CS217962B2 - Method of fixing the contents of the triiode-thyronine in the liquids e.g.blood serum and mixing agent for executing the same - Google Patents
Method of fixing the contents of the triiode-thyronine in the liquids e.g.blood serum and mixing agent for executing the same Download PDFInfo
- Publication number
- CS217962B2 CS217962B2 CS781613A CS161378A CS217962B2 CS 217962 B2 CS217962 B2 CS 217962B2 CS 781613 A CS781613 A CS 781613A CS 161378 A CS161378 A CS 161378A CS 217962 B2 CS217962 B2 CS 217962B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- thyronine
- enzyme
- tri
- triiodo
- antibody
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 claims abstract description 29
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- KKCIOUWDFWQUBT-AWEZNQCLSA-N L-thyronine Chemical compound C1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(O)C=C1 KKCIOUWDFWQUBT-AWEZNQCLSA-N 0.000 abstract 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 102000009488 Thyroxine-Binding Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010048889 Thyroxine-Binding Proteins Proteins 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M (4-nitrophenyl)acetate Chemical compound [O-]C(=O)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002248 Thyroxine-Binding Globulin Human genes 0.000 description 2
- 108010000259 Thyroxine-Binding Globulin Proteins 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000036124 hormone binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091011044 hormone binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- AUYYCJSJGJYCDS-UHFFFAOYSA-N 2/3/6893 Natural products IC1=CC(CC(N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 241000736355 Euthyroides Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007584 Prealbumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- ZKTLKYRAZWGBDB-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-propan-2-ylformamide Chemical compound CC(C)N(C)C=O ZKTLKYRAZWGBDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/44—Antibodies bound to carriers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu stanovení trijod-thyroninu v tekutinách, například v séru z lidské krve, jakož i přípravku к tomuto účelu, který obsahuje trijod-thyronin jako takový a enzym, který je vázán kovalentně na trijod-thyronin.
Způsob spočívá v odstranění trijod-thyroninu ze vzorku hodnoceného séra pomocí nesolubilizované anti-T3-protilátky a v působení senzibilizovaným enzymem na takto získaný zbytek; tímto senzibilizovaným enzymem je látka tvořená trijod-thyroninem kovalentně vázaným s karboanhydrázou.
Vynález se týká způsobu stanovení trijod-thyroninu v tekutinách, například v krevním séru, jakož i činidla (přípravku), určeného к provádění tohoto způsobu.
Je známo, že existují četné metody pro analýzu trijod-thyroninu [nadále zkratkou Тз) a jeho protilátky, zejména pro jejich kvantitativní hodnocení v krevním séru.
Z těchto metod lze uvést zejména následující metody.
1) Měření koncentrace celkového Тз:
a) Hodnocení pomocí saturačních analýz, které jsou vhodné к oddělení Тз od thyroxinu (Tá), přičemž takové dělení je ve skutečnosti těžkopádné a existuje vážná zábrana rutinního používání.
b) Radioimunologický test: v současné době je to nejvýhodnější metoda hodnocení triojod-thyroninu. Umožňuje používání specifické protilátky а Тз, který je značen izotopem 125J. Тз hodnoceného séra vstupuje do kompetitivní reakce se značkovanou protilátkou Тз: množství komplexu 125J-T3 je nepřímo úměrné koncentraci Тз hodnoceného vzorku. V souvislosti s touto metodou by mělo být zdůrazněno, že látky, které jsou zapotřebí, například 125J, mají poměrně krátký poločas a že hodnocení vyžaduje nákladné doplňky. Používání radioizotopů podléhá kromě toho přísnému zákonodárství veřejného zdravotnictví.
2) Měření interakce mezi hormonem a TBP(thyroxin-vazebná bílkovina):
a) Hodnocení frakce s volným hormonem pomocí dialýzy za rovnovážného stavu a ultrafiltrací.
b) Hodnocení relativní nasycenosti thyroxin-vazebných míst: vazba značkovaného Тз na pryskyřici (RT3U, tj. vazba Тз pryskyřicí),
c) kvantitativní hodnocení thyroxin-vazebných bílkovin: koncentrace TBG (thyroxin-vazebný globulin) a TEPA (thyroxin-vazebný proalbumin).
I
Ve všech těchto případech se jedná o pracné metody, které jsou založené na vazebné schopnosti TBP к hormonu a poskytují nepřímo měření cirkulujícího Тз. Metoda která měří vazbu značkovaného Тз na pryskyřici, nejvýhodnější ze všech tří, i když má nevýhody uvedené již v lb) výše.
Měření koncentrace celkového Тз a interakce mezi hormonem a TBP je možné vypočítat koncentraci volného Тз.
Nyní byl nalezen, a to je předmětem vynálezu, zdokonalený způsob stanovení trijod-thyroninu, který umožňuje jeho hodnocení i při velmi malých množstvích, řádu manogramů i méně, bez nedostatků uvedených výše, přičemž uvedený způsob zahrnuje použití nesolubilizované protilátky, která je specifická pro Тз. Do rozsahu tohoto vynálezu náleží i směsné činidlo, tvořené příslušným enzymem, který je konvalentně vázán к témuž Тз (senzibilizovaný Е-Тз enzym).
Předmětem vynálezu je tedy zdokonalený způsob stanovení obsahu trijod-thyroninu v tekutinách, například v krevním séru, spočívající v extrakci trijod-thyroninu ze vzorku zkoumané tekutiny pomocí nesolubilizované anti-trijodthyroninové protilátky a působením senzibilizovaným enzymem na takto získaný zbytek, který se v podstatě vyznačuje tím, že se jako senzibilizovaného enzymu používá látky tvořené kovalentní vazbou karboanhydrázy s trijodthyroninem.
Směsné činidlo к provádění tohoto způsobu podle vynálezu spočívá v podstatě v tom, že obsahuje trijod-thyronin ve směsi s látkou tvořenou kovalentní vazbou karboanhydrázy s trijodthyroninem.
Insolubilizace, jak známo, umožňuje získat imunoabsorbující protilátky, které mají vysokou imunologickou specifičnost a afinitu. Použitím přípravku uvedeného výše, se tyto vlastnosti stupňují a systém získává především zcela mimořádnou stabilitu, která je takového druhu, že dovoluje dospět к výsledkům, které byly ve světle obvyklých znalostí zcela nepředpokládatelné: trijod-thyronin lze stanovit, i když je přítomen v mimořádně malých množstvích a reprodukovatelnost metody je velice vysoká. Tato skutečnost je tím více pozoruhodná proto, že je obecně známo, že trijod-thyronin je inhibitorem enzymové aktivity několika enzymů, například lysozymu, se kterým tedy vytváří nerozpustný komplex.
Výběr enzymů pro imunoenzymový test musí být uskutečněn podle následujících kritérií:
a) enzym musí mít vysokou specifickou účinnost při takovém pH, aby nedocházelo ke ztrátě vazby protilátka-antigen,
b) enzym musí být takového druhu, aby mohl být snadno stanoven,
c) enzym musí být možno získávat snadno ve vysoce čisté, rozpustné a stálé formě,
d) enzym musí mít reaktivní skupiny, na které lze vázat jiné molekuly beze ztráty biologické účinnosti,
e) enzym nesmí být inhibován látkami přítomnými v krevním séru.
Stanovení způsobem podle tohoto vynálezu se provádí v praxi extrakcí Тз ze zkoumnaého Vzorku pomocí afinitní chromatografie na nesolubilizovaný anti-Тз protilátce, přičemž chromatografie se provádí buď na sloupci nebo ve zkumavce. V tomoto stupni se dosáhne koncentrace zkoumané látky a složky, které by mohly potenciálně interferovat s analýzou se odstraní. Potom se na sloupec působí roztokem Е-Тз a v efluentu se stanoví .zbytková enzymová aktivita.
Jestliže vzorek neobsahuje hodnocené látky (Тз), protilátka blokuje senzibilizovaný enzym (Е-Тз) a inhibuje jeho aktivitu. Jestliže je naopak látka přítomna vstupuje do kompetitivní reakce s enzymem a protilátkou, přičemž dovoluje, aby si alespoň část molekul protilátky uchovala aktivitu.
Z předchozího vyplývá, že imunoenzymový způsob stanovení trijod-thyroninu podle vynálezu je účinný, protože umožňuje přímé měření cirkulujícího hormonu, i když je přítomen v mimořádně nízkých koncentracích: takový způsob kromě toho neinterferuje s látkami, které jsou přítomny v krevním séru a lze jej snadno provádět.
Je zřejmé, že způsobu podle vynálezu lze používat ke stanovení anti-Тз protilátek v míře postačující к insolubilizaci Тз, načež se s insolubilizovaným Тз uvádí ve styk nejprve vzorek a potom enzym, který je kovalentně vázán na anti-Тз protilátku. Nakonec se zjišťuje reziduální enzymová účinnost: jestliže vzorek neobsahuje protilátky, je výsledkem komplelx Е-АЬ.Тз a enzymový účinek nelze stanovit. Jestliže jsou naopak ve vzorku přítomny protilátky, vytvoří komplex Тз.АЬ a je možné stanovit účinnost konjugovaného E-Ab.
Materiál pro provádění testů
Karboanhydráza a hovězí sérum-albumin byly výrobky firmy Bohringer-Mannheim Co. l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid byl výrobkem firmy Sigma. 3,5,3’-trijodthyronin a glutarový aldehyd byly dodány firmou Fluka. Reagencie pro elektroforézu byly dodány firmou Bio-RAD. Všechny ostatní produkty byly dodány firmou Carlo Erba nebo Merck.
Výsledky testů
A) Příprava anti-Тз protilátek:
miligramů (mg) BSA (hovězí sérový albumin) bylo rozpuštěno v 25 ml vody а к tomu bylo přidáno 150 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyljkarbodiimidu. Potom bylo přikapáno 100 mg Тз rozpuštěného v 5 mililitrech Ν,Ν-dimethylformamidu. Asi po 5 minutách bylo přidáno 50 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu.
Reakce probíhala po dobu 18 hodin při teplotě místnosti ve tmě a za míchání. Po skončení reakce byl vzorek odstředěn a dialyzován za časté výměny destilované vody po dobu 72 hodin. Počet zbytků Тз inkorporovaných v každé molekule albuminu byl stanoven spektrofotometricky za použití koeficientu 6,100 M1 cnr1 při 320 nm (nanometry). Výsledek ukazuje, že každá molekula BSA je konjugována asi s 5 zbytky Тз. Ultrafialová spektra konjugátu BSA s Тз-BSA jsou uvedena na diagramech 1 a 2 obr. 1 připojeného výkresu. Protilátky byly získány sekvenční imunizací králíků konjugátem T3.BSA. К titraci protilátek byla použita metoda pasivní aglutinace: ta představuje klasickou metodu sérologie a sestává v potahování erythrocytů zpracovaných před tím taninem, hodnocení antigenem a potom z provedení aglutinačního testu.
Protilátka, která byla získána, měla hodnotu 1 : 8000. Čištění protilátky se provádí odstředěním séra a zředěním supernatantu stejným objemem vody a stejným objemem nasyceného roztoku síranu amonného tak, aby se dosáhla konečná koncentrace 33 %. Po 15 minutách byla směs odstředěna při 4000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut a sraženina resuspendována v solném roztoku a znovu srážena síranem amonným, dokud nebylo dosaženo úplného odbarvení roztoku. Sraženina, extrahovaná solným roztokem, byla dialyzována proti dvěma výměnám solného roztoku při teplotě 4 C až do úplného odstranění síranu amonného.
B) Příprava imuno-absorpčních protilátek na polyakrylamidu
Biogel P-300 byl hydratován po dobu 24 hodin a promyt mnohokrát ve stejném prostředí. Ke 100 ml hydratovaného gelu bylo přidáno 500 ml 6% roztoku glutaraldehydu v 0,1 M fosfátového pufru při hodnotě pH 7,0. Roztok byl inkubován přes noc při teplotě 37 °C. Gel byl potom promyt 10 až 20krát vodou za použití objemu 500 ml pro každé promývání. 10 ml aktivovaného gelu bylo smícháno s 12 ml krevního séra. Roztok byl pomalu míchán při teplotě místnosti po dobu 14 hodin, odstředěn při 3000 ot./ /min. po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a supernatant byl odstraněn, aby bylo zhodnoceno množství protilátky, která nebyla absorbována. Částice gelu byly potom promyty isotonickým pufrem, až optická hustota supernatantu byla nižší než 280 nm. Množství protilátky, která byla konjugována, bylo 23 mg v ml gelu.
C) Příprava konjugátu Тз-karboanhydrázy (Тз.ВСА) mg karboanhydrázy bylo rozpuštěno ve 25 ml vody a smíchání se 30 mg l-ethyl-3- (3-dimethylaminopr opyl) karbodiimidu, bylo přikapáno 20 mg Тз rozpuštěného v 5 mililitrech Ν,Ν-dimethylformamidu, přičemž hodnota pH byla udržována mezi 5,5 a 6,0. Roztok byl udržován za stálého míchání při teplotě místnosti v temnotě po dobu asi 18 hodin. Po dokončení tohoto stupně byl vzorek odstředěn a dialyzován za časté výměny vody při teplotě 4 °C po dobu asi 4 hodin.
— ..... ?
Spektrofotometrická analýza ukázala, že zbytek Тз byl konjugován s jednou molekulou karboanhydrázy. Zbytková enzymová aktivita konjugátu odpovídala asi 50 % aktivity nativního enzymu. Тз-ВСА konjugát byl homogenní a jak bylo zjištěno pomocí elektroforézy odlišný od nativního enzymu.
D) Stanovení Тз
Kalibrační křivka se vynáší na začátku podle následujícího postupu: 1 ml protilátky insolubilizované na Bio-Gelu P-300 se umístí na sloupci (0,5X0,5 cm) termostaticky udržovaném při teplotě 25 °C. Sloupcem se nechá protékat 1 ml roztoku obsahujícího Тз-ВСА konjugát v koncentraci 0,5 M. Sloupec se ponechá stát po 1 hodinu, potom se promyje 1 ml isotonického roztoku a v efluentu se stanoví zbytková biologická aktivita konjugátu. Biologická aktivita Тз-ВСА konjugátu se stanoví spektrofotometricky při teplotě 25 °C měřením vzrůstu absorpce při 348 nm způsobeného hydrolýzou, indukovanou p-nitrofenylacetátem. 1 ml efluentu se smíchá s 1 ml 3 milimolárního (mM) roztoku p-nitrofenylacetátu. 0,3 ml 20 mM fosfátového pufru (pH 7,4) a 0,7 ml vody. Do standardní buňky se umístí vzorek, který obsahuje všechny reagencie kromě enzymu. Pro stanovení trijod-thyroninu se v různých sloupcích, z nichž každý obsahuje 1 ml nesolubilizované protilátky, umístí postupně vzrůstající množství volného hormonu (od 3 do 70 nanogramů). přičemž reakční nádoby se ponechají stát po dobu 1 hodiny. Pryskyřice se promyje 5 ml isotonického roztoku (pufr), vymývá znovu 1 ml 0,5 mikromolárního Тз-ВСА a ponechá stát po dobu 1 hodiny. Pryskyřice se promyje znovu 1 ml isotonického pufru a v efluentu se stanoví specifická aktivita konjugátu Тз-ВСА. Obr. 2 připojených výkresů ukazuje vzestup spe cifické aktivity konjugátu Тз-ВСА jeko funkci koncentrace volného Тз (úsečka). Minimální množství, které lze změřit, je 1 až 2 nanogramy.
E) Stanovení Тз ve standardním séru lidské krve
Výše uvedeným způsobem byla analyzována tři standardní séra hypothyreoidních, euthyreoidních a heperthyroidních pacientů, přičemž byly získány následující hodnoty: 110 nanogramů na 100 ml, 236 nanogramů na 100 ml a 500 nanogramů na 100 ml. Tyto hodnoty souhlasily s údaji změřenými za použití radio-imunoligických stanovení.
Specificita protilátky, získávané podle vynálezu, byla hodnocena měřením schopností T4 podstupovat kompatitivně reakci s Тз pro antisérum. Aby se získala variace specifické aktivity konjugátu Тз-ВСА, která by byla ekvivalentní té, která byla indukována 2 nanogramy Тз, je zapotřebí 500 mikrogramů T4. Za předpokladu, že normální koncentrace T4 v lidském krevním séru je asi 80 nanogramů v mililitru, je její interference v měřicím systému zanedbatelná.
Na připojených výkresech obr. 1 představuje UF-spektrum sérum-albuminu (hovězího) a Тз-hovězího sérum-albuminového konjugátu ve vodném roztoku. Diagram 2 se týká konjugátu Тз hovězího sérum-albuminu, samotného. Diagram 3 představuje diferenční spektrum konjugátu bez hovězího sérum-albuminu.
Obr. 2 ukazuje procentuální změnu aktivity konjugátu Тз-karboanhydrázy jako funkci koncentrace volného Тз. Křivka a) je pro rozmezí od 0 do 7 nanogramů v mililitru; křivka b) je pro rozmezí od 0 do 70 nanogramů v mililitru. Účinnost byla stanovena výše uvedeným způsobem.
PŘEDMĚT vynalezu
Claims (2)
1. Způsob stanovení obsahu trijod-thyroninu v tekutinách, například v krevním séru, spočívající v extrakci trijod-thyroninu ze vzorku zkoumané tekutiny pomocí nesolubilizované anti-trijodthyroninové protilátky a působením senzibilizovaným enzymem na takto získaný zbytek, vyznačující se tím, že se jako senzibilizovaného enzymu používá látky tvořené kovalentní vazbou karboanhydrázy s trijodthyroninem.
2. Směsné činidlo к provádění způsobu podle bodu 1, vyznačující se tím, že obsahuje trijod-thyronin ve směsi s látkou tvořenou kovalentní vazbou karboanhydrázy s trijod-thyroninem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT21231/77A IT1153999B (it) | 1977-03-15 | 1977-03-15 | Composizione atta alla determinazione della triiodotironina e metodo diagnostico impiegante la stessa |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS217962B2 true CS217962B2 (en) | 1983-02-25 |
Family
ID=11178747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS781613A CS217962B2 (en) | 1977-03-15 | 1978-03-14 | Method of fixing the contents of the triiode-thyronine in the liquids e.g.blood serum and mixing agent for executing the same |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4250253A (cs) |
| JP (1) | JPS53115813A (cs) |
| AU (1) | AU515842B2 (cs) |
| BE (1) | BE864934A (cs) |
| CA (1) | CA1100869A (cs) |
| CH (1) | CH636450A5 (cs) |
| CS (1) | CS217962B2 (cs) |
| DD (1) | DD138246A5 (cs) |
| DE (1) | DE2811057C2 (cs) |
| DK (1) | DK149909C (cs) |
| FR (1) | FR2384259A1 (cs) |
| GB (1) | GB1575267A (cs) |
| HU (1) | HU182037B (cs) |
| IL (1) | IL54184A0 (cs) |
| IT (1) | IT1153999B (cs) |
| LU (1) | LU79219A1 (cs) |
| NL (1) | NL177627C (cs) |
| NO (1) | NO150813C (cs) |
| SE (1) | SE430185B (cs) |
| SU (1) | SU1158029A3 (cs) |
| YU (1) | YU41429B (cs) |
| ZA (1) | ZA781364B (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4292296A (en) * | 1978-09-12 | 1981-09-29 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Diagnostic method |
| JPS6385358A (ja) * | 1986-09-29 | 1988-04-15 | Eiken Kagaku Kk | 血中遊離型トリヨ−ドサイロニンの酵素免疫測定法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1602865A (cs) * | 1964-07-16 | 1971-02-08 | ||
| NL154600B (nl) * | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| USRE29163E (en) * | 1969-03-03 | 1977-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | 1,2,3,4,10,19-Hexanor-9-oxo-5,9-seco-25D-spirostan-5-oic acid |
| NL154598B (nl) * | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| US3817837A (en) * | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
| NL171930C (nl) * | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
| US4040907A (en) * | 1974-06-20 | 1977-08-09 | Syva Company | Iodothyronine enzyme conjugates |
| CA1028643A (en) * | 1975-02-20 | 1978-03-28 | Judith I. Blakemore | Polylodothyronine immunoassay |
| NL7505699A (nl) * | 1975-05-15 | 1976-11-17 | Philips Nv | Wormoverbrenging. |
| JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
-
1977
- 1977-03-15 IT IT21231/77A patent/IT1153999B/it active
-
1978
- 1978-03-01 AU AU33703/78A patent/AU515842B2/en not_active Expired
- 1978-03-03 IL IL54184A patent/IL54184A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-03-08 ZA ZA00781364A patent/ZA781364B/xx unknown
- 1978-03-09 US US05/884,811 patent/US4250253A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-03-09 GB GB9458/78A patent/GB1575267A/en not_active Expired
- 1978-03-13 DD DD78204143A patent/DD138246A5/xx unknown
- 1978-03-13 NO NO780881A patent/NO150813C/no unknown
- 1978-03-13 LU LU79219A patent/LU79219A1/xx unknown
- 1978-03-13 FR FR7807195A patent/FR2384259A1/fr active Granted
- 1978-03-13 YU YU592/78A patent/YU41429B/xx unknown
- 1978-03-14 HU HU78SA3099A patent/HU182037B/hu not_active IP Right Cessation
- 1978-03-14 CA CA298,913A patent/CA1100869A/en not_active Expired
- 1978-03-14 DE DE2811057A patent/DE2811057C2/de not_active Expired
- 1978-03-14 CH CH277578A patent/CH636450A5/it not_active IP Right Cessation
- 1978-03-14 DK DK113278A patent/DK149909C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-03-14 SE SE7802948A patent/SE430185B/sv not_active IP Right Cessation
- 1978-03-14 CS CS781613A patent/CS217962B2/cs unknown
- 1978-03-15 SU SU782589948A patent/SU1158029A3/ru active
- 1978-03-15 BE BE185967A patent/BE864934A/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-03-15 NL NLAANVRAGE7802820,A patent/NL177627C/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-03-15 JP JP2878078A patent/JPS53115813A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1153999B (it) | 1987-01-21 |
| YU41429B (en) | 1987-06-30 |
| JPS6161064B2 (cs) | 1986-12-24 |
| CA1100869A (en) | 1981-05-12 |
| SU1158029A3 (ru) | 1985-05-23 |
| HU182037B (en) | 1983-12-28 |
| JPS53115813A (en) | 1978-10-09 |
| SE7802948L (sv) | 1978-09-16 |
| DE2811057C2 (de) | 1982-07-29 |
| YU59278A (en) | 1985-04-30 |
| LU79219A1 (fr) | 1978-06-28 |
| US4250253A (en) | 1981-02-10 |
| FR2384259A1 (fr) | 1978-10-13 |
| NO150813C (no) | 1985-01-02 |
| IL54184A0 (en) | 1978-06-15 |
| BE864934A (fr) | 1978-09-15 |
| DD138246A5 (de) | 1979-10-17 |
| AU3370378A (en) | 1979-09-06 |
| DE2811057A1 (de) | 1978-09-21 |
| ZA781364B (en) | 1979-03-28 |
| CH636450A5 (it) | 1983-05-31 |
| DK113278A (da) | 1978-09-16 |
| NL177627C (nl) | 1985-10-16 |
| FR2384259B1 (cs) | 1981-09-11 |
| NO150813B (no) | 1984-09-10 |
| SE430185B (sv) | 1983-10-24 |
| AU515842B2 (en) | 1981-05-07 |
| DK149909B (da) | 1986-10-20 |
| DK149909C (da) | 1987-03-09 |
| NO780881L (no) | 1978-09-18 |
| NL7802820A (nl) | 1978-09-19 |
| GB1575267A (en) | 1980-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Avrameas et al. | Enzyme-immunoassay for the measurement of antigens using peroxidase conjugates | |
| Locascio-Brown et al. | Liposome flow injection immunoassay: implications for sensitivity, dynamic range, and antibody regeneration | |
| US4399217A (en) | Process and a device for the determination of serum lipoproteins | |
| CA1040082B (en) | Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other | |
| EP0041426B1 (fr) | Produit de couplage entre une lectine et un ligand spécifique, obtention et application dans le domaine biologique | |
| JPS6343711B2 (cs) | ||
| CA1195925A (en) | Method for assaying antigen-antibody reactions and reagent therefor | |
| US4536478A (en) | Method for reducing non-specific interferences in agglutination immunoassays | |
| EP0055751B1 (fr) | Procede de detection et de dosage d'une substance biologique par erythroadsorption | |
| JPH10511776A (ja) | レセプター：遊離リガンド（リランド）複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット | |
| Hamaguchi et al. | Enzyme‐Linked Sandwich Immunoassay of Macromolecular Antigens Using the Rabbit Antibody‐Coupled Glass Rod as a Solid Phase | |
| CA1168580A (en) | Immunological reagent for the detection of tubes of the rheumatoid factor in a biological specimen and process for preparing this novel reagent | |
| Kane | Use of sodium salicylate as a blocking agent for cortisol-binding-globulin in a radioimmunoassay for cortisol on unextracted plasma | |
| Borrebaeck et al. | Thermometric enzyme linked immunosorbent assay in continuous flow system: Optimization and evaluation using human serum albumin as a model system | |
| CA2148971A1 (en) | Calibrator matrix | |
| CS217962B2 (en) | Method of fixing the contents of the triiode-thyronine in the liquids e.g.blood serum and mixing agent for executing the same | |
| CA1215322A (en) | Enzyme immunoassay | |
| JPH0421819B2 (cs) | ||
| EP0061071B1 (en) | Activated apoglucose oxidase, method of preparing it, its use in specific binding assay methods and reagent means and test kits containing it | |
| JPS61186855A (ja) | チロキシンを形成するグロブリンの結合能力を測定する方法 | |
| AU703940B2 (en) | Regenerable solid phase for carrying out specific binding reactions | |
| EP0100395B1 (en) | Reagent for determination of human urine kallikrein | |
| JP2704760B2 (ja) | 凝集抗体 | |
| JPH07159404A (ja) | スピンラベルしたビオチンを用いた物質の測定方法 | |
| CA1203741A (fr) | Procede de detection et de dosage d'une substance biologique par erythroadsorption |