KR101219148B1 - 가용형 ｌｏｘ―１에 대한 단일 클론 항체 - Google Patents

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Abstract

인간 가용형 LOX-1을 특이적으로 인지하는 단일 클론 항체, 특히, 인간 가용형 LOX－1과의 해리 상수(Kd)가 1×10-9 M 이하인 단일 클론 항체를 제공한다. 상기 단일 클론 항체는 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제조된 하이브리도마(hybridoma)로부터 생산된 것이다: 1) 인간을 제외한 동물에 원핵세포 유래의 인간 LOX－1 세포외 도메인을 면역화하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 동물로부터 항체를 생산하는 세포를 회수하는 단계; 3) 상기 항체를 생산하는 세포를 골수종 세포(myeloma cells)와 융합하는 단계; 4) 상기 단계 3)에서 얻은 융합 세포 속으로부터, 인간 LOX－1 세포외 도메인과 반응하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 선별하는 단계; 및 5) 상기 단계 4)에서 선별한 하이브리도마(hybridoma)로부터, 진핵세포 유래의 인간 LOX－1 세포외부 도메인과 반응하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 선별하는 단계.

Description

가용형 ＬＯＸ―１에 대한 단일 클론 항체{Monoclonal Antibody to Soluble LOX-1}
본 발명은 산화 저밀도 리포단백질(산화 LDL)의 수용체인 렉틴 유사 산화 저밀도 리포단백질 수용체-1 (Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1, LOX-1)의 일부가 절단되어 생기는 가용형 분자(soluble LOX－1)에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)에 관한 것이다. 또한, 상기 단일 클론 항체의 용도에 관한 것이다.
불안정 협심증으로 인한 급성 심근경색과 이의 합병증으로 인한 심장 돌연사까지의 일련의 병의 용태는 포괄적으로 급성관상동맥증후군(ACS)으로 불린다. 상기 ACS는 심근에 영양을 공급하는 관동맥의 동맥 경화에 의해 생긴 죽종(atheroma)이 붕괴된 후 혈전과 부착하여 관동맥의 협착이나 폐색이 생겨 발병된다고 여겨진다. 현대 사회에서 급성관상동맥증후군은 점점 증가하고 있지만, 그 대부분은 아무 징조도 없이 갑자기 발병하기 때문에, 치유하지 못하고 돌연사하는 경우가 많다. 또한, 비록 신속하게 병원에 수송되었을 경우에서도, 응급 심장 수술, 응급 경피경관관동맥 혈관 형성방법(PCI) 등이 필요한 경우가 많아, 그 치료비의 부담이 큰 질병이다.
급성관상동맥증후군의 발병은 죽종 동맥 경화 플라크(atheromatous arteriosclerosis plaque)의 붕괴와 침식이 반복해서 일어남으로써 생기는 폐색혈전(occlusⅣe thromboses)의 형성으로 인하여 야기되는 것으로 최근에 밝혀졌다(Medical Tribune, 1999, Vol. 32, No. 31, p. 6). 플라크의 붕괴 및 침식은 혈관벽 내의 염증 반응, 산화 스트레스가 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 그 중에서도 산화 LDL(저밀도 리포단백질)에 의해 야기된, 프로테아제 활성의 증가 및 아폽토시스(apoptosis)로 인한 혈관벽의 기능 장애가 그 주요한 원인으로 알려져 있다. LOX－1 (low-specific gravity lipoproteins)은 상기 산화 LDL의 수용체 단백질로 정의된다(Nature, 1997, Vol. 386, p. 73-77).
상기 LOX－1은 생체내 막단백질로서 정상적으로 세포 표면에 발현되지만, 프로테아제에 의해 막관통부 부근의 세포외 도메인에서 절단되어 가용형 LOX－1으로서 혈중에 유리된다고 알려져 있다(Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2000, 20(3), p. 715-720). 또 급성관상동맥증후군의 급성기에 있어서, 이 가용형 LOX－1의 혈중농도가 매우 상승하기 때문에, 급성관상동맥증후군의 일차적 진단 마커로서의 가능성이 보고되고 있다(Circulation, 2005, 112(6), p. 812-818).
이에, 혈액에 존재하는 가용형 LOX－1의 양을 조기의 단계에서 정확하게 정량 할 수 있다면, 급성관상동맥증후군(ACS)을 미연에 방지할 수가 있을 것이다. 한편, LOX－1에 대한 항체에 관한 보고는 있지만, 모두 일반적인 기재에 그치고 있어, 상기의 조기 진단의 목적을 위한, ELISA등의 면역화학적 분석에 사용할 수 있을 정도의 높은 친화력을 가지는 단일 클론 항체는 아직 보고되어 있지 않다(특개평(Laid-open Patent Disclosure) 9－98787호 공보, 특개(Laid-open Patent Disclosure) 2000－109435호 공보, 특표(Patent Disclosure) 2002－510710호 공보).
본 발명의 목적은, 인간 산화 LDL 수용체인 LOX－1의 가용형 분자인, 인간 가용형 LOX－1을 특이적으로 인식해 결합하는 단일 클론 항체, 특히 인간 가용형 LOX－1과의 해리 상수가 1× 10-9 M 이하인 높은 친화성을 가지는 단일 클론 항체를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 단일 클론 항체의 인간 가용형 LOX－1에 대한 특이적 친화성 및 결합성을 이용한 면역화학적 시약(인간 가용형 LOX－1의 특이적 결합 시약 또는 특이적 검출 시약) 및 상기 시약을 이용한 인간 가용형 LOX－1의 고감도 검출 방법을 위한 단일 클론 항체의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 혈중에 존재하는 인간 가용형 LOX－1을 검출 또는 정량하는 것에 의해, 심근경색으로 대표되는 급성관상동맥증후군을 진단하는 방법 및 급성관상동맥증후군용 치료제 또는 이의 후보물질의 약리효과 평가 방법을 제공하는 것이다.
상기 급성관상동맥증후군의 진단이나 급성관상동맥증후군에 대한 피검 화합물의 약리효과 평가는 본 발명의 LOX－1 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 이용하여 혈중의 인간 가용형 LOX－1을 검출 또는 정량 하는 것으로써, 기존의 방법에 비해 용이하며, 빠른 시간 내에 실시하는 것이 가능하다. 이에, 본 발명의 목적은 급성관상동맥증후군의 진단 또는 약리효과 평가를 위한 단일 클론 항체의 용도를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 인간 LOX-1 세포외 도메인과의 본 발명에서 제조한 하이브리도마(hybridoma)로부터 생산된 단일 클론 항체와의 결합을 확인하여, 인간 가용형 LOX-1에 대한 단일 클론 항체생산하는 하이브리도마를 선별하였고, 상기 하이브리도마에서 생성된 단일 클론 항체가 인간 가용형 LOX-1에 대한 해리 상수(Kd)가 1× 10-9 M 이하로 매우 높은 친화성을 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 상기 단일 클론 항체를 이용한 샌드위치 ELISA법에 의하여, 급성관상동맥증후군의 용태를 나타내는 혈중의 가용형 LOX-1의 존재를 고감도로 검출측정할 수 있음을 보여주었다. 이로부터, 본 발명의 가용형 LOX-1 단일 클론 항체를 포함하는 진단 키트를 사용하여 급성관상동맥증후군을 높은 정확도로 진단 할 수 있으며, 급성관상동맥증후군에 대한 치료제 후보 물질의 고정밀도 효능 평가도 가능함을 확인하였다.
본 발명은 관련된 발견에 근거하여 완성한 것으로서, 하기의 특징을 포함한다.
(I) 단일 클론 항체
(I-1) 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 단일 클론 항체, 이의 일부 또는 이들의 표지물.
(I-2) (I-1)에 기재된 인간 가용형 LOX-1의 해리 상수(Kd)가 1× 10-9 M 이하인 것을 특징으로 하는 (I-1)에 기재된 단일 클론 항체, 이의 일부 또는 이들의 표지물.
(I-3) 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 하이브리도마(hybridoma)에 의해 생산되는, (I-1) 또는 (I-2)에 기재된 단일 클론 항체, 이의 일부 또는 이들의 표지물:
1) 인간을 제외한 동물에 원핵세포 유래의 인간 LOX-1 세포외 도메인을 면역시키는 단계;
2) 상기 동물로부터 항체를 생산하는 세포를 회수하는 단계;
3) 상기 항체 생산하는 세포를 골수종 세포(myeloma cells)와 융합하는 단계;
4) 상기 단계로 얻은 융합 세포로부터 인간 LOX-1 세포외 도메인과 반응하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 선별하는 단계; 및
5) 상기 선택한 하이브리도마(hybridoma)로부터 진핵세포 유래의 인간 LOX-1 세포외 도메인과 반응하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 선별하는 단계.
(I-4) 하이브리도마(hybridoma) [마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-11A7 (기탁 번호：FERM　BP-10645)] 또는 [마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 6B11 (기탁 번호：FERM　BP-10646)]에 의해 생산하는 되는 단일 클론 항체 또는 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합하는 일부 또는 이들의 표지물.
(I-5) 일부가 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체의 Fab＇단편인 것을 특징으로 하는, (I-1) 내지 (I-4)에 기재된 단일 클론 항체, 이의 일부 또는 이들의 표지물.
(Ⅱ) 단일 클론 항체, 이의 일부 또는 이들의 표지물의 용도
상기의 단일 클론 항체, 이의 일부는 혈액 등의 체액에 존재하는 인간 가용형 LOX-1의 고감도 검출에 유용하게 사용될 수 있어 급성관상동맥증후군의 진단에 응용하는 것이 가능하다. 또, 이러한 단일 클론 항체, 이의 일부는 급성관상동맥증후군의 치료제 또는 이의 후보물질의 약리효과 평가에 유효하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기의 내용을 포함한다.
(Ⅱ-1) 급성관상동맥증후군의 진단에 사용하기 위한, (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물.
(Ⅱ-2) (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 이용하여 인간 체액 중의 가용형 LOX-1을 측정하는 단계를 포함하는 급성관상동맥증후군의 진단 방법.
(Ⅱ-3) 급성관상동맥증후군의 치료제 또는 이의 후보물질의 약리효과 평가에 사용하기 위한, (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물.
(Ⅱ-4) 급성관상동맥증후군의 치료제 또는 이의 후보물질이 투여된 인간의 체액을 대상으로, (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물 이용하여 상기 인간 체액중의 가용형 LOX-1을 측정하는 단계를 포함하는 급성관상동맥증후군의 치료제 또는 이의 후보물질의 약리효과의 평가방법.
(Ⅲ) 하이브리도마 ( hybridoma ) 및 그 제조 방법
(Ⅲ-1) (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma).
(Ⅲ-2) 인간 LOX-1 세포외 도메인의 가용형 단편과 CHO 세포주에서 유래한 가용형 LOX-1과의 길항적 결합을 스크리닝하기 위한 표지물로서 제조된, (Ⅲ-1)에 기재된 하이브리도마(hybridoma).
(Ⅲ-3) 「마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 1A7」(기탁 번호：FERM　BP-10645) 또는 「마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 6B11」(기탁 번호：FERM　BP-10646)인 (Ⅲ-2)기재의 하이브리도마.
(Ⅲ-4)
1) 인간을 제외한 동물에 원핵세포 유래의 인간 LOX-1 세포외 도메인을 면역시키는 단계;
2) 상기 동물로부터 항체를 생산하는 세포를 회수하는 단계;
3) 상기 항체를 생산하는 세포를 골수종 세포(myeloma cells)와 융합하는 단계;
4) 상기에서 수득한 융합 세포로부터 인간 LOX-1 세포외 도메인과 반응하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 선별하는 단계; 및
5) 상기에서 선별한 하이브리도마(hybridoma)로부터 진핵세포 유래의 인간 LOX-1 세포외 도메인과 반응하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 선별하는 단계를 포함하는 (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)의 제조 방법.
(Ⅲ-5) (Ⅲ-4)에 기재되는 방법에 따라 제조된 하이브리도마(hybridoma).
(Ⅲ-6) (Ⅲ-4)에 기재되는 방법에 따라 제조되는 (Ⅲ-1) 내지 (Ⅲ-3) 중의 하나인 하이브리도마(hybridoma).
(Ⅳ) 인간 가용형 LOX -1 검출용 시약 키트 및 그 용도
(Ⅳ-1) (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 인간 가용형 LOX-1에 대한 특이적 결합 시약 또는 인간 가용형 LOX-1의 특이적 검출 시약으로 포함하는 인간 가용형 LOX-1 검출용 시약 키트.
(Ⅳ-2) 급성관상동맥증후군의 진단 키트로 사용되는 (Ⅳ-1)의 시약 키트.
상기 시약 키트는 「(I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 포함하는 급성관상동맥증후군 진단 키트」로 달리 표현될 수 있다.
(Ⅴ) 인간 가용형 LOX -1의 특이적 검출 방법
(Ⅳ-1) (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 인간 가용형 LOX-1에 대한 특이적 결합 시약 또는 특이적 검출 시약으로서 이용하는 단계를 포함하는 인간 가용형 LOX-1의 특이적 검출 방법.
급성관상동맥증후군의 용태와 관련된 혈액 중의 가용형 LOX-1 양의 증가로부터 상기 검출 방법을 이용하여, 피험자의 급성관상동맥증후군의 용태 유무 및 그 정도를 진단하는 것이 가능하다.
본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물은 인간 가용형 LOX-1을 특이적으로 인식하고, 높은 친화성으로 결합하므로 인간 가용형 LOX-1의 특이적 검출 및 특이적 결합에 유용하다. 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물(또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함한 인간 가용형 LOX-1 검출 시약) 및 이를 이용한 인간 가용형 LOX-1의 특이적 검출법을 이용하여 생체 조직 또는 생체 시료에 있어서의 가용형 LOX-1의 발현 여부나 분포를 면역화학적으로 조사할 수가 있어 가용형 LOX-1의 생리학적 작용 및 의의를 보다 상세하게 해명하는 것이 가능해진다. 또, 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물(또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함한 인간 가용형 LOX-1 검출 시약) 및 그것을 이용한 인간 가용형 LOX-1의 특이적 검출법을 이용하여 LOX-1의 발현(발현 증가, 발현 부전/감소)에 관련해 생기는 여러 가지의 질환이나 병의 용태를 면역화학적 또는 면역조직학적으로 진단하는 것이 가능해진다. 이러한 질환 또는 병의 용태로서는, LOX-1의 발현 증가를 수반하는(또는 발현 증가에 기인하는) 질환 또는 병의 용태, 예를 들면 동맥 경화 및 그것이 보다 진전된 심혈관질환(허혈성 심질환, 심부전), 즉, 급성관상동맥증후군을 들 수 있다.
*특히, 본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명에서 수득한 2종류의 단일 클론 항체를 이용하여 2-사이트 샌드위치 ELISA를 수행한 결과, 인간 혈청 1 ㎖에서 약 0.1 ng/㎖의 정량 한계로 인간 가용형 LOX-1의 혈중농도를 측정할 수가 있다. 이러한 측정 감도는 종래의 측정 방법보다 약 10배 높은 것이다.
I. 단일 클론 항체 및 이의 제조방법
이하, 본 발명에 사용된 각종 용어의 의미를 명확히 함으로써, 본 발명의 단일 클론 항체 및 그 제조 방법을 상세히 설명한다.
본 발명에서 "LOX-1"은 포유동물에서 유래한 산화 LDL (Oxidized low density lipoprotein)의 수용체이다. 상기 포유동물은 인간, 소, 염소, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터 및 몰모트 등 일 수 있으나, 바람직하게는 인간, 소, 토끼, 래트 또는 마우스이다(Nature, Vo. 386, p73-77, 1997: Shishitsu Seikagaku Kenkyu, Vol. 39, p.83-84, 1997; 특개 평9-98787 ; GenBank Accession No.BAA81912; Biochem. J., Vol.330 (Pt3), p.1417-1422, 1998). 구체적으로, 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 인간 LOX-1 이다.
LOX-1은 당 사슬이 부착된 약 50 kDa의 Ⅱ형 막단백질로서, N-말단부터 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 도메인으로 이루어져 있고, 이 중 세포외 도메인은 넥 도메인(neck domain)과 크레아틴 유사 도메인(creatine-like domain)의 2개의 도메인으로 이루어져 총 4개의 도메인으로 구성된다. 상기 4개 도메인 중에서, 크레아틴(creatine) 도메인이 산화 LDL의 인지 부위 역할을 하고 있다(Tatsuya Sawamura, Rinsho Kensa (Clinical Testing) vol. 445, No. 3, p297). 인간 LOX-1(서열 번호 1)의 경우, 구체적으로는, 그 아미노산 1-36 영역이 세포내 도메인, 아미노산 37-57 영역이 막관통 도메인, 아미노산 58-273 영역이 세포외 도메인에 해당한다.
또한, 본 발명에서 "LOX-1 세포외 도메인"이란, 상기에서 기술한 LOX-1의 전체 구조 가운데 "세포외 도메인"의 전부 또는 그 일부를 의미한다. 구체적으로는, 막관통 단백인 LOX-1에 대하여, 세포막의 외부 측에 존재하는 부분의 구조부분영역의 전부 또는 일부를 의미한다. 다시 말해, "LOX-1 세포외 도메인"이란, 막내에 존재하는 막관통 도메인 및 상기 도메인에 연결되어 세포질 내에 존재하는 세포내 도메인을 제외한 영역의 전부 또는 일부를 의미한다. 인간 LOX-1(서열 번호 1)의 경우, 그 아미노산 서열의 58-273의 영역이 "LOX-1 세포외 도메인"의 전부에 해당한다.
또한, 본 발명에서 "인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부"란 "LOX-1 세포외 도메인"의 일부를 가리키며, 인간 LOX-1의 아미노산 서열(서열 번호 1)의 85-273 영역(서열 번호 2) 및/또는 "가용형 LOX-1" 등 가용성을 나타내는 부분 영역일 수 있다.
또한, 본 발명에서 "가용형 LOX-1"이란, 막중에 존재하는 LOX-1의 일부(보통 "세포외 도메인"의 일부)가 절단 되어 혈액 내에 방출된 LOX-1의 일부를 의미한다.
보다 구체적으로는, 인간 가용형 LOX-1은 인간 LOX-1의 세포외 도메인의 일부인 가용형(soluble) 수용체이다. 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부에 해당하는 가용형 수용체는 인간 LOX-1의 아미노산 서열(서열 번호 1)의 88-273 영역(서열 번호 3)으로 기재되는 분자 또는 상기 아미노산 서열(서열 번호 1)의 92-273 영역(서열 번호 4)으로 기재되는 분자일 수 있다. 또, 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부에 해당하는 분자로는 인간 LOX-1 세포외 도메인의 N-말단 측에 위치하는 펩티드가 포함된다. 구체적으로, 상기 펩티드는 가용형 분자의 아미노산 서열(서열 번호 3)의 1-10 영역에 해당하는 펩티드(서열 번호 5) 및 가용형 분자의 아미노산 서열(서열 번호 4)의 1-10 영역에 해당하는 펩티드(서열 번호 6)일 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 인간 LOX-1의 아미노산 서열(서열 번호 1)의 각각 88-97 영역 및 92-101 영역에 해당한다.
또한, 본 발명에서 "단일 클론 항체"란, 상기에서 기술한 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체이다. 인간 혈액 중에는 LOX-1의 일부가 절단되어 생성되는 가용형 LOX-1(서열 번호 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열)이 존재하고 있는데, 그 양은 급성관상동맥증후군의 진전과 수반하여 증가하므로, 상기 가용형 LOX-1은 급성관상동맥증후군, 구체적으로는 동맥 경화 또는 이에 기인하여 발병하는 허혈성 심장질환의 병의 용태를 알 수 있는 진단 지표로 여겨지고 있다(Hayashida et al, Circulation, 2005, 1 12 (6), 812-8).
바람직하게는, 상기 "단일 클론 항체"는 서열 번호 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 인간 가용형 LOX-1에 대해서 높은 친화성을 가지는 항체이다.
또한, 본 발명의 인간 가용형 LOX-1에 대해서 특이적 결합성을 가지는 단일 클론 항체는 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부(천연 상태, 조작된 상태, 합성된 상태, 세포 배양 상청액을 포함한다)를 면역원으로 이용하여 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 우선 면역원으로서 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부(필요에 따라서 후로인트 아주반트(Freund adjutant)와 함께)를 인간을 제외한 포유동물의 피하, 근육, 정맥, 발볼록살 또는 복강 내에 1회 내지 그 이상 주사하는 것으로써 면역 감작을 시킨다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말 또는 소(인간 항체를 생산하는 형질 전환(transgenic) 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 조작된 형질 전환(transgenic) 동물을 포함한다)이며, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트 또는 토끼이다. 첫 번째 면역으로부터 약 1~21일 마다 1~4회 면역을 실시하여, 최종 면역으로부터 약 1~10일 후에 면역 감작 된 포유동물로부터 항체 생산하는 세포를 수득할 수 있다. 면역을 시키는 회수 및 시간적 간격은 사용하는 면역원의 특징 등에 의하여 적당히 변경할 수 있다.
또한, 표준 물질, 면역원(합텐) 및 스크리닝에 사용되는 "인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부"로서, 하기 예들이 예시될 수 있다. 또한, 하기예들은 인간 가용형 LOX-1 세포외 도메인의 일부를 고농도로 함유한 분획에 적용할 수 있다:
1) 인간 LOX-1을 세포 표면에 발현하는 세포 또는 세포 표면에 발현하도록 인공적으로 제조한 세포주 또는 인간 LOX-1을 세포 표면에 발현하도록 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조한 세포주를 배양하여 얻은 배양 상청액 또는 상기 배양 상청액으로부터 정제된 인간 가용형 LOX-1；
2) 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부를 발현하도록 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작한 세포주를 배양하여 얻은 배양 상청액 또는 상기 배양 상청액으로부터 정제된 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부； 및
3) 화학적으로 합성된 인간 LOX-1 세포외 도메인의 N-말단 영역.
구체적으로 상기 인간 가용형 LOX-1으로 세포의 배양 중 분비되는 인간 가용형 LOX-1일 수 있다. 상기 배양 중 분비된 인간 가용형 LOX-1은 천연의 인간 가용형 LOX-1에 가장 가깝다. 상기 인간 가용형 LOX-1은 실시예 1-2에서 기재하는 방법과 같이 유전공학적으로 제조할 수 있다 (특개 2002-17353호 공보 등 참조).
인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부 영역은 인간 LOX-1 세포외 도메인(서열 번호 1의 아미노산 서열 58-273 영역)의 일부(예를 들면, 서열 번호 2)일 수 있다. 상기 일부 영역은 실시예 1-1에 기재하는 방법과 같이 유전공학적으로 제조할 수 있다.
또한, 인간 LOX-1 세포외 도메인의 N-말단 영역은 서열 번호 5 또는 6에 기재하는 아미노산 서열을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드를 면역원으로서 사용하는 경우, 소혈청알부민(BSA)등의 고분자와 결합시킬 필요가 있다.
본 발명에 사용되는 면역원으로서는 바람직하게는, 대장균 등의 원핵세포 유래의 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부이다.
단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma)의 제조는 케이라 및 미르슈타인 등의 방법(Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) 및 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기와 같이 면역 감작된 인간을 제외한 동물로부터 채취한 비장, 림프절, 골수 또는 편도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체 생산하는 세포와 자가 항체 생산 능력이 없는 포유동물 유래의 골수종 세포(myeloma cells)를 세포 융합 시키는 것에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 제조할 수 있다. 상기 포유동물은 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼 또는 인간일 수 있고, 바람직하게는 마우스, 래트 또는 인간일 수 있다.
또한, 상기 세포 융합에 이용되는 골수종 세포(myeloma cells)로서는 마우스 유래 골수종 P3/X63-AG8. 653(653), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8. U1(P3U1), SP2/0-Ag14(Sp2/O, Sp2), PAI, F0 또는 BW5147; 래트 유래 골수종 210 RCY3-Ag. 2. 3; 또는 인간 유래 골수종 U-266 AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 또는 CEM-T15를 사용할 수 있다.
상기 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 스크리닝하는 방법은 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등에서 하이브리도마를 배양한 후, 위에서 기술한 인간을 제외한 동물의 면역반응에 사용한 면역원(상기 1)~3) 중 어느 하나, 바람직하게는 2)에서 설명한 방법으로 준비된 원핵세포에서 유래한 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부)과 배양 상청액과의 반응성이 증가된 부분을 RIA (radioactⅣe substance-marked immuno antibody) 또는 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)같은 면역분석방법을 통하여 찾는 방법을 통해 수행할 수 있다. 그리고 상기에서 찾은 단일 클론 항체를 생산하는 클론은 상기 면역원에 대하여 특이적인 결합력을 보여준다. 이 방법에서는 효소로 표지된 2차 항체를 사용하여 배양 상청액을 고체화 면역원과 결합시켜 항체를 검출하는 비경쟁적 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법을 주로 사용한다. 그러나 이러한 비경쟁적 방법은 비특이적 결합 역시 검출하기 때문에 특이적으로 결합하는 항체만을 검출한다고 하기는 힘들다. 더욱이, 일반적으로, 대장균에서 발현시켰을 때, 항체의 3차 구조는 천연의 상태와 다르다. 인간 LOX-1의 세포외 도메인을 제외하더라도, 그러한 문제는 종종 항체의 응집을 야기하고, 이렇게 응집된 항체의 현탁액과 상청액은 면역원으로 작용한다. 이러한 경우, 천연의 가용형 LOX-1에 대한 항체와 다른, 침전 등 변성단백질에 결합하는 많은 항체들이 생길 수 있다.
이에, 본 발명자는 하기와 같은 실험을 단계적으로 실시하였다. 그 결과, 천연형의 인간 가용형 LOX-1에 매우 높은 친화성으로 결합하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다.
1) 고체화 2차 항체에 하이브리도마(hybridoma)의 배양 상청액을 결합시킨 후, 원핵세포에서 유래한 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부를 첨가한 다음, 비오틴(biotin)으로 표지된 인간 가용형 LOX-1과 경쟁적 결합 반응을 통하여 원핵세포 유래의 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부와 반응하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별한다.
2) 상기 단계 1)에서 선별된 하이브리도마(hybridoma)의 배양 상청액에 포함된 항체를 고정시킨 2차 항체와 결합시킨 후, 진핵세포 유래의 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부와 비오틴으로 표지된 인간 가용형 LOX-1을 경쟁적 결합 반응 시켜 진핵세포 유래의 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부와 반응하는 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 선별한다.
하이브리도마에서 단일 클론 항체를 제조하는 방법은 인비트로(in vitro)로 하이브리도마를 배양하여 상청액을 얻는 방법과 인간을 제외한 동물의 복수(腹水) 등에서 배양하여 그 복수를 분리하는 방법이 있다. 상기 인간을 제외한 동물은 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터 및 토끼로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 포유동물일 수 있다. 바람직하게는 마우스 또는 래트일 수 있고, 보다 바람직하게는 마우스일 수 있다. 인비트로(in vitro)로 배양하는 경우, 배양하는 세포종의 특성, 연구의 목적 및 배양 방법 등의 여러 가지 조건에 맞추어 통상 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시켜 배양 상청액으로 단일 클론 항체를 분비시키기 위해 이용되는 영양 배지 또는 기본 배지를 이용할 수 있다.
상기 기본 배지는 Ham´F12 배지, MCDB153 배지 또는 저칼슘 MEM 배지등의 저칼슘 배지 및 MCDB104 배지, MEM 배지, D-MEM 배지, RPMI1640 배지, ASF104 배지 또는 RD배지 등의 고칼슘 배지 등일 수 있으며, 목적에 따라 혈청, 호르몬, 사이토카인 및/또는 여러 가지 무기물 또는 유기물 등을 함유 할 수 있다. 단일 클론 항체의 분리, 정제는 상기의 배양 상청액 또는 복수를 포화 황산암모늄 이온 교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항면역글로불린 컬럼(column) 또는 A 단백질 컬럼(column) 등의 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography) 등으로 실시할 수 있다.
본 발명의 단일 클론 항체는, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA(IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단일 클론 항체일 수 있다. 바람직하게는, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 보다 바람직하게는, IgG1 또는 IgG2이며, 더욱 바람직하게는 IgG1이다.
본 발명에서 "단일 클론 항체의 일부"는 상기 단일 클론 항체의 일부 일 수 있으며, 상기 단일 클론 항체와 같이 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합성을 가지는 영역을 의미한다(이하, 이것을 간단히 "항체 단편"이라고 칭한다).
구체적으로, 상기 항체 단편으로는 상기의 인간 가용형 LOX-1에 대해서 특이적 결합성을 가지는 Fab (fragment　of　antigen　binding), F(ab´)2, Fab', 단일 사슬 항체(single　chain　Fv, scFv), 디아바디(diabody) V영역 단편(Diabody), 이황화물 안정화 항체(disulfide　stabilized　Fv, dsFv), dAd(single　domain　antibody), 상보성결정지역(complementarity determining region, CDR)을 포함하는 펩티드 등일 수 있다(Expert Opinion on Therapeutic Patents. Vol. 6, No. 5, p441~456, 1996).
상기 Fab는 H-사슬의 N-말단의 반쪽과 L-사슬 전체로 구성되며, 분자량 약 5만 달톤(Da)의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. 상기 Fab는 IgG의 힌지(hinge) 영역에서 2개의 H-사슬을 연결시키는 2개의 이황화 결합 (S-S결합)의 상부의 펩티드 부분을 프로테아제인 파파인으로 절단하여 제조할 수 있다. 또는, 상기 단일 클론 항체의 Fab를 코딩(coding)하는 DNA를 동물세포용 발현 벡터에 삽입한 후, 상기 발현벡터를 동물세포에 형질 도입하여 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 F(ab´)2는 2개의 Fab´영역이 힌지(hinge) 부분에서 결합하여 만들어지는 분자량 약 10만 달톤(Da)의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. 상기 F(ab´)2는 IgG의 힌지(hinge) 영역의 2개의 S-S결합의 아랫부분을 프로테아제인 펩신으로 분해하는 것에 의해 제조할 수 있다. 또한, 상기 단일 클론 항체의 F(ab´)2를 코딩(coding)하는 DNA를 동물세포용 발현 벡터에 삽입한 후, 상기 발현벡터를 동물세포에 형질 도입하여 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 Fab'는 상기 F(ab´)2의 힌지(hinge) 부위에 있는 S-S결합을 절단한 약 5만 달톤(Da)의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. Fab'는 단일 클론 항체의 F(ab´)2를 환원제 다이티오스레오이톨(dithiothreoitol)로 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 상기 단일 클론 항체의 Fab'를 코딩(coding)하는 DNA를 동물세포용 발현 벡터에 삽입한 후, 상기 발현벡터를 동물세포에 형질 도입하여 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 scFv는 한 개의 VH (heavy chain variable domain)와 한 개의 VL (light chain variable domain)를 적당한 펩티드 링커(peptide linker, P)를 이용하여 연결한 VH-P-VL 또는 VL-P-VH 폴리펩티드로서, 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. 상기의 단일 클론 항체의 VH 및 VL은 모두 본 발명의 scFv에 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용한 scFv는 본 발명의 단일 클론 항체를 발현하는 하이브리도마의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 포함하는 scFv 발현 벡터를 제작한 후, 대장균, 효모 또는 동물세포에 형질 도입하여 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 dsFv는 VH 및 VL 내의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인으로 치환한 폴리펩티드를 S-S결합으로 연결시킨 것을 말한다. 시스테인으로 치환된 아미노산잔기는 레이터(Reiter) 등에 의해 제시된 방법 (Protein Engineering, 7, 697 (1994))에 따라, 예상되는 항체의 입체 구조에 근거하여 선택할 수 있다. 본 발명의 dsFv에 포함되는 VH 또는 VL는 본 발명의 단일 클론 항체로부터 유래된 것이면 모두 가능하다. 본 발명의 dsFv는 본 발명의 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)의 VH 및 VL를 코딩(coding)하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입한 뒤, dsFv 발현 벡터를 제작하여 대장균, 효모 또는 동물세포에 형질 도입하여 발현시키는 방법으로 제조할 수 있다.
디아바디(diabody)는 항원 결합 특이성이 같거나 다른 두 개의 scFv가 형성한 항체 단편으로, 같은 항원에 대한 두 가지 항원 결합 활성 또는 다른 항원에 대한 특이적인 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. 예를 들면, 본 발명의 항원에 특이적으로 반응하는 두 가지 항원 결합 활성을 가지는 디아바디(diabody)는 본 발명의 단일 클론 항체의 VH 및 VL를 코딩(coding)하는 cDNA를 취득하여 3~10 잔기의 펩티드 링커를 가지는 scFv를 코딩(coding)하는 DNA를 제작한 후, 상기 DNA를 동물세포용 발현 벡터에 삽입하여, 상기 발현 벡터를 동물세포에 형질 도입하여 발현시키는 방법으로 제조할 수 있다.
CDR을 포함하는 펩티드는 VH 또는 VL의 CDR 중 적어도 1 영역 이상을 포함한다. 2개 이상의 CDR는 직접 또는 적당한 펩티드 링커로 연결하여 결합시킬 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 CDR를 포함하는 펩티드는 본 발명의 단일 클론 항체의 VH 및 VL를 코딩(coding)하는 cDNA를 취득한 후, CDR를 코딩(coding)하는 DNA를 제조하여, 상기 DNA를 동물세포용 발현 벡터에 삽입한 다음, 상기 발현 벡터를 동물세포에 형질 도입하여 발현시키는 방법으로 제조할 수 있다. 또한, CDR를 포함하는 펩티드는 Fmoc 방법(flourenyl methyl-oxycarbonyl method), tBoc 방법(t-butyl oxycarbonyl method) 등의 화학 합성법에 따라 제조할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 "단일 클론 항체의 일부"는 본 발명의 단일 클론 항체(IgG)에 펩신을 처리하여 얻은 F(ab´)2이다.
단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물의 항원에 대한 친화성을 나타내는 지표로서 이용되는 해리 상수(Kd)는 여러 가지의 방법에 따라 해석할 수 있다. 예를 들어, 각종 표지제로 표지 한 항원을 이용한 스캐차드(Scatchard) 법이나, 시판의 측정 키트인 비아코어X (BiacoreX, Amersham Biosciences) 또는 이와 유사한 키트를 이용하여 용이하게 해석할 수 있다. 이러한 방법을 이용해 구할 수 있는 Kd 값은 M (몰) 단위로 나타내어진다. 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물은 인간 가용형 LOX-1과의 해리 상수(Kd)가 낮으므로 강한 친화성을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부는 인간 가용형 LOX-1과의 해리 상수(Kd)가 1× 10-9 M 이하, 바람직하게는 5× 10-10 M 이하, 보다 바람직하게는 2× 10-10 M 이하인 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합하는 인간 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물이다.
본 발명이 대상으로 하는 단일 클론 항체, 이의 일부는 해리 상수가 1× 10-9 M 이하의 인간 가용형 LOX-1에 대한 친화성이 매우 높으므로, 종래로는 달성할 수 없었던 인간 가용형 LOX-1의 고감도의 검출 및 정량이 가능하다. 특히, 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부를 사용하여 정상인의 경우 혈청 중의 가용형 LOX-1의 농도가 너무 낮아 종래의 측정 방법에서는 정확한 측정이 불가능했던 문제를 극복할 수 있다.
한편, 유사한 면역원을 이용한 단일 클론 항체에 대한 보고가 있었지만(WO01/64862), 이는 치료를 목적으로 한 인간형 항체이며, 개시된 모든 단일 클론 항체의 해리 상수가 1× 10-8 M 보다 큰 값을 가지고 있어 정상인 또는 만성기와 같은 혈청 중의 가용형 LOX-1의 농도가 낮은 피험자를 측정하는 경우에 낮은 감도의 문제점 때문에 진단 마커로서의 목적은 달성할 수 없었다.(실시예 <5-9> 참조).
상기 본 발명이 대상으로 하는 단일 클론 항체는 본 발명의 구체적인 실시예의 단일 클론 항체 중 하이브리도마(hybridoma) 6B11 또는 1A7로부터 생산되는 단일 클론 항체이다.
이러한 하이브리도마(hybridoma) 6B11 및 1A7로부터 생산되는 각 단일 클론 항체의 "해리 상수(Kd)"를 표 1과 같이 나타낸다.
단일 클론 항체 Kd(× 10-10M)
1A7 5.1
6B11 3.4
상기 하이브리도마(hybridoma) 6B11 및 1A7은 각각 "마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 1A7" 및 "마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 6B11"로서, 2006년 7월 26일부로 일본 이바라키현의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 국제 기탁하였으며, 각 하이브리도마(hybridoma)의 수령 번호 및 기탁 번호를 표 2에 나타내었다.
하이브리도마 표시 수령번호 수탁번호
마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 1A7 FERM ABP-10645 FERM BP-10645
마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 6B11 FERM ABP-10646 FERM BP-10646
Ⅱ. 가용형 LOX -1 검출용 시약 키트 및 이를 이용한 가용형 LOX -1 특이적 검출 방법
전술한 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부(항체 단편)는 인간 가용형 LOX-1과 높은 친화성을 가지고 특이적으로 결합한다.
이에, 본 발명의 단일 클론 항체 또는 항체 단편은 면역 측정법을 이용하여, 인간 가용형 LOX-1을 선택적, 특이적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일 클론 항체 또는 항체 단편은, 인간 가용형 LOX-1의 조직학적 위치나 그 발현의 정도를 조사하거나 시료 중에 존재하는 인간 가용형 LOX-1을 검출 또는 정량하기 위한 면역학적 시약(면역 전기영동용 시약이나 면역 측정용 시약 등)으로 유효하게 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 단일 클론 항체 또는 항체 단편은 면역 전기영동법 또는 면역 측정법을 이용하여 인간 가용형 LOX-1을 검출하여 측정할 시, 인간 가용형 LOX-1에 대한 특이적 결합 시약 또는 특이적 검출 시약(면역학적 시약)으로 유효하게 사용할 수 있다. 상기 면역 측정법의 예로서는 직접 또는 간접의 경합 분석방법 또는 비경합 분석방법(샌드위치법 등)을 들 수 있다. 또한, 면역 전기영동법 또는 면역 측정법에는 웨스턴 블롯법, 형광 항체법, 면역 효소 항체법(ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)), 방사성 물질 표지 면역 항체법(RIA (radioactⅣe substance-marked immuno antibody)법), 면역조직 염색법이나 면역 세포 염색법등의 면역조직화학 염색법(ABC법, CSA법 등), 면역 침강법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 시행할 수 있다(Tan Kuron Kotai Jikken Manual (Monoclonal Antibody Testing Manual), Kodansha Scientific (1987); Zoku Seikagaku Jikken Kouza 5 (Continuing Lectures in Biochemistry Experiments 5); Meneki Seikagaku Kenkyu kai (Immunobiochemistry Research Society) (Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd. (1986), etc.)).
본 발명은 인간 가용형 LOX-1을 면역 전기영동법 또는 면역 측정법을 이용하여 특이적으로 검출 또는 측정하기 위한 시약 키트를 제공한다. 더욱 상세하게는 시료 중의 인간 가용형 LOX-1의 존재 또는 그 양을 항원-항체 반응을 이용하여 검출측정하기 위한 시약 키트이며, 단계 Ⅰ에서 기술한 본 발명의 단일 클론 항체 또는 항체 단편을 인간 가용형 LOX-1에 대한 특이적 결합 시약 성분 또는 특이적 검출 시약 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 단일 클론 항체 또는 항체 단편을 대신하여 인간 가용형 LOX-1에 대한 특이적 결합을 가지는 일부(항체 단편)를 이용할 수도 있다.
본 발명의 단일 클론 항체 또는 이의 일부(항체 단편)는 면역 측정용의 시약으로서 그대로 사용하거나, 고체 지지체에 결합한 형태로 사용할 수 있다. 여기서 이러한 단일 클론 항체 또는 항체 단편을 결합시키는 고체 지지체로서는 유리(glass), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 덱스트란(dextrane), 나일론(nylon), 아밀라아제(amylase), 천연/변성 셀룰로오스(natural/variant cellulose), 폴리 아크릴 아마이드(polyacryl amide), 한천(agar) 및 마그네타이트(magnetite)를 이용할 수 있다. 나아가, 이러한 고체지지체는 반응 접시의 웰(well), 시험관, 폴리스티렌 비즈(polystyrene tweezers), 마그네틱 비즈(magnetic tweezers), 니트로셀룰로스 스트립(nitrocellulose strips), 막(membranes) 및 라텍스 입자(latex granules) 등의 당업계에서 주지의 것을 임의로 사용할 수 있다. 이러한 고체 지지체에의 단일 클론 항체 또는 항체 단편을 고정시키는 방법도 당업계의 공지의 방법으로 수행할 수 있다.
또 본 발명의 단일 클론 항체 또는 항체 단편은 면역 전기영동용 및 면역 측정용 등의 면역학적 시약으로서 자연 상태 또는 임의의 표지제로 표지된 표지물의 형태로 사용할 수 있다. 본 발명에 사용가능한 표지제로서는 당업계에 공지된 효소(예를 들면, ALP (alkaline phosphatase), 퍼옥시다제(HRP) 등); 방사성동위체(예를 들면, 125I, 3H, 14C 등); 형광성 화합물(예를 들면, FITC(flouricene isothionate), RITC(tetra methyl rhodamine iso-thio cyanate) 등); 화학 발광성 화합물; 및 생물 발광성 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 표지제를 이용하는 면역 측정법은 EIA (enzyme immunoassay), ELISA (enzyme immunometricassay), RIA(radio immunoassay), 형광 면역 분석법(fluorescent immunoassay) 및 발광 면역 분석법(luminous immunoassay) 등이 있다.
바람직하게는 효소를 표지제로서 사용하는 면역 측정법(EIA, ELISA)이며, 상세하게는 상기 효소로서 ALP (alkaline phosphatase), 검출용의 발색 기질로서 화학 발광 기질 APS-5(phosphoric acid mono-[(4-chloro-phenylsulfanyl)-(10-methyl-10H-acridin-9-ylidene)-methyl] ester disodium salt(Lumigen APS-5, 오리엔탈 효모))를 이용한 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)법이나 효소로서 퍼옥시다제(peroxidase, HRP), 검출용의 발색 기질로서 비색 기질 테트라메틸벤디진색 현상액(tetramethylbendizine color developer)을 이용한 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)법이다.
본 발명의 인간 가용형 LOX-1 검출용 시약 키트는 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합하는 2개의 단일 클론 항체를 이용한 샌드위치 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)용의 시약 키트이다. 상기 시약 키트에는 고체 지지체에 고정화되는 본 발명의 단일 클론 항체 또는 그 일부, 상기의 표지제로 표지 되는 본 발명의 단일 클론 항체 또는 그 일부 및 상기 표지제와 반응해 발색, 발형광 또는 발광하는 기질이 포함된다. 키트에 포함되는 표지제로서 바람직하게는 ALP (alkaline phosphatase)일 수 있고, 또한, 기질로서 바람직하게는 APS-5일 수 있다. 샌드위치 ELISA 방법을 통해서 보다 높은 감도로 가용형 LOX-1을 검출할 수 있다.
또한, 이러한 표지 시약을 통한 표지 방법과 간접적 표지를 통한 수식 방법 및 검출방법 등은 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다("Tan Kuron Koutai" (Monoclonal Antibodies) Auth. Tetsuo Iwasaki, et al, Kodansha Scientific, 1984; "Koso Meneki Sokuteiho"(Enzyme Immunoassay Methods) Vol. 2, Auth. EiJi Ishikawa, et al, Igaku Shyoin, 1982)).
또한, 본 발명의 시약 키트는 상기 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물 외에, 면역 전기영동법 또는 면역 측정법 등 그 용도에 필요한 적당한 반응 용액, 희석 용액, 세정 용액, 인간 가용형 LOX-1의 표준 용액, 전사 용액, 영동 용액, 반응 정지 용액, 항체 검출 시약, 표지 활성 측정 시약, 염색 용액, 반응 플레이트, 니트로셀루로스 필터(nitrocellulose filters), 폴리아크릴 아마이드 겔(polyacryl amide gels)등을 포함할 수 있다. 상기 항체 검출 시약은 본 발명의 단일 클론 항체와 결합하는 방사성 물질이나 효소 등으로 표지 한 항IgG 항체나 프로테인 A 등의 2차 항체일 수 있다.
결합 또는 검출 시약으로 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 포함한 상기 시약 키트를 이용하여, 통상적인 면역 전기영동법 및 면역 측정법에 따라 인간 가용형 LOX-1을 간편하고 특이적이며 고감도로 검출 및 측정할 수 있다.
이에, 본 발명은 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 인간 가용형 LOX-1에 대한 특이적 결합 시약 또는 특이적 검출 시약으로서 이용하는 것을 특징으로 하는 인간 가용형 LOX-1의 특이적 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 측정 방법은 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 인간 가용형 LOX-1에 대한 특이적 결합 시약 또는 특이적 검출 시약으로서 사용하는 것을 특징으로 하며, 다른 기본적 조작 등은 특히 제한되는 일 없이 통상의 면역 전기영동법 또는 면역 측정법을 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 이용한 항원-항체 반응 및 생성된 항원-항체 결합물과 항체 검출 시약과의 반응 조건은 특별히 제한하지 않고, 통상의 면역 반응에 있어서의 조건이면 모두 가능하다. 통상, 45℃ 이하, 바람직하게는 약 4~40℃, 보다 바람직하게는 25~40℃ 정도의 온도 조건 하에서, pH는 약 5~9 정도아래에서, 약 0.5~40시간, 바람직하게는 1~20시간 정도 배양(incubation)하는 방법을 사용한다.
본 발명의 인간 가용형 LOX-1의 측정법은 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합하는 2개의 단일 클론 항체를 이용한 샌드위치 ELISA법이다(2-사이트 샌드위치 ELISA법). 상기 방법은 인간 가용형 LOX-1에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물이 고정화된 고체 지지체(고체화 항체)와 피험시료 및 인간 가용형 LOX-1의 표준액(항원)을 결합시킨 후, 표지제로 표지한 본 발명의 단일 클론 항체 또는 그 일부(표지 항체)를 반응시켜 고체화 항체-항원(인간 가용형 LOX-1)-표지 항체의 샌드위치형 복합체가 형성되면, 상기 형성된 복합체를 그 표지제와 기질과의 반응에 의한 발광에 근거해 검출 또는 정량하는 방법이다.
본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물은 인간 가용형 LOX-1을 특이적으로 인식하여 높은 친화성으로 결합하기 때문에 상기 항체를 포함하는 상기 시약 키트를 이용한 인간 가용형 LOX-1 측정법은 피험시료(혈액, 뇨 등)나 각종 조직중의 인간 가용형 LOX-1의 특이적 검출이나 정량, 인간 가용형 LOX-1 발현 조직의 분포 측정 및 친화성을 이용한 인간 가용형 LOX-1의 정제에 이용되는 것 뿐만 아니라, 인간 LOX-1의 발현의 증가를 수반하는(또는 인간 LOX-1 발현의 증가에 기인하는) 여러 가지 질환의 면역화학적 및 면역조직학적 진단에 유용하다.
배경기술에서 기술한 바와 같이, LOX-1은 산화 LDL 수용체로의 기능과 혈관내벽에 밀집된 대식세포가 식작용을 통해 LOX-1을 흡입하여 콜레스테롤 에스테르 세포에 LOX-1이 축적되는 것이 동맥경화증에서의 죽종의 형성에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 또 실제로 동맥 경화의 초기 죽종의 혈관상피세포, 상피 평활근 세포 및 대식세포(macrophages)에는 LOX-1의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다. 이와 같이, 산화 LDL 수용체(LOX-1)를 통하여 산화 LDL이 축적되면, 혈관 내 혈관상피세포의 기능 장해 뿐만 아니라, 상피 평활근 세포의 기능 장해나 대식세포(macrophages)의 거품세포(foam cell)로의 전환에도 관여하는 등 동맥 경화의 진전에 깊게 관계되어 있다. 또한, LOX-1은 그 일부가 세포외 도메인의 막 부근 부위에서 절단되어 혈액 중에서 가용형 분자(가용형 LOX-1)로서 존재한다고 알려져 있다. 이와 같이, 가용형 LOX-1의 혈중농도는 생체 조건(in vⅣo)에서 세포의 LOX-1 발현의 정도를 반영하기 때문에 급성관상동맥증후군의 병의 용태를 반영하는 진단 마커로서 주목받고 있어, LOX-1의 혈중농도를 측정하는 것에 의해 급성관상동맥증후군의 조기진단이 가능할 것으로 생각되고 있다(Medical Tribune, 1999, Vol. 32, No. 31, p6；Circulation, 2005, 112(6), p. 812-818).
그러므로, 상기 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 포함한 시약 키트를 이용한 인간 가용형 LOX-1 측정법을 통하여, 피험자의 혈액 중의 인간 가용형 LOX-1을 측정함으로써, 상기 피험자에 대해 급성관상동맥증후군의 위험 정도를 진단할 수 있다. 특히, 급성관상동맥증후군의 재발의 위험 정도의 진단에도 유효하다(WO 2007/072896).
상기 인간 가용형 LOX-1의 혈중농도는 급성관상동맥증후군의 병의 용태를 반영하는 바이오 마커로 사용할 수 있으며, 상기 농도를 지표로 하여, 급성관상동맥증후군에 대한 치료제의 약리효과를 평가하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 본 발명의 단일 클론 항체, 이의 일부, 또는 이들의 표지물을 포함한 시약 키트를 이용한 인간 가용형 LOX-1 측정법을 사용하여, 급성관상동맥증후군의 임상시험에서 피험자의 혈액 중의 인간 가용형 LOX-1을 측정함으로써 상기 피험자에 대한 치료제의 약리효과를 용이하게 판단할 수 있다. 또한, 상기 인간 가용형 LOX-1 측정법을 통하여, 피험자의 혈액 중의 인간 가용형 LOX-1을 측정함으로써 급성관상동맥증후군의 환자에 대한 치료제의 치료 효과를 용이하게 판단할 수 있다.
도 1은 본 발명의 단일 클론 항체의 스크리닝에 사용한 2-사이트 샌드위치 ELISA (2-site sandwich ELISA)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 sLOX-1-D로 면역한 A/J마우스〔No. 1101(원), No. 1102(삼각형), No. 1103(사각형), No. 1104(마름모)의 항혈청을 이용하여 표준 물질 sLOX-1-D(검은색) 및 CHO 세포 유래 sLOX-1(흰색)을 저해 물질로서 TR-FIA법을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다(실시예 3 참조). 세로축은 각 농도(B)의 형광 강도의 초기 농도(B0)의 형광 강도에 대한 퍼센트를, 가로축은 LOX-1 세포외 도메인 단백질(sLOX-1-D)의 농도 또는 LOX-1 발현 CHO 세포에서의 가용형 LOX-1 (sLOX-1)의 추정 농도(ng/well)를 나타낸다.
도 3은 고정화 항체-표지 항체로서 1A7-6B11 (●), 5C11-1G2 (▲), 4D1-2G11 (■)를 이용한 2-사이트 샌드위치 ELISA의 표준 곡선을 나타낸다. 도 3a는 표준 물질로서 sLOX-1-D를 이용한 ELISA의 표준 곡선을, 도 3b는 표준 물질로서 CHO 세포 유래 sLOX-1을 이용한 ELISA의 표준 곡선을 나타낸다(실시예 5-4 참조). 세로축은 형광 강도(cps)를, 가로축은 각 표준 물질의 첨가 농도(pg/well)를 나타낸다.
도 4는 고정화 항체-표지 항체로서 1A7-6B11를 이용한 2-사이트 샌드위치 ELISA의 각 혈청(인간 혈청◆, 정상 토끼 혈청▲)에 대한 반응을 나타낸다(실시예 5-6 참조). 세로축은 형광 강도(cps)를, 가로축은 혈청의 첨가량(㎕)을 나타낸다.
이와 같은 본 발명은 하기의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 표준 물질의 제조
표준 물질로서 하기와 같은 방법으로(1) 인간 LOX-1 세포외 도메인 및 (2) CHO 세포 유래의 가용형 LOX-1을 제조하였다.
<1-1> LOX-1 세포외 도메인 단백질
인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부를 코딩(coding)하는 서열(서열 번호 2)을 pQE 벡터(Qiagen)에 삽입하여 플라스미드(pQE-hLOX-1)를 제작한 뒤, 상기 플라스미드를 대장균(high-speed conversion E-coli DH5α Nippon Gene, Inc.)에 형질 도입하였다. 이 대장균을 암피실린 나트륨(ampicillin sodium) 100 ㎍/㎖ 및 황산 카나마이신(sulfuric acid kanamycin) 25 ㎍/㎖를 포함한 LB (Luria-Bertani) 배지 50 ㎖로 하룻밤 배양하여 스타터(starter)를 만든 다음, 이것을 1 L의 LB 배지로 옮긴 후, 0.5 ㏖/L IPTG (Isopropyl β-D-Thiogalactoside)를 첨가하여 4시간 배양하였다.
배지를 원심분리(8000 min-1, 10분)하여 얻은 대장균을 프로테아제 억제 칵테일(Protease inhibitor cocktail, Sigma) 0.5 ㎖ 및 리소자임(lysozyme) 20 mg를 포함한 완충액 A(1 mM EDTA를 포함하는 0. 05 M Tris-Cl 완충액, pH 8.0) 10 ㎖에 현탁시켜 얼음상태에서 1시간 방치하였다. 그 후, 초음파 처리(1 분간으로 10회)로 파쇄한 뒤, 원심분리(9000 min-1, 15 분간)하여 침전을 모았다. 이 침전물을 완충액 B(8 M urea, 0.1 M NaH2PO4·2H2O를 포함한 0.01 M Tris-Cl 버퍼, pH 8 0) 8 ㎖에 용해한 다음, 이것에 Ni-NTA 아가로즈 겔(Qiagen) 8 ㎖를 더하여 실온으로 1시간동안 혼합시켜주었다. 상기 침전물과 겔을 빈 컬럼(column)(1.1 id × 13 ㎝)으로 옮겨서, 20 m㏖/L 이미다졸(imidazol)을 포함한 완충액 B로 충분히 세정한 후, 250 m㏖/L 이미다졸(imidazol)을 포함한 완충액 B로 LOX-1 세포외 도메인 단백질(sLOX-1-D)을 용출하였다. 상기 단백질의 용출 분획을 0.05 ㏖/L 인산염 완충액(phosphate buffering solution, PBS)(pH 9.0)으로 투석하였다. 상기 투석을 실시할 때, urea 농도를 4, 2, 1, 및 0 ㏖/L 로 단계적으로 희석하여 단백질을 재접힘(refolding)시켜 주었다.
투석에 의해 전체의 90% 이상이 침전되어, 최종적으로 인간 LOX-1 세포외 도메인 단백질의 가용성 분획(sLOX-1-D)을 2.4 mg/15 ㎖ 수득하였다. 수득한 sLOX-1-D를 SDS-PAGE로 확인한 결과, 1개의 밴드만 나타났으며, 단일의 sLOX-1-D만 존재하는 것을 확인하였다.
<1-2> CHO 세포 유래의 가용형 LOX-1
인간 LOX-1를 발현하는 CHO 세포주의 배양 상청액 중에 분비되는 sLOX-1은 천연의 인간 가용형 LOX-1과 가장 가까운 형태이다. 상기 배양 상청액 중의 인간 LOX-1을 코딩(coding)하는 cDNA를 pVP22/myc-his 벡터(invitrogen)에 삽입하여 pVP22/myc-his-LOX-1 발현 벡터를 제작한 후, 상기 발현 벡터를 CHO 세포주에 형질 전환하여 안정세포(stable cell)(인간 LOX-1 (C-myc-His tag 포함) 발현 CHO 세포주)를 만들었다. 이 인간 LOX-1 (C-myc-His tag 포함) 발현 CHO 세포주를 20 ㎖의 배양액(10 vol% FCS (Fetal Calf Serum) 및 0.04 g/dL G-418을 포함하는 Ham´s F-12 배지)을 넣은 배양 플라스크(80 ㎝2)로 배양(37℃, 5% CO2)한 다음, 하기의 방법에 따라 계대 배양을 실시하였다.
우선, 배양 플라스크를 3~4일 마다 배지 교환하여 주고, 세포가 밀집되었을 때, 트립신(trypsin) EDTA를 처리하고 나서, 몇 개의 배양 플라스크로 나누어 옮겨 계대 배양 하였다. 또한, 세포의 일부는 동결 보관하고, 다른 일부는 확대 배양에 이용하였다. 확대 배양에는 세포 약 5× 106 개를 넣은 3층 배양 플라스크(500 ㎝2, 배양액 150 ㎖)에서 37℃, 4~6일 간 배양한 후, 무혈청의 배양액으로 교환하여 2일간 더 배양한 다음, 그 배양 상청액을 한계여과 필터(0.22 μm filter)로 여과하여, 10배 농축의 프로테아제 억제 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail)을 0.33 ㎖ 더하여 동결 보존하였다.
상기 LOX-1 (C-myc-His 태그 포함)을 발현하는 CHO 세포주의 배양 상청액을 모아 황산암모늄 염석· 투석· 농축 후, Ni-NTA　아가로즈(Qiagen) 컬럼을 이용하여 친화성 정제하였다. Ni-NTA 아가로즈 컬럼에서 LOX-1 (C-myc-His 태그 포함)을 용출할 때, 이미다졸 농도를 5, 10, 20, 50 및 100 m㏖/L로 높이면서 세정한 다음, 250 m㏖/L의 이미다졸을 이용하여 목적의 단백질(CHO 세포 유래 sLOX-1)을 수득하였다.
실시예 2　: TR - FIA 법 및 이를 사용한 항체 역가 및 친화성의 측정
항체의 스크리닝법으로서 TR-FIA (time-resolｖed　fluoroimmunoassay)법을 구축하였다. 상기 방법은 2차 항체를 고정한 플레이트에 피험항체 시료를 더한 후, 상기 피험항체 시료에 비오틴(biotin) 표지된 항원(biotin tagged sLOX-1-D)을 결합시켜 생성된 복합체(2차 항체-항sLOX-1 항체-biotin tagged sLOX-1-D)를 유로피움(europium, Eu)으로 표지된 아비딘(또는 Eu로 표지된 스트렙타비딘)과 결합시켜 TR-FIA법을 통하여 검출하는 것을 특징으로 한다.(도 1 참조).
또한, 상기 실험방법에서, 실시예 1-1 또는 실시예 1-2에서 제조한 표준 물질(sLOX-1-D 또는 CHO 세포 유래 sLOX-1)을 첨가하여 비오틴으로 표지된 sLOX-1-D와 경합시켜, 피험항체 시료와 비오틴 표지 sLOX-1-D와의 결합을 저해하는 정도를 측정함으로써 피험항체 시료의 상기 각 표준 물질(sLOX-1-D 또는 CHO 세포 유래 sLOX-1)에 대한 친화도를 측정할 수 있다.
　
<2-1> sLOX-1-D의 비오틴화(biotinylation)(비오틴 표지 sLOX-1-D의 제조)
실시예 1-1에서 제조한 인간 LOX-1 세포외 도메인 단백질(sLOX-1-D)을 비오틴화(biotinylation) 시약(sulfo-NHS-LC-biotin, Pierce)을 이용하여 비오틴화(biotinylation)하였다. 상기 비오틴화(biotinylation) 시약의 메뉴얼에 따라 하기와 같은 방법으로 실시하였다. ⅰ)sLOX-1-D 0.06 mg (3× 109 ㏖e)을 반응 버퍼(0.1 ㏖/L 인산염 버퍼(PBS), pH 7.4) 0.25 ㎖에 용해한 뒤, 상기 반응버퍼에 비오틴화(biotinylation) 시약(sulfo-NHS-LC-biotin, Pierce) 0.025 mg (4.5× 108 ㏖e)을 용해한 반응 버퍼 0.025 ㎖를 추가하였다. ⅱ)실온에서 2시간 교반하면서 반응시켰다. ⅲ)겔 여과(PD-10, Amersham)를 통하여 비오틴(biotin) 표지 sLOX-1-D을 분취한 후 농축하였다.
<2-2> 2차 항체 고정화 플레이트의 제조
2차 항체로서 염소 유래 항마우스 IgG 혈청(Sheba Goat)으로부터 MAPS-Ⅱ 키트(BioRad)로 정제 하여 얻은 IgG 분획(15.8 mg/㎖)을 이용하였다. 상기 IgG 분획을 고정화 버퍼(0.05 g/dL 질화나트륨이 함유된 0.05 ㏖/L Tris 버퍼, pH 7.8)에 더하여 10 ㎍/㎖을 제조한 다음, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate, maxi soap fluoro, Nunc)의 각 웰(well)에 100 ㎕씩 분주하였다. 실온에서 하룻밤 이상 방치한 후, 블로킹 버퍼(20 g/dL 수크로즈(sucrose) 및 블로카제(blockase)(1패키지 당 4 g(Snow Brand Milk Products)을 정제수 100 ㎖와 고정화 버퍼 100 ㎖를 더하여 용해한 것)로 2회 세정하여, 한번 더 블로킹 버퍼 200 ㎕를 더하여 5시간 이상 방치하였다. 블로킹 버퍼를 제거한 후, 상기 플레이트를 저온 건조하여 2차 항체 고정화 드라이 플레이트(4℃ 보관)를 제조하였다.
<2-3> 항체 역가의 측정 방법
상기 실시예 2-2에서 제조한 2차 항체 고정화 플레이트를 세정액(0.01 g/dL Tween 20 및 0.05 g/dL 질산나트륨을 포함한 생리 식염수)으로 2회 세정한 후, 각 웰에 피험항체 시료 희석액 50 ㎕ 및 표지 항원 혼합액(비오틴 표지 sLOX-1-D와 Eu표지 스트렙타비딘의 등량 혼합물) 100 ㎕를 더하여 4℃로 16시간 배양한 다음, 3회 더 세정하였다. 그 다음에 증폭 시약 150 ㎕ (정제수 1 L당 프탈산 수산화 칼륨 1.39 g, 초산 6.0 g, TOPO (tri-n-octylphosphine oxide) 19.3 mg, NFA (2-naphthoyltrifluoroacetone) 4.59 mg 및 Triton X-100 1.0 g 함유)를 더하여 고체 지지대에 고정화된 유로피움(Eu)의 시간 분해 형광 강도를 멀티 라벨 카운터(1420 Arbo SX, Wallach)를 이용하여 측정하였다. 형광 강도를 통해 피험항체의 희석 배수의 100000배까지 피험항체 시료의 농도를 도출할 수 있다.
또한, 상기 측정에서 분석 시료로서 0.5 g/dL BSA, 0.05 g/dL 질산 나트륨, 0.98 mg/dL DTPA, Tween 800.1 g 및 0.9 g/dL 염화 나트륨을 포함한 0.05 ㏖/L Tris buffer (pH 7.4)를 사용할 수 있다.
<2-4> 항체의 인간 가용형 LOX-1에 대한 친화성의 평가방법(저해 곡선)
상기 실시예 2-2에서 제조한 2차 항체 고정화 플레이트의 웰에 피험항체 시료의 희석액 50 ㎕, 인간 가용형 LOX-1의 표준 물질(sLOX-1-D 또는 CHO 세포 유래 sLOX-1) 용액 50 ㎕, 표지 항원 혼합액(비오틴 표지 sLOX-1-D와 Eu표지 스트렙타비딘의 등량 혼합물) 50 ㎕를 더한 후, 4℃로 하룻밤 배양한 다음, 3회 세정하였다. 그 후에, 증폭 시약 150 ㎕를 더하여 고체 지지대에 고정화된 유로피움(Eu)의 시간 분해 형광 강도(time-resolｖed　fluorescence intensity)를 멀티 라벨 카운터(1420 Rabo SX, Wallach)를 이용하여 측정하였다. 배합하는 표준 물질의 농도를 단계적으로 바꾸어 피험항체 시료와 비오틴 표지 sLOX-1-D와의 결합을 측정한 다음, 표준 물질(sLOX-1-D 또는 CHO 세포 유래 sLOX-1)의 농도에 대한 저해 곡선 그래프를 작성하였다. 상기 저해 곡선 데이터의 스캐차드(Scatchard) 분석을 통하여 피험항체의 인간 가용형 LOX-1에 대한 해리상수(dissociation constant, Kd)를 도출하였다.
실시예 3　: 단일 클론 항체의 제작
<3-1> 면역원(hapten)
면역원으로서 실시예 1-1에서 제조한 sLOX-1-D(침전물을 용해시킨 현탁액) 및 인간 LOX-1 세포외 도메인의 N-말단 쪽에 위치하는 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(펩티드 1 및 펩티드 2)를 면역원(hapten)로 사용하였다. 이는 실시예 1-2의 CHO 세포 유래 sLOX-1의 배양 상청액 중의 함량이 대장균 등과 비교하여 매우 적고, 배양 상청액 중의 불순물이 많아, 이 sLOX-1을 면역원으로서 사용하기 위한 필요량을 확보하는 것이 곤란하기 때문이다. 상기의 면역원와 소혈청알부민(BSA, Sigma)의 접합체를 면역원으로서 이용하였다.
각 펩티드의 C-말단에는 크로스-링킹(cross-linking) 시약과의 결합을 위하여, 시스테인(Cys)을 도입하였다. BSA에 크로스-링킹(cross-linking) 시약 N-(ε-말레이미도카프로이록시) 설포숙신이미드 에스테르(N-() sulfosuccinimide ester, sulfo-EMCS, Pierce)를 이용하여 말레이미드기(maleimide group)를 도입하여, 도입한 말레이미드기와 상기의 시스테인(Cys)의 S-H 기를 포함하는 펩티드 단편을 반응시켜 면역원-BSA 접합체를 수득하였다. 즉, BSA 27 mg(4× 107 ㏖e)를 반응 버퍼(0.05 ㏖/L 인산염 버퍼(PBS), pH 7.0) 1 ㎖ 에 용해한 후, sulfo-EMCS 8.21 mg (2× 105 ㏖e)을 용해한 반응 버퍼 0.2 ㎖를 더한 다음, 실온에서 90분 간 교반하면서 반응시켰다. 반응 후, 반응액 전량에 대하여 겔 여과 컬럼(PD-10, Amersham)을 이용한 겔 여과를 실시하여 말레이미드화 BSA (maleimide-converted BSA)를 분리하였다.
말레이미드화 BSA 용액 2 ㎖(전체의 1/2량)에 반응 버퍼 0.5 ㎖에 용해한 서열 번호 5로 기재되는 펩티드 1(단 C-말단에 시스테인 도입, 8.68 mg, 6.8× 106 ㏖e)을 더한 후, 실온에서 1.5 시간 교반시킨 다음, 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 그 후, 정제수로 투석하여 동결 건조하였다(펩티드 1-BSA).
또한, 서열 번호 6으로 기재되는 펩티드 2 (시스테인 포함)의 8.3 mg (6.6× 106 ㏖e)을 말레이미드화 BSA 용액 2 ㎖를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 동결 건조하였다(펩티드 2-BSA).
<3-2> 면역
A/J마우스(6~8주령, 암컷, 10~20 g(체중), Japan SRC) 20 마리를 이용하여 4마리씩 5군〔1-1군(No. 1101~1104), 2-1군(No. 2101~2104), 3-1군(No. 3101~3104), 4-1군(No. 4101~4104) 및 5-1군(No. 5101~5104)〕로 나눈 후, 면역원(sLOX-1-D, 펩티드 1-BSA 및 펩티드 2-BSA)을 생리 식염수에 용해한 용액과 상기 생리식염수와 동량의 프로인트 컴플리트 보조제(Freund's Complete Adjuvant, Difco)를 더하여 유화시켰다. 이 유상액의 약 100 ㎍/100 ㎕를 각 마우스의 복강 내에 3주 간격으로 4회 주입하였고, 이를 표 3에 나타내었다.
그룹 면역원 계통(마우스 번호) 접종량 면역 횟수
(간격)
1-1 sLOX-1-D A/J(1101-1104) 약 100㎍ 4× (3 주)
2-1 Peptide 1-BSA A/J(2101-2104) 약 100㎍ 4× (3 주)
3-1 Peptide 2-BSA A/J(3101-3104) 약 100㎍ 4× (3 주)
4-1 Peptide 1-BSA A/J(4101-4104) 약 100㎍ 4× (3 주)
5-1 sLOX-1-D A/J(5101-5104) 약 100㎍ 4× (3 주)
3~4회 감작 한 후에 채취한 항혈청을 피험항체 시료로서 실시예 2에서 기재한 TR-FIA법을 실시하여 각 항혈청의 항체 역가를 측정하였다. 1-1군(No. 1101~1104), 2-1군(No. 2101~2104), 3-1군(No. 3101~3104)의 마우스로부터 얻을 수 있던 항혈청의 항체 역가를 표 4에 나타내었다.
마우스 번호 면역원 계통 항체 역가 (1/V)
2 회 면역 3 회 면역 4 회 면역
1101 sLOX-1-D A/J >100000 >200000 -
1102 sLOX-1-D A/J >100000 100000 -
1103 sLOX-1-D A/J >100000 200000 -
1104 sLOX-1-D A/J >100000 200000 -
2101 Peptide 1-BSA A/J 10000 20000 -
2102 Peptide 1-BSA A/J 20000 30000 50000
2103 Peptide 1-BSA A/J 2000 2000 2000
2104 Peptide 1-BSA A/J 2000 20000 5000
3101 Peptide 2-BSA A/J 30000 80000 200
3102 Peptide 2-BSA A/J 2000 2000 500
3103 Peptide 2-BSA A/J 70000 80000 30000
3104 Peptide 2-BSA A/J 3000 5000 10000
-Titer (1/V): dilution at 100000 cps
표 4의 결과로부터, sLOX-1-D로 면역하여 얻을 수 있는 항혈청의 항체 역가(형광 강도가 100000 cps에 있어서의 희석 배수)은 각각 10만 이상이며, 2~3회 면역으로 거의 안정기(포화 한도)에 이르는 것을 알 수 있었다. 또, 항체 역가 측정 결과로부터, 상기 실험에서 사용한 모든 군의 마우스의 비장 세포를 세포 융합에 사용 가능함을 확인하였다.
또한, 하기의 방법으로 마우스를 선택하였다. 먼저 실시예 2-4의 TR-FIA법을 통하여, 항혈청(3회 감작 한 후에 채취한 것)을 피험항체 시료로서 우선 면역원으로서 사용한 sLOX-1-D에 대한 친화도를 측정하였다. 그 다음에, sLOX-1-D에 대하여 친화도가 높았던 항혈청을 피험항체 시료로서 CHO 세포 유래 sLOX-1에 대한 친화도를 조사하였다. 그 결과를 도 2에 1-1군의 마우스에 대하여 조사한 결합 저해 곡선을 나타내었다. 모든 마우스에서 면역원인 sLOX-1-D와 50% 저해 농도가 낮은 값(웰 근처 2~3 ng)을 나타내지만, CHO 세포 유래 sLOX-1에 대해서는 마우스에 따라 차이가 있지만 결합 저해 능력이 있음을 보여주고 있다. 또, 펩티드 2를 면역원(hapten)로 하는 BSA 접합체로 면역한 마우스의 항혈청에서는 펩티드 2와의 반응성은 높았지만, CHO 세포 유래의 sLOX-1과는 결합 저해를 나타내지 않았다. 이에, 펩티드 2 면역원(hapten)를 면역한 마우스는 세포 융합에 사용하지 않았다.
<3-3> 세포 융합
상기 실시예 3-2에서 기재한 바와 같이, 항혈청이 면역원으로서 사용한 sLOX-1-D 및 CHO 세포 유래 sLOX-1에 대해서 친화도가 높았던 마우스(No. 1103, No. 2101, No. 4103, No. 5101)로부터, 비장 세포를 채취하여 골수종 세포(myeloma cells)와 세포 융합을 실시하였다. 골수종 세포(myeloma cells)로는 P3U1 세포(In company line of P3-X63.Ag8.U1 cells)를 이용하였다. 사용 전에, 액체 질소 중에서 보관되어 있는 골수종 세포(myeloma cells)를 해동 후, 골수종 계대용 배지(RPMI-HEPES：RPMI 1640　450 ㎖에 1 ㏖/L HEPES (pH6.8) 5 ㎖, OPK 용액(옥살아세트산(oxalacetate) 7.5 mg/㎖, 피르빈산(pyruvic acid) 7.5 mg/㎖, 카나마이신(kanamycin) 5 mg/㎖) 10 ㎖ 및 FBS (Fetal　Boｖine　Serum) 50 ㎖를 혼합한 것)를 이용해 7~10일간 계대 배양 하여 세포 융합에 사용하였다.
세포 융합 3일전에 추가 면역시킨 상기 마우스의 비장을 에테르 마취 후 적출하여, RPMI-HEPES (RPMI1640　225 ㎖ 및 1 ㏖/L HEPES (pH 6.8) 2.5 ㎖)로 세정 후, 비장 세포의 부유액을 제조하였다. 이 비장 세포 약 1× 108 개와 P3U1 골수종 세포(myeloma cells) 약 2× 107 개를 혼합하여, 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 37℃에서 800 ㎕의 50 g/dL 폴리에틸렌 글리콜 4000 (polyethylene glycol 4000, PEG4000, 가스 크로마토그래피용, Merck)를 1분간 흔들어 섞으면서 첨가한 다음, 1.5분 간 교반하였다. 다음으로 1 ㎖의 RPMI-HEPES를 1분 간 교반하면서 적하하는 것을 2회 반복하고, 30초 간 1 ㎖의 RPMI-HEPES를 교반하면서 적하하는 것을 2회 반복하였다. 그 후, 6 ㎖의 RPMI-HEPES를 2분간 교반하면서 추가하여, 마지막으로 12 ㎖의 HEPES-RPMI를 더하였다.
RPMI-HEPES에 현탁하여 있는 세포를 원심 분리하여, 상청을 완전하게 제거한 후, HAT 배지(RPMI1640 350 ㎖, NCTC109 (GIBCO) 50 ㎖, OPK 용액 10 ㎖, NEAA (non-essential amino acids, GIBCO) 5 ㎖, 1 ㏖/L HEPES (pH 6.8) 5 ㎖, HAT (히포잔티닌(hypoxanthinine), 아미노플라틴(aminoplatin), 티미딘(thymidine)) 5 ㎖, FCS 100 ㎖ 및 10 ｖol%　BM-Condimed H1 (Roche Applied Sciences)를 포함하는 배지) 170 ㎖에 현탁한 다음, 배양용 96 웰 마이크로 플레이트(96-well micro plates) 약 9개(878 웰)에 1.1× 105 cell/0.19 ㎖/well로 분주하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 각 세포 융합의 자세한 조건을 표 5에 나타내었다.
마우스 번호 PEG 4000 (mL) 비장 세포 수자
(× 108)		 P3U1 세포 수자
(× 108)
1103 0.8 1.0 0.2
2101 0.5 0.57 0.11
4103 0.8 0.68 0.16
5101 0.8 0.84 0.17
PEG4000를 이용한 세포 융합의 결과, 융합 효율은 거의 100%로 한 개 웰 당 몇 개~10개 정도의 콜로니가 형성되었다.
<3-4> HAT 배지에 의한 융합 세포의 선별
융합 세포를 배양한 5일 째에, 37℃ HAT 배지 0.1 ㎖을 각 웰에 더해주었다. 위상차 현미경을 이용하여, 매일 하이브리도마의 성장을 관찰하여 웰 전체의 1~5%에 하이브리도마가 증식하면, 각 웰의 배양 상청액을 0.1 ㎖씩 채취하였다. 이것을 피험항체 시료로서 실시예 2에 기재한 TR-FIA법을 수행하여, 항체 역가가 크고, 친화성 및 세포 증식이 좋은 것을 선택하여 하기와 같이 클로닝하였다.
<3-5> 클로닝(한계 희석법)
클로닝할 웰의 하이브리도마를 파스퇴르 파이펫(Pasteur pipette)을 사용하여 24 웰의 배양 플레이트에 이동하였다. 일부 세포를 계수하여 약 50 cell/㎖ 가 되도록 HT배지(RPMI1640 350 ㎖, NCTC109 50 ㎖, OPK 용액 10 ㎖, NEAA 5 ㎖, 1 ㏖/L HEPES (pH 6.8) 5 ㎖, HT (히폭시잔틴(hypoxyxanthine), 티미딘(thymidine)) 5 ㎖, FBS 100 ㎖ 및 10ｖol% BM-Condimed H1를 포함한 배지)로 기하배수로 희석하였다(8 단계). 이 0.2 ㎖ (세포수 0.1~10 cell/well)를 배양 플레이트에 분주하였다. 3~6일 후에 위상차 현미경으로 관찰하여, 각 웰의 세포수를 확인하였다. 하이브리도마가 어느 정도 증식한 다음, 웰당 배양 상청액 약 2개 또는 그 이하를 피험항체 시료로서 TR-FIA법으로 스크리닝을 실시하여, 항체 역가· 친화성 및 증식성이 좋은 단일 클론인 웰을 선별하였다(일차 클로닝). 선별한 웰은 신속하게 재차 클로닝(2차 클로닝)을 실시하여, 일차 클로닝과 같이 TR-FIA법으로 스크리닝을 실시하여 목적의 항체를 선택하였다. 단일 클론이 아닌 것에 대해서는 재차 클로닝(삼차 클로닝)을 실시하였다. 확립한 클론은 계대를 반복하면서 서서히 큰 배양 플라스크에 옮겨, 배양 상청액을 분취하여 항체 역가를 측정한 후, 약 5~10× 106 cell/㎖의 농도로 혈청 튜브(serum tube)에 0.5 ㎖씩 분주(약 5개)하여 액체 질소 중에 보관하였다. 또한, 확립한 하이브리도마는 동결 후, 확인을 위해 다시 배양을 실시하여 세포의 증식성 및 항체 역가를 확인하였다.
sLOX-1-D를 면역한 마우스(No. 1103)로부터 수득한 하이브리도마는, 세포 융합 10일 째에 스크리닝하여, 합계 11개의 양성 웰(>100000 cps)을 선별하였다. 그 중에서 증식이 좋은 5 웰에 대해 한계 희석법에서 일차 클로닝을 실시하여, 단일 클론이라고 생각되는 10 웰을 수득하였다. 그 후, 2차 클로닝을 실시하여, 그 10일 째에 스크리닝을 통해 단일 클론이라고 생각되는 3 웰을 수득하였다. 상기 클론들은 모두 6B11의 클론으로부터 수득한 것이다.
또, 마우스(No. 5101)로부터 제작한 하이브리도마에서 총 48개의 양성 웰이 선별되었다. 그 중에 sLOX-1-D에 대한 친화도가 높은 9 웰에 대해 일차 클로닝을 실시하였다. 클로닝 후의 10일 째에 스크리닝하여, 항체 역가 및 친화성이 양호하고 단일 클론인 웰을 선별하여 2차 클로닝을 실시하였다. 그 결과, 합계 8개의 클론(1G2, 2E4, 2E5, 2G11, 3E12, 7G1, 1B8, 1A7)을 수득하였다.
또한, 펩티드 1을 면역원(hapten)로 하는 BSA 접합체를 3회 면역한 A/J마우스(No. 2101)로부터 수득한 하이브리도마에 대해서도 2회의 클로닝에 의해, 클론(5C11)을 수득하였다. 상기와 같은 방법에 의하여, 마우스(No. 4103)로부터 2회의 스크리닝 및 클로닝을 수행하여 클론(4D1)을 수득하였다
상기의 클로닝 결과를 표 6에 나타내었다.
마우스 번호 면역원 하이브리도마 양성
/전체 웰		 2차 스크리닝 후 단일 클론 번호 (클론 번호)
1103 sLOX-1-D 11/784 6B11
2101 Peptide 1-BSA 2/803 5C11
4103 Peptide 1-BSA 121/1144 4D1
5101 sLOX-1-D 48/580 1G2 , 2E4, 2E5, 2G11, 3E12, 7G1, 1B8, 1A7
<3-6> 단일 클론 항체의 채취(배양 상청액 및 복수)
실시예 3-5에서 제조한 하이브리도마 가운데, LOX-1의 세포외 도메인 단백질(sLOX-1-D) 및 LOX-1의 세포외 도메인의 N-말단 펩티드인 펩티드 1의 BSA 접합체를 면역원으로서 제조한 11 종류의 하이브리도마(1G2, 2E4, 2E5, 2G11, 3E12, 7G1, 1B8, 1A7, 6B11, 5C11, 4D1)를 대량 배양하여, 무혈청 배지에 옮긴 후, 그 배양 상청액을 모으는 방법으로 단일 클론 항체를 채취하였다.
또, 상기의 하이브리도마 중 LOX-1의 세포외 도메인 단백질(sLOX-1-D)을 면역원으로서 제조한 하이브리도마(1G2, 2G11, 6B11 및 1A7) 및 펩티드 1을 면역원(hapten)로서 제조한 하이브리도마(5C11, 4D1)를 미리 프리스탄(pristane) 1 ㎖로 처리해 놓은 마우스(Balb/c 및 Balb/c　nu(nude mice))의 복강에 약 2~3× 106 cell씩 주입하였다. 또한, 액체 질소에 동결 보관해 둔 하이브리도마는 해동하여, 7~10일간 확장 배양한 후, 마우스의 복강 내에 주입하였다. 이 마우스를 관찰하여 복부가 부풀어 오른 마우스(투여 후 8~17일)를 에테르 마취로 사망시킨 후, 복강 내의 복수를 채취하였다. 각 하이브리도마를 접종 한 마우스로부터 1마리 당 1.2~4.9 ㎖의 복수를 채취하여, 항체 역가를 측정하였다. 상기 측정 결과는 표 7에 나타내었다.
클론 번호 면역원 마우스 계통 항체 역가 마우스당 복수의 부피
(mL)
6B11 LOX-1-D Balb/c nu ++ 4.7
6B11 LOX-1-D Balb/c ++ 2.4
1G2 LOX-1-D Balb/c nu ++ 4.6
1G2 LOX-1-D Balb/c ++ 2.7
2G11 LOX-1-D Balb/c nu ++ 4.9
2G11 LOX-1-D Balb/c ++ 3.0
1A7 LOX-1-D Balb/c nu ++ 2.5
1A7 LOX-1-D Balb/c ++ 1.2
5C11 Peptide 1-BSA Balb/c nu ++ 2.6
5C11 Peptide 1-BSA Balb/c ++ 3.1
4D1 Peptide 1-BSA Balb/c nu ++ 3.2
4D1 Peptide 1-BSA Balb/c ++ 2.8
<3-7> 단일 클론 항체의 정제
상기 실시예 3-6에서 제조한 하이브리도마의 배양 상청액 및 마우스 복수에 포함된 단일 클론 항체를 프로테인 A 친화성 컬럼(AMAPS-Ⅱ 키트, BioRad)을 사용하여 IgG로 정제 하였다. 구체적으로는, 우선, 빈 컬럼에 약 1 ㎖의 프로테인 A 고정화 비즈의 겔(현탁액 약 1.5~2 ㎖)를 충전한 후, 결합 버퍼(키트에 첨부) 10 ㎖로 세정하여 프로테인 A친화성 컬럼을 제조하였다. 하이브리도마의 배양 상청액 또는 마우스 복수 0.5 ㎖와 결합 버퍼 0.5~1 ㎖ 를 혼합하고, 원심 분리하여 상청액을 얻은 후, 상기에서 제조한 프로테인 A 친화성 컬럼에 넣고, 20 ㎖의 결합 버퍼를 흘려 결합 고정되지 않은 물질을 제거한 다음, 용출 버퍼(키트에 첨부) 30 ㎖를 이용하여 IgG를 추출하였다. 용출 버퍼를 넣어준 후 최초로 나오는 단백질 분획을 IgG 용액으로서 채취하였다. 용출 버퍼는 산성(pH 3.0)이므로, 용액 내의 IgG를 1 ㏖/L Tris 버퍼(pH 9.0)로 즉시 중화시켜주었다. 수득한 IgG 용액은 인산 완충 생리 식염수(PBS)에서 투석한 후, 동결 보관하였다. 이 결과, 하이브리도마의 배양 상청액의 일부(30~40 ㎖)로부터 100~700 ㎍의 IgG를 얻을 수 있었다.
수득한 단일 클론 항체(IgG)의 동위형(isotype)을 맙 베이스드 마우스 Ig 이소타이핑 키트(MAb-BASED MOUSE Ig ISOTYPING KIT, Pharmingen)에 의해 결정하였다. 그 결과, 11 종류(6B11, 1G2, 2E4, 2E5, 2G11, 3E12, 7G1, 1A7, 1B8, 5C11, 4D1)중 9 종류가 IgG1로 나머지가 IgG2a와 IgG2b였다(표 8). 또, 이러한 단일 클론 항체의 해리 상수(Kd)의 일부를 이하에 나타낸다(표 9). 또한, 상기의 Kd의 각각의 값은, 인간 LOX-1 세포외 도메인의 일부(서열 번호 2)에 대한 것이지만, 인간 가용형 LOX-1(서열 번호 3 및 서열번호 4)과의 아미노산 서열의 차이는 매우 적기 때문에, 인간 가용형 LOX-1에 대한 Kd도 거의 동등하다고 생각된다.
마우스 번호 면역원 클론번호 sLOX-1-D에 대한 친화성 sLOX-1 (CHO)에 대한 친화성 세포 증식 아종
1103 sLOX-1-D 6B11 ++ ++ ++ IgG1
2101 Peptide1-BSA 5C11 +++ + ++ IgG1
4103 Peptide1-BSA 4D1 ++ + ++ IgG2a
5101 sLOX-1-D 1G2 +++ +++ ++ IgG1
5101 sLOX-1-D 2E4 +++ +++ ++ IgG1
5101 sLOX-1-D 2E5 ++ ++ ++ IgG1
5101 sLOX-1-D 2G11 ++ ++ ++ IgG1
5101 sLOX-1-D 3E12 ++ ++ ++ IgG1
5101 sLOX-1-D 7G1 ++ ++ ++ IgG1
5101 sLOX-1-D 1A7 ++ ++ ++ IgG1
5101 sLOX-1-D 1B8 ++ ++ ++ IgG2b
하이브리도마 해리 상수(nM)
6B11 0.34
4D11 0.36
2G11 0.16
3E12 1.32
7G1 0.12
1A7 0.51
실시예 4 : 단일 클론 항체의 조합
상기 실시예 3에서 얻을 수 있던 11 종류의 단일 클론 항체(배양 상청액의 IgG 분획)중 1B8항체를 제외한 10 종류를 실시예 2-1에서 기재한 방법에 따라 비오틴 표지 하였다. 이러한 10종의 비오틴 표지 항체와 상기 11 종류의 단일 클론 항체를 실시예 2-2 방법에 따라 고정화한 플레이트를 이용하여, 2-사이트 샌드위치 ELISA (2-site Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 통해서, 110가지의 항체의 조합에 대하여 sLOX-1-D와 CHO 세포 유래 sLOX-1을 표준 물질로 했을 때의 ELISA (2-site Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 표준 곡선을 측정하였다.
펩티드 1(서열 번호 5로 나타나는 폴리펩티드의 말단에 연결용의 시스테인을 첨가한 것)에 BSA를 접합시킨 펩티드 1-BSA를 면역원으로서 실시예 3에 따라 제조한 항체(4D1항체 및 5C11 항체)를 고정상으로 했을 때, 바탕값이 높긴 하지만, 다른 비오틴 표지 단일 클론 항체(6B11, 1G2, 2E4, 2E5, 2G11, 3E12, 7G1, 1A7, 1B8)와의 조합에 대한 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 측정값 보다 높은 반응치를 나타내었다(표 10).
sLOX-1 ELISA에서의 단일 클론 항체 조합
No. 6B11 "PA7 3E12 1G2 2G11 2E4 7G1 5C11 4D1 2E5 1B8

비오틴 표지 항체
 6B11 ++ - - - - - ++ ++ - -
1A7 ++ - - - - - + ++ - -
3E12 + - - - - - + + - -
1G2 + - - - - - ++ ++ + -
2G11 + - - - - - ++ ++ + -
2E4 - - - - - - ++ ++ - -
7G1 - - - - - - + + - -
5C11 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - ++ ++
4D1 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - ++ ++
2E5 - - - - - - - ++ ++ -
1B8 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음
　상기 결과로부터, sLOX-1-D를 면역하여 수득한 9 종류의 단일 클론 항체(6B11, 1G2, 2E4, 2E5, 2G11, 3E12, 7G1, 1A7, 1B8)는 sLOX-1 N-말단 펩티드에 대한 항체와 동시에 결합을 하고 있는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 sLOX-1의 N-말단(neoepitopes)과는 다른 부위를 인식하고 있는 것을 알 수 있었다.
또한, sLOX-1-D를 면역해 수득한 항체(6B11, 1G2, 2E4, 2E5, 2G11, 3E12, 7G1, 1A7, 1B8) 중에서는, 1A7항체와 6B11 항체와의 조합에서만 강한 반응를 나타내어, 나머지 항체는 모두 인식 부위가 근접하고 있을 가능성이 시사되었다(표 10).
이에, 상기에서 수득한 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 가운데, 하이브리도마 1A7 및 6B11에 대해서는 각각 하이브리도마의 명칭 "마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 1A7" 및 "마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 6B11"로서, 2006년 7월 26일부로, 일본 이바라키현의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 Patent Microorganism Depository Center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)에 국제 기탁하였다. 각 하이브리도마의 수령 번호 및 기탁 번호는 표 11에 나타내었다.
하이브리도마 표기 수령 번호 기탁 번호
마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 1A7 FERM ABP-10645 FERM BP-10645
마우스-마우스 하이브리도마 sLOX-1 6B11 FERM ABP-10646 FERM BP-10646
실시예 5　: 화학 발광 ELISA
<5-1> 단일 클론 항체의 단편화 방법
단일 클론 항체(IgG)의 0.02 ㏖/L 아세트산 버퍼 용액(pH 4.0) 0.25 ㎖에 펩신(Sigma) 희석액(50 ㎍/㎖) 50 ㎕를 더하여 교반해준 후, 37℃에서 3시간 반응하였다. 반응 종료후, 겔 여과 HPLC 시스템(시마츠 LC-6A (Shimadzu LC-6A), 컬럼：TSK-gelG3000SWXL, 6.8× 300 mm, 용출액：0.2 ㏖/L 염화나트륨을 포함한 0.1 ㏖/L 인산염 버퍼, pH 7.0, 유속：0.5 ㎖/min, 검출：280 nm)을 사용하여 유지 시간 약 18분의 F(ab´)2 분획(분자량 약 9.2만)을 분취하였다.
분취한 F(ab´)2 분획을 원심 울트라 필터(YM-30, Centricon)로 농축 후, 0.32 mg를 버퍼 A(5 m㏖/L EDTA를 포함한 0.1 ㏖/L 인산염 버퍼, pH 6.0) 0.25 ㎖에 0.1 ㏖/L 2-머캅토 에틸아마이드(2-mercaptoehtylamide) 0.025 ㎖를 더해 37℃에서 90분간 환원시켰다. 반응 종료 후, 겔 여과 HPLC 시스템을 이용하여 유지 시간 약 20 분의 Fab´ 분획(분자량 약 4.6만)을 채취하였다. 분취한 Fab´ 분획은 원심 울트라 필터(YM-30)로 농축하였다.
<5-2> 알칼리 인산화 효소(Alkali Phosphatase)에 의한 항체의 표지 방법
알칼리 인산화 효소(ALP, 소 소장 유래, Kikkoman) 1 mg를 0.1 ㏖/L 인산염 버퍼(pH 7.0) 0.2 ㎖에 용해하여, 정제수 0.05 ㎖에 용해한 N-(8-말레이미도카프릴록시) 설포숙신아마이드(N-(8-maleimidocapryloxy) sulfosuccinimide), 나트륨(sodium salt(sulfo-HMCS, Dojindo Laboratories) 0.1 mg를 더해, 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, PD-10 컬럼(용출액：버퍼 A))로 정제 후, 그 고분자 분획을 원심 울트라 필터(YM-10, Centricon)로 농축하여, 말레이미드화 ALP로 제작하였다.
실시예 5-1에서 제조한 단일 클론 항체의 Fab´를 0.13 mg 포함한 버퍼 A 0.25 ㎖에, 상기 말레이미드화 ALP 용액 0.026 ㎖ (0.128 mg)를 더해 교반 후, 실온으로 16시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액 0.15 ㎖를 겔 여과 HPLC 시스템(용출액：0.2 ㏖/L 염화 나트륨을 포함한 0.1 ㏖/L 인산염 버퍼, pH 7.0)에서 분리 정제하여(유지 시간 약 15분), ALP 표지 항체(ALP 표지 Fab´)로 제작하였다.
　　　
<5-3> ALP 표지 단일 클론 항체(1G2, 2G11, 6B11)의 최적량의 검토
배양 상청액 또는 복수로부터 수득한 3 종류의 단일 클론 항체(1G2, 2G11, 6B11)의 IgG 분획(1G2：2.0 mg, 2G11：1.9 mg 및 6B11：1.3 mg)를, 상기 실시예 5-1및 실시예 5-2의 방법에 따라, 펩신 처리 후 환원하여 Fab´로 만든 다음, 말레이미드화 ALP와 반응시켜, 겔 여과 HPLC에 의해, 3 종류의 Fab´-ALP 접합체(효소 표지 항체)를 수득하였다. 상기에서 수득한 효소 표지 항체는 각각 0.41 mg, 0.42 mg 및 0.29 mg이다.
3 종류의 고상 항체(5C11, 4D1, 1A7)를 이용하여 상기에서 수득한 3 종류의 효소 표지 항체(1G2, 2G11 및 6B11)를 평가하였다. 그 결과, 모든 효소 표지 항체(1G2, 2G11 및 6B11)에서 3 종류의 고정상 항체(5C11, 4D1, 1A7)에 대해서 양호한 반응를 나타내어, 제작한 효소 표지 항체가 모두 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에 사용할 수 있음을 알 수 있었다. 나아가, 효소 표지 항체의 웰 근처의 사용량은 1G2에서는 170 ng/㎖, 2G11에서는 150 ng/㎖ 및 6B11에서는 190 ng/㎖의 것을 100 ㎕사용하는 것으로 하였다.
<5-4> 화학 발광 ELISA에 의한 인간 혈청 시료의 측정 방법
단일 클론 항체 IgG (1A7의 IgG)의 고정화 버퍼 희석액 100 ㎕(1 ㎍/100 ㎕)를 이용해, 실시예 2-2 항에서 말한 2차 항체 고정화 플레이트 제작 방법으로 항체 고정화 건조 플레이트를 제작하였다.
이 항체 고정화 플레이트를 세정액(0.01 g/dL Tween 20 및 0.05 g/dL 질화나트륨을 포함한 생리 식염수)으로 2회 세정한 후, 각 웰에 sLOX-1-D표준 용액 또는 CHO 세포 유래 sLOX-1 정제액 100 ㎕(인간 혈청 시료 측정 때는 검사 100 ㎕에 시료 10 ㎕)를 더해, 5시간 정치 하였다. 3회 세정 후, ALP 표지 항체 용액(6B11의 Fab´-ALP 접합체) 100 ㎕를 더하였다. 실온으로 하룻밤 배양해준 후, 4회 세정하고, 고체상에 화학 발광 기질 용액(100 ㎕)을 더해 즉시 각 웰의 발광 강도를 멀티 라벨 카운터에 의해 측정하였다. 발광 기질에는 LumigenAPS-5 (Oriental Yeast)를 이용하였다. 또한, 고체화 항체와 ALP 표지 항체의 조합으로서 1A7-6B11 (고정화 항체-ALP 표지 항체)를 이용하였다.
또한, 시약의 제조 등에 이용하는 분석 버퍼에는, 0.5 g/dL BSA, 0.05 g/dL 질화나트륨, 0.01 g/dL Tween 80, 1 m㏖/L 염화마그네슘, 0.1 m㏖/mL염화아연 및 0.9 g/dL 염화 나트륨을 포함한 0.05 ㏖/L Tris 버퍼(pH 7.4)를 이용하였다.
<5-5> ELISA계의 선택
실시예 5-4에 따라, 3 종류의 효소 표지 항체(1G2, 2G11 및 6B11)와 단일 클론 항체 1A7, 5C11 및 4D1의 IgG를 고정화(1 ㎍/0.1 ㎖) 한 플레이트를 이용해, LOX-1 세포외 도메인 단백을 표준 물질로 한 화학 발광 2-사이트 샌드위치 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)의 표준 곡선(0.24-250 pg/well)을 나타내었다. 모든 조합에서 높은 반응 값이 나타났지만, 특히 고정화 항체와 표지 항체(Fab´-ALP 접합체) 의 조합이 각각 1A7-6B11, 5C11-1G2, 4D1-2G11 때 고감도인 표준 곡선을 얻을 수 있었다. 그 중에서도 바탕값이 약간 높긴 하지만, 1A7-6B11과의 조합에서 가장 반응이 잘 일어나는 것을 확인하였다(추정 검출 한계 0.24 pg/well(약 6 a㏖/well)).
CHO 세포 유래 sLOX-1을 표준 물질로 한 화학 발광 2-사이트 샌드위치 ELISA의 표준 곡선 중에서, 1A7-6B11의 조합은, 펩티드 1에 대한 항체를 고정상으로 사용한 5C11-1G2, 4D1-2G11와 비교하여 100배 정도 감도가 좋음을 확인하였다(도 3).
<5-6> 혈청 성분의 ELISA에 미치는 영향
인간 혈청[5명의 지원자들의 혈청 풀(pool)], 토끼 혈장 및 소태아 혈청을 1/1~1/64까지 희석해, 그 중 50 ㎕ (혈청량은 0.78~50 ㎕/well)를 상기의 3 종류의 분석 방법을 이용하여 측정하였다. 1A7-6B11 (고정화 항체-ALP 표지 항체)의 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 동물 혈청에서는 거의 반응이 없었지만, 인간 혈청에서는 혈청량에 따라 반응을 나타내어, 0.78~12.5 ㎕의 범위에서 희석농도 별 선형 증가곡선을 볼 수 있었다. 이러한 결과는, 이 측정 방법을 사용하여 인간 혈청 중의 인간 sLOX-1을 특이적으로 측정할 수 있는 것을 나타낸다(도 4).
또, 인간 혈청의 채취량이 10 ㎕ 이하인 경우, 혈청 성분에 의한 영향은 극히 작다고 추정되므로, 혈청의 채취량은 10 ㎕로 하고, 표준 용액은 인간 혈청을 포함하지 않는 분석 버퍼로 제조하였다.
<5-7> 마우스γ글로불린의 ELISA에 미치는 영향
혈중에 항마우스 항체(human anti-mouse antibody, HAMA)를 가지는 사람이 무시할 수 없는 비율로 존재하는 것이 알려져 있어, 마우스 항체를 사용하는 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에 대해 이러한 사람의 혈액 시료는 비정상적인 높은 측정값을 나타낸다. 이러한 방해는 분석 버퍼에 미리 마우스γ글로불린(IgG)을 첨가하는 것으로써 억제할 수 있음이 알려져있다. 본 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법에서도 마우스γ글로불린을 분석 버퍼에 첨가하여 혈중 항마우스 항체의 방해에 대한 영향을 제거하기 위하여, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 표준 곡선에 미치는 마우스γ글로불린 농도의 영향을 조사하였는데, 20 ㎍/㎖까지는 거의 영향을 주지 않아, 분석 버퍼에 10 ㎍/㎖의 마우스γ글로불린을 첨가하였다. 한편, 상기의 지원자 5명의 혈청 중에는 HAMA는 존재하지 않았다. 도 5에 마우스γ글로불린을 포함한 분석 버퍼로 작성한 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 표준 곡선을 나타내었다.
<5-8> 검증과 정량 한계의 추정
sLOX-1 농도가 낮은 지원자 혈청(No.3)에 sLOX-1-D를 0.100~12.8 ng/㎖ (1~128 pg/well)의 농도로 첨가한 시료를 이용하여 검증을 실시하였다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 0.100~6.40 ng/㎖의 범위에서 실험 간의 정밀성 및 재현성이 양호하였다(1.7~15.7% 및-10.5~＋14.4%). 또한, 동일 농도 범위에서 실험 간의 정밀성 및 재현성 역시 양호하였다(5.3~12.3% 및-8.3~+7.5%). 한편, 고농도(12.8 ng/㎖)에서는 약간 재현성이 나쁘지만, 표준 곡선의 포인트와 회귀 계산방법의 수정을 통하여 개선할 수 있다. 상기 결과로부터, 정량 한계는 약 0.1 ng/㎖로 평가하였으며, 상기 정량 한계는 폴리클로날 항체를 이용한 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (정량 한계：1 ng/㎖) 방법의 경우보다 10배 감도가 향상된 것이다.
본 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법에서 1차 및 2차 반응의 시간(각각 5시간 및 하룻밤)은 폴리클로날 항체를 사용한 경우에 맞추었지만, 단일 클론 항체를 이용하고 있으므로 반응 시간을 단축할 수 있는 여지가 있다. 이에, 1차 반응을 4시간, 2차 반응을 1시간으로 했을 때의 실험내의 정밀도(accuracy)· 신뢰도(fidelity)를 조사한 결과를 표 13에 나타내었으며, 그 결과, 상기 폴리클로날 항체를 사용한 경우와 같이 재현성이 우수하였다(각각 2.3~14.7% 및-14.1~16.0%).
측정 1 (ng/㎖) 측정 2 (ng/㎖) 측정 3 (ng/㎖)
첨가량 0.100 0.40 1.60 6.40 12.8 0.100 0.40 1.60 6.40 12.8 0.100 0.40 1.60 6.40 12.8
측정치 0.116 0.384 1.68 5.87 11.0 0.127 0.33 1.65 5.49 9.41 0.085 0.403 1.57 6.52 12.0
0.101 0.342 1.74 5.77 11.2 0.102 0.34 1.57 5.67 9.72 0.109 0.373 1.95 5.92 10.6
0.108 0.416 1.65 6.01 10.7 0.103 0.38 1.69 5.48 9.33 0.102 0.385 1.83 5.66 11.0
0.111 0.335 1.67 5.99 10.7 0.083 0.36 1.68 5.82 9.36 0.127 0.374 1.90 6.07 11.0
0.110 0.393 1.69 5.90 10.5 0.094 0.39 1.58 5.47 9.33 0.121 0.349 1.90 6.42 12.0
평균 0.109 0.374 1.69 5.91 10.9 0.102 0.358 1.63 5.59 9.4 0.109 0.377 1.83 6.12 11.3
시험내 표준곡선 0.005 0.035 0.03 0.10 0.3 0.016 0.023 0.06 0.15 0.2 0.017 0.020 0.15 0.36 0.6
신뢰도
/정밀도		 4.6 9.4 1.8 1.7 2.8 15.7 6.4 3.7 2.7 2.1 15.6 5.3 8.2 5.9 5.3
바이아스
(편차)		 9.0 -6.5 5.6 -7.7 -14.8 2.0 -10.5 1.9 -12.7 -26.6 9.0 -5.8 14.4 -4.4 -11.7
평균 0.106 0.370 1.72 5.87 10.5
시험내 표준곡선 0.013 0.026 0.12 0.31 0.9
신뢰도
/정밀도		 12.3 7.0 7.0 5.3 8.6
바이아스
(편차)		 6.0 -7.5 7.5 -8.3 -18.0
sLOX-1 ELISA의 단시간 측정조건에서의 정밀도 및 신뢰도(제 1 반응시간: 4시간, 제 2 반응시간: 1시간)
첨가량 실험의 신뢰도/정밀도 (ng/㎖)
0.100 0.40 1.60 6.40 12.8
측정치
 0.110 0.394 1.64 6.13 11.7
0.096 0.387 1.89 6.04 10.8
0.106 0.369 1.69 6.31 10.7
0.133 0.410 1.92 6.03 11.2
0.133 0.388 1.97 6.30 10.6
평균
S.D
V.C
바이아스(편차)		 0.116 0.39 1.82 6.16 11.0
0.017 0.015 0.15 0.14 0.4
14.7 3.8 8.2 2.3 3.6
16.0 -2.5 13.8 -3.8 -14.1
　<5-9> 혈청 중 sLOX-1의 측정
　상기 실시예 5-8에서 기재한 분석방법을 이용하여 정상 지원자 5명으로부터 얻은 혈청 중의 sLOX-1 농도(sLOX-1-D를 표준 물질로 했을 때)의 면역반응을 측정하였다. 표 14에 나타낸 바와 같이, 정상 인간 혈청의 sLOX-1의 값은 0.15~0.57 ng/㎖로써, 본 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법에 의해 종래의 방법(폴리클로날 항체를 이용한 경우의 ELISA)에서는 측정할 수 없었던 정상 인간 혈청 중의 낮은 농도의 sLOX-1의 측정이 가능하였다. 또한, 이 측정 결과를 통하여, 성별 또는 연령에 상관없이 측정이 가능함을 확인하였다.
sLOX-1 ELISA에 의한 정상 지원자 혈청의 측정 결과
혈청 번호 지원자 성별 및 연령 sLOX-1
(ng/㎖)
No.1 M 40 0.37
No.2 F 34 0.21
No.3 M 51 0.15
No.4 M 51 0.54
No.5 F 26 0.57
평균± 표준 편차 0.37
0.19
Pool 0.35
정상인의 sLOX-1의 평균 농도는 0.35 ng/㎖이고, 그 분자량을 고려하면, 혈청 중의 몰 농도는 2× 10-11 M 정도 이다. 이것을 10배 희석하여 측정에 사용하므로, 측정시의 몰 농도는 2× 10-12 M 정도 이다. 한편, 본 발명의 단일 클론 항체와 같은 고친화성(Kd 값이 1× 10-10 M 이하) 항체의 0.1% 가 sLOX-1와 결합하고 있을 때의 sLOX-1의 총 농도는 2× 10-12 M 정도라고 추측된다. 이와 같이, 고친화성 단일 클론 항체를 이용함으로써 정상인의 혈청 중의 sLOX-1의 농도를 측정할 수 있어 보다 정확한 진단이 가능하다.
일본 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM10645 20060726 일본 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERM10646 20060726
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 수탁번호 FERM　BP－10646으로 기탁된 마우스-마우스 하이브리도마 sLOX－1 6B11(Mouse-Mouse Hybridoma sLOX－1 6B11)의 하이브리도마에 의해 생산되고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 인간 가용형 LOX－1에 특이적으로 결합하는 성질을 구비하고, 인간 가용형 LOX－1과의 해리 상수(Kd)가 1× 10-9 M 이하인 것을 특징으로 하는, 단일 클론 항체,
    상기 인간 가용형 LOX－1에 특이적으로 결합하는 성질을 구비한 상기 단일 클론 항체의 단편으로서, Fab(fragment　of　antigen　binding), F(ab´)2, Fab', scFv(single　chain　Fv), 디아바디(dibody), dsFv(disulfide　stabilized　Fv), dAd(single　domain　antibody) 및 상기 단일클론항체의 VH 또는 VL의 CDR 중 적어도 1 영역 이상을 포함하는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 단일 클론 항체의 단편, 또는
    효소, 방사성동위체, 형광성 화합물, 화학발광성 화합물 및 생물발광성 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나로 표지되는 상기 단일 클론 항체 또는 그의 단편.
  2. 인간 가용형 LOX－1의 해리 상수(Kd)가 1× 10-9 M 이하인 단일 클론 항체를 생산하는, 기탁 번호 FERM　BP－10646으로 기탁된 마우스-마우스 하이브리도마 sLOX－1 6B11.
  3. 제 1항의 단일 클론 항체, 제 1항에 기재된 단일 클론 항체의 단편, 또는 제 1항에 기재된 표지된 단일 클론 항체 또는 그의 단편을 포함하는 인간 가용형 LOX－1 검출용 시약 키트.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 시약 키트는 급성관상동맥증후군 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 시약 키트.
  5. 제 1항의 단일 클론 항체, 제 1항에 기재된 단일 클론 항체의 단편, 또는 제 1항에 기재된 표지된 단일 클론 항체 또는 그의 단편을 인간 가용형 LOX－1에 대한 특이적 결합 시약 또는 특이적 검출 시약으로서 이용하는 단계를 포함하는 인간 가용형 LOX－1의 특이적 검출 방법.
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