TW202229332A - SARS-CoV-2結合肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種與SARS-CoV-2結合之肽及其利用方法。 本發明係一種與SARS-CoV-2結合之肽，其具有1個以上包含CDR3之結構域，該CDR3包含序列編號1～9之任一者所示之胺基酸序列或該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。

Description

SARS-CoV-2結合肽
本發明係關於一種與SARS-CoV-2結合之肽。
SARS冠狀病毒-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2；SARS-CoV-2)與SARS冠狀病毒(SARS-CoV)、MERS冠狀病毒(MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus，中東呼吸道症候群冠狀病毒))同屬β冠狀病毒屬，係導致急性呼吸道疾病之SARS相關冠狀病毒。2019年在中國湖北省武漢市附近首次確認到發生一種急性呼吸道疾病，導致該急性呼吸道疾病之病毒隨後被鑑定為一種新型冠狀病毒並被命名為COVID-19，但其已經發生多種突變並引發了世界性流行(大流行)。
SARS-CoV-2與普通冠狀病毒同樣地，具有大的正義RNA基因組，其編碼4種結構蛋白、16種非結構蛋白(nsp1-16)、及若干附屬蛋白。結構蛋白包含刺突蛋白、核衣殼(Nucleocapsid)、膜蛋白、包膜蛋白，刺突蛋白係由承擔受體結合之N末端S1次單元與承擔膜融合之C末端S2次單元所構成。已知S1次單元進一步被分為N末端域(NTD)、受體結合域(RBD)、亞域1(SD1)、亞域2(SD2)。已知S2次單元進一步被分為融合肽(FP)、七肽重複區1(HR1)及七肽重複區2(HR2)(參照非專利文獻1)。
與SARS-CoV同樣地，SARS-CoV-2由其刺突蛋白介導與宿主細胞受體血管收縮素轉化酶2(ACE2)結合而侵入至細胞內。與受體之結合係由刺突蛋白之結構變化觸發的，從而導致變化成活化狀態。得到活化之刺突在S1/S2部位處被蛋白酶(若為SARS-CoV及SARS-CoV-2，則為TMPRSS2)切斷，S1次單元被釋出，而使得S2次單元上之FP露出。已知FP被插入至靶細胞膜，HR1與HR2再摺疊而形成融合後之構形，從而促進病毒膜與靶細胞之融合(參照非專利文獻2)。
最近，藉由低溫電子顯微鏡或晶體分析，對SARS-CoV-2三聚體刺突之融合前構形或SARS-CoV-2刺突RBD與全長人ACE2之結構進行分析，解析了與ACE2之結合方式，並發現了會與人ACE2形成更強接觸之RBD上的重要突變點，還提供了對用於鑑定以SARS-CoV及SARS-CoV2之RBD為靶向之交叉反應性抗體的表位之見解。進而，根據SARS-CoV-2刺突蛋白之糖鏈分析，SARS-CoV-2刺突蛋白與SARS-CoV同樣地具有多個糖基化部位，其中還報告有一個SARS-CoV所沒有的獨特之糖基化部位，另據報告，此種特異性糖鏈有可能藉由隱蔽表位來促進免疫逃逸(參照非專利文獻3)。
SARS-CoV-2之刺突蛋白於病毒侵入宿主細胞時發揮至關重要之作用，並會成為中和抗體的主要目標。由於冠狀病毒S1次單元之功能性及高免疫原性，故據報告，此前針對冠狀病毒之大部分中和抗體係以S1、尤其是S1-RBD為靶。又，在之前的SARS及MERS感染流行期間也開發出若干中和抗體，且已被證明有可能用於治療冠狀病毒感染症。 然而，對於SARS-CoV之RBD具有特異性之多個已知中和抗體(S230、m396、80R等)即便在濃度高達1 μM時亦不會與SARS-CoV-2結合，另一方面，據報告，藉由篩選單一B細胞而自SARS-CoV-2感染者中單離出之單株抗體均未與SARS-CoV之RBD出現交叉反應。如上所述，多個既有之中和抗體之交叉反應性不足，但另據報告，存在對SARS-CoV及SARS-CoV2兩者顯示中和活性之47D11或S309等IgG抗體或作為單域抗體之VHH-72-Fc等(參照非專利文獻3)。
COVID-19之病毒學診斷係主要藉由利用基因擴增法(PCR)進行之SARS-CoV-2之基因檢測(PCR檢查)來進行(以下，稱為「先前技術1」)。 另一方面，病毒檢測還已知有與PCR不同之檢查方法。其中一種檢查方法係一種抗原檢查，其係檢測病毒表面之蛋白片段，而並非檢測病毒之遺傳物質(以下稱為「先前技術2」)。若能檢測出抗原，則幾分鐘就可以診斷出是否感染，而無需昂貴之機器、無需培訓執行檢查者熟悉所需技術、無需耗費大量精力進行檢查等。 作為其他檢查方法，已知有檢測血清中之病毒特異性抗體之免疫膠體層析法、利用酶標抗體法(ELISA)進行之血清學診斷法(以下稱為「先前技術3」)等。
關於免疫應答中之抗體，已知有在生物體因感染而與抗原接觸後，於感染相對早期於患者之血液中會增加之免疫球蛋白M(以下有時簡稱為「IgM」)及隨後會增加之IgG等。 此處，一般之Ig係由輕鏈與重鏈所構成，但已知駝科之動物會產生不包含輕鏈之重鏈抗體。又，包含重鏈抗體可變區之單域係天然單域，其自身亦作為抗體發揮功能。因此，稱為「單域抗體」(以下有時簡稱為「VHH抗體」)。
於病毒之立體結構表位包含例如酶袋之類之孔狀結構、或區域間分裂之結構部分之情形時，若為先前之IgG，則因其較大而無法與上述表位結合。相對於此，上述VHH抗體之分子量較小，為IgG抗體之10分之1，因此亦可與如上述之結構之表位結合，且亦可與經多個糖鏈修飾之病毒粒子之表面等結合，因此可以成為靶分子之分子範圍變大。
進而，VHH之耐酸性、耐熱性亦優異，且與IgG不同，可利用大腸桿菌、酵母等來生產，而無需利用培養細胞產生。因此，有容易量產，亦容易純化之優點。進而，已知VHH抗體係由單鏈肽所構成，因此具有如下特徵：容易使用蛋白質工程技術或化學修飾等技術來改變功能、容易製作抗體藥物複合體(ADC)(以下稱為「先前技術4」)。
[非專利文獻1]Neutralizing nanobodies bind SARS-CoV-2 spike RBD and block interaction with ACE2. Nature Structural & Molecular Biology 2020 [非專利文獻2]Development of multi-specific humanized llama antibodies blocking SARS-CoV-2/ACE2 interaction with high affinity and avidity. Emerging Microbes & Infections 2020; 9; 1034-1036 [非專利文獻3]Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell 2020; 181: 1004-1015. [非專利文獻4]Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2. Cell Host & Microbe 2020; 27: 891-898
先前技術1係檢測病毒之遺傳物質之方法，在目前所能使用之病毒檢查中被認為最為準確，係在精度較高之方面上優異之技術。然而，存在實施檢查時耗費時間及精力，而難以將PCR檢查之實施數增加至真正需要之數量的問題。 又，先前技術2係如下方面優異之技術，即幾分鐘就可以診斷出是否感染，而無需昂貴之機器、無需培訓執行檢查者熟悉所需技術、無需耗費大量精力進行檢查等。因此，若建立了可靠之抗原檢查法，則可輕鬆增加檢查數量。又，要想可以在家中或診療實踐中診斷出COVID-19感染，需要儘快導入至臨床實踐。然而，存在製備抗體耗費成本，且難以確保檢查所需量之問題。
先前技術3係如下方面優異之方法，即於COVID-19之感染中可以經時掌握狀況，上述COVID-19之感染在較多病例中從感染到發病之潛伏期被認為較長，並且亦報告有在發病約1週後症狀會迅速惡化而發展成重症肺炎等臨床病程較長之病例。然而，即便是上述血清學方法，由於檢查中使用抗體，故而亦抱有與抗原檢查相同之問題。
血清學診斷所使用之抗體之代表例為IgG，但其製造方法一般來說，係自投予有抗原之動物之血清中純化所得，或者將編碼目標IgG之核苷酸序列之基因片段組入至質體等而導入至培養細胞並進行培養所得。因此，社會對於純化無需耗費時間及精力且會作為抗體發揮功能之分子有著強烈需求。
VHH如上所述具有各種優點，但難以取得與基質之親和性較高之VHH。因此，社會對於取得與基質之親和性較高、易於產生及純化且可對應易突變之基質(病毒之核苷酸序列)之VHH、尤其是會與SARS-CoV-2結合之VHH有著強烈需求。 又，IgG抗體由於以基於靜脈內投予或皮下投予之全身投予作為前提，故而有與局部投予相比，無法期待充分之治療效果之問題。另一方面，亦擔心有因全身暴露而導致抗體依賴性感染增強(ADE)之風險。進而，關於VHH-72-Fc，有報告稱在VHH單獨時未顯示充分之中和活性，除因Fc融合化會導致單域抗體喪失物理上之優勢以外，還擔心有由Fc介導之抗體依賴性感染增強(ADE)之風險。 綜上所述，社會上對於開發會識別各種表位之單域抗體以開發對SARS相關冠狀病毒顯示優異治療效果的藥劑有著強烈需求。
本發明係關於一種SARS-CoV-2結合肽，其具有1個以上包含CDR3之結構域，該CDR3包含序列編號1～9之任一者所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。 作為一態樣，上述肽係選自由VHH抗體、重鏈抗體及VHH抗體多聚體所組成之群中之任一者。 又，作為另一態樣，上述VHH抗體多聚體係複數個上述結構域連結而成之多聚體。
又，作為另一態樣，上述序列編號1～9之任一者所示之胺基酸序列相對於SARS-CoV-2具有3.6×10 -9M以下之KD。 又，作為另一態樣，上述結構域進而包含CDR1及CDR2，上述CDR1包含序列編號10～18所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列，上述CDR2包含序列編號19～27所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。 又，本發明之另一態樣係一種核酸，其編碼上述肽。
又，本發明之另一態樣係一種樣本中之SARS-CoV-2之檢測方法，其包括使上述任一項之肽與受驗樣本接觸之步驟。 又，本發明之另一態樣係一種SARS-CoV-2檢測套組，其含有上述任一項之肽。 又，本發明之另一態樣係一種醫藥，其含有上述任一項之肽。 又，本發明之另一態樣係一種上述任一項之肽之用途，其用以製造醫藥。 又，本發明之另一態樣係一種上述任一項之肽，其用以作為醫藥來使用。
本發明係關於一種與SARS-CoV-2結合之肽及其利用法。
本發明人等為了獲得與SARS-CoV-2結合之肽而進行了研究，結果係藉由利用cDNA展示法進行篩選，成功地從構建體中包含具有特定胺基酸數之CDR1～3之VHH抗體庫中獲得與SARS-CoV-2反應性較高之純系。
根據本發明，可以提供一種高反應性之SARS-CoV-2結合肽，其可以有助於創制出具有先前抗體所無法獲得之強力中和能力等之抗體醫藥。藉由使用該肽，能夠檢測出SARS-CoV-2、即迅速檢測出作為SARS-CoV-2感染症之新型冠狀病毒感染症(COVID-19)。 又，可提供一種可有助於呼吸道感染症治療劑之藥物發現之肽，其可以直接藉由吸入器局部投予至作為感染部位之上呼吸道或肺。
本發明之SARS-CoV-2結合肽(以下稱為「本發明之肽」)係一種與SARS-CoV-2結合之肽，其具有1個以上包含CDR3之結構域，該CDR3包含序列編號1～9之任一者所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。
此處，SARS-CoV-2係導致急性呼吸道疾病之SARS相關冠狀病毒(COVID-19)，且係其病毒基因組為29,903個鹼基之正鏈單鏈RNA病毒。本發明之肽係與SARS-CoV-2結合之肽，詳細而言，係與SARS-CoV-2之刺突蛋白中之S1次單元結合之肽。
作為本發明之肽，可例舉具有與表位潛在結合之能力之肽，就代表性而言，抗體或抗體片段屬於上述肽。「抗體」係自承擔體液免疫之抗體產生細胞產生，除包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM以外，還包括重鏈抗體、單鏈抗體、ScFv、包含重鏈抗體之CDR3序列之單域抗體(以下有時稱為「VHH」或「VHH抗體」)、可與侵入至體內之病原體等異物結合之適體、及其等之一部分經修飾、改型者。
本說明書中，所謂「CDR3群集」，係以作為一個互補決定區之CDR3之胺基酸序列為對象，使用CD-HIT(Cluster Database at High Identity with Tolerance)及其他序列聚類程式，將80%一致性(聚類之閾值)定義為一個集群者。
本發明之肽包含至少3個互補決定區(Complementarity Determining Region，以下有時稱為「CDR」)及複數個架構區。CDR亦被稱為超可變區，係指包含序列可變之抗原識別部位或隨機序列區之區域。並且，各CDR之位置關係係自N末端側起依序為CDR1、CDR2、CDR3。又，上述架構區(Framework Region，以下有時稱為「FR」)係指抗體分子之可變區中除互補決定區以外之區域、即高保守性之區域，可以位於上述框架中指出之上述CDR1～CDR3之5'側及3'側這兩處。
本發明之肽中，上述CDR1～CDR3中之CDR3為例如下述表1中所示之序列中之任一者、或者該等胺基酸序列之至少一者被置換為其他胺基酸者。此處，供置換之胺基酸之位置及置換後之胺基酸之種類並無限定，只要該等胺基酸序列與抗原之解離常數不會成為100 nM以上即可，較佳為1個置換。
[表1]
   CDR3序列 CDR3殘基數 序列編號
VHH-COVE1 LLRRYNYGFTFDNY 14 1
VHH-COVE2 FGGSDFLMDY 10 2
VHH-COVE3 AWSDYEYLEV 10 3
VHH-COVE4 TPWYSASHTY 10 4
VHH-COVE5 VTWLRGDY 8 5
VHH-COVE6 ITTGSPLLGGGMDF 14 6
VHH-COVE7 VFPSGGDY 8 7
VHH-COVE8 VGLFGIQASDY 11 8
VHH-COVE9 PGVVTGSYDVRNY 13 9
具有上述CDR3之肽係於下述實施例中，藉由利用cDNA展示法進行篩選所獲得之與SARS-CoV-2反應性較高之純系、即SARS-CoV-2結合肽(抗SARS-CoV-2抗體(CoVHH))。 再者，與SARS-CoV-2之結合能力可藉由業者公知之方法來評價。具體而言，如下述實施例所示，藉由利用生物膜層干涉法求出解離常數KD而進行評價。又，亦可藉由使用例如固定有抗原之ELISA法、免疫膠體層析法、等溫滴定熱量測定法、表面電漿子共振測定法等之方法進行評價。本發明中之解離常數KD係藉由生物膜層干涉法而求出。
上述VHH-COVE1～9中，基於對於SARS-CoV-2之中和活性之方面考慮，較佳為VHH-COVE2、VHH-COVE5、VHH-COVE8、VHH-COVE9。
於本發明之肽之結構域中，例如CDR1係序列編號10～18之任一者所示之胺基酸序列，CDR2亦可為序列編號19～27之任一者所示之胺基酸序列。該等胺基酸序列亦可為構成該等胺基酸序列之胺基酸序列之至少1個胺基酸被取代為其他胺基酸所得者。 例如，上述VHH-COVE1～9之結構域中之3個互補決定區之胺基酸序列如以下所示。
[表2]
   CDR1 CDR2 CDR3
VHH-COVE1 序列編號10 序列編號19 序列編號1
VHH-COVE2 序列編號11 序列編號20 序列編號2
VHH-COVE3 序列編號12 序列編號21 序列編號3
VHH-COVE4 序列編號13 序列編號22 序列編號4
VHH-COVE5 序列編號14 序列編號23 序列編號5
VHH-COVE6 序列編號15 序列編號24 序列編號6
VHH-COVE7 序列編號16 序列編號25 序列編號7
VHH-COVE8 序列編號17 序列編號26 序列編號8
VHH-COVE9 序列編號18 序列編號27 序列編號9
又，FR1亦可為序列編號28～34所示之胺基酸序列，FR2亦可為序列編號35～42所示之胺基酸序列。FR3亦可為序列編號43～50所示之胺基酸序列，FR4亦可為序列編號51～53所示之核苷酸序列所規定之胺基酸序列。
又，FR1～FR4較佳為包含與上述序列編號28～53所示之胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列。此處，作為與序列編號28～53所示之胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列，更佳為與序列編號28～53所示之胺基酸序列具有85%以上之同一性之序列，進而較佳為具有90%以上之同一性。進而較佳為包含具有99%以上之同一性之胺基酸序列之架構區。
此處，胺基酸序列之同一性係指於比對2個胺基酸序列時兩個序列中存在相同胺基酸殘基之位置之數相對於全長胺基酸殘基數的比率(%)。具體而言，例如可藉由使用National Center for Biotechnology Information(NCBI，國家生物技術資訊中心)之BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比對搜索工具進行分析而算出。
作為本發明之包含CDR3之序列之肽，例如可例舉：自N末端側朝向C末端側以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之順序連結而成者。該等區域之胺基酸序列如上所述，由序列表之序列編號1～53表示，上述VHH-COVE1～VHH-COVE9之該區域之胺基酸序列係序列編號65(VHH-COVE1)、序列編號66(VHH-COVE2)、序列編號67(VHH-COVE3)、序列編號68(VHH-COVE4)、序列編號69(VHH-COVE5)、序列編號70(VHH-COVE6)、序列編號71(VHH-COVE7)、序列編號72(VHH-COVE8)、序列編號73(VHH-COVE9)所示者。
本發明之肽之形態並無限定，只要具有至少1個上述結構域即可，除如VHH抗體之可變區片段(亦稱為奈米抗體)以外，亦可為單鏈抗體、重鏈抗體、利用肽連接子等將可變區片段結合而成之多聚體、例如二聚體。
本發明之肽之製作方法並無特別限定，藉由該技術領域中公知之技術可容易地製作。例如可組合肽固相合成法與自然化學連接(Native Chemical Ligation；NCL)法來製作，或以基因工程方式來製作，但較佳為如下方法：將編碼本發明之肽之核酸組入至適當載體(例如質體)後，將載體導入至宿主細胞，而以重組肽之形式產生。
此處，作為本發明之肽之表現用質體，可使用適合各種宿主細胞之質體。例如可使用pBR322、pBR325、pUC12、pUC13及其他源自大腸桿菌之質體；pUB110、pTP5、pC194及其他源自枯草菌之載體；pSH19、pSH15及其他源自酵母之載體；λ噬菌體及其他噬菌體；腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、牛痘病毒、桿狀病毒及其他病毒載體、以及其等經適當改型而成之載體。
該等表現質體具有適合各個質體之複製起點、選擇標記及啟動子，視需要，亦可具有強化子、轉錄終止序列(終止子)、核糖體結合部位及多聚腺苷酸化訊號等。進而，對於表現質體，亦可插入用以使FLAG標籤、His標籤、HA標籤及GST標籤等融合並表現之鹼基序列，以使表現之多肽之純化變得容易。
本發明之肽產生菌可藉由所需之方法、例如電穿孔法，將上述表現質體導入至所需菌中來製作。作為重組肽之產生所使用之宿主細胞，例如可例舉：大腸桿菌、枯草菌、麩胺酸棒狀桿菌、各種黴菌、動物細胞、植物細胞及其他細胞、桿狀病毒/昆蟲細胞或酵母細胞等。其中，適宜使用麩胺酸棒狀桿菌及枯草菌，更佳為生產性較高之枯草菌。
自培養菌體或培養細胞中提取表現之本發明之肽時，在培養後，藉由公知之方法採集菌體或培養細胞，使之於適當之緩衝液懸浮，藉由超音波、溶菌酶及/或凍結融解等將菌體或細胞破壞後，藉由離心分離或過濾而取得可溶性提取液。適當與公知之分離、純化法組合，而自所獲得之提取液中取得目標肽。
作為公知之分離、純化法，可使用：鹽析或溶劑沈澱法等利用溶解度之方法；透析法、超過濾法、凝膠過濾法、SDS-PAGE等主要利用分子量之差之方法；離子交換層析法等利用電荷之差之方法；親和層析法等利用特異性親和性之方法；逆相高效液相層析法等利用疏水性之差之方法或等電點電泳法等利用等電點之差之方法等。
如下述實施例所示，本發明之肽係藉由使用cDNA展示法選拔VHH抗體候選序列而找出的。以下，使用該方法之情形時關於抗體之取得係如下所述。
關於靶分子，使用SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突S1-His重組蛋白(以下簡稱為「SARS-CoV-2刺突S1蛋白」，Sino Biological)作為篩選用靶分子。以由RePHAGEN公司提供之源自羊駝之初始VHH庫基因作為模板，利用VHH特異性引子，藉由PCR來擴增CDR1-2區或CDR3區之2個基因片段，使用重疊PCR用引子，進行延伸PCR以使之延伸，從而製作全長VHH編碼化DNA庫。
作為此處所使用之VHH特異性引子，例如可例舉序列表之序列編號54及55。又，作為重疊PCR用引子，例如可例舉序列表之序列編號56及57。構成上述庫之DNA片段較佳為包含T7啟動子、Ω強化子、Kozak一致序列、VHH基因、His標籤、及連接子雜交區域(Y標籤)。
對以上述方式獲得之庫(PCR產物)進行純化，接著進行轉錄。關於上述庫之純化，可使用市售之套組、例如Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)等。又，關於轉錄，可使用市售之套組、例如T7 RiboMAX快速大量RNA製備系統(Promega)等。其後，例如使用NanoPad DS-11FX(DeNovix)等對RNA進行定量。
藉由照射所需波長之光所需時間、例如照射330～370 nm之光1～10分鐘，而使所獲得之mRNA與包含cnvK或起相關物等光交聯鹼基之嘌呤黴素連接子連結，從而獲得mRNA-連接子連結體。使用所獲得之mRNA-連接子連結體進行無細胞轉譯，而由mRNA-連接子連結體合成mRNA-VHH連結體。該無細胞轉譯時，例如可使用經核酸酶處理之兔網狀紅血球裂解液系統(Promega)等市售品。
繼而，將所獲得之mRNA-VHH連結體固定化在磁珠上。作為此種珠，例如可使用Dynabeads My One抗生蛋白鏈菌素C1(Thermo Fisher Scientific)等。將未固定化在上述磁珠上之上述mRNA-VHH連結體去除，進行逆轉錄反應，藉此合成cDNA-VHH連結體。 繼而，可添加例如包含核糖核酸酶T1之His標籤洗滌緩衝液，而沖提固定化在磁珠上之cDNA-VHH連結體，進行His標籤純化，而獲得純化後之cDNA-VHH連結體。
為了將所需之靶分子、例如SARS-CoV-2刺突S1蛋白固定化在例如上述磁珠上，而藉由常規方法將上述靶分子進行生物素化。如此經生物素化之靶蛋白會與固定化在上述珠上之抗生蛋白鏈菌素結合，因此可使靶分子固定化在珠上。藉由測定固定化前後之溶液之蛋白濃度，並對SDS-PAGE上之條帶強度比進行比較，可確認上述固定化反應之產率。
繼而，使用以上述方式獲得之cDNA-VHH連結體(cDNA展現分子)、及固定有靶分子、例如SARS-CoV-2刺突S1蛋白之珠，進行體外淘汰選擇。基於使所獲得之VHH之序列收斂之方面考慮，該選擇較佳為反覆進行複數次，且為了提高選擇之效率，較佳為反覆進行3～6輪。
於該選擇中，使用cDNA展示法，但較佳為一面調節各輪中所使用之mRNA-連接子連結體之量，一面視需要進行預選拔以去除非特異性吸附物。又，各輪中之沖提所使用之沖提液及沖提次數可適當進行選擇。例如，可改變第1輪及其後輪之沖提次數，又，亦可在各輪中使用複數種沖提緩衝液。所獲得之沖提液例如可使用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)進行純化，而獲得純化產物。
繼而，將選擇中所獲得之純化產物供於PCR，進行擴增，而可獲得PCR擴增產物。將所獲得之PCR擴增產物以與上述相同之方式固定化在例如上述磁珠上，可獲得經FITC標記之FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter，螢光活化細胞分選術)分選用珠。對上述靶蛋白固定化珠之區域進行鑑定。於最佳分取條件下進行分選，回收所需之粒子數、例如分別回收50萬粒子，並以與上述相同之方式進行純化。針對所獲得之粒子，例如使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶進行擴增，以與上述相同之方式進行純化。
其後，利用下一代定序儀(NGS)進行測序分析，藉由體外淘汰循環來詳細地查明DNA庫之收斂度。序列樣本之製備例如可依據illumina公司所提供之兩步PCR擴增子建庫(2-step PCR Amplicon Library Preparation)來進行。以各選擇後之PCR產物作為模板，例如使用序列編號60及61所示之引子，對所需引子進行擴增子PCR。
將如此藉由擴增子PCR所獲得之PCR產物以與上述相同之方式進行純化，其後，進行索引PCR，將所獲得之PCR產物以與上述相同之方式進行純化後，藉由凝膠電泳來確認PCR產物大小。其後，例如使用Nanodrop進行PCR產物之定量，例如依據下述式(1)而算出莫耳濃度，基於所獲得之值，利用NFW進行稀釋，而製備成所需濃度、例如4 nM。 (數1) DNA濃度[ng/μL]/(660[g/mol]×550[bp])×10 6＝DNA濃度[nM]   (1)
依據推薦操作說明來調整庫濃度，將經過改性、稀釋之樣本庫及對照組之濃度製備成所需最終濃度。其後，例如可使用MiSeq(Illumina)及MiSeq Reagent奈米套組v2500循環(Illumina)進行測序。 接著，將所獲得之被拆分之序列資料供於分析，選出編碼VHH抗體之鹼基序列區域，並將之轉譯為胺基酸序列。根據該等轉譯資料，計測與各胺基酸序列完全一致之胺基酸序列數，其後，以一個互補決定區、例如CDR3之序列作為對象，使用例如上述序列聚類程式CD-HIT等，將所需類似度為80%以上作為同一群集來計測純係數，從而可以求出各輪之群集數。
根據FACS分選之資料比較等，將被認為是非特異性結合之純系去除後，選拔與靶分子結合之VHH抗體候選序列。使用所需之引子、例如序列編號63及64所表示之引子，利用PCR對所選拔之VHH抗體候選序列進行擴增，對所獲得之PCR擴增產物進行純化，從而製備VHH抗體作成用之基因。利用無細胞轉譯系，自所獲得之基因製作多株VHH抗體。所獲得之多株VHH抗體之抗體效價例如可依據常規方法，藉由ELISA進行評價。
為了使在ELISA評價中觀察到結合之包含CDR3序列之VHH純系進行蛋白表現，自上述體外篩選之R5之DNA庫製備各VHH之基因，將之導入至表現用質體。靶片段之DNA係使用限制酶切出，使之與表現質體接合而製備重組質體後，轉形為所需菌、例如大腸桿菌。可自轉形之大腸桿菌中提取上述重組質體而獲得表現質體。將所獲得之表現質體導入至所需菌，將所獲得之抗體產生菌於包含抗生素之培養基中進行預培養，其後進行正式培養而回收培養上清液。VHH之產生可藉由凝膠電泳等進行確認。對所回收之培養上清液進行His-標籤純化，可製成VHH抗體樣本。
本發明之肽由於與SARS-CoV-2結合，故而藉由使本發明之肽與含有SARS-CoV-2或者有可能含有SARS-CoV-2之受驗樣本接觸，可確認在該樣本中是否存在SARS-CoV-2。 具體而言，在使用本發明之肽來檢測SARS-CoV-2時，具備如下步驟：使本發明之肽與受檢樣本接觸而形成本發明之肽與上述受驗樣本中之SARS-CoV-2之結合體；及對上述結合體中之SARS-CoV-2進行檢測。 又，於血清中之病毒特異性抗體之檢測中，會添加一部分SARS-CoV-2抗原並使之與固定化之受驗樣本(血清)中所包含之抗SARS-CoV-2抗體(例如血清抗體)結合，本發明之肽亦可用於確認處在該結合體狀態下之SARS-CoV-2抗原之存在。
作為受驗樣本，除支氣管拭子、鼻拭子，咽拭子、鼻洗液、鼻吸液、鼻水、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織或細胞之破碎物等生物樣本以外，還可例舉自有可能附著病毒之固體表面、例如門把手、馬桶等採集之樣本。本發明之肽可固定化於固相，亦可不固定化於固相。 檢測上述結合體中之SARS-CoV-2之步驟例如可藉由使上述結合體與識別結合體中之與本發明之肽不同之表位的抗SARS-CoV-2抗體發生反應來進行。或者，亦可藉由勻相測定法於液相中檢測上述結合體中之SARS-CoV-2。
又，本發明之肽可作為SARS-CoV-2檢測用套組之構成成分。該套組可用作SARS-CoV-2感染症(COVID-19)之診斷藥、及SARS-CoV-2感染症治療藥之開發用工具。 該檢測套組除包含本發明之SARS-CoV-2結合肽以外，還可包含檢測所需之試劑及器具，例如抗體、固相載體、緩衝液、酶促反應終止液、微盤讀取器等。 於該檢測套組中，本發明之肽亦可固定化於固相。作為固相，例如可例舉：珠、膜、反應容器之側面或底面、載玻片等板狀基板、免疫培養板等具有孔之基板(以下稱為「孔基板」)，本發明之肽被直接或間接地固定。
當本發明之肽與SARS-CoV-2之S1次單元結合而抑制病毒與細胞結合之情形時，本發明的肽可用作投予於哺乳動物，用以預防或治療SARS-CoV-2感染症的醫藥。作為上述哺乳動物，例如可例舉：人、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、貓、狗、猴、牛、馬、豬等，較佳為人。
於使用本發明之肽作為醫藥之情形時，關於其投予形態，經口、非經口均可，且可適當與周知之藥學上可容許之賦形劑、稀釋劑等組合使用。作為非經口投予，可例舉：靜脈內投予、皮下投予、皮內投予、肌內投予等；利用噴霧及其他方式進行之黏膜投予等。 上述投予時，亦可適當調整醫藥中所包含之本發明之肽含量，並在1週內以1～數次左右之間隔投予有效量。
本發明中關於上述實施方式，進而揭示以下之態樣。 ＜1＞一種SARS-CoV-2結合肽，其具有1個以上包含CDR3之結構域，上述CDR3包含序列編號1～9之任一者所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。 ＜2＞如＜1＞記載之肽，其中SARS-CoV-2結合肽係選自由VHH抗體、重鏈抗體及VHH抗體多聚體所組成之群中之任一者。 ＜3＞如請求項2記載之肽，其中VHH抗體多聚體係複數個上述結構域連結而成之多聚體。 ＜4＞如＜1＞至＜3＞中任一項記載之肽，其中序列編號1～9之任一者所示之胺基酸序列相對於SARS-CoV-2具有3.6×10 -9M以下之KD。 ＜5＞如＜1＞至＜4＞中任一項記載之肽，其中結構域進而包含CDR1及CDR2，上述CDR1包含序列編號10～18所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列，上述CDR2包含序列編號19～27所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。 ＜6＞如＜5＞記載之肽，其選自具有1個以上分別包含CDR1、CDR2及CDR3之結構域之1)～9)，上述CDR1、CDR2及CDR3包含上述表2中記載之序列編號1～27所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。 ＜7＞一種核酸，其編碼如＜1＞記載之肽。 ＜8＞一種樣本中之SARS-CoV-2之檢測方法，其包括使如＜1＞至＜6＞中任一項記載之肽與受驗樣本接觸。 ＜9＞一種SARS-CoV-2檢測套組，其含有如＜1＞至＜6＞中任一項記載之肽。
＜10＞一種醫藥，其含有如＜1＞至＜6＞中任一項記載之肽。 ＜11＞如＜10＞記載之醫藥，其用以預防或治療SARS-CoV-2感染症。 ＜12＞一種如＜1＞至＜6＞中任一項記載之肽之用途，其用以製造醫藥。 ＜13＞如＜12＞記載之用途，其中醫藥係用以預防或治療SARS-CoV-2感染症之醫藥。 ＜14＞如＜1＞至＜6＞中任一項記載之肽，其用以作為醫藥來使用。 ＜15＞如＜14＞記載之肽，其中醫藥係用以預防或治療SARS-CoV-2感染症之醫藥。 ＜16＞一種SARS-CoV-2感染症之預防或治療方法，其係向需要之對象投予如＜1＞至＜6＞中任一項記載之肽。 [實施例]
(實施例1)抗SARS-CoV-2單域抗體之篩選 ＜材料及方法＞ 1.篩選之靶分子 關於靶分子，使用SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突S1-His重組蛋白(以下簡稱為「SARS-CoV-2 刺突S1蛋白」，Sino Biological)。
2. cDNA展示之合成 (1)全長源自羊駝之抗體之可變區片段(single Variable domain of the Heavy chain of a Heavy-chain antibody：VHH)編碼化DNA庫之製作 以由RePHAGEN公司提供之源自羊駝之初始VHH庫基因作為模板，利用VHH特異性引子(序列編號54、55)，藉由PCR對CDR1-2區或CDR3區之2個基因片段進行擴增後，為了調整為包含T7啟動子、ω強化子、Kozak一致序列、VHH基因、His標籤、及連接子雜交區域(Y標籤)之DNA片段，而使用重疊PCR用引子(序列編號56、57)進行延伸PCR而使之延伸，從而製作全長VHH編碼化DNA庫。
[表3]
引子名 序列 序列編號
VHH特異性引子 5'-GAT CCC GCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG GAA GTA TTT TTA CAA CAA TTA CCA ACA ACA ACA ACA AAC AAC AAC AAC ATT ACA TTT TAC ATT CTA CAA CTA CAA GCC ACC ATG-3' 54
5'-TTT CCA CGC CGC CCC CCG TCC TGC TTC CGC CGT GAT GAT GAT GAT GAT GGC TGC CTC CCC C-3' 55
重疊PCR用引子 5'-GAT CCC GCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG GAA GTA TTT TTA CAA CAA TTA CCA ACA ACA ACA ACA AAC AAC AAC AAC ATT ACA TTT TAC ATT CTA CAA CTA CAA GCC ACC ATG-3' 56
5'-TTT CCA CGC CGC CCC CCG TCC TGC TTC CGC CGT GAT GAT GAT GAT GAT GGC TGC CTC CCC C-3' 57
PCR產物之純化係使用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)。每1 μL之PCR產物添加1.8 μL之珠，藉由移液加以混合後，靜置5分鐘。於磁性板上靜置到變透明後，將上清液去除。添加1.4 mL之70%乙醇，靜置30秒後，去除上清液。該乙醇洗淨係進行3次。將上清液去除後，於磁性板上靜置3分鐘，使珠風乾。自磁性板取下管，添加100 μL無核酸酶之水後，藉由移液使珠懸浮，靜置5分鐘。將管於磁性板上靜置2分鐘後，回收上清液。
(2)體外轉錄 使用T7 RiboMAX快速大量RNA生產系統(Promega)。將25 μL之RiboMAX(商標)Express T7 2×緩衝液、20 pmol PCR產物、及5 μL之酵素混合物(Enzyme Mix)加以混合，於37℃下培養30分鐘。繼而，添加5 μL之RQ1無核酸酶之DNA酶(RQ1 RNase-Free DNase)，於37℃下培養15分鐘。轉錄產物之純化使用RNAClean XP(Beckman Coulter)來進行。加入到管中之轉錄產物每1 μL添加1.8 μL之珠，進行移液加以混合，其後靜置5分鐘。於磁性板上靜置後，去除上清液。添加200 μL之70%乙醇，靜置30秒鐘後，去除上清液。該乙醇洗淨係進行3次。去除上清液後，於磁性板上靜置10分鐘，使珠風乾。自磁性板取下管，添加20 μL之無核酸酶之水後，藉由移液使珠懸浮，靜置5分鐘。將管靜置於磁性板上1分鐘後，回收上清液。純化後，藉由NanoPad DS-11FX(DeNovix)定量RNA。
(3) mRNA(messenger ribonucleic acid，信使核糖核酸)與嘌呤黴素連接子之連結 將4 μL之0.25M Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride，三(羥甲基)胺基甲烷鹽酸鹽)(pH值7.5)、4 μL之1 M NaCl、20 pmol之mRNA、20 pmol之cnvK ribo G連接子加以混合，藉由無核酸酶之水以成為20 μL之方式製備反應液。退火係使用ProFlex PCR系統(Life technologies)，於90℃下2分鐘、70℃下1分鐘、25℃下30秒、4℃下培養之條件下來進行。升降溫速率(Ramp rate)係設定為0.1℃/秒。繼而，使用手持式紫外線燈(6 W、UVGL-58、測定波長254/365 nm、100 V；Analytik jena US、An Endress＋Hauser Company)，照射波長365 nm之光5分鐘。mRNA-連接子連結體在使用之前被遮光且被冰浴冷卻。
(4)無細胞轉譯 自mRNA-連接子連結體合成mRNA-VHH連結體時，使用經核酸酶處理(Nuclease Treated)之兔網狀紅血球裂解液系統(Rabbit Reticulocyte Lysate System)(Promega)。將10.5 μL之無核酸酶之水、15 μL之20×轉譯混合物、525 μL之兔網狀紅血球裂解液、15 μL之RNasin(商標)核糖核酸酶抑制劑(40U/μL)(Promega)、9 μL之mRNA-連接子連結體加以混合。將該反應液於37℃下培養15分鐘後，添加36 μL之IVV形成緩衝液(3 M KCl，1 M MgCl 2)混合液，進而於37℃下反應20分鐘，藉此合成mRNA-VHH連結體。
(5)固定化於抗生蛋白鏈菌素磁粒 於60 μL之Dynabeads My One抗生蛋白鏈菌素C1(Thermo Fisher Scientific)中添加60 μL之2×結合緩衝液(20 mM Tris-HCl、2 M NaCl、0.2%Tween20、2 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，pH值8)，藉由進行1分鐘移液而使其懸浮。於磁性板上靜置1分鐘，捨棄上清液。該洗淨係進行2次。將其與75 μL之mRNA-VHH連結體、75 μL之2×結合緩衝液、經過洗淨之抗生蛋白鏈菌素磁粒加以混合，於室溫下培養30分鐘。於磁性板上靜置1分鐘後，去除上清液。添加200 μL之結合緩衝液(10 mM Tris-HCl、1 M NaCl、0.1%Tween20、1 mM EDTA，pH值8)，進行1分鐘移液後，去除上清液。該洗淨係進行2次。
(6)逆轉錄反應 將55.5 μL之無核酸酶之水、1.5 μL之5×ReverTra Ace緩衝液(Toyobo Life Science)、3 μL之25 mM dNTP混合物、1.5 μL之ReverTra Ace(100 U/μL)(Toyobo Life Science)加以混合。於上述反應液中添加固定化在抗生蛋白鏈菌素磁粒上之mRNA-VHH連結體，於42℃下培養30分鐘，藉此進行逆轉錄反應，從而合成cDNA-VHH連結體。
(7)自磁粒切下 對於固定化在抗生蛋白鏈菌素磁粒上之cDNA-VHH連結體，添加His標籤洗滌緩衝液(20 mM磷酸鈉、500 mM NaCl、5 mM咪唑、0.05%Tween20，pH值7.4)，藉由進行1分鐘移液而懸浮。於磁性板上靜置1分鐘，捨棄上清液。繼而，添加30 μL含有10 U核糖核酸酶T1(Thermo Fisher Scientific)之His標籤洗滌緩衝液，藉由進行1分鐘移液而懸浮後，於37℃下靜置15分鐘，藉此沖提cDNA-VHH連結體。
(8)His標籤純化 將30 μL之His Mag瓊脂糖凝膠鎳珠(GE Health Care)於磁性板上靜置1分鐘，捨棄上清液後，利用His標籤洗滌緩衝液進行再懸浮。該洗淨操作係進行2次。將cDNA-肽連結體之沖提液與His Mag瓊脂糖凝膠鎳珠懸浮液加以混合，於室溫下培養30分鐘後，於磁性板上靜置1分鐘，捨棄上清液。添加200 μL之His標籤洗滌緩衝液，藉由進行1分鐘移液而使其懸浮。於磁性板上靜置1分鐘，捨棄上清液。該洗淨操作係進行2次。添加10 μL之His標籤沖提緩衝液(20 mM 磷酸鈉、500 mM NaCl、250 mM 咪唑、0.05%Tween20，pH值7.4)，於室溫下培養15分鐘，藉此沖提cDNA-VHH連結體。
3.選擇 (1)靶分子向磁珠之固定化 為了固定化作為靶分子之SARS-CoV-2刺突S1蛋白，使用Dynabeads My One抗生蛋白鏈菌素C1，以如下順序進行固定化。首先，於25 μg之SARS-CoV-2刺突S1蛋白中加入100 μL之1×PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝液)緩衝液後，於本溶液中加入1 mM之EZ-Link™ Sulfo-NHS-SS-Biotin溶液6.5 μL，於室溫下培養30分鐘。利用Zeba™旋轉去鹽管柱(Thermo Fisher)對反應溶液進行純化，回收生物素化SARS-CoV-2刺突S1蛋白116 μL。
取20 μL之Dynabeads My One抗生蛋白鏈菌素C1至微量離心管中，於磁性板上靜置1分鐘後，去除上清液，添加1×結合緩衝液(10 mM Tris-HCl、1 M NaCl、0.1%Tween20、1 mM EDTA，pH值8)100 μL來進行再懸浮。進行1分鐘移液後，於磁性板上靜置1分鐘而將上清液去除。加入25 μL之生物素化SARS-CoV-2刺突S1蛋白溶液，於室溫下攪拌30分鐘，於磁性板上靜置1分鐘後，利用100 μL之1×結合緩衝液、100 μL之PBST依序洗淨，加入100 μL之PBST，而獲得SARS-CoV-2刺突S1蛋白固定化珠溶液。固定化反應之產率係藉由如下方式推定：使用NanoPad DS-11FX(DeNovix)測定固定化前後之溶液之蛋白濃度，將SDS-PAGE上之條帶強度比進行比較。
(2)體外淘汰選擇 使用上述2-(8)中所合成之cDNA-VHH連結體(cDNA展現分子)及上述3-(1)中所製備之SARS-CoV-2刺突S1蛋白固定化珠，於下述表4中所示之條件下，藉由以下順序，自第1輪至第5輪(R1～R5)反覆進行體外淘汰選擇。於cDNA展示合成中，(R1)中使用192 pmol之mRNA/連接子連結產物，於R2中使用12 pmol之mRNA/連接子連結產物，於R3、R4、R5中使用6 pmol之mRNA/連接子連結產物。於(R2)～(R5)中，為了去除非特異性吸附物而實施預選拔。即，利用PBST將所製備之cDNA展現分子製成100 μL之稀釋溶液，使該cDNA展現分子與預先經1×結合緩衝液洗淨之抗生蛋白鏈菌素結合磁粒結合，於室溫下攪拌1～2小時後，於磁力架上靜置2分鐘，回收上清液。將該操作進行1～2次後，將所獲得之上清液以相對於SARS-CoV-2刺突S1蛋白之固定化量，PBST於(R1)中成為1 μM、於(R2)～(R4)中成為100 nM之方式進行稀釋後，與SARS-CoV-2刺突S1固定化珠結合，於室溫下攪拌1～2小時。於磁力架上靜置2分鐘後，將上清液去除，利用100 μL之PBST將磁珠洗淨。
將洗淨操作反覆1～3次後，將40 μL之10 mM TCEP緩衝液(pH值7～8)、10 mM NaOH溶液、含1%SDS之PBST溶液、或者20 μL之1 μM SARS-CoV-2刺突S1蛋白溶液以沖提緩衝液之形式進行添加，並於室溫下培養5～30分鐘，回收沖提液。關於各輪之沖提次數，於(R1)中進行4次，於(R2)～(R5)中進行3次。再者，關於(R1)及(R2)，最初之2次係利用TCEP緩衝液進行沖提，在第3次利用NaOH溶液進行沖提，在(R1)之第4次時利用含1%SDS之PBST進行沖提。關於(R3)～(R5)，最初之2次係利用SARS-CoV-2刺突S1蛋白溶液進行沖提，在第3次利用TCEP緩衝液進行沖提。使用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)，並依據該製品之使用說明書純化所獲得之沖提液。
[表4]
輪 mRNA/連接子連結產物 (cDNA展示) 預選擇 洗淨次數
1 192 pmol 無 3次
2 12 pmol 2次 3次
3 6 pmol 2次 3次
4 6 pmol 2次 3次
5 6 pmol 1次 3次
(3)選擇樣本之PCR擴增 將上述淘汰選擇中所獲得之沖提樣本供於PCR。使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Takara Bio(股)製造)，製備下述表5中所示之組成之PCR反應液，加入該PCR反應液來進行PCR。反應條件為：於98℃下2分鐘後，將98℃下10秒、62℃下5秒、72℃下35秒進行25個循環，於72℃下反應1分鐘後，冷卻至10℃。T7omega_New引子係使用具有序列編號58之序列者，NewYtag for polyA cnvK引子係使用具有序列編號59之序列者(參照表6)。使用Agencourt AMPure XP並依據該製品之使用說明書純化所獲得之PCR產物。
[表5]
組成 容量(μL)
5×PrimeSTAR緩衝液 10
2.5 mM dNTP混合物 4
10 μM T7omega_New 1
10 μM NewYtag for polyA cnvK 1
模板DNA 20
2.5 U/μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶 0.5
無核酸酶之水(NFW) 13.5
合計 50.0
[表6]
引子 序列 序列編號
T7omega_New 5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3' 58
NewYtag for poly A cnvK 5'-TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCT-3' 59
(4)FITC珠之製作 取20 μL之抗生蛋白鏈菌素(SA)磁珠(Dynabeads My One抗生蛋白鏈菌素C1：Invitrogen)至微量離心管中，於磁性板上靜置1分鐘後，去除上清液，加入100 μL之1×結合緩衝液，進行再懸浮。進行1分鐘移液後，在磁性板上靜置1分鐘，將上清液去除。加入20 μL之10 μg/mL之生物素(5-Fluorescein)(Sigma-Aldrich)，於室溫下攪拌1小時後，於磁性板上靜置1分鐘，將上清液去除。加入100 μL之PBST，進行1分鐘移液後，於磁性板上靜置1分鐘，將上清液去除。將該操作反覆2次後，加入1.8 μL之PBST，而獲得FITC珠溶液。
(5)利用FACS進行分選 將藉由上述方法調整之8 μL之FITC珠與4 μL之SARS-CoV-2刺突S1蛋白固定化珠加以混合，於磁性板上靜置1分鐘後，去除上清液，加入100 μL之PBST，進行再懸浮。進行1分鐘移液後，於磁性板上靜置1分鐘，將上清液去除，調整FACS分選用珠。於所獲得之珠中混合由(R5)之PCR擴增產物調整之50 μL之cDNA展示溶液(6 pmol)，於室溫下攪拌30分鐘後，在磁力架上靜置2分鐘，去除上清液，加入100 μL之PBST，進行1分鐘移液。其後，於磁性板上靜置1分鐘，將上清液去除。將該操作反覆3次後，加入1 mL之PBST而製成分選用溶液。
將所獲得之分選用溶液放置於FACS(Cell Sorter SH800：SONY)中，設置樣本流路、及分取時之微滴形成條件後，實施分選。根據粒徑來鑑定磁珠之區域，藉由488 nm之雷射照射，根據螢光強度來鑑定FITC珠與SARS-CoV-2刺突S1蛋白固定化珠之區域，於最佳之分取條件下進行分選，利用微量離心管分別回收50萬粒子。氣候，以13,000×g進行10分鐘離心分離。離心後，在磁性板上靜置10分鐘，其後，去除上清液，加入40 μL之沖提緩衝液，進行10分鐘振盪。接著，於磁性板上靜置2分鐘後，回收沖提液。使用Agencourt AMPure XP並依據該製品之使用說明書純化所獲得之沖提液。
(6)FACS分離樣本之PCR擴增 藉由與上述相同之方法，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶進行PCR，而獲得PCR產物。使用Agencourt AMPure XP並依據該製品之使用說明書純化所獲得之PCR產物。
(7)擴增子測序之實施 為了利用體外淘汰循環詳細地查明DNA庫之收斂度，而利用次世代定序儀(NGS)進行測序分析。序列樣本之製備係參考illumina公司所提供之兩步PCR擴增子建庫(2-step PCR Amplicon Library Preparation)之方法來實施。最初，以各選拔後之PCR產物作為模板，製備下述表7中所示之組成之PCR反應液，使用下述序列編號60及61所示之引子(參照表8)，進行擴增子PCR。PCR係於如下條件下進行：於98℃下1分鐘後，將98℃下10秒、62℃下5秒、72℃下35秒進行15個循環，然後於72℃下進行1分鐘。
[表7]
組成 容量(μL)
5×PrimeSTAR緩衝液 2
2.5 mM dNTP混合物 0.8
20 μM NGS Fw 1 stPCR引子 0.2
20 μM NGS Rv 1 stPCR引子 0.2
模板DNA(10稀釋) 0.5
2.5U/μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶 0.1
無核酸酶之水(NFW) 6.2
合計 10.0
[表8]
引子名 序列 序列編號
NGS Fw 1 stPCR引子 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNATGGCTGAGGTGCAGCTCGTG-3' 60
NGS Rv 1 stPCR引子 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNTGATGATGATGGCTACCACCTCCCG-3' 61
使用Agencourt AMPure XP並依據該製品之使用說明書純化所獲得之PCR產物後，進行索引PCR。以藉由擴增子PCR所獲得之PCR產物作為模板，調整下述表9中所示之組成之PCR反應液，進行索引PCR。PCR係於如下條件下進行：於98℃下1分鐘後，將98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下17秒進行10個循環，然後於72℃下1分鐘。
[表9]
組成 容量(μL)
擴增子1 stPCR產物 2
5×PrimeSTAR緩衝液 10
2.5 mM dNTP混合物 4
10 μM Nextera XT索引1引子(N7XX)(Illumina) 1
10 μM Nextera XT索引2引子(S5XX)(Illumina) 1
2.5U/μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶 0.5
無核酸酶之水(NFW) 31.5
合計 50.0
使用Agencourt AMPure XP並依據該製品之使用說明書純化所獲得之PCR產物後，藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳來確認PCR產物大小。其後，使用Nanodrop進行PCR產物之定量，依據以下之式(1)算出莫耳濃度。基於所獲得之定量值，利用NFW進行稀釋，藉此製備成4 nM。 DNA濃度[ng/μL]/(660[g/mol]×550[bp])×10 6＝DNA濃度[nM]   (1)
依據使用4 nM庫時之推薦操作說明來進行製備。經過改性、稀釋之樣本庫之最終濃度係製備成7 pM。又，樣本庫中之PhiX對照係製備成5%。使用MiSeq(Illumina)及MiSeq試劑奈米套組v2500循環(Illumina)進行測序。
(8)VHH抗體之胺基酸序列之選出及CDR3群集分析 將使用MiSeq控制器而得到拆分之序列資料供於分析。自測序資料中選出編碼VHH抗體之鹼基序列區域，並轉譯為胺基酸序列。根據所獲得之轉譯資料，計測與各胺基酸序列完全一致之胺基酸序列數後，計測CDR3群集數，而求出各輪之群集數。結果確認到，每輪純係數都減少，進行了良好之淘汰選擇(圖1)。
(9)抗SARS-CoV-2VHH抗體候選序列之選拔 根據FACS分選之資料比較等，將被認為是非特異性結合之純系去除後，以R5中出現之CDR3群集作為對象，算出輪間之頻度上升率(Enrichment)，選出自R4至R5出現頻度上升了10倍以上之CDR3群集，結果下述表10中所示之9個CDR3群集符合。
[表10]
群集No. CDR3序列 CDR3殘基數 R5/R4頻度上升率 序列編號
1 LLRRYNYGFTFDNY 14 48.54 1
2 FGGSDFLMDY 10 29.16 2
3 AWSDYEYLEV 10 20.61 3
4 TPWYSASHTY 10 46.31 4
5 VTWLRGDY 8 22.15 5
6 ITTGSPLLGGGMDF 14 175.16 6
7 VFPSGGDY 8 30.87 7
8 VGLFGIQASDY 11 25.12 8
9 PGVVTGSYDVRNY 14 26.23 9
(實施例2)利用無細胞轉譯系製作多株VHH抗體 (1)基因之製備 以體外篩選之R5中所獲得之PCR產物作為模板，使用Newleft引子(序列編號62)及包含上述中所選擇之CDR3序列之特異性引子9種來進行PCR。其後，利用上述Newleft引子及包含CDR3以後之FR4序列與His標籤序列之引子將C末端進行延伸，最後使用設計成PUREflex系統合成用之PURE_System_FW引子(序列編號63)、PURE_System_Rv引子(序列編號64)來進行PCR(參照下述表11)。使用Agencourt AMPure XP純化所獲得之PCR產物，而製備9種多株VHH抗體製作用之基因。
[表11]
引子名 序列 序列編號
Newleft 5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3' 62
PURE_System_FW 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCTGAGGTGCAGCTCGTG-3' 63
PURE_System_Rv 5'-CCGCCGTGATGATGTTACTTACTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGTGATGATGATGATGATGGCTGC-3' 64
(2)無細胞轉譯合成 以上述(1)中所製備之基因作為模板DNA，依據PUREflex1.0(Genefrontier)之操作說明，以下述表12之組成製備反應溶液，於37℃下培養3～4小時，而合成多株VHH抗體。
[表12]
組成 容量(μL)
溶液I 10
溶液II 1
溶液III 1
DNA模板(30 ng) X
DNAK混合物 1
無核酸酶之水 7-X
合計 20
(3)His標籤純化 將30 μL之His Mag瓊脂糖凝膠鎳珠(GE Health Care)於磁性板上靜置1分鐘，捨棄上清液。其後，利用200 μL之結合緩衝液進行再懸浮。將該洗淨操作進行2次。將上述(1)中所製備之無細胞轉譯液20 μL加入至裝有His Mag瓊脂糖凝膠鎳珠之管中，於室溫下培養30分鐘。其後，於磁性板上靜置1分鐘，捨棄上清液。於該管中添加200 μL之結合緩衝液，進行1分鐘移液而使其懸浮。將該管於磁性板上靜置1分鐘，捨棄上清液。將該洗淨操作進行2次。將20 μL之His標籤沖提緩衝液(20 mM 磷酸鈉、500 mM NaCl、250 mM 咪唑、0.05% Tween 20，pH值7.4)添加至該管中，於室溫下培養15分鐘。於磁性板上靜置1分鐘，回收上清液。將該沖提操作進行2次。將含1%BSA之PBS溶液加入至管中，稀釋成200 μL，而獲得多株VHH抗體樣本溶液。
(實施例3)利用ELISA之評價 利用含1%BSA之PBS溶液，將SARS-CoV-2 S1次單元-Fc溶液(The Native Antigen Company)稀釋成2 μg/mL。於免疫模組(Immuno Clear Standard Modules_C8_MaxiSorp(cat#445101，Thermo Scientific))之各孔中添加100 μL之該溶液，密封後，於4℃下靜置一晚而將上述S1蛋白固相化。利用200 μL之PBST將該模組洗淨3次，其後，於各孔中添加含3%BSA之PBS溶液300 μL，於室溫下培養1小時。繼而，利用200 μL之PBST(0.05% Tween20)將該模組洗淨3次，其後對於固相化有S1蛋白之上述模組之各孔，添加上述實施例2(3)中經過調整之多株VHH抗體樣本溶液100 μL，於室溫下進行振盪。其後，利用200 μL之PBST將該模組洗淨3次。
使用含1%BSA之PBS溶液，將HRP偶聯抗FLAG標籤單株抗體(Anti-FLAG-tag mAb conjugated with HRP)(cat#A8592，Sigma)稀釋至1/10,000。繼而，於上述各孔中各添加100 μL之稀釋液，對孔板進行遮光，於室溫下振盪1小時。利用200 μL之PBST將該模組洗淨3次。利用10 mL之0.1 M NaH 2PO 4使OPD錠劑(cat#155-02161，FUJIFILM Wako Pure Chemical公司)溶解，添加5 μL之30%H 2O 2而製備OPD錠劑溶液。洗淨後，於各孔中各添加100 μL之OPD錠劑溶液，於遮光下培養5分鐘。添加100 μL之1 M 硫酸，立即使用酶標儀Infinite 200Pro M PLEX(TECAN)，以490 nm測定各孔之吸光度(圖2)。該ELISA試驗之結果確認到所選擇之全部9種多株VHH抗體具有良好之結合活性。
(實施例4)藉由重組麩胺酸棒狀桿菌生產單株VHH抗體 (1)VHH表現用質體之構建 利用重組麩胺酸棒狀桿菌，生產在C末端賦予有連接子及His標籤序列之VHH-COVE5、VHH-COVE6、VHH-COVE7、VHH-COVE8、VHH-COVE9。具體而言，製作具有與VHH-COVE5(序列編號69)相同之CDR1、2、3之VHH抗體(序列編號90)(以下記為「源自麩胺酸棒狀桿菌之VHH-COVE5」)、具有與VHH-COVE6(序列編號70)相同之CDR1、2、3之VHH抗體(序列編號91(以下記為「源自麩胺酸棒狀桿菌之VHH-COVE6」)、具有與VHH-COVE7(序列編號71)相同之CDR1、2、3之VHH抗體(序列編號92)(以下記為「源自麩胺酸棒狀桿菌之VHH-COVE7」)、具有與VHH-COVE8(序列編號72)相同之CDR1、2、3之VHH抗體(序列編號93)(以下記為「源自麩胺酸棒狀桿菌之VHH-COVE8」)、具有與VHH-COVE9(序列編號73)相同之CDR1、2、3之VHH抗體(序列編號94)(以下記為「源自麩胺酸棒狀桿菌之VHH-COVE9」)。為了使在ELISA評價中觀察到結合之包含CDR3序列之VHH純系蛋白表現，而自體外篩選之R5之DNA庫製備各VHH之基因，導入至包含His標籤之表現用質體。利用2種限制酶SfiI及NotI(均為Thermo Fisher)對所合成之VHH純系之基因及空白表現用質體進行處理，藉由瓊脂糖凝膠電泳，分別單離純化靶片段之DNA。其後，使用接合反應混合物(Toyobo)，將經限制酶處理之VHH純系基因與表現用質體接合，使用該接合產物轉形為選殖用勝任細胞JM109。自轉形之大腸桿菌提取質體，取得VHH純系之表現用質體。
(2)重組麩胺酸棒狀桿菌株之製作 向麩胺酸棒狀桿菌株之質體導入係藉由以下所示之電穿孔法來實施。將以甘油為原料之麩胺酸棒狀桿菌株接種至CM2G液體培養基，以30℃、160 rpm進行數小時振盪培養。將該培養液回收至微型管中，利用離心機(TAITEC)以15,000rpm(20,380×g)進行1分鐘離心，使去除上清液後之顆粒於殺菌水中懸浮。再次藉由與上述相同之操作，利用殺菌水將菌體洗淨後，使所獲得之顆粒於100 μL之殺菌水中懸浮，而製成懸浮液。將該懸浮液與各種VHH表現用質體加以混合，實施電穿孔法。於該液中加入1 mL之CM2G培養基，以30℃、180 rpm進行1小時滲透後，適量塗敷於包含25 μg/mL康黴素之CM2G瓊脂培養板，於30℃下培養1～2天。
(3)VHH產生 將上述(2)中所製作之重組麩胺酸棒狀桿菌株接種至包含25 μg/mL康黴素之CM2G培養基，於30℃下振盪一晚，而製成預培養液。將全部預培養液5%接種至PM1S培養基，於25℃下進行72小時振盪培養。培養結束後，利用離心機(Thermo Fisher Scientific)以4,100 rpm、4℃進行30分鐘離心，回收培養上清液。為了確認各培養上清液中之VHH之產生，而進行SDS-PAGE。於各孔中加入4 μL量之樣本後，於150 V且1小時之條件下進行電泳。分子量標記使用Precision Plus Protein TMStandards(BIO-RAD)。電泳後，進行庫馬斯亮藍(CBB)染色，確認到於培養上清液中合成了VHH。
對於所回收之培養上清液，使用PVDF膜(Merck Millipore)進行過濾後，使用鎳離子瓊脂糖凝膠6FF(Ni Sepharose 6 Fast Flow)(Cytiva)，依據該製品之使用說明書進行純化。添加400 μL之His標籤沖提緩衝液(50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH值7.5)，利用離心機(TOMY)以500×g進行30秒鐘離心。回收沖提液，而製成VHH抗體樣本。
(實施例5)利用蛋白酶缺損重組枯草菌生產VHH (1)基因序列之人工合成 利用蛋白酶缺損重組枯草菌來生產於C末端賦予有His標籤序列之VHH-COVE1、VHH-COVE2、VHH-COVE3、VHH-COVE4。具體而言，合成出於N末端賦予有Ala殘基、於C末端賦予有包含連接子之His標籤序列(序列編號74)之VHH-COVE1(序列編號95(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE1」)、VHH-COVE2(序列編號96)(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE2」)、VHH-COVE3(序列編號97)(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE3」)、VHH-COVE4(序列編號98)(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE4」)之人工合成基因。Eurofins公司人工合成出於編碼序列編號95～98之鹼基序列之3'末端賦予有終止密碼子、進而在5'末端賦予有GCAGCTCTTGCAGCA(序列編號75)、在3'末端賦予有TCTATTAAACTAGTT(序列編號76)之序列編號77(VHH-COVE1表現用結構)、序列編號78(VHH-COVE2表現用結構)、序列編號79(VHH-COVE3表現用結構)、序列編號80(VHH-COVE4表現用結構)，而供於實驗。
(2)附His標籤之VHH表現用質體之構建 將以pHY300PLK為基礎所製作之重組質體pHY-S237(參照日本專利特開2014-158430)作為模板，使用作為引子之5'-GATCCCCGGGAATTCCTGTTATAAAAAAAGG-3'(序列編號81)及5'-ATGATGTTAAGAAAGAAAACAAAGCAG-3'(序列編號82)、及PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TaKaRa)，進行PCR，擴增上述表現用質體構建用之質體序列。
以168株之基因組作為模板，使用5'-GAATTCCCGGGGATCTAAGAAAAGTGATTCTGGGAGAG-3'(序列編號83)與5'-CTTTCTTAACATCATAGTAGTTCACCACCTTTTCCC-3'(序列編號84)之引子集合，進行PCR，擴增源自spoVG基因之啟動子DNA。 使用In-Fusion HD選殖套組(Takara)，將所獲得之啟動子DNA組入至質體序列，構建與spoVG啟動子連結之VHH表現用質體。 使用作為引子之5'-TGCTGCAAGAGCTGCCGGAAATAAA-3'(序列編號85)及5'-TCTATTAAACTAGTTATAGGG-3'(序列編號86)、以及PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TaKaRa)，進行PCR，而擴增上述質體序列。使用In-Fusion HD選殖套組(Takara)，將包含(1)中所製作之人工合成基因之DNA分別組入至所獲得之PCR產物，構建包含各人工合成VHH基因之附帶His標籤之VHH表現用質體。依據下述(3)中所示之順序，依據日本專利特開2006-174707號中記載之方法，自168株枯草桿菌中使8種細胞外蛋白酶基因(epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprE)缺損，進而依據日本專利第4336082中記載之方法，使與孢子形成相關之sigF基因缺損，藉此獲得株(Dpr8ΔsigF)，將所構建之質體導入至該株(Dpr8ΔsigF)中。
(3)重組枯草菌之製作 上述質體向枯草菌株之導入係藉由以下所示之原生質體法來進行。於裝有1 mL之LB液體培養基之管中接種預先存在於包含甘油之溶液中的枯草菌，於30℃、210 rpm下進行一晚振盪培養。第二天，於新鮮之1 mL之LB液體培養基中接種該管中之培養液10 μL，於37℃、210 rpm下進行約2小時振盪培養。培養結束後，將該培養液回收至15 mL管中，以1,2000 rpm進行5分鐘離心，將上清液去除。添加包含4 mg/mL之溶菌酶(SIGMA)之500 μL之SMMP，使所獲得之顆粒懸浮，將該管於37℃下培養1小時。
培養結束後，將該管以3,500 rpm進行10分鐘離心，而將上清液去除。將400 μL之SMMP加入至該管中，使所獲得之顆粒懸浮而製成懸浮液。於另一個管中加入所獲得之懸浮液33 μL，於其中加入以上述方式製作之各質體並加以混合，進而添加100 μL之40%PEG，進行漩渦攪拌而製成混合液。於該混合液中加入350 μL之SMMP並進行倒置混和，於30℃、210 rpm下進行1小時振盪，而獲得振盪培養物。其後，於預先準備好之包含DM3瓊脂培養基之培養板之瓊脂培養基上塗敷全部振盪培養物，於30℃下進行2～3天培養，而獲得重組枯草菌。
(4)VHH之產生 將(3)中所製作之重組枯草菌接種至包含50 ppm之四環素之LB培養基1 mL中，於32℃下反覆振盪一晚而獲得預培養液。將所獲得之預培養液1%接種至已加入到帶褶皺三角燒瓶中之20 mL之2×L-mal培養基中，於30℃下進行72小時振盪培養。培養結束時，取1 mL之培養物至微型管中，以4℃、15,000 rpm進行5分鐘離心，回收上清液。針對所回收之上清液中所包含之各VHH，使用Ni-NTA瓊脂糖珠(富士膠片和光純藥)，依據套組所隨附之操作說明進行純化。作為純化時之沖提液，使用包含50 mM之咪唑之PBS。
為了確認培養上清液中所包含之抗體之生產量，於以下條件下進行西方印漬法。SDS-PAGE係使用SuperSep Ace或15-20%(Tricine gel)(均為富士膠片和光純藥)。於各孔中加入包含0.5 μL之培養上清液之樣本，其後以120 V進行3小時泳動。分子量標記係使用xL ladder(Broad)(Aproscience)。使用Trans-Blot Turbo微型PVDF轉移包(BIO-RAD)、及Trans-Blot Turbo系統(BIO-RAD)，將蛋白自SDS-PAGE凝膠轉錄至PVDF膜。作為抗體，使用6x-His標籤單株抗體(3D5)、HRP(Invitorogen)或過氧化酶(HRP)偶聯抗FLAG M2(Sigma-Aldrich)，使用iBind Western System(Invitrogen)進行抗體反應。使用一步Ultra TMB印漬溶液(Thermo Scientific)檢測靶蛋白。
(實施例6)藉由生物膜層干涉法測定結合活性 使用生物膜層干涉法(以下有時簡稱為「BLI」)，對源自枯草菌之VHH-COVE1～VHH-COVE4、源自麩胺酸棒狀桿菌之VHH-COVE5～VHH-COVE9對於SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突S1蛋白的結合活性進行測定。BLI中，使用Octet 384(Fortebio)，將利用動力學緩衝液(含0.05% Tween20之PBS，pH值7.4)製備成10～20 μg/mL之各VHH純系固相化於抗Penta-HIS(HIS1K、Fortebio)感測器晶片，與自495 nM進行2倍連續稀釋所製備之SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突S1-Fc重組蛋白(SinoBiological)結合，而測定解離速度。作為測定準備，使感測器晶片之前端浸漬於200 μL之動力學緩衝液中10分鐘，以水合感測器晶片。其後，將50 μL之各測定液添加至384孔黑色板(Fortebio)中，藉由以下所示之1)～6)之步驟進行測定。
1)基線步驟：動力學緩衝液中之基線測定(60秒)， 2)加載步驟：VHH抗體向感測器之固定化(240秒)， 3)基線步驟：動力學緩衝液中基線測定(30秒)， 4)關聯步驟：於刺突S1蛋白溶液中締合(180秒)， 5)解離步驟：動力學緩衝液中進行測定(240秒)， 6)再生步驟：將於甘胺酸-鹽酸(pH值2.2)中測定5秒且於動力學緩衝液中測定5秒反覆進行3次。
上述測定結束後，自實測值減去參考值(僅動力學緩衝液)，使用Octet軟體，並使用1：1之結合模型進行整體擬合，算出結合活性(圖3)。將各VHH純系對於刺突S1蛋白之平衡解離常數(KD)示於表13。
[表13]
抗體 K D(M) K on(Ms -1) K off(s -1) 序列編號
VHH-COVE1 3.63×10 -9 7.70×10 4 2.80×10 -4 1
VHH-COVE2 1.20×10 -9 7.07×10 4 8.47×10 -5 2
VHH-COVE3 9.24×10 -10 1.06×10 5 9.75×10 -5 3
VHH-COVE4 9.97×10 -10 1.15×10 5 1.14×10 -4 4
VHH-COVE5 1.30×10 -12 3.72×10 4 ＜1.0×10 -7 5
VHH-COVE6 9.09×10 -10 8.04×10 4 7.31×10 -5 6
VHH-COVE7 ＜1.0×10 -12 6.96×10 4 ＜1.0×10 -7 7
VHH-COVE8 2.37×10 -9 2.33×10 4 5.51×10 -5 8
VHH-COVE9 7.26×10 -10 1.92×10 5 1.39×10 -4 9
(實施例7)藉由生物膜層干涉法測定競爭抑制活性 使用Octet 384，對各VHH純系間之對於SARS-CoV-2刺突S1蛋白之競爭抑制進行分析。競爭抑制活性係藉由如下方式算出：將固相化有源自枯草菌之VHH-COVE1～VHH-COVE4、源自麩胺酸棒狀桿菌之VHH-COVE5～VHH-COVE9之任一者作為第1抗體之感測器晶片浸漬於製備成一定濃度之刺突S1蛋白、與作為源自枯草菌之VHH-COVE1～VHH-COVE4、源自麩胺酸棒狀桿菌之VHH-COVE5～VHH-COVE9之任一者之第2抗體的混合液中一定時間，將所獲得之結合訊號與僅以刺突S1蛋白結合時之結合訊號進行比較。
首先，將利用動力學緩衝液(含0.05% Tween20之PBS，pH值7.4)製備成100 μg/mL之第一競爭VHH抗體固相化於HIS1K感測器晶片。繼而，將100 μg/mL之第二競爭VHH純系與20 μg/mL、10μg/mL、5及0 μg/mL之SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突S1-Fc重組蛋白(SinoBiological)分別加以混合，進行5分鐘反應而製備結合溶液。每次運轉之測定順序如下所示。
1)基線步驟：動力學緩衝液中之基線測定(60秒)， 2)加載步驟：VHH抗體向感測器之固定化(60秒)， 3)基線步驟：動力學緩衝液中之基線測定(30秒)， 4)關聯步驟：刺突S1蛋白溶液與競爭VHH抗體混合溶液中之締合(120秒)， 5)解離步驟：動力學緩衝液中進行測定(30秒)， 6)再生步驟：將於甘胺酸-鹽酸(pH值2.2)中測定5秒且於動力學緩衝液中測定5秒反覆進行3次。
關於競爭抑制率，將由第1抗體與刺突S1蛋白所獲得之結合訊號作為100%，將在第2抗體存在下訊號強度減少至未達最大結合能力之25%之情形定義為競爭，將結合超過75%之情形定義為非競爭。25%～75%之水準係視為中間競爭。根據各純系之結合競爭訊號之結果，獲得了高結合活性之VHH純系，關於此次觀察到活性之VHH純系，認為可以分成至少5個競爭群組(參照下述表14)。
[表14]
競爭群組 A B C A D C B C E
COVE1 COVE2 COVE3 COVE4 COVE5 COVE6 COVE7 COVE8 COVE9
A COVE1 22.02 73.33 96.34 10.22 61.16 99.20 69.01 107.16 106.85
B COVE2 62.71 18.62 17.02 68.40 33.86 3.38 5.54 3.61 2.13
C COVE3 108.78 19.37 13.24 80.26 49.63 15.26 21.89 20.09 5.87
(實施例8)測定對於SARS-CoV-2之中和活性 測定源自枯草菌之VHH-COVE2對於SARS-CoV-2之中和活性。抗體係藉由與2%胎牛血清(FBS)/杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)混合而製備成15 μg/mL之濃度。進而，藉由將100 μL之VHH純系混合液與100 μL之2%FBS/DMEM加以混合而製備3倍稀釋液，製備抗體之3倍稀釋系列溶液。
於96孔板中添加VHH純系之3倍稀釋系列溶液100 μL，進而分別添加2.5×10 6RNA複製/mL之SARS-CoV-2溶液(自日本國立感染症研究所獲取)各100 μL。其後，於37℃下培養2小時後，於4℃下培養一晚，使抗體與病毒接觸。於接種有Vero-E6/TMPRSS2細胞(自JCRB細胞庫買入)之孔中加入使抗體與病毒接觸之溶液200 μL，於37℃、5%CO 2環境下進行培養。於培養開始3天後回收培養上清液，藉由定量PCR來定量上清液中之病毒基因組之複製數。
基於藉由定量PCR法所獲得之結果，算出VHH純系之各濃度時之SARS-CoV-2之感染抑制率(圖5)。其結果，VHH-COVE2對於SARS-CoV-2顯示出中和活性，因此可知能夠與SARS-CoV-2之粒子結合。又，根據感染抑制率求出之IC50為0.05 μg/mL，可知VHH-COVE2對於SARS-CoV-2具有較高之中和活性。
(實施例9)利用蛋白酶缺損重組枯草菌生產VHH 利用蛋白酶缺損重組枯草菌生產於C末端賦予有His標籤序列之VHH-COVE5、VHH-COVE8、VHH-COVE9。具體而言，合成於N末端賦予有Ala殘基且於C末端賦予有包含連接子之His標籤序列(序列編號74)之VHH-COVE5(序列編號99)(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE5」)、VHH-COVE8(序列編號100)(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE8」)、VHH-COVE9(序列編號101)(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE9」)之人工合成基因。由Eurofins公司人工合成於編碼序列編號99～101之鹼基序列之3'末端賦予有終止密碼子，進而於5'末端附加有GCAGCTCTTGCAGCA(序列編號75)、於3'末端附加有TCTATTAAACTAGTT(序列編號76)之序列編號87(VHH-COVE5表現用結構)、序列編號88(VHH-COVE8表現用結構)、序列編號89(VHH-COVE9表現用結構)，而供於實驗。以下利用蛋白酶缺損重組枯草菌生產VHH之操作係依據實施例5來進行。
(實施例10)測定對於SARS-CoV-2之中和活性 依據上述實施例8中記載之方法，將所使用之VHH純系自VHH-COVE2分別變更為源自枯草菌之VHH-COVE5、源自枯草菌之VHH-COVE8、源自枯草菌之VHH-COVE9，評價對於SARS-CoV-2之中和活性。其結果為，根據感染抑制率求出之IC50為3.048 μg/mL(VHH-COVE5)、未達1.733 μg/mL(VHH-COVE8)、未達0.58 μg/mL(VHH-COVE9)。
(實施例11)利用蛋白酶缺損重組枯草菌生產VHH 利用蛋白酶缺損重組枯草菌生產於C末端賦予有His標籤序列之VHH-COVE6、VHH-COVE7。具體而言，合成於N末端賦予有Ala殘基且於C末端賦予有包含連接子之His標籤序列(序列編號74)之VHH-COVE6(序列編號102)(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE6」)、VHH-COVE7(序列編號103)(以下記為「源自枯草菌之VHH-COVE7」)之人工合成基因。由Eurofins公司人工合成於編碼序列編號Q、序列編號R之鹼基序列之3'末端賦予有終止密碼子，進而於5'末端附加有GCAGCTCTTGCAGCA(序列編號75)、於3'末端附加有TCTATTAAACTAGTT(序列編號76)之序列編號104(VHH-COVE6表現用結構)、序列編號105(VHH-COVE7表現用結構)，而供於實驗。以下利用蛋白酶缺損重組枯草菌生產VHH之操作係依據實施例5來進行。
(實施例12)測定對於SARS-CoV-2突變株之結合活性 關於源自枯草菌之VHH-COVE1～VHH-COVE5、VHH-COVE7～VHH-COVE9之8種VHH抗體，藉由ELISA法來測定SARS-CoV-2突變株對於刺突蛋白之結合活性。再者，使用利用PBST(含0.05% Tween20之磷酸鹽緩衝鹽水將作為靶蛋白之全長三聚體SARS-CoV-2刺突抗原(記為「武漢型」)、SARS-CoV-2全長刺突重組抗原B.1.1.7突變(記為「英國型」)、SARS-CoV-2全長刺突重組抗原B.1.351突變(記為「南非型」)、SARS-CoV-2全長刺突重組抗原P.1突變(記為「巴西型」)(Bio-serv公司))稀釋而成之者(0、5、50、500ng/mL)。所謂英國型，係相對於武漢型，缺失H69-V70、缺失Y144；N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H產生突變者。所謂南非型，係相對於武漢型，缺失Y144；K417N、E484K、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H產生突變者。所謂巴西型，係相對於武漢型，L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I、V1176F產生突變者。
於Pierce TM鎳包被板(透明，96孔)(Thermo Fisher Scientific)之各孔中各添加製備成20 μg/mL之各VHH抗體100 μL，於室溫下培養1小時，而進行固相化。其後，使用移液管仔細地去除VHH抗體後，將添加200 μL之PBST並利用移液管仔細地去除之操作(記為「洗淨」)反覆進行3次。繼而，於各孔中添加200 μL之5%脫脂乳/PBST，在室溫下進行1小時培養後，進行封閉。其後，使用移液管仔細地去除脫脂乳/PBST後，將洗淨操作反覆進行3次。繼而，於各孔中添加製備成適當濃度之100 μL之靶蛋白，於室溫下培養1小時。其後，使用移液管仔細地去除靶蛋白溶液後，將洗淨操作反覆3次。 製備將作為初級抗體之Ms mAb to Rhodopsin[1D4](Abcam)利用PBST進行1/5,000稀釋而成者，於各孔中各添加100 μL。於室溫下培養1小時後，使用移液管仔細地去除初級抗體後，將洗淨操作反覆3次。製備將作為二級抗體之Goat pAb to Ms(HRP)(Abcam)利用PBST進行1/5,000稀釋而成者，於各孔中各添加100 μL。於室溫且遮光條件下培養1小時後，使用移液管仔細地去除二級抗體後，將洗淨操作反覆3次。製備使作為發光基質之OPD錠劑(Thermo Fisher Scientific)溶解於穩定過氧化物基質緩衝液(Thermo Fisher Scientific)中而成者，於各孔中各添加100 μL。其後，於室溫且遮光條件下培養20分鐘，使用GloMax(註冊商標)Explorer System(Promega公司)，對吸光度(450 nm)進行測定。
ELISA試驗之結果如圖6所示。關於供於試驗之所有VHH抗體，確認到對4種刺突蛋白之結合活性。再者，關於除E1及E4以外之VHH抗體，確認到對所有刺突蛋白均有特別良好之結合活性(吸光度為0.97以上)。
(實施例13)測定對於SARS-CoV-2突變株之結合活性 依據上述實施例11之方法，關於源自枯草菌之VHH-COVE6，藉由ELISA法來測定對於SARS-CoV-2突變株之刺突蛋白之結合活性。與實施例11同樣地，使用利用PBST(含0.05% Tween20之磷酸鹽緩衝鹽水)將作為靶蛋白之全長三聚體SARS-CoV-2刺突抗原(記為「武漢型」)、SARS-CoV-2全長刺突重組抗原B.1.1.7突變(記為「英國型」)、SARS-CoV-2全長刺突重組抗原B.1.351突變(記為「南非型」)、SARS-CoV-2全長刺突重組抗原P.1突變(記為「巴西型」)(Bio-serv公司)之任一者進行稀釋而成者(0、5、50、500 ng/mL)。再者，各突變株中之突變部位係與實施例12中所記載者相同。圖7中表示ELISA試驗之結果，確認到VHH-COVE6對所有突變株之刺突蛋白均有明顯之結合活性。
(實施例14)測定對於SARS-CoV-2突變株之結合活性 依據上述實施例11之方法，關於源自枯草菌之VHH-COVE1～VHH-COVE9之9種VHH抗體，藉由ELISA法來測定對於SARS-CoV-2英國/奈及利亞突變株之刺突蛋白之結合活性。再者，使用利用PBST(含0.05% Tween20之磷酸鹽緩衝鹽水)將作為靶蛋白之SARS-CoV-2全長刺突重組抗原B.1.525突變(以下記為「英國/奈及利亞型」)(Bio-serv公司)稀釋而成者(0、5、50、500 ng/mL)。所謂英國/奈及利亞突變株，係相對於武漢型，缺失H69-V70、缺失Y144；Q52R、E484K、Q667H、F888L產生突變者。
將ELISA試驗之結果示於圖8。關於供於試驗之全部VHH抗體，均確認到對於英國/奈及利亞型之刺突蛋白之結合活性。關於VHH-COVE3、VHH-COVE8、VHH-COVE9，確認到非常良好之結合活性(吸光度為1以上)。關於VHH-COVE5、VHH-COVE6、VHH-COVE7，亦確認到良好之結合活性(吸光度為0.5以上)。
(實施例15)測定對於SARS-CoV-2突變株之結合活性 依據上述實施例11之方法，關於源自枯草菌之VHH-COVE1～VHH-COVE9之9種VHH抗體，藉由ELISA法來測定對於SARS-CoV-2加利福尼亞突變株及印度突變株之刺突蛋白之結合活性。再者，使用利用PBST(含0.05% Tween20之磷酸鹽緩衝鹽水)將作為靶蛋白之SARS-CoV-2全長刺突重組抗原B.1.429突變(以下記為「加利福尼亞型」)、SARS-CoV-2全長刺突重組抗原B.1.617突變(以下記為「印度型」)(Bio-serv公司)分別稀釋而成者(0、5、50、500 ng/mL)。所謂加利福尼亞突變株，係相對於武漢型，S13l、W152C、L452R、D1183Y產生突變者。所謂印度突變株，係相對於武漢型，G142D、E154K、L452R、E484Q、D614G、P681R、Q1071H產生突變者。
將ELISA試驗之結果示於圖9。關於除VHH-COVE3以外之所有VHH抗體，均未確認到對於加利福尼亞型及印度型之刺突蛋白的結合活性。另一方面，關於VHH-COVE3，確認到對於加利福尼亞型及印度型之刺突蛋白之高結合活性。基於實施例11、實施例13可知，VHH-COVE3識別了不易受刺突蛋白突變影響之表位，對於SARS-CoV-2之突變株顯示出廣泛之結合活性。
(實施例16)測定對於SARS-CoV-2刺突RBD之結合活性 關於源自枯草菌之VHH-COVE1～VHH-COVE9之9種VHH抗體，利用與實施例7相同之方法測定對於SARS-CoV-2刺突RBD重組蛋白之結合活性。將利用動力學緩衝液(含0.05% Tween20之PBS，pH值7.4)製備成10～20 μg/mL之各VHH純系固相化於抗Penta-HIS(HIS1K、Fortebio)感測器晶片，與自199.2 nM進行2倍連續稀釋所製備之SARS-CoV-2刺突RBD重組蛋白(40592-VNAH、SinoBiological、武漢型)結合，測定解離速度。作為測定準備，使感測器晶片之前端浸漬於200 μL之動力學緩衝液中10分鐘，以對感測器晶片進行水合。其後，將50 μL之各測定液添加至384孔黑色板(Fortebio)中，藉由以下所示之1)～6)之步驟進行測定。
1)基線步驟：動力學緩衝液中之基線測定(30秒) 2)加載步驟：VHH抗體向感測器之固定化(120秒) 3)基線步驟：動力學緩衝液中之基線測定(60秒) 4)關聯步驟：於RBD蛋白溶液中締合(180秒) 5)解離步驟：動力學緩衝液中測定(240秒) 6)再生步驟：將於甘胺酸-鹽酸(pH值2.2)中測定5秒鐘且於動力學緩衝液中測定5秒鐘反覆進行3次。
上述測定結束後，自實測值減去參考值(僅動力學緩衝液)，使用Octet軟體，並使用1：1之結合模型進行整體擬合，算出結合活性。各VHH抗體對於RBD蛋白之平衡解離常數(K D)如表15所示。
[表15]
抗體 K D(M) K on(Ms -1) K off(s -1) 序列編號
VHH-COVE1 ND ND ND 1
VHH-COVE2 6.42×10 -9 3.22×10 4 2.06×10 -4 2
VHH-COVE3 6.19×10 -9 4.09×10 4 2.53×10 -4 3
VHH-COVE4 ND ND ND 4
VHH-COVE5 5.40×10 -8 1.66×10 4 8.99×10 -4 5
VHH-COVE6 5.98×10 -9 7.89×10 4 4.72×10 -4 6
VHH-COVE7 4.54×10 -10 6.88×10 4 3.13×10 -5 7
VHH-COVE8 3.19×10 -8 2.12×10 4 6.77×10 -4 8
VHH-COVE9 6.14×10 -9 1.69×10 5 1.04×10 -3 9
根據對於RBD之平衡解離常數(K D)，除VHH-COVE1及VHH-COVE4以外之其他VHH抗體與S1蛋白同樣地顯示出強力之結合活性。另一方面，關於VHH-COVE1及VHH-COVE4，未顯示出明確之結合。確認到VHH-COVE1及VHH-COVE4與S1蛋白結合，且與結合於RBD之VHH-COVE2等競爭，因此推測會將RBD之附近部位(NTD)識別為表位。
(實施例17)測定SARS-CoV-2刺突RBD與ACE2之結合之競爭抑制活性 藉由與實施例7相同之方法，關於在實施例15中確認到對於RBD之結合之源自枯草菌之VHH-COVE2、源自枯草菌之VHH-COVE3、源自枯草菌之VHH-COVE5～VHH-COVE9之7種VHH抗體，使用Octet 384，實施對於SARS-CoV-2刺突RBD與人ACE2之結合之競爭抑制評價。將利用動力學緩衝液(含0.05% Tween20之PBS，pH值7.4)製備成10～20 μg/mL之各VHH純系藉由培養120秒鐘而固相化於抗Penta-HIS(HIS1K、Fortebio)感測器晶片，浸漬於作為第1分析物之199.2 nM之SARS-CoV-2刺突RBD重組蛋白(20 μg/mL，40592-VNAH，SinoBiological，武漢型)溶液中，確認180秒鐘後之結合後，浸漬於緩衝溶液中240秒鐘。將感測器晶片浸入調整為20 ng/mL之ACE2-Fc之孔中，確認在180秒鐘後有無結合，此期間有30秒鐘之基線步驟。
確認到固定在感測器晶片之各VHH抗體與作為第1分析物之RBD間之結合響應後，結合作為第2分析物之ACE2-Fc時，VHH-COVE3、VHH-COVE5、VHH-COVE6、VHH-COVE7、VHH-COVE8明確抑制與ACE2之結合，顯示出競爭性。該結果表明，VHH-COVE3、VHH-COVE5、VHH-COVE6、VHH-COVE7、VHH-COVE8對於SARS-CoV-2顯示中和活性。 另一方面，VHH-COVE9未與ACE2顯示競爭性，VHH-COVE2與ACE2局部地顯示出競爭性。將對於ACE2之各感測器圖譜之變化示於圖10。根據本結果顯示，VHH-COVE9在RBD上將ACE2結合位點以外視為表位，且認為其中和活性係不同於與ACE2直接競爭而顯示中和活性之一般抗體的作用。
(實施例18)測定對於SARS-CoV2刺突RBD突變株之結合活性 利用與實施例7相同之方法，測定源自枯草菌之VHH-COVE2、源自枯草菌之VHH-COVE3、源自枯草菌之VHH-COVE5～VHH-COVE9之6種VHH抗體對於SARS-CoV-2刺突RBD突變株之結合活性。預先使用EZ-Link NHS-PEG12-生物素化試劑(Thermo Fisher Scientific)，將各SARS-CoV-2刺突RBD突變株(SPD-C52Hn，Acro Biosystems，N501Y)、SARS-CoV2刺突RBD突變株(SRD-C52H3，Acro Biosystems，E484K)、SARS-CoV2刺突RBD突變株(SRD-C52H2，Acro Biosystems，N440K)、SARS-CoV2刺突RBD突變株(SPD-C52Hp，Acro Biosystems，K417N，E484K，N501Y)進行生物素化，利用動力學緩衝液(含0.05% Tween20之PBS，pH值7.4)製備成10～20 μg/mL。將RBD突變株固相化於SA感測器晶片(Fortebio)，與自666.7 nM進行2倍連續稀釋所調整之各VHH結合，測定解離速度。作為測定準備，使感測器晶片之前端浸漬於200 μL之動力學緩衝液中10分鐘，以水合感測器晶片。其後，將50 μL之各測定液添加至384孔黑色板(Fortebio)中，藉由以下所示之1)～5)之步驟進行測定。
1)基線步驟：動力學緩衝液中之基線測定(60秒) 2)加載步驟：VHH抗體向感測器之固定化(300秒) 3)基線步驟：動力學緩衝液中之基線測定(60秒) 4)關聯步驟：於刺突RBD蛋白溶液中締合(120秒) 5)解離步驟：動力學緩衝液中進行測定(240秒)
上述測定結束後，自實測值減去參考值(僅動力學緩衝液)，使用Octet軟體，並使用1：1之結合模型進行整體擬合，而算出結合活性。各VHH純系之對於SARS-CoV2刺突RBD突變株之平衡解離常數(K D)如表16、表17、表18、及表19所示。
[表16]
對於RBD突變株(N501Y)之結合親和性
抗體 K D(M) K on(Ms -1) K off(s -1) 序列編號  
VHH-COVE2 4.01×10 -9 1.09×10 5 4.38×10 -4 2  
VHH-COVE5 1.16×10 -8 9.11×10 4 1.06×10 -3 5  
VHH-COVE7 2.40×10 -8 7.33×10 4 1.86×10 -3 7  
VHH-COVE8 2.88×10 -8 5.53×10 4 1.59×10 -3 8  
VHH-COVE9 6.90×10 -9 3.86×10 5 2.67×10 -3 9  
[表17]
對於RBD突變株(E484K)之結合親和性
抗體 K D(M) K on(Ms -1) K off(s -1) 序列編號
VHH-COVE2 3.44×10 -8 1.06×10 5 3.65×10 -3 2
VHH-COVE5 6.26×10 -7 3.92×10 4 2.46×10 -2 5
VHH-COVE7 8.02×10 -8 8.81×10 4 7.07×10 -3 7
VHH-COVE8 2.11×10 -7 6.97×10 4 1.47×10 -2 8
VHH-COVE9 9.90×10 -9 3.10×10 5 3.07×10 -3 9
[表18]
對於RBD突變株(N440K)之結合親和性
抗體 K D(M) K on(Ms -1) K off(s -1) 序列編號
VHH-COVE2 2.96×10 -9 1.66×10 5 4.91×10 -4 2
VHH-COVE3 1.54×10 -8 2.92×10 4 4.48×10 -4 3
VHH-COVE5 4.24×10 -8 4.21×10 4 1.78×10 -3 5
VHH-COVE7 2.42×10 -8 4.66×10 4 1.13×10 -3 7
VHH-COVE8 ＜1.0×10 -12 7.45×10 4 ＜1.0×10 -7 8
VHH-COVE9 1.25×10 -8 2.06×10 5 2.58×10 -3 9
[表19]
對於BD突變株(K417N、E484K、N501Y)之結合親和性
抗體 K D(M) K on(Ms -1) K off(s -1) 序列編號  
VHH-COVE2 9.07×10 -8 5.84×10 4 5.29×10 -3 2  
VHH-COVE3 2.65×10 -7 4.00×10 4 1.06×10 -2 3  
VHH-COVE5 3.06×10 -7 2.04×10 5 6.25×10 -2 5  
VHH-COVE7 9.37×10 -8 4.24×10 4 3.98×10 -3 7  
VHH-COVE8 2.39×10 -7 7.99×10 4 1.91×10 -2 8  
VHH-COVE9 1.09×10 -8 1.46×10 5 1.59×10 -3 9  
結合分析之結果，供於本試驗之全部VHH抗體均與各RBD突變株結合。然而，關於觀察到與ACE2之表位競爭性之VHH-COVE2、VHH-COVE3、VHH-COVE5、VHH-COVE7、VHH-COVE8，確認到根據突變位置不同而會對結合活性產生影響。另一方面，關於與不同於ACE2之表位結合之VHH-COVE9，並未觀察到結合活性伴隨該等突變而降低。綜上所述，表明VHH-COVE9對於上述突變株亦有可能發揮中和活性。
(實施例19)測定對於SARS-CoV-2印度型突變株之RBD之結合活性 關於實施例15中確認到對於源自印度型突變株之刺突蛋白之結合活性的VHH-COVE3，評價對於源自印度型突變株之RBD之結合活性。首先，將恢復至常溫之Dynabeads™ MyOne羧酸(ThermoFisher)充分攪拌30分鐘以上，分取250 μL至1.5 mL管中。其後，使用磁力架將上清液去除。加入250 μL之15 mM MES緩衝液(pH值6.0)後，進行10秒鐘漩渦攪拌。其後，使用磁力架將上清液去除。利用50 μL之15 mM MES緩衝液(pH值6.0)使珠懸浮，加入50 μL之製備成10 mg/mL之1-乙基-3-(-3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽並加以混合後，於常溫下攪拌30分鐘。其後，使用磁力架將上清液去除。繼而，製備120 μL之包含50 ng之VHH-COVE3之15 mM MES緩衝液(pH值6.0)，利用該溶液使珠懸浮。於常溫下攪拌一晚後，使用磁力架將上清液去除。利用500 μL之PBST使珠懸浮，進行10分鐘攪拌。其後，使用磁力架將上清液去除。再者，該操作係反覆進行2次。利用500 μL之包含3%之牛血清白蛋白之PBST進行懸浮後，攪拌30分鐘。其後，藉由PBST進行3次洗淨。藉由以上之操作，而製備VHH-COVE3固定化珠。又，一併製備VHH非固定化珠以作為對照。繼而，使用PBST，將SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突RBD(L452R、E484Q)蛋白(His標籤)(以下表達為「印度型RBD」)(Sino Biological公司)製備成12.5 μg/mL。於1.5 mL管內利用200 μL之印度型RBD使VHH-COVE3固定化珠懸浮後，緩慢進行攪拌。攪拌開始10分鐘後分取30 μL之反應液，於磁力架上靜置至溶液變得透明後，分取其上清液並供於SDS-PAGE。SDS-PAGE係於Bolt(註冊商標)Bis-Tris Plus凝膠(ThermoFisher)之各孔中加入包含20 μL之上清液之樣本，其後以200 V進行35分鐘泳動。分子量標記係使用Novex™ Sharp預染蛋白質標準(ThermoFisher)。染色係使用GelCode™藍色安全蛋白染色劑(ThermoFisher)。
供於SDS-PAGE所得之結果如圖11所示。將作為新發樣本之相當於250 ng之印度型RBD供於SDS-PAGE，藉由與該條帶之比較來評價該VHH之結合活性。關於對照，於使VHH非固定化珠與印度型RBD反應之情形時，在與新發樣本相同之位置上確認到條帶(區帶1與2之比較)。即，確認到VHH非固定化珠與印度型RBD無結合活性。另一方面，若使VHH-COVE3固定化珠與印度型RBD反應，則源自印度型RBD之條帶消失(區帶1與3之比較)。該結果意味著VHH-COVE3固定化珠吸附有印度型RBD。綜上所述，可知VHH-COVE3具有與印度型RBD明顯之結合活性。
(實施例20)藉由重組麩胺酸棒狀桿菌生產VHH-COVE9突變體 (1)VHH-COVE9突變體表現用質體之構建 考慮體外淘汰選擇之R5之DNA庫內的序列，選拔出在VHH-COVE9(序列編號73)之CDR3區內產生了R108K突變之VHH-COVE9-R108K(序列編號106)、同樣在CDR3區內產生了N109D突變之VHH-COVE9-N109D(序列編號107)及產生了Y110S突變之VHH-COVE9-Y110S(序列編號108)。利用重組麩胺酸棒狀桿菌製作該等VHH時，以在N末端賦予有Ala殘基且在C末端賦予有包含連接子之His標籤序列(序列編號74)的形態表現VHH-COVE9-R108K(序列編號109)、VHH-COVE9-N109D(序列編號110)、VHH-COVE9-Y110S(序列編號111)。由Eurofins公司合成各VHH之基因，導入至表現用質體。利用2種限制酶SfiI及ApaI(均為Thermo Fisher)對所合成之VHH純系之基因與空白表現用質體進行處理，藉由瓊脂糖凝膠電泳，分別單離純化靶片段之DNA。其後，使用接合反應混合物(Toyobo)，將經限制酶處理之VHH純系基因與表現用質體進行接合，使用該接合產物，轉形為選殖用勝任細胞JM109株。自轉形之大腸桿菌進行質體提取，取得VHH純系之表現用質體。
(2)重組麩胺酸棒狀桿菌株之製作 向麩胺酸棒狀桿菌株之質體導入係在與實施例4相同之條件下實施。
(3)產生VHH 將上述(2)中所製作之重組麩胺酸棒狀桿菌株接種至包含25 μg/mL康黴素之CM2G培養基中，於30℃下振盪一晩而製成預培養液。將預培養液5%接種至裝入到96深孔板中之700 μL之PM1S培養基，於25℃下進行72小時振盪培養。於培養結束後，利用離心機(Thermo Fisher Scientific)以4,000 rpm、4℃進行30分鐘離心，將培養上清液回收至管中。
對於所回收之培養上清液，使用PVDF膜(Merck Millipore)進行過濾後，使用次氮基三乙酸鎳(Ni-NTA)瓊脂糖珠(富士膠片和光純藥)，依據該製品之使用說明書進行純化。於沖提VHH時，添加700 μL之His標籤沖提緩衝液(50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH值7.5)，利用離心機(TOMY)以500×g進行30秒鐘離心。回收沖提液，而製成VHH抗體樣本。
為了確認純化之VHH之純度，而進行SDS-PAGE。於各孔中加入4 μL量之樣本後，於150 V且1小時之條件下進行電泳。分子量標記係使用Precision Plus Protein TMStandards(BIO-RAD)。電泳後，對凝膠進行庫馬斯亮藍(CBB)染色，確認到於培養上清液中合成出VHH。
(實施例21)藉由生物膜層干涉法測定結合活性 藉由與實施例6相同之方法，測定VHH-COVE9-R108K(序列編號106)、VHH-COVE9-N109D(序列編號107)、VHH-COVE9-Y110S(序列編號108)對於SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突S1-Fc重組蛋白(SinoBiological)之結合活性。各VHH純系對於刺突S1蛋白之平衡解離常數(K D)如表20所示。
[表20]
抗體 K D(M) K on(Ms -1) K off(s -1) 序列編號
VHH-COVE9-R108K 3.28×10 -9 1.33×10 5 4.37×10 -4 106
VHH-COVE9-N109D 8.38×10 -9 1.26×10 5 1.06×10 -3 107
VHH-COVE9-Y110S 4.74×10 -9 1.44×10 5 6.83×10 -4 108
(實施例22)測定VHH-COVE3對於SARS-CoV-2突變株之中和活性 測定源自枯草菌之VHH-COVE3對於SARS-CoV-2α型及δ型突變株之中和活性。抗體藉由與2%胎牛血清(FBS)/杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)混合，而製備成150 μg/mL之濃度。進而，藉由將100 μL之VHH純系混合液與100 μL之2%FBS/DMEM加以混合而製備3倍稀釋液，從而製備抗體之3倍稀釋系列溶液。
於96孔板中添加100 μL之VHH純系之3倍稀釋系列溶液，進而分別添加2.5×10 6RNA複製/mL之SARS-CoV-2α型・δ型突變株之溶液(自日本國立感染症研究所獲取)各100 μL。其後，於37℃下培養2小時後，於4℃下培養一晩，使抗體與病毒接觸。於接種有Vero-E6/TMPRSS2細胞(自JCRB細胞庫購入)之孔中加入使抗體與病毒接觸之溶液100 μL，於37℃、5%CO 2環境下進行培養。於培養開始1天後回收培養上清液，藉由定量PCR來定量上清液中之病毒基因組之複製數。於定量PCR中，使用SARS-CoV-2檢測套組(Toyobo)。將培養上清液3 μL與預處理液3 μL加以混合，將其中之3 μL加入至RT-PCR反應液(反應液15 μL、酵素液2.5 μL、引子・探針液2.5 μL)，利用LightCycler(註冊商標)96進行定量PCR。關於反應條件，設為逆轉錄反應42℃・5分鐘、預改性95℃・10秒、循環反應[改性95℃・1秒、締合50℃・3秒、延伸55℃・10秒]45個循環，於此條件下進行檢測。
藉由定量PCR法所獲得之細胞中之病毒數之結果如圖12所示。其結果明確，VHH-COVE3對於SARS-CoV-2α型、δ型均顯示出中和活性，又，顯示對該等病毒之結合活性。
(實施例23)測定對於源自SARS-CoV-2κ型突變株之(L452R、E484Q、B.1.617.1株)與ACE2之結合之競爭抑制活性 關於源自枯草菌之VHH-COVE3，使用Octet 384，實施對於源自SARS-CoV-2κ型突變株之RBD(L452R、E484Q)與人ACE2之結合之競爭抑制評價。將利用動力學緩衝液(含0.05% Tween20之PBS，pH值7.4)製備成20 μg/mL之VHH-COVE3藉由進行120秒鐘培養而固相化於抗Penta-HIS(HIS1K、Fortebio)感測器晶片，分別浸入至作為分析物之10 μg/mL之SARS-CoV-2刺突RBD重組蛋白(SPD-C525e，AcroBiosystems)溶液(50 μL)、20 μg/mL之SARS-CoV-2刺突RBD重組蛋白(25 μL)及40 μg/mL之ACE2(SPD-C525e，AcroBiosystems)溶液(25 μL)的混合溶液、20 μg/mL之ACE2(50 μL，參考孔)中，確認120秒鐘後之結合後，浸入至緩衝溶液中120秒鐘。
以固定有ACE2之感測器晶片作為參考並進行資料處理所得之結果如圖13所示。結果為，對於固定於感測器晶片之VHH-COVE3與RBD間之結合響應，於RBD與ACE2之混合液中響應明確地消失。由於VHH-COVE3明確地抑制ACE2與源自κ型突變株之RBD之結合，故而可知VHH-COVE3對於κ型突變株亦具有中和活性。
(實施例24)測定對於源自SARS-CoV-2δ型突變株之RBD(L452R、T478K、B.1.617.2株)與ACE2之結合之競爭抑制活性 關於源自枯草菌之VHH-COVE3，使用Octet 384，實施對於源自SARS-CoV-2δ型突變株之RBD(L452R、T478K突變株)與人ACE2之結合之競爭抑制評價。將利用動力學緩衝液(含0.05% Tween20之PBS，pH值7.4)製備成20 μg/mL之VHH-COVE3藉由進行120秒鐘培養而固相化於抗Penta-HIS(HIS1K、Fortebio)感測器晶片，分別浸入至作為分析物之10 μg/mL之SARS-CoV-2刺突RBD重組蛋白(SPD-C525e，AcroBiosystems)溶液(50 μL)、20 μg/mL之SARS-CoV-2刺突RBD重組蛋白(25 μL)及40 μg/mL之ACE2(SPD-C525e，AcroBiosystems)溶液(25 μL)之混合溶液、20 μg/mL之ACE2(50 μL)中，確認120秒鐘後之結合後，浸入至緩衝溶液中120秒鐘。
以固定有ACE2之感測器晶片作為參考並進行資料處理所得之結果如圖14所示。結果為，對於固定於感測器晶片之VHH-COVE3與RBD間之結合響應，於RBD與ACE2之混合液中響應明確地消失。由於VHH-COVE3明確地抑制ACE2與源自δ型突變株之RBD之結合，故而可知VHH-COVE3對於δ型突變株亦具有中和活性。
(實施例25)測定倉鼠體內中之VHH-COVE9對於SARS-CoV-2α型突變株之中和活性 向12隻6週齡之雄性敘利亞倉鼠(以下稱為倉鼠)腹腔內投予3種混合麻醉劑(鹽酸美托咪定0.15 mg/kg、咪達唑侖2.0 mg/kg、酒石酸布托啡諾2.5 mg/kg之混合劑)以鎮靜後，經鼻投予SARS-CoV-2 α型突變株(10 3.5TCID 50/head)。經鼻投予後，向倉鼠腹腔內投予阿替美唑而使倉鼠自鎮靜狀態恢復。於SARS-CoV-2投予之1天後，再次向所有倉鼠腹腔內投予3種混合麻醉劑以鎮靜後，按濃度不同(20 mg/kg、4 mg/kg、0.8 mg/kg)每3隻經鼻投予VHH-COVE9。作為對照，向3隻倉鼠僅經鼻投予用於稀釋VHH-COVE9之添加了白蛋白之PBS。自剛投予病毒後開始直至4天後每天都測定倉鼠之體重。
倉鼠體內之VHH-COVE9之中和活性評價之結果如圖15所示。於未投予VHH-COVE9之對照中，確認到伴隨SARS-CoV-2感染之明顯體重減少。若投予0.8 mg/kg之VHH-COVE9，則確認到體重減少之緩和。又，於投予有4 mg/kg、20 mg/kg之VHH-COVE9時，伴隨著SARS-CoV-2感染之體重減少得到明顯抑制。即，明確VHH-COVE9對於SARS-CoV-2α型突變株具有中和活性(治療效果)。
(實施例26)測定對於SARS-CoV-2λ型突變株之RBD之結合活性 關於VHH-COVE3，評價對於源自λ型突變株之RBD之結合活性。依據實施例19來製備VHH-COVE3固定化珠。又，一併製備VHH非固定珠及VHH-COVE9固定化珠以作為對照用。繼而，使用PBST，將SARS-CoV-2(2019-nCoV)刺突RBD(L452Q，F490S)蛋白(His標籤)(以下表達為「λ型RBD」)(Sino Biological公司)製備成12.5 μg/mL。於1.5 mL管內，利用200 μL之λ型RBD分別使VHH-COVE3固定化珠、VHH-COVE9固定化珠、VHH非固定珠懸浮後，緩慢地進行攪拌。於攪拌開始10分鐘後分取100 μL之反應液，於磁力架上靜置至溶液變得透明後，將其上清液去除。繼而，利用40 μL之蒸餾水使所回收之珠懸浮後，與SDS-PAGE之樣本緩衝液加以混合，將混合所得者於100℃下靜置5分鐘，使吸附於珠之λ型RBD沖提至樣本緩衝液中，藉此製備成沖提組分。SDS-PAGE係於Bolt(註冊商標)Bis-Tris Plus凝膠(ThermoFisher)之各孔中加入包含40 μL之沖提組分之樣本，其後以200 V進行35分鐘泳動。分子量標記係使用Novex™ Sharp 預染蛋白質標準(ThermoFisher)。染色係使用GelCode™藍色安全蛋白染色劑(ThermoFisher)。
供於SDS-PAGE所得之結果如圖16所示。將作為新發樣本之相當於250 ng之λ型RBD供於SDS-PAGE(區帶1)。於作為對照之VHH非固定珠、VHH-COVE9固定化珠之沖提組分中，未確認到源自λ型RBD之條帶(區帶2、4)。另一方面，於VHH-COVE3固定化珠之沖提組分中，確認到源自λ型RBD之條帶(區帶3)。以上之結果表明，VHH-COVE3固定化珠吸附有λ型RBD。即，明確VHH-COVE3具有與λ型RBD之結合活性。
(實施例27)測定倉鼠體內VHH-COVE3對於SARS-CoV-2α型突變株之中和活性 向6隻6週齡之雄性敘利亞倉鼠(以下稱為倉鼠)腹腔內投予3種混合麻醉劑(鹽酸美托咪定0.15 mg/kg、咪達唑侖2.0 mg/kg、酒石酸布托啡諾2.5 mg/kg之混合劑)以鎮靜後，經鼻投予SARS-CoV-2 α型突變株(10 3.5TCID 50/head)。經鼻投予後，向倉鼠腹腔內投予阿替美唑以使倉鼠自鎮靜狀態恢復。於SARS-CoV-2投予之1天後，再次向所有倉鼠腹腔內投予3種混合麻醉劑以鎮靜後，向3隻倉鼠經鼻投予8 mg/kg之VHH-COVE3。作為對照，向3隻倉鼠僅經鼻投予用於稀釋VHH-COVE3之添加了白蛋白之PBS。自剛投予病毒後開始直至4天後每天都測定倉鼠之體重。
倉鼠體內之VHH-COVE3之中和活性評價之結果如圖17所示。於未投予VHH-COVE3之對照中，確認到伴隨SARS-CoV-2感染之明顯體重減少。若投予8 mg/kg之VHH-COVE3，則體重減少得到抑制。即，明確VHH-COVE3對於SARS-CoV-2α型突變株具有中和活性(治療效果)。
(實施例28)測定倉鼠體內VHH-COVE3對於SARS-CoV-2δ型突變株之中和活性 向6隻6週齡之雄性敘利亞倉鼠(以下稱為倉鼠)腹腔內投予3種混合麻醉劑(鹽酸美托咪定0.15 mg/kg、咪達唑侖2.0 mg/kg、酒石酸布托啡諾2.5 mg/kg之混合劑)以鎮靜後，經鼻投予SARS-CoV-2 δ型突變株(10 3.5TCID 50/head)。經鼻投予後，向倉鼠腹腔內投予阿替美唑以使倉鼠自鎮靜狀態恢復。於SARS-CoV-2投予之1天後，再次向所有倉鼠腹腔內投予3種混合麻醉劑以鎮靜後，向3隻倉鼠經鼻投予8 mg/kg之VHH-COVE3。作為對照，向3隻倉鼠僅經鼻投予用於稀釋VHH-COVE3之添加了白蛋白之PBS。自剛投予病毒後開始直至4天後每天都測定倉鼠之體重。
倉鼠體內之VHH-COVE3之中和活性評價之結果如圖18所示。於未投予VHH-COVE3之對照中，確認到伴隨著SARS-CoV-2感染之明顯體重減少。若投予8 mg/kg之VHH-COVE3，則體重減少得到抑制。即，明確VHH-COVE3對於SARS-CoV-2δ型突變株具有中和活性(治療效果)。 [產業上之可利用性]
本發明可用於醫藥及診斷藥之領域。
圖1係表示每輪選擇後出現之抗SARS-CoV-2抗體候選之CDR3群集數之變遷的圖。 圖2係表示利用ELISA對藉由選擇而選拔出之VHH純系之結合性進行評價所得之結果的圖。 圖3係表示利用生物膜層干涉法所得之VHH純系之結合特性之圖。 圖4係所獲得之VHH純系之間之競爭抑制之感測器圖譜。 圖5係表示VHH純系之SARS-CoV-2之感染抑制率之圖。 圖6係表示對於SARS-CoV-2突變株之結合活性之圖。 圖7係表示VHH-COVE6對於SARS-CoV-2突變株之結合活性之圖。 圖8係表示對於SARS-CoV-2英國/奈及利亞突變株之結合活性之圖。 圖9係表示對於SARS-CoV-2加利福尼亞突變株及印度突變株之結合活性之圖。 圖10係表示各VHH純系對於RBD與ACE2之結合之競爭抑制之圖。 圖11係表示VHH-COVE3對於源自印度型突變株之RBD之結合活性的SDS-PAGE。 圖12係表示VHH-COVE3對於SARS-CoV-2α型及δ型突變株之中和活性之圖。 圖13係表示VHH-COVE3對於RBD(L452R、E484Q)與ACE2之結合之競爭抑制之圖。 圖14係表示VHH-COVE3對於RBD(L452R、T478K)與ACE2之結合之競爭抑制之圖。 圖15係表示動物體內VHH-COVE9對於SARS-CoV-2α型突變株之中和活性之圖。 圖16係表示VHH-COVE3對於源自λ型突變株之RBD之結合活性之SDS-PAGE。 圖17係表示動物體內VHH-COVE3對於SARS-CoV-2α型突變株之中和活性之圖。 圖18係表示動物體內VHH-COVE3對於SARS-CoV-2δ型突變株之中和活性之圖。 

          <![CDATA[<110>  日商艾普西隆分子工程股份有限公司(EPSILON MOLECULAR ENGINEERING, INC.)]]>
                 學校法人北里研究所(THE KITASATO INSTITUTE)
                 日商花王股份有限公司(KAO CORPORATION)
          <![CDATA[<120>  SARS-CoV-2結合肽]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Phe Gly Gly Ser Asp Phe Leu Met Asp Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Ala Trp Ser Asp Tyr Glu Tyr Leu Glu Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Thr Pro Trp Tyr Ser Ala Ser His Thr Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Val Thr Trp Leu Arg Gly Asp Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Ile Thr Thr Gly Ser Pro Leu Leu Gly Gly Gly Met Asp Phe 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Val Phe Pro Ser Gly Gly Asp Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Val Gly Leu Phe Gly Ile Gln Ala Ser Asp Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Arg Asn Tyr 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Pro Met Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Arg Arg Thr Ser Ser Thr Tyr Ala Met Gly 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Ala Pro Thr Phe Met Thr Tyr Thr Met Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Ala Met Thr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Asp Gln Ile Phe Asp Asn Tyr Asn Met Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Arg Thr Trp Asn Ile Ala Ser Met Thr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gly Arg Thr Phe Ser Ser Cys Ala Met Gly 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gly Gln Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Gly Thr Ile Phe Ser Thr Asn Ala Met Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Phe Ile Asp Gly Glu Gly Thr Ser Thr Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Ala Ile Ser Trp Asp Gly Gly Arg Thr Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Ala Leu Ser Lys Asn Phe Val Thr Thr Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Thr Ile Ser Gly Ala Asp Gly Ser Thr Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Ala Leu Ser Trp Gly Asp Ser Asn Thr Gly 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Thr Ile Lys Trp Ser Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Ala Ile Ser Arg Gly Gly Gly Ser Thr Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Thr Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Gly 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Val Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 
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          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser 
                      20                  25  
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                  35                  
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          gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaagtat ttttacaaca attaccaaca       60
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          tttccacgcc gccccccgtc ctgcttccgc cgtgatgatg atgatgatgg ctgcctcccc       60
          c                                                                       61
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          gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaagtat ttttacaaca attaccaaca       60
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          tttccacgcc gccccccgtc ctgcttccgc cgtgatgatg atgatgatgg ctgcctcccc       60
          c                                                                       61
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          gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaagtat ttttacaaca attaccaaca       60
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          tttccacgcc gccccccgtc ct                                                22
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  58]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  60]]>
          tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagnnnnatg gctgaggtgc agctcgtg         58
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          <![CDATA[<211>  63]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222>  (35)..(38)]]>
          <![CDATA[<223>  n為a、c、g或t]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagnnnntg atgatgatgg ctaccacctc       60
          ccg                                                                     63
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          gatcccgcga aattaatacg actcactata ggg                                    33
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  63]]>
          gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt       60
          ttaactttaa gaaggagata taccaatggc tgaggtgcag ctcgtg                     106
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  72]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          ccgccgtgat gatgttactt acttacttgt cgtcatcgtc tttgtagtcg tgatgatgat       60
          gatgatggct gc                                                           72
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          <![CDATA[<211>  123]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Pro Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Ser Phe Ile Asp Gly Glu Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Leu Leu Arg Arg Tyr Asn Tyr Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr 
                      100                 105                 110         
          Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120             
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Arg Arg Thr Ser Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Ser Trp Asp Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ser Phe Gly Gly Ser Asp Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Val Ser Ala Pro Thr Phe Met Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Leu Ser Lys Asn Phe Val Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Val Ala Trp Ser Asp Tyr Glu Tyr Leu Glu Val Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Ala Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Thr Ile Ser Gly Ala Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ala Thr Pro Trp Tyr Ser Ala Ser His Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  69]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  69]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Asp Gln Ile Phe Asp Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Leu Ser Trp Gly Asp Ser Asn Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ala Val Thr Trp Leu Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser 
                  115         
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Trp Asn Ile Ala 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Phe 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Thr Ile Lys Trp Ser Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ser Lys Asn Thr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe 
                          85                  90                  95      
          Cys Tyr Ala Ile Thr Thr Gly Ser Pro Leu Leu Gly Gly Gly Met Asp 
                      100                 105                 110         
          Phe Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  117]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Cys 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Ser Arg Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Arg Ala Arg Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ala Val Phe Pro Ser Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser 
                  115         
          <![CDATA[<210>  72]]>
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          <![CDATA[<400>  72]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gln Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Lys Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ala Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Leu Val Gly Leu Phe Gly Ile Gln Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  73]]>
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr Asn 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Arg Asn Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  74]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          Gly Gly Gly Ser His His His His His His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  75]]>
          gcagctcttg cagca                                                        15
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          tctattaaac tagtt                                                        15
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          <![CDATA[<211>  426]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  77]]>
          gcagctcttg cagcagcaga agttcaactg gttgaatcag gcggaggcct ggttcaacct       60
          ggcggatcac tgagactgtc atgcgcagca tcaggcttta catttggcaa ttatgaaatg      120
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          ggaggctcaa catattatgc agattcagtt aaaggacgct tcatcatttc acgcgataat      240
          ggcaaaaata cggtctacct gcaaatgaat tcactgaaac cggaagatac agcggtctat      300
          tattgcaatg cagatgtcta tacaaatagc ggctggcgca attcatgggg acaaggcaca      360
          caagttacag tttcaagcgg aggcggaagc catcaccatc atcatcatta atctattaaa      420
          ctagtt                                                                 426
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  438]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          gcagctcttg cagcagcaga agttcaactg gttgaatcag gcggaggcct ggttcaacct       60
          ggcggatcac tgagactgtc atgcgcagca tcaggcttta cattttcatc aacatggatg      120
          tattgggtca gacaagcacc tggcaaaggc ctgaaatggg tttcatcaat ttctccggat      180
          ggcagatcag gctattatgc agattcagtt aaaggacgct ttacgattag cagagataac      240
          gcgaaaaata cggtctacct gcaaatgaat tcactgcgtc cggaagatac agcagtctat      300
          tattgcgcag cagcagatcc gctgagaggc ggatattatg aagatggcat ggattacatg      360
          ggcaaaggca cactggttac agtttcatct ggcggaggct cacatcatca ccatcatcat      420
          taatctatta aactagtt                                                    438
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          <![CDATA[<400>  79]]>
          gcagctcttg cagcagcaga agttcaactg gttgaatcag gcggaggcct ggttcaacct       60
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          cattgggtta gacaagcacc tggcaaaggc ctggaatggg tttcaacaat taatcctggc      180
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          gcggaaaatg tcgtctacct gcaaatgaac aatctgaaag aagaagatac aggcgtctat      300
          tattgcgcag ttgcaccgta tacaacaaca gtcgaagatg attatattct gtggggacaa      360
          ggcacacaag ttacagtttc atctggcgga ggctcacatc atcaccatca tcattaatct      420
          attaaactag tt                                                          432
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  435]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  80]]>
          gcagctcttg cagcagcaga agttcaactg gttgaatcag gcggaggcct ggttcaacct       60
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          tattgggtta gacaagcacc tggcaaaggc ctggaatggg tttcatcaat tgcaccgtat      180
          tcaggcacaa cgtattatac agattcagtc aaaggacgct ttacgattag cagagataat      240
          gcgaaaaaca cggtctacct gcaaatgaat tcactgaaac cggaagatac agcggtctat      300
          tattgcaatg caaaatatgg ccttggctat ggcgatccgt atgaatatga ttattgggga      360
          caaggcacac aagttacagt ttcatctggc ggaggctcac atcatcacca tcatcattaa      420
          tctattaaac tagtt                                                       435
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          gatccccggg aattcctgtt ataaaaaaag g                                      31
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          <![CDATA[<400>  82]]>
          atgatgttaa gaaagaaaac aaagcag                                           27
          <![CDATA[<210>  83]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  83]]>
          gaattcccgg ggatctaaga aaagtgattc tgggagag                               38
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  84]]>
          ctttcttaac atcatagtag ttcaccacct tttccc                                 36
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
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          <![CDATA[<400>  85]]>
          tgctgcaaga gctgccggaa ataaa                                             25
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  86]]>
          tctattaaac tagttatagg g                                                 21
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  417]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  87]]>
          gcagctcttg cagcagcaga agttcaactg gttgaatcag gcggaggcct ggtccaagca       60
          ggcggatcac tgagactgtc atgcacagca tcagatcaga tttttgacaa ctataacatg      120
          gcgtggttta gacaatcacc gggaaaagaa agagaatttg ttgcagcact gtcatgggga      180
          gattcaaata caggctatgc agattcagtc aaaggacgct ttacaattag cagagataac      240
          gcgaaaaaca cggtctatct gcaaatgaat tcactgaaac cggaagatac agcggtctat      300
          tattgctatg cagttacatg gctgagaggc gattattggg gacaaggcac acaagttaca      360
          gtttcatctg gcggaggctc acatcatcac catcatcatt aatctattaa actagtt         417
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          ctagtt                                                                 426
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          <![CDATA[<400>  89]]>
          gcagctcttg cagcagcaga agttcaactg gttgaatcag gcggaggcct ggttcaacct       60
          ggcggatcac tgagactgtc atgcgcagca tcaggcacaa ttttttcaac aaatgcaatg      120
          agctggtata gacaagcacc gggaaaacaa agagaactgg ttgcagcaat tacaagcgga      180
          ggcaatacaa attatgcaga ttcagtcaaa ggacgcttta caattagcag agataacgcg      240
          aaaaacacgg tctatctgca aatgaattca ctgaaaccgg aagatacagc ggtctattat      300
          tgcaatgcac ctggcgttgt tacaggctca tatgatgtta gaaattattg gggacaaggc      360
          acacaagtta cagtttcatc tggcggaggc tcacatcatc accatcatca ttaatctatt      420
          aaactagtt                                                              429
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  135]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Asp Gln Ile Phe Asp Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Leu Ser Trp Gly Asp Ser Asn Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ala Val Thr Trp Leu Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser Gln Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser His His His His His His 
              130                 135 
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  134]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Trp Asn Ile Ala 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Phe 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Thr Ile Lys Trp Ser Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ser Lys Asn Thr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe 
                          85                  90                  95      
          Cys Tyr Ala Ile Thr Thr Gly Ser Pro Leu Leu Gly Gly Gly Met Asp 
                      100                 105                 110         
          Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          His His His His His His 
              130                 
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  135]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Cys 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Ser Arg Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Arg Ala Arg Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ala Val Phe Pro Ser Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser His His His His His His 
              130                 135 
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gln Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Lys Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ala Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Leu Val Gly Leu Phe Gly Ile Gln Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His His His 
                  115                 120                 125             
          His His 
              130 
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  131]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr Asn 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Arg Asn Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His His 
                  115                 120                 125             
          His His His 
              130     
          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  134]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 
                  35                  40                  45              
          Ile Ser Phe Ile Asp Gly Glu Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Asn Ala Leu Leu Arg Arg Tyr Asn Tyr Gly Phe Thr Phe Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          His His His His His His 
              130                 
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Arg Arg Thr Ser Ser Thr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Ile Ser Trp Asp Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Tyr Ser Phe Gly Gly Ser Asp Phe Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His His His 
                  115                 120                 125             
          His His 
              130 
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Val Ser Ala Pro Thr Phe Met Thr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Leu Ser Lys Asn Phe Val Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Asn Val Ala Trp Ser Asp Tyr Glu Tyr Leu Glu Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His His His 
                  115                 120                 125             
          His His 
              130 
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Ala 
                  35                  40                  45              
          Val Ser Thr Ile Ser Gly Ala Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Ala Ala Thr Pro Trp Tyr Ser Ala Ser His Thr Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His His His 
                  115                 120                 125             
          His His 
              130 
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  128]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  99]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Asp Gln Ile Phe Asp Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Leu Ser Trp Gly Asp Ser Asn Thr Gly Tyr Ala Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Tyr Ala Val Thr Trp Leu Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His His His His His 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<211>  131]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  100]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gln Thr Phe Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Thr Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Met Lys Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ala Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Tyr Leu Val Gly Leu Phe Gly Ile Gln Ala Ser Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His His 
                  115                 120                 125             
          His His His 
              130     
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  132]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Arg Asn Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His 
                  115                 120                 125             
          His His His His 
              130         
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  135]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Trp Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Ala Ser Met Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr 
                  35                  40                  45              
          Phe Val Ala Thr Ile Lys Trp Ser Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Phe Cys Tyr Ala Ile Thr Thr Gly Ser Pro Leu Leu Gly Gly Gly Met 
                      100                 105                 110         
          Asp Phe Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser His His His His His His 
              130                 135 
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  128]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Cys Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Ile Ser Arg Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Arg Ala Arg Asn Thr Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Cys Tyr Ala Val Phe Pro Ser Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser His His His His His His 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  438]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          gcagctcttg cagcagcaga agttcaactg gttgaatcag gcggaggcct ggtccaagca       60
          ggcggatcac tgagactgtc atgcacagca tcaggcagaa catggaatat tgcatcaatg      120
          acatggttta gacaagcacc tggcggaaaa gaaagaacat ttgttgcgac aatcaaatgg      180
          tcagatctgg cgacatatta tacggattca gtcaaaggac gctttacaat ttcaagaggc      240
          aacagcaaaa acacggtcta tctgcaaatg aattcactga aaccggaaga tacaggcgtc      300
          tatttttgct atgcaattac aacaggctca ccgctgcttg gcggaggcat ggatttttgg      360
          ggcaaaggca cactggttac agtttcaagc ggaggcggaa gccatcacca tcatcatcat      420
          taatctatta aactagtt                                                    438
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  417]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          gcagctcttg cagcagcaga agttcaactg gttgaatcag gcggaggcct ggttcaagca       60
          ggcgattcac tgagactgtc atgcacagca tcaggcagaa cattttcatc atgcgcaatg      120
          ggctggttta gacaagcacc gggaaaagaa agagaatttg ttgcagcaat ttcaagaggc      180
          ggaggatcaa catcatatgc agattcagtt aaaggacgct tcacgatttc aaaagataga      240
          gcaagaaata cggcgtatct ggaaatgaat tcactgaaac cggaagatac ggcgatctat      300
          tattgctatg cagtttttcc gagcggaggc gattattggg gacaaggcac acaagttaca      360
          gtttcatctg gcggaggctc acaccatcat catcaccatt aatctattaa actagtt         417
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr Asn 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Lys Asn Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr Asn 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Arg Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr Asn 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Arg Asn Ser Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Lys Asn Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser His His His His 
                  115                 120                 125             
          His His 
              130 
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Arg Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser His His His His 
                  115                 120                 125             
          His His 
              130 
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  設計之肽]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Pro Gly Val Val Thr Gly Ser Tyr Asp Val Arg Asn Ser Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser His His His His 
                  115                 120                 125             
          His His 
              130
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053

Claims (15)

  1. 一種SARS-CoV-2結合肽，其具有1個以上包含CDR3之結構域，該CDR3包含序列編號1～9之任一者所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之肽，其中SARS-CoV-2結合肽係選自由VHH抗體、重鏈抗體及VHH抗體多聚體所組成之群中之任一者。
  3. 如請求項2之肽，其中VHH抗體多聚體係複數個上述結構域連結而成之多聚體。
  4. 如請求項1至3中任一項之肽，其中序列編號1～9之任一者所示之胺基酸序列相對於SARS-CoV-2具有3.6×10 -9M以下之KD。
  5. 如請求項1至4中任一項之肽，其中結構域進而包含CDR1及CDR2，該CDR1包含序列編號10～18所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列；該CDR2包含序列編號19～27所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列。
  6. 如請求項5之肽，其選自具有1個以上分別包含CDR1、CDR2及CDR3之結構域之1)～9)，上述CDR1、CDR2及CDR3包含下述序列編號1～27所示之胺基酸序列或於該胺基酸序列中至少1個胺基酸被置換為其他胺基酸後所得之胺基酸序列，    CDR1 CDR2 CDR3    1) 序列編號10 序列編號19 序列編號1    2) 序列編號11 序列編號20 序列編號2    3) 序列編號12 序列編號21 序列編號3    4) 序列編號13 序列編號22 序列編號4    5) 序列編號14 序列編號23 序列編號5    6) 序列編號15 序列編號24 序列編號6    7) 序列編號16 序列編號25 序列編號7    8) 序列編號17 序列編號26 序列編號8    9) 序列編號18 序列編號27 序列編號9 。
  7. 一種核酸，其編碼如請求項1之肽。
  8. 一種樣本中之SARS-CoV-2之檢測方法，其包括使如請求項1至6中任一項之肽與受驗樣本接觸的步驟。
  9. 一種SARS-CoV-2檢測套組，其含有如請求項1至6中任一項之肽。
  10. 一種醫藥，其含有如請求項1至6中任一項之肽。
  11. 如請求項10之醫藥，其用以預防或治療SARS-CoV-2感染症。
  12. 一種如請求項1至6中任一項之肽之用途，其用以製造醫藥。
  13. 如請求項12之用途，其中醫藥係用以預防或治療SARS-CoV-2感染症之醫藥。
  14. 如請求項1至6中任一項之肽，其用以作為醫藥來使用。
  15. 如請求項14之肽，其中醫藥係用以預防或治療SARS-CoV-2感染症之醫藥。
TW110136790A 2020-10-02 2021-10-01 SARS-CoV-2結合肽 TW202229332A (zh)

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