ES2331936T3 - Metodo para la determinacion selectiva de procalcitonina 1-116 a efectos diagnosticos y anticuerpos y kits para ejecutar tal metodo. - Google Patents

Abstract

Método inmunodiagnóstico para determinar la procalcitonina y los derivados de procalcitonina de efectos diagnósticos, caracterizado por el hecho de que se determinan selectivamente en una muestra biológica de un pacientes aquellas formas moleculares de la procalcitonina o los péptidos parciales de procalcitonina derivados de las mismas que tienen los aminoácidos alanina y prolina (Ala-Pro AP) en las posiciones 1 y 2 del terminal amino de la procalcitonina 1-116 completa (ID SEC Nº: 1), no siendo la procalcitonina 3-116 que está también presente en la muestra biológica codeterminada y no representando la misma una significativa contribución al valor medido.

Description

Método para la determinación selectiva de procalcitonina 1-116 a efectos diagnósticos y anticuerpos y kits para ejecutar tal método.

La invención se refiere al sector de la diagnosis médica, y en particular a la determinación de biomarcadores en fluidos biológicos por medio de métodos inmunodiagnósticos. Más concretamente, la invención se refiere a la determinación del péptido procalcitonina a efectos diagnósticos, determinándose para la procalcitonina 1-116 completa un valor selectivo medido que no era obtenible hasta la fecha y usándose dicho valor en particular para una diagnosis temprana más sensible, para la supervisión del tratamiento y para la supervisión de la progresión de infecciones sistémicas y locales, y en particular de infecciones bacterianas y de sepsis.

En el contexto de la presente invención, expresiones tales como "diagnosis" o "a efectos diagnósticos" se usan como expresión general para determinaciones médicas que pueden surgir de distintos problemas en dependencia del estado clínico del paciente a partir del cual se realiza la determinación y que sirven en particular para la diagnosis y la diagnosis temprana, la determinación de la severidad y la valoración de la progresión, incluyendo la valoración de la progresión como acompañamiento al tratamiento, y la prognosis de la futura de progresión de una enfermedad y la estratificación de pacientes según el riesgo. Aunque en la siguiente descripción se presta particular atención a la mejorada supervisión de la progresión y del tratamiento, no está asociada a la misma limitación alguna de la expresión "a efectos diagnósticos" a tales objetivos diagnósticos específicos.

La prohormona madura procalcitonina (PCT) es un péptido que consta de 116 aminoácidos y del que primeramente se habló como precursor de la importante hormona calcitonina (tireocalcitonina) y cuya secuencia completa de aminoácidos (ID SEC Nº: 1) ha sido conocida desde hace mucho tiempo, como lo han sido los detalles de su degradación proteolítica normal, que conduce a la liberación de la hormona madura calcitonina y otros péptidos más cortos, incluyendo en particular la llamada catacalcina (procalcitonina 96-116) y un péptido N-terminal (N-procalcitonina 1-57), a los que aquí se designa, inter alia, como "péptidos parciales de PCT". Como se explica más exactamente, por ejemplo, en las patentes EP 0 656 121 B1 o US 5.639.617 de la Solicitante y en publicaciones tales como ASSICOT M., GENDREL D., CARSIN H., RAYMOND J., GUILBAUD J., BOHUON C. (1993): High serum Procalcitonin concentrations in patients vith sepsis and infection. Lancet 341:515-518, las infecciones bacterianas severas y ciertas infecciones parasitarias y fungales con una reacción inflamatoria sistémica inducen la liberación de PCT en la circulación, donde la misma se encuentra en muy grandes cantidades que son fácilmente mensurables (véanse por ejemplo también los artículos de resumen en O'CONNOR E., VENKATESH B., LIPMAN J., MASHONGONYIKA C.,
HALL J. (2201): Procalcitonin in critical illness. Critical Care and Resuscitation 3:236-243; WHICHER I., BIENVENU J., MONNERET G. (2001): Procalcitonin as an acute phase marker. Annals of Clinical Biochemistry 38:483-893; BECKER K. L., NYLEN E. S., WHITE J. C., MUELLER B., SNIDER R. H. (2004): Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection and sepsis: a journey from procalcitonin back to its precursors. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 89:1512-1525). Las enfermedades virales, autoinmunes y alérgicas, por otro lado, no conducen a un importante incremento de la concentración de PCT mensurable en la sangre. La PCT refleja la severidad de una infección bacteriana y se usa como marcador para la diagnosis y la supervisión terapéutica de la sepsis, de la sepsis severa y del shock séptico de origen bacteriano (DANDONA P., NIX D., WILSON M.F., ALJADA A., LOVE J., ASSICOT M., BOHUON C. (1994): Procalcitonin increase after endotoxin injection in normal subjects. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 79:1605-1608; GENDREL D., ASSICOT M., RAYMOND J., MOULIN F., FRANCOUAL C., BADOUAL J., BOHOUN C. (1996): Procalcitonin as a marker for the early diagnosis of neonatal infection. Journal of Paediatrics 128:570-573; SNIDER R. H. JR., NYLEN E. S., BECKER K. L. (1997): Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation: immunochemical characterization. Journal of Investigative Medicine 45:552-560; WHANG K. T., STEINWALD P. M., WHITE J. C., NYLEN E. S., SNIDER R. H., SIMON G. L., GOLDBERG R. L., BECKER K. L. (1998): Serum calcitonin precursors in sepsis and systemic inflammation. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83:3296-3301; MUELLER B., BECKER K. L., SCHACHINGER H., RICKENBACHER P. R., HUBER P. R., ZIMMERLI W., RITZ R. (2000): Calcitonin precursors are reliable markers of sepsis in a medical intensive care unit. Critical Care Medicine 28:977-983). Se hace expresamente referencia para suplementar la presente descripción a los conocimientos técnicos generales que se exponen en dichas patentes y referencias bibliográficas.

La determinación de PCT puede también usarse a efectos de diagnosis diferencial puesto que, sobre la base de las concentraciones de PCT mensurables en el suero y en el plasma, es posible distinguir las enfermedades inflamatorias basadas en infecciones bacterianas de las que son de etiología no infecciosa (véase también la EP 0 880 702 B1). Esta posibilidad de establecer tal distinción ha demostrado ser muy valiosa para controlar el uso de antibióticos en el tratamiento, por cuanto que es posible evitar la administración de antibióticos también en los casos en los que los mismos no son eficaces porque el paciente no tiene una infección bacteriana.

Ya se han hecho también intentos de determinar la procalcitonina en el caso de infecciones en el fluido cerebroespinal (CSF). En todos los casos que se han descrito en la literatura se empleó un ensayo comercial desarrollado para la diagnosis de sepsis y que tiene una sensibilidad funcional de ensayo (FAS) de solamente 300 ng/l. Los resultados medidos que fueron obtenidos eran contradictorios. Como se describe en la solicitud de patente DE 10 2005 034 174.8 recién publicada o en la WO 2007/009789, sin embargo, pueden obtenerse resultados medidos más significativos si se emplea un ensayo más sensible, que también ha estado disponible desde hace algún tiempo. Con un ensayo de este tipo se obtiene una significativa correlación de la inmunorreactividad de PCT mensurable con la severidad de la enfermedad incluso en el caso de las enfermedades neurodegenerativas. Aunque a continuación no se trata específicamente acerca de la determinación de PCT en el CSF, queda expresamente comprendido dentro del alcance de la presente invención el uso del método según la invención que aquí se describe también en este sector parcial de la diagnosis.

Queda también en principio cubierta por la presente invención una determinación en la orina.

La determinación de PCT se efectúa, como se describe en las patentes y referencias bibliográficas anteriormente mencionadas, de manera adecuada mediante inmunoensayos del tipo sándwich con el uso de dos anticuerpos que se fijan a la secuencia de aminoácidos del péptido PCT completo, con lo cual no se detecta la PCT completamente procesada con liberación de calcitonina pero se detectan la PCT no procesada total y opcionalmente también aquellos péptidos parciales de PCT más largos que siguen teniendo ambos sitios de fijación para los dos anticuerpos que se usan en un ensayo en sándwich dentro de una única molécula, no siendo posible distinguir entre las formas de PCT opcionalmente modificadas terminalmente. Los métodos convencionales emplean dos anticuerpos que en general se fijan a aquellos segmentos del péptido PCT completo que, al tener lugar el procesamiento proteolítico de la PCT con formación de calcitonina, quedan situados en distintos péptidos parciales de PCT de entre los péptidos parciales de PCT que se forman o están situados en péptidos parciales de PCT que no comprenden la secuencia de la calcitonina.

El hecho de que la PCT 1-116 completa (ID SEC Nº: 1) no se encuentre o al menos no se encuentre primariamente en el suero o en el plasma en el caso de la sepsis, sino que en su lugar se encuentre una PCT 3-116 que es más corta en dos aminoácidos (ID SEC Nº: 2), está explicado en la EP 1 121 600 A1 o en la EP 1 408 334 A1 o en la US 6.756.483, a las que se hace referencia para suplementar la presente invención. Se hace además en este contexto referencia a la publicación: WEGLÖHNER W, STRUCK J, FISCHER-SCHULZ C, MORGENTHALER NG, OTTO A, BOHUON C, BERGMANN A: Isolation and characterization of serum procalcitonin from patients with sepsis. Peptides 2001; 22: 2099-103. Como se explica en dichas publicaciones, la única biomolécula con inmunorreactividad de procalcitonina que fue caracterizable en las muestras investigadas de pacientes de sepsis fue la mencionada procalcitonina 3-116 (ID SEC Nº: 2). En el adicional trabajo de WRENGER S, KAHNE T, BOHUON C, WEGLÖHNER W, ANSORGE S, REINHOLD D: Amino-terminal truncation of procalcitonin, a marker for systemic bacterial infections, by dipeptidyl peptidase IV (DP IV); FEBS Lett 2000; 466:155-9, se demuestra que esta procalcitonina 3-116 puede ser obtenida a partir de una procalcitonina 1-116 preparada sintéticamente mediante la acción de dipeptidilaminopeptidasa IV (DAP IV; DP IV; CD 26; E.C. 3.4.14.5).

Ninguna de dichas publicaciones revela si la procalcitonina 3-116 caracterizada en el caso de sepsis e infecciones es secretada directamente o si la misma es formada con posterioridad proteolíticamente a partir de un precursor "completo" en forma de procalcitonina 1-116 (PCT 1-116) liberada como intermedio a la circulación. Justo tan poco es lo que dichas publicaciones revelan acerca de si una "procalcitonina completa" 1-116 se da en concentraciones de estado estacionario mensurables en las muestras biológicas investigadas (sangre total o suero o plasma) o si la misma hace una importante contribución a la señal medida obtenida en la determinación de procalcitonina convencional.

Para la determinación de las inmunorreactividades de procalcitonina en suero/plasma hay varios ensayos comerciales de la Solicitante, como p. ej. el ensayo de quimioluminiscencia B.R.A.H.M.S PCT LIA (B.R.A.H.M.S AG), que tiene una FAS de aproximadamente 300 ng/l y está adaptado a la determinación de PCT en la sepsis, donde pueden darse muy altas concentraciones de PCT. Para la determinación de PCT con más alta sensibilidad fue recientemente desarrollado un inmunoensayo en sándwich modificado que opera con un anticuerpo policlonal purificado por afinidad y está descrito en más detalle en MORGENTHALER N. G., STRUCK J., FISCHER-SCHULZ C., BERGMANN A. (2002): Sensitive immunoluminometric assay for the detection of procalcitonin. Clinical Chemistry 48: 788-789, y está disponible como B.R.A.H.M.S PCTsensitiv LIA (B.R.A.H.M.S AG). Este ensayo tiene una considerablemente mejor sensibilidad funcional de ensayo (FAS) de 7 ng/l. Con ayuda de este ensayo fue posible determinar una concentración de PCT en suero de 13,5 ng/l (13,5 pg/ml) en personas sanas, habiéndose hallado valores de < 7 a 63 ng/l y correspondiendo a los 42,5 ng/l un porcentaje de un 97,5%.

A fin de permitirle al médico hospitalario realizar directamente en el hospital ("point-of-care") ("point-of-care" = sitio donde se administran los cuidados médicos) una comprobación rápida del estado de un potencial paciente de sepsis, está disponible un ensayo rápido de un solo paso en forma de un ensayo inmunocromatográfico para la rápida determinación semicuantitativa de procalcitonina en suero humano o plasma humano de un paciente (PCT-Q; B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft).

Como queda evidenciado por ejemplo por las publicaciones y los artículos de resumen anteriormente citados, la determinación del biomarcador procalcitonina está en la actualidad firmemente establecida en la rutina química, primariamente para la diagnosis temprana de la sepsis. Una razón para este éxito es la fiable correlación entre la sepsis o las infecciones bacterianas y un incremento de la inmunorreactividad de PCT mensurable en la sangre o en el suero/plasma de los pacientes, y la relativamente sencilla mensurabilidad de esta inmunorreactividad de PCT debido a las altas concentraciones que se alcanzan en la sangre de los pacientes de sepsis, debido a la alta estabilidad de la PCT 3-116 al menos primariamente detectada en la medición.

A pesar de estas indiscutibles ventajas de la determinación de la inmunorreactividad de PCT mediante los ensayos que están disponibles hasta la fecha con esta finalidad, sin embargo, los inventores descubrieron que la alta estabilidad y las altas concentraciones de la inmunorreactividad de PCT medida van también asociadas a ciertas desventajas para ciertos problemas diagnósticos clínicamente relevantes:

Una alta estabilidad o "larga vida" de un analito, y p. ej. de un péptido tal como la PCT 3-116, significa que la medición de un analito de este tipo proporciona información sumaria acerca de las actividades secretorias que ya han tenido lugar por espacio de un relativamente largo periodo de tiempo. Si por ejemplo se supone una producción más o menos continua de un analito durante un proceso patológico agudo, el analito estable se acumula en la muestra biológica y su producción fisiológica pretérita queda reflejada acumulativamente en sus concentraciones mensurables pero reducida por su reducción de la concentración que ha tenido lugar en el mismo periodo a su velocidad de eliminación fisiológica (su desaparición de la muestra debido a su conversión en productos de degradación que no son detectables analíticamente, o a su excreción a través de los riñones, o debido a otros mecanismos fisiológicos que son en sí conocidos). Cuanto más larga sea la vida de un analito o cuanto más baja sea su velocidad de eliminación, tanto menor será la influencia del exacto tiempo de medición en la determinación de la susodicha "formación" o "secreción" del analito. Por ejemplo, en este cuadro, una concentración que sea constante por espacio de periodos relativamente largos puede significar que la formación y la eliminación se equilibran mutuamente. Si la concentración disminuye, ello puede indicar que ha disminuido la secreción del analito, que actúa en el sentido de un "restablecimiento de la concentración". Sin embargo, la concentración del analito en la sangre puede seguir teniendo valores altos. Si sin embargo los valores de concentración mensurables son altos y la velocidad de eliminación es baja, los cambios en la secreción de un analito se manifiestan tan sólo como relativamente pequeñas y difícilmente interpretables variaciones de números relativamente grandes.

Si sin embargo el clínico está interesado precisamente en establecer con rapidez las variaciones que se produzcan en la secreción del analito, por ejemplo porque desee sacar conclusiones acerca del éxito de un tratamiento o de la recurrencia o la reinfección sobre la base de estas variaciones, frecuentemente es difícil reconocer una variación de este tipo de manera rápida e inequívoca sobre la base de los valores de concentración medidos para analitos "de larga vida".

Los inventores por consiguiente se fijaron a sí mismos el objetivo de mejorar la determinación de procalcitonina en el sentido de que las variaciones en la secreción de procalcitonina puedan ser reconocidas de manera rápida y fiable para que sean más cortos los periodos para el reconocimiento del éxito de un tratamiento o para la introducción de las necesarias intervenciones terapéuticas y de que sea posible obtener adicional información de la que no se disponía anteriormente que inmediatamente permita sacar conclusiones acerca de hasta qué punto ha progresado ya una infección/sepsis cuando el médico debe valorar al paciente por primera vez.

Este objetivo es alcanzado por un método según las reivindicaciones 1 a 12 y mediante la previsión de los nuevos anticuerpos según las reivindicaciones 13 a 15 que se requieren para tal método, y mediante los correspondientes kits (kits = conjuntos de materiales y utensilios) según las reivindicaciones 16 a 22.

Adicionales características importantes de la presente invención le resultarán evidentes al experto en la materia a la luz de la siguiente descripción y de las explicaciones de los ejemplos, y en particular a la luz de las discusiones de los resultados medidos que se dan, quedando estas explicaciones y estos ejemplos incorporados a la presente por referencia.

Al comienzo de las consideraciones de los inventores se supuso que el péptido procalcitonina, que es determinado como inmunorreactividad de PCT mediante los métodos de ensayo convencionales, es presumiblemente formado a partir de su prepéptido asociado (preprocalcitonina; pre-PCT) que tiene 141 aminoácidos, cuya secuencia de aminoácidos es conocida (ID SEC Nº: 3). Como es sabido en general para muchas prohormonas, la PCT es formada a partir de su molécula precursora más larga por eliminación de la secuencia señal. A pesar de que el punto de escisión no ha sido determinado experimentalmente, las secuencias señal generalmente tienen configuraciones similares, por lo que los puntos de escisión pueden predecirse con alta probabilidad. En el caso de la pre-PCT, la secuencia señal debería comprender los aminoácidos 1 a 24 de la pre-PCT (ID SEC Nº: 3). Se sigue de esto que el aminoácido aminoterminal en posición 1 de la prohormona PCT corresponde al aminoácido 25 de la pre-PCT (ID SEC Nº: 3). Sobre la base de tales consideraciones, se supuso originalmente que la PCT que se encuentra en la circulación durante la sepsis comprende 116 aminoácidos tras eliminación de la secuencia señal y tiene la secuencia de aminoácidos PCT 1-116 (ID SEC Nº: 1). Puesto que, sin embargo, solamente la PCT 3-116 (ID SEC Nº: 3) pudo ser caracterizada en muestras de pacientes de sepsis, quedaba la cuestión de la secreción intermedia de PCT 1-116 y de las concentraciones posiblemente alcanzadas de tal PCT 1-116 en la circulación. Hay que señalar de nuevo que los ensayos tipo sándwich que han venido siendo usados hasta la fecha para determinar la inmunorreactividad de procalcitonina operan con combinaciones de dos anticuerpos que no permiten una distinción entre PCT 1-116 y 3-116. Los ensayos conocidos, por consiguiente, naturalmente no pueden detectar selectivamente dichas formas distintas de PCT, y por lo tanto tampoco detectan las posibles variaciones características de las cantidades molares relativas de dichos analitos si dichas variaciones se producen en el curso de un proceso patológico, como por ejemplo en el curso de una sepsis. A la inmunorreactividad de PCT que se determina mediante un ensayo convencional se la denomina por consiguiente "total de PCT" en la presente Solicitud.

Los inventores decidieron en esta situación aportar un nuevo tipo de método para la determinación inmunodiagnóstica de procalcitonina por medio del cual se determinen selectivamente tan sólo aquellas fracciones de procalcitonina que también tengan los dos primeros aminoácidos de la procalcitonina 1-116, y, con el uso de este nuevo método, comprobar si es posible con el mismo obtener resultados de medición clínicamente relevantes que sean cualitativamente mejores que los resultados de la anterior determinación de la inmunorreactividad de procalcitonina.

Como se describe más en detalle en la siguiente parte experimental, los inventores primeramente desarrollaron nuevos anticuerpos que tienen las propiedades de fijación necesarias para una determinación clínica, con lo cual reconocen tan sólo aquellas moléculas de procalcitonina que contienen la secuencia de procalcitonina completa en el terminal amino con los dos primeros aminoácidos (Ala-Pro) de la procalcitonina 1-116 o que contienen al menos el aminoácido 2 (Pro). Entonces usaron estos nuevos anticuerpos en un ensayo tipo sándwich que permite una determinación selectiva de la PCT 1-116 en una muestra biológica de un paciente humano, o sea por ejemplo en suero o en particular en plasma, sin que el valor medido sea influenciado por la presencia de PCT 3-116 (ID SEC Nº: 2) en la muestra. En otras palabras, las concentraciones de PCT 3-116, y naturalmente de todos los otros fragmentos de PCT truncados en el N-terminal en al menos dos aminoácidos, si están presenten en la muestra biológica, no son detectadas (codeterminadas) por el método de ensayo según la presente invención para la determinación selectiva de PCT 1-116 en una muestra biológica y no pasan a formar parte (no forman un importante incremento) del valor medido.

Como se pone de manifiesto más adelante en la parte experimental de la Solicitud, los resultados medidos obtenidos usando un ensayo de este tipo colmaron las esperanzas de los inventores en cuanto al deseado perfeccionamiento de la determinación diagnóstica de la procalcitonina a los particulares efectos diagnósticos que se han mencionado anteriormente.

De hecho se comprobó que en muestras recién obtenidas de suero humano y en particular de plasma humano recién obtenido de pacientes están presenten importantes concentraciones de PCT 1-116 que son fácilmente mensurables. Las concentraciones molares de PCT 1-116 halladas por los inventores en tales muestras son del orden de aproximadamente 1/5 a 1/8 de las concentraciones molares para la inmunorreactividad de PCT que es mensurable en paralelo mediante métodos tradicionales ("total de PCT").

Si se supone que la PCT total secretada en la circulación es secretada primariamente como PCT 1-116, se sigue de ello que las concentraciones de PCT 1-116 y de total de PCT deben ser iguales en un hipotético punto en el tiempo al comienzo de la secreción de PCT, con lo cual puede suponerse para la relación de PCT 1-116 a total de PCT un máximo límite inicial hipotético de 1,0. Relaciones situadas dentro de la gama de relaciones que va desde aproximadamente 1/5 hasta 1/8, como las que fueron halladas por los inventores en las muestras investigadas, por consiguiente ya contienen de por sí información acerca de la historia de la muestra, por ejemplo en el sentido de la duración transcurrida y/o de la severidad de la infección/sepsis. Debido a la menor estabilidad de la PCT 1-116 (debido a la conversión en PCT 3-116), dicha relación y las variaciones de concentración que pueden ser establecidas para la PCT 1-116 reflejan el estado agudo de un paciente mucho más directamente que los valores para la PCT 3-116 más estable. La determinación selectiva de PCT 1-116 por consiguiente conduce a un considerable progreso diagnóstico. Esto también se manifiesta en particular cuando la determinación selectiva según la invención de la PCT 1-116 con ayuda del nuevo método se combina con la determinación convencional de la inmunorreactividad de PCT total (total de PCT).

El método según la invención tiene particulares ventajas en los casos en los que es deseable una rápida detección del estado de enfermedad real de un paciente. Sin embargo, dicho método puede ser en principio usado en todos los casos en los que han venido usándose hasta la fecha los métodos conocidos para la determinar la inmunorreactividad de PCT. Siempre que una determinación sea selectiva para la PCT 1-116 con ambos aminoácidos amino-terminales (Ala-Pro) o al menos para una procalcitonina con el aminoácido en posición 2 (Pro), el método debe considerarse como un método según la presente invención. La forma de ensayo especial elegida desempeña un papel bastante secundario, y un formato de ensayo especial se elige primariamente desde puntos de vista prácticos relativos a la tecnología de medición.

A pesar de que por consiguiente se describe en la parte experimental de esta solicitud y se usa para la medición un método específico de tipo sándwich con el uso de anticuerpos específicos (anticuerpos monoclonales), la presente invención no queda limitada a este método específico o a un método de un tipo similar. En lugar de ello, la invención incluye cualesquiera métodos inmunodiagnósticos deseados que, en el contexto de la presente invención, permitan una determinación selectiva de PCT 1-116 sin que el valor medido sea influenciado por otros derivados de PCT simultáneamente presentes, y en particular por la PCT 3-116. En otras palabras, las concentraciones de PCT 3-116 en la muestra biológica no varían el valor medido selectivamente para la PCT 1-116 ni representan contribución alguna al mismo.

Es obvio para el experto en la materia que por ejemplo ensayos de tipo competitivo (por ejemplo con un anticuerpo selectivo inmovilizado y un análogo marcado/selectivamente marcable del analito que compita con la PCT 1-116, o con un análogo inmovilizado y un anticuerpo selectivo marcado) u otros formatos de ensayo, como por ejemplo los llamados ensayos turbidométricos, pueden ser usados en lugar del ensayo tipo sándwich que se ha descrito.

En principio puede usarse cualquier marcador conocido adecuado para ensayos diagnósticos (es decir que en lugar de la marcación por luminiscencia que se usa en los ejemplos, pueden también usarse, por ejemplo, radioisótopos, enzimas, etiquetas de fluorescencia, otras etiquetas de quimioluminiscencia o etiquetas de bioluminiscencia y marcaciones de color óptica y directamente detectables tales como, por ejemplo, átomos de oro y partículas de colorante como los que se usan en los ensayos acelerados).

Queda además expresamente dentro del alcance de la presente invención el diseñar el método según la invención como ensayo acelerado, por ejemplo en forma de un método de ensayo inmunocromatográfico.

Si el método se diseña como un método heterogéneo en el cual un fijador específico en forma inmovilizada está presente y fijado a una fase sólida y/o los productos de reacción son al menos parcialmente inmovilizados en una fase sólida, la fase sólida puede ser cualquier fase sólida adecuada que se desee, como por ejemplo una pared de un tubo de ensayo, una fase sólida particulada, por ejemplo en forma de partículas magnéticas en suspensión en la solución de reacción, o una fase sólida en forma de un soporte de un aparato inmunocromatográfico (para un ensayo acelerado).

En una realización actualmente preferida, el método es ejecutado como un inmunoensayo en sándwich heterogéneo en el cual uno de los anticuerpos está inmovilizado en las paredes de tubos de ensayo recubiertos (p. ej. de poliestireno; "tubos recubiertos"; CT) o en placas de microtitulación, por ejemplo de poliestireno, o en partículas, como por ejemplo partículas magnéticas, mientras que el otro anticuerpo lleva un residuo que representa una etiqueta directamente detectable o permite un enlace selectivo con una etiqueta y sirve para la detección de las estructuras en sándwich que se forman. Con el uso de adecuadas fases sólidas es también posible una inmovilización retardada o posterior.

El método no tiene sin embargo que diseñarse como un método heterogéneo en el cual está presente en forma inmovilizada al menos un fijador específico. Todos los reactivos y los productos de reacción pueden también estar presentes en suspensión en una fase líquida homogénea y pueden permanecer ahí para la medición. En un caso de este tipo es preferible marcar ambos anticuerpos que se usen para la determinación con partes de un sistema de detección que permita una generación de señales o una producción de señales al ser ambos anticuerpos integrados en un solo sándwich. Tales técnicas pueden diseñarse en particular como métodos de detección por amplificación de fluorescencia o por extinción de fluorescencia. Un método particularmente preferido de este tipo es relativo al uso de reactivos de detección que se usan por parejas, como se describe, por ejemplo, en los documentos US-A-4 822 733, EP-B1-180 492 o EP-B1-539 477 y en el estado de la técnica que ahí se cita. Dichos reactivos permiten efectuar una medición que detecta selectivamente tan sólo los productos de reacción que contienen ambos componentes de marcación en un solo complejo inmune, directamente en la mezcla de reacción. Como ejemplo puede hacerse referencia a la tecnología que se ofrece con las marcas TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) o KRYPTOR®, que ponen en ejecución las doctrinas de las Solicitudes anteriormente mencionadas.

Se supone además que el método de ensayo según la invención puede ser también ventajosamente usado como parte de una diagnosis llamada diagnosis multiparamétrica. Son adicionales parámetros que se determinan con la misma por ejemplo parámetros de sepsis e infección que pueden ser seleccionados, por ejemplo, de entre los miembros de un grupo que consta de anticuerpos anti-gangliósido, las proteínas procalcitonina total (total de PCT), procalcitonina 3-116, proteínas CA 125, CA 19-9, S100B y S100A, LASP-1, fragmentos de citoqueratina solubles, y en particular CYFRA 21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1 solubles (sCY1F), los péptidos inflamina y CHP, otras prohormonas peptídicas tales como, en particular, pro-ANP, pro-BNP, pro-adrenomedulina, pro-endotelina, pro-vasopresina y los fragmentos peptídicos utilizables en diagnosis de las mismas, glicina N-aciltransferasa (GNAT), carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) y la proteína C-reactiva (CRP), citoquinas, p. ej. del tipo interferón, o adecuados fragmentos de los mismos. En dichas determinaciones multiparamétricas puede pretenderse determinar los resultados medidos para una pluralidad de parámetros simultáneamente o en paralelo y evaluarlos, por ejemplo con ayuda de un programa de ordenador que también use correlaciones de parámetros diagnósticamente significativos.

Una particularmente importante medición en combinación es una medición selectiva paralela de PCT 1-116 y de la habitual inmunorreactividad de PCT (total de PCT) que, a la luz de los resultados de la presente Solicitud, representa una medición sumaria de las concentraciones de PCT 1-116 más PCT 3-116 presentes en una muestra. Con respecto a las ventajas de una medición de este tipo, se hace expresamente referencia a los ejemplos siguientes.

Es además posible combinar mediciones selectivas de PCT 1-116 y PCT 3-116. Los inventores también han realizado tales mediciones en combinación usando un anticuerpo monoclonal selectivo para PCT 3-116 (no se indican los resultados). Puesto que las concentraciones de PCT 3-116 que se forma constantemente de nuevo en la degradación proteolítica de la PCT 1-116 están directamente incluidas en las concentraciones de PCT 3-116, es sin embargo más compleja la evaluación de las mediciones comparativas. Por añadidura, parece ser que puede producirse una adicional degradación proteolítica en el terminal amino de la PCT 3-116, con el resultado de que los resultados medidos son falseados. Una medición en combinación de PCT 1-116 con una medición selectiva de PCT 3-116 es por consiguiente menos preferible en la actualidad.

En los ejemplos siguientes se hace referencia a figuras en las cuales:

La figura 1 muestra una curva estándar de un ensayo en sándwich para la determinación selectiva de PCT 1-116 como se describe más en detalle en la parte experimental;

la figura 2 muestra una curva estándar de un B.R.A.H.M.S PCT LIA convencional tras adaptación de la curva de calibración a las unidades pmoles/l;

la figura 3 muestra mediciones comparativas de la variación de la concentración de PCT 1-116 determinada mediante el ensayo según la invención (triángulos) y la concentración del total de PCT determinada mediante un ensayo comercial (B.R.A.H.M.S PCT LIA; cuadrados), basadas en cada caso en las concentraciones de partida de coordinadas en el día 0 y medidas en plasmas EDTA de ocho pacientes de sepsis de una unidad de cuidados intensivos tratados con éxito;

la figura 4 muestra los resultados de la determinación de la relación molar de PCT 1-116 al total de PCT en muestras según la figura 3 y la variación de la misma en función del tiempo a lo largo de 3 días.

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Parte experimental I. Desarrollo del ensayo - Síntesis de péptidos y desarrollo de anticuerpos I.1. Síntesis de péptidos

Los siguientes péptidos fueron sintetizados como constituyentes antigénicos para producción de anticuerpos, como ligandos selectivos para purificación por afinidad y para mapeo epitópico y como potenciales patrones y competidores:

Sacados de la conocida secuencia de aminoácidos de la pre-procalcitonina (pre-PCT; ID SEC Nº: 3), los de una pluralidad de segmentos peptídicos parciales fueron seleccionados y fueron sintetizados químicamente como péptidos solubles por métodos estándar. Éstos fueron purificados, sometidos a control de calidad por medio de espectrometría de masas y HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) de fase inversa y liofilizados en partes alícuotas (JPT, Berlín, Alemania). Las secuencias de aminoácidos de los péptidos sintetizados son las que se indican a continuación (las posiciones de los aminoácidos que se indican están basadas en pre-PCT; y el aminoácido 25 corresponde al aminoácido 1 de la PCT 1-116 según la ID SEC Nº: 1):

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I.2. Desarrollo, marcación y caracterización de anticuerpos con especificidad para el N-terminal de la PCT 1-116 I.2.1. Desarrollo y selección de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales fueron desarrollados por métodos estándar como los descritos, por ejemplo, por Harlow y Lane (Harlow E., Lane D. "Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, ISBN 0-87969-314-2). Se resume más en detalle el desarrollo a continuación:

Por medio de MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), el péptido PAS10 (ID SEC Nº: 4; aminoácidos 1 a 10 de PCT 1-116) fue conjugado con la proteína portadora KLH (hemocianina de lapa californiana) (véanse las instrucciones de trabajo "NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers" de PIERCE, Rockford, IL, EE.UU.). Fueron inmunizados con este conjugado ratones Balb/c. Tras potenciación, células del bazo de los ratones fueron posteriormente fusionadas con células de mieloma SP2/0.

Para los ensayos de fijación de los anticuerpos de los supernatantes de cultivo de las células de mieloma, los péptidos PAD20 (ID SEC Nº: 6) y PPD19 (ID SEC Nº: 7; aminoácidos 2-20 de PCT 1-116) fueron inmovilizados en placas de microtitulación. Con esta finalidad, los péptidos fueron disueltos en fosfato de Na 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM en una concentración de 7 \mug/ml, y se pipetaron 150 \mul de ello por cavidad.

Se efectuó incubación por espacio de 20 horas a 4ºC. La solución fue filtrada con aspiración. Cada cavidad fue luego llenada con 150 \mul de fosfato sódico 10 mM, Karion FP al 2%, albúmina de suero bovino al 0,3%, pH 6,5. Tras haber transcurrido 20 horas, la solución fue filtrada con aspiración.

150 \mul de cada uno de los supernatantes de cultivo a someter a ensayo fueron pipetados al interior de cavidades de placa de microtitulación recubiertas con PAD20 (ID SEC Nº: 6) o PPD19 (ID SEC Nº: 7). Se efectuó incubación por espacio de dos horas a 22ºC. El supernatante fue filtrado con aspiración. Se efectuó lavado dos veces con fosfato de Na 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM, y los anticuerpos fijados fueron detectados con conjugado secundario de anticuerpo anti-ratón-fosfatasa alcalina por métodos estándar (SIGMA, Deisenhofen, Alemania).

Fueron seleccionados para aislamiento aquellos cultivos celulares que secretaron anticuerpos que se habían fijado al péptido PAD20 (ID SEC Nº: 6) pero mucho menos al péptido PPD19 (ID SEC Nº: 7). Los supernatantes de cultivo de los aislamientos fueron cribados por el mismo método como para los cultivos celulares iniciales. Los clones celulares cribados positivamente en este sentido fueron luego cultivados a mayor escala, y los anticuerpos fueron purificados por medio de cromatografía de afinidad en una columna de proteína G, y tres de dichos anticuerpos fueron adicionalmente investigados como potenciales candidatos para la fijación selectiva de PCT 1-116 en un inmunoensayo (designaciones internas de los anticuerpos: mAb 295/3H12; mAb 295/4G9; mAb 295/4611).

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I.2.2. Marcación de los anticuerpos

Para la caracterización de la especificidad epitópica de los tres anticuerpos seleccionados y el posterior desarrollo del ensayo, los anticuerpos monoclonales obtenidos fueron marcados con una etiqueta de quimioluminiscencia de la manera siguiente:

Cada anticuerpo fue ajustado a una concentración de 1,5 mg/ml en un tampón de fosfato potásico 100 mM (pH 8,0). 67 \mul de la solución de anticuerpo fueron mezclados con 10 \mul de NHS-éster de acridinio MA70 (1 mg/ml; de HOECHST Behring) e incubados por espacio de 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación de ello fueron añadidos 423 \mul de glicina 1M y se efectuó incubación por espacio de otros 10 minutos. A continuación de ello, el lote de marcación fue retamponado a través de una columna de filtración en gel NAP-5 (Pharmacia) en 1 ml de fase móvil A (fosfato potásico 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) según las instrucciones de trabajo, y fue con ello liberado de los constituyentes de bajo peso molecular. Para separar los últimos residuos de etiquetas no fijadas al anticuerpo, fue efectuada HPLC de filtración en gel (columna: Waters Protein Pak SW300). La muestra fue aplicada y fue cromatografiada con un caudal de 1 ml/min. con fase móvil A. Fueron medidas las longitudes de onda de 280 nm y 368 nm usando un fotómetro de flujo. La relación de absorción a 368 nm/280 nm como medida del grado de marcación del anticuerpo fue de 0,10 +/- 0,01 en el pico. Las fracciones con contenido de anticuerpos monoméricos (tiempo de retención 8-10 min.) fueron recogidas y fueron reunidas en 3 ml de fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, albúmina de suero bovino al 5%, azida sódica al 0,1%, pH 7,4.

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I.2.2. Mapeo epitópico de tres anticuerpos monoclonales seleccionados

Para el mapeo epitópico de los tres anticuerpos monoclonales desarrollados y seleccionados, fueron inmovilizados en tubos varios péptidos que representan el segmento N-terminal de la procalcitonina (véase I.1.; Tab. 1). Esto se efectuó como se ha descrito anteriormente para el recubrimiento de placas de microtitulación, exceptuando que en lugar de 150 \mul se pipetaron 300 \mul de solución de péptido.

El respectivo anticuerpo monoclonal marcado por quimioluminiscencia fue diluido en tampón de ensayo (fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, albúmina de suero bovino al 0,5%, IgG inespecífica de ratón al 0,1%, azida sódica al 0,1%, pH 7,4), con lo cual fue obtenida una concentración final de 0,9 millones de RLU (unidades relativas de luz)/200 \mul. Porciones de 200 \mul de estas soluciones fueron pipetadas al interior de los tubos con péptido, y se efectuó incubación por espacio de 2 horas a 22ºC con sacudimiento. A continuación de ello se efectuó lavado cuatro veces con porciones de 1 ml de solución de lavado (Tween 20 al 0,1%) por tubo, se dejó que se escurriesen los tubos y se efectuó una medición de la quimioluminiscencia fijada al tubo en un luminómetro (de BERTHOLD, LB952T; reactivos básicos de la BRAHMS AG).

Como queda puesto en evidencia por la siguiente tabla 1, los tres anticuerpos seleccionados (designación interna mAb 295/3H12; mAb 295/4G9; mAb 295/4G11) fueron los que mejor reaccionaron con un péptido sacado de pre-procalcitonina (o procalcitonina) si el mismo terminaba con la posición 25 en el N-terminal (péptido PAD20; ID SEC Nº: 6). Si estaba ausente la posición 25 (péptido PPD19; ID SEC Nº 7), se lograba tan sólo una fijación marginal, que correspondía tan sólo a aproximadamente dos veces la fijación inespecífica para los anticuerpos monoclonales individuales y era inferior con un factor de 199 (mAb 295/3H12), un factor de 85 (mAb 295/4G9) o un factor de 102 (mAb 295/4G11) a la correspondiente al péptido PAD20 en el cual estaba presente la posición 25.

Así, los anticuerpos son altamente específicos y adecuados para distinguir los péptidos de procalcitonina que contienen las posiciones 1 y 2 de la PCT 1-116 (posiciones 25 y 26 de la pre-PCT) en el N-terminal de aquellos péptidos de procalcitonina que están acortados en solamente un residuo de aminoácido en el N-terminal en comparación con los mismos.

TABLA 1 Mapeo epitópico. Los valores de fijación medidos están indicados como unidades relativas de luminiscencia (RLU)

1

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I.4. Desarrollo de un inmunoensayo en sándwich para la medición específica de PCT 1-116 I.4.1. Acoplamiento

Tubos de poliestireno de 5 ml de alta fijación (de Greiner) fueron recubiertos como se indica a continuación con un anticuerpo monoclonal (designación interna: QN05) que está dirigido a un epítope en el segmento C-terminal de la procalcitonina y se usa también en un ensayo comercial B.R.A.H.M.S PCT LIA: El anticuerpo fue diluido en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,8, hasta una concentración de 6,6 \mug/ml. Fueron pipetados al interior de cada tubo 330 \mul de esta solución. Los tubos fueron incubados por espacio de 20 horas a 22ºC. La solución fue filtrada con aspiración. Cada tubo fue luego llenado con 4,2 ml de fosfato sódico 10 mM, Karion FP al 2%, albúmina de suero bovino al 0,3%, pH 6,5. Tras haber transcurrido 20 horas, la solución fue filtrada con aspiración. Finalmente, los tubos fueron secados en un secador al vacío.

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I.4.2. Marcación

El anticuerpo monoclonal mAb 295/3H12, que ha sido caracterizado anteriormente más en detalle con respecto a su comportamiento en materia de fijación y reconoce específicamente el N-terminal de la PCT 1-116, fue marcado por quimioluminiscencia como se ha descrito anteriormente en I.2.2.

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I.4.3. Procedimiento y evaluación del inmunoensayo

El péptido PAN40 (ID SEC Nº: 11), que fue diluido serialmente en suero normal de caballo, sirvió de material patrón. Fueron atribuidas a los patrones así preparados concentraciones según el peso de péptido tomado.

El inmunoensayo en sándwich fue preparado de la manera siguiente: Fueron pipetados al interior de los tubos de ensayo recubiertos con anticuerpos 50 \mul de patrones o muestras y 150 \mul de tampón de ensayo (fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, albúmina de suero bovino al 0,5%, IgG inespecífica de ratón al 0,1%, azida sódica al 0,1%, pH 7,4) que contenía 0,5 millones de RFU (unidades relativas de luz) del anticuerpo marcado con MA70. Se efectuó incubación por espacio de 3 horas a 22ºC con sacudimiento. A continuación de esto se efectuó lavado 4 veces con porciones de 1 ml de solución de lavado (Tween 20 al 0,1%) por tubo, se dejó que se escurriesen los tubos y se efectuó una medición de la quimioluminiscencia fijada al tubo en un luminómetro (de BERTHOLD, LB952T; reactivos básicos de la BRAHMS AG). Usando el software MultiCalc (Spline Fit), las concentraciones de PCT 1-116 de las muestras fueron leídas a partir de la curva estándar. Se muestra en la Figura 1 una curva estándar típica. El ensayo tenía una sensibilidad funcional de ensayo (FAS), definida como la concentración a la cual el coeficiente de variación de la media de diez pruebas independientes era del 20%, de 6 pmoles/l.

A continuación de los experimentos de la especificidad epitópica del anticuerpo 295/3H12 anteriormente descritos, fue efectuada una investigación para determinar la reactividad cruzada del ensayo para un péptido que estaba sacado de procalcitonina y carecía del primer aminoácido N-terminal: Una muestra de PCT 2-116 (InVivo GmbH, de Henningsdorf, Alemania; véase también la EP 1 408 334) que tenía una concentración de 37433 pmoles/l arrojó una medición de 206 pmoles/l. Así, la reactividad cruzada era tan sólo de un 0,5%.

II. Mediciones de la estabilidad del analito y de plasmas humanos de pacientes de sepsis II.1. Estabilidad del analito en las muestras

Se investigó primeramente la estabilidad de la PCT 1-116 natural en muestras de pacientes de sepsis sobre la base de su mensurabilidad en el ensayo de la PCT 1-116 según I. Con esta finalidad fueron obtenidas de diez pacientes de sepsis muestras de suero y plasma EDT, y tanto recién obtenidas como tras haber estado almacenadas por espacio de seis horas a 22ºC dichas muestras fueron luego sometidas a medición mediante el ensayo anteriormente mencionado.

De promedio, la disminución de la inmunorreactividad a las 6 h era de tan sólo un 3,6% en el caso de los plasmas, y la máxima disminución individual era de un 7,6%. En el caso de los sueros, por otro lado, la inmunorreactividad disminuyó por término medio en un 13,5%, y se observaron en la disminución considerables diferencias individuales.

Las diferencias de estabilidad individuales observadas para la PCT 1-116, en particular en el suero, que reflejan una actividad enzimática posiblemente distinta a nivel individual, significan que puede no ser directamente posible relacionar las mensurables variaciones de concentración de PCT 1-116 en una muestra de un paciente individual con un valor de referencia universalmente aplicable para la eliminación de la PCT 1-116 de la circulación, por ejemplo a fin de distinguir los casos de una pura disminución de una concentración inicial fija de PCT 1-116 de los casos en los que se superpone a tal disminución de la concentración una secreción persistente o recurrente de PCT 1-116.

La procalcitonina, medida como inmunorreactividad de PCT o "total de PCT" mediante el ensayo convencional B.R.A.H.M.S PCT LIA, es estable en muestras de suero tras almacenamiento por espacio de seis horas a 22ºC (instrucciones de trabajo para el ensayo B.R.A.H.M.S PCT LIA).

El B.R.A.H.M.S PCT LIA es un inmunoensayo en sándwich que usa anticuerpos monoclonales contra epítopes en el segmento C-terminal (fracción de catacalcina) o en el segmento de la región central (fracción de calcitonina). Para permitir una consideración comparativa, las concentraciones de los patrones especificadas por el fabricante en ng/ml fueron convertidas en pmoles/l. Se muestra en la Figura 2 una típica curva estándar. El ensayo tenía una sensibilidad funcional de ensayo (FAS), definida como la concentración a la cual el coeficiente de variación de la media de diez pruebas independientes era del 20%, de 20 pmoles/l.

Puede considerarse que habitualmente es suficiente para la práctica clínica la estabilidad del analito PCT 1-116 determinada en plasma EDTA humano. No obstante, si hay un riesgo de que el respectivo plasma EDTA obtenido de la muestra no pueda ser medido con suficiente inmediatez, queda dentro del alcance de la presente invención el impedir la degradación de la PCT 1-116 por parte de la dipeptidilaminopeptidasa IV (DAP IV) para su conversión en PCT 3-116 mediante la adición de inhibidores sintéticos para la DAP IV a la muestra (p. ej. mediante la adición de Lys [Z(NO_{2})]-tiazolidida o de Pro-Pro^{(P)}[OPh-4Cl]_{2}, véase WRENGER S, KAHNE T, BOHUON C, WEGLÖHNER W, ANSORGE S, REINHOLD D: Amino-terminal truncation of procalcitonin, a marker for systemic bacterial infections, by dipeptidyl peptidase IV (DP IV), FEBS Lett 2000; 466:155-9). Si adicionalmente y de manera opcional otras enzimas contribuyen a la disminución de la concentración de PCT 1-116 en una muestra, es naturalmente también posible usar otros inhibidores del efecto enzimático destructivo.

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II.2. Mediciones acerca del valor clínico II.2.1. La cinética del exitoso tratamiento de infecciones

Es deseable reconocer en una etapa temprana y de manera fiable el éxito del tratamiento en el caso de los pacientes de sepsis porque con ello se incrementa la seguridad en el régimen de tratamiento de un paciente y pueden reducirse las costosas permanencias en la unidad de cuidados intensivos.

Para verificar la cuestión de si la medición según la invención de PCT 1-116 mediante el uso del ensayo en sándwich anteriormente descrito puede dar resultados que se diferencien de los de una medición convencional de la inmunorreactividad de PCT ("total de PCT"), se adoptó el procedimiento siguiente:

Fueron obtenidas diariamente muestras de plasma de ocho pacientes de sepsis que fueron tratados con éxito en la unidad de cuidados intensivos. Se midieron al comienzo del tratamiento y a los dos días subsiguientes el total de PCT (medido mediante el ensayo convencional B.R.A.H.M.S PCT LIA; véase lo expuesto anteriormente) y la PCT 1-116. Las concentraciones medias al comienzo de las mediciones (en el día 0) eran de 100,6 pmoles/l para la PCT 1-116 y de 591,8 pmoles/l para el total de PCT (relación molar de las concentraciones iniciales de aproximadamente 0,17).

Las concentraciones de PCT 1-116 disminuyeron significativamente más rápido que las del total de PCT: La disminución de PCT 1-116, sobre la base del día 0, fue de un 32% en el primer día y de un 52% en el segundo día. En contraste con ello, la disminución del total de PCT fue solamente de un 11% en el primer día y solamente de un 30% en el segundo día (Figura 3).

En vista del objetivo diagnóstico de reconocer el tratamiento exitoso lo más rápidamente posible sobre la base de una disminución de la secreción de procalcitonina, es ahora posible plantear la cuestión relativa al tiempo después del cual los dos métodos de ensayo que se han comparado anteriormente permiten reconocer en absoluto una disminución. Si se tienen en cuenta las variancias inter ensayo, es aproximadamente cierto que una disminución de aproximadamente un 20% puede ser clasificada como fácilmente detectable. Una disminución de este orden es detectable tras haber transcurrido tan sólo 0,6 días en una medición de PCT 1-116, pero tan sólo tras haber transcurrido 1,2 días en la medición convencional de la inmunorreactividad de PCT (del total de PCT).

El éxito de un tratamiento es por consiguiente detectable de manera considerablemente más rápida y fiable en la medición de PCT 1-116 que en la medición convencional de la inmunorreactividad de PCT ("total de PCT").

Para una adicional evaluación de los datos medidos, se calculó para cada paciente y cada tiempo de medición la respectiva relación molar de PCT 1-116 al total de PCT. A lo largo de los tres días de observación, esta relación, expresada como la media, disminuyó desde 0,17 y pasando por 0,15 hasta 0,12 (Figura 4). También esta evaluación refleja la distinta cinética de degradación de la PCT 1-116 y del total de PCT. Expresado en términos simples, es cierto que la disminución de PCT 1-116 refleja directamente la degradación de la misma o su menor estabilidad, mientras que la disminución del "total de PCT" refleja la degradación de PCT 3-116 o la estabilidad de la misma. Puesto que la conversión de PCT 1-116 en PCT 3-116 no debería tener un efecto considerable en la medición en la determinación del total de PCT porque el método convencional no distingue entre la PCT 1-116 y la PCT 3-166, la velocidad de conversión de PCT 1-116 en PCT 3-116 no influencia significativamente a la disminución de la concentración del total de PCT, por lo que esto corresponde en sustancia a la disminución de la PCT 3-116 más estable que se ha acumulado en la muestra.

Las consideraciones anteriores demuestran que, además, un valor pequeño para la relación de PCT 1-116 al total de PCT (es decir, una baja concentración de PCT 1-116 con una al mismo tiempo comparativamente alta concentración del total de PCT) indica el final de la infección, mientras que un valor grande indica un punto en el tiempo cercano al comienzo de la secreción de PCT, y por consiguiente una infección altamente aguda. Esta observación tiene implicaciones no tan sólo para la observación de la progresión, sino también para la estimación inicial del estado de infección de un paciente, por ejemplo en la admisión de emergencias o en el tratamiento médico del paciente como paciente externo.

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II.2.2. La cinética en el caso de infección secundaria

Durante su permanencia en la unidad de cuidados intensivos, los pacientes de sepsis frecuentemente sufren una infección adicional que, debido al debilitamiento de su sistema inmune, es particularmente amenazadora para la vida y puede tener efectos fatales. Cuanto más tempranamente sea detectada una infección secundaria de este tipo, tanto más rápidamente y con tanto mayor eficacia podrá iniciarse la toma de contramedidas terapéuticas. Debido al conocido fenómeno de la tolerancia a las endotoxinas, sin embargo, las infecciones secundarias redundan en un incremento menos pronunciado de la concentración del total de PCT.

La detección temprana de una reinfección bacteriana que esté asociada a un posterior incremento menos pronunciado de la temporalmente ya reducida o incluso terminada secreción de PCT es particularmente complicada por cuanto que, debido a la infección primaria, los pacientes ya tienen considerables concentraciones del total de PCT que, debido a la alta estabilidad de la PCT 3-116, se reducen tan sólo de manera relativamente lenta incluso con un tratamiento exitoso. Como se ha demostrado anteriormente, la PCT 1-116 tiene una cinética de degradación in vivo que es considerablemente más rápida que la del total de PCT (con una predominante proporción de PCT 3-116). Si se supone que la PCT 1-116 es convertida en el primer paso de su degradación en PCT 3-116, la disminución de la concentración (más baja en valores absolutos) de PCT 1-116 no corresponde a un incremento de los valores para el total de PCT. Éstos aumentan tan sólo a la velocidad de producción de nueva PCT 1-116.

En el caso de una infección a la que se ha opuesto considerable resistencia y que ya no es aguda, es decir, antes de una infección secundaria, las concentraciones mensurables de PCT 1-116 deberían ser relativamente bajas, a pesar de que los valores absolutos para las concentraciones del total de PCT sigan siendo altos debido a la estabilidad de la PCT 3-116, que en este punto en el tiempo probablemente representará la principal contribución a la concentración medida del total de PCT. Un posterior incremento de la secreción de PCT, inducido por una infección secundaria, debería ser por consiguiente detectable en una etapa temprana sobre la base de los valores medidos para la PCT 1-116, mientras que no es detectable o no es detectable inequívocamente sobre la base de los mucho más altos valores medidos para el total de PCT en términos absolutos.

La consideración de las concentraciones de PCT 1-116 y de PCT 3-116 medidas juntamente en la determinación del total de PCT lleva a la conclusión de que, bajo la influencia de una disminución bastante lenta de una alta concentración de PCT 3-116 de la infección primaria y del posterior incremento de PCT de la infección secundaria, el comienzo de la resecreción de PCT es posiblemente detectable de manera no inmediata como un incremento mensurable de la PCT total, pero inicialmente tan sólo como una reducción difícilmente detectable de la disminución de las concentraciones del total de PCT, que empiezan a disminuir más lentamente que lo que corresponde a la velocidad de eliminación de la PCT 3-116.

Se realizó por consiguiente una investigación para determinar si una evolución de la concentración de PCT 1-116 en el sentido de un incremento o de un enlentecimiento inferior a la habitual reducción de la concentración de PCT 1-116 relacionada con la estabilidad que se diferencia considerablemente de la evolución de la concentración del total de PCT predice un posterior incremento también del total de PCT al día siguiente, como signo de una infección secundaria.

Se obtuvo diariamente plasma de 44 pacientes de sepsis con una permanencia media de 10,8 días en la unidad de cuidados intensivos, se determinaron en paralelo en dicho plasma el total de PCT y la PCT 1-116, y la curva de concentración de los mismos fue supervisada para cada paciente individual durante el periodo de las mediciones.

Se observó seis veces que un incremento del total de PCT al día siguiente iba precedido por un incremento de la PCT 1-116, mientras aún disminuía el total de PCT.

En otros 7 casos - en cada caso con una continuada disminución del total de PCT - se observó una reducida reducción de la disminución de la concentración de PCT 1-116, o sea una disminución menor que en otras muestras, que iba asociada al inicio de una infección secundaria. Las concentraciones del total de PCT aún no variaban en grado significativo. Tan sólo al día siguiente eran detectables signos de un posterior incremento del total de PCT. Queda dentro del alcance de la presente invención también el usar aquellos incrementos "ocultos" de la concentración del PCT 1-116 que no quedan aún de manifiesto en la supervisión del total de PCT con la aplicación de adecuadas técnicas de supervisión y evaluación y modelos matemáticos adecuados para esta finalidad en la supervisión de pacientes de sepsis terapéutica para detectar infecciones secundarias.

En resumen, puede decirse que una disminución de la PCT 1-116 que sea reducida en comparación con el total de PCT o incluso un incremento de la PCT 1-116 al día siguiente predice de manera altamente específica e incluso sensible un incremento del total de PCT como expresión de una infección secundaria.

En vista de los resultados que se han expuesto anteriormente, los inventores contemplan la determinación selectiva de PCT 1-116 según el método de la presente invención como alternativa a la determinación de PCT (del total de la misma) mediante un ensayo que reconoce predominantemente la PCT 3-116. La PCT 1-116 puede ser determinada en todos los casos en los cuales la determinación de PCT (del total de la misma) haya ya demostrado ser útil en el campo de la diagnosis médica.

En particular, el uso de la determinación selectiva de PCT 1-116 para la diagnosis, la diagnosis diferencial, la estratificación según riesgo, la prognosis, la valoración del curso de una enfermedad y el control de medidas terapéuticas está destinado a o se contempla específicamente para pacientes humanos en conexión con infecciones, y en especial con infecciones por bacterias gram-negativas o gram-positivas y por agentes etiológicos fungales y/o parasitarios, cuyas infecciones pueden ocasionar una respuesta inflamatoria localmente confinada o sistémica (como por ejemplo sepsis, sepsis severa y shock séptico), así como en casos de una co-morbilidad subyacente en pacientes de fallo cardíaco, y además a efectos de estratificación según riesgo y prognosis de pacientes que padezcan de enfermedad de las arterias coronarias (CAD).

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias que cita el solicitante se aporta solamente en calidad de información para el lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

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<120> Método para la determinación selectiva de procalcitonina 1-116 a efectos diagnósticos y anticuerpos y kits para ejecutar tal método

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<130> 5143 PCT

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<150> DE 102007009751.6

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<151> 2007-02-28

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<160> 11

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 116

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<212> PRT

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<213> HUMANA

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 114

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<212> PRT

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<213> HUMANA

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 139

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 3

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4

5

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<210> 4

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 4

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6

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<210> 5

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 5

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7

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<210> 6

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 6

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8

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<210> 7

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 7

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9

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<210> 8

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 8

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10

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<210> 9

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 9

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11

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<210> 10

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 10

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12

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<210> 11

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 11

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13

Claims (22)

1. Método inmunodiagnóstico para determinar la procalcitonina y los derivados de procalcitonina de efectos diagnósticos, caracterizado por el hecho de que se determinan selectivamente en una muestra biológica de un pacientes aquellas formas moleculares de la procalcitonina o los péptidos parciales de procalcitonina derivados de las mismas que tienen los aminoácidos alanina y prolina (Ala-Pro AP) en las posiciones 1 y 2 del terminal amino de la procalcitonina 1-116 completa (ID SEC Nº: 1), no siendo la procalcitonina 3-116 que está también presente en la muestra biológica codeterminada y no representando la misma una significativa contribución al valor medido.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la determinación es realizada usando al menos un anticuerpo que requiere para su fijación específica una secuencia de procalcitonina que tenga al menos uno de los aminoácidos de las posiciones 1 y 2 de la secuencia completa de la procalcitonina 1-116 (ID SEC Nº: 1).

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo requiere para su fijación específica la presencia de ambos aminoácidos de las posiciones 1 y 2 de la secuencia completa de la procalcitonina 1-116 (ID SEC Nº: 1).

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo que es al menos uno es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, como por ejemplo un anticuerpo policlonal purificado por cromatografía de afinidad.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que la muestra biológica es un fluido biológico que es seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de sangre y una fracción de sangre, y en particular suero o plasma, y fluido cerebroespinal (CSF).

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que el mismo es ejecutado como parte de la diagnosis de enfermedades que son seleccionadas de entre los miembros del grupo que consta de infecciones locales o sistémicas, inflamaciones, sepsis y enfermedades neurodegenerativas.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que el mismo es ejecutado en la supervisión y el control del tratamiento o en la supervisión de la progresión de una de dichas enfermedades.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que el mismo está diseñado como método inmunocromatográfico para diagnosis en el mismo sitio en que se imparten los cuidados médicos ("point-of-care") o como otro ensayo acelerado.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que el mismo es ejecutado como parte de una determinación multiparamétrica.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que el mismo es ejecutado como parte de una determinación multiparamétrica mediante el uso de tecnología de chips y/o como parte de un método automatizado con una evaluación asistida por ordenador de los resultados medidos.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que en la determinación multiparamétrica se determina al menos un parámetro adicional relevante para la diagnosis de sepsis.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que el parámetro adicional o los parámetros adicionales que es relevante o son relevantes para la diagnosis de sepsis es seleccionado o son seleccionados de entre los miembros del grupo que consta de procalcitonina total, procalcitonina 3-116, proteínas CA 125, CA 19-9, S100B, S100A, LASP-1, fragmentos de citoqueratina solubles, y en particular CYFRA 21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1 solubles (sCY1F), los péptidos inflamina y CHP, las prohormonas pro-ANP, pro-BNP, pro-adrenomedulina, pro-endotelina, pro-vasopresina y sus fragmentos utilizables a efectos diagnósticos, glicina N-aciltrasnferasa (GNAT), carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1), la proteína C-reactiva (CRP) y fragmentos de la misma y de citoquinas.

13. Anticuerpo que se fija selectivamente tan sólo a la procalcitonina 1 a 116 intacta (ID SEC Nº: 1) o a los derivados de procalcitonina que tienen una secuencia de aminoácidos de procalcitonina o una secuencia parcial de aminoácidos de procalcitonina con al menos uno de los aminoácidos 1 y 2, y preferiblemente con ambos aminoácidos 1 y 2, del terminal amino de la secuencia de la procalcitonina 1 a 116 completa (ID SEC Nº: 1).

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, que es obtenible mediante inmunización de un animal con un antígeno en forma de un conjugado con un péptido que es o comprende un péptido según la ID SEC Nº: 4.

15. Anticuerpo según la reivindicación 13 o 14, que es un anticuerpo monoclonal.

16. Kit para ejecutar un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y que, además de los habituales líquidos tampón y de lavado, contiene al menos

- al menos un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 y 15 en una forma fijada a una fase sólida o en forma marcada o marcable selectivamente y

- un competidor o un compuesto patrón en forma de un péptido que comprende al menos los aminoácidos 1 a 6 de la secuencia de aminoácidos de la procalcitonina 1 a 116 completa (ID SEC Nº: 1) y que es fijado selectivamente por el anticuerpo que es al menos uno.

17. Kit según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que el competidor está fijado a una fase sólida o está marcado o es selectivamente marcable.

18. Kit para ejecutar un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que, además de los habituales líquidos tampón y de lavado y opcionalmente de las sustancias para la detección de señales o la generación de señales, contiene al menos

- un primer anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 y 15, y

- un segundo anticuerpo que se fija selectivamente a cualquier deseada secuencia parcial de aminoácidos de la procalcitonina 1 a 116 completa (ID SEC Nº: 1) que no comprende los aminoácidos 1 y 2 del terminal de aminoácidos de la procalcitonina.

19. Kit según la reivindicación 18, en el que uno de los dos anticuerpos está presente en una forma fijada a una fase sólida y el otro anticuerpo está presente en forma marcada o selectivamente marcable.

20. Kit según la reivindicación 18, en el que ambos anticuerpos están presentes en una forma adecuada para ser usada como una dispersión en una fase líquida, estando un primer componente de marcación que es parte de un sistema de marcación basado en la extinción o amplificación de fluorescencia o quimioluminiscencia fijado al primer anticuerpo, y estando el segundo componente de marcación de este sistema de marcación fijado al segundo anticuerpo, con lo cual, tras la fijación de los dos anticuerpos al fragmento peptídico a detectar, es producida una señal mensurable que permite la detección de los resultantes complejos en sándwich en la solución de medición.

21. Kit según la reivindicación 20, en el que el sistema de marcación comprende criptatos o quelatos de tierras raras en combinación con un colorante de fluorescencia o quimioluminiscencia, en particular del tipo cianina.

22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, comprendiendo también el kit, como componente adicional, un compuesto para estabilizar la muestra biológica inhibiendo la acción enzimática de la dipeptidilaminopeptidasa IV (DAP IV; DP IV; CD 26).