JPH01321360A - 乾式免疫分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原−抗体反応を利用する酵素免疫分析法によ
る免疫学的に有用な乾式免疫分析要素に関する。

〔従来の技術〕

体液などに含有されている生化学物質を定量する方法と
して種々の方法が知られているが、比較的感度よく測れ
る方法として酵素免疫測定法が知られている。一方、簡
便さ、迅速性の観点から乾式分析要素を用いる方法が開
発されている（例えば、特開昭４９−５３８８８、特開
昭５５−１６４３５６、特開昭５９−１０２３８８）。

両技術を結合することにより乾式分析要素及び酵素免疫
測定法の欠点を互いに克服した乾式免疫分析要素の開発
が望まれていた。そこで、本発明者らは特開昭６１−８
００４９、特開昭６１−８００５０に記載の酵素抗体結
合物の基質として、水に不溶性の高分子物質を使用する
酵素免疫測定法を乾式分析要素に組込むことを試み鋭意
努力した結果、基質である水に不溶性の高分子物質と、
酵素抗体結合物を組込んだ乾式免疫分析要素を作製する
ことに成功した。その結果、この乾式免疫分析要素が、
遠心分離や予備反応などの繁雑な操作のない簡便で迅速
な分析要素であることを見出し、本発明に到達した。

［発明の目的］ 本発明の目的は簡便な操作で高感度の酵素免疫分析法を
実施することができる乾式免疫分析要素を提供すること
である。

〔発明の構成〕

本発明の前記目的は、少なくとも１つの水浸透性層を有
する、検体中のりガントの測定のための酵素免疫分析法
による乾式免疫分析要素であって、前記水浸透性層中に
、 （Ａ）　　リガンド又はその誘導体と高分子化合物との
結合物であるところの高分子化抗原、（Ｂ）水不溶性高
分子物質、及び、 （Ｃ）前記リガンドと反応する抗体と前記水不溶性高分
子物質に作用しうる酵素との結合物であるところの酵素
抗体結合物、 を含有することを特徴とする乾式免疫分析要素により達
成することができた。

〔発明の構成の詳細な説明〕

本発明の乾式免疫分析要素の測定対象は検体に含まれ名
抗原決定基を有するリガンドである。検体の種類は限定
されないが、例えば血液（全血、血漿、血清）、リンパ
液、尿などである。血漿５、血清、尿などの場合には、
通常特別な前処理を必要とせず、検体そのままについて
測定を行うことができる。

リガンドは抗原決定基を１又は２以上有しているもので
あり、例としてはジゴキシン、テオフィリン、フェノバ
ルビタール、フェニトイン、ペニシリン、アミカシン等
の薬物、プロスタグランジン、テストステロン、プロゲ
ステロン、ヂロキシン等のホルモン等を挙げることがで
きる。本発明の乾式免疫分析要素は特に低分子量のリガ
ンド、例えば分子量約２万以下のものの測定に威力を発
揮する。

リガンドの誘導体とはりガントにアミノ基、カルボキシ
ル基あるいはチオール基等が導入された物質であり、例
えばテオフィリンに対しては８−プロピルカルボキシテ
オフィリンがその誘導体である。

また、リガンドに対する抗体が交差反応性を有する化合
物の誘導体もリガンドの誘導体として用いることが出来
る。例えば、リガンドであるテオフィリンに対する抗体
がカフェインに交差反応する場合、カフェインの誘導体
も用いることが出来る。

リガンド又はその誘導体と結合している高分子化合物は
、分子量１０万ダルトン以上でかつ水溶性のものが適当
である。高分子化合物の例としては、可溶性デキストラ
ン、カルボキシメチル化デキストラン、アミノ化デキス
トラン、アミロース等の多糖類及びその誘導体、ゼラチ
ン、ヘモシアニン、フェリチン等の蛋白質、ポリエチレ
ングリコールなどを挙げることができる。これらはリガ
ンド又はその誘導体と結合させた状態で所定の条件を具
備していればよく、例えば生血清アルブミンのような比
較的低分子のものであっても、それ自身を重合させるな
どして高分子化したものであってもよい。

リガンド又はその誘導体自身を重合することによって高
分子化してもよい。重合方法は、下記のリガンド又はそ
の誘導体と高分子化合物との結合方法のなかから適宜選
択すればよく、例えば、カルボジイミド、グルタルアル
デヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよい。

リガンド又はその誘導体と高分子化合物との結合方法は
双方の官能基を考慮して決定すればよい。

官能基は、アミン基、カルボキシル基、水酸基、チオー
ル基、イミダゾール基、フェニル基などを利用すること
ができ、例えばアミノ基相互間を結合させる場合には、
ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド法、ジフルオ
ロベンゼン法、ヘンゾキノン法等数多く知られている。

また、アミノ基とカルボキシル基との間を結合させる方
法としては、カルボキシル基ををサクシンイミドエステ
ル化する方法のほかカルボジイミド法、ウッドワード試
薬法等が知られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨ
ウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もある。チオール基を
利用する場合には、例えば一方の側のカルボキシル基を
サクジンイミドエステル化してこれにシスティンを反応
させてチオール基を導入し、チオール基反応性二価架橋
試薬を用いて双方を結合することができる。フェニル基
を利用する方法としてはジアゾ化法、アルキル化法など
がある。結合方法はこれらの例示に限られるものではな
く、このほか例えば’Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」
あるいは石川、河合、宮井　編「酵素免疫測定法」（医
学書院、１９７８年発行）等の底置に記載されている方
法のなかから適宜選択して利用することができる。結合
比はｔｒｉに限らず、目的に応じて任意の比率をとるこ
とができることはいうまでもない。反応後は、ゲル濾過
法、イオン交換クロマトブラフイー、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製を行い、
必要により凍結乾燥法等で乾燥する。

結合物を構成している抗体は前記のりガント又はその誘
導体に共通の抗原決定基と反応するものである。この抗
体にはＦ（ａｂ’）ｚ、　ａｂ’、Ｆａｂなどのフラグ
メントも含まれる。

抗体の製造方法としてはりガント又はその誘導体と蛋白
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の温血動物に体重１ｋｇあたり０．３〜２Ｉｌ１ｇを１
〜数回背中皮下、フットバンド、大腿筋等にアジュバン
トとともに注射して当該動物の体内に抗体を形成させる
。この抗体は血清をそのまま用いてもよく、血清から抗
体すなわち免疫グロブリンを採取する公知の方法によっ
て精製してから用いてもよい。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合にはマウスに前記のいずれかの抗
原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し牌臓細胞
を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウス
ミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞の
なかから当該抗体を産生ずるものをクローニングによっ
てモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中で増
殖させることによって単一抗体、すなわちモノクローナ
ル抗体を大量に製造することができる。

結合物を構成している酵素は水不溶性高分子物質に作用
しうるちのであるが、そのなかでは活性の測定方法が容
易なものがよい、このような酵素は例えばアミラーゼ、
デキストラナーゼ、セルラーゼ、コラ−ゲナーゼ、マン
ナーゼ、プロテアーゼ、エラスターゼ、リパーゼ、グル
コアミラーゼなどである。

これらの酵素の作用する水不溶性高分子物質としては酵
素の基質をあげることができる。例えばセルロース、澱
粉、アミロース、アミロペクチン、ペプチド等をあげる
ことができ、詳しくは丸尾、田宮、監修「酵素ハンドブ
ック」（朝倉書店、１９８２年）、日本生化学会編「生
化学ハンドブックｊ（丸善、１９８０年）に記載されて
いる。

また、上記水不溶性高分子物質には直接または間接に検
出できる官能基又は化合物がついていてもよい。

前記直接または間接に検出できる官能基又は化合物とし
ては、色素部を有する化合物、蛍光、発光を生じる化合
物等をあげることができる。また特公昭５７−３０００
０、特開昭５９−３００６３等に記載されているような
色素形成化合物（例、カプラー）などであってもよい。

前記物質の検出の為には極大吸収波長における透過又は
反射による光学的測定が適しているが、目的や必要精度
によっては目視により判定してもよい。発光、蛍光等の
測定には、蛍光、発光等の主波長付近における光学的測
定が適している。

水不溶性高分子物質に前記官能基を結合させる方法とし
ては、例えばに、Ｖｅｎｋａｔａｒｍａｎ　ｌｉ　ｒＴ
ｈｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　
Ｄｙｅｓ」第６巻（Ａｃａｄｅ−ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社
、１９７２年発行）に記載の反応性染料を用いる方法、
特公昭５７−３００００、特開昭５９−３００６３等に
記載の方法等の公知の方法から適宜に選択することがで
きる。

水不溶性高分子物質に検出できる官能基又は化合物を結
合させたものの好ましい具体例として、色素を結合させ
た澱粉（ダイスターチ）がある。

酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮して決定
すればよい。官能基は、アミノ基１．カルホキシル基、
水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基など
を利用することができ、結合方法は前記のリガンド又は
その誘導体と高分子化合物との結合方法のなかから適宜
選択すればよい。

反応後はゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合せ
て精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾燥する。

一方、結合物の酵素と同種の酵素が検体に含まれている
場合には、この検体中の酵素を阻害する程度が前記の結
合物に結合されている酵素の活性を阻害する程度より大
きい酵素阻害物質を接触させるのがよい。

この酵素阻害物質は検体に含まれている酵素を完全に失
活させかつ結合物に結合されている酵素を全く阻害しな
いものが最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は単に測定時においてブランク値を上昇させなければよ
く、測定後に酵素阻害物質が失活するなどしてこの酵素
活性が回復してもよい。この酵素阻害物質の作用が問題
になるもう一方の酵素は、抗体に結合されている状態の
ものであり、遊離状態では酵素阻害物によって失活する
ものであってもよい。この酵素阻害物質にはこのような
特異性を有する公知の酵素阻害物質を利用すればよいが
、そのほか、検体に含まれている酵素を温血動物に投与
してその抗体を取得し、これを酵素■害物質として用い
ることもできる。

抗体の取得方法は前述のリガンドに対する抗体の取得方
法と同様である。

本発明の乾式免疫分析要素は公知の多種の乾式分析要素
と同様の層構成とすることができる。分析要素は多孔性
層、後述する試薬層のほか、支持体、展開層、検出層、
光遮蔽層、接着層、濾過層、吸水層、下塗り層その他の
層を含む多重層の構成を有してもよい。かような分析要
素として、米国特許第３，９９２．１５８号、同４，０
４２，３３５号および特開昭５５−１６４３５６号各明
細書に開示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
免疫分析要素は、実用的に次のような構成を採りうる。

もちろん本発明はこれに限定されるわけではない。

（１）支持体上に試薬層、その上に展開層を有するもの
。

（２）支持体上に検出層、試薬層、展開層をこの順に有
するもの。

（３）支持体上に試薬層、光反射層、展開層をこの順に
有するもの。

（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。

（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、展開層を
この順に有するもの。

（６）支持体上に第二試薬層、光反射層、第一試薬層、
展開層をこの順に有するもの。

（７）支持体上に検出層、第二試薬層、光反射層、第一
試薬層、展開層をこの順に有するもの。

（８）支持体上に検出層、免疫反応試薬含有展開層をこ
の順に有するもの。

（９）支持体上に検出層、光反射層、免疫反応試薬含有
展開層をこの順に有するもの。

上記（１）ないしく５）において試薬層は異なる複数の
層から成ってもよい。また、試薬層は免疫反応しうる成
分を含む免疫試薬層であってもよい。支持体と試薬層ま
たは検出層との間には吸水層を設けてもよい。上記（１
）ないしく３）と（６）において試薬層と検出層または
展開層の間に濾過層を設けてもよい。

上記（３）ないしく７）において光反射層と検出層、試
薬層または展開層との間、試薬層と検出層との間または
試薬層と展開層との間に、さらに濾過層を設けてもよい
。試薬層が複数層から成る場合に、試薬層と試薬層の間
にさらに濾過層を設けてもよい。試薬層、検出層は後述
する多孔性層と同様な多孔性検出層、多孔性試薬層であ
ってもよい。

光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものは
ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。親
水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を設ける
か、親水化処理を施すことが好ましい。

支持体としては光反射性又は光不透過性（不透明）で水
不透過性の支持体も用いることができる。

光反射性又は不透明支持体の例として、二酸化チクン微
粒子又は硫酸バリウム微粒子を分散含有させた白色又は
乳白色不透明ポリエチレンテレフタレートがある。

本発明の乾式分析要素の水浸透性層としては、親水性ポ
リマーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例えば
特開昭５８−７０１６３５号、特開昭６１−４９５９号
、特願昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８５９
号、同６０−２７９８６０号、同６０−２７９８６１号
等に記載されているような多孔性層も好適である。親水
性ポリマーとして例えば、ゼラチンおよびこれらの誘導
体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例
えばヒドロキシメチルセルロース）、アガロース、アク
リルアミド共重体、メタアクリルアミド共重体、アクリ
ルアミドまたはメタアクリルアミドと各種ビニル性七ツ
マ−との共重合体等が利用できる。

多孔性層を構成する材料としては、例えば濾紙、不織布
、織物布地（例えば平織布地）、編物生地（例えば、ト
リコツ）Ｉ布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることがで
きる。展開層としては、これらのうち織物、編物等が好
ましい。織物等は特開昭５７−６６３５９号に記載され
たようなグロー放電処理をしてもよい。展開層には、展
開面積、展開速度等を調節するため、特開昭６０−２２
２７７０号、特願昭６１−１２２８７５号、６１−１２
２８７６号、６１−１４３７５４号に記載したような親
水性高分子あるいは界面活性剤を含有してもよい。

免疫反応試薬層は、本発明の分析要素の主要な免疫反応
試薬組成物の成分である （Ａ）リガンド又はその誘導体と高分子化合物との結合
物であるところの高分子化抗原、（Ｂ）水不溶性高分子
物質、及び、 （Ｃ）前記リガンドと反応する抗体と前記水不溶性高分
子物質に作用しうる酵素との結合物であるところの酵素
抗体結合物、 の一部又は全部を含有する水浸透性層である。含有量は
高分子化抗原が約０．１■／ボ〜約１００■／ｎ（、好
ましくは約１．０■／イ〜約１０■／イ、水不溶性高分
子物質が約１．０■７Ｍ〜約２０ｇ／ｒｒｉ、好ましく
は約４．０ｇ／％〜約１０ｇ／ｒｒｆ、そして酵素抗体
結合物が約０．１ｍｇ／ｒｒｆ　〜約１００ｍｇ／ｆ′
ｒｆ、好ましくは約１．０ｍｇ／ｒｒｆ〜約１０■７Ｍ
が通常適当である。免疫反応試薬層は、複数の層からな
りたっていてもよい。この場合、上記の各成分は複数の
層に別れて含有されていてもよい。

さらに詳しくは、本発明の乾式分析要素において、酵素
抗体結合物（Ｌｌ）、高分子化抗原（Ｌ２）、水不溶性
高分子物質（Ｓ）は下表に記載のような組合せで乾式免
疫分析要素に含有されてもよい。

○の中の数字は分析要素の様態を示す番号である。

■ いずれの態様においても、試薬層の支持体と反対側に展
開層を設けてもよいし、試薬層が展開層をかねていても
よい。また上記■〜■において、Ｌｌ、　Ｌ２．　　Ｓ
以外の試薬（例、呈色試薬）を含有する試薬層をさらに
設けてもよい。

本発明の分析要素の試薬層に含有させることができる緩
衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やｒＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　、　５　（２）　、４６７−
４７７（１９６６）に記載されているグツド（Ｇｏｏｄ
）の緩衝剤などを挙げることができる。これらの緩衝剤
は［蛋白質・酵素の基礎実験法］（堀尾武−ほか著、南
江堂、１９８１年）、前記ｒ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　ｉｓ
　ｔｒｙ　Ｊ等の文献を参考にして選択することができ
る。

多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用（
メータリング作用）を有する層であることが好ましい。

液体計量作用とは、その表面に点着供給された液体試料
を、その中に含有している成分を実質的に偏在させるこ
となく面の方向上に単位面積当たりほぼ一定量の割合で
広げる作用である。

多孔性層を接着し積層するための接着層を試薬層、光反
射層、濾過層、吸水層、検出層等の層の上に設けてもよ
い。接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着するこ
とができるような親水性ポリマー、例えばゼラチン、ゼ
ラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなるこ
とが好ましい。

光反射層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測定する際に、展開層に点着供給された被検液の色、
特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮
蔽するとともに背景層としても機能する。光反射層は、
親水性ポリマーをバインダーとして、二酸化チタン、硫
酸バリウム等の光反射性微粒子が分散された水浸透性の
層であることが好ましい。バインダーとしてはゼラチン
、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からな
ることが好ましい。

分析要素には、光反射層を設ける代わりに、またはそれ
と同時に、展開層、試薬層、検出層等に二酸化チタン等
の光反射粒子を含有させてもよい。

本発明の乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記載
の公知の方法により調製することができる。

本発明の分析要素は一辺約１５ｍａ＋から約３０鴫の正
方形またはほぼ同すイ丙の円形等の小片に裁断し、特公
昭５７−２８３３１、実開昭５６−１４２４５４、特開
昭５７−６３４５２、実開昭５８−３２３５０、特表昭
５８−５０１１４４等に記載のスライド枠に収めて免疫
スライドとして用いることが、製造、包装、輸送、保存
、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目的によって
は、長いテープ状でカセ・・？トまたはマガジンに収め
て用いること、または小片を開口のあるカードに添付ま
たは収めて用いることなどもできる。

本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作
により液体試料中のアナライトであるリガンドの分析を
実施できる。例えば、約５μｅから約３０μ２、好まし
くは８μｒから１５μｅの範囲の全血、血漿、血清、リ
ンパ液、尿等の水性液体試料滴を展開層に点着し１分か
ら１０分の範囲で、約２０°Ｃから約４０″Ｃの範囲の
実質的に一定の温度で、好ましくは３７゛Ｃ近傍の実質
的に一定の温度でインクヘーションし、要素内の発色又
は変色を可視光又は紫外光の吸収極大波長またはその近
傍の波長の光を用いて光透過性支持体から反射測光し、
予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により液
体試料中のリガンドの含有量を求めることができる。

あるいは、要素内の蛍光の強度を測定し、予め作成した
検量線を用いて液体試料中のりガント含有量を求めるこ
とができる。点着する液体試料の量、インクベーション
時間及び温度を一定にすることによりリガンドの定量分
析を高精度で実施できる。

光反射性又は不透明支持体を用いる態様においては、分
析要素内の発色又は変色を支持体と反対側の最外層側か
ら反射測定する。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３、特開昭６０−２
２０８６２、特開昭６１−２９４３６７、特開昭５８−
１６１８６７等に記載の化学分析装置により極めて容易
な操作で高精度の定量分析を実施できる。

（合成例） （１）酵素抗体結合物の合成 ■ＣＨＭ化アミラーゼの作製 バチルス・サブチリスアミラーゼ５［ｌＩｇをｐＨ６，
３の０．１Ｍグリセロ燐酸１　ｍｌに溶かし、ＣＨＭ　
Ｓ　２■／ｄのＤＭＦ溶液１００μｅを加えて室温で１
時間放置して反応させた。この反応液をセファデックス
Ｇ−２５のカラムに入れ、ｐＨ６，３の０．１Ｍグリセ
ロ燐酸を流してゲル濾過を行ない、素通り分画を分取し
た。

■抗テオフィリンマウスｌ　ｇＧ　Ｆ　（ａｂ’）ｚの
作製抗テオフィリンマウスＩｇＧＩＯ■（０，１，Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５，５））　２　ｍｌにパパイン３００
ｐｇを加え、３７°Ｃで１８時間撹拌し、た。０．ＩＮ
−ＮＡＯＨを加えてｐｌ＋を６．０に調節したこの反応
液を予め０．１Ｍ燐酸緩衡１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６
、３）で緩衝化したＡｃ八へ４４ゲルカラムに入れ、上
記の燐酸緩衝液で溶出した。分子量約１０万付近に溶出
されたピーク部分を集めて１戚に濃縮し、目的の抗テオ
フィリンマウスＩ　ｇ　Ｇ　Ｆ　（ａｂ’　）ｚを得た
。

■α−アミラーゼー抗テオフィリンマウスｒｇＧＦａｂ
’結合物の作製 ■で調製した抗−テオフィリンマウスＩ　ｇＧＦ（ａｂ
’）ｚ６１１ｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝１ｍＭＥＤＴ
Ａ溶液（ｐＨ６，０）　１　ｒａｉｌに１０ｍｇ／ｄの
２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｅを
加え、３７°Ｃで９０分間撹拌した。この反応液を予め
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ４６．３）で緩衝化したセ
ファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反応の２
−メルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ３−Ｆａｂ”を
得た。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミラーゼ２■
を加え、３７°Ｃで９０分間反応させた。次にこの反応
液を０．１Ｍ酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ
７，０）で緩衝化したＡｃＡ−３４カラムでゲル濾過し
て分子量２０万以上の分画を集め、これを濃縮して目的
の結合物を得た。

（２）高分子化抗原（ウマフェリチン−テオフィリン結
合物）の合成 ８−プロピルカルボキシテオフィリン５■を１μｌジメ
チルホルムアミド にＮ−ヒドロキシサクシンイミド３■、水溶性カルボジ
イミド５■を加え室温にて２時間撹拌し活性化テオフィ
リンを調製した。ウマフェリチン１０■を０．１Ｍ炭酸
水素ナトリウム水溶液１ｄに溶かし、上記活性化テオフ
ィリン溶液を５００μｐ加え室温にて１時間放置し、予
め燐酸緩衝化生理食塩水（ｐｈ７．０）で平衡化したセ
ファデックス−Ｇ２５ゲルカラムにて、未反応物を除去
し目的の高分子化抗原（ウマフェリチン−テオフィリン
結合物）を９　ｍｇ得た。

（３）水不溶性ダイスターチの調製 ４０ｇのカルボキシメチルスターチ（木材産業社製、製
品名エクスプロタブ）を１５０７！の蒸留水に懸濁させ
て、これに８ｇのダイアミラーブリリアントブルー（Ｄ
ｉａｍｉｒａ　ｆｌｒ目１ｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）　Ｔ’
ｉ’　（Ｃ．Ｉ。

Ｎｕｍｂｅｒ　６１２００　；三菱化成工業社製）を加
え、室温で３０分間撹拌した。その後、この懸濁液に１
５０ｇの無水硫酸ナトリウムを加えて、さらに室温で３
０分間撹拌した。その後、この懸濁液に１５０ｇの無水
硫酸ナトリウムを加えてさらに室温で３０分間撹拌した
後４５ｇの炭酸ナトリウムを添加し、４５°Ｃで一夜撹
拌した。それから、この懸濁液を遠心し上清を除いて沈
澱物に蒸留水を加え、再び懸濁した後遠心した。この懸
濁、遠心の操作を上清の着色がなくなるまで繰り返した
。最後に沈澱をエタノールで洗って乾燥した。

実施例１ ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０−の無色透
明ポリエチレンテレツクレート（ＰＥＴ）シート（支持
体）の上に下記の被覆量になるように架橋剤含有吸水層
を水溶液を用いて塗布し、乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　１０ｇ／ｒｒｆノニ
ルフェノキシポリグリシドール （平均１０グリシド一ル単位含有）　　　３５０ｍｇ／
ｎ（ビス〔（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミ
ンコメタン　　　　　　　　　４００ｍｇ／ボ架橋剤含
有吸水層の上に下記の被覆量になるようにして検出層を
水分散液を用いて塗布し、乾燥して設けた。

酸処理ゼラチン　　　　　　　　　　ｌＯｇ／ボ重合体
ラテックス（１）　　　　　　　　　３ｇ／ボノニルフ
ェノキシボリグリシドール （平均■０グリシドール単位含有）　　２■／ｒｒｒ検
出層の上に下記の被覆量で乾燥層厚７μｍになるように
して光遮蔽層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して設け
た。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　２．９ｇ／ｒｒｆル
チル型二酸化チタン微粒子　　　　１３ｇ／ｒｒｒノニ
ルフェノキシポリグリシドール （平均１０グリシド一ル単位含有）　　　４００ｍｇ／
ｒｒｆ吸水層の上に下記の被覆量で乾燥層厚５ｐＩＩ＋
になるようにして接着層を水分散液を用いて塗布し、乾
燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　６．１ｇ／ｒｄノニ
ルフエノキシボリグリシドール （平均１０グリシド一ル単位含有）　　　６００ｍｇ／
ｎずついで、接着層の表面に水を３０ｇ／　ｒｄの割合
でほぼ一様に供給して湿潤させ、その上に公称孔径３、
０μｍ１厚さ約１４０μｍのセルロースアセテートメン
ブランフィルタ−をラミネート接着し、多孔性検出層と
した。

次に、下記被覆量になるように酵素抗体結合物を多孔性
検出層に塗布乾燥した。

アミラーゼ−抗テオフィリンＩｇＧ　　Ｆａｂ’結合物
（合成例（１））　　　　　　　　　　　４．０■／　
ｎｆノニルフェノキシポリエトキシエタノール２００■
／ボ ついで多孔性検出層の上に、下記組成の基質、免疫反応
用試薬組成物を含有させた、５０デニール相当のＰＥＴ
紡績糸３６ゲージ編した厚さ約２５０μｍのトリコット
編物布地をラミネート接着して多孔性展開層を設けた。

ダイスターチ（合成例（３））　　　　　　　７ｇ／イ
テオフィリンーウマフエリチン結合物（合成例（２））
　　　　　　　　　　　　　　　　４．２■／ボツニル
フエノキシポリエトキシエタノール５００■／ポ これを−辺１５ａｎの正方形チップに裁断し、特開昭５
８−３２３５０記載のスライドの枠に収めてテオフィリ
ン分析用多層分析スライドとした。

性能評価実験 前記のテオフィリン分析用多層免疫スライドの展開層に
、既知量のテオフィリンを含有するｐ１１７の５（ｂｎ
Ｍグリセロ燐酸緩衝溶液２０μｉ滴下した。３７°Ｃで
２０分間反応後、支持体側より６４０ｎｍの反射光学濃
度を測定した。結果は第１表に示す。

第１図の検量線より、本発明のテオフィリン分析用乾式
免疫分析要素はテオフィリンの定量が精度よ（実施でき
ることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１のテオフィリン分析用乾式免疫分析要
素の検量線を示す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社同　　　冨士レ
ビオ株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１つの水浸透性層を有する、検体中の
   リガンドの測定のための酵素免疫分析法による乾式免疫
   分析要素であって、前記水浸透性層中に、 （Ａ）リガンド又はその誘導体と高分子化合物との結合
   物であるところの高分子化抗原、 （Ｂ）水不溶性高分子物質、及び、 （Ｃ）前記リガンドと反応する抗体と前記水不溶性高分
   子物質に作用しうる酵素との結合物であるところの酵素
   抗体結合物、 を含有することを特徴とする乾式免疫分析要素
2. （２）一体化された少なくとも２つの水浸透性層を有し
   、そのうちの少なくとも１層が多孔性層である請求項（
   １）に記載の免疫分析要素