CN107422133A

CN107422133A - 用于诊断目的的选择性测定降钙素原1‑116的方法、以及实施该方法的抗体和试剂盒

Info

Publication number: CN107422133A
Application number: CN201611048598.7A
Authority: CN
Inventors: A·贝格曼; J·施特鲁克
Original assignee: Universita di Pisa
Current assignee: Universita di Pisa
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2017-12-01
Also published as: EP2032992B1; ES2331936T3; JP2010519322A; WO2008104321A1; EP2032992A1; US20100056763A1; CN101617230A; US8354506B2; DE102007009751A1; JP5520609B2; DE602008000117D1; US9664689B2; US20130122515A1; ATE441116T1

Abstract

本发明涉及用于诊断目的的、测定患者的生物学样品中的降钙素原和降钙素原衍生物的免疫诊断方法，其中所述的诊断目的具体而言为监测和控制治疗情况，以及监测局部或系统性细菌感染、发炎、脓血症或神经退行性疾病的进程，其中选择性地测定那些分子形式的降钙素原、或由其衍生的降钙素原部分肽，其中所述的肽在完整降钙素原1‑116(SEQ ID NO:1)的氨基末端的位置1和2处具有氨基酸甘氨酸和脯氨酸(Ala‑Pro，AP)，并且本发明还涉及实施上述方法的抗体和试剂盒。

Description

用于诊断目的的选择性测定降钙素原1-116的方法、以及实施该方法的抗体和试剂盒

本申请是申请日为2008年2月21日、申请号为200880005375.X、发明名称为“用于诊断目的的选择性测定降钙素原1-116的方法、以及实施该方法的抗体和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及医学诊断领域，具体而言，本发明涉及通过免疫诊断方法来测定生物学流体中的生物学标记物。更准确地说，本发明涉及用于诊断目的的肽降钙素原(procalcitonin)的测定，其是至今不可获得的选择性测量的数值，针对完整降钙素原1-116进行测定，并且特别地用地更灵敏地早期诊断，监测治疗情况，以及监测系统性或局部感染的进程，特别是细菌感染的和脓毒症的进程。

在本发明的内容中，诸如“诊断”或“用于诊断目的”之类的术语用作用于医学测定中的常规术语，根据实施所述测定的患者的临床状况，所述的医学测定引起了不同的问题，并且所述的医学测定具体用于诊断和早期诊断，严重性的测定以及进展情况的估测(包括对进展情况的伴随治疗的估测，对疾病的未来进展情况的预后，以及患者的危险分层(stratification))。在以下的说明书中，即使具体关注于经改善的、对进展情况和治疗的监测，但是术语“用于诊断目的”并非限于这种特定的诊断目的。

成熟的激素原降钙素原(PCT)为这样的肽，该肽由116个氨基酸构成，其首先是作为重要的激素降钙素的前体(甲状腺降钙素(thyreocalcitonin))而论述的，并且所述肽的完整的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)已经被人们所知已久，已有其正常的蛋白水解降解的详细情况，该蛋白水解降解导致释放成熟的激素降钙素和其他的短肽，具体包括所谓的降钙素(降钙素原96-116)和N-末端肽(N-降钙素原1-57)(其在本文中被特别称为“PCT部分肽”)。例如，在本申请人的专利EP 0 656 121 Bl或US 5,639,617中、以及出版物ASSICOTM.,GENDREL D.,CARSIN H.,RAYMOND J.,GUILBAUD J.,BOHUON C.(1993):High serumProcalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection.Lancet341:515-518中更明确说明的那样，发生系统性发炎反应的严重的细菌感染、以及某些寄生虫和真菌的感染诱导循环系统中PCT的释放，此时发现PCT的量极高并且容易测定(例如还可以参见综述文章：O'CONNOR E.,VENKATESH B.,LIPMAN J.,MASHONGONYIKA C,HALL J.(2001):Procalcitonin in critical illness.Critical Care and Resuscitation 3:236-243；WHICHERI.,BIENVENU J.,MONNERET G.(2001):Procalcitonin as an acutephase marker.Annals of Clinical Biochemistry 38:483-893；BECKER K.L.,NYLENE.S.,WHITE J.C,MUELLER B.,SNIDER R.H.(2004):Procalcitonin and the calcitoningene family of peptides in inflammation,infection and sepsis:a journey fromprocalcitonin back to its precursors.Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism 89:1512-1525)。另一方面，病毒、自身免疫和过敏性疾病都不能导致血液中可测定的PCT的浓度发生显著的升高。PCT反映了细菌感染的严重程度，并且被用作用于诊断和治疗性监测细菌起因的脓血症、严重脓血症和脓血性休克(DANDONA P.,NIX D.,WILSONM.F.,ALJADA A.,LOVE J.,ASSICOT M.,BOHUON C.(1994):Procalcitonin increaseafter endotoxin injection in normal subjects.Journal of ClinicalEndocrinology and Metabolism 79:1605-1608；GENDREL D.,ASSICOT M.,RAYMOND J.,MOULIN F.,FRANCOUAL C.,BADOUAL J.,BOHOUN C.(1996):Procalcitonin as a markerfor the early diagnosis of neonatal infection.Journal of Paediatrics 128:570-573；SNIDER R.H.JR.,NYLEN E.S.,BECKER K.L.(1997):Procalcitonin and itscomponent peptides in systemic inflammation:immunochemicalcharacterization.Journal of Investigative Medicine 45:552-560；WHANG K.T.,STEINWALD P.M.,WHITE J.C,NYLEN E.S.,SNIDER R.H.,SIMON G.L.,GOLDBERG R.L.,BECKER K.L.(1998):Serum calcitonin precursors in sepsis and systemicinflammation.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83:3296-3301；MUELLER B.,BECKER K.L.,SCHACHINGER H.,RICKENBACHER P.R.,HUBER P.R.,ZIMMERLIW.,RITZ R.(2000):Calcitonin precursors arereliable markers of sepsis in amedical intensive care unit.Critical Care Medicine 28:977-983)。在所述的专利和参考文献中记录的普通的技术知识都明确地用于补充本说明书。

所述的PCT的测定还可以用于差异诊断目的，这是因为根据血清和血浆中可测定的PCT的浓度，可以将基于细菌感染的发炎性疾病与那些非感染性病因的疾病区分开(还可以参见EP 0 880 702 Bl)。这种可行的区分已经证实，对于控制治疗中抗生素的使用是非常有价值的，这是因为可以在由于患者未患有细菌感染而导致抗生素是无效的情况下，避免施用抗生素。

此外，已经进行了一些尝试来测定在脑脊液(CSF)受到感染的情况下的降钙素原。在所述文献中描述的所有情况下，采用了开发用于脓血症诊断并具有功能性测定灵敏度(FAS)仅为300ng/l的商业测定法。所得的测定结果是矛盾的。但是，如在刚刚公开的专利申请DE 10 2005 034 174.8中、或者在WO 2007/009789中所描述的那样，如果采用更灵敏的测定法(而且这些方法已经被使用了一段时间)，则可以得到更显著的测定结果。采用所述的测定法，即使在神经退行性疾病的情况下，也可以得到可测量的PCT免疫反应性与疾病严重程度之间的、明显的相关性。即使下文中没有特意论述CSF中PCT的测定情况，但是该内容也明确地在使用根据本发明的方法的本发明的范围内，其中在本文中，所述的根据本发明的方法还在诊断的部分领域中有描述。

尿中的测定也大体被本发明所涵盖。

按照上文所述的专利和参考文献中所述，通过使用了两种抗体的夹层式免疫测定法来以合适的方式进行PCT的测定，其中所述的两种抗体与完整的PCT肽的氨基酸序列结合，这样经完全处理的、释放出降钙素的PCT不能被检测到，而全部未经处理的PCT以及可任选的那些更长的PCT部分肽(其在单个分子中仍具有针对在夹层式测定方法中使用的两个抗体的两个结合位点)则被检测到，该检测不能区分任选的、末端经修饰的PCT形式。传统的方法使用了通常与完整的PCT肽的一些节段相结合的两种抗体，其中在形成降钙素的PCT蛋白水解过程中，所述的节段位于所形成的PCT部分肽中的不同的PCT部分肽上，或者位于不包含降钙素序列的PCT部分肽上。

在EP 1 121 600 Al或EP 1 408 334 Al或US 6,756,483中说明了这样的事实，在患有脓血症的情况下并未在血清或血浆中发现或者至少并未主要发现完整的PCT 1-116(SEQ ID NO:1)，而是发现了少了2个氨基酸的PCT 3-116(SEQ ID NO:2)，其中所述的文献用于补充本发明的说明书。此外，在本发明的内容中，参考了以下出版物：W,STRUCK J,FISCHER-SCHULZ C,MORGENTHALER NG,OTTO A,BOHUON C,BERGMANN A:Isolation and characterization of serum procalcitonin from patients withsepsis.Peptides 2001；22:2099-103。如在所述出版物中说明的那样，具有降钙素原免疫反应性的唯一的生物分子(其可在得自脓血症患者的所研究的样品中表征)为所提及的降钙素原3-116(SEQ ID NO:2)。在其他著作：WRENGER S,KAHNE T,BOHUON C,W,ANSORGE S,REINHOLD D:Amino-terminal truncation of procalcitonin,a markerfor systemic bacterial infections,by dipeptidyl peptidase IV(DP IV)；FEBS Lett2000；466:155-9中，表明所述的降钙素原3-116可以通过二肽基-氨基肽酶IV(DAP IV；DPIV；CD 26；E.C.3.4.14.5的作用从合成方式制备的降钙素原1-116获得。

所述的出版物均未揭示，在脓血症和感染情况下表征的降钙素原3-116是否是直接分泌的，或者是否是由降钙素1-116(PCT 1-116)(其以中间体形式被释放到循环系统中)形式的“完整”前体经过蛋白水解而依次形成的。所述的出版物仅仅揭示了，在所研究的生物学样品(全血、血清或血浆)中“完整的降钙素原”1-116是否以可测定的稳定状态的浓度形成，或者“完整的降钙素原”1-116是否明显有助于在传统的降钙素原测定中所得到的测定信号。

就血清/血浆中降钙素原免疫反应性的测定而言，有多种本申请人的商业测定法，例如化学发光测定法B.R.A.H.M.S PCT LIA(B.R.A.H.M.S AG)，该测定法具有大约300ng/l的FAS，并且适于脓血症(在这种情况下可以形成极高浓度的PCT)中PCT的测定。就具有更高灵敏度的PCT的测定而言，最近研发出经修改的夹层式免疫测定法，该方法是使用亲合纯化的多克隆抗体来进行的，并且在MORGENTHALER N.G.,STRUCK J.,FISCHER-SCHULZ C,BERGMANN A.(2002):Sensitive immunoluminometric assay for the detection ofprocalcitonin.Clinical Chemistry 48:788-789,and is available as B.R.A.H.M.SPCTsensitiv LIA(B.R.A.H.M.S AG)中进行了更详细的描述。该测定法具有为7ng/l的基本更好的功能性测定灵敏度(FAS)。通过这种测定法辅助，可以测定健康人中的平均PCT血清浓度为13.5ng/l(13.598/ml)，已经发现其值为<7至63ng/l，并且97.5％为42.5ng/l。

为了使医院的医师能够直接在医院内(“及时现场护理(point-of-care)”)快速地检查潜在脓血症患者的状态，利用了用于快速半定量测定患者的人血清或人血浆中的降钙素原的、免疫层析测定法形式的一步快速测试方法(PCT-Q；B.R.A.H.M.SAktiengesellschaft)。

例如，从上文所述的出版物和综述文章显而易见的是，目前在化学常规方法中已经确切地建立了主要用于脓血症的早期诊断的、生物标记物降钙素原的测定方法。这种方法成功的原因在于脓血症或细菌感染与患者血液或血清/血浆中可测定的PCT的免疫反应性增高之间所存在的可靠的相关性，以及由于脓血症患者血液中所达到的高浓度而得到的PCT免疫反应性的相对简单的可测定性(这是由于至少主要在测定过程中所检测的PCT 3-116的高度稳定性)。

尽管针对上述目的的、目前可用的测定法在PCT免疫反应性的测定方面具有毋庸置疑的优点，但是本发明人发现，所测定的PCT免疫反应性的高度稳定性和高浓度对于某些临床相关性的诊断问题同样具有某些缺点：

分析物(例如诸如PCT 3-116之类的肽)的高度稳定性或“长寿命”是指这种分析物的测量提供了这样的大致的信息，即，已经丧失的分泌活性会持续相对长的时间。例如，如果假定在急性病理过程中会或多或少地持续地生产分析物，则稳定的分析物会在生物学样品中积聚，并且这种分析物之前的生理生产是以累积方式由其可测量的浓度所反映的，但随着浓度的降低而减少，这种情况在同一时期内以其生理学清除速率下发生(分析物由所述样品中的消失是由于其转化为不能以分析方法检测到的降解产物、通过肾脏排泄或者通过本身已知的其他生理学机制)。分析物的寿命越长或者其清除速率越低，则确切的测量时间对分析物的上文所述的“形成”或“分泌”的测定的影响就越小。例如，在这种描述下，在相对长的时间内保持恒定的浓度是指形成与清除之间彼此平衡。如果浓度降低，可能表示以“浓度补充”方式发挥作用的分析物的分泌减少。然而，血液中分析物的浓度仍可能具有较高的值。但是，如果可测量的浓度值较高，并且清除速率较低，则分析物分泌的变化表明相对大量的分析物本身发生了相对较小的、无法解释的变化。

此外，如果临床医生由于希望基于分析物分泌的变化而对治疗的成功或复发或再感染得出一些结论，而恰好关注于分析物分泌中快速形成的变化，则基于“长寿命”分析物的测量浓度值经常难以识别这种快速且明确的变化。因此，就可以快速且可靠地识别降钙素原分泌的变化而言，本发明人将他们的目标设定为改善降钙素原的测定方法，使得识别治疗的成功或者引入所需的治疗干预的时间更短，并且可能获得其他的之前不可得的信息，当医师必须首次对患者进行估测时，所述的信息可以对感染/脓血症已经进展的程度立即得到结论。

所述的目标是通过根据权利要求1至12所述的方法、以及通过提供这些方法所需的根据权利要求13至15所述的新型抗体、以及根据权利要求16至22所述的相应的试剂盒而实现的。

通过以下的说明书以及实施例的说明，具体而言给定的测量结果的讨论，本发明的其他重要的特征对于本领域的技术人员而言是显而易见的，这些说明和实施例通过引用方式而并入本文。

在本发明人进行思考的初期，假定通过传统的测定法作为PCT免疫反应性而测定的肽降钙素原大概是由其相关的具有141个氨基酸的前肽(前降钙素原；pre-PCT)形成的，其氨基酸序列(SEQ ID NO:3)是已知的。如对于许多激素原通常所知的那样，PCT是由这种更长的前体分子通过删除信号序列而形成的。虽然尚未通过实验测定切割位点，但是信号序列通常具有相似的模式，这样可以通过较高的概率来预测这些切割位点。在pre-PCT的情况下，信号序列应该包含pre-PCT(SEQ ID NO:3)的氨基酸1至24。在该信号序列之后为激素原PCT位置1处的氨基末端氨基酸，该氨基酸与pre-PCT(SEQ ID NO:3)的氨基酸25相对应。基于这种考虑，最初假定，在脓血症期间在循环系统中发现的PCT在除去信号序列后116个氨基酸，并且具有氨基酸序列PCT 1-116(SEQ ID NO:1)。但是，由于仅仅PCT 3-116(SEQ IDNO:3)能够在脓血症患者的样品中被表征，所以仍保留了对PCT 1-116中间体分泌以及这种PCT 1-116在循环系统中可能得到的浓度的疑问。应该再次指出，目前已经用于测定降钙素原免疫反应性的夹层式测定法是通过组合使用两种抗体来进行的，而这两种抗体并不能区分PCT1-116和3-116。因此，已知的测定法当然不能选择性地检测所述的不同形式的PCT，因此如果在病理学过程(例如在脓血症过程中)中发生相对摩尔量的变化的话，所述的这些方法也不能检测这种可能的特征性变化。因此，在本申请中，通过传统的测定法测定的PCT免疫反应性还被称为“PCT总和”。

在这种情况下，本发明人决定提供一种用于免疫诊断测定降钙素原的新型方法，通过该方法，仅有那些还具有降钙素原1-116的头两个氨基酸的降钙素原级分被选择性地测定，并且通过这种新型方法，可以检查是否可以由此获得临床相关的测量结果，而该结果在质量上要好于之前测定的降钙素原免疫反应性的结果。

如在以下的实验部分中更加详细描述的那样，本发明人首先研发出了多种具有临床测定所需的结合性质的新型抗体，这样这些抗体仅仅识别这样的降钙素原分子，该降钙素原分子包含完整的降钙素原序列，该序列在氨基末端具有降钙素原1-116的头两个氨基酸(Ala-Pro)，或者所述的降钙素原分子包含至少氨基酸2(Pro)。然后在夹层式测定法中，本发明人使用了这些新型的抗体，这些抗体可以选择性地测定在人类患者的生物学样品中，例如在血清或者特别是血浆中的PCT 1-116，而测量值不会受到样品中PCT 3-116(SEQID NO:2)存在受到影响。换言之，PCT 3-116的浓度，以及当然N-末端的至少2个氨基酸被截平的所有其他PCT片段(如果在生物学样品中存在的话)都不能被用于选择性地检测生物学样品中的PCT 1-116的、根据本发明的测定法所检测(共检测)，并且不能成为测量值的一部分(不会形成明显的增值)。

如下文中本申请的实验部分所示，采用所述的测定法得到的测量结果实现了本发明的愿望，即，针对上文所述的具体的诊断目的，对降钙素原的诊断测定进行了所需的改善。

事实上发现，显著的、容易测量的浓度的PCT 1-116存在于人血清的新鲜样品中，特别是存在于患者的新鲜人血浆中。本发明人所发现的所述样品中的PCT 1-116的摩尔浓度为通过传统方法平行测定的PCT免疫反应性的摩尔浓度的大约1/5至1/8(“PCT总和”)。

如果假定，循环系统中分泌的总的PCT主要是以PCT 1-116的形式分泌的，则在假设时间内在开始分泌PCT时，PCT 1-116的浓度与PCT总和的浓度必需是相等的，这样对于PCT 1-116与PCT总和的比值可以假定为最大假设初始极限为1.0。因此，在所研究的样品中，如本发明人所发现的那样，范围为约1/5至1/8的比值已经在本质上包含了关于样品历史的信息，例如在丧失的过程中和/或感染/脓血症的严重程度。由于PCT 1-116的稳定性较低(由于转化为PCT 3-116)，所以与针对更稳定的PCT 3-116而得到的值相比，针对PCT 1-116而建立的所述比值和浓度变化更直接地反映了患者的急性状态。因此，选择性地测定PCT 1-116会得到重要的诊断进程。此外，特别当将通过新型方法的辅助、根据本发明的、PCT 1-116的选择性测定与传统的总PCT(PCT总和)免疫反应性的测定结合起来时，情况更是如此。

在需要快速检测患者急性疾病状态的情况下，根据本发明的方法具有特别的优点。但是在原则上，所述的方法可以用于目前已知的方法已经用于测定PCT免疫反应性的所用情况中。只要测定对于具有两个氨基末端氨基酸(Ala-Pro)的PCT 1-116是选择性的，或者至少对位置2具有氨基酸(Pro)的降钙素原是选择性的，则所述的方法可以被认为是本发明的一部分。所选的具体的测定法形式起到了相对次要的作用，并且主要根据与测量技术有关的实际观点来选择具体的测定法形式。

虽然使用了特定抗体(单克隆抗体)的夹层式特定方法由此在本申请的实验部分中有所描述，并且用于测量，但是本发明不限于这种具体的方法或者相似种类的方法。而且本发明包括任何所需的免疫诊断方法，就本发明的内容而言，这些诊断方法可以选择性地测定PCT1-116，并且测量值不受到同时存在的其他PCT衍生物、特别是PCT3-116的影响。换言之，生物学样品中PCT 3-116的浓度不有助于或改变针对PCT 1-116的选择性测量的值。

对于本领域的技术人员显而易见的是，还可以使用例如竞争类型的测定法(例如使用与PCT 1-116竞争的、固定的选择性抗体和经标记的/选择性标记的分析物的类似物；或者使用固定的类似物和经标记的选择性抗体)或者其他测定法形式，例如所谓的比浊度测定法，而不使用所述的夹层式测定法。

原则上，可以使用适用于诊断检测的任何已知的标记物(即，如在加速测试中使用的那样，可以使用例如：放射性同位素、酶、荧光标记、其他化学发光标记或生物发光标记、以及可直接目测的颜色记号(例如金原子和染料颗粒)来替代实施例中使用的发光标记)。

进一步明确包含在本发明范围内的是将根据本发明的方法设计为加速测试，例如以免疫层析测定方法的形式。

如果所述的方法被设计为这样的多相方法(heterogeneous method)，其中固定形式的特异性粘结剂以与固相结合的形式存在和/或所述的反应产物至少部分固定在固相上，则所述的固相可以为任何所需的合适的固相，例如试管壁、颗粒状固相(例如悬浮于反应溶液中的磁性颗粒)、或者免疫层析装置的支承体形式的固相(用于加速测试)。

在目前优选的实施方案中，以多相夹层式免疫测定法来实施所述的方法，其中将一种抗体固定在经涂敷的试管的壁(例如聚苯乙烯；“经涂敷的管”；CT)上，或者固定于微孔板(例如聚苯乙烯)上，或者固定于颗粒(例如磁性颗粒)上，而另一种抗体具有残基，该残基代表了可直接检测的标记或者允许与标记进行选择性连接，并且起到检测所形成的夹层结构的作用。此外，还可以进行使用合适的固相的延时或随后的固定。

但是，所述的方法不必被设计成其中至少一种特异性粘结剂以固定形式存在的多相方法。此外，所有反应物和反应产物都可以以悬浮于均相液相中的形式存在，并且可以保留在其中用于测量。在这种情况下，优选的是使用部分检测系统来标记用于测定的两种抗体，其中所述的检测系统在两种抗体被整合成单一的夹层时允许产生信号或触发信号。这样的技术可以具体被设计成荧光放大或荧光消灭检测方法。特别优选的此类方法涉及成对地使用待用的检测试剂，例如在US-A-4822 733,EP-B1-180 492或EP-B1-539 477中以及其中所引用的现有技术所述。这些方法可以进行这样的测量，该测量直接在反应混合物中，选择性地仅检测在单一的免疫复合物中包含两种标记成分的反应产物。例如，可以参见品牌(Time Resolved Amplified Cryptate Emission)或所提供的技术，该技术补充了上述申请中所述的教导。

进一步假定，根据本发明的测定方法还可以作为所谓的多参数诊断的部分而有利地使用。此外，由此测定的参数为例如脓血症和感染参数，这些参数可以选自例如：抗神经节苷脂抗体、蛋白质类总降钙素原(PCT总和)、降钙素原3-116、CA 125、CA 19-9、S100B、S100A蛋白质、LASP-1、可溶性细胞角蛋白片段(具体为CYFRA21、TPS和/或可溶性细胞角蛋白-1片段(sCYlF))、肽类inflammin和CHP、其他肽类激素原(具体例如有pro-ANP、pro-BNP、pro-肾上腺髓质素、pro-内皮素、pro-抗利尿激素及其可用于诊断的肽片段)、甘氨酸N-酰基转移酶(GNAT)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS 1)和C反应蛋白(CRP)、细胞因子(例如干扰素种类的细胞因子或其合适的片段)。在所述的多参数测定中，旨在同时测定针对多个参数的测量结果，或者平行测定针对多个参数的测定结果，并借助于例如计算机程序(其还利用了具有诊断意义的参数相关性)来对它们进行评价。

特别重要的组合测量为PCT 1-116与常规的PCT免疫反应性(PCT总和)的平行选择性测量，根据本申请中所得的结果，所述的测量代表了样品中总体测量的PCT 1-116加上PCT 3-116的浓度。关于该测量的优点，可以明确地参见以下的实施例。

可以进一步将PCT 1-116的选择性测量与PCT 3-116的选择性测量相组合。本发明人还使用了选择用于PCT 3-116的单克隆抗体来实施了所述的组合测量(结果未示出)。由于在PCT 1-116的蛋白水解降解过程中以恒定方式新形成的PCT 3-116的浓度被直接包含在PCT3-116的浓度内，从而使得评价对比测量变得更复杂。此外，似乎在PCT 3-116的氨基末端可以发生进一步的蛋白水解降解，其结果导致所测量的结果为假阳性。因此，目前，PCT1-116与PCT 3-116的选择性测量的组合测量是不优选的。

在以下的实施例中，参见附图，其中：

图1示出了如实验部分中更加详细描述的，用于选择性测定PCT1-116的夹层测定法的标准曲线；

图2示出了在采用了单位为pmol/l的校正曲线之后，传统的B.R.A.H.M.S PCT LIA的标准曲线；

图3示出了根据本发明的测定法得到的PCT 1-116的浓度变化(三角形)与通过商业测定法(B.R.A.H.M.S PCT LIA；正方形)得到的PCT总和的浓度的对比测量，其中在各种情况下，都是基于第0天坐标系中的起始浓度的，并且都是在经过重病特别护理的8位经过连续治疗的脓血症患者的EDTA血浆中测定得到的；

图4示出了根据图3，样品中的PCT 1-116与PCT总和的摩尔比的测定结果，并且其变化作为3天期间中时间的函数。

实验部分

I.测定法的形成-肽的合成以及抗体的形成

I.1.肽的合成

合成以下多种肽来作为用于产生抗体的抗原组分，作为用于亲合纯化和表位图谱绘制的选择性结合伴侣，以及作为潜在的标准品和竞争者：

多种部分肽的节段是由pre-降钙素原(pre-PCT；SEQ ID NO:3)的已知氨基酸序列衍生得到的，对这些节段加以选择，并通过标准的方法以化学方式合成为可溶性的肽。将得到的肽纯化，并通过质谱和反相HPLC进行质量控制，然后以等分的量冻干(JPT,Berlin,Germany)。所合成的多种肽的氨基酸序列如下(其中所述的氨基酸的位置是以pre-PCT为基础的；氨基酸25对应于SEQ ID NO:1中所示的PCT 1-116的氨基酸1)：

I.2.对PCT 1-116的N-末端具有特异性的抗体的形成、标记和表征

I.2.1.单克隆抗体的形成和选择

例如，通过Harlow and Lane(Harlow E.,Lane D."Antibodies-A LaboratoryManual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988,ISBN 0-87969-314-2)所述，采用标准的方法来形成单克隆抗体。所述的形成方法以更详细的方式概括如下：

通过MBS(m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，将肽PAS10(SEQ ID NO:4；PCT 1-116的氨基酸1至10)与载体蛋白质KLH(钥孔血蓝蛋白)缀合(参见"NHS-酯-马来酰亚胺交联剂"的操作说明书，得自PIERCE,Rockford,IL,USA)。使用所得的缀合体免疫Balb/c小鼠。在加强之后，随后将小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。

就来得自骨髓瘤细胞的培养物上清液的抗体的结合测试而言，将肽PAD20(SEQ IDNO:6和PPD19(SEQ ID NO:7；PCT 1-116的氨基酸2-20)固定于微孔板上。就这一目的而言，将所述的肽以浓度为7μg/ml溶解于20m/M磷酸钠,pH 7.4，50mM NaCl中，并在每孔中吸出150μl。在4℃下温育20小时。通过抽吸过滤所述的溶液。然后在每个孔中装满150μl的10mM磷酸钠,2％Karion FP,0.3％牛血清蛋白,pH 6.5。在20小时后，通过抽吸过滤所述的溶液。

将待测试的150μl每种培养物上清液吸入到涂敷有PAD20(SEQ ID NO:6)或PPD19(SEQ ID NO:7)的微孔板的孔中。在22℃下温育2小时。通过抽吸过滤所得的上清液。使用20mM磷酸钠,pH 7.4,50mM NaCl洗涤2次，并通过标准的方法使用二级抗小鼠抗体-碱性磷酸酶缀合体检测结合的抗体(SIGMA,Deisenhofen,Germany)。

选择如下细胞培养物来进行分离，所述的细胞培养物分泌与肽PAD20(SEQ ID NO:6)的结合远不及与肽PPD19(SEQ ID NO:7)的结合的抗体。通过相同的方法筛选通过分离而得到的培养物上清液来作为初始细胞培养物。然后，以更大的规模培养在所述意义上为阳性的经筛选的细胞克隆，并通过亲合层析在蛋白质G柱上纯化所述的抗体，将3种所述的抗体作为用于免疫测定法中选择性结合PCT 1-116的潜在候选物来进行进一步的研究(所述抗体的内部名称为：mAb 295/3H12；mAb 295/4G9；mAb 295/4611)。

I.2.2.抗体的制备

对于三种所选抗体的表位特异性的表征以及随后的测定法的形成而言，按照如下方式将所得的单克隆抗体用化学发光标记来进行标记：

在100mM磷酸钾缓冲剂(pH 8.0)中将各种抗体的浓度调节至1.5mg/ml。将67μl的抗体溶液与10μl的MA70吖啶NHS酯(1mg/ml；得自HOECHST Behring)混合，并在室温下温育15分钟。然后，加入423μl的1M甘氨酸，并另外温育10分钟。此后，根据操作说明书，将标记的一批抗体在NAP-5凝胶过滤柱(Pharmacia)上在1ml的流动相A(50mM磷酸钾,100mM NaCl,pH7.4)中再次缓冲，并从低分子量的组分中游离出来。进行凝胶过滤HPLC(柱：WatersProtein Pak SW300)，来分开未与抗体结合的标记的最后的残基。施加样品，并将该样品以流速1ml/min用流动相A进行层析。使用流体光度计测定在波长为280nm和368nm下进行测量。吸收的比值368nm/280nm作为抗体标记程度的量度，其峰值为0.10+/-0.01。收集含有单体抗体的级分(保留时间为8-10min)，并将这些级分收集在3ml的100mM磷酸钠,150mMNaCl,5％牛血清蛋白,0.1％叠氮化钠,pH 7.4中。

I.2.2.3种所选单克隆抗体的表位的图谱绘制

就3种所形成的并选择的单克隆抗体的表位的图谱绘制而言，将代表了降钙素原的N-末端节段(参见I.I.；表1)的多种肽固定在试管上。按照上文微孔板的涂敷中所述来实施这一过程，不同之处在于吸取300μl的肽溶液，而并非吸取150μl的肽溶液。

将自的种化学发光标记的单克隆抗体在测定缓冲剂(100mM磷酸钠,150mM NaCl,0.5％牛血清蛋白,0.1％非特异性小鼠IgG,0.1％叠氮化钠,pH 7.4)中稀释，这样得到90万RLU(相对的光单位)/200μl的最终浓度。将200μl份的这种溶液吸入到所述肽的试管中，然后在22℃下摇动温育2小时。然后使用1ml份的洗涤溶液(0.1％Tween20)将每个试管洗涤4次，滴下溶液，并在照度计(得自BERTHOLD,LB952T；得自BRAHMS AG的碱性试剂)中测定与所述试管结合的化学发光情况。

由下表1显而易见的是，如果由pre-降钙素原(或降钙素原)衍生的肽在N-末端的位置25处结束(肽PAD20；SEQ ID NO:6)，则所有3种所选抗体(内部名称分别为：mAb 295/3H12；mAb 295/4G9；mAb295/4G11)都与这种肽良好地反应。如果缺少位置25(肽PPD19；SEQID NO:7)，则仅可以实现边缘结合，这解释了针对单个的单克隆抗体的非特异性结合仅为大约2倍，分别低于针对具有位置25的肽PAD20的结合的199倍(mAb 295/3H12)，85倍(mAb295/4G9)或102倍(mAb 295/4G11)。

因此，所述的抗体是高度特异性的，并且适用于区分在N-末端具有PCT 1-116的位置1和2(pre-PCT的位置25和26)的降钙素原肽与相对比的在N-末端仅具有1个氨基酸残基的、被缩短的那些降钙素原肽。

表1：表位的图谱绘制。测定的结合值以相对的光单位(RLU)表示。

I.4.用于PCT 1-116的特异性测量的夹层式免疫测定法的形成

I.4.1.偶联

按照以下方式使用单克隆抗体(内部名称：QN05)涂敷高度结合的5ml的聚苯乙烯试管(得自Greiner)，其中所述的单克隆抗体针对降钙素原的C-末端节段的表位，而且还用于商业测定法B.R.A.H.M.S PCT LIA中，其所述的方式为：将所述的抗体在50mM tris,100mM NaCl,pH 7.8中稀释至浓度为6.6μg/ml。将300μl所述的溶液吸入到各试管中。将该试管在22℃下温育20小时。通过抽吸过滤所述的溶液。然后，向各试管中装满4.2ml的10mM磷酸钠,2％Karion FP,0.3％牛血清蛋白,pH 6.5。在20小时后，通过抽吸过滤所述的溶液。最后，将所述的试管在真空干燥器中干燥。

I.4.2.标记

按照I.2.2中所述，单克隆抗体mAb295/3H12是化学发光标记的，其中针对所述抗体的结合行为上文中对其进行了更详细的表征，并且该抗体特异性地识别PCT 1-116的N-末端。

I.4.3.免疫测定法的过程和评价

将在马的正常血清中系列稀释的肽PAN40(SEQ ID NO:11)作为标准材料。将根据获得肽重量的浓缩物作为由此制备的标准品。

按照以下过程来进行夹层式免疫测定法：将50μl的标准品或样品、以及150μl含有50万RFU(相对的光单位)的MA70标记抗体的测定缓冲剂(100mM磷酸钠,150mM NaCl,0.5％牛血清蛋白,0.1％非特异性小鼠IgG,0.1％叠氮化钠,pH 7.4)吸入到涂敷有抗体的测试试管中。在22℃下摇动温育3小时。然后使用1ml份的洗涤溶液(0.1％Tween 20)将每个试管洗涤4次，滴下溶液，并在照度计(得自BERTHOLD,LB952T；得自BRAHMS AG的碱性试剂)中测量与所述试管结合的化学发光情况。使用软件MultiCalc(Spline Fit)，从标准曲线上读取样品的PCT 1-116的浓度。典型的标准曲线如图1所示。所述的测试具有功能性测定法灵敏度(FAS)为6pmol/l，其被定义为这样的浓度，在该浓度下，10次独立测试的平均值的变化系数为20％。

在上文所述的抗体295/3H12的表位特异性实验之后，进行研究以测定由降钙素原衍生的、并缺少第一个N-末端氨基酸的肽的测定法交联反应性：浓度为37433pmol/1的PCT2-116(InVivo GmbH,Hennigsdorf,Germany；此外参见EP 1 408 334)样品被测量为206pmol/l。因此，交联反应性仅为0.5％。

II.对分析物稳定性以及脓血症患者的人血浆的测量

II.1.样品中的分析物稳定性

首先，根据I所述的PCT 1-116测定法中的测量性能，来研究得自脓血症患者样品中的天然PCT 1-116的稳定性。就这一目的而言，由10名脓血症患者得到EDT血浆和血清样品，然后立即测定，再根据上文所述的测定法在22℃下储存6小时。

平均而言，在6h后，血浆的免疫反应性仅降低3.6％，最大的个体降低为7.6％。另一方面，血清的免疫反应性平均降低13.5％，在降低的情况中，可以观察到相当大的个体差异。

特别是在血清中，所观察到的PCT 1-116的个体稳定性的差异(其反应了可能的个体差异的酶活性)是指例如为了将PCT 1-116的固定起始浓度发生纯粹的降低的情况与PCT1-116的持续分泌或再次分泌被叠加给所述的浓度降低的情况区分开，不可以直接将个体患者样品中PCT 1-116的可测量的浓度变化与用于除去循环系统中的PCT 1-116的、广泛使用的参照值相关联。

降钙素原(其通过传统的B.R.A.H.M.S PCT LIA方法作为PCT免疫反应性或“PCT总和”表测量)在22℃下储存6小时后，在血清样品中是稳定的。

B.R.A.H.M.S PCT LIA为夹层式免疫测定法，该方法使用了对抗C-末端节段(抗钙素原级分)或中间区域节段(降钙素级分)的表位的单克隆抗体。为了可以进行对比考虑，将制造商指定为标准品的浓度ng/ml转换成pmol/l。典型的标准曲线如图2所示。所述的测试具有功能性测定法灵敏度(FAS)为20pmol/l，其被定义为这样的浓度，在该浓度下，10次独立测试的平均值的变化系数为20％。

认为，所述分析物PCT 1-116在人EDTA血浆中测定的稳定性通常足可以用于临床实践。但是，如果存在这样的风险，即，由来自样品的各自EDTA血浆不能在足够短的时间内进行测量，则需要向所述的样品中加入针对二肽基-氨基肽酶IV(DAP IV)的合成抑制剂，从而防止DAP IV将PCT 1-116降解成PCT 3-116，而这也被包含在本发明的范围内(例如Lys[Z(NO₂)]-四氢噻唑或Pro-Pro(p)[OPh-4Cl]₂；参见：WRENGER S,KAHNE T,BOHUON C,WEGLOHNER W,ANSORGE S,REINHOLD D:Amino-terminal truncation of procalcitonin,amarker for systemic bacterial infections,by dipeptidyl peptidase IV(DP IV),FEBS Lett 2000；466:155-9)。此外，可任选地，如果其他酶有助于样品中PCT 1-116浓度的降低，当然还可以使用破坏性酶作用的其他抑制剂。

II.2.临床值的测量

II.2.1.成功治疗感染的动力学

由于患者治疗方案中的安全性由此增加，并减少在加护病房中昂贵的停留，所以理想的是早期且可靠地识别脓血症患者的治疗的成功。

为了检查这样的问题，即，根据本发明的、使用了上文所述的夹层式测定法的PCT1-116的测量是否可以得到能够区分那些PCT免疫反应性("PCT总和")传统的测量的结果，采用了以下的过程：

每天，从8位脓血症患者得到血浆样品，其中所述的脓血症患者在加护病房中获得成功治疗。在治疗开始时以及其后的2天中测量PCT总和(通过传统的B.R.A.H.M.S PCT LIA测量；参见上文)和PCT1-116。在测量开始时，PCT 1-116的中间浓度为100.6pmol/l，PCT总和的浓度为591.8pmol/l(初始浓度的摩尔比为大约0.17)。

与PCT总和的浓度相比，PCT 1-116的浓度明显下降的更快：根据第0天的情况，在第1天，PCT 1-116降低32％；第2天，PCT 1-116降低52％。与此截然不同的是，在第1天，PCT总和的降低仅为11％，而第2天PCT总和的降低仅为30％(参见图3)。

考虑到基于降钙素原分泌的降低而尽可能快地识别成功治疗的诊断目的，目前可以提出这样的与时间有关的问题，即，在所述的时间后，上文所比较的两种测定法能够使降低情况被完全识别。如果考虑到内部测定法的变化，大概真实的情况是降低大约20％可以认为是可靠的检测。在PCT 1-116的测量中，仅在0.6天之后便可检测这种降低，但是在传统的PCT免疫反应性(PCT总和)测量中只有在1.2天之后才能检测到这种降低。

因此，与PCT免疫反应性("PCT总和")的传统测量相比，在PCT 1-116的测量中，实质上可以更快并且更可靠地检测治疗的成功。

就对测量数据的进一步评价而言，针对每个患者和每个测量时间计算PCT 1-116与PCT总和的各自的摩尔比。在进行观察的3天中，以中值表示的所述比值由0.17降至0.15，再降至0.12(图4)。所述的评价还反映了PCT 1-116和PCT总和的不同的降解动力学。简单地表述为，事实上PCT 1-116的降低直接反应了其降解或低稳定性，而“PCT总和”的降低则反映了PCT 3-116的降解或其稳定性。由于PCT 1-116转化为PCT 3-116不应该较大程度地影响PCT总和测定中的测量，因为传统的方法不能区分PCT 1-116和PCT 3-116，所以PCT 1-116转化为PCT 3-116的速率不会显著地影响PCT总和的浓度降低，这种情况基本上与样品中积聚的更稳定的PCT 3-116所发生的降低相对应。

上述考虑表明，PCT 1-116与PCT总和的比值较小(即，在PCT 1-116的浓度较低的同时，PCT总和的浓度相对的较高)则指示感染的结束，而PCT 1-116与PCT总和的比值较大则指示接近PCT开始分泌的时间，并因此指示了高度急性的感染。上述观察不仅涉及对进展情况的观察，而且涉及在例如对门诊患者进行紧急入院或医学治疗时对患者的感染状态进行初始评估。

II.2.2.在继发感染情况下的动力学

在脓血症患者处于加护病房中的过程中，他们由于脆弱的免疫系统经常患上其他的感染，这些感染特别是威胁生命的，并且可能具有致命的作用。对这种继发感染检测的越早，便可以更快更有效地启动治疗对策。但是，由于已知的内毒素耐受性现象，继发感染会导致PCT总和浓度发生不明显的升高。

早期检测细菌再感染(在已经临时减少或者甚至终止的PCT分泌中，所述的细菌再感染与随后发生的并不明显的PCT升高有关)是特别复杂的，这是因为由于初次感染使得患者已经具有相当高的PCT总和浓度，由于PCT 3-116的稳定性高，所以即使进行了成功的治疗，PCT总和的浓度也是相对缓慢地减少。如上文所示，与PCT总和(其中主要的部分为PCT3-116)相比，PCT 1-116具有基本上更快的体内降解动力学。如果假定PCT 1-116在其降解的第一个步骤中便被转化为PCT 3-116，则PCT 1-116的浓度的降低(绝对值较低)与PCT总和的值的升高是不对应的。它们仅以新的PCT 1-116的生成速率而升高。

在已经充分地经受并且不再为急性感染的情况(即，在继发感染之前)下，的PCT1-116的可测量浓度应该是相对较低的，但是由于PCT 3-116的稳定性(此时这种稳定性可能主要帮助形成了PCT总和的测量浓度)，使得PCT总和的浓度的绝对值仍保持较高。因此，根据PCT 1-116的测定值，可以在早期阶段测定由继发感染而诱导的、PCT分泌的随后增多，而基于绝对项中PCT总和的、高得多的测量值，PCT分泌的增多是不可检测的，或者是不可明确检测的。

对在PCT总和测量中一起测量的PCT 1-116和PCT 3-116浓度的考虑，得到这样的结论，在由初次感染而导致的PCT 3-116高浓度的相对缓慢的降低、以及由继发感染而导致的PCT的随后增多的影响下，不可能在总的PCT发生可测量的增多时立刻测定出PCT分泌的开始，而是仅仅在PCT总和浓度的降低发生很难测定的减少的初期来测定PCT分泌的开始，其中与PCT 3-116的清除速率相比，所述的PCT总和浓度的降低发生很难测定的减少是更缓慢的。

因此，进行研究以确定从所形成的PCT 1-116的浓度发生升高或者降低至通常与稳定性相关的、减少的PCT 1-116的浓度以下(其与所形成的PCT总和的浓度基本不同)的意义上来说，所述的PCT 1-116的浓度是否预示了在随后的一天PCT总和随后也发生了增多，作为继发感染的迹象。

每天，从在加护病房病房中平均停留10.8天的44名脓血症患者中取得血浆，在所述的血浆中平行测定PCT总和以及PCT 1-116，并在测定期间针对每个单独的患者检测其浓度曲线。

观察到，在随后的一天PCT 1-116的增多是PCT总和的增多的6倍，而PCT总和仍降低。

在7种其他的情况(在各种情况下PCT总和发生连续减少)下，观察到PCT 1-116的浓度的降低发生减少，即，比其他样品中发生的降低要慢，这与继发感染的发生有关。PCT总和的浓度没有发生显著程度的变化。仅仅在随后的一天出现了随后发生的可检测的PCT总和增多的迹象。在本发明的范围内还使用了那些浓度为“隐藏”增多的PCT 1-116，而这种情况尚未显现在监测用于检测继发感染的治疗脓血症患者的过程中，使用了适用于该目的的合适的监测和评价技术、以及数学模型来监测PCT的总和。

总体而言，据信，PCT 1-116的降低(与PCT总和相比，其是减少的)或者甚至在随后的一天PCT 1-116发生增多预示PCT总和以高度特异性、甚至灵敏的方式发生增多(其表明发生了继发感染)。

鉴于上文所述的结果，本发明人考虑了根据本发明的方法来对PCT 1-116进行的选择性的测定，其为通过主要识别PCT 3-116的测定方法来检测PCT(总和)的备选方法。在所有的情况下都可以测定PCT1-116，其中已经证明PCT(总和)的测定可用于医学诊断领域中。

具体而言，采用选择性测定PCT 1-116来用于诊断、差异诊断、风险分层、预后、疾病过程的估测以及治疗测量的控制是本发明所预计的，或者被考虑特别用于与感染有关的人类患者，其中所述的感染特别为革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的感染、真菌的炎性和/或寄生虫致病因子的感染，这些感染可以导致局部限定的或系统性的感染应答(例如脓血症、严重的脓血症和脓血症休克)，以及在心力衰竭患者经历共病的情况下，以及另外用于遭受冠状动脉病(CAD)的患者的分层和预后的风险。

优选的实施方式：

1.用于诊断目的的、测定降钙素原和降钙素原衍生物的免疫诊断方法，其特征在于在患者的生物学样品中选择性地测定那些分子形式的降钙素原或由其衍生的降钙素原部分肽，其中在所述的生物学样品中还存在不被共同测定的降钙素原3-116，并且该降钙素原3-116不会显著影响测量值，其中所述的部分肽具有在完整降钙素原1-116(SEQ ID NO:1)的氨基末端的位置1和2处的氨基酸甘氨酸和脯氨酸(Ala-Pro AP)。

2.根据项目1的方法，其特征在于使用至少一种抗体来进行测定，其中所述的抗体需要具有完整降钙素原1-116序列(SEQ ID NO:1)的位置1和2的氨基酸中至少1个的降钙素原序列用于其特异性结合。

3.根据项目2的方法，其特征在于所述的抗体需要存在降钙素原1-116完整序列(SEQ ID NO:1)的位置1和2的2个氨基酸用于其特异性结合。

4.根据项目1至3的任意一项中的方法，其特征在于所述的至少1种抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，例如通过亲合层析纯化的多克隆抗体。

5.根据项目1至4的任意一项中的方法，其特征在于所述的生物学样品为生物学流体，其选自血液和血液级分，特别是血清或血浆、以及脑脊液(CSF)。

6.根据项目1至5的任意一项中的方法，其特征在于作为疾病诊断的部分来实施该方法，其中所述的疾病选自局部或全身感染、发炎、脓血症和神经退行性疾病。

7.根据项目6的方法，其特征在于在监测和控制治疗、或者在监测一种所述的疾病的进程中来实施该方法。

8.根据项目1至7的任意一项中的方法，其特征在于该方法被设计为用于及时现场护理诊断的免疫层析方法，或者另一种加速测试。

9.根据项目1至8的任意一项中的方法，其特征在于作为多参数测定方法的部分来来实施该方法。

10.根据项目9的方法，其特征在于作为采用了芯片技术的多参数测定方法的部分、和/或作为使用了计算机辅助评价测量结果的自动化方法的部分来实施该方法。

11.根据项目10的方法，其特征在于在多参数测定方法中，测定与脓血症诊断有关的至少一种其他参数。

12.根据项目11的方法，其特征在于所述的与脓血症诊断有关的一种或多种其他参数选自：总的降钙素原、降钙素原3-116、CA 125、CA 19-9、S100B、S100A蛋白质、LASP-1、可溶性细胞角蛋白片段(具体为CYFRA21、TPS和/或可溶性细胞角蛋白-1片段(sCYlF))、肽类inflammin和CHP、激素原pro-ANP、pro-BNP、pro-肾上腺髓质素、pro-内皮素、pro-抗利尿激素及其可用于诊断的片段、甘氨酸N-酰基转移酶(GNAT)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS 1)和C反应蛋白(CRP)及其片段、以及细胞因子。

13.仅与完整的降钙素原1至116(SEQ ID NO:1)或降钙素原衍生物选择性结合的抗体，所述降钙素原衍生物具有降钙素原氨基酸序列或降钙素原氨基酸的部分序列，其中所述的部分序列具有完整降钙素原1至116序列(SEQ ID NO:1)的氨基末端的氨基酸1和2中的至少一个、优选的是具有所述氨基酸1和2中的两个。

14.根据项目13的抗体，该抗体是通过使用抗原对动物免疫而获得的，其中所述的抗原为与肽形成缀合体的形式，其中所述的肽是或者包含SEQ ID NO:4所示的肽。

15.根据项目13或14的抗体，其为单克隆抗体。

16.用于实施根据项目1至7的任意一项中的方法的试剂盒，除了常规的缓冲剂和洗涤液以外，所述的试剂盒至少包含

－根据项目13、14和15的任意一项中的至少1种抗体，其是与固相结合形式的、或者经标记或选择性可标记形式；以及

－肽形式的竞争剂或标准化合物，其中所述的肽包含完整降钙素原1至116(SEQID NO:1)氨基酸序列中的至少氨基酸1至6，并且所述的肽选择性地与至少1种抗体结合。

17.根据项目16的方法，其特征在于所述的竞争剂与固相结合，或者是经标记或选择性可标记的。

18.用于实施根据项目1至7的任意一项中的方法的试剂盒，除了常规的缓冲剂、洗涤液以及可任选的用于信号检测或信号形成的物质以外，所述的试剂盒至少包含

－根据项目13、14和15的任意一项中的第一抗体；以及

－第二抗体，其选择性地与完整的降钙素原1至116(SEQ ID NO:1)的、任何所需的氨基酸部分序列选择性结合，其中所述的序列不包含降钙素原氨基末端的氨基酸1和2。

19.根据项目18的试剂盒，其中所述的2种抗体中的1种抗体以与固相结合的形式存在，而另一种抗体以经标记或选择性可标记的形式存在。

20.根据项目18的试剂盒，其中2种抗体以适于分散于液相中的形式存在，第一标记成分是基于荧光或化学发光消灭或放大的、与所述的第一抗体结合的标记系统的部分，而该标记系统的所述第二标记成分与所述的第二抗体结合，这样在所述的2种抗体与待检测的肽片段结合后，便在所述的测量溶液中产生可以检测所得的夹层式复合物的可测量信号。

21.根据项目20的试剂盒，其中所述的标记系统包含与荧光或化学发光染料，特别是花青类型的染料组合的稀土穴状化合物或螯合物。

22.根据项目14至21的任意一项中的试剂盒，该试剂盒还包含额外的成分，即通过抑制二肽基-氨基肽酶IV(DAP IV；DP IV；CD 26)的酶作用，用于稳定生物学样品的化合物。

序列表

<110> B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft

<120>用于诊断目的的选择性测定降钙素原1-116的方法、以及实施该方法的抗体和试剂盒

<130> 5143 PCT

<150> DE 102007009751.6

<151> 2007-02-28

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr

1 5 10 15

Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp

20 25 30

Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser

50 55 60

Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr

65 70 75 80

Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp

85 90 95

Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro

100 105 110

Gln Asn Ala Asn

115

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp Tyr Val

20 25 30

Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu Gly Ser

35 40 45

Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys

50 55 60

Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro

65 70 75 80

Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Met Ser

85 90 95

Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro Gln Asn

100 105 110

Ala Asn

<210> 3

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Met Gly Phe Gln Lys Phe Ser Pro Phe Leu Ala Leu Ser Ile Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Gln Ala Gly Ser Leu His Ala Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu

20 25 30

Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser Asp Glu Ala Arg Leu

35 40 45

Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu

50 55 60

Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser

65 70 75 80

Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln

85 90 95

Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly

100 105 110

Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His

115 120 125

Arg Pro His Val Ser Met Pro Gln Asn Ala Asn

130 135

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Cys

1 5 10

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Ala Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala

1 5 10 15

Thr Leu Ser Glu Asp

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr

1 5 10 15

Leu Ser Glu Asp

20

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ser Glu Asp

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Asp

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser Glu

1 5 10 15

Asp

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser Glu Asp

1 5 10 15

<210> 11

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr

1 5 10 15

Leu Ser Glu Asp Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His

20 25 30

Val Ser Met Pro Gln Asn Ala Asn

35 40

Claims

1.用于实施在生物学流体样品中只测定分子形式的降钙素原的方法的试剂盒,所述分子形式的降钙素原包含在完整降钙素原1-116(SEQ ID NO:1)的位置1和2处的N-末端氨基酸甘氨酸和脯氨酸(Ala Pro；AP)，所述生物学流体包含(i)分子形式的降钙素原,其包含所述N-末端氨基酸甘氨酸和脯氨酸(Ala Pro；AP),和另外地,至少(ii)截平形式的降钙素原,其由氨基酸3-116(SEQ ID NO:2)组成，

除了常规的缓冲剂和洗涤液以外，所述的试剂盒至少包含

－只与完整的降钙素原1至116(SEQ ID NO:1)的表位选择性结合的一种第一抗体，所述的表位包含在完整降钙素原1-116(SEQ ID NO:1)的N-末端氨基酸1和2，所述第一抗体与固相结合的形式或者经选择性可标记形式，以及

－肽形式的竞争剂或标准化合物，其包含完整降钙素原1-116(SEQ ID NO:1)氨基酸序列中的至少氨基酸1至6。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于所述的竞争剂与固相结合，或者是经标记或选择性可标记的。

3.根据权利要求1的试剂盒，其还包含第二抗体，所述的第二抗体选择性地与完整的降钙素原1-116(SEQ ID NO:1)的氨基酸部分序列选择性结合，其中所述的氨基酸部分序列不包含降钙素原的N-末端氨基酸1和2。

4.根据权利要求3的试剂盒，其中所述的第二抗体结合降钙素原(SEQ ID NO:1)的C-末端节段中存在的表位。

5.权利要求3或4的试剂盒，其中所述的2种抗体中的1种抗体以与固相结合的形式存在，而另一种抗体以经标记或选择性可标记的形式存在。

6.根据权利要求3或4的试剂盒，其中所述的2种抗体以适于分散于液相中的形式存在，第一标记成分是基于荧光或化学发光消灭或放大的、与所述的第一抗体结合的标记系统的部分，而该标记系统的所述第二标记成分与所述的第二抗体结合，这样在所述的2种抗体与待检测的肽片段结合后，便在所述的测量溶液中产生可以检测所得的夹层式复合物的可测量信号。

7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述的标记系统包含与荧光或化学发光染料，特别是花青类型的染料组合的稀土穴状化合物或螯合物。

8.根据权利要求1至7的任意一项中的试剂盒，该试剂盒还包含额外的成分，即通过抑制二肽基-氨基肽酶IV(DAP IV；DP IV；CD 26)的酶作用，用于稳定生物学样品的化合物。

9.抗体，其用作根据权利要求1至8的任一项中的试剂盒中的第一抗体，所述抗体需要其与分子形式的降钙素原结合在完整降钙素原1-116(SEQ ID NO:1)的位置1和2处的N-末端氨基酸甘氨酸和脯氨酸(Ala Pro；AP)。

10.根据权利要求9的抗体，该抗体是通过使用抗原对动物免疫而获得的，其中所述的抗原为包含肽的缀合体的形式，其中所述的肽是或者包含SEQ ID NO:4所示的肽。

11.根据权利要求9或10的抗体，其为单克隆抗体。