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Enzymmodulator-Ligand-Konjugat und Verfahren
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unter dessen Anwendung zur Bestimmung von Liganden und insbesondere
biologisch wirksamen Verbindungen Die Erfindung betrifft ein Enzymmodulator-Ligand-Konjugat
und Verfahren unter dessen Anwendung zur Bestimmung eines Liganden und insbesondere
biologisch wirksamen Verbindungen.
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Es sind bereits eine Reihe von chemischen Verbindungen, Komplexen
oder Konjugaten beschrieben worden, die eine besondere Anwendung in der medizinischen
Diagnose finden
können. Dort besteht ein Bedürfnis nach schnell
durchzuführenden, exakten Bestimmungsmethodiken für biologisch wirksame Systeme,
die zudem häufig in äusserst niedriger Konzentration vorliegen. Dies können Wirkstoffe
von Arzneimitteln, Drogen oder Narkotika in Körperflüssigkeiten, wie Blut oder Harn,
oder auch durch den Körper selbst auf natürlichem Wege synthetisierte Gruppierungen
darstellen. Als solche können Hormone, Steroidhormone, Polypeptide, wie auch Prostaglandine,
Toxine, etc., angeführt werden.
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Es wurden eine Reihe von Methodiken entwickelt, die auf der Fähigkeit
eines Rezeptors, im allgemeinen eines Antikörpers, mit einem Liganden einen Komplex
mit hoher molekularer Spezifität zu bilden, beruhen. Während die Spezifität dieser
Techniken im wesentlichen auf der Schlüssel-Loch-Komplementarität beruht, ist die
Empfindlichkeit unter anderem von der Komplexbildungskonstante (thermodynamische
Gleichgewichtskonstante) von Rezeptor und Ligand abhängig. Bei Verwendung eines
markierten Liganden und einer Konkurrenzreaktion von markiertem und unmarkiertem
Liganden, um die Bindungsstellen, ist die Menge des gebundenen markierten (bei konstanter
Konzentration) Liganden eine Funktion der Konzentration des unmarkierten Liganden.
Sur Auswertung ist es dann erforderlich, dass entweder (a) freier und Antikörper
gebundener markierter Ligand durch geeignete Verfahren getrennt werden: z.B.
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heterogene Methodiken, wie RIA oder ELISA , oder
(b)
freier und rezeptorgebundener markierter Ligand unterschiedliche Signale geben.
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Als Markierung für die Liganden sind eine Reihe von Stoffgruppen mit
speziellen physikochemischen oder biochemischen Eigenschaften bereits beschrieben
worden.
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Insbesondere wurden die Liganden mit Stoffgruppen, wie Erythrocyten,
Latexteilchen, Radioisotopne, freien Radikalen, präparierten Bakteriophagen, fluoreszierenden
Gruppen und Enzymen umgesetzt. Bezüglich eines solchen Standes der Technik wird
z.B. auf die DE-AS 22 23 385, DE-OS 27 55 008 oder auch "Das Medizinische Laboratorium",
S. Hirzel Verlag, Stuttgart, Band 31, May 1978, Heft 5, verwiesen.
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In jüngerer Zeit ist auch der Einsatz von reversibel bindendem Enzymmodulator,
der sich in nicht kovalenter Weise mit einem Enzym umsetzt, als Marker in der DE-PS
27 54 086 beschrieben worden. Dadurch, dass der Enzymmodulator sich in reversibler,
nicht kovalenter Weise mit dem Enzym verbindet, ist es möglich, entweder durch die
hemmende oder stimulierende Wirkung des Modulators auf die Enzymaktivität in der
nachgelagerten Messreaktion analytische Bestimmungen durchzuführen. Daher wird in
dieser Druckschrift nicht nur besonderer Wert auf eine reversible, nicht kovalente
Bindung des Enzymmodulators mit dem Enzym, sondern auch darauf gelegt, dass die
Bindungskonstante für die Assoziation des Enzymmodulators mit dem Enzym vorzugsweise
im Bereich zwischen ungefähr 105 und ungefähr 109 und in jedem Fall unter 1011 Mol
1 liegt. Eine Reihe, diese Bedingungen erfüllender Enzymmodulatoren sind dort genannt
worden.
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Durch die Bereitstellung von reversiblen, nicht kovalent bindenden
Enzymmodulatoren ist es zwar gelungen, ein weiteres Markierungssystem den bereits
vorbekannten hinzuzufügen, ohne allerdings der ständigen Nachfrage nach der Schaffung
von markierten Konjugaten genügen zu können, die einen weitgehendst störungsfreieren,
mit hoher Empfindlichkeit an zeigenden Nachweis, der einfach durchzuführen ist,
gestatten. Während bs spielsweise bei den Radio Immuno Assay Methoden die Gefahren
der Handhabung radioaktiv markierter Substanzen, entsprechende behördliche Auflagen
etc. hinderlich sind, beim Einsatz fluoreszierender Gruppen sich ein sehr limitierter
Einsatz unter anderem aufgrund von Verstärkungsproblemen ergeben, hat sich bei der
Verwendung von reversiblen, nicht kova-lent gebundenem Enzyminhibitor-Ligand-Komplexen
das Problem mangelnder Sensibilität der Analysenmethode gezeigt. Diese ist nämlich
direkt abhängig von einer Bezugsfunktion, die der Sättigungsfunktion des Bezugsenzyms
mit dem Enzymmodulator-Ligand-Konjugat entspricht und somit durch die Affinitätskonstante
K des Inhibitorkonjugats-Enzym limitiert. Durch Versuche hat sich gezeigt, dass,trotz
hoher Affinitätskonstanten von Rezeptor-14 Ligandensystemen in der Grössenordnung
von 1010 bis 10 Mol 1 sich bei Einsatz von reversibel, nicht kovalent bindenden
Enzymmodulatoren nur Sensitivitäten des Messsignals im Mikromolbereich ergeben,
die den steigenden Anforderungen an die Exaktheit der Methodik nicht immer entsprechen.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neuartig markierte Systeme
zu schaffen. Hiernach soll es insbesondere möglich sein, durch die Bereitstellung
neuartiger Ligand-Marker-Konjugate, die bestehenden Analysenmethodiken zur
Bestimmung
von Haptenen, Antigenen, etc., zu bereichern und zu verbessern. Insbesondere soll
die Bereitstellung der neuartigen Systeme eine hohe Ansprechbarkeit im p-Mol-Bereich
der Analysenmethodiken ermöglichen, die möglichst störungsfrei, bequem auf - sofern
gewünscht -homogene Weise durchführbar sein soll; Die erfindungsgemäse Aufgabe wird
durch die Schaffung eines Enzymmodulator-Ligand-Konjugates gelöst, dessen Enzymmodulatorkomponente
zur irreversiblen Aktivitätsbeeinflussung und/oder kovalenten-Binduns von Bezugsenzym
befähigt und vorzugsweise diese Eigenschaft durch Anwesenheit von Rezeptor - üblicherweise
geeignetem Antikörper -beeinflussbar ist.
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Mit der Bezeichnung "Ligand" werden hier grundsätzlich all diejenigen
Liganden erfasst, die in der DE-AS 22 23 385 in den Spalten 22 bis 46 beschrieben
worden sind, worauf ausdrücklich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Bezug
genommen wird. Die - kovalente - Bindung des Enzymmodulators an den Ligand erfolgt
dabei i.a. an den Stellen des Liganden, wie dies ebenfalls in der DE-AS 22 23 385
beschrieben worden ist. Lediglich zur Erläuterung sei hier kurz angeführt, dass
es sich hierbei unter anderem um Antigene, um Haptene oder auch um natürlich vorkommende
Rezeptoren handeln kann. Unter diese Gruppe fallen eine Fülle biologisch aktiver
Systeme, wie Hormone, z.B. Thyroxin, viele Steoride, wie die östrogene, Kortison,
Kortikosteron oder östradiol, Polypeptide, wie Insulin aber auch Wirkstoffe von
Arzneimitteln als solche, wie z.B. Pros glandine, Zucker, häufig eingenommene Dorgen,
wie Benzdiazepione Antibiotika, etc..
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Bei der Bezeichnung "Rezeptor" handelt es sich im Regelfall um sogenannte
Antikörper, deren Gewinnung beispielsweise
durch Immunisierung
von Tieren mit entsprechend hoch gereinigtem Antigen, Carrier-gebundenem Hapten,
etc., bekannt ist. Die Antikörper sind häufig -Globuline, die, wie eingangs ausgeführt,
mit hoher Spezifität den Liganden zu binden vermögen. Unter der Bezeichnung Rezeptor
sollen hier neben normalen Antikörpern auch sogenannte Anti-Inhibitor-Antikörper,
gegebenenfalls in Kombination mit Anti-IgG-Antikörpern und/oder auch Fab-Fragmente
verstanden werden.
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Mit der Bezeichnung Bezugsenzym werden solche Enzyme bezeichnet, die
sich in einer Messreaktion mit der Enzymmodulatorkomponente des Enzymmodulator-Ligand-Konjugates
praktisch irreversibel und'oder kovalent binden, wodurch sich eine dementsprechend
quantitative "Störung"bzw. "Blockierung der Enzymaktivität ergibt. Die Bezugsenzyme
können somit aus der Reihe der auf dem Gebiet der Enzymologie bekannten Enzyme in
Abstimmung mit der gewählten Enzymmodulatorsubstanz des Konjugatkomplexes ausgewählt
werden. Diese können im Hinblick auf die Kriterien der Billigkeit, der Spezifität
der Wirkung, ihrer Stabilität, ihrer Nachweisbarkeit, ihres Nichtvorliegens im endogenen
System, etc., gewählt werden, wobei lediglich illustrativ z.B. D.H.F.-Reduktase,
Pepsin, vorteilhaft auch in derivatisierter Form, z.B. als Acetylverbindung, Chymotrypsin,
Esterase, Leucin, Aminopeptidase, Cathepsin D, Proteinase, etc., genannt werden
können.
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In überraschender Weise wurde gemäss der Erfindung gefunden, dass
Enzymmodulatoren, die in kovalenter Weiseund/ oder praktisch irreversibel quantitativ
das zugehörige Enzym binden und somit zu einer praktisch irreversiblen
und
quantitativen "Störung" bzw. "Blockierung" der Enzymaktivität in der Lage sind,
diese Eigenschaft auch in Enzymmodulator-Ligand-Konjugaten beibehalten, wobei sich
zusätzlich gezeigt hat, dass diese Eigenschaft durch den Hinzutritt von Rezeptor,
im allgemeinen Antikörper, blockiert werden kann. Hierdurch ergeben sich eine Reihe
von im folgenden noch weiter zu erörternden Vorteilen.
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Das Enzymmodulator-Ligand-Konjugat, wird im allgemeinen aus dem quantitativ,
irreversibel undyoder kovalent bindenden Enzymmodulator und dem Ligand nach Methodiken
analog erzeugt, die aus der Bildung von Ligand-Marker-Konjugaten, bei denen andere
Markersubstanzen, wie z.B. Enzyme, Coenzyme, etc., Verwendung finden,grundsätzlich
bekannt sind. Die Kopplungsreaktionen hängen im wesentlichen von den am Ligand bzw.
Enzymmodulator zur Verfügung stehenden bzw. einführbaren reaktiven bzw. aktivierbaren
Gruppen ab. Im allgemeinen werden die bekannten Methoden der Peptid-Chemie,der Affinitätschromatografie,
der Solid-Phase-Technologie, ganz analog angewandt. Mit Vorteil kann man, z.B. bei
kleinen Haptenen, analoge Reaktionen, die zur Synthese des Antigens, d.h. Kopplung
an Albumin, Thyroglobulin etc., verwendet werden, einsetzen. Vorteilhaft sind auch
Kopplungsverfahren mit bifunktionellen Reagentien, wie z.B. Carbodiimiden (z.B.
1-Cyclohexyl-3- (morpholinäthyl) -carbodiimid), Glutaraldehyd, m-Maleinimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester,
etc., sowie spezielle Verfahren, wie die reduktive Sminierung, gemischte Anhydrirlmethnden,
Thioätherverfahren, etc. Bei grösseren Liganden ist manchmal auch die Einführung
einer verlängerten Kette, auch "Spacer" oder "Brücke" genannt, mit einer Länge von
etwa 1 bis 20 C-Atomen vorteilhaft.
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Wesentlich ist bei der zur Bildung des Enzymmodulator-Ligand-Konjugates
führenden Kopplungsreaktion, dass die in dem gebildeten Konjugat enthaltende Enzymmodulatorkomponente
zur quasi irreversibelen und/oder kovalenten Bindung des gewählten Bezugsenzyms
befähigt bleibt und hierdurch eine irreversible"Aktivitätsstörung" regelmässig die
völlige Aktivitätsblockierung erhalten bleibt. Diese Eigenschaft der Enzymmodulatorkomponente
des Enzymmodulator-Ligand-Konjugates ist vorteilhaft durch den Zutritt von geeignetem
Rezeptor beeinflussbar und bei Anwendung geeigneter Verfahrensführung im allgemeinen
quantitativ abschirmbar, wodurch sich eine überaus empfindliche Beeinflussung der
Bezugsmessreaktion Enzym:Substrat ergibt. Letztere kann dann zur Be-Bestimmung des
Liganden in homogenen wie heterogenen Verfahren ausgenutzt werden.
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Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besitzt
der Enzymmodulator im Konjugat eine Affinitätskonstante zum Bezugsenzym von 1010
bis 1015. und vorzugsweise von 1011 bis bzw. mehr als 1011 bis 1014 Mol-1 Als Enzymmodulator
kommen mit Vorteil sogenante "Affinity-Labeling-Substanzen" bzw."Active site directed"-Reagentien
in Betracht, die sich unter Erhalt ihrer charakteristischen Eigenschaften an Liganden
binden lassen. Unter diesen kommen Ks-Reagentien, K+5+-Reagentien und Kcat-Reagentien,
die auch "suizide" Reagentien genannt werden, in Frage, wobei hierunter im allgemeinen
Modulatoren des K+s+-Typus aufgrund ihrer extrem spezifischen Wirkung bevorzugt
sind. Nachstehend werden beispielhaft im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugte
Enzymmodulatoren angeführt, die sich für die Bildung des erfindungsgemässen Konjugates
eignen. In der nachfolgenden Aufstellung sind neben
der Modulatorkomponente,
die eine Inhibitorkomponente darstellt, auch zugehörige "Bezugsenzyme angeführt:
| Enzym Inhibitor |
| Alcollol- |
| debydrogellase H OH |
| H. |
| dellydrogenase | NH |
| hInlnt- H I~O |
| dehydrogenase .C=O |
| Olutamat- |
| dellydrogellase |
| O O |
| IIRCLRI- %-C'cP |
| dcIytl r(>gt'Ilat' |
| Oxalat |
| Triosel)liosplnlt~ n-Tllreose 2,4-bispllosllllal |
| dc1ydrogcmt.c |
| Transe nrboxylase ()xalaH |
| I'yruval- kinnse |
| NH-Asp |
| Aspartat CH, |
| tnult;carl,- 0=p-oI( |
| nmylase dII |
| PALA |
| H |
| R-C--COOH |
| Pyri<Iuamii- NH |
| pyruvnt~ CRt |
| trans:llllillase + |
| u |
| Pyridoxylalanin |
| 00000 |
| II II II II |
| A(iellylalkinase 5' AOPOi:OPOPGPO5' A |
| 00000 |
| H H H H H |
| Crentin~kinllse |
| Arginin kinnYe AOPOPO--NO,--NHsR |
| -Rezym aLi>i(or |
| ArvtyI(IL()!i:- Borsäuren |
| esternYe |
| Chylllotryl)#i |
| SUI)tilisitz |
| H |
| I'al>nio R--E |
| Ilaalnuc 1' |
| AspnnrRitlnae |
| Ami(l:lse Aldehyde. |
| (hemlacet.lle) |
| 069 |
| Glynono- |
| iaclon. |
| C;lyclsi<llwrn lartoa |
| 0 |
| CO NH, |
| 1-Amlno- |
| glycosid |
| HO |
| HtC il |
| Purin- yy/if |
| dentllilla.«5erl |
| H OH |
| H |
| uK |
| v |
| Pyrimi(lill H OH |
| deaini'ia.c n |
| II |
| ¢- cM,-CH-COOH |
| carboxy- |
| peptidase A |
| HO-C=O |
| senzylsucetnat |
| Enzylll IniIl,ilor |
| Oxalt)aeetat- Osalllt |
| de( nrlxoxylase |
| PIOP |
| I(olr)cooll |
| Ril,tlloe His- l>i?i- |
| OH |
| Dhosl'llst- HHCIOH |
| rarlosyltrsc CH,OP |
| CIZor |
| c'-0o- |
| bl<lolasc CII, |
| OP |
| 2-PhofiphoRlycr>lo- |
| hydroxamat |
| COOH |
| cO |
| CII |
| e(3 NH |
| i'rolill rnteemnso coOG |
| H |
| Steroitl |
| -i.uIncra.<, $i) |
| TriosephoHpilat- o |
| isomerase C-0' |
| R |
| Clueose-o- NH-OH |
| phosphotu C~ 0°II |
| isomerase C- 0 |
| Enzym Inhibitor |
| Aminosäure AMP-O-C112- Cl'R-Nit?+ |
| aktivierende |
| Enzyme CH, |
| I crl, |
| O=SNPe |
| <;lutall) CE ) |
| epntllc!lasc. (CB,), |
| NH,- C-COOII |
Besonders günstige Ergebnisse werden auch mit D-Galactal (ß-Galactosidase)
erhalten.
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Eine weitere bevorzugte Klasse von Enzymmodulatoren, die sich für
die Bildung des erfindungsgemässen Konjugates eignen, sind Haloketonanaloge von
NAD
| Icagerz Enzyne |
| 0 |
| »gCCH,8r |
| LActnt |
| dchydropcnnse |
| NAI) kinase |
| 3-Bromoacetyl- |
| pyridin |
| 0 |
| CCH,Br |
| N |
| N |
| CH2CH2COOH Lact:t |
| dcllydr<lgennsa |
| 3-Bromoacetyl |
| 1 -carboxyethyl |
| pyridinium (ion) |
Alkoholdehydrogenase P-[3-(2-Bromoacetylpyridinium)propyl]-P²-5'-adenon-5'-yl diphosphat
Leber-Alkoholdehydrogenase Nicotinamid [5-(bromoacetyl)-4-methylimidazol-1-yl]dinucleotid
Alkoholdehydrogenase Estradiol 17ßdehydrogenase 3-Chloroacetylpyridinium adenin
dinucleotid
Andere, für die Bildung der erfindungsgemässen Konjugate
besonders geeignete Verbindungen sind "Site-specific"-Haloketone, z.B. gemäss nachstehender
Formel, die sich besonders gut für Bestimmungen der ebenfalls angegebenen Proteine
als Bezugsenzyme eignen:
| Reagen z Protein |
| II,I3r |
| c=o |
| ßNOZ Trallsgitlltttllillltffe |
| I3 NO, TnuluKll(aminrrNC |
| 2-Bromo-4'-hydroxy-3'- |
| nitroacetophetnJn- |
| /-=-7 11 C-CH,CI |
| H3Co SN HCi1 |
| ½ Lu(:fcrase |
| (S)-N-,fee-(ChloroacetylJphenethyli- |
| p-toluenesulíonanHde |
| 0 |
| II |
| -cIi2CI |
| NH2- C- t |
| H2 Tyr, I'llo.trrLnsport |
| I,roteiir in |
| Uucillus sulliliu |
| (S)-3-Amtnn.l-chloro- |
| 4-phenyl-2-butanon |
| -cH2cl Neutrale Amino- |
| H2NH, säure-transport- |
| protein |
| l-Amlno-3-chloro- in Trypanosoma |
| 2-propanon brucci |
| Rengcnz Protein |
| CH2Dr |
| N1- -U |
| CHsCll vlsoleucill: tltblA |
| (H2 linse |
| CEX, |
| (3S,4S)-3-Amlno-l-bronlo- |
| rl-methyl--hcxanon |
| 0 |
| I I |
| NH,-C-II |
| 4}{2 Carl,Rmyll,llosl>Ilnt- |
| ¢=0 synl)lctn?ic |
| CH2CL |
| (S)-2-Amlno-5- |
| chlorolevullnsäure |
| 0 |
| -CI12CI |
| NHlZHC<2Cl LVnline: (ISA |
| C ligszse |
| H,C/ ligluo |
| (S)-3-Amlno-l-chloro- |
| 4-nlethyl-2-pentanon |
| 0 |
| II0- |
| c}12-op |
| 0 |
| H-Dr RibuloscLial>hoöl>lnt- |
| cH2rorio. esrboxylase |
| 0 |
| (R, 5)-3-Bronno-1, 4- |
| dlhydroxy-3-butanonw |
| 1, 4-blphosphat |
Im Hinblic- auf die Blockierung so bekannter Enzyme, wie Chymotrypsin,
Trypsin, Thrombin, Calecrein, Papain, etc., kommen halogenierte Derivate von Aminosäuren
und Peptiden mit Vorteil in Betracht, wie sie nachstehend angeführt sind.
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Inhibitor Enzyme TosPheCH3Cl Chymoirypsin Z-(Hy-Leu-PheCH3Cl Z-(Hy-Leu-PheCH3Cl
Cathepsin (1 Z-PheCH3Br Subtilisin Z-Ala-Gly-PheCH3Cl Ac-Phe-Gly-Ala-LeuCH3Cl Phe-Ala-LysCH3Cl
Boc-Gly-Leu-PheCH3Cl Streptomyres griseus protense B Ar-AlaCH3Cl Elastase Ar-Ala-Ala-AlnCH3Cl
Ar-Ala-Ala-Pro-AlaCH3Cl Tos-LysCH3Cl Trypsin Tos-ArgCH3Cl Lys-Ala-LysCH3Cl Tos-LysCH3Cl
Aerosin Tos-LysCH3Cl Thrombin 11<1 Glu-Ala-LysCH3Cl Tos-LysCH3Cl Plasmin Z-LysCH3Cl
Kallikrein Ala-Phe-LysCH2Cl Z-PheCH2Cl Carboxypeptidine Y Tos-PheCH2Cl Carboxypepthinse
C Tos-PheCH2Cl Arid carboxypeptidases Tos-PheCH2Cl Pspain Z-Gly-Leu-PheCH2Cl Tos-LysCH2Cl
Clostripsin Tos-PheCH2Cl Calbespin Bt Ac-Aln-Ala-AlaCH2Cl Tos-LysCH2Cl Cocoxmase
Schliesslich
können auch Haloacetylderivate etwa der folgenden Art angeführt werden:
| Protein modifiz.Aminosäure Produkt |
| -NH-CH-CO- |
| Papain Cystein CH1 |
| 8 C}t: COO |
| -NU-C?l-C0- |
| CarhoxypeptielaFe" (;lutami ,Cil,)2 |
| COOCE12COO- |
| -Nfl-Cl(-CO- |
| cil, |
| Cnrbonie anhyelrase' IliJtitlis N-CHCOO |
| N N- CH1-COO |
| -NH-CICO- |
| Staphyloc.occal nucle:wses Lysin (Cil2)4 |
| morc-31," |
| hfOI>C-3I.3" I |
| NH-CI,COO- |
| ß-Cnlactosixlase' 3çfethioninj (cit12 )2 |
| chymotrypsirl'P j |
| HIC-S-CH, COO |
| -NH-CH-CO- |
| Trypsin11 Serin I |
| O-ClICOo |
| -NH-Cll-CO- |
| C, |
| Staphyloeoeeal nu,Iease' Tyrosin |
| 3.101'C-315" |
| 0-CH2-C00 |
Schliesslich. sind auch Inhibitoren des Aza-aminosäure- bzw.
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Aza-peptid-Typus von Interesse, wie sie beispielsweise auf Seite 215
von "METHODS IN ENZYMOLGY", Vol. 46, 1977, Academic Press, New York, San Francisco,
London, beschrieben wurden. Als weiteres mit Chymotrypsin reagierende Active-site-Substanz
sei N-Nitroso-N-benzylamid von N'-Isobutyrylphenylalanin und dessen zyklische Analoge
genannt (aaO, S. 217). Als Kcat-Reagentien können z.B.
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noch Inhibitoren von Serin und Thiolprotinasen aufgeführt werden,
wobei insbesondere auf Leupeptin als Inhibitor für Plasmin, Trypsin, Papain und
Catepsin B hingewiesen wird. Auch einige Leupeptinanaloge können in Betracht kommen,
in denen Leu durch Ile oder Val ersetzt sein kann.
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Andere Inhibitoren, die eine chemische Bindung eingehen und irreversibel
wirken, sind z.B. die folgenden Inhibitor Enzym 2-Amino-4-pentinsäure(I) -Cystathionase
2-Amino-4-chlor-4.-pentensäure (II) 3,3-Dichloralanin (III) 3,3,3-Trichloralanin
(IV) (IV) Alanin-racemase D-Cycloserin (IV) Tryptophanase Trpytophan-synthase (B2)
(IV) und (a2ß2) 2-Hydroxyl-3-butinsäure Lactat-oxidase N ,N-Trimethyl-2-propinylamin
Monoamin-oxidase ß-Aminopropionitril 2-Bromäthylamin Plasma-amin-oxidase 2-Propinylamin
2-Chlorallylamin Phenylglycin P-Nitrophenylglycid Aminoacetonitril
(IV)
ß-Cystathionase 2-Amino-3-hydroxypropyl-1,3'-carboxy-3'-amino-1'-propenyl-1-äther
L-2-Amino-4-methoxy-trans-3- Aspartat-aminotransbutensäure ferase Äthanolamin-sulfat
γ-Aminobuttersäure-α-ketoglutarat-transaminase Formylglycinamid-ribo-nucleo-Albiziin
tid-amidotransferase Azaserin Diazooxonorleucin Diazooxoanorvalin Transpeptidase
(membran-6-Aminopenicillansäure gebunden # 3-7-Aminocephalosporinsäure B6 -gebundene
Enzyme Mimosin Physo s tigim Serin-protease Methionin-sulfoxin Glutamin-synthetase
Rotlauf-Toxin (wildfire toxin) Dextranblau Enzyme mit einem Bedarf an Nueleotiden,
wie Malatdehydrogenase und Lactatdehydrogenase o-Dianisidin-dextran Peroxidase
Aber
auch andere Verbindungen kommen in Frage, wie beispielsweise proteingebundene Pyruvatdehydrogenase,
5-Fluor-2'deoxyuridin-5'-(4-aminophenyl)-phosphat, etc..
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Für die Herstellung der erfindungsgemässen Konjugate überaus bevorzugte
Inhibitoren, die sich sowohl durch einen hohen Wert der Affinitätskonstante als
auch eine praktisch irreversible und/oder kovalente Bindung auszeichnen, sind die
folgenden: 1. (TTPP)Thiamin-thiazolon-pyrophosphat (TTTPP)Thiamin-thio-thiazolon
Pyruvat-Dehydrogenase Phyrophosphat Pepstatin Pepsin Chymostatin Chymotrypsin Antipain
Papain Elastinal Elastase o-Dianisidin Peroxidase 2. 5-Fluor-2'-Deoxyuridylat +
5,10-Methylentetrahydrofolat Thymidylat Synthetase Dichlormethotrexat
+ NADPH DFH-Reduktase Methotrexat Aus der obigen Aufstellung wird ersichtlich, dass
erfindungsgemäss bevorzugte Enzymmodulatorkomplexe ihre hohe Bindungskonstante erst
durch gleichzeitige Anwesenheit eines oder mehrerer weiterer Reaktionspartner erhalten
können: Es liegen dann stabile komplexe vor, z.B. Komplexbildungskonstante von Methotrexat
mit DHF-Reduktase allein 109(M 1); 12 1 dagegen in Anwesenheit von NADPH 1012 (M
1) oder z.B.
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5-Fluor-2'-Deoxyuridylat mit Thymidylatsynthetase allein P 106(M 1)
in Anwesenheit von 5,10-Methylentetrahydrofolat # 1013 (M-1).
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Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden daher bevorzugt auch
Enzymmodulatoren mit "Hilfssubstanz" in Betracht gezogen, wobei die gleichzeitige
Anwesenheit dieser "Hilfssubstanz" dem Modulator die erfindungsgemäss gewünschten
Eigenschaften verleiht. Insbesondere bevorzugt sind hier wiederum Reduktasen, die
mittels NADPH-Zusatz wesentlich besser bzw. schneller mit active site directed-Substanzen
reagieren.
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Die oben genannten besonders bevorzugten Enzyminhibitoren weisen zum
grossen Teil ein recht geringes Molekulargewicht auf, und sind zum Teil durch mikrobielle
Synthese zugängig. Aufgrund des geringen Molekulargewichtes lassen sie sich durch
Rezeptoren.. auch mit besonders hoher Wirksamkeit blockieren, wodurch- sich eine
besondere Eignung für Messzwecke ergibt. Bezüglich der Synthese solcher und
anderer
Substanzen wie unter anderem auf '2The Japanese Journal of Antibiotics", Dezember
1977, S. 121 ff. hingewiesen.
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Durch eingehende Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass aufgrund
der praktisch irreversiblen und häufig quantitativen Enzyminhibierung, die durch
die Enzymmodulatorkomponente des erfindungsgemässen Konjugates ausgelöst ist, dessen
Nachweis nicht mehr von einer eventuell nur teilweisen oder im unterschiedlichen
Ausmass erfolgenden Verringerung der enzymatischen Aktivität der zugehörigen Messreaktion
abhängig ist. Dadurch liegt die Limitierung der Signalempfindlichkeit nur noch in
der Empfindlichkeit des enzymatischen Nachweises. So kann beispielsweise beim Einsatz
spezieller Enzymmodulatoren, z.
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B. Pepstatin, sowohl mit kleinen Substraten, wie z.B. Phe-Gly-His-4-Nitro-Phe-Phe-Val-Leu-OMe,
als auch mit grossen Substraten, wie z.B. Hämoglobin, eine Empfindlichkeit von kleiner
als 0,1 p-Mol erreicht werden.
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Abgesehen von der enormen Steigerung der Empfindlichkeit von Messverfahren,
in denen die erfindungsgemässen Konjugate Einsatz finden, gegenüber der Verwendung
von Konjugatkomplexen, die auf reversibel, nicht kovalent bindenden Enzyminhibitoren
aufbauen, ergeben sich weitere Vorteile bei der Bestimmung von Liganden, bei denen
die physiologischen Verhältnisse bei ihrer Bestimmung erschwerend wirken. So werden
eine Reihe 'kleiner" (Molgewicht bis 1000) Hormone, wie z.B. T3, T4, Cortisol oder
Testosteron, im Blut ebenso wie eine Reihe von Pharmaka, z.B.
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Digoxin, Digitoxin, etc., zu einem beträchtlichen Teil an endogene
Proteine , wie z.B. TBG, CBG, Albumin, etc., gebunden. Zur Gesamtbestimmung dieser
Hormone muss diese Bindung zu den Bindungsproteinen gelöst werden. Durch den Einsatz
der erfindungsgemässen Konjugate ist es nun möglich, die pH-Abhängigkeit der vorstehend
genannten Bindungen auszunützen und den pH-Wert der Lösungen so stark nach oben
(alkalisch) oder nach unten (sauer) zu verschieben, dass
die Bindung
Hormon-Serumprotein, sich nicht mehr bei der Messung störend auswirkt, während der
Rezeptor aber seine Bindungsfähigkeit beibehält. Auch hierdurch zeigen sich erhebliche
Vorteile gegenüber dem Einsatz reversibler Enzyminhibitoren in entsprechenden Ligandkonjugaten,
da diese in derartigen pH-Bereichen im allgemeinen keine ausreichende Enzyminhibierung
bzw. keine ausreichend empfindliche Nachweise ergeben.
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Bei Einsatz von Pepstatin in dem erfindungsgemässen Konjugat ergibt
sich für eine Vielzahl von zugehörigen Liganden eine praktisch irreversible Inhibierung
des Bezugsenzyms Pepsin.
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Dabei ist besonders hervorzuheben, dass die irreversible Blockierung
des Pepsins in einem pH-Bereich von 1 bis 5,5 erfolgen kann. Auf diese Weise lassen
sich Bestimmungen von proteingebundenen Liganden ohne spezielle irritierende Zusätze
(wie z.B. ANS für T4) und ohne Signalempfindlichkeitsverlust und ohne zusätzliche
Umpufferungsschritte ausführen, weshalb der Einsatz von Pepstatin in den erfindungsgemässen
Konjugaten besonders bevorzugt sein kann.
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Die hier geltend gemachten Vorteile treffen nicht nur auf Pepstatin
und dessen strukturanaloge Modifizierungen, sondern für eine Vielzahl der vorstehend
angegebenen quantitativ und praktisch irreversibel inhibierenden Enzymmodulatorkomponenten
des Konjugates zu.
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Die Verfahren unter Anwendung des Enzymmodulator-Ligand-Kon jugates
zur Bestimmung eines Liganden und insbesondere biologisch wirksamer Verbindungen
sind dadurch gekennzeichnet, dass man in einem flüssigen Medium die (Serum) Probe,
das Enzymmodulator-Ligand-Konjugat, einen unter Beeinflussung der Aktivität der
Enzymmodulatorkomponente reagierenden Rezeptor, das Bezugsenzym und ein Substrat
hierfür in geeigneter Reihenfolge zusammenführt und die Aktivität des Bezugsenzyms
misst. Das Verfahren kann in homogener Weise durchgeführt werden, was häufig die
bequemste Methodik darstellt.
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Genauso ist es aber auch möglich, eine heterogene Verfahrensweise
anzuwenden, wobei die bekannten Trenntechniken, wie Solid-phase-Technik (immobilisierter
Rezeptor), Trennungstechniken, wie z.B. mit Ammoniumsulfat, Polyäthylenglycol (PEG)
oder Doppelantikörper und Adsorptionstechniken, wie z.B. an Kohle, Ionenaustauscher
etc., zugrundegelegt werden.
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Nach -erfolgter Trennung wird die tntsprechend verbliebene Modulatorkonjugataktivität
(frei oder gebunden) vermessen.
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Die homogene Arbeitsweise beruht im Prinzip darauf, dass nach der
Komplexierung des Ligand-Enzymmodulator-Konjugates mit dem Rezeptor, normalerweise
einem Antikörper, die Enzymmodulatorwirkung verloren geht bzw. stark verändert wird.
Durch eine anschliessende Reaktion des-Bezugsenzyms mit dem vorhandenen Substrat
bzw. die Inhibierung dieser Reaktion und die Messung der Enzymaktivität nach bekannten
Methoden, vorzugsweise z.B.
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mit chromogenen oder fluorogenen Substraten oder auch mit gekoppelten
Lumineszenzreaktionen, kann die verbliebene Enzymmodulatoraktivität nachgewiesen
werden.
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Die Reihenfolge der Zugabe der einzelnen Komponenten hängt von der
zu bestimmenden Substanz (=Ligand) ab, wobei die sich ergebenden verschiedenen Möglichkeiten
nachfolgend noch ausführlicher dargelegt werden. Im wesentlichen handelt es sich
meistens um mehrere Inkubationsperioden hintereinander.
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Die nach Bildung des "Koluplexc" aus Ligand-Enzymmodulator-Konjugat
und Rezeptor vorhandene bzw. verbliebene Enzymmodulatorwirkung ist normalerweise
ein Mass für das freie (nicht Rezeptor gebundene) Ligand-Enzymmodulator-Konjugat.
Durch Herstellung von Standards mit bekannten Mengen der zu bestimmenden Substanz
können Eichkurven erhalten werden, mit denen die zu bestimmenden (im Hinblick auf
den Gehalt an Ligand unbekannten) Proben in Bezichung gesetzt werden können. Das
gleiche Prinzip lässt sich auch in Form von Solid-phase-Techniken, z.B. mit immobilisierten
Antikörpern, durchführen.
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Der Nachweis der noch vorhandenen Enzymmodulator- bzw. Inhibitoraktivitäten
erfolgt mit Hilfe von Enzymmodulator- bzw. Enzyminhibitorkonzentration abhängigen
Bezugsenzymsubstratreaktionen.
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Bereits vorstehend wurde dargelegt, dass zur Messung dann chromogene
oder fluorogene Substrate oder Lumineszenzreaktionene als Hilfsreaktionen verwendet
werden.
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Bei der Bestimmung von Proteinen kann es bei erstellung des Ligand-Enzymmodulator-Konjugates,
in dem der Ligand demnach ein Protein ist, zweckmässig sein, mehrere Enzymmodulatoren
bzw. Inhibitoren pro Molekül anzukoppeln. Die (sterische) Hinderung der Modulatorwirkung
kann in diesem Fall nach dem Zutritt von Antikörpern durch zusätzliche Anti-IgG-Antikörper,
d.h. eine zusätzliche sterische Hinderung für die Reaktion Enzym/Enzymmodulator,
verstärkt werden. Das nicht komplexierte Ligand-Enzymmodulator-Konjugat ist auch
hier-üblicherweise für das Bczugsenzym zugänglich, weshalb die gemessene Aktivitätsveränderung
des Enzyms mit dem freien, d.h. nicht antikörpergebundenen Anteil des Ligand-Enzymmodulator-Konjugates
korrespondiert.
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Wenn das Enzym, wie beispielsweise im Falle von Pepsin, relativ klein
ist, der nachzuweisende Ligand aber beispielsweise sehr gross ist, z.B. das "Australia"-Hepatitis-Antigen,
so ist
der gekoppelte Enzymmodulatoranteil, auf den nachstehend
auch als Inhibitoranteil Bezug genommen wird, sterisch eventuell schwer zu blockieren.
In diesem Fall kann durch den Einsatz von Anti-In}libitor-Antikörpern zusammen mit
Anti-IgG-Antikörpern (möglicherweise schon vorreagiert), die Inhibitorwirkung des
gebundenen (im Antikörper-Antigen-Komplex gebundenen) Modulators mit anschliessender
enzymatischer Inikatorreaktion erfasst werden.
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Werden in diesem raile sogenannte Solid-pha sc-Techni ken mit immobilisierten
Antikörpern angewandt, so kann die Messgrösse sowohl das frcie als auch das gebundene
Ligand-Enzymmodulator-Konjugat, je nach Durchführung der Methodik, erfassen. In
der speziellen "Sandwich"- (bzw. two side assay") Variante der Solid-phase-Techniken
können auch Antikörper-Inhibitor-Konj:ugate verwendet werden.
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Es braucht hier nicht weiter dargelegt werden, dass im Hinblick auf
die Enzymreaktion vorliegenden Substrate besonders ausgewählt werden. Hier sind
spezielle "massgeschneiderte" chromogene oder fluorogene Substrate, z.R.
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für kleine Peptidc z.B. proteolytische Enzyme, bekannt, die nach Reaktion
eine starke Änderung der Absorption, Extinktion Emission, des Emissionsmaximums,
etc., ergeben. Hierbei ist es bekannt, auch die Empfindlichkeiten durch Kopplung
mit einem Lumineszenzenzymsystem zu steigern. Wenn eine heterogene Durchführung
der Reaktion gewählt wird, bieten sich bekannte Solid-phase-Substrate an, z.B. Proteine
(Kaseine oder Hämoglobin) oder spezielle kleinere Peptide, die an eine feste Matrix
gekoppelt sina, z.B. an eine Gelfiltrationsmatrix, Polyacrylamid, Glaspartikel,
Agarose, etc.. Zur Optimierung sind auch Kopplungen an Enzymketten möglich.
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Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, das grundsätzliche, erfindungsgemässe
Verfahren auszuführen. Dies soll nachstehend weiter erörtert werden:
Bestinunungsmethodiken
für relativ kleine Moleküle, z.B.
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Haptende mit relativ geringem Molgevicht: Das Verfahren zur Messung
des Liganden, d.h. HaE)tcns, oder auch Antigens in einer biologischen Probe kann
sich durch folgende Schritte auszeichnen: a) Der Probe wird eine bestimmte Menge
(Uberschuss) eines An-Antikörpers zugesetzt, der gegenüber dem Ligand in der Probe
spezifisch ist, um einen Ligand-Antikörper-Komplex zu bilden.
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b) Dem unter a)- gebildeten Gemisch wird eine bekannte Menge einer
Lösung des Ligand-Enzymmodulator-Konjugates zugesetzt und zwar möglichst mit einem
Uberschuss gegenüber der Menge, die erforderlich ist, um die Menge-des nicht gebundenen
Rezeptors bzw. Antikörpers zu komplexieren.
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c) In dem Gemisch von b) erfolgt die Zugabe einer bekannten Menge
einer Lösung des für den Enzymmodulator-Teil spezifischen Enzyms, so dass der nicht
rezeptorgebundene Anteil möglichst quantitativ an das Enzym gebunden wird und modulatorisch,
d.h. im allgemeinen inhibitorisch, wirkt.
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d) Zu dem Gemisch c) erfolgt die Zugabe einer bekannten Menge einer
Substratlösung, so dass die verbleibende Enzymkonzentration (Aktivität) erfasst
werden kann, z.B. durch ein Substrat mit chromophorer, fluorophorer oder Lumineszenz-Nachweismöglichkeit.
Hierbei sollte die Substratkonzentration derart gewählt sein, dass möglichst eine
Enzymsättigung gewährleistet ist.
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Das obige Verfahren kann in der angegebenen Reihenfolge, jedoch auch
in andersartiger Anordnung durchgcführt werden. Dies soll
nachstehend
schematisch anhand von Kurzbezeichnungen der jeweiligen Komponenten gekennzeichnet
werden. Hierbei bedeuten Pr = Probe Ak = Rezeptor (=Antikörper) H = Ligand (=Hapten)
I = Enzymmodulator (häufig = Inhibitor) HI = Ligand-Enzymmodulator-Konjugat E =
Enzym S = Substrat /-Ak = Rezeptor (=Antikörper) immobilisiert Ag = Ligand (=Antigen)
AgI = Antigen-Enzymmodulator-Konjugat IgG = Immunglobulin IAk = Antikörper-Enzymmodulator-Konjugat
Im folgenden werden nun einige Verfahrensvarianten, die nicht als Beschränkung aufzufassen
sind, dargestellt: 1. a) Pr + Ak b) +HI c) + E d) + S 2. a) Pr + Ak + S b) + HI
c) + E 3. a) Pr + Ak + E b) + HI c) + S 4. a) Pr + AK b) HI + S c) + E 5. a) Pr
+ AK + E b) + HI + S 6. a) Pr + /-AK + HI b) im Eluat + E c) + 5
7.
a) AK + HJ b) + Pr c) + E d) + S 8. a) Ak + Pr + BJ b) + E c) + S Die obigen Verfahrensvariaten
sind z.B. anwendbar für T3.
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T4, rT3. T2, etc. ..., für Steoride, wie- z.B. Cortisol, östriol,
östradiol, Testosteron, Progesteron, ... , für Pharmaka, wie Digoxin, Digitoxin,
Phenytoin, Diphenylhydantoin, Morphin, Gentamycin, Amphetamin, Barbiturate, etc.,
sowie auch für Vitamine, Nahrungsmittelschadstoffe, Herbicide, Insekticide, Aflatoxine,
etc..
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B. Zur Bestimmung grosser Moleküle, z.B. Antigenen mit höherem Molekulargewicht
eignen sich Verfahren gemäss obigen Varianten, bei denen zusätzliche Antikörper,
nämlich von Anti-IgG-(Anti-Antikörper) von anderen Tierspezies bzw.Anti-Inhibitor-Antikörper
einaesetzt!serden. Anstelle von Antikörpern können eventuell auch Fab-Fragmente
zur Verhinderung von Präzipitationen und zur Messung der Geschwindigkeit der Enzymaktivität
(4Abnahme) hinzugefügt werden. In diesen Fällen lassen sich die verschiedenen Reagenzien
durch eine Reihe von Methodiken kombinieren, die in der parallelen Anmeldung des
Anmelders vom gleichen Tage mit dem Titel "Verfahren zur kompetitiven Bestimmung
von Liganden" ausführlich beschrieben worden sind. Es kommen aber auch andere, spezielle-Methodiken,
von denen nachstehend einige aufgeführt sind, in Betracht:
Das
erfindungsgemässe Verfahren wird nachstehend anhand von einigen nicht optimierten
Versuchsbeispielen zur Herstellung des Konjugates, zur Herstellung von rezeptorgebundenem
Konjugat, zur Ermittlung von entsprechenden Eichkurven, u.a. zur Bestimmung der
Antikörpermenge erläutert. Hierbei können die Versuchsbedingungen zur Herstellung
des Konjugates, zur Reaktion mit Rezeptor etc. in,dem Fachmann,bekannterWeise je
nach Wahl des speziellen Systems Ligand-Enzymmodulator-Bezugsenzym, gewählt werden.
Im allgemeinen ergeben sich die folgenden Reaktionszeiten für die einzelnen Schritte:
A) bei Haptenen: Reaktionszeit Antikörper/Hapten 5 Minuten bis 30 h Reaktionszeit
Enzym/Enzymmodulator 0 " " 60 Minuten Enzym-Substratreaktionszeit 10 Sekunden b.
60 Minuten B) für grössere Liganden, d.h. Antigene etc.: Reaktionszeit Antikörper/Antigen
3 Minuten bis 30 h Reaktionszeit Enzym/Enzymmodulator 0 " " 60 Minuten Enzym-Substratreaktionszeit
10 Sekunden b. 60 Minuten Reaktionszeit Rezeptor/Enzymmodulator 1 Minute bis 6 h
Diese Verfahren sind beispielsweise anwendbar für Antigene, wie TSH, HCG, Prolactin,
IgG, Hepatitis-Antigen, etc.
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1. Synthese des Pepstatin-Thyroxinäthylester-Konj ugates: 0,1 mMol
Pepstatin werden in 10 ml trockenem Dimethylsulfoxid gelöst. Dann werden 10 ml trockenes
Tetrahydrofuran hinzugegeben.
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Die Lösung wird auf OOC abgekühlt und mit 0,125 mMol Tri-nbutylamin
versetzt. Es folgen 0,1 mMol Chlorameisensäureisobutylester. Nach 15 Min. werden
0,1 mMol Thyroxinäthylester hin zugegeben. Nach 2 h bei Raumtemperatur ist die Reaktion
beendet. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser in der Kälte versetzt. Der Niederschlag
wird abgesaugt und kann so weiter verer.det werden.
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In analoger Weise wurde ein Konjugat aus IgG mit Pepstatin und auch
Dichlormethotrexat hergestellt.
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2. Synthese des Dichlor-methotrexat-E -Aminocapronsäure-HuIC;G-Konjugates:
0,1 tTol Dichlor-methotrexat werden in 10 nl trockenem Dimethylsulfoxid gelöst.
Dann werden 10 ml trockenes Tetrahydrofuran hinzugegeben.
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Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und mit 0,125 mMol Tri-nbutylamin
versetzt. Es folgen 0,1 mMol Chlorameisensäureisobutylester. Nach 15 Min. werden
0,1 mMol £-Aminocapronsäure hinzugegeben. Unter Rühren erfolgt die Reaktion innerhalb
von 2 h bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde erneut auf 0°C abgekühlt
und mit 0,1 mMol Tri-n-butylamin versetzt. Es folgen 0,1 mMol Chlorameisensäureisobutylester.
Das Reaktionsgemisch wird nach 15 Min. zu einer Lösung von 150 mg HuIgG in 20 ml
Wasser gegeben. Nach 2 h wird gegen Wasser dialysiert; insgesamt 16 h. Das Dialysat
wird gefriergetrocknet.
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3. Abhängigkeit der Pepsin-Enzymaktivität von der Td-Ester-Pepstatinkonjugat-Menge
Zu 500 l Hämoglobin-Sephadex Gel werden eine- Lösung, die T4-Ester-Pepstatin-Konjugat,
das gemäss Vorschrift 1) erhalten
wurde, enthält, und 200 ng Pepsin
zugesetzt, 30 Min. bei 400C inkubiert, zentrifugiert und der Uberstand gemessen:
T4-Ester)-Pepstatin-Konjugat E (p Mol) 0,627 1 0,555 2 0,481 3 0,412 4 0,340 5 0,265
6 0,196 Aus den obigen, nicht optimierten Daten wird ersichtlich, dass die Inhibitorkomponente
des Konjugats ihre inhibierende Wirkung voll beibehalten hat.
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4. Abhängigkeit der antikörpergebundenden T4-Menge von der zugesetzten
T4-Pepstatin-Konjugat-Menge Dieser Versuch wurde durchgeführt, um zu zeigen, dass
die Bindungsfähigkeit des Ligandanteils des Konjugates mit Antiligand-Antikörper
erhalten bleibt.
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T4-Antikörper (vom Kaninchen) wird mit einer bestimmten Menge radioaktiv
markiertem T4 versetzt. Nach Zugabe von unterschiedlichen Mengen T4-Pepstatin-Konjugat
wird nach einer Reaktionszeit von 25 Min. Aktivkohle in Barbitalpuffer zugesetzt
und 5 Min. zentrifugiert. Gemessen werden Aliquote des Uberstandes. Es ergab sich
folgende Dosiswirksamkeitskurve:
T4-Ester-Pepstatin-Konjugat counts
per Minute (pMol Konjugat) antikörpergebundener Tracer (cpm) 0 26500 1 22500 2 18750
3 15500 4 13000 5 12000 10 10000 5. Enzymaktivitäten in Abhängigkeiten von T4-Pepstatin-Konjugat,
T4 und T4-Antikörper Zunächst wurde die Enzymaktivität des Enzyms in Anwesenheit
des Antikörpers vermessen (Substrat wiederum Hämoglobin-Sephadex-Gel). Bei konstanten
Enzym- und Antikörpermengen ergab sich bei Zusatz von Konjugat (10 pMol) eine leichte
Verringerung der Enzymaktivität. Durch Zufügung von kaltem T4 ergab sich durch die
zusätzliche Freisetzung von T4-Pepstatin-Konjugat aus der Antikörperbindung eine
verstärkte Abnahme der Enzymaktivität.
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T4-Antikörper T4 T4-Pepstatin Enzym Extinktion x 0 0 x 0,429 x 0 x
x 0,400 x x x x 0,294 x x x 0 0,150 Bei Reaktionszeiten von T4-Antikörper 10 Min.
und Enzymsubstrat 15 Min. ergab sich eine Dosis-Wirkungskurve, die
bis
10 pMol von 100 auf 25 z abfällt.
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In analoger Weise können Eichkurven für T3 und IgG mit Pepstatin und
Dichlormethotrexat aufgestellt. werden.