TW200819465A - Monoclonal antibody for soluble LOX-1 - Google Patents

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200819465 九、發明說明： 【發明所屬之技彳好領域】 技術領域 本發明關於一種單株抗體及產生該抗體之融合瘤，該 5單株抗體對於氧化低密度脂蛋白（以下稱為「氧化LDL」） 之5：體’即’凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體_1(]^也1141]^ oxidized low density lip〇pr〇tein receptor-1)(以下稱為 「LOX-1」）之一部分開裂而產生的可溶型分子（以下稱為 「可溶型L0X-1」）具有專一性親和性而與其結合。本發明 10更有關於該單株抗體之用途。

L· mT J 背景技術 從不穩定性心絞痛（unstable angina pectoris)、急性心肌 梗塞(acute myocardial infarction)至與該等症狀合併之心因 15性猝死等一連串的病態被統稱為急性冠狀動脈症候群 (ACS)。該等疾病均被認為是供給心臟營養之冠狀動脈發生 動脈硬化所產生之斑塊(plaque)碎裂，血栓附著於上，導致 冠狀動脈發生狹窄及閉塞進而發病。於現代社會中，急性 冠狀動脈症候群只增不減，但因絕大多數均無前兆而忽然 20 發病，無法救治而導致猝死的情況甚多。此外，即使被迅 速送至醫院，為救命而常需緊急心臟手術、緊急經皮穿腔 冠狀動脈血管成形術(PCI)等，其等在醫療經濟上造成無法 計量的負擔。 近年來已逐漸獲知，急性冠狀動脈症候群之發病係起 5 200819465 因於粥狀動脈硬化斑塊之破裂或糜爛續發，形成閉塞性血 栓（非專利文獻1)。雖已顯示血管壁内之致炎反應及氧化應 激(oxidative strees)在斑塊破裂及糜爛上扮演重要的角色， 其中尤以已受氧化變性之LDL(低密度脂蛋白）所引起的蛋 5白_ ’舌性增加及細胞〉周亡（Aptosis)為中心之血管壁機能障 礙為其主要原因。LOX-1被鑑定為該氧化LDL之受體蛋白質 (非專利文獻2)。已知該LOX-1在活體内通常作為膜蛋白質 而表現在細胞表面上，但透過蛋白酶之作用而在膜貫通部 附近之胞外區域被截斷，成為可溶性(soluble)L〇X-1而游離 10於血中（非專利文獻3)。此外，由於在急性冠狀動脈症候群 之急性期（acute phase)中，該可溶性LOX-1之血中濃度明顯 上昇’已有報告指出其作為急性冠狀動脈症候群之一次性 診斷標誌的可能性(非專利文獻4)。 因此，若能於早期階段正確地定量出存於血中之可溶 15型1^^-1之量，即可謂是可將急性冠狀動脈症候群(ACS) 防患於未然。另一方面，雖已有報告係針對抗L〇x_i之抗 體，但均止於一般性記載，現今仍未有報告指出可達成上 述目的並可運用在ELISA等免疫化學測定系統中之具高度 親和性的單株抗體(專利文獻1〜3)。 20 【非專利文獻 1】Medical Tribune，1999, Vol. 32, No.31，p.6 【非專利文獻 2】Nature，1997, Vol.386, ρ·73-77 【非專利文獻 3】Arterioscler· Thromb· Vase. Biol.，2000， 20(3)，ρ·715-720 【非專利文獻 4】Circulation，2005, 112(6)，ρ·812·818 6 200819465 【專利文獻1】曰本特開平9_98787號公報 【專利文獻2】日本特開2〇〇〇_1〇9435號公報 【專利文獻3】曰本特表2002-510710號公報 【韻^明内溶^】 5 發明之揭示 發明欲解決之課題 本發明之目的在於：提供一種可專一性識別人類可溶 型LOX-1並與其結合之單株抗體，其係人類氧化受體之 LOX-1的可溶型分子；特別是提供一種對於人類可溶型 10 [OX-1具有咼度親和性之單株抗體，其與人類可溶型1^〇：^1 之解離常數係於1ΧΚΓ9⑽以下。此外，本發明的另一目的 在於提供該單株抗體之用途，例如含有該抗體且利用對人 類可〉谷型LOX-1之專一親和性及結合性的免疫學試劑（如， 人類可溶型LOX-1之專一性結合試劑或專一性檢測試劑）， 15以及，利用該試劑之人類可溶型L〇x领專一性且高感度 之檢測方法。 再者，本發明之另一目的在於，藉由檢測或定量出存 於血中之人類可溶型LOM，以提供一種可診斷出急性冠 狀動脈症候群（以心肌梗塞為代表）的方法，以及評估急性冠 20狀動脈症候群之治療藥或其候補藥之藥效的方法。 藉由使用前述單株抗體檢測或定量存於血中之人類可 ㈣LOX-卜而可較習知方法更容易、更早期地診斷急性 虺狀動脈症候群及評估針對急性冠狀動脈症候群之受測藥 物的藥效。因此，本發明之目的亦在於提供—種在性冠 7 200819465 狀動脈症候群之診斷及藥效評估上的單株抗體用途。 解決課題之手段 為解決前述課題，本案發明人進行精心研究，發現以 與人類LOX-1胞外區域之結合作為指標而調製之融合瘤所 5產生的單株抗體對於人類可溶型LOX-1，解離常數係於 1x1(T9(M)以下而具有極高之親和性，此外，依據使用該等 單株抗體之夾層式ELISA(sandwichELISA)法，已確認可高 感度地檢驗並測定出血中可溶型L〇X-i之存在，血中可溶 型LOX-1之存在反映出急性冠狀動脈症候群之病態。根據 10上述見解，確信若利用使用到本發明單株抗體之檢測套 組’即可高精度地診斷急性冠狀動脈症候群，且可高精度 地评估對急性冠狀動脈症候群之受測藥的藥效。 本發明係基於前述見解而完成者，包含有下述態樣： ⑴單株抗體 15 (1-1)一種單株抗體、其一部分或該等之標記物，具有 與人類可溶型LOX-1專一性結合之特性。 (1-2)如（1-1)之單株抗體、其一部分或該等之楳記物， 其與人類可溶型L〇x-i之解離常數（Kd)係於ix1〇-9(m)以 下。 20 (1-3)如（1-1)或(1-2)之單株抗體、其一部分或該等之標 記物，其係由包含下述步驟之方法所調製之融合瘤產生者： (1) 使源自原核細胞之人類LOX-1胞外區域的/部分於 非人類動物中免疫； (2) 從該動物回收抗體產生細胞； 8 200819465 (3) 使該抗體產生細胞與骨趟瘤細胞融合； (4) 從上述步驟所獲得之融合細胞中選出產生單株抗體 之融合瘤，該單株抗體係與該人類LQX4胞外區域發生反 應者；及 (5) 再從該選出之融合瘤令選出產生單株抗體之融合 瘤’該單株抗體係與源自真核細胞之人類[οχ—!胞外區域 發生反應。 (1-4)一種單株抗體、其與人類可溶型L〇X-1專一性結 合之一部分或該等之標記物，其係由「小鼠_小鼠融合瘤 10 sLOX-1 1A7」（寄存編號：FERMBP-10645)或「小氣-小鼠 融合瘤sLOX-1 6B11」（寄存編號：FERm BP-10646)產生者。 (1-5)如(1-1)〜(1-4)中任一項之單株抗體、其一部分或該 等之標記物，其中該單株抗體之一部分為與人類可溶型 LOX-1專一性結合之單株抗體的Fab，片段。 15 Oil單株抗體、其一部分^莖隻文標記物的用途 前述單株抗體或其一部分可有效地利用在高感度檢測 存於血液等體液中之人類可溶型L0X-1，而可應用在診斷 急性冠狀動脈症候群上。此外，該等單株抗體或其一部分 可有效利用在評估急性冠狀動脈症候群之治療藥或治療候 20補藥的藥效上。因此，本發明包含下述態樣。 (II-1)如(I-1)〜(1-5)中任一項之單株抗體、其一部分或該 等之標記物，其係使用於診斷急性冠狀動脈症候群者。 (11_2) —種急性冠狀動脈症候群之診斷方法，具有以下 步驟，即··使用如(1-1)〜(1-5)中任一項之單株抗體、其一部 9 200819465 刀或疋忒專之標§己物來測疋人類體液中之可溶性LOXd。 (11_3)如(1_；!)〜(1_5)中任—項之單株抗體、其一部分或该 專己物，其係使用於评估急性冠狀動脈症候群之治濟 藥或治療候補藥之藥效者。 5 (11-4) 一種急性冠狀動脈症候群之治療藥或治療候禎 藥的藥效评估方法，係以經投藥急性冠狀動脈症候群之治 療藥或治療候補藥之人類體液為對象，並使用如(Ι_ιΗρ5) 中任一項之單株抗體、其一部分或是該等之標記物來測定 該體液中之可溶性LOX-1者。 10 瘤及奚調芻方法 (ΙΙΙ-1) 一種融合瘤，可產生如（Μ)〜(J_5)中任一項之單 株抗體。 (III-2)如（III-1)之融合瘤，其係以人類1/))^1胞外區域 之可溶性分液與源自CHO細胞之可溶型L0X-1的競爭結合 15 作為篩檢指標而調製者。 (III-3)如（II-1)或(II-2)之融合瘤，其係「小鼠-小鼠融合 瘤 sLOX-1 1A7 (Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 1A7)」（寄 存編號：FERM BP-10645)或「小鼠-小鼠融合瘤sLOX-1 6B11 (Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 6B11) j (寄存編號： 20 FERM BP-10646)。 (m-4)如（m-i)之融合瘤之調製方法，包含下述步驟： (1) 使源自原核細胞之人類LOX-1胞外區域的一部分於 非人類動物中免疫； (2) 從該非人類動物回收抗體產生細胞； 10 200819465 (3) 使該抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合； (4) 從上述步驟所獲得之融合細胞中選出產生單株抗體 之融合瘤，該單株抗體係與該外區域發生反 應者；及 5 (5)再從該選出之融合瘤中選出產生單株抗體之融合 瘤，該單株抗體係與源自真核細胞之人類L〇x_i胞外區域 發生反應者。 (III-5)—種融合瘤，其係以如（m_4)之方法調製者。 (III-6)如（III-1)〜(III-3)中任一項之融合瘤，其係以如 10 (III-4)之方法調製者。 (IV)人類可溶型LOX-1檢測用試劍套組及其用途 (IV-1) —種人類可溶型L〇X-1;j^測用試劑套組，包含如 (Μ)〜(1-5)中任一項之單株抗體、其一部分或是該等之標記 物以作為對人類可溶型LOX-1之專一性結合試劑或人類 15可溶型LOX-1之專一性檢測試劑。 (IV-2)如（IV-1)之試劑套組，其係急性冠狀動脈症候群 診斷套組。 此外，換言之，該試劑套組亦可為「一種急性冠狀動 脈症候群邊斷套組，含有（1-1)〜(1-5)中任一項之單株抗體、 20其一部份或該等之標記物」。

(V、l)一種人類可溶型LOXq之專一性檢測方法，具有 以下步驟，:將如㈣〜㈣中任一項之單株抗體、其一 邛刀或疋該等之標記物作為針對人類可溶型匕以^」之專一 11 200819465 性結合試劑或專一性檢測試劑來使用。 由於血液中之可溶型LOX-1量係與急性冠狀動脈症候 群之病態呈正相關地增加，故而可利用前述檢測方法，針 對受測者診斷出有無急性冠狀動脈症候群之病態及其程 5 度。 發明之效果 本發明之單株抗體可專一性地識別人類可溶型LOX-1 並以高度親和性與其結合，因此，在該人類可溶型LOX-1 之專一性檢測及專一性結合上甚為有用。依照本發明之單 10株抗體、其一部分或是該等之標記物（或含有該等中任一者 之人類可溶型LOX-1檢測試劑）以及利用其之人類可溶型 LOX-1的專一性檢測法，可採免疫化學方式調查活體組織 或活體試料中之可溶型LOX4的表現分布及存在，進而可 更詳細地解析可溶型LOX—i之生理作用及意義。此外，依 15據本發明之單株抗體、其一部分或是該等之標記物（或是含 有該等中任一者之人類可溶型LOX.1檢測試劑）以及利用其 之人類可溶型LOX，專一性檢測法，可採免疫化學或免 疫組織學上之方法_出與LQXq之表現(表現完進 、表現 不全/減少）相_產生的各種疾病或病態。該等疾病或病態 2〇可例示如：伴隨LOW之表現宄進（或起因於表現完進）而來 之^病或病態’舉例來說’如動脈硬化及更進一步發展之 病態，例如心血管疾病（缺血性心臟病、心、室不全），即，急 性冠狀動脈症候群。 特別是，如實施例所示，若依組合使用2種本發明之單 12 200819465 株抗體的2側夾層ELISA法，可以人類血清imL約〇.lng/Ml 之定量界限來測定人類可溶型LOX-1之血中濃度。此一測 定感度相當於習知測定方法之約1〇倍。 L實施方式;J 5本發明之最佳實施形態 I·單株抗體及毛製造方法 茲闡明本發明所使用之各種用語的意義如下，以更詳 盡地說明本發明之單株抗體及其製造方法。 於本發明中，「LOX-1」為源自哺乳動物之氧化 10 LDL(Oxdized low density lipoprotein)的受體。於此，哺乳 動物可列舉如人類、牛、山羊、兔、小鼠、大鼠、倉鼠及 天竺鼠等，但以如已知報導所記載之人類、牛、兔、大鼠 或小亂的氧化 LDL 文體（Oxdized low density lipoprotein receptor)為宜（Nature，Vol.386, ρ·73-77, 1997;脂質生化學研 15 究，Vol· 39, ρ·83-84，1997;日本特開平9-98787號公報；

GenBank Accession No.BAA81912 ; Biochem. J·，Vol.330 (Pt.3)，ρ·1417·1422, 1998)。具體而言，可列舉如具有序列 編號1所載胺基酸序列之人類LOX-1。 該LOX-1為一種附加有糖鏈且約50kDa之II型膜蛋白 2〇 質，自N端起算，係由胞内區域、膜貫通區域及胞外區域所 構成，且該胞外區域係由頸區(neck domain)與凝集素樣區 等2個區域所構成（共4個區域）。其中，凝集素樣區係作為氧 化LDL之識別部位發揮作用（澤村達也，臨床檢查，v〇l 45, Νο·3, ρ·297)。就人類LOX-1(序列編號1)而言，具體來說， 13 200819465 其胺基酸1-36領域相當於胞内區域，胺基酸37-57領域相當 於膜貫通區域，胺基酸58-273領域則相當於胞外區域。 於本發明中，「LOX-1胞外區域」係指：前述LOX-1之 整體結構中，「胞外區域」之全部或一部分。具體來說，於 5 係膜貫通蛋白質之LOX-1之中，意指存在於細胞膜外界側 麵 ^ 之部分結構(部分領域）之全部或一部分。換言之，「LOX-1 ： 胞外區域」係指：除了被置入膜内之膜貫通領域及接續該 領域而存在於細胞質内之胞内區域以外的全部或一部分領 域。就人類LOX-1(序列編號1)而言，如前述，其胺基酸序 10 列中之58-273領域相當於全部的「LOX-1胞外區域」。 「人類LOX-1胞外區域之一部分」係指「LOX-1胞外區 域」的一部分，除了人類LOX-1之胺基酸序列（序列編號1) 中之85-273領域（序列編號2)以外，可列舉如「可溶型 LOX-1」專顯不出可溶性之部分領域。 15 於本發明中，「可溶型LOX-1」係指：存於膜中之部分 LOX-l(—般為「胞外區域」之一部分)被截斷(解離）而被放 i 出（分泌）至血中的LOX-1之一部分。 更具體來說，人類可溶型LOX-1係指由人類LOX-1之一 • 部分胞外區域所構成之可溶型受體。相當於人類LOX-1部 20分胞外區域之可溶型受體分子之例可例示如：由人類 mi • L0X-1之胺基酸序列（序列編號1)的88-273領域(序列編號3) 所構成之分子，或’該胺基酸序列（序列編號1)之92-273領 域(序列編號4)所構成之分子。此外，相當於人 分胞外區域之分子中，包含位在人類L〇x_i胞外區域N端之 200819465 胜肽。具體而言，該胜肽可例示如··相當於可溶型分子之 胺基酸序列（序列編號3)1-10領域的胜肽(序列編號5);及， 相當於可溶型分子之胺基酸序列（序列編號4)1_1〇領域的胜 肽（序列編號6)。另，該等胜肽各自相當於人類L〇X-1之胺 5基酸序列(序列編號1)的88-97領域及92-101領域。 本發明標的之「單株抗體」係指與前述人類可溶型 LOX-1作專一性結合之單株抗體。人類血液中存有 之一部分開裂而產生之具有序列編號3或4所示胺基酸序列 的可溶型LOX-1，由於其量隨著急性冠狀動脈症候群之進 1〇展而增加，該可溶型LOX-1被認為可作為反映急性冠狀動 脈症候群（具體來說即是動脈硬化及起因於動脈硬化而發 病之缺血性心臟病等）之病態的診斷指標（林田氏等，

Circulation、2005，112(6)、ρ·812-818)。 因此，本發明標的之「單株抗體」宜為一種對具有序 15列編號3或4所示胺基酸序列之人類可溶型LOX-1具有高親 和性之抗體。 此種對人類可溶型LOX-1具有專一性結合性之本發明 「單株抗體」，可使用人類LOX-1胞外區域之一部分（包含天 然物、基因重組物、合成物及細胞培養上清液)作為免疫原 20而調製出。具體而言，首先以人類LOX-1胞外區域之一部 分作為免疫原，再依需要而與佛氏佐劑一起注射至非人類 哺乳動物之皮下内、肌肉内、靜脈内、腳掌内或腹腔内1至 數次，藉以施行免疫致敏，該非人類哺乳動物宜為小鼠、 大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、貓、狗、豬、山羊、雉雞、驢、 15 200819465 馬或牛（包含人類抗體產生基因轉殖小鼠等，係製作來產生 源自其他動物之抗體的基因轉殖動物），更宜為小鼠、大 鼠、倉鼠、天竺鼠或兔。通常，從初回免疫起每約卜21曰 進行1~4次免疫，而可於最終免疫起約卜⑴日後，從業經免 疫致敏之該非人類哺乳動物取得抗體產生細胞。施行免疫 之次數及時間的間距可依照所使用之免疫原性質等而加以 適當變更。 f

此外，舉例而έ，標準物質、免疫原（半抗原（haptene)) 及被用於篩檢之「人類LOX-1胞外區域之一部分」可例示 10如下述者。此外，上述任一者均僅須為含有高濃度人類 LOX-1胞外區域之一部份者即可，亦可為分液。 (A)使人類LOX-1表現於細胞表面之細胞，或以人工方 式建立使其表現在細胞表面之細胞株；或，使用基因重組 技術’製作使人類LOX-1表現於細胞表面之基因重組細 15胞’再加以培養而獲得之培養上清液；或是從該培養上清 液純化而來之人類可溶型LOX-1 ; (B)利用基因重組技術，使人類LOX-1胞外區域之部分 領域作為蛋白質表現，製作出基因重組細胞並加以培養而 取得之培養上清液；或是從該培養上清液純化而來之人米員 20 胞外區域之部分領域；或 (C)化學合成之人類LOX-1胞外區域的N端領域。 具體而言，（A)之人類可溶型LOX-1可列舉如被分必至 細胞培養液中之人類可溶型LOH。這是因為被分泌至、名 胞培養液中之可溶型LOX-1最接近天然之人類可、容型 16 200819465 LOX-l 〇該人類可溶型LOX-1可如實施例1(2)所記載之方法 般，採基因工程方式調製出（參照日本特開2002-17353號公 報等）。 此外，（B)之人類LOX-1胞外區域的部分領域可列舉如 5 人類LOX-1胞外區域（序列編號1之胺基酸序列58-273領域) 中之一部分(如序列編號2)。該部分領域可如實施例1(1)所 記載之方法般，採基因工程方式調製出。 再者，（C)之人類LOX-1胞外區域的N端領域可列舉如 具有序列編號5或6之胺基酸序列的胜肽。該胜肽在用作半 10 抗原時，需使其與牛血清白蛋白（BSA)等高分子共軛。 本發明所使用之免疫原宜為(B)，即源自大腸菌等原核 細胞之人類LOX-1胞外區域的部分領域。 可依照凱拉氏（Kohler)及米爾斯汀氏（Milstein)之方法 (Nature，1975, Vol.256, ρ·495-497)以及以其為之方法來調 15 製分泌單株抗體之融合瘤。即，如前所述，使從業經免疫 致敏之非人類哺乳動物取得的脾臟、淋巴結、骨髓或扁桃 腺等（宜為脾臟所含之抗體產生細胞)與較佳為源自小鼠、大 鼠、天竺鼠、倉鼠、兔或人類等哺乳動物（更宜源自小鼠、 大鼠或人類）之無自體抗體產生能的骨髓瘤細胞作細胞融 20 合’即可調至出融合瘤。 舉例來說，用於細胞融合之骨髓瘤細胞可採用：源自 小鼠之骨髓瘤 P3/X63-AG8.653(653)、P3/NSI/l-Ag4-l (NS-1)、P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)、SP2/0-Agl4(Sp2/O、Sp2)、 PAI、F0或BW5147 ;源自大鼠之骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3 ; 17 200819465 或疋源自人類之骨趙瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、 UC729-6、CEM-AGR、D1R11 或 CEM-T15。 篩檢產生單株抗體之融合瘤選殖株時，舉例來說，首 先將融合瘤置於微置滴定盤(microtiter plate)中培養，再以 5 RIA4ELISA等免疫測定法，測定可見增殖之井(weli)中的 培養上清液對於免疫原（前述(A)〜(C)中之任一者。較宜為採 (B)法調製出之源自原核細胞之人類lqx_i胞外區域的一部 为）之反應性，该免疫原係已使用在前述非人類動物之免疫 致敏上，再選擇可產生對於該免疫原顯示出專一親和性之 10單株抗體的選殖株。於該方法中，通常係採用所謂的非競 爭法ELISA，即，使免疫原固相化，再以經酶標記之第二 抗體檢測出與其結合之培養上清液中的抗體。然而，該非 競爭法亦會檢測出非專一性之結合，而難以僅檢測出作專 一性結合之抗體。再者，一般來說，使蛋白質於大腸菌等 15原核生物之細胞中表現時，其立體結構與天然者不同。更 何況’於大腸菌中表現之人類L0X-1胞外區域的一部分 中，多數將會成為沉澱物。因此，免疫原雖可使用該沉澱 物與上清液之懸濁液，此種狀況下，可想見所產生之抗體 將會包含許多會與變性蛋白質（與天然人類可溶型L〇X-1相 20 異之沉澱等）結合者。 因此’本案發明人階段性地進行下述（1)及(2)之筛檢， 結果選出了可產生與天然型人類可溶型LOX-丨具有極高親 和性進而與其結合之單株抗體的融合瘤。 (1)使融合瘤之培養上清液中的抗體與業經固相化之第 18 200819465 二抗體結合後，先於其中添加源自原核細胞之人類LOX-1 胞外區域的一部分，再使其與經生物素標記之人類可溶性 LOX-1競爭反應並選出融合瘤’該融合瘤可產生與源自原 核細胞之人類LOX-1部分胞外區域反應的抗體。 5 (2)使用前述選出之融合瘤的培養上清液’此其中所含 之抗體與經固相化之第二抗體結合，再與業經人類lox—1 部分胞外區域（源自真核細胞）及生物素標記的人類可溶性 LOX-1作競爭反應，進而選出融合瘤，該融合瘤係產生與 源自真核細胞之人類LOX-1部分胞外區域反應之抗體。 10 使融合瘤於活體外培養，或是置於小鼠、大鼠、天竺 鼠、倉鼠或兔等非人類哺乳動物（宜為小鼠或大鼠，更宜為 小鼠）之腹水中等進行培養，再由所得培養上清液或哺乳動 物腹水進行離析，及可從融合瘤製造單株抗體。於活體外 培養時，可配合所培養細胞種之特性、試驗研究目的及培 15 養方法等各種條件使融合瘤增殖、維持及保存，並可對培 養上清液使用用來產生單株抗體之已知營養培養基或從已 知基本培養基衍生調製出的營養培養基。 基本培養基可列舉如Ham，F12培養基、MCDB153培養 基或低鈣MEM培養基等低鈣培養基以及MCDB104培養 2〇基、MEM培養基、D-MEM培養基、RPMI1640培養基、 ASF104培養基或RD培養基等高鈣培養基等，該等基本培養 基可依目的而含有如血清、激素、細胞激素㈣⑽丨⑽及/ 或各種無機或有機物質等。可將前述培養上清液或腹水供 予飽和硫酸銨、離子交換層析法(DEAE4DE52等）、抗免疫 19 200819465 球蛋白管柱或蛋白A管柱(Protein A column)等親和管柱層 析法’以進行單株抗體之離析及純化。 本發明之單株抗體可為具有IgG(IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4)、IgM、Ig A(Ig A1、Ig A2)、IgD 或 IgE 中任一同型（iS0type) 5之單株抗體。較宜為IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，更宜 為IgGl或IgG2，且以IgGl尤佳。 於本發明中，「單株抗體之一部分」係指：為前述本發 明單株抗體之一部份，且與該單株抗體相同地，對人類可 溶型LOX-1具有專一結合性的領域（以下，亦將其稱為「抗 10 體片段」）。 具體來說，此種抗體片段可列舉如前述對人類可溶型 LOX-1具有專一結合性之胜肽，且該胜肽包含Fab (抗原結 合片段，fragment of antigen binding)、F(ab，)2、Fab，、單鏈 抗體（單鏈Fv;以下，記為「scFv」）、二聚化物V領域片段（以 15 下，記為Diabody)、二硫鍵穩定性抗體(disulfide stabilized Fv ;以下記為「dsFv」）、dAd(單域抗體，single domain antibody)或 CDR(Expert Opinion on Therapeutic Patent，第 6 卷，第5號，第441〜456頁，1996年）。

Fab係一種由大約一半Η鏈N端與L鏈整體所構成，分子 20 量約5萬且具有抗原結合活性之抗體片段。使係於igG之樞 紐領域(hinge region)交聯2條Η鏈之2個雙硫鍵(S-S鍵結）的 上方胜肽部分以木瓜蛋白酶分解，即可調製出該Fab ;亦可 使前述之本發明單株抗體經木瓜蛋白酶處理而獲得本發明 所使用之Fab。此外，將編碼前述本發明單株抗體之Fab的 20 200819465 DNA插入動物細胞用表現載體，再將該載體導入動物細胞 中使其表現’亦可製得Fab。 F(ab，)2係一種2個Fab，領域在樞紐部分結合而構成之抗 體片段，其分子量約10萬，且具有抗原結合活性。使IgG之 5 樞紐領域的2個S-S鍵結的下方部分以胃蛋白酶分解，即可 調製出該F(ab，)2 ;亦可將前述本發明之單株抗體以胃蛋白 酶處理，而獲得本發明所使用之F(ab’)2。此外，亦可將編 碼該單株抗體之F(ab’)2的DNA插入動物細胞用表現載體， 再將該載體導入動物細胞中使其表現而製得F(ab’)2。 10 Fab’係一種已截斷前述F(ab’)2之樞紐間S-S鍵結之抗體 片段，分子量約5萬且具有抗原結合活性。可使前述本發明 單株抗體之F(ab’)2以還原劑二硫蘇糖醇（dithiothreitol)處 理，即可製得本發明所使用之Fab’。此外，亦可將編碼該 單株抗體之Fab’的DNA插入動物細胞用表現載體，再將該 15 載體導入動物細胞中使其表現而製得Fab，。 scFv係一種使用適當之胜肽連結物(peptide iinker，以 下記為P)而將1條VH與1條VL連結而成之VH_p_VL或 VL-P-VH多胜肽，且係具有抗原結合活性之抗體片段。本 發明所使用之scFv所含VH及VL僅需為前述本發明單株抗 20體所有者即可。可從生產本發明單株抗體之融合瘤取得編 碼VH及VL之cDNA並構築scFv表現載體，再導入大腸菌、 酵母或動物細胞中使其表現，從而製得本發明所使用之 scFv ° 各將VH及VL中之1個胺基酸殘基取代為半耽胺酸殘基 21 200819465 (cysteine residue)，再使如此形成之多胜肽藉由s s鍵結而結 合，所得者即稱是dsFv。可依照Reiter氏等人所教示之方法 (Protein Engineering、7、697 (1994))，依照抗體之立體結 構預測來選出取代為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基。本發明 5使用之dsFv所含VH或VL僅需為本發明之單株抗體所有者 即T可從生產本發明單株抗體之融合瘤取得編碼^幵及乂匕 之cDNA，插入適當載體中以構築％以表現載體，再將該表 現載體導入大腸菌、酵母或動物細胞中使其表現，從而製 得本發明所使用之本發明使用之dsFv。 10 Diabody係一種抗原結合專一性相同或不同的scFv形 成一聚物之抗體片段，具有對於相同抗原之2價抗原結合活 性，或對於不同抗原之專一性抗原結合活性。舉例來說， 取得編碼本發明單株抗體之VH及VL的CDNA，並構築用以 編碼scFv(該scFv具有3〜10殘基之胜肽連結物）之DNA，將該 15 DNA插入動物細胞用表現載體後，將該表現載體導入動物 細胞中使Diabody表現，即可製得對本發明單株抗體呈專一 性反應之2價Diabody。 含CDR之胜肽係含有VH或VL之CDR的至少丨領域以上 而構成者。可直接或透過適當之胜肽連結物而結合多個 20 CDR。可於取得編碼本發明單株抗體之VH及VL的cDNA 後，構築編碼CDR之DNA，再將該DNA插入動物細胞用表 現載體，再使該載體導入動物細胞中使其表現，從而製得 本發明所使用之含CDR之胜肽。此外，亦可藉由Fm〇c法（苐 基甲氧羰基法)及tBoc法（第三丁氧羰基法）等化學合成方法 22 200819465 製造含CDR之胜肽。 較佳地，「單株抗體之一部分」可列舉如以胃蛋白酶處 理本發明之單株抗體(IgG)而獲得的F(ab，)2。 解離常數(Kd)係用作顯示單株抗體或其一部分對於抗 5原之親和性的指標，而依照各種方法進行解析。例如，使 用Scatchard法（係使用業經各種標示劑作標記之抗原）、市隹 測定套組之Biacore系統（Amersh疆Phamiacia社製）或類似 套組，再依照該套組所附使用說明書及實驗操作方法，即 可容易的進行解析。採用該等方法求得iKd值係以M(莫耳) 1〇單位表示。解離常數(Kd值）越小，表示所試驗之單株抗體 具有越強的親和性。 本發明標的之單株抗體或其一部分係包含與人類可溶 型LOX-1專一性結合之人類單株抗體或其一部份，該人類 單株抗體或其一部份與人類可溶fLOX—i之解離常數氓⑴ 15為lxl〇9(M)以下，較佳為5x1〇_1()(M)以下，而更宜為 2xl01()(M)以下。 本毛月“的之單株抗體及其一部分的解離常數係於 1Xl〇9(M)以下’對人類可溶型LOX-1之親和性非常高，因 而可以習知技術所無法達成之高感度來檢測及定量人類可 20，谷型LOX-1。特別是，健康正常人血清中之可溶型匕⑽“ 浪度極低，而無法以習知測定方法正確測定，依據本發明 之單株抗體，將可克服此一問題。 另一方面，雖已有報告係利用類似免疫原的單株抗體 (WO01/64862)，位其係以治療為目的之人類型抗體，且所 23 200819465 揭任一單株抗體之解離常數均顯示出較1χ1〇Λμ)更大之 值以此種程度之解離常數來測定健康正常人或是處於慢 性期而血清中之可溶型LOX七農度甚低的受測者時，從感 度的觀點來看，無法達成用作診斷標記的目的（參照實施例 5 5(9))。 、、、 本發明標的之單株抗體中，較佳者可列舉如實施例所 示者，即，融合瘤6B11或1A7所產生之單株抗體。 茲將該等融合瘤6B11及1A7所產生之各單株抗體的 「解離常數(Kd)」顯示如下。 10 表1 單維體 Kd (X 1 〇-10M) 1 A7 5. 1 6 B 1 1 3.4 該等融合瘤6B11及1A7各自於2006年7月26日以「小鼠 -小鼠融合瘤 sLOX-1 1A7(Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 1A7)」及「小鼠-小鼠融合瘤 sLOX-1 6Bll(Mouse-Mouse 15 hybridoma sLOX-1 6B11)」國際寄存於獨立行政法人產業技 術綜合研究所專利生物寄存中心，住址為日本國茨城縣筑 波市東1丁目1番1中央第6。各融合瘤之領收編號及寄存編 號係如下所示。 表2 _融合瘤之標示 — 領收編號__寄存編號 — 「Mouse^Axise hybridoma sLOX-1 1A7J FERM ABF-10645 PERM BP-10645 Γ Mouse-Mouse hybridoma sLOXH 6B11J FiRM ABP-10646 FERM BP-10646 II.可溶剞LOX-1檢測用試劑套組及使用其之可溶型LOX-1 24 20 200819465 的專一性檢測方法 前述本發明之單株抗體及其一部分(抗體片段)與人類 可溶型LOX-1具有高親和性而與其專一性地結合。 因此，依照本發明之單株抗體或其抗體片段，可利用 5 免疫測疋法而選擇性且專 ' —性地檢測人類可溶型LOX-1。 故而，本發明之單株抗體或其抗體片段可調查人類可溶型 LOX-1之組織局部性(tissue i〇caiizati〇n)及其表現程度，亦 可有效地用作免疫學試劑（如免疫電泳用試劑或免疫測定 用試劑等）以檢測或定量受測試料中可能存在之人類可溶 10型LOX-1。亦即，前述本發明之單株抗體或其抗體片段在 利用免疫電泳法或免疫測定法檢驗及測定人類可溶型 LOX-1時，可有效用作針對人類可溶sL〇X l之專一性結合 试劑或專一性檢測試劑（免疫學試劑）。於此，免疫測定法之 例示可列舉如直接或間接競爭性分析(c〇mpetitive assay)或 15非競爭測定(如夾層法等）。此外，免疫電泳法或免疫測定法 包a西方墨點法、螢光抗體法、免疫酵素抗體法卬lisa)、 放射性物質標記免疫抗體法(RIA法）、免疫組織染色法及免 疫細胞染色法等免疫組織化學染色法(ABC法、csa法等） 以及免疫沉澱法等（單株抗體實驗手冊，講談社科學 2〇 (1987)，、’生化學貫驗講座5，免疫生化學研究會（東京化學 同人（1986)等）。 本發明提供-種利用免疫電泳法或免疫測定法而用以 專一性地檢驗或測定出人類可溶型LOX-i之試劑套組。此 毛月係種利用抗原-抗體反應而用以檢驗測定出受測 25 200819465 試料中之人類可溶型LOX-1之存在或其量的試劑套組，其 特徵在於：含有前述本發明單株抗體或其抗體片段作為針 對人類可溶型咖·1之專-性結合試劑成分或專-性檢測 試劑成分。此外，亦可使用對人類可溶型LOx—丨具有專一 5性結合之其一部分(抗體片段）來取代本發明之單株抗體或 其抗體片段。 本發明之單株抗體或其一部分(抗體片段）可直接使用 或以結合在固態支持物的形態用作免疫測定用之試劑。於 此，用以與該等單株抗體或抗體片段結之固態支持物可任 10意使用業界周知之物，可列舉如玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、 聚乙烯、葡聚糖、耐倫、澱粉酶、天然/改質纖維素、聚丙 烯醯胺、洋菜及磁鐵礦等。此外，該等固態支持物包含反 應盤之井、試管、聚苯乙烯珠、磁性珠、硝基纖維素條 (nitrocellulose strip)、膜及乳膠粒子等。該等固態支持物與 15單株抗體或抗體片段之結合方法亦為習知，本發明亦可鹿 用該等習知方法。 此外，本發明之單株抗體及其抗體片段可直接用作免 疫電泳用及免疫測定用等免疫學試劑，亦可經任意標示劑 標記而以標記物形態使用。本發明可使用之標示劑可廣泛 20地列舉如：用來作為單株抗體結合標示劑之業界習知酵素 [如鹼性磷酸酶(ALP)、過氧化酶(；HRP)等]、放射性同位素(如 1251、3H、14c等）、螢光化合物[如螢光素異硫代氰酸酉旨 (FITC)、四甲基若丹明異硫代氰酸醋（RITC)等]、化學發光 性化合物及生物發光性化合物等。此外，將該等用作標示 26 200819465 劑之免疫測定法被稱為酵素免疫分析法(ΕΙΑ)、酵素免疫計 量分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、螢光免疫分析 法以及發光免疫分析法等。 較佳地’宜為將酵素用作標示劑之免疫測定法(EIA、 5 ELISA);具體來說，可列舉如：酵素使用鹼性磷酸酶(ALp)、 檢測用發色基質使用化學發光基質APS-5(phosphoric acid mono-[(4-chloro-phenylsulfanyl)-(l〇.methyl-10H-acridin-9- ylidene)-methyl] ester disodium salt(Lumigen APS-5, Oriental Yeast Co·，Ltd··))之ELISA法；及，酵素使用過氧化 10酶（HRP)、檢測用發色基質使用比色基質四甲基聯苯胺 (tetramethylbenzidine)iELISA&。 本發明所提供之較佳人類可溶型L Ο X -1檢測用試劑套 組係夾層ELISA用之試劑套組，其使用2種與人類可溶型 LOX-1專一性結合之單株抗體。該試劑套組至少含有：固 15 定化於固態支持物而成之本發明單株抗體或其片段；以前 述標示劑標記而成之本發明單株抗體或其片段；及，與該 標示劑反應而發色、發螢光或發光之基質。此時，較佳地， 標示劑可列舉如前述酵素，特別是鹼性磷酸酶(ALP);此 外，基質較佳可列舉如APS-5。依據此種夾層ELISA，可以 2〇 更南感度檢測可溶型LOX-1。 此外’該等標示劑之標記方法及間接標示化之修飾方 法以及該等之檢測方法等，可依照本身習知之方法進行 (「單株抗體」，岩崎辰夫等著，講談社科學，1984年；「酵 素免疫測定法」第2版，川榮治等著，醫學書院，1982年 27 200819465 等）。 本發明之试劑套組除前述本發明單株抗體、其抗體片 段或該等標記物外，更可依照免疫電泳法或免疫測定法等 用途而進一步含有適當之反應液、稀釋液、洗淨液、人類 5 可溶型LOX-1之標準液、轉錄溶液、泳動溶液、反應停止 液、抗體檢測試劑、標記活性測定試劑、染色液、反應蓝、 硝基纖維素濾紙及聚丙烯醯胺凝膠等。於此，抗體檢測試 劑可列舉如可與本發明單株抗體結合之二次抗體，例如經 放射性物質及酵素等標記之抗IgG抗體及蛋白A等。 10 利用含有本發明之單株抗體、抗體片段或該等之標記 物作為結合或檢測試劑的前述試劑套組，並依照一般之免 疫電泳法及免疫測定法，即可簡便' 專一性且高感度地檢 驗及測定人類可溶型LOX-1。 因此，本發明更提供一種人類可溶型LOX-1之專一性 15測疋方法，其特徵在於：使用本發明之單株抗體、抗體片 段或《亥寺之；^ έ己物作為針對人類可溶型L〇x_ 1之專一性結 合試劑或專一性檢測試劑。 本發明之測定方法必須使用前述本發明單株抗體、抗 體片叙或σ亥等之標記物作為針對人類可溶型L Ο X -1之專/ 2〇性j合試劑或專一性檢測試劑，在此前提下，其他基本操 =二未特別爻限，可廣泛地採用一般免疫電泳法或免疫 / 中之恢用方法。因此，利用本發明之單株抗體、抗 體片段或是該等標記物之抗原·抗體反應以及所產生之抗 ’、體、、、"合物與抗體檢測試劑之反應條件亦無特別受 28 200819465 限，可採用—般免疫反應之條件。通常可列舉如下述方法， 即.於45C以下（宜為約4〜4〇。〇，更宜為μ〜贼程度）之溫 度條件下，以pH約5〜9程度，放置或培養約〇5~4〇小時（宜 1〜20小時)程度。 5 本發明所提供之較佳人類可溶型L Ο X -1測定法係一種 夾層ELISA法，其使用2種與人類可溶.L〇X-1專一性結合 之單株抗體(2側夾層ELISA(2 side sandwich)法）。該方法係 使與人類可溶型LOX-1專一性結合之本發明單株抗體或其 抗體片段固定化而得之固態支持物（固相化抗體）與受測試 10料及人類可溶型LOX-1之標準液(抗原）結合，接著再與業經 標示劑標記之本發明單株抗體或其抗體片段(標記抗體）反 應’而形成固相化抗體-抗原（人類可溶型LOX-1)-標記抗體 之夾層型複合物後，以該標示劑與基質之反應所導致之發 光來檢測或定量如此形成之複合物。 15 本發明之單株抗體、其抗體片段及該等之標記物係專 一性地識別人類可溶型LOX-1並以高親和性與其結合，因 此，利用含該抗體之前述試劑套組的人類可溶型LOX-1測 定法除了可利用在專一性檢測及定量受測試料（如血液及 尿液等）及各種組織中之人類可溶型LOX-1、測定人類可溶 20 型LOX-1表現組織之分布以及利用親和性之人類可溶型 LOX-1的純化上之外，在伴隨人類LOX·1之表現增加所導致 (或起因於人類LOX-1表現之增加）的各種疾病之免疫化學 及免疫組織學的診斷上甚有用。 如習知技術欄所述’已知L〇X-1係作為氧化LDL受體 29 200819465 發揮作用，而膽固醇酯之細胞内蓄積在動脈硬化病變中之 斑塊形成上扮演了主要角色，且該膽固醇酯之細胞内蓄積 係透過集聚於血管内膜之巨噬細胞中的氧化受體 (LOX-1)而攝入者。此外，實際上，動脈硬化斑塊之内膜平 5滑肌細胞（已進展為包覆動脈硬化初期病變之血管内皮細 胞）與巨噬細胞顯示LOX-1之表現增強。如前述，透過ldl 受體(LOX-1)攝入氧化ldl不僅與血管内皮細胞之機能障 礙有關’而亦與血管平滑肌細胞之機能障礙以及巨噬細胞 之泡沫細胞化相關，與粥狀動脈硬化之進展關聯甚深。此 1〇外，已顯示LOX-1之一部分在胞外區域之膜附近部位被截 斷，於血液中係以可溶型分子（可溶型L〇X-1)存在。如前 述’可溶型LOX-1之血中濃度反映出活體内（in vivo)細胞中 之LOX-1表現程度，因此而作為反映急性冠狀動脈症候群 病態之診斷標誌受到矚目，認為藉由測定可溶型LOX_u^ 15 可早期診斷急性冠狀動脈症候群(Medical Tribune，1999,

Vol.32, Νο·31，p6 ; Circulation，2005, 112(6)，ρ·812-818) 〇 因此’依照上述人類可溶型LOX-1測定法（其係利用含 有鈾述本發明单株抗體、其抗體片段或該等之標記物的試 劑套組），可藉由測定受測者之血液中人類可溶型LOX-1， 20而就該受測者診斷出急性冠狀動脈症候群之風險程度。特 別是’在診斷急性冠狀動脈症候群之再發風險程度上亦有 效(WO 2007/072896)。 此外，如前所述，人類可溶型LOX-ι之血中濃度可成 為反映出急性冠狀動脈症候群之病態的生物標誌 30 200819465 (Bumiarker)，以该濃度作為指標，可評估受測藥對於 冠狀動脈症候群之藥效。具體來說，依據利用試劑套^人 有本發明之單株抗體、其抗體片段或是該等之標記物)之I 類可:型LQX-1測定法，舉例而言，在急性冠狀動脈症候 • 5 #之臨床試驗時’可藉由測定該受測者血液中之人類可溶 3L OX 1而谷易地判斷出試驗藥對於受測者之藥效。再 : I，依據前述人類可溶型贿」測定法，可藉由測定該受 〆 ’則者血液中之人類可溶型[〇以，而容易地判斷受測藥對 # 於急性冠狀動脈症候群患者之治療效果。 10 實施例 茲列舉實施例於下俾更詳盡地說明本發明，但本發明 並不侷限於該等實施例。 實施例1 [調製標準物質] 如下所示般調製⑴人類LOX-1胞外區域及⑵源自 I5 CHO細胞之可浴型LOX-1 ’以作為標準物質。 (l)LOX-l胞外區域蛋白 (

將編碼人類LOX-1胞外區域之一部分的序列（序列編號 2)組入pQE載體(QIAGEN社)製作質體(pQE-hLOX-l)，再將 ‘ 其導入至大腸菌（高速轉型大腸菌DH5a、NIPPON GENE 20 CO·，LTD.製）。再以含有安比西林鈉（ampicillin sodium)lOOpg/mL 及硫酸卡那黴素（kanamycin sulfate) 25pg/mL之LB(Luria-Bertani)培養基50mL培養該大腸菌一 夜以製作起子（starter)，將其移至1L之培養基後，添加 0.5mol/L之IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)培養4小時。 31 200819465 離心分離培養基(δ,ΟΟΟηήιΤ1、l〇分鐘)後，將已集菌之 大腸菌懸濁於含有 Protease inhibitor cocktail(Sigma 製)0.5mL及溶菌酶20mg之緩衝液A(含有lmM EDTA之0.05 Μ三鹽酸緩衝液，pH8.0)10mL中，於冰冷下放置1小時。接 5 著，以超音波處理（1分鐘1〇次）進行破碎，離心pOOOmirT1、 15分鐘）並收集沉澱物。再以緩衝液b(含有8M尿素、〇·1Μ NaH2P〇4 · 2H2〇之0.01M三鹽酸緩衝液，pH8 〇)8mL使該不 溶性分液可溶化，於其中加入Ni-NTA瓊脂凝膠(QIAGEN 製)8mL後，以室溫混合1小時。接著，將凝膠移入空管柱（υ 10 id X 13cm)，再以含有20mmol/L味唾之緩衝液b充分洗淨 後，以含有250mmol/L咪唑之緩衝液B使LOX-1胞外區域蛋 白（sLOX-1-D)溶出。使該蛋白溶出分液對〇〇5m〇1/L鱗酸鹽 緩衝液(ρΗ9·0)透析。令透析時所加入之尿素濃度以4、2、1、 0 mol/L p白^又性淡化，以進行蛋白質之再摺疊（^^^匕 15 refolding)。 藉由透析，全成分之90%以上沉澱，最終取得之人類 LOX-1胞外區域蛋白可溶分液（以下，稱為「sL〇x l D」） 為2.4mg/15mL。以SDS-PAGE檢查所得sLOX-1-D，大致為 1 條色帶(band)，而確認其大致為單一sL〇XlD。 20 (2)源自CHO細胞之可溶型l〇x_i 分泌至人類L〇X-1表現CHO細胞培養液中之sL〇X-1被 認為與天然人類可溶型LOXd最接近。於此，將編碼人類 LOX 1 之 cDNA 組入 pVP22/myc-his 載體（Invitrogen Corporation製）以製作pVP22/myc his L〇X l，將其轉染至 32 200819465 CHO細胞，製作穩定細胞(人類LOX-1(附有C-myc-His標記) 表現CHO細胞）。以裝有20mL培養液(含有10vol% FCS(Fetal Calf Serum)及0.04g/dL G-418之Ham’s F-12培養基）的培養 瓶（80cm2)培養(37°C、5%C〇2)該人類LOX-1(附有C-myc-His 5 標記）表現CHO細胞，並依照下述方法從培養細胞起進行繼 代。 首先，使培養瓶每3〜4日更換培養基，於細胞呈密集狀 態時進行胰蛋白酶-EDTA處理，將所收集之細胞移至數個 培養瓶後進行繼代培養。此外，細胞係冷凍保管一半，另 10 —半則用於擴大培養。擴大培養時，係於裝有約5χ10ό個細 胞之3層培養瓶（500cm2，培養液i5〇mL)中以37。(：培養4~6 曰，再更換為無血清之培養液培養2天後，超限過濾(〇·22μιη filter)该培養上清液’再加入1〇倍濃縮iprotease inhibitor Cocktail 0.33mL並冷康保存。 15 收集該[ΟΧ-Κ附c-myc-His標記）表現CHO細胞培養上 清液並進行硫酸銨鹽析、透析及濃縮後，使用Ni-NTA瓊脂 (QIAGEN)管柱，進行親和性純化。從Ni_NTA瓊脂管柱溶出 時，使味唾濃度精細地變為5、1〇、2〇、50及100mmol/L並 洗淨，及，使用250mmol/L之咪唑而使目的蛋白質（源自ch〇 20 細胞之sLOX-Ι)溶出並採取之。 實齡口 [TR-nA法及使用其测定抗體價及親和性] 抗體篩檢法已構築有TR_FIA(time_res〇lved fluoro-immunoassay)法。該方法的原理為：於第二抗體固相 化孤中添加受測抗體試料，使經生物素標記之抗原（生物素 33 200819465 標記sLOX-1-D)與其結合而產生複合物，再以銪(Eu)標記卵 白素（或Eu標記鏈卵白素（streptavidin))加以標記而產生複 合物（苐二抗體·抗sLOX-Ι抗體-生物素標記sl〇x小d)，而 以時間分解螢光法檢測該複合物（參照第丨圖）。 5 於δ玄反應糸統中添加實施例1 (1)或（2)調製之標準物， (sLOX-1-D或源自CHO細胞之sLOX-Ι)，使其與生物素禪兮己 sLOX-1-D競爭，透過阻礙受測抗體試料與生物素桿圮 sLOX-1-D之結合，可測定出受測抗體試料對於前述各標準 物質（sLOX-1-D或源自CHO細胞之sLOX-Ι)之親和性。 10 (l)sLOX-1-D之生物素化(調製生物素標記sl〇x小D) 使用生物素化試劑（sulfo-NHS-LC-biotin，Pias Corporation製）使實施例1 (1)調製之人類L〇x_丨胞外區域蛋 白（sLOX-1-D)生物素化。即，依手冊進行下述方法。 ⑴使sLOX-1-D 0.06 mg(3xl(T9mole)溶解於反應緩衝液 15 (〇.lmol/L磷酸鹽緩衝液，pH7.4)0.25mL中，於其中添加溶 有 sulfo-NHS-LC-biotin (Pias Corporation製）〇.〇25mg(4.5x 10_8111〇化)之反應緩衝液〇.〇251111^。 (ii) 以室溫攪拌2小時，進行反應。 (iii) 反應後’以凝膠過濾、法(PD-10，Amersham製）分選 2〇 目的物（生物素標識sLOX-1-D)後，進行濃縮。 (2)調製第二抗體固相化皿 藉MAPS-II套組(Bio-Rad Laboratories製）從山羊抗小鼠 IgG血清（shiba-goat)純化製得lgG分液（15.8mg/mL)，使用其 作為第二抗體。將該IgG分液於使用時以固相化緩衝液(含 34 200819465 〇.〇5g/dL氮化鈉之0·05 mol/L Tris緩衝液，ρΗ7·8)調製成 l(^g/mL，再以ι〇0μί分別注入微量滴定盤（Maxisorp fluoro，Nunc)之各井中。以室溫靜置一夜以上後，以阻隔 緩衝液(加入純水1 〇〇mL與固相化缓衝液1 OOmL使20g/dL蔗 5 糖及B1()ck Ace(l包4g，雪印乳業）溶解者）洗淨2次後，更加 入阻隔緩衝液200μΙ^靜置5小時以上。吸引阻隔緩衝液，再 使該皿於減壓以室溫乾燥，製成第二抗體固相化乾式皿 (4°C保管）。 ⑶抗體量(抗體價）之測定方法 10 以洗淨液(含〇.〇lg/dL Tween 20及0.05g/dL氮化納之生 理食鹽水)將（2)所調製之第二抗體固相化皿洗淨2次後，於 各井中添加受測抗體試料之稀釋液50μί及標記抗原混合液 (生物素標記sLOX-1-D與Eu標記鏈卵白素之等量混合 物）100μί，以4°C保溫16小時，再洗淨3次。接著，加入增 15 強試劑150μί(將鄰苯二曱酸氫鉀1.39g、乙酸6.0g、TOPO(氧 化三正辛基膦，tri-n-octylphosphineoxide)19.3mg、NFA(2-奈甲基三氟丙酮，2-naphthoyltrifluoroacetorie)4.59mg 及 Triton X-100 l.〇g以純水製成1L者），再以多層次計數器 (multilevel counter ，1420 ARVO SX，Wallac 製）測定已固 20 定化成固相之銪（Eu)的時間分解螢光強度。如此，即可從 賦予100000 counts螢光強度之受測抗體的稀釋倍數求得受 測抗體試料之抗體價。 此外，於本測定中用於調製試劑等之分析緩衝液可列 舉如含有 〇.5g/dL BSA、0.05g/dL氮化鈉、〇.98mg/dL DTPA、 35 200819465 TWeen 80 〇.lg及0.9g/dL氯化鈉之〇 〇5m〇1/LTr_衝液肿 7.4)。 (4)抗體對人類可溶型LOX-1之親和性評估方法(抑制曲線） 將受測抗體試料之稀釋液50μί、人類可溶型1^〇尽1標 5準物質（sLOX-1-D或源自CHO細胞之sL〇X-1)溶液卿l、標 記抗原混合液（生物素標記sL〇X-l_D與Eu標識鏈卵白素之 等量混合物）50μί加入(2)所調製之第二抗體固相化皿之井 後，以4°C保溫一夜，再洗淨3次。接著，加入增強試劑 150μί，再以多層次計數器（1420 arV0 SX，Wallac製）測定 10已固定化為固相之銪（Eu)的時間分解螢光強度。階段性地 改變所配合標準物質之濃度，再測定受測抗體試料與生物 素標記sLOX-1-D之結合，並依標準物質（sL〇X-1-D或源自 CHO細胞之sLOX-Ι)濃度製出抑制曲線。透過解析抑制曲線 數據之scatchard，即可求出受測抗體對人類可溶型[οχ」 15 之親和性(解離常數，Kd)。 f施例3 [製作單株抗體] (1)免疫原 將實施例1 (1)調製之sLOX-1-D(含沉澱物之懸濁液）及 由位在人類LOX-1胞外區域N端側之序列編號5及6所示胺 20基酸序列所構成之胜肽(胜肽1、胜肽2)製為半抗原以用作免 疫原。這是因為，實施例1(2)之源自CHO細胞之sLOX-Ι培 養液中的含量與大腸菌等相較下非常少，且培養液中之夾 雜物甚多，欲將該sLOX-Ι用作免疫原使用時，難以確保必 需量。使用該半抗原與牛血清白蛋白（BSA、Sigma製）之共 36 200819465 輛物作為免疫原。 為了使各胜肽C端與交聯試劑結合而導入Cys。使用交 聯試劑Ν-(ε-順丁烯二醯亞胺基乙醯氧基）琥珀醯亞胺酯 (sulfo-EMCS，Pias社製），將順丁烯二醯亞胺基導入BSA， 5 使其與前述含有SH基之胜肽片段反應，製得半抗原-BSA共 輛物。即，將BSA 27mg(4xl0_7mole)溶解於反應緩衝液 (0.05mol/L磷酸鹽緩衝液，pH7.0)lmL中，於其中加入已溶 有sulfo-EMCS 8.21mg(2xl0 5mole)之反應緩衝液0.2mL。以 室溫攪拌並反應90分鐘。反應後，對反應液全量使用凝膠 10 過濾管柱(PD-10，Amersha社製）進行凝膠過濾，而分選出 順丁烯二醯亞胺化BSA。 於導入順丁烯二醯亞胺基之BSA溶液2mL(整體之1/2 量）中加入已溶解於反應緩衝液0.5 mL之序列編號5所示胜 肽1(但C端導入cys，8.68mg，6·8χ1(Γ6 mole)，並以室溫攪: 15 拌1.5小時後，以4°C反應一夜。對純水進行透析後，冷凍乾 燥之（胜肽1-BSA)。 此外，對8.33 mg(6.6xl0_6mole)序列編號6所示胜肽 2(附Cys)，使用導入順丁烯二醯亞胺基之BSA溶液2mL進行 相同反應（胜肽2-BSA)。 20 (2)免疫 免疫動物使用A/J小鼠(6〜8週齡，雌，l〇~20g(體重）， 自曰本SLC取得）。使用2〇隻A/J小鼠，每4隻分為1群共分5 群[1-1 群(No.1101 〜1104)、2-1 群(No.2101 〜2104)、3-1 群 (No.3101 〜3104) 、4-1 群（No.4101 〜4104)及 5-1 群 37 200819465 (No.5101〜5104)]。將免疫原（sLOX-l-D、胜肽1-BSA及胜肽 2-BSA)溶解於生理食鹽水，加入等量之佛氏完全佐劑 (DIFCO)使其乳化。如表3所示，將該乳劑之約lOOpg/lOC^L 間隔3週地投藥至各小鼠腹腔内，投藥4次。 5 表3 ; 群 免疫原 系統（小鼠No.) 接種量 免疫次數 (間隔） • 1-1 sLOX-1-D A/J (1101-1104) 約 100pg 4次(3週） ~ 2-1 胜肽1-BAS A/J (2101-2104) 約 100pg 4次(3週） 3-1 胜肽2-BAS A/J (3101-3104) 約 100pg 4次（3週） 胜肽1-BAS A/J (4101-4104) 約 100pg 4次（3週） 1 5-1 sLOX-1-D A/J (5101-5104) 約 100pg 4次（3週） 以致敏3〜4次後所採取之抗血清作為受測抗體試料，進 行實施例2所說明之TR-FIA法，藉此調查各抗血清之抗體 價。茲將取自 1-1 群(No.1101 〜1104)、2-1 群(No.2101 〜2104)、 3-1群(Νο·3101〜3104)小鼠之抗血清的抗體價示於表4。 10 表4 小鼠抗sLOX-Ι抗血清之抗體價 小鼠 免疫原 系統 抗體價（1/V) No. 2次免疫 3次免疫 4次免疫 1101 sLOX-1-D A/J >100000 > 200000 — 1102 sLOX-1-D A/J > 100000 100000 — 1103 sLOX-1-D A/J > 100000 200000 — 1104 sLOX-1-D A/J >100000 200000 — 2101 胜肽1-BAS A/J 10000 20000 — 2102 胜肽1-BAS A/J 20000 30000 50000 2103 胜肽1-BAS A/J 2000 2000 2000 2104 胜肽1-BAS A/J 2000 20000 5000 3101 胜狀2-BAS A/J 30000 80000 200 3102 胜肽2-BAS A/J 2000 2000 500 3103 胜肽2-BAS A/J 70000 80000 30000 3104 胜肽2-BAS A/J 3000 5000 10000 38 200819465

Titer(l/V) ·· dilution at 100000 cps 從該等結果得知，以sLOX-l-D進行免疫而獲得之抗血 清的抗體價（螢光強度為lOOOOOcps之稀釋倍數)各為1〇萬以 上，且免疫2〜3次大致到達高原期（plateau)。此外，從抗體 5 價判斷，任一群小鼠之脾臟細胞均可使用在細胞融合上。 再進一步以下述方法從其中選出小鼠。具體而言，以 貫施例2(4)之TR-F1A法’將抗血清（致敏3次後採取者）用作 受測抗體試料，先調查其對用作免疫原之sLOX-1-D的親和 性。接者’以對sLOX-1-D親和性較高之抗血清作為受測抗 10 體試料，調查對於源自CHO細胞之sLOX-Ι的親和性。第2 圖顯示出針對1-1群小鼠調查之結合抑制曲線。任一小鼠與 免疫原之sLOX-1-D之50%抑制濃度均低（每井2〜3ng)而數 值近似，就源自CHO細胞之sLOX-Ι而言，雖因小鼠別而有 差異，仍顯示出結合抑制。此外，以胜肽2為半抗原之BSA 15 共軛物經免疫之小鼠的抗血清與胜肽2之反應性甚高，但與 源自CHO細胞之sLOX-Ι則未顯示出結合抑制。因此，未針 對已免疫胜肽2半抗原之小鼠進行細胞融合。 (3)細胞融合 如前述，從抗血清對用作免疫原之sLOX-1-D及源自 20 CHO細胞之sLOX-Ι均顯示高親和性的小鼠(No. 1103、No. 2101、No. 4103、Νο·5101)採取脾臟細胞，並與骨髓瘤細胞 進行細胞融合。骨髓瘤細胞選擇P3U1細胞(P3-X63.Ag8.Ul 細胞之社内繼代系）。使用前將保管於液態氮中之骨髓瘤細 胞解凍後，使用骨髓瘤繼代用培養基(RPMI-HEPES ·•於 39 200819465 450mL之 RPMI 1640 中加入 lmol/L HEPES(pH6.8)5mL、 OPK溶液（草乙酸7.5mg/mL、丙酮酸納7.5mg/mL、卡那黴 素5mg/mL)10mL及FBS(Fetal Bovine Serum)50mL)，進行 7〜10日繼代培養供細胞融合。 5 於細胞融合3天前，於醚麻醉下摘除前述經追加免疫之 小鼠脾臟，以 RPMI-HEPES(RPMI1640 225mL及 lmol/L HEPES(pH 6.8) 2.5mL)洗淨後，於網上進行處理調製出脾臟 細胞之浮遊液。將該脾臟細胞約lxl08cell與P3U1骨髓瘤細 胞約2xl07cell混合，離心沉澱除去上清液後保持37它，一 10 邊以1分鐘添加800μί之50g/dL聚乙二醇4000 (PEG4000)(氣 體層析用，Merck Ltd·)—邊振盪混合後，更攪拌1.5分鐘。 接著，於1分鐘内攪拌lmL之RPMI-HEPES—邊進行滴定（重 覆2次），再於30秒内一邊攪拌lmL之RPMI-HEPES —邊滴定 (重複2次）。接著，攪拌6mL之RPMI-HEPES達2分鐘，一邊 15 進行追加，最後加入12mL之HEPES-RPMI。 將懸濁於RPMI-HEPES之細胞離心分離，待完全去除 上清液後，懸濁於170mL之HAT培養基（含有350mL之 RPMI1640、50mL之NCTC109(GIBCO)、OPK溶液 l〇mL、 NEAA(非必需胺基酸，GIBCO)5mL、5mL之lmol/LHEPES 20 (ρΗ6·8)、HAT(次黃嘌呤、胺嗓呤、胸腺嘴。定)5mL、FCS 100mL及 lOvol% BM-Condimed HI (Roche Applied Science) 之培養基），分別注入約9片培養用96井微滴定皿（878 井）(l.lxl05cell/0.19 mL/well)，於5%二氧化碳培養器内以 37°C進行培養。茲將各細胞融合之詳細條件示於表5。 40 200819465 表5 睥鲮七抱數 ρ3Π飪抱數 X 108 W ................................................... X 108 …丨丨I丨丨丨丨！丨丨丨I丨丨-丨丨丨Μ· 1.0 ................................... 0.2 0. 57 0.11 0.68 0.16 0.84 0.17 斤使用PEG4000之細胞融合結果，融合效率約為臟， 每一井可見數個〜十多個群落。 5 (4)選別hat培養基之融合細胞 於培養融合細胞第5天，將加溫至3：rc之Hat培養基 0.1M1追加至各井。使綠相差顯微鏡觀察每天融合瘤之成 長，一旦融合瘤增殖至井整體之1〜5%，即將各井之培養上 清液每O.lmL地取樣。將其作為受測抗體試料，進行實施例 10 2所說明之TR-FIA法，從抗體價較高者中更選出親和性及細 胞增殖強烈者，供予下述選殖。

拓狍融合傷伴 小鼠No· --------- PE64000 mL 1103 2101 0.5 4103 0.8 5101 0,8 (5)選殖(臨界稀釋法） 以巴斯德移液管（Pasteur Pipet)剝離欲進行選殖之井的 融合瘤，移動並擴大至24孔培養皿中。計數一部分，再以 15 HT培養基(含有RPMI1640 350mL、NCTC 10950mL、OPK 溶液 10 mL、NEAA 5mL、lmol/L HEPES(pH 6.8)5mL、 HT(次黃嘌呤、胸腺嘧啶）5mL、FBS lOOmL及lOvol% BM-Condimed HI)逐倍稀釋（8階段）至約50cell/mL。將該 0.2mL(細胞數為0.1〜l〇cell/Well)分別注入培養皿。3〜6曰後 41 200819465

5 m / 以位相差顯微鏡觀察，檢查各井之^&查4 <、、、田胞數。一旦融合瘤增 殖至-定程度，就1井約2個以下者將其培養上清液作為受 測抗體試料，使用TR-FIA法進行_檢，從抗_、_ = 及增殖性佳者中選出為單株之井(―次選殖)。使選出之井快 速地再次進行選殖（二次選殖）’與—次選殖相同地使用 TR-FIA法進行篩檢，選出目的抗體。尚未成為單株者則再 度進行選殖(三次選殖）。將已確立之選殖株—邊反覆繼代， 一邊緩緩移入大型培養瓶中，調製成濃度約 5〜10xl06Cell/mL，再以0.5mL逐一分別注入血清管（Serum 10 tube)(約5根），並保存於液態氮中。分選此時之培養上清 液，檢查抗體價。此外，已確立之融合瘤於冷涞後，為了 進行確認而再次培養，檢查細胞增殖性及抗體價。 15 / 從經免疫81^0乂-1-0之小鼠（]^〇.11〇3)取得之融合瘤係 於細胞融合第10天篩檢，檢測出共11個陽性井 (>100000cps)。其中，就增殖良好之5井，以臨界稀釋法進 行一次選殖，獲得被認為大致係單株的10井。再進一步進 行二次選殖，並於第1〇天進行筛檢，獲得被認為係單株之3 井。該等均是取自6B11選殖株者。 20 此外，從小鼠(No.5101)同樣製作而得之融合瘤則檢測 出共48個陽性井。其中，對sLOX-1-D親和性強之9井進行 一次選殖。於選殖後第10天進行篩檢，選出抗體價及親和 性良好且接近Single者進行二次選殖。結果，獲得共8株選 殖株（1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、1B8、1A7)。 更從免疫3次以胜肽1為半抗原之BSA共軛物後的A/J 42 200819465 小鼠(No.2101)取得融合瘤，進行2次選殖，進而確立選殖株 (5CU)。同樣地，從小鼠(N〇.4103)進行2次篩檢及選殖而確 立選殖株(4D1)。 茲將上述選殖結果示於表6。 5

表6

(6)採取單株抗體(培養上清液及腹水） 於(5)所調製之融合瘤中，大量培養以LOX-1胞外區域 蛋白（sLOX-1-D)及胜狀1 (係LOX-1胞外區域之n端胜肽）之 BSA共輛物作為免疫原而調製出之11種融合瘤（ig2、2E4、 ίο 2E5、2G11、3E12、7G1、1B8、1A7、6B11、5C11、4D1) 後，更換為無血清培養基並收集其培養上清液，藉以採取 單株抗體。 此外，於上述融合瘤中，將以LOX-1胞外區域蛋白 (sLOX-1-D)作為免疫原而調製之融合瘤（1G2、2G11、6B11 15 及1A7)及以胜肽1為半抗原而調製之融合瘤（5C11、4D1)以 約2〜3xl00cell逐一接種至已預先以降植烷(pristane)lmL處 理之小鼠(Balb/c及Balb/c nu(裸鼠))腹腔。另，融合瘤係由 液態氮下之冷凍狀態解凍，擴大培養7〜1〇曰後，投予小鼠 腹腔内。觀察該等小鼠，使腹部逐漸膨脹之小鼠（投予後 20 8〜17日）在醚麻醉下死亡後，採取腹腔内之腹水。再從每隻 已接種各融合瘤之小鼠取得1.2〜4.9mL腹水，測定抗體價 43 200819465 (表 7)。 表7 單株抗體之採取

6B11 6811 1G2 162 2G11 2G11 1A7 1A7 5C11 5C11 4D1 4D1 Balb/c m Balb/c Balb/c mj Balb/c Balb/c nu Balb/c Balb/c nu Balb/c Balb/c nu Balb/c Balb/c nu Balb/c 每隻小鼠之腹水量· (niL) 4 7 2.4 4 6 2.1 4.9 3,0 2.5 1,2 2.6 3/1 3,2 18

L0X-H) L0X-H) LOXH，D L0X-H) LOX-1-〇 LOX-H) loxhhb L0Xw,1'-J) 胜肽1_BSA fttt 1 -BSA 胜肽1 3工.Ια 1 一 gSA ++ ++ Ή- +-f H· (7)純化單株抗體 5 將⑹所調製之融合瘤的培養上清液及小鼠腹水所含之 單株抗體供予蛋白A親和性管柱（Affi_Gel p⑽如 AMAPS-II套組，Bi()_Rad製），純化為邮。具體來說，先於

二&柱中填充約lmL蛋白A固定化珠之凝膠（懸濁液約 1.5〜2mL)，再以結合緩衝液（附於套組中）i〇mL洗淨，而製 ⑴作成蛋白錢和性管柱。使融合狀培養上清液或小鼠腹水 〇.5mL與結合緩衝液〇5〜lmI^合，將離心分離而調製出之 上清液供傾述製作之蛋白_和性管柱，先流通加机之 結合緩衝液來洗淨除去不被支持者，接著使用溶出緩衝液 (附加於。套組中）3〇mL使用IgG脫離溶出。取代為溶出缓衝液 15後，將最初流出之蛋白央峰作為IgG溶液採取。目溶出緩衝 液為酸性(ΡΗ3·0)，立即以lm〇1/LTds緩衝液(pH9〇)中和溶 44 200819465 出之IgG。以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)透析所得IgG溶液 後’冷凍保管之。結果，從融合瘤之一部分(30〜40mL)培養 上清液取得1〇〇〜700pg之IgG。 以 MAb-BASED MOUSEIg ISOTYPING KIT 5 (PHARMINGEN)決定所得單株抗體(IgG)之同型（isotype)。 結果，11 種(6BH、1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、 1A7、1B8、5C11、4D1)中有9種為IgGl而殘留，剩餘者為 IgG2a與IgG2b(表8)。此外，將該等單株抗體之一部分解離 常數(Kd)顯示於下（表9)。此外，前述Kd各值雖為針對人類 10 L0X-1胞外區域之一部分（序列編號2)者’但人類可溶担 L0X-1(序列編號3及4)與胺基酸序列之差異非常小，因此， 對於人類可溶型1〇:^1之1^亦大致同等。 表8 星秩杭體之性罠· 小鼠 免疫原 No. 1103 sLOX-卜D 2101 胜肽1 一 BSA 4103 胜肽1 一 BSA 5101 sL0X~1-D 6101 sLOX-1-D 510t sLOX^I·"^ 5101 sLOX+D 5101 sL0X^1""D 5101 sL0X~1~0 5101 sLOX·卜D 5101 sL0X-H) 選殖株 No. 6B11 5C11 4D1 m 2E4 2E5 2G11 3E12 7G1 1A7 188 與 sLOX+D 之親和性 與 sLOXH (CH〇) 之親和性 增殖 子類

-Η» lgG1 UG2a 1姊1 IfGl I €61 lgQ1 IgGl IgGl igG1

45 200819465 表9

Scatchard Plot之鐘薩常數 融合瘤 _離常數 (nM) 6B11 0.34 4D1 0.36 2611 0.16 3E12 1.32 761 0.12 __ 1A7 0,51 單株抗體之組合 依舨貫施例2(1)所說明之方法，將實施例3所得n種單 5株抗體（培養上清液之JgG分液）中排除1B8抗體所剩下的1〇 種進行生物素標記。使用依照實施例2(2)之方法而固相化有 此10種生物素標記抗體與前述Η種單株抗體之亚，構築2側 夾層ELISA，針對11〇種抗體之組合，調查asL〇X-1_D與源 自CH0細胞之sLOX-1為標準物質時之此岱八標準曲線。 10 使用係胜肽i(於序列編號5所示多胜肽末端附加結合 用之半胱胺酸而成者）與BSA共軛之胜肽1-BSA作為免疫 原’令依照實施例3調製出之抗體(4D1抗體及5C11抗體）呈 固相時，Blank雖高，但於與任一生物素標記單株抗體 (6B11、1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、1A7、1B8) 15組合之ELISA中均顯示良好之反應（表1〇)。 46 200819465 表ίο sL0X4 ELISA中之單株抗體組合

No. 6ΒΠ 1A7 3E12 1G2 2G1I 2E4 7G1 5CI1 4D1 2E5 1B8 6B11 \ 十+ 一 條 - - ++ ++ 一 1A7 ++ \ 細 - - 爾 + Ή* - » 3E12 - \ - - - + 嫌 - 1G2 十 - 細 \ 一 - - ++ + 生物素標記 抗體 2G11 - - - \ 一 - -Η- φ 一 2E4 \ ++ -H- - - 7G1 - \ + 一 供 5C11 十+ HHh ++ +十 Ή- \ 一 +十 十+ 4D1 .+ ++ ++ ++ \ ++ ++ 2E5 - ++ -Η- \ IBS None None None None None None None None None None \ 此一事實顯示，使sLOX-1-D免疫而獲得之9種單株抗 體(6BU、1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G卜 1A7、1B8) 5 同時與抗sLOX-lN端胜肽之抗體結合，而識別與sLOX-Ι之 N端(new EpiTalk)不同的部位。 使sLOX-1-D免疫而獲得之抗體群(6B11、1G2、2E4、 2E5、2G11、3E12、7G卜 1A7、1B8)則僅於 1A7抗體與6B11 抗體之組合上顯示強烈反應，這暗示了除此之外的抗體均 10 有識別部位接近的可能性(表10)。 此外，前述製得之產生單株抗體的融合瘤中，融合瘤 1A7及6B11係以融合瘤標示「小鼠-小鼠融合瘤sLOX_l lA7(Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 1A7)」及「小鼠-小鼠 融合瘤 sLOX-1 6B11 (Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 47 200819465 6B11)」於2006年7月26日國際寄存於獨立行政法人產業技 術綜合研究所專利生物寄存中心，住址為日本國茨城縣筑 波市東1丁目1番1中央第6。各融合瘤之領收編號及寄存編 號係如下所示。 5 表11 _.融合衝之標不____ 領收fg號 寄存編號 「Mouse-Mouse hybridoma sLOXH 1A7j FERM ABFH 0645 FERM BFH0645 rMouse-他use hybridoma sLOXH 6B11 j FERM ABF-10646 FERM BP-10646 實施例5 〔化學發光ELISA〕 (1)單株抗體之片段化方法 於單株抗體（IgG)之〇.〇2mol/L乙酸緩衝液 10 (pH4.0)0.25ml 中添加胃蛋白酶（Sigma)稀釋液（50pg/mL) 5(^L攪拌後，以37°C反應3小時。反應結束後進行凝膠過 濾，透過HPLC系統（島津LC-6A，管柱：TSK-gel G3000SWXL，6.8x300mm、溶離液：含0.2mol/L氣化鈉之 0.1mol/L磷酸鹽緩衝液，ρΗ7·0，流速：0.5mL/min，檢測： 15 28〇11111)，分選出保持時間約18分之尸(&13’)2分液(分子量約9.2 萬）。 使分選之F(ab，)2分液以離心超限過濾（YM-30， Centricon)濃縮後，將〇.32mg加入緩衝液A(含5mm〇l/L EDTA之0.1mol/L磷酸鹽緩衝液，pH6.0)0.25mL中，並加入

20 0.1mol/L 2-半胱胺（2-mercaptoethylamine)0.025mL，以37〇C 還原90分鐘。反應結束後，以凝膠過濾HPLC系統採取保持 時間約20分之Fab，分液(分子量約4.6萬）。分選之Fab’分液以 離心超限過濾(YM-30)濃縮之。 48 200819465 (2)驗性磷酸酶之抗體標記方法 將驗性鱗酸酶（ALP，源自牛小腸，Kikkoman Corporation) 1 mg溶解於〇.imol/L磷酸鹽緩衝液 (pH7.0)0.2mL，加入業已溶解於純水0 05niL之N-(8-順丁烯 5 二酸亞胺基乙醯氧基）琥珀醯亞胺鈉鹽（sulfo-HMCS，同仁 化學)0.1mg，以室溫使其反應2小時。反應結束後，以PD_10 管柱(溶離液：緩衝液A)純化後，以離心超限過濾(YM-io， Centdcon)濃縮其高分子分液，製成順丁烯二醯亞胺化alp。 於0.25mL含有〇.i3mg(l)所調製之單株抗體的Fab，之緩 10 衝液A中，加入前述順丁烯二醯亞胺化ALP溶液 0.026mL(0.128mg)攪拌後，以室溫反應16小時。反應結束 後’使0.15mL反應液以凝膠過濾Hplc系統(溶離液：含0.2 mol/L氣化鈉之O.lm〇i/L磷酸鹽緩衝液，ρΗ7·0)分離純化(保 持時間約15分），製得ALP標記抗體(ALP標記Fab，）。 15 (3)探討ALP標記單株抗體（1G2、2G11、6B11)之最適量 將得自培養上清液或腹水之3種單株抗體（1G2、2G11、 6B11)之IgG分液（1G2: 2.0mg、2Gll : 1.9mg及6B11 : 1.3mg) 依照前述（1)及（2)之方法進行胃蛋白酶處理後，還原成為 Fab’，與順丁烯二醯亞胺化ALP反應，並透過凝膠過濾HPLC 20分選出3種Fab’-ALP共軛物（酵素標記抗體）。所得酵素標記 抗體各為0.41mg、0.42mg及0.29mg。 使用3種固相抗體(5C11、4D1、1A7)調查所得3種酵素 標記抗體（1G2、2G11及6B11)之評價。結果，任一酵素標記 抗體（1G2、2G11及6B11)均對3種固相抗體(5C11、4D1、1A7) 49 200819465 顯示出良好之反應，而得知所製作之任一酵素標記抗體均 可使用在ELISA上。另，酵素標記抗體之每井使用量為： 使用 1G2為 170ng/mL，2G11 為 i5〇ng/mL且6B11 為 190ng/mL 者 ΙΟΟμί。 5 (4)化學發光ELIS Α之人類血清試料測定方法 使用單株抗體IgG(lA7之IgG)之固相化缓衝稀釋液 100μΐχΐμ§/100μί)，依實施例2(2)項所述第二抗體固相化皿 之製作方法為準進行操作，而製作出抗體固相化乾式皿。 以洗淨液（含0·01 g/dL Tween20及0.05g/dL氮化鈉之生 10 理食鹽水）將該抗體固相化皿洗淨2次後，於各井中添加 sLOX-1-D標準溶液或源自CHO細胞之sLOX-Ι純化液 ΙΟΟμί(測定人類血清試料時，係於分析緩衝液l〇(^L中加入 試料10μί)，靜置5小時。洗淨3次後，加入ALP標記抗體溶 液(6Β11之Fab’-ALP共軛物）1〇〇μί。以室溫保溫一夜，洗淨 15 4次洗淨後，於固相中加入化學發光基質溶液（1〇〇μί)，立 刻以多層次計數器測定各井之發光強度。發光基質使用 Lumigen APS-5(Oriental Yeast Co·，Ltd·)。此外，固相化抗 體與ALP標記抗體之組合係使用1A7-6B11(固相化抗體 -ALP標記抗體）。 20 另外，使用在調製試劑等之分析緩衝液係使用含有 0.5g/dL BSA、0.05g/dL氮化納、0.01g/dL Tween 80、 lmmol/L氣化鎮、0.1mmol/L氣化鋅及0.9g/dL氣化鈉之0.05 mol/LTris緩衝液(pH 7.4)。 (5)選擇ELISA系統 50 200819465 依照實施例5⑷項，使用已使3種酵素標記抗體⑽、 2CH1及沾⑴與單株抗體^、5C11及_之吵固相化 (WO.lmL)的I ’製作係以low胞夕卜區域蛋白為標準物 質之化學發光2側夾層ELISA的標準曲線（〇 24 25〇 5 Pg/Well)。任一組合均顯示高度反應，特別是固相化抗體與 標記抗體（Fab’-ALP共軛物）之組合，各在1A7_6Bn、 5C11-1G2、4D1-2G11時獲得高感度之標準曲線。其中，空 白（Blank)稍高但反應最高者為1A7-6B11之組合（推定檢測 界限0.24pg/well(約 6amol/well))。 10 即使係以源自CHO細胞之sLOX-1為標準物質的化學 發光2側爽層ELISA之標準曲線中，亦可獲知：1A7-6B11之 組合與固相使用抗胜肽1之抗體的5C11-1G2、4D1-2G11相 較，感度良好100倍程度（第3圖）。 (6)血清成分對ELIS A造成之影響 15 將人類血清（彙整(pool)志願者5人分之血清者）、兔血漿 及牛胎兒血清稀釋至1/1~1/64，再以上述3種分析系統測定 其50μ1^(血清量為0.78〜5(^L/well)。於1A7-6B11(固相化抗 體-ALP標記抗體）之ELISA系統中，動物血清幾乎未有反 應，人類血清則依血清量而顯示出反應，於0.78〜12·5μί範 20 圍内可觀察到稀釋直線性。該等結果顯示，該測定系統可 專一性地測定人類血清中之人類sLOX-Ι(第4圖）。 此外，由於推定人類血清之採樣量在ΙΟμΙ以下時血清 成分之影響極小，而令血清之採樣量為ι〇μΐ，標準溶液則 以不含人類血清之分析缓衝液調製。 51 200819465 (7)小鼠γ球蛋白對ELISA造成之影響 已知 血中具有抗小鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA)之人類係以無法忽視之比例存在，於使 用小鼠抗體之EUSA中，該等人類之血液試料顯示出異常 高值。此-触可藉由預先於分析緩衝液巾添加]、鼠丫球蛋 白（IgG)來抑制，於本ELISA忖是將小鼠γ球蛋白添加於分 析缓衝液而去除其影響。調查小鼠γ球蛋白濃度對阳从標 準曲線造成之影響，結果至2〇tAg/mL為止幾乎不會造成影 響，而於分析緩衝液中添加lOpg/mL之小鼠γ球蛋白。另外， 10在此所使用之志願者5人之血清中未存有HAMA。第5圖顯 示以含有小鼠γ球蛋白之分析緩衝液作成之EUSA標準曲 線0 (8)預證(prevalidation)與定量界限之推定 對sLOX-Ι濃度較低之志願者血清（Ν〇· 3)使用添加 3 sL〇X-l_D至濃度(U0042.8 ng/mL(l〜I28pg/well)之試料進 行預證。如表12所示，o.ioo〜6.40 ng/mL範圍之實驗内精 度、真度均良好(1·7〜15.7%及-10.5〜+ 14.4%)。同濃度範圍 之實驗間的精度、真度亦良好(5.3〜12.3%及-8.3〜+7.5%)。 另一方面，雖然於高濃度（12.81^/11^)下真度略差，但認為 20玎透過再檢討標準曲線點與回歸計算方法來加以改善。從 該等結果，定量限界推定為約O.lng/mL。與使用多株抗體 之ELISA(定量限界·· ing/mL)相較下，感度提高達1〇倍。 本ELISA之第一及第二反應時間（各為5小時及一夜)係 配合多株抗體態樣者，但由於使用單株抗體而有可縮短反 52 200819465 應時間之可能性，復而調查第一反應4小時、第二反應1小 時下的實驗内精度、真度，獲得如表13所示之結果（各為 2·3〜14.7%及-14.1 〜16.0%)。 表12 添加最 测定磁 實驗內檩準差 精度、真度變動係數 偏差(bim、 測苽 ΐ (Tig/mL) 0.!00 0.40 1.60 6.40 12.8 0.116 0,384 0.101 OJ42 0J0B 0,416 0.1 Π 0.335 0,110 0393 0.109 0374 0.005 0.035 4.6 9.4 9.0 -6.5 ΰ\2* 7* 7 5 1ΓΙ101αα 7 7 1^-0 8 7 ο·91^ 5·5*6·^ Β 4 5 7 9 6ts-·6·6^ 0. 6903.8.6 Γ 1 I 5 .91.10.7 -7.,

,.3,84.8 G 2 I

a 100 0.40 \M 6M 12J 0J27 0.33 1.65 5.49 9.41 0.J02 0.34 L57 5.67 9.72 0.103 038 IM 5.4g 9.33 0.083 0.36 1,68 5M 936 0.094 0.39 1.58 5*47 9.33 0J02 0.358 1.63 5*39~9A~ 0.016 0.023 0.06 0.15 0.2 15*7 6.4 3.7 2.7 2；I 2.0 -10.5 L9 -12.7 -26.6 測定 OJOO 0.40 1.60 6.40 12.8 0,085 0.403 1.57 6.52 12.0 0,109 0,373 1.95 5.92 _ a 102 0.385 1.83 5.66 11.0 0J27 0,374 J.90 6.07 11.0 0.121 0,349 K90 6.42 12.0 0.109 0.377 1.83 6.12 11.3 0.017 0.020 0.15 036 0.6 15.6 S3 8.2 5.9 5.3 9.0 *5,8 144 -1,4 ，Ι!·7 0.106 (Κ370 1.72 5.87 10.5 0,013 0.026 0.12 031 0.9 12.3 7.0 7.0 5.3 8.6 6.0 -7.5 7.5 S3 -18,0 ，Η^均 實驗間檩準差 ( 褙度、真度變動係赛； 45 C 偏差(bias} 表13 LOX-1 ELISA在短時間測定條件下之精度與真度 (第一反應時間：4小時、第2反應時間：1小時） 實驗內精度、真度(ng/niL) 添加量 0J00 0.40 L60 6,40 12.8 —測涵 0.110 0394 1·64 6.13 11.7 0.096 0,387 1·89 6·04 10.8 (U06 0.369 1.69 631 10.7 0J33 0.410 1.92 6,03 11.2 0.133 0388 1·97 630 10.6 平均 0·116 0.39 1.82 6,16 11.0 標準差 0.017 0.015 0·15 0·14 0·4 變動係數 14.7 3,8 8,2 23 3.6 偏差(bias) 16,0 -2.5 13.8 -3.8 -14.1 10 (9)測定血清中SLOX-1 使用本分析系統測定得自正常志願者5人之血清中 sLOX-Ι濃度（以sLOX-1-D為標準物質時之免疫反應性）。如 表14所示，正常人類血清之sLOX-Ι值為0.15〜0.57ng/mL， 53 200819465 透過本ELISA ’即可測定習知方法（多株抗體態樣之ELISA) 所無法測定之正常人類血清中的sLQx—i。此外，從測定結 果無法斷定與性別或年齡之關連。 表14 sLOX-1 ELISA之正常人志願者血清的測定結果 Μ滑 志願者 sLQX-1 No. 性別與年齡 ng/mL NoJ Μ 40 0.37 No.2 F34 0.21 No3 Μ 51 0J5 Νο·4 Μ 51 0.54 No.S F26 0.57 平"iQ 0·37 ±標準差 0.19 彙整(Pool) 035 由於正常人之sLOX_l血中平均濃度為〇.35ng/mL，若考 慮其分子量，血清中之莫耳濃度將為2XHT11 Μ程度，將其 稀釋至10倍稀釋供測定用，因此測定時之莫耳濃度算為 10 2χ1(Γ12 Μ程度。另一方面，如本發明單株抗體般具有高親 和性（Kd= ΙχΚΓ10 Μ以下）之抗體的0.1%與sLOX-Ι結合時 之sLOX-1總濃度估計為2χ1〇_12Μ程度。如前所述，藉由使 用高親和性單株抗體，可測定正常人血清中之sL〇X-lc7)濃 度’進而進行正確之診斷。 15 序列編號5係顯示胜肽之胺基酸序列，其相當於可溶型 分子（序列編號3)之胺基酸序列M0領域。相當於人類 L0X_1(序列編號1)之胺基酸序列88-97領域。 序列編號6係顯示胜肽之胺基酸序列，其相當於可溶型 54 200819465 刀子（序列編號4)之胺基酸序列1 -l〇領域。相當於人類 LOX-1(序列編號1)之胺基酸序列92-101領域。

【圖式簡單說明;J 第1圖係顯示一用於篩檢本發明單株抗體之2側夾層 5 ELIS A的概略圖。 第2圖係一繪有抑制曲線之圖表，即，使用經免疫 sLOX-1-D而製出之A/j小鼠[N〇11〇1(圓形記號）、 Νο·11〇2(三角形記號）、No ll〇3(四角形記號）、N〇 11〇4(菱 形記號)]之抗血清，並以標準物質sL〇x_丨_D(黑色記號)及源 10自CHO細胞之sLOX_1(中空記號)作為抑制物質，而將進行 TR-FIA法之結果繪成抑制曲線者(實施例3)。縱軸表示各濃 度(B)之螢光強度相對於零濃度(Bq)之螢光強度的百分比， 橫轴表示LOX-1胞外區域蛋白質（SL〇X-1_D)濃度或源自 LOX-1表現CHO細胞之可溶型LOX_〗(sL〇X-丨）的推定濃度 15 (ng/well)。 第 3 圖顯示使用 1Α7-6Β11(·)、5cn_1G2(i^、 4D1-2G11(·)作為固相化抗體-標記抗體之2側爽層犯从的 標準曲線。其中，A圖顯示使用sL〇X-M)作為標準物質進 行ELISA之標準曲線，B圖則顯示使用源自CH〇細胞之 20 sL〇X_1作為標準物質進行ELISA之標準曲線（實施例 5(4))。縱軸表示螢光強度(cps)，橫軸表示各標準物質之添 加濃度(pg/well)。 第4圖顯示使用η作為固相化抗體-標記抗體進 行2侧夾層ELISA時，對於各血清（人類血清♦、正常家兎血 55 200819465 清▲)之反應（實施例5(6))。縱軸顯示螢光強度(cps)，橫軸顯 示血清添加量（μΐ)。 第5圖顯示使用固相化1Α7抗體-標記6Β11抗體之2側夾 層ELISA的標準曲線。其中Α圖顯示log-log plot，圖Β顯示 5 semi-log plot。縱軸顯示螢光強度(cps)，橫軸顯示標準物質 (sLOX-1-D)之添加濃度(pg/well)。所添加之γ球蛋白濃度為 0pg/mL(〇)、5pg/mL〇)、10pg/mL(.)、20pg/mL(_)。 【主要元件符號說明】 (無） 56 200819465 序列表（SEQUENCE LISTING) <110〉鹽野義製藥股份有限公司 〈120>抗可溶型LOX-1之單株抗體 <130> 200769TW <150〉 JP 2006-207054 <151〉 2006-07-28 <16〇> 6 < 170> Patentln version 3.1 〈21〇> 1 〈211〉 273 <212> PRT <213〉人類 <4〇〇> 1

Met Thr Phe Asp Asp Leu Lys lie Gin Thr Val Lys Asp Gin Pro Asp 1 5 10 15

Glu Lys Ser Asn Gly Lys Lys Ala Lys Gly Leu Gin Phe Leu Tyr Ser 20 25 30

Pro Trp Trp Cys Leu Ala Ala Ala Thr Leu Gly Val Leu Cys Leu Gly 35 40 45

Leu Val Val Thr lie Met Val Leu Gly Met Gin Leu Ser Gin Val Ser 50 55 60

Asp Leu Leu Thr Gin Glu Gin Ala Asn Leu Thr His Gin Lys Lys Lys 57 200819465 65 70 75 80

Leu Glu Gly Gin lie Ser Ala Arg Gin Gin Ala Glu Glu Ala Ser Gin 85 90 95

Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met lie Glu Thr Leu Ala Arg Lys 100 105 110

Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gin Met Glu Leu His His Gin Asn Leu 115 120 125

Asn Leu Gin Glu Thr Leu Lys Arg Val Ala Asn Cys Ser Ala Pro Cys 130 135 140

Pro Gin Asp Trp lie Trp His Gly Glu Asn Cys Tyr Leu Phe Ser Ser 145 150 155 160

Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gin Glu Lys Cys Leu Ser Leu Asp 165 170 175

Ala Lys Leu Leu Lys lie Asn Ser Thr Ala Asp Leu Asp Phe lie Gin 180 185 190

Gin Ala lie Ser Tyr Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Arg 195 200 205

Arg Asn Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Trp Glu Asp Gly Ser Pro Leu Met 210 215 220

Pro His Leu Phe Arg Val Arg Gly Ala Val Ser Gin Thr Tyr Pro Ser 225 230 235 240

Gly Thr Cys Ala Tyr lie Gin Arg Gly Ala Val Tyr Ala Glu Asn Cys 245 250 255 lie Leu Ala Ala Phe Ser lie Cys Gin Lys Lys Ala Asn Leu Arg Ala 58 200819465 260 265 270

Gin <210〉 2 〈211〉 189 <212〉PRT <213〉人類 <4〇〇> 2 lie Ser Ala Arg Gin Gin Ala Glu Glu Ala Ser Gin Glu Ser Glu Asn 15 10 15

Glu Leu Lys Glu Met lie Glu Thr Leu Ala Arg Lys Leu Asn Glu Lys 20 25 30

Ser Lys Glu Gin Met Glu Leu His His Gin Asn Leu Asn Leu Gin Glu 35 40 45

Thr Leu Lys Arg Val Ala Asn Cys Ser Ala Pro Cys Pro Gin Asp Trp 50 55 60 lie Trp His Gly Glu Asn Cys Tyr Leu Phe Ser Ser Gly Ser Phe Asn 65 70 75 80

Trp Glu Lys Ser Gin Glu Lys Cys Leu Ser Leu Asp Ala Lys Leu Leu 85 90 95

Lys lie Asn Ser Thr Ala Asp Leu Asp Phe lie Gin Gin Ala lie Ser 100 105 110

Tyr Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Arg Arg Asn Pro Ser 115 120 125 59 200819465

Tyr Pro Trp Leu Trp Glu Asp Gly Ser Pro Leu Met Pro His Leu Phe 130 135 140

Arg Val Arg Gly Ala Val Ser Gin Thr Tyr Pro Ser Gly Thr Cys Ala 145 150 155 160

Tyr lie Gin Arg Gly Ala Val Tyr Ala Glu Asn Cys lie Leu Ala Ala 165 170 175

Phe Ser lie Cys Gin Lys Lys Ala Asn Leu Arg Ala Gin 180 185 <21〇> 3 <211〉 186 <212〉PRT 〈213〉人類 <4〇〇> 3

Arg Gin Gin Ala Glu Glu Ala Ser Gin Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys 1 5 10 15

Glu Met lie Glu Thr Leu Ala Arg Lys Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu 20 25 30

Gin Met Glu Leu His His Gin Asn Leu Asn Leu Gin Glu Thr Leu Lys 35 40 45

Arg Val Ala Asn Cys Ser Ala Pro Cys Pro Gin Asp Trp lie Trp His 50 55 60

Gly Glu Asn Cys Tyr Leu Phe Ser Ser Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys 65 70 75 80 60 200819465

Ser Gin Glu Lys Cys Leu Ser Leu Asp Ala Lys Leu Leu Lys lie Asn 85 90 95

Ser Thr Ala Asp Leu Asp Phe lie Gin Gin Ala lie Ser Tyr Ser Ser 100 105 110

Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Arg Arg Asn Pro Ser Tyr Pro Trp 115 120 125

Leu Trp Glu Asp Gly Ser Pro Leu Met Pro His Leu Phe Arg Val Arg 130 135 140

Gly Ala Val Ser Gin Thr Tyr Pro Ser Gly Thr Cys Ala Tyr lie Gin 145 150 155 160

Arg Gly Ala Val Tyr Ala Glu Asn Cys lie Leu Ala Ala Phe Ser lie 165 170 175

Cys Gin Lys Lys Ala Asn Leu Arg Ala Gin 180 185 / <210〉 4 <211〉 182

<212> PRT ， <213〉人類 • <400〉 4

Glu Glu Ala Ser Gin Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met lie Glu 15 10 15

Thr Leu Ala Arg Lys Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gin Met Glu Leu 20 25 30 61 200819465

His His Gin Asn Leu Asn Leu Gin Glu Thr Leu Lys Arg Val Ala Asn 35 40 45

Cys Ser Ala Pro Cys Pro Gin Asp Trp lie Trp His Gly Glu Asn Cys 50 55 60

Tyr Leu Phe Ser Ser Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gin Glu Lys 65 70 75 80

Cys Leu Ser Leu Asp Ala Lys Leu Leu Lys lie Asn Ser Thr Ala Asp 85 90 95

Leu Asp Phe lie Gin Gin Ala lie Ser Tyr Ser Ser Phe Pro Phe Trp 100 105 110

Met Gly Leu Ser Arg Arg Asn Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Trp Glu Asp 115 120 125

Gly Ser Pro Leu Met Pro His Leu Phe Arg Val Arg Gly Ala Val Ser 130 135 140

Gin Thr Tyr Pro Ser Gly Thr Cys Ala Tyr lie Gin Arg Gly Ala Val 145 150 155 160

Tyr Ala Glu Asn Cys He Leu Ala Ala Phe Ser lie Cys Gin Lys Lys 165 170 175

Ala Asn Leu Arg Ala Gin 180

<210〉 5 〈211〉 10 <212> PRT 62 200819465 〈213>人工序列 〈4〇〇> 5

Arg Gin Gin Ala Glu Glu Ala Ser Gin Glu 1 5 10 <21〇> 6 <211> 10 <212〉PRT <213〉人工序列 <4〇〇> 6

Glu Glu Ala Ser Gin Glu Ser Glu Asn Glu 1 5 10

/ V 63

Claims (1)

1. 200819465 十、申請專利範圍： 1· 一種單株抗體、其一部分或該等之標記物，具有與人類 可溶型LOX-1專一性結合之特性。 2.如申請專利範圍第1項之單株抗體、其一部分或該等之 5 標記物，其與人類可溶型LOX-1之解離常數（Kd)為 1χ10_9(Μ)以下。 3·如申請專利範圍第1項之單株抗體、其一部分或該等之 標記物，其係由包含下述步驟之方法所調製之融合瘤產 生者： ίο (1)使源自原核細胞之人類LOX-1胞外區域的一部 分於非人類動物中免疫； (2) 從該動物回收抗體產生細胞； (3) 使該抗體產生細胞與骨趙瘤細胞融合； (4) 從上述步驟所獲得之融合細胞中選出產生單株 15 抗體之融合瘤，該單株抗體係與包含該人類LOX-1胞外 區域之一部分的分液發生反應；及 (5) 再從該選出之融合瘤中選出產生單株抗體之融 合瘤，該單株抗體係與源自真核細胞之人類LOX-1胞外 區域的一部分發生反應。 20 4.如申請專利範圍第1項之單株抗體、其一部分或該等之 標記物，其係由「小鼠-小鼠融合瘤sLOX-1 1A7」（寄存 編號：FERM BP-10645)或「小鼠-小鼠融合瘤sLOX-1 6B11」（寄存編號：FERM BP-10646)產生者。 5.如申請專利範圍第1項之單株抗體、其一部分或該等之 64 200819465 標記物，其係使用於診斷急性冠狀動脈症候群者。 6·如申請專利範圍第1項之單株抗體、其一部分或該等之 標記物，其係使用於評估急性冠狀動脈症候群之治療藥 或治療候補藥之藥效者。 f 5 7· 一種融合瘤，可產生如申請專利範圍第1至4項中任一項 之單株抗體。 1 8.如申請專利範圍第7項之融合瘤，其係「小鼠-小鼠融合 瘤sLOX-1 1Α7」（寄存編號：FERMBP-10645)或「小鼠 f -小鼠融合瘤sLOX-1 6B11」（寄存編號：FERM 10 BP-10646)。 9· 一種融合瘤之調製方法，包含下述步驟： (1) 使源自原核細胞之人類胞外區域的一部 分於非人類動物中免疫； (2) 從該動物回收抗體產生細胞； 15 (3)使該抗體產生細胞與骨殲瘤細胞融合； (4)從上述步驟所獲得之融合細胞中選出產生單株 抗體之融合瘤，該單株抗體係與該人類LOX-ΐ胞外區域 之一部分發生反應者；及 厂 （5)再從該選出之融合瘤中選出產生單株抗體之融 t 20 合瘤，該單株抗體係與源自真核細胞之人類1^^-1胞外 ^ 區域的一部分發生反應者。 10· —種融合瘤，其係以如申請專利範圍第9項之方法調製 11. 一種人類可溶型LOX-1檢測用試劑套組’包含如申請專 65 200819465 利範圍第1至4項中任一項之單株抗體、其〜 等之標記物。 心刀或疋遠 申請專利範圍糾項之試劑套組，其係急性冠狀動脈 症候群診斷套組。 13·種人類可溶型LOX-1之專一性檢測方法，具有乂下介 驟，即：將如申請專利範圍第丨至4項中铵〜 鱗廿A 、 ，之單株机 體或是該等之標記物作為針對人類可溶型 LOX-1之專一性結合試劑或專一性檢測試劑來使用。 —種急性冠狀動脈症候群之診斷方法，且 10 15 ,以下步驟， 即：使用如申請專利範圍第丨至4項中任—項之單株抗 體、其-部分或是該等之標記物來敎人類體液:之可 溶性LOX-1。 15. -種急性冠狀動脈症候群之治療藥或治療候補藥的藥 效評估方法，係以經投藥急性冠狀動脈症候群之治療藥 或治療候補藥之人類體液為對象，並使用如申請專利範 圍第1至4項中任一項之單株抗體、其一部分或是該等之 標記物來測定該體液中之可溶性L〇xl者。 66