KR20240072325A - SARS-CoV-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서 - Google Patents

SARS-CoV-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서 Download PDF

Info

Publication number
KR20240072325A
KR20240072325A KR1020220150156A KR20220150156A KR20240072325A KR 20240072325 A KR20240072325 A KR 20240072325A KR 1020220150156 A KR1020220150156 A KR 1020220150156A KR 20220150156 A KR20220150156 A KR 20220150156A KR 20240072325 A KR20240072325 A KR 20240072325A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
antigen
cov
binding fragment
Prior art date
Application number
KR1020220150156A
Other languages
English (en)
Inventor
변재철
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to PCT/KR2023/017217 priority Critical patent/WO2024101762A1/ko
Publication of KR20240072325A publication Critical patent/KR20240072325A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus

Abstract

본 발명은 SARS-CoV-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체는 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2, 서열번호 4의 CDR3을 포함하는 가변영역; 및 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2, 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다.

Description

SARS-CoV-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서 {Antibody for the detection of SARS-CoV-1 and immunoaffinity biosensors using thereof}
본 발명은 SARS-CoV-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Escherichia coli(E. coli)의 외막에 발현된 Fv 라이브러리에서 유래되어 SARS-CoV-1 SP에 특이적으로 결합하는 Fv 항체의 스크리닝을 통해 선별한 SARS-CoV-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서에 관한 것이다.
CoV 균주 OC43, HKU1, NL63 및 CoV-229E와 같은 인간 코로나바이러스(Human coronaviruses, CoVs)는 계절성 감기 및 폐렴의 가장 흔한 원인 인자 중 하나로 알려져 있다(Jain et al., 2015). 특히 중증급성호흡기증후군(severe acute respiratory syndrome, SARS)은 메르스(MERS, Middle East Respiratory Syndrome) 및 COVID-19와 마찬가지로 베타-CoV에 의해 유발되는 것으로 보고되었다(Belouzard et al., 2012). SARS 관련 코로나바이러스(SARS-CoV-1) 감염은 SARS-CoV-1 스파이크 단백질(spike protein, SP)이 숙주 세포의 안지오텐신 전환 효소 2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) 수용체에 결합하여 발생하는 것으로 보고되었다(Lan et al., 2020). 호모삼량체 스파이크 당단백질의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD)은 SP와 ACE2 간의 상호작용의 핵심 영역으로 알려져 있으며, ACE2에 대한 SP의 결합 친화도는 ~31-100nM 범위인 것으로 알려져 있다(Lan et al., 2020). 결과적으로 SP의 RBD 영역에 대한 항체는 숙주 세포로의 바이러스 진입을 차단할 수 있는 잠재적인 치료 표적으로 연구되었으며 많은 연구 그룹에서 CoV에 대한 다중 고친화성 중화 항체의 개발을 보고했다(He et al., 2006).
Jain, S., Self, W.H., Wunderink, R.G., Fakhran, S., Balk, R., Bramley, A.M., Reed, C., Grijalva, C.G., Anderson, E.J., Courtney, D.M., 2015. Community-acquired pneumonia requiring hospitalization among US adults. New Engl. J. Med. 373(5), 415-427. Belouzard, S., Millet, J.K., Licitra, B.N., Whittaker, G.R., 2012. Mechanisms of coronavirus cell entry mediated by the viral spike protein. Viruses 4(6), 1011-1033. Lan, J., Ge, J., Yu, J., Shan, S., Zhou, H., Fan, S., Zhang, Q., Shi, X., Wang, Q., Zhang, L., Wang, X., 2020. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature 581(7807), 215-220. He, Y., Li, J., Du, L., Yan, X., Hu, G., Zhou, Y., Jiang, S., 2006. Identification and characterization of novel neutralizing epitopes in the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein: revealing the critical antigenic determinants in inactivated SARS-CoV vaccine. Vaccine 24(26), 5498-5508.
본 발명자들은 Escherichia coli(E. coli)의 외막에 발현된 Fv 라이브러리에서 유래되어 SARS-CoV-1 SP에 특이적으로 결합하는 Fv 항체를 스크리닝링함으로써 우수한 수준으로 SARS-CoV-1을 검출할 수 있는 항체를 선별하여 본 발명을 완성하였다.
위와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명은 SARS-CoV-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체는 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2, 서열번호 4의 CDR3을 포함하는 가변영역; 및 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2, 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 1의 HCDR1, 서열번호 2의 HCDR2, 서열번호 4의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 1의 HCDR1, 서열번호 2의 HCDR2, 서열번호 7의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 13과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 14와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 도메인 항체 형태인 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-1을 검출하기 위한 용도인 것을 기술적 특징으로 한다.
본 발명은 SPR 바이오센서와 SARS-CoV-1 SP에 대해 스크리닝된 두 클론에서 얻은 고정화된 Fv-변이체를 활용하는 임피던스 분광법을 사용함으로써 SARS-CoV-1의 의학적 진단이 실현 가능하다.
도 1a는 SARS-CoV-1 검출에 사용되는 Fv-변이체의 스크리닝 및 적용 절차를 도시한 그림
도 1b는 부위 지정 돌연변이유발을 사용한 무작위 CDR3 영역을 갖는 Fv-라이브러리의 제조 과정을 도시한 그림
도 1c는 표면발현 벡터를 사용한 E. coli의 외막에서 Fv-라이브러리의 발현 과정을 도시한 그림
도 1d는 SDS-PAGE 결과(레인 1: 표면발현된 Fv-변이체를 포함하는 Fv-라이브러리, 레인 2: 표면발현된 Fv를 포함하는 돌연변이 균주(CDR1 및 CDR2), 레인 3: 온전한 E. coli)
도 2a는 형광 표지된 SP를 Fv 라이브러리에 처리한 후 유세포 분석 결과(왼쪽부터 Fv-라이브러리 + SP, 돌연변이 균주 + SP, 온전한 E. coli + SP)
도 2b는 고정화된 SP를 붙인 자성비드를 사용하여 표적 클론에 대한 스크리닝 절차를 도시한 그림
도 2c는 유세포 분석 결과 및 각 클론의 CDR3 시퀀싱 결과
도 2d는 SP 및 표지된 형광 염료(형광염료)에 대한 스크리닝된 클론의 결합 친화도 비교
도 3a는 CDR1 및 CDR2가 있는 돌연변이 균주와 비교하여 스크리닝된 클론들(왼쪽부터 클론번호 4, 클론번호 18)에 형광 표지된 SP를 처리한 후 유세포 분석 결과
도 3b는 유세포 분석과 함께 정량적 결합 분석을 사용한 결합 상수(KD)의 측정 결과
도 4a는 선별된 Fv-변이체에 대한 발현 절차를 도시한 그림
도 4b는 SPR 바이오센서를 사용하여 고정화된 SARS-CoV-1 SP에 대한 두 개의 스크리닝된 클론(위부터 클론번호 4(Anti-SP1), 클론번호 18(Anti-SP2))의 결합 상수(KD) 측정 결과
도 4c는 SPR 바이오센서를 사용하여 고정화된 Fv-변이체에 대한 SARS-CoV-1 SP의 결합 상수(KD) 측정 결과
도 5a는 고정화된 Fv-변이체를 사용한 SPR 바이오센서 및 임피던스 분광분석의 분석 과정을 도시한 그림
도 5b는 두 개의 스크리닝된 클론(Anti-SP1 및 Anti-SP2)에서 두 종류의 고정화된 Fv-변이체와 함께 SPR 바이오센서를 사용한 SARS-CoV-1의 검출 결과
도 5c 두 개의 스크리닝된 클론(Anti-SP1 및 Anti-SP2)에서 두 종류의 고정화된 Fv-변이체를 사용한 임피던스 분광법을 사용한 SARS-CoV-1의 검출 결과
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 가장 포괄적인 기재로서 현재까지 알려진 모든 항체의 형태를 포괄하는 의미이다. 즉, 항체는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 전장 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 다양한 항체 구조를 포괄한다. 용어 "항체"는 종래의 4-쇄 항체, 단일 도메인 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 단일 도메인 항체(single domain antibody, sdAb)의 형태일 수 있다. 단일 도메인 항체는 중쇄-단독 항체로부터의 중쇄 가변 도메인 (예를 들면, 낙타과에서 VHH (중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인)), 종래의 4-쇄 항체로부터 유래된 경쇄, 단일 도메인 (예컨대 VH 또는 VL)이 자연적으로 결여된 결합 분자, 인간화된 중쇄 단독 항체, 인간 중쇄 분절을 발현시키는 유전자이식 마우스 또는 랫트에 의해 생산된 인간 단일 도메인 항체, 및 항체로부터 유래된 것들 이외 조작된 도메인 및 단일 도메인 스캐폴드를 비제한적으로 포함할 수 있다. sdAb는 마우스, 랫트, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소과를 비제한적으로 포함하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 또한 낙타과 이외 종으로부터의 자연 발생 단일 도메인 항체를 포함할 수 있다.
또한, 단일 도메인 항체는 경쇄가 결여된 중쇄 항체로서 공지된 자연 발생 단일 도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 그와 같은 단일 도메인 분자는, 예를 들어 WO 94/04678 및 Hamers-Casterman, et al., (1993) Nature 363:446-448에서 개시된다. 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 본원에서 VHH로서 공지되어 이것을 4-쇄 면역글로불린의 종래의 VH와 구별시킨다. 그와 같은 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 비쿠냐, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 분자를 생산할 수 있고, 그와 같은 VHH는 본원의 범위 내이다.
또한, 본 발명에 따른 단일 도메인 항체는 키메라 항체일 수 있다. 특정한 키메라 항체는, 예를 들면, 특허 US4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 기재된다. 일부 구현예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들면, 낙타과 종, 예컨대 라마로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 키메라 항체는 인간화될 수 있다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 감소시키는 반면, 친계 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지시킨다. 일반적으로, 인간화된 항체는 CDR(또는 이의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 이의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 한 부분을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에 있어서 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선하기 위해, 비-인간 항체 (예를 들면, CDR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "SARS-CoV-1(severe acute respiratory syndrome coronavirus)"은 중증급성호흡기증후군(SARS)을 일으키는 바이러스주(strain)로, 외피가 있고 양성 단일가닥 RNA 바이러스를 말한다. 사람, 박쥐, 아시아사향고양이의 허파 상피세포를 감염키는데, 구체적으로 안지오텐신 전환 효소 2 수용체에 결합함으로써 숙주세포에 침입하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "SP(spike protein)"는 바이러스 외피(viral capsid 또는 viral envelope)에서 바깥으로 돌출된 돌기형태의 단백질을 말하며, 바이러스가 숙주세포의 수용체와 결합할 때 활용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fv(Variable region fragment)"는 Fv는 면역글로불린 G의 항원 결합 영역을 나타내며, 3개의 CDR 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과 CDR 영역 사이의 프레임워크 영역(FR)으로 구성되어 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역만을 갖는 최소의 항체 단편이다. Fv를 생산하는 재조합 기법은 국제특허출원 WO88/10649호 등에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CDR(complementarity determining region, 상보성 결정 영역)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 또한, 중쇄가변영역(heacy chain)의 CDR은 HCDR로 표기할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 발현(display)하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 발현하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다. 특히, 고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산은 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL*?* 프로모터, pR℃프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, 액틴 프로모터, 인간 헤로글로빈 프로모터 및 인간 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
Escherichia coli, bacillus subtilis 및 Bacillus thuringiensis와 같은 바실러스 속 균주, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis 및 Staphylococcus와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,(a) 세포를 배양하는 단계; 및(b) 상기 배양액 및/또는 상기 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 핵산은 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 표적 단백질에 대해 특이적인 항체(가령, 본 발명에 따른 SARS-CoV-1 검출용 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
Fv-라이브러리를 제조하기 위해 CDR3 영역의 아미노산 서열을 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 무작위화 하였다(Xie et al., 2020). 이전에 보고된 바와 같이 CDR3 영역은 11개의 아미노산으로 구성되며 Fv-라이브러리 플라스미드는 도 1b와 같이 항-갑상선 퍼옥시다아제(thyroid peroxidase, TPO) 항체를 주형 서열로 사용하여 제조되었다. 준비된 Fv-라이브러리 플라스미드를 발현(표면발현, autodisplay) 벡터에 삽입하고 Fv- 라이브러리를 도 1a와 같이 표면발현 기술을 사용하여 대장군의 외막에 발현시켰다. 표면발현 기술을 사용할 경우, 외막의 Fv-라이브러리는 10 5 Fv / E. coli 만큼 높은 발현 효율을 갖는 것으로 보고되었다.(Yoo et al., 2015). 도 1c 및 도 1d는 Fv-변이체가 E. coli의 외막에 표면발현 되었음을 보여준다; CDR1 및 CDR2 영역을 보유하는 Fv-변이체를 갖는 돌연변이 균주도 대조군 균주로서 준비하였다. 표적 Fv-변이체(variant)는 형광 표지된 항원으로 처리한 후 유세포 분석 분리(flow cytometric isolation)를 통해 스크리닝될 수 있다; 고정화된(immobilized) 항원이 있는 자성비드(magnetic beads)를 사용하여 도 2b와 같이 표적 Fv-변이체를 분리할 수 있다. SARS-CoV-1 SP에 대해 높은 친화성을 나타내는 표적 Fv-변이체의 스크리닝은 표면발현 기술의 높은 발현 효율로 인해 반복적인 바이오패닝(biopanning) 과정 없이 달성할 수 있다. 비오틴(biotin), 도파민(dopamine), 형광염료(fluorescein), 로다민 B(rhodamine B) 및 요산일나트륨 결정(monosodium urate crystal)과 같은 다양한 항원에 대해 여러 종류의 표적 Fv-변이체가 표면발현된 Fv- 라이브러리를 이용하여 스크리닝되었다(Jung et al., 2021c; Jung et al., 2021d; Lee et al., 2021; Sung et al., 2022a; Sung et al., 2022b).
이 작업에서 SARS-CoV-1 SP에 대한 높은 친화도를 갖는 Fv-변이체를 Fv 라이브러리에서 스크리닝하고, 두 개의 스크리닝된 클론의 결합 친화도를 유세포 분석을 사용하여 분석했다. 최종적으로, SARS-CoV-1 SP(Anti-SP1 및 Anti-SP2)에 대한 두 개의 스크린된 클론들로부터 얻은 발현된 Fv-변이체는 녹색 형광 단백질(GFP)를 갖는 융합 단백질로 발현되었고, SARS-CoV-1의 검출은 SARS-CoV-1 SP에 대한 두 개의 스크린된 클론들에서 획득한 고정화된 Fv-변이체를 이용하는 임피던스 분광법 및 SPR 바이오센서를 사용하는 SARS-CoV-1의 바이러스 배양을 사용하여 입증되었다.
한편, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-1 바이러스의 검출을 위한 다양한 용도로 사용될 수 있다. 가령, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-1 진단 키트 또는 바이오센서에 이용될 수도 있다. 이의 구체적인 적용에 관해서는 대한민국 공개특허공보 제10-2022-0124972, 10-2022-0021791을 참조한다.
이하에서는, 실시예를 통해 본 발명에 대하여 설명한다.
실시예 1.
1.1 재료
SARS-CoV-1 SP는 Optolane Inc.(Seongnam, Korea)으로부터 공급되었다. Luria-Bertani(LB) 중형은 Duchefa(Haarlem, Netherlands)에서 구입했다. M-280 토실기-활성화 자성비드(tosyl - activated dynabeads, 직경: 2.8μm)는 Invitrogen Co.(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했다. 소 혈청 알부민은 Sigma-Aldrich Korea(Seoul, Korea)에서 구입했다. 프라이머는 Bionics(Seoul, Korea)에 의해 맞춤 합성되었다. Klenow DNA 중합효소는 New England BioLabs(Ipswich, MA, USA)에서 구입했다. PCR 정제 미니 키트는 Favorgen(Pingtung, Taiwan)에서 구입했다. Phusion high-fidelity DNA 중합효소는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입했다. sfGFP 라벨이 붙은 Fv-변이체 융합 단백질 플라스미드는 Cosmogenetech(Seoul, Korea)에 의해 맞춤 합성되었다. NATtrol TM SARS-CoV-1 시약(주기 임계값: 25-28) 및 NATtrol TM 음성 대조군 시약(A-549 세포, 50,000 cells/mL)은 Zeptometrix(Buffalo, NY, USA)에서 구입했다.
1.2 준비 및 Fv-라이브러리의 표면발현
구분 염기 서열 서열번호
무작위 정방향 프라이머
(75개 염ㄱ)		 5'-GTCTATTATTGCGCTCGTKRYVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNGATKWY TGGGGTCAAGGTACTACGGTTACG-3' 11
역방향 프라이머
(22개 염기)		 3'-CCCAGTTCCATGATGCCAATGC-5' 12
N = A, C, G, T / R = A, G / K = G, T / Y = C, T / W = A, T / V = A, C, G -
CDR3 영역에서 부위 특이적 돌연변이 유발을 갖는 Fv-라이브러리를 제조하기 위해, 도 1(b)와 같이 CDR3의 무작위화된 서열(75 bp)을 갖는 단일 가닥 정방향 프라이머를 상응하는 역방향 프라이머(22 bp)와 혼합하였다. Fv 라이브러리에 대한 프라이머 시퀀스는 표 1에 요약되어 있다. 정방향 프라이머에서 N, R, K, Y, W, V는 표에 기재된 각 문자에 대응하는 뉴클레오티드로 치환되는 것을 의미한다. 가령, N은 A, C, G, T로, R은 A, G로 치환되는 것을 의미한다. 이어서 프라이머(각각 2μL)의 어닐링(annealing)은 95℃에서 5분 동안 가열한 후 36℃로 냉각하였고, NEB 버퍼(4 μL) 및 DW(32 μL) 등 총 부피 40 μL로 이루어진다. 익스텐션(extension) 반응을 위해 Klenow(exo-) DNA 중합효소(3 μL), NEB 버퍼(16 μL), 10 mM dNTP(8 μL), DW(133 μL)를 첨가하여 총 부피가 200 μL가 되도록 하였다. 이후 37℃에서 15분간 익스텐션 반응을 수행하였다. 75℃에서 20분 동안 효소 반응을 비활성화한 후, PCR 정제 미니 키트를 사용하여 PCP 제품(무작위화된 CDR3 영역이 있는 Fv 라이브러리의 이중 가닥 프라이머)을 여과했다. 무작위화된 CDR3 서열을 포함하는 Fv-라이브러리 플라스미드가 PCR을 통해 준비됐다. Fv-라이브러리 플라스미드는 주형 플라스미드(pST009, 150ng), 이중 가닥 Fv-라이브러리 프라이머 혼합물(150ng), HF 버퍼(10μL), 10mM dNTP(1μL) 및 Phusion high-fidelity DNA 중합효소(0.5 μL) 등 총 부피 50 μL 혼합물을 이용하여 합성되었다. PCR은 다음의 단계에 따라 수행되었다;(1) 초기 변성(denaturation, 98 ℃에서 1분), (2) 변성(98 ℃에서 30초), (3) 어닐링(68 ℃에서 1분),(4) 신장(elongation, 72℃에서 5분),(5)(2)-(4)를 30회 반복 및 (6) 종결(72℃에서 10분). 마지막으로, 주형 플라스미드는 DpnI 제한 효소(16시간 동안 37℃)로 잘렸다(digested). 잘린 Fv-라이브러리 플라스미드를 100K Amicon 필터(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 여과하였다. E. coli BL21(DE3)의 외막에 Fv-라이브러리의 표면발현은 도 1c와 같이 준비된 Fv-라이브러리 플라스미드를 전기영동법을 통해 컴피턴트 세포로 형질전환하여 수행하였다. 형질전환된 E. coli 세포를 50㎍/mL 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 E. coli 세포(100μL)를 99% ℃- 메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol, 8μL), 카나마이신(50μg/mL) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, 5μM)이 포함된 LB 배지(10mL)에서 37℃로 진탕(150rpm)하면서 0.6의 OD600nm 에 도달할 때까지 재배양하였다. Fv-라이브러리 발현을 유도하기 위해, 배양된 E. coli 세포(10 mL, OD600nm = 0.6)를 3시간 동안 진탕(120rpm)하면서 30℃에서 1mM 이소프로필티오-β-갈락토사이드(isopropylthio-℃-galactoside, IPTG)와 함께 인큐베이션하였다.
1.3 표적 Fv 변이체의 스크리닝
SARS-CoV-1 SP에 대한 특이적인 결합 활성을 갖는 E. coli 외막 상의 표면발현된 Fv-라이브러리를 이용하는 표적 Fv-변이체의 스크리닝은 다음 단계를 사용하여 수행하였다:(1) Fv-라이브러리(500μL, OD600 = 0.5)를 SARS-CoV-1 SP(20μg)로 코팅된 M-280 토실기-활성화된(tosyl-activated) 자성비드(dynabeads, 5mg)와 37℃, 10rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. (2) Fv-라이브러리가 결합된 자성비드를 자석을 사용하여 분류하고 0.01% PBST 및 PBS로 비드를 5회 세척하여 결합되지 않은 E. coli 세포를 제거했다. (3) SARS-CoV-1 SP에 대한 E. coli에 결합된 상태의 분리된 자성비드를 PBS(100 μL)에 재현탁하고, (4) PBS에서 분리된 자성비드를 한천 플레이트에 펼쳐 그림 2(b)와 같이 스크리닝된 E. coli 클론을 얻었다. SARS-CoV-1 SP에 대한 스크리닝된 E. coli 클론의 결합 특성은 SARS-CoV-1 SP로 표지된 FITC와 혼합하여 측정했다. 선별된 E. coli(150 μL, OD600 = 0.5)을 FITC 표지 SARS-CoV-1 SP(3.1-100.0 nM)와 1시간 동안 혼합했습니다. 원심분리(3,000×g, 2분) 후, 스크리닝된 E. coli 클론을 0.01% PBST 및 PBS로 세척하였다. PBS에 재현탁한 후 스크리닝된 클론의 형광 강도는 도 3과 같이 488 nm의 파장에서 작동되는 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 기록되었다.
1.4 Fv-변이체의 발현
SARS-CoV-1 SP, sfGFP 및 His-tag 융합 단백질에 대한 결합 활성을 갖는 Fv-변이체의 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 플라스미드 pJY003 및 pJY004는 도 4a에서와 같이 Cosmogenetech에 의해 맞춤 합성되었다. Fv-변이체는 맞춤형 플라스미드를 컴피턴트 세포로 형질전환함으로써 E. coli에서 세포내 발현되었다. 형질전환된 E. coli를 1mM IPTG 및 30㎍/mL 카르베니실린(carbenicillin)을 함유하는 20mL 고염(high-salt) LB 배지에서 30℃, 16시간 동안 배양하였다. E. coli 펠릿을 원심분리(3,000 x g, 3분)를 통해 수집한 다음 3M 요소(urea)가 포함된 50mL의 결합 버퍼(5mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA 및 1M NaCl에 재현탁하였다. 발현된 E. coli는 초음파 반응기(Vibra cell VCX-130, Sonics, USA)를 사용하여 초음파 처리하였다. 용해물을 25,000 x g에서 10분 동안 원심분리했다. 그 다음 상층액의 Fv-변이체를 용출 버퍼(3M 요소 및 500mM 이미다졸 이 포함된 결합 버퍼)를 사용하여 His-tag 정제 컬럼(Roche, Bassel, Switzerland)에서 정제했다. 정제된 단백질을 100rpm, 4℃에서 16시간 동안 투석하여 요소와 이미다졸을 제거하였다.
1.5 발현된 Fv-변이체를 이용한 SPR 바이오센서 및 임피던스 분광법
Anti-SP1 및 Anti-SP2에서 얻은 발현된 Fv-변이체의 SPR 측정은 I-Cluebio(Seongnam, Korea)의 SPR 바이오센서를 사용하여 측정했다. 분석 구성은 SPR 바이오센서의 금 표면(gold surface)에 고정화된 발현 Fv-변이체 또는 SARS-CoV-1 SP를 사용하여 준비되었다. SPR 측정을 위한 SPR 칩은 BK-7 유리(11 ℃cm 2)에 접착층으로 티타늄(두께: 2 nm) 및 금(두께: 48 nm)으로 스퍼터 코팅된 단계를 사용하여 제조되었다. 도 4b 및 도 4c는 SPR 칩이 Fv-변이체 또는 SARS-CoV-1 SP(각각 20μg /mL)와 함께 4 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션되었음을 보여준다. PBS로 세척한 후 BSA(1 mg/mL)로 비특이적 차단을 위한 인큐베이션을 1시간 동안 수행했다. 세척 단계 후, 결합 단계로서 SARS-CoV-1 SP(3.7-30.0 nM) 또는 Fv-변이체(15.0-120.0 nM) 용액을 플로우 셀에 10분(15μL /min) 동안 주입했다. 마지막으로, 해리 단계로서 PBS를 10분(15μL /min) 동안 플로우 셀에 주입했다.
도 5b에 도시된 바와 같이 희석된 NATtrol TM SARS-CoV-1 및 1.0 Х10 2 배(Ct 값 = 33.1) ~ 1.0 Х10 4 배(Ct 값 = 39.4)의 희석 범위의 음성 샘플을 사용하여 SPR 바이오센서를 이용하는 방법으로 기술한 바와 같이 분석했다. SPR 측정은 시료를 유동 조건에서 처리하여 수행하였으며, 해리 단계 후에 결합된 분석물의 양에 따른 SPR 신호를 기록하였다.
임피던스 분광법은 IVIUM Technologies(Eindhoven, Netherlands)의 3전극 시스템과 상용 전위 가변기(potentiostat)를 이용하여 수행되었다. SiO2 웨이퍼를 금(두께: 100 nm)으로 증착하고 전극으로 사용했다. 발현된 Fv-변이체(20 μg/mL)를 2시간 동안 전극에 고정화시켰다. BSA(1 mg/mL)로 비특이적 차단을 위한 인큐베이션을 전극에서 1시간 동안 수행했다. 희석된 NATtrolTM SARS-CoV-1 시료와 음성 시료를 전극에 첨가하고 1.0 Х102 배(Ct 값 = 33.1) ~ 1.0 Х104 배(Ct 값 = 39.4)의 희석 범위에서 30분간 배양했다. 각 검출은 0.01% PBST 및 PBS 로 세척 단계 후에 수행되었다. 임피던스 분광법은 도 5c와 같이 0.1Hz ~ 1MHz(진폭: 10mV)의 주파수 범위에서 Ag/AgCl 기준 전극(진폭: 50mV)과 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide, 50mM)에서 수행되었다. 측정된 임피던스 값은 병렬 전하 이동 저항(Rct)과 이중층 정전 용량(Cdl)과 직렬 중간 저항(Rs)의 조합으로 구성된 Randles 등가 회로 모델을 사용하여 수행되었다.
실시예 2.
2.1 SARS-CoV-1 SP에 대한 Fv 변이체의 스크리닝
3개의 CDR 영역이 있는 Fv-라이브러리는 CDR3 영역을 무작위화하여 이전에 보고된 대로 준비했다(Jung et al., 2021c; Jung et al., 2021d; Lee et al., 2021; Sung et al., 2022a; Sung et al., 2022b). 또한, Fv-라이브러리와 동일한 CDR1 및 CDR2 영역을 갖는 돌연변이 균주도 제조하였다. CDR1, 2의 서열은 표 2에 기재되어 있다.
항체 아미노산 서열 서열번호
CDR1 TYGIQ 1
CDR2 WIHAGTGGTKYSRKFQG 2
형광 표지된 SARS-CoV-1 SP를 Fv-라이브러리, 대조군 균주(CDR1 및 CDR2만 포함) 및 온전한 E. coli(표면발현 Fv 제외)에 추가한 후, 유세포 분석을 수행했고 그 결과 도트 플롯(dot plot)을 Fv-라이브러리와 비교했다.
도 2a는 Fv-라이브러리가 대조군 균주(CDR1 및 CDR2만 있는 경우) 및 절단에 대해 손상되지 않은 E. coli(Fv가 표면발현되지 않음)와 비교할 때 도트 플롯에서 컷-오프값(그래프에서 점선으로 표시됨)을 넘어 높은 형광 영역을 나타냄을 보여준다. 따라서, Fv-라이브러리의 높은 형광 영역은 일부 Fv-변이체의 CDR3 영역이 높은 친화도로 형광 표지된 SP에 결합할 수 있음을 나타낸다. SP에 대한 높은 친화도를 갖는 후보 Fv-변이체는 고정화된 SP와 함께 자성비드를 사용하여 분리되었다.
SP에 대한 특정 친화도를 갖는 Fv-변이체는 E. coli의 외막에 있는 Fv-라이브러리로부터 표면발현으로 선별되었다. 그림 2(b)는 SP가 토실기-활성화된 자성비드에 공유적으로 고정되어 있음을 보여준다. 고정화된 SP를 갖는 자성비드를 Fv-라이브러리와 함께 인큐베이션하여 SP에 대한 결합 친화성을 갖는 Fv-변이체를 갖는 E. coli을 스크리닝 하였다. 외부 자석을 이용하여 E. coli가 결합된 자성비드를 분리한 후 한천 플레이트에서 배양하였다. 이들 클론을 추가로 분석하여(1) 배양된 클론의 Fv-변이체가 주형 서열과 비교할 때 CDR3 영역에 대한 다양한 유전 서열을 갖고, (2) 형광 표지된 SP를 이용하여 Fv-변이체가 SP에 대해 특이적 친화성을 갖는다는 것을 확인하였다.
배양된 콜로니 중 Fv-라이브러리에서 무작위로 21개를 선택하였다. 도 2(c)는 무작위화된 CDR3 영역에 대한 염기서열이 분석되었고, 6개의 클론(클론번호 1, 4, 7, 9, 18, 및 20)은 주형 서열과 비교할 때 부위지정(site-directed) 돌연변이 유발로부터 적절한 뉴클레오티드 서열을 갖는 형광 표지된 SP에 대한 결합 친화도를 갖는 것으로 결정되었다는 것을 보여준다. 6개의 클론들의 아미노산 서열을 표 3에 기재하였다.
항체 아미노산 서열 서열번호
클론번호 1_CDR3 GLSRPGLVKDV 3
클론번호 4_CDR3 GRTTGNDRPDY 4
클론번호 7_CDR3 GRRPIVISMDY 5
클론번호 9_CDR3 GNPKRARKPDD 6
클론번호 18_CDR3 CLRQAGTADDV 7
클론번호 20_CDR3 GVAVRLIPLDF 8
나머지 14개 클론은 염기서열이 부적절하였다: 2개 클론은 염기가 결실되었고, 2개 클론은 반복 염기서열을 갖고, 10개 클론은 결합활성이 없거나 부위지정 돌연변이 전 주형 플라스미드와 동일한 염기서열을 가졌다.
형광표지된 SP의 결합이 형광염료(fluorescein)에서 발생하는지 알아보기 위해, 적절한 염기서열을 갖는 6개의 선택된 클론(클론번호 1, 4, 7, 9, 18 및 20)을 형광 표지된 SP 및 형광염료 염료와 반응시켰다. 6개의 선별된 클론에 형광염료를 반응시켰을 때, 4개의 클론(Clone No. 1, 7, 9, 20)에 대해 현저한 형광 시그널이 관찰되었고, 이는 도 2d에 표시된 것처럼 표지된 형광 염료(fluorescein)를 통해 이러한 클론에 대한 형광 표지된 SP의 비특이적 결합을 나타낸다. 또한, SP에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 2개의 표적 클론이 결정되었고(클론번호 4 및 18), 클론번호 4(아미노산 서열: 1 GRTTG 5 NDRPD 11 Y)에 대해 "Anti-SP1", 클론번호 18(아미노산 서열: 1 CLRQA 5 GTADD 11 V)에 대해 "Anti-SP2"로 명명되었다. 스크리닝된 클론번호 4 및 18의 아미노산 서열에 대한 정보가 표 4에 정리되어 있다.
항체 아미노산 서열 서열번호
클론번호 4 CDR1 TYGIQ 1
CDR2 WIHAGTGGTKYSRKFQG 2
CDR3 GRTTGNDRPDY 4
VH EVQLVESAAEVRRPGASVKITCKASGYSFSTYGIQWMRQAPGQRPEWLGWIHAGTGGTKYSRKFQGRITITRDTSANTVYLDLNSLTSEDTAVYYCARGRTTGNDRPDYWGQGTTVTVSS 9
클론번호 18 CDR1 TYGIQ 1
CDR2 WIHAGTGGTKYSRKFQG 2
CDR3 CLRQAGTADDV 7
VH EVQLVESAAEVRRPGASVKITCKASGYSFSTYGIQWMRQAPGQRPEWLGWIHAGTGGTKYSRKFQGRITITRDTSANTVYLDLNSLTSEDTAVYYCARCLRQAGTADDVWGQGTTVTVSS 10
2.2 스크리닝된 Fv 변이체의 결합능
두 개의 스크리닝된 클론의 결합 친화도를 유세포 분석을 사용하여 분석했다. 처음에 2개의 스크리닝된 클론으로부터의 형광 신호를 형광염료로 표지된 SARS-CoV-1 SP로 처리한 후에 CDR1 및 CDR2를 갖는 돌연변이 균주와 비교하였다.
도 3a는 두 개의 스크리닝된 클론(Anti-SP1 및 Anti-SP2)에 대해 얻은 도트 플롯이 돌연변이 균주와 비교할 때 훨씬 더 높은 형광 신호를 나타냄을 보여준다. 이러한 결과는 두 개의 스크리닝된 클론이 SP에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖는 Fv-변이체를 가졌음을 보여준다. 스크리닝된 Fv-변이체의 결합 상수(KD)를 평가하기 위해, 2개의 스크리닝된 클론으로부터 관찰된 형광 신호를 상이한 농도의 형광염료 표지된 SP로 처리할 때 분석하였다. 도 3b는 연구된 농도 범위에서 정량적으로 증가하는 형광 신호가 관찰되었으며 돌연변이 균주에 대해 관찰된 신호는 기준선 수준에서 유지되었음을 보여준다. Fv-변이체의 KD 값을 평가하기 위해 피크 값을 형광 신호로 취했다. 용량-반응 곡선은 형광 표지된 SP의 농도에 대한 형광 신호를 플롯팅하여 얻었다. 등온선 모델을 사용하여 용량-반응 곡선을 피팅함으로써 KD 값은 Anti-SP1의 경우 80.5 ± 3.6 nM, Anti-SP2의 경우 45.6 ± 8.9 nM 으로 측정되었다(n = 3). 문헌에 따르면 숙주의 ACE2 수용체에 대한 SARS-CoV-1 SP의 KD는 31-100 nM 범위이다(Lan et al., 2020; Walls et al., 2020; Wrapp et al., 2020; Zahradn℃k et al., 2021). 이러한 결과는 두 개의 스크리닝된 Fv-변이체가 SARS-CoV-1 SP에 대해 비교적 높은 결합 친화도를 갖는다는 것을 보여준다.
3개의 CDR 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과 CDR 영역 사이의 프레임워크 영역을 포함하는 Fv-변이체는 도 4(a)에 나타낸 바와 같이 sfGFP의 융합 단백질로 발현되었다. SP가 SPR 칩에 고정화된 후, 도 4b와 같이 3.8-30.0 nM 범위에서 발현된 Fv-변이체의 다른 농도가 추가되었다. SP에 대한 발현된 Fv-변이체의 결합은 SPR 센서를 사용하여 모니터링되었으며, 이는 연속 흐름 조건하에서 연관되고 해리되었다. SP에 대해 발현된 Fv-변이체의 KD 값은 Anti-SP1에서 발현된 Fv-변이체에 대해 14.1 ±1.6 nM, Anti-SP2에서 발현된 Fv-변이체에 대해 16.2 ±3.4 nM으로 측정되었다(n = 3). 발현된 Fv-변이체를 SARS-CoV-1 검출에 적용하기 위해, SARS-CoV-1 SP에 대해 고정화된 Fv-변이체의 KD 값도 SPR 바이오센서를 사용하여 측정하였다. 발현된 Fv-변이체는 SPR 바이오센서에 고정되었고 도 4c와 같이 15.0-120.0 nM 범위의 다양한 농도의 SARS-CoV-1 SP가 추가되었다. 발현된 Fv-변이체에 대한 SP의 결합은 동일한 연속 흐름 조건에서 SPR 센서를 사용하여 모니터링되었으며, SP에 대해 발현된 Fv-변이체의 KD 값은 Anti-SP1에서 발현된 Fv-변이체에 대해 41.7 ±1.4 nM, Anti-SP2에서 발현된 Fv-변이체에 대해 42.2 ±1.2 nM으로 측정되었다(n = 3). 이러한 결과는(1) SPR에 대한 고정화된 Fv-변이체의 결합 상수가 나노몰 범위에 있는 것으로 측정되었고, (2) 고정화된 Fv-변이체가 SARS-CoV-1의 검출에 사용될 수 있음을 보여준다.
2.3 발현된 Fv-변이체를 사용한 SARS-CoV-1의 검출
발현된 Fv-변이체는 SPR 바이오센서 및 임피던스 분광기를 사용하여 SARS-CoV-1을 검출하는데 사용되었다.
실제 시료는 의료용 시료와 조성이 유사한 Zeptometrix(Buffalo, NY, USA)의 SARS-CoV-1 NATtrol TM 시약을 사용하였다. NATtrol TM 시약의 주기 역치(Ct) 값은 SARS-CoV-1의 경우 평균 26.5 범위였다(Wei et al., 2021; Park et al., 2022). RT-PCR을 이용한 SARS-CoV-1 진단의 컷오프 Ct 값은 35로 보고된 바 있다 (Lau et al., 2003; Poon et al., 2003). 본 연구에서는 NATtrol TM 시약을 연속 희석하여 SPR 바이오센서와 임피던스 분광법을 이용한 진단용 표준시료를 준비하였다. 음성 대조군으로는 SPR 바이오센서 및 임피던스 분광기에서 Zeptometrix(Buffalo, NY, USA)의 SARS-CoV-1이 포함되지 않은 NATtrol TM 음성 시약을 사용했다. 도 5a는 SPR 바이오센서의 센서 표면과 임피던스 분광계의 금 전극에 발현된 Fv 변이체를 고정화함으로써 준비한 SARS-CoV-1 검출에 사용된 분석 구성을 보여준다.
SPR 측정은 26.5의 평균 Ct 범위에서 1.0 × 102배(Ct 값 = 33.1) ~ 1.0 × 104배(Ct 값 = 39.4) 범위로 희석된 NATtrol ?? SARS-CoV-1 시약에서 얻은 희석된 SARS-CoV-1 샘플을 처리하면서 수행하였다. 시료를 유동 조건에서 처리하여 SPR 측정을 수행하였으며, 도 5b와 같이 해리 단계 후 결합된 분석물질의 양에 따른 SPR 신호를 기록하였다. SARS-CoV-1의 검출은 1.0 Х 102배(Ct값=33.1)~1.0 × 104 배(Ct값=39.4)의 희석 범위에서 가능했다; 음성 샘플의 SPR 신호는 기준선 수준에서 유지되었다. 검출 한계는 Anti-SP1의 Fv-변이체에 대해 3.0 Х104 배(Ct 값 = 38.2), Anti-SP2의 Fv-변이체에 대해 2.0 Х104 배(Ct 값 = 38.7)의 희석 계수로 측정되었다. 이러한 결과는 SARS-CoV-1에 대해 스크리닝된 두 개의 클론에서 얻은 Fv-변이체를 고정화한 SPR 바이오센서를 사용하여 기존에 사용된 컷오프 값 35와 비교할 때 SARS-CoV-1 SP의 의학적 진단이 가능했음을 보여준다.
임피던스 분광법은 희석된 SARS-CoV-1 샘플을 1.0 Х 10 2 배(Ct값=33.1) ~ 1.0 Х 104 배(Ct값=39.4)의 동일한 희석 범위로 처리하여 수행하였다. 도 5c와 같이 세척 단계 후 임피던스 스펙트럼의 x-cut에 기록된 결합된 분석물질의 양에 따른 임피던스 신호와 유동 조건에서 시료를 처리한 후 임피던스 분광법을 수행하였다. X-cut 값은 전하이동 저항(R ct)을 나타내며, 이는 전극으로의 전하 이동에 필요한 저항이다. SARS-CoV-1에 결합하면 Rct 값이 정량적으로 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 고정화된 Fv-변이체에 대한 SARS-CoV-1의 특이적 결합을 나타낸다. SARS-CoV-1의 검출은 1.0 Х 10 2 배(Ct값=33.1) ~ 1.0 Х 104 배(Ct값=39.4) 범위에서 가능했고, 음성 시료의 임피던스 신호는 기준선에서 유지되었다. 검출 한계는 Anti-SP1의 Fv-변이체에 대해 4.0 Х 104 배(Ct 값 37.7) 및 Anti-SP2의 Fv-변이체에 대해 3.0 Х 104 배(Ct 값 38.2)로 측정되었다. 이러한 결과는 SARS-CoV-1 SP에 대해 스크리닝된 두 클론에서 얻은 고정화된 Fv-변이체를 활용한 임피던스 분광법을 사용한 SARS-CoV- 1의 의학적 진단의 가능성을 보여준다.
위에서 설명한 각 실시예들을 정리하면 다음과 같다.
표면발현 기술을 사용하여 E. coli의 외막에 Fv 라이브러리를 준비했다. SARS-CoV-1 SP에 대해 특이적 친화성을 갖는 Fv-변이체는 SP로 고정화된 자성비드를 사용하여 스크리닝 되었다. Fv-라이브러리의 스크리닝을 통해 SP에 대한 특이적인 결합력을 가진 2개의 타겟 클론(클론번호 4 및 클론번호 18)이 결정되었고, 스크리닝된 클론은 클론 클론번호 4(CDR3 아미노산 서열: 1 GRTTG 5 NDRPD 11 Y)에 대해 "Anti-SP1" 및 클론번호 18(CDR3 아미노산 서열: 1 CLRQA 5 GTADD 11 V)에 대해 "Anti-SP2"로 명명되었다. 두 개의 스크리닝된 클론의 결합 친화도를 유세포 분석을 사용하여 분석했다. 이 두 개의 스크리닝된 클론에서 관찰된 형광 신호는 형광염료로 표지된 SARS-CoV-1 SP로 처리한 후에만 CDR1 및 CDR2가 있는 돌연변이 균주와 비교되었으며 KD 값은 Anti-SP1의 경우 80.5 ± 3.6 nM, Anti-SP2의 경우 45.6 ± 8.9nM으로 측정되었다. 문헌에서 숙주의 ACE2 수용체에 대한 SARS-CoV-1 SP의 결합 친화도는 31-100 nM 인 것으로 보고되었다. 이러한 결과는 두 개의 선별된 Fv-변이체가 SARS-CoV-1 SP에 대해 비교적 높은 결합 친화도를 가짐을 보여준다. 또한, 3개의 CDR 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 CDR 영역 사이의 프레임워크 영역을 포함하는 Fv-변이체는 sfGFP의 융합 단백질로 발현되었다. SP에 대한 발현된 Fv-변이체의 결합은 SPR 센서를 사용하여 모니터링되었고, SP에 대한 표현된 Fv-변이체의 KD 값은 Anti-SP1에서 표현된 Fv-변이체에 대해 14.1 ±1.6 nM, Anti-SP2에서 표현된 Fv-변이체에 대해 16.2 ±3.4 nM으로 측정되었다(n = 3). 발현된 Fv-변이체를 SARS-CoV-1 검출에 적용하기 위해, SARS-CoV-1 SP에 대한 고정화된 Fv-변이체의 KD 값도 SPR 바이오센서를 사용하여 측정하였다. 분석 결과는 (1) SPR에 대한 고정화된 Fv-변이체의 결합 상수가 나노몰 범위에 있는 것으로 측정되었고, (2) 고정화된 Fv-변이체가 SARS-CoV-1의 검출에 사용될 수 있음을 보여주었다. 마지막으로, SARS-CoV-1 SP(Anti-SP1 및 Anti-SP2)에 대한 두 개의 선별된 클론에서 발현된 Fv-변이체를 SARS-CoV-1의 NATtrol TM 시약을 사용하여 SARS-CoV-1 검출에 적용했다. SARS-CoV-1의 의학적 진단은 SPR 바이오센서와 SARS-CoV-1 SP에 대해 스크리닝된 두 클론에서 얻은 고정화된 Fv-변이체를 활용하는 임피던스 분광법을 사용하여 실현 가능한 것으로 입증되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. SARS-CoV-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항체는 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2, 서열번호 4의 CDR3을 포함하는 가변영역; 및
    서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2, 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 1의 HCDR1, 서열번호 2의 HCDR2, 서열번호 4의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 1의 HCDR1, 서열번호 2의 HCDR2, 서열번호 7의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 13과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 14와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 도메인 항체 형태인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-1을 검출하기 위한 용도인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  8. 청구항 7에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  9. 청구항 8에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  10. 청구항 9에 있어서,
    동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포로 구성된 군에서 선택되는 것인 세포.
  11. 청구항 9에 있어서,
    원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포, 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichiapastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurosporacrassa)에서 선택되는 것인 세포.
  12. 다음 단계를 포함하는 SARS-CoV-1 검출용 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 청구항 9항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양액 및/또는 상기 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  13. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 SARS-CoV-1 진단 키트.
  14. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 면역친화성 바이오센서.
KR1020220150156A 2022-11-11 2022-11-11 SARS-CoV-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서 KR20240072325A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2023/017217 WO2024101762A1 (ko) 2022-11-11 2023-11-01 Sars-cov-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240072325A true KR20240072325A (ko) 2024-05-24

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112010965B (zh) 一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白RBD区的单克隆抗体及其应用
CN111778218B (zh) 噬菌体展示抗体库及基于其淘筛获得的针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体
CN113264998B (zh) 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用
WO2021244089A1 (zh) 新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用
CN112390879B (zh) 靶向SARS-CoV-2的抗体及其制备方法和应用
CN113150129B (zh) 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S2蛋白的单链抗体及其应用
JP2015531597A (ja) 安定化された免疫グロブリン可変ドメイン選別方法及び選別されたドメインの応用
Liu et al. Selection, characterization, and thermal stabilization of llama single domain antibodies towards Ebola virus glycoprotein
US9458244B2 (en) Single chain multivalent binding protein compositions and methods
KR20210031946A (ko) Ns1 단백질의 결합 단백질 및 응용
WO2022061594A1 (zh) 新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用
CN109134647B (zh) Ns1蛋白的结合蛋白
KR20210056362A (ko) Ns1-결합 단백질
JP7307158B2 (ja) 抗ヒト心筋型トロポニンｉ抗体及びその応用
KR20240072325A (ko) SARS-CoV-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서
WO2024101762A1 (ko) Sars-cov-1 검출용 항체 및 이를 이용한 면역친화성 바이오 센서
US20240117012A1 (en) Anti-sars-cov-2 antibody
JP5137266B2 (ja) 抗原濃度測定法
KR101791503B1 (ko) 신경괴사바이러스에 대한 항체 및 그의 용도
KR101955906B1 (ko) 적색 도미 이리도바이러스에 대한 항체 및 그의 용도
JP7414225B2 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド
KR102671155B1 (ko) Ns1 단백질의 결합 단백질
CN113214393B (zh) Il-6抗体或其抗原结合片段及包含其的检测试剂盒
CN116496392B (zh) 抗新型冠状病毒n蛋白单域抗体、融合蛋白及其编码基因和应用
CN116547004A (zh) SARS-CoV-2结合肽