JP2003121444A - 脳梗塞を検出する方法 - Google Patents
脳梗塞を検出する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 脳梗塞を検出する方法を提供する。
【解決手段】 体液試料中のニックβ２グリコプロテイ
ンＩの濃度を測定して、脳梗塞を検出する。あるいは、
体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃
度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）を算出し、その比率を指標とし
て検出する。
ンＩの濃度を測定して、脳梗塞を検出する。あるいは、
体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃
度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）を算出し、その比率を指標とし
て検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、脳梗塞を検出する
方法に関する。本発明は、特に、脳梗塞患者の診断及び
治療後の病態観察に利用することができる。
方法に関する。本発明は、特に、脳梗塞患者の診断及び
治療後の病態観察に利用することができる。
【０００２】本明細書において、「ニックβ２グリコプ
ロテインＩ」とは、プロテアーゼによりアミノ酸配列の
一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるもの
の、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２
グリコプロテインＩを意味する。また、本明細書におい
て、プロテアーゼによる開裂を受けていないβ２グリコ
プロテインＩを、前記の「ニックβ２グリコプロテイン
Ｉ」と区別する必要がある場合には、「インタクトβ２
グリコプロテインＩ」と称することがある。従って、本
明細書において、単に「β２グリコプロテインＩ」と称
する場合には、特に断わらない限り、「インタクトβ２
グリコプロテインＩ」を指すものとする。更に、本明細
書において、「トータルβ２グリコプロテインＩ」と
は、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」と前記「イ
ンタクトβ２グリコプロテインＩ」との両方を含む。
ロテインＩ」とは、プロテアーゼによりアミノ酸配列の
一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるもの
の、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２
グリコプロテインＩを意味する。また、本明細書におい
て、プロテアーゼによる開裂を受けていないβ２グリコ
プロテインＩを、前記の「ニックβ２グリコプロテイン
Ｉ」と区別する必要がある場合には、「インタクトβ２
グリコプロテインＩ」と称することがある。従って、本
明細書において、単に「β２グリコプロテインＩ」と称
する場合には、特に断わらない限り、「インタクトβ２
グリコプロテインＩ」を指すものとする。更に、本明細
書において、「トータルβ２グリコプロテインＩ」と
は、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」と前記「イ
ンタクトβ２グリコプロテインＩ」との両方を含む。
【０００３】
【従来の技術】β２グリコプロテインＩは、健常人の血
液中に約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在する糖タンパク
質であり、陰性荷電リン脂質と結合する性質を有し、内
因系凝固の接触相、ＡＤＰによる血小板凝集、活性化第
５因子やリン脂質依存性プロトロンビナーゼ活性、プロ
テインＳとその結合タンパクとの相互反応などを抑制し
て抗凝固活性を示すことが知られている。また、β２グ
リコプロテインＩの一部がプロテアーゼにより開裂を受
けたニックβ２グリコプロテインＩでは、陰性荷電リン
脂質との親和性が、インタクトβ２グリコプロテインＩ
の親和性から約１／１００以下に低下することが報告さ
れている［Ｊ．Ｅ．Ｈｕｎｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９０巻，第２１４１頁〜
第２１４５頁（１９９３年）］。様々な病態において、
血管内凝固系が活性化されると、これに引き続いて線溶
系酵素であるプラスミンが活性化されるので、このプラ
スミンによってβ２グリコプロテインＩが開裂を受け
［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１巻，第４１７３頁〜第４
１７９頁（１９９８年）］、陰性荷電リン脂質との親和
性が低下し、ニックβ２グリコプロテインＩが血液中に
遊離してくるものと考えられる。
液中に約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在する糖タンパク
質であり、陰性荷電リン脂質と結合する性質を有し、内
因系凝固の接触相、ＡＤＰによる血小板凝集、活性化第
５因子やリン脂質依存性プロトロンビナーゼ活性、プロ
テインＳとその結合タンパクとの相互反応などを抑制し
て抗凝固活性を示すことが知られている。また、β２グ
リコプロテインＩの一部がプロテアーゼにより開裂を受
けたニックβ２グリコプロテインＩでは、陰性荷電リン
脂質との親和性が、インタクトβ２グリコプロテインＩ
の親和性から約１／１００以下に低下することが報告さ
れている［Ｊ．Ｅ．Ｈｕｎｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９０巻，第２１４１頁〜
第２１４５頁（１９９３年）］。様々な病態において、
血管内凝固系が活性化されると、これに引き続いて線溶
系酵素であるプラスミンが活性化されるので、このプラ
スミンによってβ２グリコプロテインＩが開裂を受け
［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１巻，第４１７３頁〜第４
１７９頁（１９９８年）］、陰性荷電リン脂質との親和
性が低下し、ニックβ２グリコプロテインＩが血液中に
遊離してくるものと考えられる。
【０００４】脳梗塞は血栓による脳動脈の閉塞により生
じる疾患であり、日本における死因の第３位になってい
る脳卒中の主病型で死亡率の高い疾患である。従来か
ら、脳梗塞の診断にはＣＴ検査などによる画像診断がな
されているが、これに加えて、血中の脳梗塞特異的な分
子マーカーを測定することが可能となれば、脳梗塞の予
知や治療後の病態のスクリーニングに有効に活用される
ものと考えられる。
じる疾患であり、日本における死因の第３位になってい
る脳卒中の主病型で死亡率の高い疾患である。従来か
ら、脳梗塞の診断にはＣＴ検査などによる画像診断がな
されているが、これに加えて、血中の脳梗塞特異的な分
子マーカーを測定することが可能となれば、脳梗塞の予
知や治療後の病態のスクリーニングに有効に活用される
ものと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、脳梗塞検
出可能な方法を開発する目的で鋭意研究したところ、ニ
ックβ２グリコプロテインＩは健常人に比べ脳梗塞患者
で有意に高値となること、更に、トータルβ２グリコプ
ロテインＩ濃度に対するニックβ２グリコプロテインＩ
濃度の比率も、脳梗塞の診断に有効であることを見出し
た。また、従来の凝固線溶系マーカー、例えば、ＴＡＴ
（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩ
Ｃ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体）
値、及びＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値では、健常人におけ
る正常基準値と脳梗塞患者（あるいは脳梗塞経験患者）
の測定値との間に統計学的な有意差が認められない。こ
れに対し、ニックβ２グリコプロテインＩ（例えば、プ
ラスミンにより開裂を受けたニックβ２グリコプロテイ
ンＩ）は、健常人に比べ脳梗塞患者で統計学的に有意に
高値となり、更に、トータルβ２グリコプロテインＩ濃
度に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度の比率
も、健常人に比べ脳梗塞患者で統計学的に有意に高値と
なるので、ニックβ２グリコプロテインＩ、又はトータ
ルβ２グリコプロテインＩ濃度に対するニックβ２グリ
コプロテインＩ濃度の比率は、脳梗塞の診断に有効な高
感度のマーカーとなる。本発明は、こうした知見に基づ
くものである。
出可能な方法を開発する目的で鋭意研究したところ、ニ
ックβ２グリコプロテインＩは健常人に比べ脳梗塞患者
で有意に高値となること、更に、トータルβ２グリコプ
ロテインＩ濃度に対するニックβ２グリコプロテインＩ
濃度の比率も、脳梗塞の診断に有効であることを見出し
た。また、従来の凝固線溶系マーカー、例えば、ＴＡＴ
（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩ
Ｃ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体）
値、及びＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値では、健常人におけ
る正常基準値と脳梗塞患者（あるいは脳梗塞経験患者）
の測定値との間に統計学的な有意差が認められない。こ
れに対し、ニックβ２グリコプロテインＩ（例えば、プ
ラスミンにより開裂を受けたニックβ２グリコプロテイ
ンＩ）は、健常人に比べ脳梗塞患者で統計学的に有意に
高値となり、更に、トータルβ２グリコプロテインＩ濃
度に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度の比率
も、健常人に比べ脳梗塞患者で統計学的に有意に高値と
なるので、ニックβ２グリコプロテインＩ、又はトータ
ルβ２グリコプロテインＩ濃度に対するニックβ２グリ
コプロテインＩ濃度の比率は、脳梗塞の診断に有効な高
感度のマーカーとなる。本発明は、こうした知見に基づ
くものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、体液試料中の
ニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定することを
特徴とする、脳梗塞を検出する方法に関する。また、本
発明は、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの
濃度（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃
度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）を算出し、その比率を指標とす
る、脳梗塞を検出する方法に関する。更に、本発明の好
ましい態様においては、前記の濃度測定を免疫学的測定
法又は生化学的測定法に基づいて行う。
ニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定することを
特徴とする、脳梗塞を検出する方法に関する。また、本
発明は、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの
濃度（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃
度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）を算出し、その比率を指標とす
る、脳梗塞を検出する方法に関する。更に、本発明の好
ましい態様においては、前記の濃度測定を免疫学的測定
法又は生化学的測定法に基づいて行う。
【０００７】本明細書において、「ニックβ２グリコプ
ロテインＩ」とは、前記のとおり、プロテアーゼにより
アミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド
鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結
合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。具体的
には、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」には、例
えば、（１）プラスミンにより第Ｖドメインに開裂（ヒ
トβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１７番目の
リジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との間で開
裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩ、及び
（２）顆粒球エラスターゼにより第Ｖドメインに開裂
（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１４番
目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残
基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテイン
Ｉが含まれる。
ロテインＩ」とは、前記のとおり、プロテアーゼにより
アミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド
鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結
合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。具体的
には、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」には、例
えば、（１）プラスミンにより第Ｖドメインに開裂（ヒ
トβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１７番目の
リジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との間で開
裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩ、及び
（２）顆粒球エラスターゼにより第Ｖドメインに開裂
（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１４番
目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残
基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテイン
Ｉが含まれる。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明方法によれば、脳梗塞を高
感度に検出することができる。脳梗塞は、血栓による脳
動脈の閉塞により生じる疾患である。頭蓋内外の脳動脈
に、狭窄ないし閉塞により、脳循環障害が起こり、その
結果、脳組織に非可逆的に損傷が起こることにより脳梗
塞となる。脳組織の損傷により、種々の神経症状を呈す
る。脳梗塞は、生じる血管の閉塞機序により、塞栓性の
心原性脳梗塞、血栓性のラクナ梗塞、あるいは前記２者
に血行力学性因子が加わるアテローム血栓性脳梗塞に分
類される。その診断は、従来から、例えば、画像診断
（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍａｇｎ
ｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈ
ｙ）所見及び臨床所見（神経徴候、等）により行われて
いる［東ら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
第２９巻２号，第１３８項〜１４６項（２００１
年）］。また、脳梗塞（ラクナ梗塞）の診断への補助的
アプローチとして、凝血学的検査としてＴＡＴ（トロン
ビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩＣ（プラ
スミン・α２プラスミンインヒビター複合体）値、ＤＤ
（Ｄ−Ｄダイマー）値の測定が行われている［山口ら，
今日の診断指針，第３版，医学書院，第４９９項〜５０
０項（１９９２年）］。本明細書において「脳梗塞」と
は、例えば、上記の診断方法により診断された疾患病態
をいう。また、前記の脳梗塞を経験し、その後の治療経
過を観察中の病態も含まれる。
感度に検出することができる。脳梗塞は、血栓による脳
動脈の閉塞により生じる疾患である。頭蓋内外の脳動脈
に、狭窄ないし閉塞により、脳循環障害が起こり、その
結果、脳組織に非可逆的に損傷が起こることにより脳梗
塞となる。脳組織の損傷により、種々の神経症状を呈す
る。脳梗塞は、生じる血管の閉塞機序により、塞栓性の
心原性脳梗塞、血栓性のラクナ梗塞、あるいは前記２者
に血行力学性因子が加わるアテローム血栓性脳梗塞に分
類される。その診断は、従来から、例えば、画像診断
（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍａｇｎ
ｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈ
ｙ）所見及び臨床所見（神経徴候、等）により行われて
いる［東ら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
第２９巻２号，第１３８項〜１４６項（２００１
年）］。また、脳梗塞（ラクナ梗塞）の診断への補助的
アプローチとして、凝血学的検査としてＴＡＴ（トロン
ビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩＣ（プラ
スミン・α２プラスミンインヒビター複合体）値、ＤＤ
（Ｄ−Ｄダイマー）値の測定が行われている［山口ら，
今日の診断指針，第３版，医学書院，第４９９項〜５０
０項（１９９２年）］。本明細書において「脳梗塞」と
は、例えば、上記の診断方法により診断された疾患病態
をいう。また、前記の脳梗塞を経験し、その後の治療経
過を観察中の病態も含まれる。
【０００９】本発明方法においては、任意の哺乳動物
（特にはヒト）の任意の体液試料を用いることができ
る。体液試料としては、例えば、血液試料、特には血
漿、血清を挙げることができ、特に血漿を用いるのが好
ましい。
（特にはヒト）の任意の体液試料を用いることができ
る。体液試料としては、例えば、血液試料、特には血
漿、血清を挙げることができ、特に血漿を用いるのが好
ましい。
【００１０】本発明者は、後述する実施例に示すとお
り、脳梗塞患者においては、健常人と比較して、体液試
料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩの濃
度が統計学的に有意に高くなることを見出した。従っ
て、本発明方法においては、検査対象者から採取した体
液試料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩ
の濃度を測定することによって、脳梗塞を検出すること
ができる。ニックβ２グリコプロテインＩの濃度は、例
えば、免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行
うことができる。
り、脳梗塞患者においては、健常人と比較して、体液試
料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩの濃
度が統計学的に有意に高くなることを見出した。従っ
て、本発明方法においては、検査対象者から採取した体
液試料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩ
の濃度を測定することによって、脳梗塞を検出すること
ができる。ニックβ２グリコプロテインＩの濃度は、例
えば、免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行
うことができる。
【００１１】また、本発明者は、後述する実施例に示す
とおり、脳梗塞患者では、健常人と比較して、体液試料
中においてトータルβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）（すなわち、Ｒ値）が統計学的
に有意に高くなることを見出した。従って、本発明方法
においては、検査対象者から採取した体液試料中に含ま
れているニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）及
びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）を測定
し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対
するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率
（Ｎ／Ｔ）（すなわち、Ｒ値）を算出し、そしてそのＲ
値を指標とすることによって、脳梗塞を検出することが
できる。ニックβ２グリコプロテインＩの濃度は、例え
ば、前記の免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づい
て行うことができ、トータルβ２グリコプロテインＩの
濃度も、同様に、免疫学的測定法又は生化学的測定法に
基づいて行うことができる。
とおり、脳梗塞患者では、健常人と比較して、体液試料
中においてトータルβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度
（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）（すなわち、Ｒ値）が統計学的
に有意に高くなることを見出した。従って、本発明方法
においては、検査対象者から採取した体液試料中に含ま
れているニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）及
びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）を測定
し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対
するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率
（Ｎ／Ｔ）（すなわち、Ｒ値）を算出し、そしてそのＲ
値を指標とすることによって、脳梗塞を検出することが
できる。ニックβ２グリコプロテインＩの濃度は、例え
ば、前記の免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づい
て行うことができ、トータルβ２グリコプロテインＩの
濃度も、同様に、免疫学的測定法又は生化学的測定法に
基づいて行うことができる。
【００１２】前記のニックβ２グリコプロテインＩの免
疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号公
報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反応
しないが、ニックβ２グリコプロテインＩとは反応する
モノクローナル抗体」（以下、抗ニックＧＰＩモノクロ
ーナル抗体と称することがある）又はその抗体フラグメ
ントを用いて実施することができる。前記の抗ニックＧ
ＰＩモノクローナル抗体としては、好ましくは、（１）
インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、ニッ
クβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、ニックβ
２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する［特
に、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにおける（アミ
ノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残基〜第
３２６番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを
有する］モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブ
リドーマＮＧＰＩ−５９（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９２）
から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、あ
るいは、（２）インタクトβ２グリコプロテインＩとは
反応せず、ニックβ２グリコプロテインＩと反応し、し
かも、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜
第IVドメインからなる領域に反応する［特に、ヒトニッ
クβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から
数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミ
ノ酸残基からなる領域にエピトープを有する］モノクロ
ーナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマＮＧＰＩ
−６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９３）から分泌されるモ
ノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を挙げることができ
る。
疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号公
報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反応
しないが、ニックβ２グリコプロテインＩとは反応する
モノクローナル抗体」（以下、抗ニックＧＰＩモノクロ
ーナル抗体と称することがある）又はその抗体フラグメ
ントを用いて実施することができる。前記の抗ニックＧ
ＰＩモノクローナル抗体としては、好ましくは、（１）
インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、ニッ
クβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、ニックβ
２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する［特
に、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにおける（アミ
ノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残基〜第
３２６番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを
有する］モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブ
リドーマＮＧＰＩ−５９（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９２）
から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、あ
るいは、（２）インタクトβ２グリコプロテインＩとは
反応せず、ニックβ２グリコプロテインＩと反応し、し
かも、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜
第IVドメインからなる領域に反応する［特に、ヒトニッ
クβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から
数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミ
ノ酸残基からなる領域にエピトープを有する］モノクロ
ーナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマＮＧＰＩ
−６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９３）から分泌されるモ
ノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を挙げることができ
る。
【００１３】前記のトータルβ２グリコプロテインＩの
免疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号
公報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反
応し、しかもニックβ２グリコプロテインＩとも反応す
るモノクローナル抗体」（以下、抗トータルＧＰＩモノ
クローナル抗体と称することがある）又はその抗体フラ
グメントを用いて実施することができる。前記の抗トー
タルＧＰＩモノクローナル抗体としては、インタクトβ
２グリコプロテインＩ（特には、ヒトインタクトβ２グ
リコプロテインＩ）、及びニックβ２グリコプロテイン
Ｉ［特には、第Ｖドメインに開裂を受けたヒトニックβ
２グリコプロテインＩ］と反応し、好ましくはインタク
トβ２グリコプロテインＩ及びニック２グリコプロテイ
ンＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域［例え
ば、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにおける（アミ
ノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４
１番目のアミノ酸残基からなる領域］にエピトープを有
するモノクローナル抗体が好ましく、ハイブリドーマＮ
ＧＰＩ−２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９１）から分泌さ
れるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３がより好まし
い。
免疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号
公報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反
応し、しかもニックβ２グリコプロテインＩとも反応す
るモノクローナル抗体」（以下、抗トータルＧＰＩモノ
クローナル抗体と称することがある）又はその抗体フラ
グメントを用いて実施することができる。前記の抗トー
タルＧＰＩモノクローナル抗体としては、インタクトβ
２グリコプロテインＩ（特には、ヒトインタクトβ２グ
リコプロテインＩ）、及びニックβ２グリコプロテイン
Ｉ［特には、第Ｖドメインに開裂を受けたヒトニックβ
２グリコプロテインＩ］と反応し、好ましくはインタク
トβ２グリコプロテインＩ及びニック２グリコプロテイ
ンＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域［例え
ば、ヒトニックβ２グリコプロテインＩにおける（アミ
ノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４
１番目のアミノ酸残基からなる領域］にエピトープを有
するモノクローナル抗体が好ましく、ハイブリドーマＮ
ＧＰＩ−２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９１）から分泌さ
れるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３がより好まし
い。
【００１４】抗ニックＧＰＩモノクローナル抗体又は抗
トータルＧＰＩモノクローナル抗体の抗体フラグメント
としては、前記の各モノクローナル抗体のフラグメント
であって、しかも、もとの各モノクローナル抗体と同じ
反応特異性を有する抗体フラグメントを用いることがで
きる。抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、又はＦｖ等が含まれる。
トータルＧＰＩモノクローナル抗体の抗体フラグメント
としては、前記の各モノクローナル抗体のフラグメント
であって、しかも、もとの各モノクローナル抗体と同じ
反応特異性を有する抗体フラグメントを用いることがで
きる。抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、又はＦｖ等が含まれる。
【００１５】ニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的
測定法は、例えば、前記の抗ニックＧＰＩモノクローナ
ル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶
性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と体液試
料とを接触させ、続いて、第１抗体とは別種の前記の抗
ニックＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラ
グメントに標識を付した第２抗体、又は前記の抗トータ
ルＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメ
ントに標識を付した第２抗体と接触させると、前記の固
定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と
結合した前記第２抗体又は前記の固定化第１抗体−ニッ
クβ２グリコプロテインＩ複合体と結合しなかった前記
第２抗体の前記標識からの信号を検出することができる
ので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量
を測定することができる（サンドイッチ法）。
測定法は、例えば、前記の抗ニックＧＰＩモノクローナ
ル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶
性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と体液試
料とを接触させ、続いて、第１抗体とは別種の前記の抗
ニックＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラ
グメントに標識を付した第２抗体、又は前記の抗トータ
ルＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメ
ントに標識を付した第２抗体と接触させると、前記の固
定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と
結合した前記第２抗体又は前記の固定化第１抗体−ニッ
クβ２グリコプロテインＩ複合体と結合しなかった前記
第２抗体の前記標識からの信号を検出することができる
ので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量
を測定することができる（サンドイッチ法）。
【００１６】また、前記の抗ニックＧＰＩモノクローナ
ル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、
別種の前記の抗ニックＧＰＩモノクローナル抗体若しく
はその抗体フラグメント又は前記の抗トータルＧＰＩモ
ノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類
とを不溶性担体に固定化し、これらの固定化したモノク
ローナル抗体又はその抗体フラグメントと体液試料とを
接触させると、体液試料中のインタクトβ２グリコプロ
テインＩとは凝集反応を起こさず、ニックβ２グリコプ
ロテインＩとの間でのみ凝集反応を起こさせることがで
きるので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩ
の量を測定することができる（凝集法）。
ル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、
別種の前記の抗ニックＧＰＩモノクローナル抗体若しく
はその抗体フラグメント又は前記の抗トータルＧＰＩモ
ノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類
とを不溶性担体に固定化し、これらの固定化したモノク
ローナル抗体又はその抗体フラグメントと体液試料とを
接触させると、体液試料中のインタクトβ２グリコプロ
テインＩとは凝集反応を起こさず、ニックβ２グリコプ
ロテインＩとの間でのみ凝集反応を起こさせることがで
きるので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩ
の量を測定することができる（凝集法）。
【００１７】従って、前記のニックβ２グリコプロテイ
ンＩの免疫学的分析方法においては、体液試料を前処理
せずに（例えば、クロマトグラフィーの手法で、予めイ
ンタクトβ２グリコプロテインＩとニックβ２グリコプ
ロテインＩとを分離操作することなく）、そのまま使用
しても、体液試料中に存在するインタクトβ２グリコプ
ロテインＩの妨害を避けることができる。
ンＩの免疫学的分析方法においては、体液試料を前処理
せずに（例えば、クロマトグラフィーの手法で、予めイ
ンタクトβ２グリコプロテインＩとニックβ２グリコプ
ロテインＩとを分離操作することなく）、そのまま使用
しても、体液試料中に存在するインタクトβ２グリコプ
ロテインＩの妨害を避けることができる。
【００１８】サンドイッチ法を利用するニックβ２グリ
コプロテインＩの免疫学的分析方法では、具体的には、
前記の抗ニックＧＰＩモノクローナル抗体（例えば、前
記のモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９又はモノクロー
ナル抗体ＮＧＰＩ−６０）又はその抗体フラグメントを
適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不
溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、
適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆す
る。続いて、未希釈の体液試料を加えて一定時間（例え
ば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０
℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次
反応）。続いて、前記第１次抗体として用いたモノクロ
ーナル抗体とは別種の前記の抗ニックＧＰＩモノクロー
ナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した
第２抗体、又は前記の抗トータルＧＰＩモノクローナル
抗体（例えば、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３）若
しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体を
加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度
（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触
させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例
えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、
不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その
値から、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの
量を算出することができる。また、１次反応と２次反応
とを同時に行うことも可能である。
コプロテインＩの免疫学的分析方法では、具体的には、
前記の抗ニックＧＰＩモノクローナル抗体（例えば、前
記のモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９又はモノクロー
ナル抗体ＮＧＰＩ−６０）又はその抗体フラグメントを
適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不
溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、
適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆す
る。続いて、未希釈の体液試料を加えて一定時間（例え
ば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０
℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次
反応）。続いて、前記第１次抗体として用いたモノクロ
ーナル抗体とは別種の前記の抗ニックＧＰＩモノクロー
ナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した
第２抗体、又は前記の抗トータルＧＰＩモノクローナル
抗体（例えば、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３）若
しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体を
加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度
（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触
させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例
えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、
不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その
値から、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの
量を算出することができる。また、１次反応と２次反応
とを同時に行うことも可能である。
【００１９】トータルβ２グリコプロテインＩの免疫学
的測定法は、例えば、前記のニックβ２グリコプロテイ
ンＩの測定法において、抗ニックβ２ＧＰＩモノクロー
ナル抗体又はその抗体フラグメントの代わりに抗トータ
ルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメ
ントを用いて同様の方法により測定することが可能であ
る（サンドイッチ法）。
的測定法は、例えば、前記のニックβ２グリコプロテイ
ンＩの測定法において、抗ニックβ２ＧＰＩモノクロー
ナル抗体又はその抗体フラグメントの代わりに抗トータ
ルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメ
ントを用いて同様の方法により測定することが可能であ
る（サンドイッチ法）。
【００２０】前記のサンドイッチ法による免疫学的分析
方法に使用することのできる不溶性担体は特に限定され
るものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリ
アクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポ
リサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、
紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示するこ
とができる。標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は
発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例
えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、
例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、
発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、
ルシフェリン等を使用することができる。
方法に使用することのできる不溶性担体は特に限定され
るものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリ
アクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポ
リサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、
紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示するこ
とができる。標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は
発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例
えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、
例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、
発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、
ルシフェリン等を使用することができる。
【００２１】凝集反応を利用する免疫学的分析方法にお
いて、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集
反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任
意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテック
ス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げ
ることができる。モノクローナル抗体を不溶性担体に固
定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架
橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用
いる）又は物理吸着法を用いることができる。
いて、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集
反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任
意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテック
ス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げ
ることができる。モノクローナル抗体を不溶性担体に固
定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架
橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用
いる）又は物理吸着法を用いることができる。
【００２２】前記のニックβ２グリコプロテインＩ及び
トータルβ２グリコプロテインＩの濃度は、例えば、生
化学的に測定することもできる。例えば、ニックβ２グ
リコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテイン
Ｉの生化学的測定法は、過塩素酸処理したヒト血漿を、
ＨｉＴｒａｐ−Ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｌｕｍｎを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにより分画すること
で実施することができる［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１
巻，第４１７３頁〜第４１７９頁，（１９９８年）］。
この際、ニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクト
β２グリコプロテインＩは、それらの溶出位置の違いに
より（すなわち、ヘパリンに対するアフィニティーの違
いにより）、分離が可能となる。溶出フラクションのタ
ンパク定量を行うことにより、ニックβ２グリコプロテ
インＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩのそれぞ
れの量を測定することができる。前記のニックβ２グリ
コプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩ
のそれぞれの量からトータルβ２グリコプロテインＩの
濃度を算出し、これらの値からトータルβ２グリコプロ
テインＩ濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテイ
ンＩ濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ＝Ｒ）を求めることがで
きる。
トータルβ２グリコプロテインＩの濃度は、例えば、生
化学的に測定することもできる。例えば、ニックβ２グ
リコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテイン
Ｉの生化学的測定法は、過塩素酸処理したヒト血漿を、
ＨｉＴｒａｐ−Ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｌｕｍｎを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにより分画すること
で実施することができる［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１
巻，第４１７３頁〜第４１７９頁，（１９９８年）］。
この際、ニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクト
β２グリコプロテインＩは、それらの溶出位置の違いに
より（すなわち、ヘパリンに対するアフィニティーの違
いにより）、分離が可能となる。溶出フラクションのタ
ンパク定量を行うことにより、ニックβ２グリコプロテ
インＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩのそれぞ
れの量を測定することができる。前記のニックβ２グリ
コプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩ
のそれぞれの量からトータルβ２グリコプロテインＩの
濃度を算出し、これらの値からトータルβ２グリコプロ
テインＩ濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテイ
ンＩ濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ＝Ｒ）を求めることがで
きる。
【００２３】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【実施例１】《ニックβ２グリコプロテインＩの測定》
本実施例では、脳梗塞患者群、及び健常人群におけるニ
ックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定した。ここ
で、脳梗塞患者群は、脳梗塞経験者で定期的に経過観察
をしている患者である。
本実施例では、脳梗塞患者群、及び健常人群におけるニ
ックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定した。ここ
で、脳梗塞患者群は、脳梗塞経験者で定期的に経過観察
をしている患者である。
【００２４】前記の脳梗塞患者より採取された血漿検体
及び健常人より採取された血漿検体を試料とし、以下の
方法にてニックβ２グリコプロテインＩの測定を行っ
た。モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０の断片Ｆ（ａ
ｂ’）2を１０μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝
液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５
ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕１００μＬを９
６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍ
ｍｕｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェ
ルに入れて、４℃で１８時間放置した。そのプレートを
洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ
／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体
を感作したプレートのウェルに、ニックβ２グリコプロ
テインＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０
ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び
６．２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ
〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ
／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ
７．６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試
料１００μＬ、あるいは、検体血漿を同様のトリス緩衝
液Ｂにて５倍に希釈した検体試料１００μＬを加え、２
５℃で２時間反応させた。
及び健常人より採取された血漿検体を試料とし、以下の
方法にてニックβ２グリコプロテインＩの測定を行っ
た。モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０の断片Ｆ（ａ
ｂ’）2を１０μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝
液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５
ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕１００μＬを９
６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍ
ｍｕｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェ
ルに入れて、４℃で１８時間放置した。そのプレートを
洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ
／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体
を感作したプレートのウェルに、ニックβ２グリコプロ
テインＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０
ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び
６．２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ
〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ
／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ
７．６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試
料１００μＬ、あるいは、検体血漿を同様のトリス緩衝
液Ｂにて５倍に希釈した検体試料１００μＬを加え、２
５℃で２時間反応させた。
【００２５】次に、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄し
た後に、ビオチン標識モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２
３の断片Ｆ（ａｂ’）2を２μｇ／ｍＬの量で含有する
トリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０（ｐＨ７．６）〕１００μＬを加え、２５℃で
１時間反応させた。続いて、前記洗浄液Ｗ（０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３
回洗浄した後、トリス緩衝液Ｂにて２０００倍に希釈し
たペルオキシダーゼ標識アビジン（ダコ社）１００μＬ
を加え、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液Ｗで３
回洗浄した後、酵素基質液［１０ｍｍｏｌ／Ｌフェノー
ル／０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン／
０．００５％過酸化水素を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ
７．５）］を各ウェルに２００μＬずつ加え、各ウェル
の４９２ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダ
ー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。各濃度の
スタンダード試料の吸光度をもとに検量線を作製し、こ
の検量線より検体血漿中のニックβ２グリコプロテイン
Ｉの濃度を求めた。
ｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄し
た後に、ビオチン標識モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２
３の断片Ｆ（ａｂ’）2を２μｇ／ｍＬの量で含有する
トリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０（ｐＨ７．６）〕１００μＬを加え、２５℃で
１時間反応させた。続いて、前記洗浄液Ｗ（０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３
回洗浄した後、トリス緩衝液Ｂにて２０００倍に希釈し
たペルオキシダーゼ標識アビジン（ダコ社）１００μＬ
を加え、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液Ｗで３
回洗浄した後、酵素基質液［１０ｍｍｏｌ／Ｌフェノー
ル／０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン／
０．００５％過酸化水素を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ
７．５）］を各ウェルに２００μＬずつ加え、各ウェル
の４９２ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダ
ー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。各濃度の
スタンダード試料の吸光度をもとに検量線を作製し、こ
の検量線より検体血漿中のニックβ２グリコプロテイン
Ｉの濃度を求めた。
【００２６】結果を表１及び図１に示す。各群のニック
β２グリコプロテインＩ濃度の平均値±ＳＤは、健常人
群（４４例）が５８．６０±３８．９８ｎｇ／ｍＬ、脳
梗塞患者群（６３例）が１９６．６９±１４５．７５ｎ
ｇ／ｍＬであった。健常人に対して脳梗塞患者群はｐ＜
０．００１であり、統計学的に有意な差が認められた。
β２グリコプロテインＩ濃度の平均値±ＳＤは、健常人
群（４４例）が５８．６０±３８．９８ｎｇ／ｍＬ、脳
梗塞患者群（６３例）が１９６．６９±１４５．７５ｎ
ｇ／ｍＬであった。健常人に対して脳梗塞患者群はｐ＜
０．００１であり、統計学的に有意な差が認められた。
【００２７】
【００２８】
【実施例２】《トータルβ２グリコプロテインＩ及びＲ
値の測定》本実施例では、脳梗塞患者群、並びに健常人
群におけるトータルβ２グリコプロテインＩを測定し、
Ｒ値を算出した。実施例１と同じ血漿検体を試料として
使用し、以下の方法にてトータルβ２グリコプロテイン
Ｉの測定を行った。モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３
を５μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝液Ａ〔５０
ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕５０μＬを９６ウェルＥＬ
ＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−
II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに入れて、
４℃で１８時間放置した。そのプレートを前記洗浄液Ｗ
（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｎ
ａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体を感作し
たプレートのウェルに、インタクトβ２グリコプロテイ
ンＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ
／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．
２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ〔２
０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．
６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料５
０μＬ及び、検体血漿を同様のトリス緩衝液Ｂにて８０
００倍に希釈した検体試料５０μＬを加え、２５℃で２
時間反応させた。
値の測定》本実施例では、脳梗塞患者群、並びに健常人
群におけるトータルβ２グリコプロテインＩを測定し、
Ｒ値を算出した。実施例１と同じ血漿検体を試料として
使用し、以下の方法にてトータルβ２グリコプロテイン
Ｉの測定を行った。モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３
を５μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝液Ａ〔５０
ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕５０μＬを９６ウェルＥＬ
ＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−
II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに入れて、
４℃で１８時間放置した。そのプレートを前記洗浄液Ｗ
（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｎ
ａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体を感作し
たプレートのウェルに、インタクトβ２グリコプロテイ
ンＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ
／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．
２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ〔２
０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．
６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料５
０μＬ及び、検体血漿を同様のトリス緩衝液Ｂにて８０
００倍に希釈した検体試料５０μＬを加え、２５℃で２
時間反応させた。
【００２９】次に、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄し
た後に、ビオチン標識抗ヒトβ２グリコプロテインＩウ
サギポリクローナル抗体（セダレーン社）を２．５μｇ
／ｍＬの量で含有するトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／
Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，
０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕５０μＬ
を加え、２５℃で１時間反応させた。続いて、前記洗浄
液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、トリス緩衝液Ｂにて２
０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ダ
コ社）１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。
前記洗浄液Ｗで３回洗浄した後、酵素基質液［１０ｍｍ
ｏｌ／Ｌフェノール／０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノ
アンチピリン／０．００５％過酸化水素を含むトリス緩
衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１
５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕］を各ウェル
に２００μＬずつ加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける
吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ
型；東ソー）で測定した。各濃度のスタンダード試料の
吸光度をもとに検量線を作製し、この検量線より検体血
漿中のトータルβ２グリコプロテインＩ濃度を求めた。
ｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄し
た後に、ビオチン標識抗ヒトβ２グリコプロテインＩウ
サギポリクローナル抗体（セダレーン社）を２．５μｇ
／ｍＬの量で含有するトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／
Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，
０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕５０μＬ
を加え、２５℃で１時間反応させた。続いて、前記洗浄
液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、トリス緩衝液Ｂにて２
０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ダ
コ社）１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。
前記洗浄液Ｗで３回洗浄した後、酵素基質液［１０ｍｍ
ｏｌ／Ｌフェノール／０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノ
アンチピリン／０．００５％過酸化水素を含むトリス緩
衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１
５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕］を各ウェル
に２００μＬずつ加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける
吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ
型；東ソー）で測定した。各濃度のスタンダード試料の
吸光度をもとに検量線を作製し、この検量線より検体血
漿中のトータルβ２グリコプロテインＩ濃度を求めた。
【００３０】前記実施例１で測定したニックβ２グリコ
プロテインＩ濃度（Ｎ）を用いて、本実施例で測定した
トータルβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｔ）に対するニ
ックβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ
＝Ｒ）を個々の検体について算出した。その結果を表２
及び図２に示す。健常人に対して脳梗塞患者群ではｐ＜
０．００１となり、統計学的に有意な差が認められた。
プロテインＩ濃度（Ｎ）を用いて、本実施例で測定した
トータルβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｔ）に対するニ
ックβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ
＝Ｒ）を個々の検体について算出した。その結果を表２
及び図２に示す。健常人に対して脳梗塞患者群ではｐ＜
０．００１となり、統計学的に有意な差が認められた。
【００３１】
【００３２】
【実施例３】《ＴＡＴ、ＰＩＣ、及びＤＤ測定値とニッ
クβ２グリコプロテインＩ値の相関性の検定》本実施例
においては、脳梗塞患者群に関して、従来法によってＴ
ＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、
ＰＩＣ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合
体）値、及びＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値を測定し、ニッ
クβ２グリコプロテインＩ値との相関性の検討を行っ
た。本実施例でも、実施例１及び２で用いた同じ血漿検
体を使用した。前記凝固線溶系マーカーの測定は、ＴＡ
Ｔ、ＰＩＣ、及びＤＤのいずれに関しても凝集法（ヤト
ロン）を使用した。
クβ２グリコプロテインＩ値の相関性の検定》本実施例
においては、脳梗塞患者群に関して、従来法によってＴ
ＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、
ＰＩＣ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合
体）値、及びＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値を測定し、ニッ
クβ２グリコプロテインＩ値との相関性の検討を行っ
た。本実施例でも、実施例１及び２で用いた同じ血漿検
体を使用した。前記凝固線溶系マーカーの測定は、ＴＡ
Ｔ、ＰＩＣ、及びＤＤのいずれに関しても凝集法（ヤト
ロン）を使用した。
【００３３】その結果、ニックβ２グリコプロテインＩ
との相関は、それぞれ以下の通りであった。 ＴＡＴ値：ｒ＝０．０１７、 ＰＩＣ値：ｒ＝−０．０２８、 ＤＤ値：ｒ＝−０．０１８。 すなわち、いずれの測定値ともニックβ２グリコプロテ
インＩとの相関性は認められなかった。
との相関は、それぞれ以下の通りであった。 ＴＡＴ値：ｒ＝０．０１７、 ＰＩＣ値：ｒ＝−０．０２８、 ＤＤ値：ｒ＝−０．０１８。 すなわち、いずれの測定値ともニックβ２グリコプロテ
インＩとの相関性は認められなかった。
【００３４】
【実施例４】《脳梗塞患者群のＴＡＴ、ＰＩＣ、及びＤ
Ｄ測定値における正常基準値との比較》実施例３で測定
したＴＡＴ、ＰＩＣ及びＤＤ測定値を用いて、これらの
値と正常基準値（各試薬の添付文書に記載された参考基
準値による）との比較を行った。結果を表３に示す。
Ｄ測定値における正常基準値との比較》実施例３で測定
したＴＡＴ、ＰＩＣ及びＤＤ測定値を用いて、これらの
値と正常基準値（各試薬の添付文書に記載された参考基
準値による）との比較を行った。結果を表３に示す。
【００３５】
【００３６】その結果、脳梗塞患者群におけるＴＡＴ、
ＰＩＣ及びＤＤの値はいずれも正常基準値とほとんど統
計学的有意差が認められなかった。
ＰＩＣ及びＤＤの値はいずれも正常基準値とほとんど統
計学的有意差が認められなかった。
【００３７】
【発明の効果】本発明方法によれば、脳梗塞を高感度で
検出することができる。
検出することができる。
【図１】本発明方法によるサンドイッチ酵素免疫測定法
により測定した血漿検体中のニックβ２グリコプロテイ
ンＩ（ニックβ２ＧＰＩ）濃度の値を、健常人及び脳梗
塞患者群別に示した棒グラフである。
により測定した血漿検体中のニックβ２グリコプロテイ
ンＩ（ニックβ２ＧＰＩ）濃度の値を、健常人及び脳梗
塞患者群別に示した棒グラフである。
【図２】本発明方法によるサンドイッチ酵素免疫測定法
にて測定した血漿検体中のニックβ２グリコプロテイン
Ｉ濃度及びトータルβ２グリコプロテインＩ濃度から算
出した比率Ｒを、健常人及び脳梗塞患者群別に示した棒
グラフである。
にて測定した血漿検体中のニックβ２グリコプロテイン
Ｉ濃度及びトータルβ２グリコプロテインＩ濃度から算
出した比率Ｒを、健常人及び脳梗塞患者群別に示した棒
グラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 加藤 久雄
大阪府吹田市上山田８−13−1013
(72)発明者 田中 英之
東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株
式会社ヤトロン内
(72)発明者 風早 由美子
東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株
式会社ヤトロン内
Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BA13 BB14 BB20 BB31
BB41 BB51 CA26 DA36
Claims (3)
- 【請求項１】 体液試料中のニックβ２グリコプロテイ
ンＩの濃度を測定することを特徴とする、脳梗塞を検出
する方法 - 【請求項２】 体液試料中のニックβ２グリコプロテイ
ンＩの濃度（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩ
の濃度（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテイン
Ｉの濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩ
の濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）を算出し、その比率を指
標とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 濃度測定を免疫学的測定法又は生化学的
測定法に基づいて行う、請求項１又は２に記載の方法。
Priority Applications (7)
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|---|---|---|---|
| JP2001314357A JP4070443B2 (ja) | 2001-10-11 | 2001-10-11 | 脳梗塞を検出する方法 |
| DE60239281T DE60239281D1 (de) | 2001-10-11 | 2002-10-11 | Verfahren zur diagnose eines hirninfarkts |
| EP02775332A EP1443326B1 (en) | 2001-10-11 | 2002-10-11 | Method of diagnosing cerebral infarction |
| US10/492,479 US20040248200A1 (en) | 2001-10-11 | 2002-10-11 | Method of diagnosing cerebral infarction |
| AT02775332T ATE499608T1 (de) | 2001-10-11 | 2002-10-11 | Verfahren zur diagnose eines hirninfarkts |
| PCT/JP2002/010610 WO2003034066A1 (fr) | 2001-10-11 | 2002-10-11 | Procede de diagnostic d'un infarctus cerebral |
| US12/197,730 US20090004750A1 (en) | 2001-10-11 | 2008-08-25 | Method of Diagnosing Cerebral Infarction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001314357A JP4070443B2 (ja) | 2001-10-11 | 2001-10-11 | 脳梗塞を検出する方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003121444A true JP2003121444A (ja) | 2003-04-23 |
| JP2003121444A5 JP2003121444A5 (ja) | 2005-06-02 |
| JP4070443B2 JP4070443B2 (ja) | 2008-04-02 |
Family
ID=19132685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001314357A Expired - Fee Related JP4070443B2 (ja) | 2001-10-11 | 2001-10-11 | 脳梗塞を検出する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1443326B1 (ja) |
| JP (1) | JP4070443B2 (ja) |
| AT (1) | ATE499608T1 (ja) |
| DE (1) | DE60239281D1 (ja) |
| WO (1) | WO2003034066A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015129652A (ja) * | 2014-01-06 | 2015-07-16 | 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 脳梗塞の診断マーカー及び診断キット |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1853631B1 (en) * | 2005-01-24 | 2016-03-09 | Board of Regents, The University of Texas System | Fc FUSION CONSTRUCTS BINDING TO PHOSPHATIDYLSERINE AND THEIR THERAPEUTIC USE |
| CN117568445B (zh) * | 2024-01-18 | 2024-04-09 | 西南交通大学 | 一种tat、pic复合质控品的制备方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5900359A (en) * | 1993-09-29 | 1999-05-04 | Yamasa Corporation | Method for determination of oxidized lipoproteins and use thereof |
| JP2000028607A (ja) * | 1998-07-10 | 2000-01-28 | Iatron Lab Inc | 新規なモノクローナル抗体及びニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法 |
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2001
- 2001-10-11 JP JP2001314357A patent/JP4070443B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-10-11 US US10/492,479 patent/US20040248200A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-11 AT AT02775332T patent/ATE499608T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-10-11 DE DE60239281T patent/DE60239281D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-11 EP EP02775332A patent/EP1443326B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-11 WO PCT/JP2002/010610 patent/WO2003034066A1/ja active Application Filing
-
2008
- 2008-08-25 US US12/197,730 patent/US20090004750A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015129652A (ja) * | 2014-01-06 | 2015-07-16 | 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 脳梗塞の診断マーカー及び診断キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1443326B1 (en) | 2011-02-23 |
| WO2003034066A1 (fr) | 2003-04-24 |
| US20040248200A1 (en) | 2004-12-09 |
| EP1443326A1 (en) | 2004-08-04 |
| US20090004750A1 (en) | 2009-01-01 |
| EP1443326A4 (en) | 2007-08-01 |
| ATE499608T1 (de) | 2011-03-15 |
| DE60239281D1 (de) | 2011-04-07 |
| JP4070443B2 (ja) | 2008-04-02 |
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