミノ酸グリシン(G)及びセリン(S)からなる。共にクローニングすると、第1のsdAbに直接続く制限部位(NotI)が3つの更なるアラニン(A)残基をもたらす。リンカー配列を表15に示し、sdAb二量体の完全なアミノ酸配列を表16(A型インフルエンザ標的化コンストラクト)及び表17(B型インフルエンザ標的化コンストラクト)に示す。sdAbの位置(前又は後ろ)は、コンストラクトにおいて、最適な組み合わせが実現するように変えた。発現及び精製は実施例5に記載されるとおり実施した。
精製sdAbホモ及びヘテロ二量体を実施例6に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、sdAb構成単位と比較したときに効力及び範囲の向上が示された。結果は、A型インフルエンザ中和二量体について表18に示し、B型インフルエンザ中和二量体について表19に示す。
精製sdAbホモ及びヘテロ二量体を実施例6に記載されるとおりの結合アッセイで試験し、sdAb構成単位と比較したときに結合強度(アビディティ)の向上が示された。結果は、A型インフルエンザ中和二量体について表20に示す。
sdAb多量体の生成
sdAb多量体(三量体、四量体及び五量体)を作成するため、sdAbコード配列を共にクローニングするか、或いは完全長遺伝子を直接合成し(Genscript)、真核細胞発現ベクターにライゲートした。異なる長さ(10又は35アミノ酸)のリンカー配列はアミノ酸グリシン(G)及びセリン(S)からなる。共にクローニングすると、第1のsdAbに直接続く制限部位(NotI)が3つの更なるアラニン(A)アミノ酸をもたらし、第2のsdAbに直接続く2つの連続する制限部位(PacI及びXhoI)が5つの更なるアミノ酸(LINLE)をもたらす。リンカー配列を表15に示し、sdAb三量体の完全なアミノ酸配列を表23に示し、sdAb四量体及び五量体の完全なアミノ酸配列を表24に示す。コンストラクト内におけるsdAbの位置は、最適な組み合わせが実現するように変えた。発現及び精製は実施例5に記載されるとおり実施した。
精製マルチドメイン抗体を実施例6に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、sdAb構成単位と比較したときに効力及び範囲の向上が示された。結果は、インフルエンザ中和三量体について表25に示し、四量体及び五量体について表26に示す。
無標識バイオレイヤー干渉法を用いることにより、pH7.4におけるマルチドメイン抗体と種々のインフルエンザ株の組換えHA分子との間の結合効力の尺度としての平衡解離定数(KD値)を決定した。KD値は、定常状態におけるMD濃度範囲の結合反応(会合相のプラトーで計測した最後の10秒の平均結合反応)をフィッティングして飽和の50%の濃度を求めることにより決定した(これはKD値(R=Rmax*[sdAb]/(KD+[sdAb]))を反映する)。段階希釈物はデュプリケートで計測しており、幾何平均KD値を表27に報告する。
HA茎部結合sdAb構成単位を含有するマルチドメイン抗体が、それらの競合抗体と同様に、HAの立体構造変化を防ぎ、それによりウイルス融合、続いて感染を阻止することを立証するため、実施例6に記載されるとおりアッセイを実施した。結果は表29に要約する。
Fc融合コンストラクトの生成
sdAb及びsdAb多量体は、抗体のFc領域に融合させることができる。Fc領域は、ヒンジ領域と、続くCH2及びCH3ドメインを含有する抗体、例えばヒトIgG1分子の一部として定義される。種々のFc融合コンストラクトが生成され、HA結合、インビトロ中和及びインビボ有効性に関してsdAb多量体及びモノクローナル抗体と比較されている。
精製Fc含有シングル及びマルチドメイン抗体コンストラクトを実施例6に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、sdAb構成単位と比較したときに効力及び範囲の向上が示された。結果は、インフルエンザ中和Fc融合コンストラクトについて表31〜表37に示す。
ADCC(抗体依存性細胞傷害)レポーターバイオアッセイ(Promega)を用いて、細胞が発現するヒトFcγRIIIa(CD16a)に対する機能的結合を計測した。標的A549細胞をB/ブリスベン/60/2008又はB/フロリダ/04/2006に感染させるか、又はOPTI−MEM I(Gibco)中のLipofectamine 2000(Invitrogen)を使用してH3N2 A/ウィスコンシン/67/2005 HAをコードするプラスミドでトランスフェクトした。24時間後、HAを発現する標的細胞を白色96ウェルプレートに播種し、Fc融合コンストラクトの段階希釈物又はIgG対照抗体と共に30分間インキュベートした。更なる陰性対照として、Fc断片にLALA点突然変異を担持するコンストラクトを使用した。LALA点突然変異(L234A、L235A、Hessel et al.2007により記載されるとおり)は、ヒトFcγ受容体に対する結合の大幅な低下及びADCCの誘導を示す。最後に、標的細胞にジャーカットエフェクターT細胞(FcγRIIIa V158及びNFAT−REルシフェラーゼを安定に発現する)を加えて6時間インキュベートした。ウェルにBio−Gloルシフェラーゼアッセイ基質溶液(Promega)を添加し、ルミネセンスプレートリーダー(Perkin Elmer)でルミネセンス(RLU単位)を計測した。SPSSで標準4パラメータロジスティック非線形回帰モデルを使用してRLUデータをフィッティングした。
A型インフルエンザグループ1シングルドメイン抗体のインビボ有効性
例示的A型インフルエンザグループ1シングルドメイン抗体SD1016、SD1038及びSD1045を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)にSD1016、SD1038又はSD1045を0.5mg/kgの単一用量で鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/プエルトリコ/8/1934−MA(H1N1)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。SD1038及びSD1016の両方の投与は媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした一方、SD1045の投与は生存期間の改善をもたらすのみであった(図2を参照のこと)。
例示的A型インフルエンザグループ2シングルドメイン抗体SD1036、SD1046及びSD1048を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に5mg/kgの用量のSD1046又はSD1048又は2つの用量(0.5mg/kg又は5mg/kg)のSD1036を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/香港/1/1968−MA(H3N2)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、SD1036、SD1046又はSD1048の鼻腔内投与がA/香港/1/1968−MAウイルスの致死的攻撃誘発に対する完全防御を提供することを示している(図3を参照のこと)。
例示的B型インフルエンザシングルドメイン抗体SD1083及びSD1084を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に5mg/kgの単一用量のSD1084又は2つの用量(0.5mg/kg又は5mg/kg)のSD1083を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株B/フロリダ/4/2006で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、sdAb SD1084がB/フロリダ/4/2006による致死的攻撃誘発に対する100%の防御を提供する一方、SD1083は最も高い5mg/kgの用量で部分的防御を提供するのみであることを示している。それより低い用量のSD1083は生存期間の改善をもたらすのみであった(図4)。
例示的A型インフルエンザsdAb SD1038及び例示的A型インフルエンザマルチドメイン抗体MD1211及びMD1212を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に1mg/kgの用量のMD1211又はMD1212又は単独(0.5mg/kg)若しくはSD1036との1:1混合物(総用量=1mg/kg)のいずれかのSD1038を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/プエルトリコ/8/1934−MA(H1N1)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、SD1038、MD1211、MD1212又はSD1038とSD1036との1:1混合物の鼻腔内投与がA/プエルトリコ/8/1934−MAウイルスの致死的攻撃誘発に対する完全防御を提供することを示している。体重曲線は、MD1211及びMD1212の有効性がsdAb(混合物)より優れていることを示している(図5)。
例示的A型インフルエンザsdAb SD1036及び例示的A型インフルエンザマルチドメイン抗体MD1211及びMD1212を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に5mg/kgの用量のMD1211又はMD1212又は単独(2.5mg/kg)若しくはSD1038との1:1混合物(総用量=5mg/kg)のいずれかのSD1036を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/香港/1/1968−MA(H3N2)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、SD1036、MD1211、MD1212又はSD1036とSD1038との1:1混合物の鼻腔内投与がA/香港/1/1968−MAウイルスの致死的攻撃誘発に対する完全防御を提供することを示している。体重曲線は、MD1211及びMD1212の有効性がsdAb(混合物)より優れていることを示している(図6)。
例示的A型インフルエンザシングルドメイン抗体SD1038及び例示的A型インフルエンザマルチドメイン抗体MD1212を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に4つの用量(5mg/kg、1.7mg/kg、0.6mg/kg又は0.2mg/kg)のSD1038又はMD1212を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/香港/1/1968−MA(H3N2)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、SD1038がA/香港/1/1968−MAウイルスの致死的攻撃誘発に対して部分的防御を提供するのみであること、及び防御レベルが用量依存的であることを示している。対照的に、二量体SD1038(MD1212)は4つ全ての用量群で100%の防御を提供する(図7)。
例示的B型インフルエンザマルチドメイン抗体MD1221、MD1222及びMD1224を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に5mg/kgの単一用量のMD1221又はMD1224又は2つの用量(0.5mg/kg又は5mg/kg)のMD1222を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株B/フロリダ/4/2006で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、3つ全てのマルチドメイン抗体がB/フロリダ/4/2006による致死的攻撃誘発に対する100%の防御を提供することを示している(図8)。
例示的A型及びB型インフルエンザマルチドメイン抗体MD1301及びMD2601を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に3mg/kgの単一用量のMD1301又はMD2601を静脈内投与した。CR9114を陽性対照としてとった。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/プエルトリコ/8/1934−MA(H1N1)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、Fc含有マルチドメイン抗体MD2601が静脈内投与後に完全防御を提供する一方、Fc不含MD1301が生存に効果を及ぼさないことを示している。対照抗体CR9114はA/プエルトリコ/8/1934−MA(H1N1)による致死的攻撃誘発に対して部分的防御を提供するのみである(図9)。
例示的A型及びB型インフルエンザマルチドメイン抗体MD1301及びMD2601及び基準抗体CR914を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に3つの用量(0.2、0.05又は0.01mg/kg)のMD1301、MD2601又は基準抗体CR9114を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/プエルトリコ/8/1934−MA(H1N1)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、最小有効用量(100%防御を提供する最も低い用量として定義される)がFc含有抗体MD2601及びCR9114について0.05mg/kgであり、Fc不含MD1301について0.2mg/kgであることを示している。0.05mg/kg CR9114を投与されたマウスは、同じ用量のMD2601を投与されたマウスよりも大きい体重減少を示した(図10)。
例示的マルチドメイン抗体MD2617を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)にMD2617を鼻腔内に0.2mg/kg、0.05mg/kg又は0.01mg/kgで、或いは静脈内に3、1又は0.3mg/kgで投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のA/プエルトリコ/8/1934−MA(H1N1)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。MD2617の用量0.2mg/kgの鼻腔内投与又は3mg/kgの静脈内投与は、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした(図11)。
例示的マルチドメイン抗体MD2617を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)にMD2617を鼻腔内に0.5mg/kgで、或いは静脈内に2mg/kgで投与した。2mg/kgで静脈内投与したCR9114を陽性対照としてとった。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のA/香港/1/1968−MA(H3N2)又はB/フロリダ/4/2006で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。MD2617の鼻腔内投与並びに静脈内投与は媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした。
例示的マルチドメイン抗体MD2407及びMD3606及び基準抗体CR9114を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に3つの用量(0.02mg/kg、0.1mg/kg又は0.5mg/kg)のMD2407、MD3606又はCR9114を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株B/フロリダ/4/2006で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。0.02、0.1及び0.5mg/kg MD2407及びMD3606の投与は媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした一方、CR9114の投与は0.1及び0.5mg/kgで生存率の改善をもたらすのみであった(図13)。
例示的マルチドメイン抗体MD3606及び基準抗体CR9114を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に3つの用量(0.2mg/kg、1mg/kg又は5mg/kg)のMD3606又はCR9114を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株B/フロリダ/4/2006で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、MD3606が1mg/kgもの低い用量に至るまでB/フロリダ/4/2006に対する完全防御を提供することを示している。対照的に基準抗体CR9114は、最も高い5mg/kgの用量で部分的防御を提供するのみである(図14)。
例示的マルチドメイン抗体MD2407、MD3606及び基準抗体CR9114を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に3つの用量(0.02mg/kg、0.1mg/kg又は0.5mg/kg)のMD2407、MD3606及びCR9114を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/香港/1/1968−MA(H3N2)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。この試験は、MD2407及びCR9114が、それぞれ0.1及び0.5mg/kgの低い用量に至るまでA/香港/1/1968−MAに対する完全防御を提供することを示している。MD3606は、最も低い0.02mg/kgの用量であっても完全防御を提供する(図15)。
例示的マルチドメイン抗体MD3606及び基準抗体CR9114を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に3つの用量(0.6mg/kg、1.7mg/kg又は5mg/kg)のMD3606又はCR9114を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/香港/1/1968−MA(H3N2)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。用量1.7mg/kgもの低さに至るまでのMD3606及びCR9114の投与が、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした。5又は1.7mg/kg MD3606で治療したマウスは、同じ用量のCR9114で治療したマウスよりも小幅な体重減少を示した(図16)。
例示的マルチ抗体MD2407、MD3606及び基準抗体CR9114を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に3つの用量(0.02mg/kg、0.1mg/kg又は0.5mg/kg)のMD2407、MD3606又はCR9114を鼻腔内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/プエルトリコ/8/1934−MA(H1N1)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。0.25及び0.05mg/kg MD2407又はCR9114の投与は、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした一方、MD3606については、この改善は最も低い0.01mg/kgの用量に至るまで有意であった(図17)。
例示的マルチドメイン抗体MD3606及び基準抗体CR9114を、Balb/Cマウスを使用したインビボインフルエンザ中和試験に選択した。簡潔に言えば、6〜8週齢雌Balb/Cマウス(n=8)に3つの用量(0.6mg/kg、1.7mg/kg又は5mg/kg)のMD3606又はCR9114を静脈内投与した。緩衝溶液のみの投与を受けた別の8匹のマウス群を媒体対照群として供した。投与翌日、マウスを25×LD50のインフルエンザ株A/プエルトリコ/8/1934−MA(H1N1)で鼻腔内から攻撃誘発した。感染後21日間にわたって生存及び体重をモニタした。1.7及び5mg/kg MD3606及び5mg/kg CR9114の投与は、媒体対照群と比較して生存率の統計学的に有意な改善をもたらした(図18)。
sdAb SD1036、SD1038、SD1046、SD1083、SD1084及びSD1087のタンパク質配列をIMGTヒトV遺伝子データベース(http://www.imgt.org)に対してBLASTにかけた。続いて各sdAbを最も相同なヒトV遺伝子配列とアラインメントした。各sdAbのFR4配列をヒトJコンセンサス配列WGQGTLVTVSSとアラインメントした。アラインメントしたヒトV及びJ配列と比べたsdAbフレームワーク領域(FR)におけるアミノ酸の違いを表39に示す。
SD1036については、11個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの幾つかは、親sdAbと等しい、又は場合によってはむしろ良好な中和活性を示した。発現レベルに大きい差は観察されなかった一方、SD1036変異体の大多数について、融解開始温度が増加した。変異体SD3097は、試験した全てのグループ2インフルエンザ株のなかでヒト生殖細胞系列に対するFR突然変異数が最も少なく、Tm開始値が高く、加えて強力な中和を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。
SD1038については、21個のヒト化変異体を作製した。SD3031〜33を除く全ての変異体が、親sdAbとしての4つのグループ1株と同程度の中和活性を示した。SD1038変異体のほとんどについて、H3株A/ブリスベン/10/07及びA/香港/1/68に対するIC50値がやや高かった。変異体SD3119は、試験した全てのインフルエンザ株のなかでヒト生殖細胞系列に対するFR突然変異数が最も少なく、Tm開始値が高く、且つ強力な中和を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。この変異体では、CDR3のMetがIleに置き換えられている。
SD1046については、11個のヒト化変異体を作製した。第1の一連の変異体は、親sdAbと比較して中和活性の強い低下を示した。第2の一連の変異体を作製し、これらはVNAにおいてSD1046と極めて類似した活性を示した。これらの変異体のうち、SD3099は、ヒト生殖細胞系列に対するFR突然変異数が最も少なく、且つ高い温度安定性を示すため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。
SD1083については、10個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの幾つかはHEK293細胞で低い発現レベルを示し、2つは全く発現しなかった。十分に発現した3つの変異体のうち、SD3087を最終的なヒト化変異体として選択した。このsdAbは、VNAにおいて親SD1083よりも強力で、且つTm開始値が実質的に高い。
SD1084については、6個のヒト化変異体を作製した。これらの変異体のうちの4つが、VNAにおいて親sdAbと同程度の中和活性を示した。これらの変異体のうち、SD3085は、Tm開始値が最も高く、且つヒト生殖細胞系列と比べてFR突然変異が僅か2つであるため、これを最終的なヒト化変異体として選択した。
SD1087については、23個のヒト化変異体を作製した。第1の一連の8個の変異体は、VNAにおいて2つのB型インフルエンザ株と比べて計測可能な活性を示さなかった。第2の一連のSDAbを作製し、これには、SD1087と同程度のIC50値を示す幾つもの変異体が含まれた。これらの変異体の温度安定性は親分子より低かった。CDR2にMetの置換を含むこれらの変異体のいずれも、VNAにおいて活性を示さなかった。SD3093は、Tm開始値の低下が少なく、VNAにおけるその活性がSD1087と同等であったためこれを最終的なヒト化変異体として選択した。
Fc融合コンストラクトの生成
実施例11に記載するヒト化sdAb変異体を使用して多量体Fc融合コンストラクトを生成した。ヒト化多量体結合分子、即ち少なくとも2つのヒト化sdAbを含む多量体結合分子を、Fc領域のN末端に直接融合した。Fc融合コンストラクトを哺乳類細胞で発現させて、二量体Fc分子として培地中に分泌させた。これらのFc融合コンストラクトの完全なアミノ酸配列を表44に示す。ホモ二量体並びにヘテロ二量体Fc融合分子を生成した。ヘテロ二量体Fc融合物は、Labrijn et al.(2013)によって記載されるとおり2つのFc鎖のCH3ドメインに単一点突然変異(K409R及びF405L)を導入することによるか、又は欧州特許第0812357B1号明細書及び欧州特許第0979281B1号明細書に記載されるとおりノブ・イントゥ・ホール突然変異を導入することにより生成した。
精製Fc融合タンパク質を実施例6に記載されるとおりのインフルエンザウイルス中和アッセイで試験し、対応する野生型バージョンと比較したときに同程度の効力及び範囲が示された。種々のインフルエンザ株に対する平均中和力価を表45に要約する。
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Claims (22)
- 系統発生学的グループ2の2つの異なるHA亜型のHAを含む少なくとも2つのA型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン(HA)との特異的結合能を有するか;又は系統発生学的グループ1の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ2の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン(HA)との特異的結合能を有するか;又は少なくとも1つのB型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン(HA)との特異的結合能を有するシングルドメイン抗体。
- HAの茎部領域のエピトープに結合する、請求項1に記載のシングルドメイン抗体。
- B型インフルエンザHAの頭部領域のエピトープに結合する、請求項1に記載のシングルドメイン抗体。
- ラクダ科動物VHHである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
- 系統発生学的グループ2の2つの異なるHA亜型のHAを含む少なくとも2つのA型インフルエンザウイルス株;又は系統発生学的グループ1の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ2の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株;又は少なくとも1つのB型インフルエンザウイルス株の中和能を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
- 配列番号227、228及び229から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号230、231及び232から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号233、234及び235から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号236、237及び238から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号239、240及び241から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号242、243及び244から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号245、246及び247から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号248、249、及び250から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号251、252及び253から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号254、255及び256から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号257、258及び259から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号260、261及び262から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号263、264及び265から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号266、267及び268から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号269、270及び271から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号272、273及び274から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号275、276及び277から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号278、279及び280から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号281、282及び283から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号284、285及び286から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号287、288及び289から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号290、291及び292から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号293、122及び123から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号124、125及び126から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号127、128及び129から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号130、131及び132から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号133、134及び135から選択されるCDR配列の1つ以上;
配列番号136、137及び138から選択されるCDR配列の1つ以上;又は
配列番号139、140及び141から選択されるCDR配列の1つ以上
を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。 - 配列番号1〜29からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
- ヒト化ラクダ科動物VHHである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
- 前記ヒト化シングルドメイン抗体が、配列番号146〜226及び配列番号340からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のシングルドメイン抗体。
- Fcテールを更に含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体。
- 前記FcテールがヒトIgG Fcテールである、請求項10に記載のシングルドメイン抗体。
- 少なくとも2つの、請求項1〜9のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体を含むマルチドメイン抗体。
- 系統発生学的グループ1の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株、系統発生学的グループ2の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株及び少なくとも1つのB型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン(HA)との特異的結合能を有する、請求項12に記載のマルチドメイン抗体。
- 系統発生学的グループ1の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株及び系統発生学的グループ2の少なくとも1つのA型インフルエンザウイルス株及び少なくとも1つのB型インフルエンザウイルス株の中和能を有する、請求項12又は13に記載のマルチドメイン抗体。
- Fcテールを更に含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体。
- 前記FcテールがヒトIgG Fcテールである、請求項15に記載のマルチドメイン抗体。
- 配列番号30〜107、配列番号110〜121及び配列番号293〜339からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項12〜16のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体又は請求項12〜17のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体をコードする核酸分子。
- 請求項18に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項12〜17のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、請求項18に記載の核酸分子、及び/又は請求項19に記載のベクターを含む医薬組成物。
- インフルエンザ感染の診断、予防及び/又は治療において使用される、請求項1〜11のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項12〜17のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、請求項18に記載の核酸分子、又は請求項19に記載のベクター。
- インフルエンザ感染の診断、予防及び/又は治療用医薬の製造における、請求項1〜11のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体、請求項12〜17のいずれか一項に記載のマルチドメイン抗体、請求項18に記載の核酸分子、又は請求項19に記載のベクターの使用。
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