JPS6312958A

JPS6312958A - Ｉｌ−２の測定法

Info

Publication number: JPS6312958A
Application number: JP61157622A
Authority: JP
Inventors: Seiichi Hashida; 誠一橋田; Eiji Ishikawa; 石川　栄治; Yasukazu Omoto; 安一大本; Yoshikatsu Hirai; 嘉勝平井
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1986-07-03
Publication date: 1988-01-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、ＩＬ−２（インターロイキン２）の測定法、
詳しくは生体内ＩＬ−２含量等の微量の１’Ｌ−２の測
定をも可能とする極めて高感度な測定法に関する。

従　　来　　の　　技　　術！Ｌ−２は、リンパ球の反応性を調節し、■−リンパ球
のインビトロでの長期間培養を促進する作用を有する可
溶性蛋白質として知られている（Ｓｗｉｔｈ、　Ｋ、　
Ａ、、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、、Ｖｏｌ、　５１　
。

３３７　（１９８０））。

該ＩＬ−２は、医薬品としての応用が種々研究されてい
る一方で、免疫的に欠陥のあるＴ細胞に起因する各種の
免疫欠損病や悪性新生物病等の異常免疫応答の研究並び
に之等の臨床上の診断のために、臨床サンプルにおける
その測定技術が着目されている。

しかして、現在、該ＩＬ−２の測定技術としては、バイ
オアッセイ（生物学的定量法）（Ｊ。

ｌｍ１ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄ、、　６５．５５　（
１９８３）　）や免疫学的測定法（Ｊ　、ｌ　＋ｕｍｕ
ｎｏ１０Ｍｅｔｈｏｄ、。

７４．３９　（１９８４））が知られており、特に後者
の方法は、前者に比し簡便且つ正確な方法として、例え
ば試験的もしくは工業的に生産されたＩＬ−２標品の測
定やそれらを用いた試験系におけるＩ　Ｌ−２ｍ度の測
定等に利用されている。しかしながら該方法は、その測
定感度が低いという致命的な欠点があり、例えば臨床サ
ンプル等の微量のＩＬ−２を含有するサンプル中の該Ｉ
Ｌ−２の測定には、到底利用できない。

かかる臨床サンプル等の上記免疫学的定置法における測
定限界を遥かに越える低８１度サンプル中のＩＬ−２含
聞の測定は、前記バイオアッセイ法に頼らざるを得ない
現状にある。しかるに、この方法は、上記の通り操作が
非常に煩雑で、正確性に劣り、更に測定値を干渉する物
質の存在を常に考慮する必要があり、多くの生理活性が
混在する臨床サンプル等においては、実際上、多くの課
題を残している。

発明が解決しようとする問題点本発明は、上記現状において、従来技術の欠点を全て解
消して、ＩＬ−２に特異性が高く、臨床サンプル等の低
ＩＬ−２含恒サンプル中の該ＩＬ−２の測定をも充分可
能とする高感度、高精度で、しかも簡便な新しいＩＬ−
２測定技術を提供することをその目的とする。

問題点を解決するための手段本発明によれば、サンドイツチ法による酵素免疫測定法
において、第１抗体として不溶化されたＩＬ−２モノク
ローナル抗体を用い、第２抗体としてＳＨ基を介して酵
素標識されたＩＬ−２抗体のｌ”　ａｂ’　フラグメン
トを用いることを特徴とするＩＬ−２の測定法が提供さ
れる。

本発明の測定方法は、（１）第１抗体としての不溶化さ
れたＩＬ−２モノクローナル抗体及び（２）第２抗体と
してのＳＨＭを介して酵素標識されたＩし一２抗体のＦ
　ａｂ’　フラグメント、を組合せ利用することを必須
の要件として、その基本的操作は、通常の酵素免疫測定
法としてのサンドイツチ法に従うことができる。

本発明において上記第１抗体として利用する不溶化され
たＩＬ−２モノクローナル抗体は、ＩＬ−２を認識する
もの、即ちＩＬ−２に結合性を示すものである限り特に
限定はなく、公知の不溶化された各種のＩＬ−２に対す
るモノクローナル抗体を利用できるが、特定の高次構造
からなる天然のＩＬ−２に対して特異性が高く且つ結合
力の強い抗体を不溶化したものであるのが好ましい。

上記抗体は、通常の方法に従い、ＩＬ−２を免疫抗原と
して利用して製造することができる。より具体的には、
例えば上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免
疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞（ハ
イブリドーマ、ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）を作成し、これ
より！Ｌ−２をＷｇ識する所望抗体を産生ずるクローン
を選択し、該クローンの培養により製造できる。

上記方法において用いられる免疫抗原としての［Ｌ−２
としては、特に限定はなく、既に公知のインビトロで誘
導された■し−２を含有する培養上清乃至その精製標品
、遺伝子組換技術に従い１造されたＩＬ−２及びその同
効物（ｒｌＬ−２）、例えば特開昭６０−２４６３２２
号公報に記載の天然型ＩＬ−２の一部アミノ酸配列から
なる合成ペプチド等のいずれでもよい。之等の内で、特
に遺伝子組換技術に従い得られる大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ（以下［β−ｇａｌ　ｌと略す）とＩＬ−２もし
くはその部分構造からなる融合蛋白質は、殊に天然のＩ
し−２に対して高い特異性及び結合性を示す所望抗体を
提供できるものであり、上記免疫抗原として好ましいも
のである。

また、上記方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物
としては、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質
細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく
、−４にはマウス、ラット等が有利に用いられる。

免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動
物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与する
ことにより実施できる。より具体的には、免疫抗原を、
所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に
２〜１４日毎に数回投与し、総投与量が約１００〜５０
０μｇ／マウス程度になるようにするのが好ましい。免
疫抗原としては、上記最終投与の約３日後に摘出した牌
臓細胞を使用するのが好ましい。

更に、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての
吐乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の
もの、例えばｐ３　（１）３／Ｘ６３−ＡＱ８）（Ｎａ
ｔｕｒｅ　、２５６，４９５−４９７（１９７５））、
ｐ３−Ｕｌ　（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｙ　ａｎｄ　Ｉ　ｇｉｓ＋ｕｎ
ｏｌｏａｙ　。

８１．１−７　（１９７８））、Ｎ５−１　（Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６．５１１−５１９　（１９７
６））ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ　、　８．４０５−４１
５（１９７６））、５Ｐ２１０　（Ｎａｔｕｒｅ　、２
７６゜２６９−２７０　＜１９７８））、ＦＯ（Ｊ。

１Ｉｌｉｕｎｏ１．　Ｍａｔｈ、、　３５．１−２１　
（１９８０）　）Ｘ６３．６．５．３．　　（Ｊ、　　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１　２３．。

１５４８−１５５０（１９７９））、５１９４（Ｊ、Ｅ
ｘｐ、Ｍｅｄ、、１４８，３１３−３２３（１９７８）
）等や、ラットにおけるＲ２１０（Ｎａｔｕｒｅ、２７
７．１３１−１３３　（１９７９））等の骨髄腫細胞等
を使用できる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）ら
の方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　　［：ｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、■ｏｌ、　７３゜ｐｐ３（１９８１））等に準じて
行なうことができる。より具体的には、上記融合反応は
、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の存在下に、
通常の培地中で実施され、培地には更に融合効率を高め
るためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じ
て添加することもできる。

免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法と
変りはな（、例えば形質細胞ｖｉｍＷａに対して免疫ｉ
胞を約１〜１０倍程度用いるのが普通である。融合反応
時の培地としては、上記形質細胞１１１ＩＩ胞の増殖に
通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０
培地、ＭＥＭ培地、その他のこの種細胞培養に一般に利
用されるものを例示でき、通常２等培地は牛胎児血清（
ＦＯ８）等の血清補液を抜いておくのがよい。融合は上
記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定借を、上記培地内
でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、
例えば平均分子１１０００〜６０００程度のものを、通
常培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度で加えて混ぜ合せ
ることにより行なわれる。以後、適当な培地を逐次添加
して遠心し、上清を除去する操作を繰返すことにより所
望のハイブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡ　Ｔ培地（ヒボキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む培地）で培養することにより
行なわれる。該１−ＩＡＴ培地での培養は、目的とする
ハイブリドーマ以外め細胞（未融合細胞等）が死滅する
のに充分な時間、通常数日〜数週問おこなえばよい。か
くして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に
より目的とする抗体の検索及び単一クローン化に供され
る。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｅ　ｎ
ｇｖａｌｌ、　　Ｅ　　、、Ｍｅｔｈ、Ｅ　ｎｚｙｍｏ
ｌ、、にΩ−２４１９−４３９（１９８０））　、プラ
ーク法、スポット法、凝集反応法、オクテｏ　ニー　（
Ｑ　ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種
々の方法（「ハイブリドーマ法ともツクローナル抗体」
、株式会社Ｒ＆Ｄブラニング発行、第３０−５３頁、昭
和５７年３月５日〕に従い実施することができ、この検
索には前記免疫抗原が利用できる。

かくして得られるＩＬ−２を認識する所望のモツクロー
ナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、通常の培地で継
代培養することができ、また液体窒素中で長期間保存す
ることができる。

上記ハイブリドーマからの所望抗体の採取は、該ハイブ
リドーマを、常法に従って培養してその培養上清として
得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動
物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採
用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

また上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル
濾過法、アフイニテイクＯマドグラフィー等の通常の手
段により精製することができる。

かくして得られるＩＬ−２モノクローナル抗体は、常法
に従いこれを不溶性担体に、物理的又は化学的結合させ
て不溶化抗体とされ、本発明に第１抗体として利用され
る。

上記不溶化のための不溶性担体としては、例えばセルロ
ース粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチレ
ン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹
脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチッ
クチューブ、ナイロン、ガラスピーズ、絹、ポリアミン
−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ
酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体等を使用で
きる。不溶化は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチ
ド法（１！！アミド誘導体法、カルボキシルクロライド
樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体
法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖休
演、セルロースカルボナート誘導体法、綜合試薬を使用
する方法等）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合
法（架橋試薬としてゲルタールアルデヒド、ヘキサメチ
レンイソシアナート等を用いる）、Ｌ１ｇｉ反応による
担体結合法等の化学的反応；或いはイオン交換樹脂のよ
うな担体を用いるイオン結合法；ガラスピーズ等の多孔
性ガラスを担体として用いる物理的吸着法等によって行
なうことができる。

かくして、本発明において第１抗体として用いる不溶化
されたＩＬ−２モノクローナル抗体を収得できる。

本発明において、第２抗体としては、前記の通りＩし一
２抗体のＦａｂ’　フラグメントであって、該フラグメ
ントの５ｔ−（Ｗを介して酵素標識された標識抗体を使
用する。

上記ＩＬ−２抗体のＦａｂ’　フラグメントとしては、
ＩＬ−２を認識するもの、即ちＩＬ−２に結合性を有す
る抗体のｌ”　ａｂ’フラグメントである限り、特に限
定はなく、前記したＩＬ−２モノクローナル抗体もしく
は該抗体の製法において開示した免疫抗原を哺乳動物に
投与して生体内に所望抗体を産生させて採取することか
らなる、常法に従って得られる杭体くポリ抗体）のＦ　
ａｂ’　フラグメントを使用できる。

上記抗体のＦ　ａｂ’　フラグメントのｖＡ製は、それ
自体公知の方法に従い、例えば抗体をパパインで部分分
解することにより、又はペプシンで分解して得られるＦ
（ａｂ’）２フラグメントを、還元処理することにより
、容易に実施できる（　Ａ　ｎｎ。

Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２　１　　、　３　１　
０　　（１９８４）　　）　　。

また、酵素標識のための酵素標識物質としては、例えば
パーエキシダーゼ（ＰＯＸ）、マイクロパーオキシダー
ゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダー
ゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミ
ラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｐ−ナーゼ等を
例示することができる。２等標識物質によるＦ　ａｂ’
　フラグメントのＳＨ基を介した標識方法も、通常の方
法に従うことができる（　Ａ　ｎｎ、　ＣＩｉｎ　、　
３１ｏｃｈｅａ＋、、　２　ｌ　。

３１０　（１９８４））。

かくして本発明において第２抗体として使用する、ＳＨ
基を介して酵素標識されたＩＬ−２抗体のＦ　ａｂ’フ
ラグメントが調製される。

本発明の測定方法は、前述した通り、特定の第１抗体及
び第２抗体を用いることを除いては、通常のサンドイツ
チ法による酵素免疫測定法に従うことができる。

より好ましい本発明方法につき、詳細に説明すれば、該
方法は、例えばまず測定しようとする検体（被検サンプ
ル）中の１し−２と、第１抗体とを反応させて免疫複合
体を形成させ、次いでこの複合体に第２抗体を反応させ
て、該複合体に結合した酵素活性を測定するにより実施
される。

上記において測定系に利用される溶媒としては、反応に
悪影響を与えない通常の各種のものをいずれも用い得る
が、例えばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、酢酸緩衝液等の１１８が約５．０〜９．０程度
の緩衝液を用いるのが好ましい。尚、本発明においては
、上記溶媒に、約１〜１０ｖ　／ｖ％程度の血清（測定
対象のＩＬ−２が含まれていないもの）及び／又は約０
．１〜０．５Ｍ程度のＮａ　ＣＱを含ませるのが、本発
明の目的により合致していて好ましい。

また本発明測定法において、検体としての臨床サンプル
は、例えば血清もしくは血漿形態の血液、細胞組織液、
リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、膵臓液、骨
髄液、唾液等の各種の体液のいずれであってもよい。

測定の際の免疫反応条件は、特に制限はなく、通常のこ
の種測定法と同様のものとすることができる。一般に゛
は４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃程度の温度条件
下に、約１〜４０時間程度を要して反応を行なえばよい
。

本発明方法では、上記免疫反応終了後に固相一液相分離
を行ない、次いで分離された各相につき酵素活性を測定
する。上記固相一液相分離は、例えば遠心分離、炉別、
デカンテーション、洗浄等の通常の方法に従うことがで
き、また酵素活性の測定は、使用した酵素の種類に応じ
て公知の方法に従い実施することができる。

かくして、本発明方法によれば、臨床サンプル等の微量
のＩＬ−２を含有する試料を検体として、該検体中のＩ
Ｌ−２を高精度、高感度をもって、しかも簡便な操作で
定量することができる。

本発明方法の実施に特に便利な方法は、上・記測定のた
めのキットを利用する方法である。該キットには、前記
第１抗体及び第２抗体を含有させることが重要である。

またこの抗体試薬には、例えばグリセロールや牛血清蛋
白等の安定化剤及び／又は保存剤を添加することができ
る。好ましくは、この抗体試薬は、凍結乾燥したもので
あり、該キットには水溶性もしくは水と混和し得る溶媒
を含有させることができる。更に抗体試薬には、再構成
された試薬系を一定のＩ）Ｈに保つためのｗｉ衝液及び
／又は試料が悪化するのを防止するための保存剤及び／
又は安定剤を配合することもできる。

緩衝液はキット試薬の必須成分ではないが、本発明測定
法を実施する際に、ｐｔ−１を５．０〜９．０程度とす
るものを用いるのが好ましい。また再構成剤は、好まし
くは水を含んだものであるが、水の一部又は全部を水と
混和し得る溶媒で置き換えることもできる。この水と混
和し得る溶媒としては、よく知られている例えばグリセ
リン、アルコール類、グリコールエーテル類等を例示で
きる。

発　　明　　の　　効　　果本発明によれば、ＩＬ−２を有利に且つ簡便に測定でき
る。殊に、本発明方法は、その測定感度が極めて高く、
特異性も優れており、従って、例えば臨床サンプル等め
橿めて低濃度のＩＬ−２を含有する検体中の該ＩＬ−２
をも正確に測定することができる。

実　　　施　　　例以下、本発明をより詳しく説明するため参考例及び実施
例を挙げるが、本発明は之等に限定されるものではない
。

尚、各個において、ポリペプチド等におけるアミノ酸の
表示は、ＩＵＰＡＣにより採択されているアミノＰＩＪ
命名法における略号乃至当該分野で慣用される略号によ
るアミノ酸残基の表示法に従うものとし、塩基配列にお
ける核酸の表示や制限酵素等の試薬の表示も同様に、慣
用される略号によるものとする。

参考例１：ヒトＩＬ−２の製造ヒトＩＬ−２を下記■〜■に示す方法（遺伝子組換え技
術）に従い、大腸菌を用いて製造した。

上記ヒトＩＬ−２発現プラスミド構築の概略図を第１図
に示す。

■　ＩＬ−２をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド
Ｄ　ｔｒｌ）　Ｉ　Ｌ−２Ｄ８（７）構築ヒト扁桃腺の
ｍＲＮ　Ａからクローニングされた［　Ｌ−２ｃ　ＤＮ
Ａを含むプラスミド１ｌＨＩＧ５−３　（Ｍａｅｄａ、
　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ。３　ｉｏｃｈｅｍ、　［３１ｏｐ
ｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　　Ｇｏ＋ｕ　、、１１５．　１０４０−１０
４７（１９８３）、大きさ約４．４ｋｂｏ）を、制限酵
素Ｈｉｎｄｌｌ及びｐｖｕ■により浦化し、ｆＬ−２Ｇ
ＤＮＡを含む約１．２キロベースベアーズ（ｋｂｐ）の
ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動法により単離し
た。単離されたＤＮＡ断片を制限酵素ト１ａｉＡＩで消
化し、ＩＬ−２をコードしているＤＮＡ断片（約０．８
ｋｂｌ））を、アガロースゲル電気泳動法により単離し
た後、このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理
し、更にＣ１ａＩアダプターとしての合成オリゴヌクレ
オチド［５′−ＴＧＣＣＡＴＴＡＴ−３’　及び５’　
　−ＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＡ−３’　　（前者のオリゴ
ヌクレオチドのみ５′末端を予めリン酸化しており）］
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結合させ、得られるＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動法により単離精製した
。

この合成オリゴヌクレオチドを結合させたＩＬ−２をコ
ードするＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＣＩａＩで切断し
たプラスミドｐＡＴ１５３（Ｎａｔｕｒｅ　、　２８３
．２１６　（１９８０）　、大きさ約３．７ｋｂｐ）の
該Ｃ１ａＩ切断部位に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させ
、得られた結合物で大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換させ
、形質転換株から所望のプラスミドｐ　ＡＴ　ｍｌ　Ｌ
２−２　（大きさ約４．５ｋｂｐ）を保有する形質転換
大腸菌Ｈａ１０１／ｐＡＴ　ＪＬ２−２を得た。

得られた大腸菌ＨＢ１０１／ｐ　ＡＴ　Ｉ　Ｌ２−２よ
り、プラスミドｐ　ＡＴ　ｍｌ　Ｌ２−２を分離し、こ
れを制限酵素ＣＩａＩで切断後、ＩＬ−２遺伝子をコー
ドする領域を含むＤＮＡＩＷｉ片（約０．８ｋｂｐ　）
をアガロースゲル電気泳動法により単離した。

一方ベクターブラスミドｐＴＭ１（今本文男、代謝第２
２巻、第２８９頁（１９８５）、大きさ約４．７ｋｂｐ
）を、制限酵素ＣＩａ工で切断し、この切断部位に、上
記で得たＩＬ−２３１伝子をコードするＤＮＡ断片を、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、結合物で大腸菌Ｈ８１
０１を形質転換させて、５０μｇ／ｌｌＩ２アンピシリ
ンを含むＬＢ寒天培地に拡げ、出現したアンピシリン耐
性株につき、ホイリング法（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎａ、　ｐ　３６６
　（ＣｏｌｄＳ　ｐｒｉｎｏ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　（１９８２）　）によりプラスミドを単
離し、種々の制限酵素による切断地図より、所望のプラ
スミドｐｔｒｐｌＬ２Ｄ８（大きさ約５．５ｋｂｐ）を
保有する形質転換株（大腸菌Ｈ８１０１／ｐ　ｔｒｐ　
ＩＬ２Ｄ８）を得た。

■　ヒトＩＬ−２発現プラスミド１）ｔｒりＩＬ２Ｄ８
Δの構築上記■で得た形質転換株からプラスミドｐ　ｔｒｐＩＬ
２Ｄ８を取り出し、これを制限酵素５ｔｕｌ及びｌ−１
ｉｎｄＩ［で切断し、３′末端の遺伝子をコードしてい
ない部分を除いたＤＮＡ断片を、アガロ−スゲルミ気泳
動法により単離した。

次いで、このＤＮＡ断片を、ＤＮＡポリメラーゼエ（ク
レノーフラグメント）を用いて処理し、更にＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより自己結合させ、結合物で大腸菌ＨＢ１０
１を形質転換して、目的とするプラスミドｐｔｒｐｌＬ
２Ｄ８Δを含む形質転換大ｍ菌ＨＢ１０１／ｐ　ｔｒｐ
　ＩＬ２Ｄ８Δｌｌた。

■　ヒトＩＬ−２の製造かくして得られた形質転換株を、アンピシリン５０μＯ
／ｍＱを含むＬＢ培地２０〇−中で３７℃で一晩培養後
、１％カザミノ酸及び５０μＱ／’ｍＡアンピシリンを
含むＭ９培地１０１２に植菌し、３７℃で８．５時間培
養後、菌体を遠心分離して集菌した。

この菌体を生理食塩水に懸濁させ、遠心分離により上溝
を除いた後、沈漬を２５％蔗糖及び０．０１％アジ化ナ
トリウムを含むトリス塩Ｍ緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）に懸
濁させ、これに１１０ｌｌ１／鶴リゾチームを５０ｍＭ
　　ＥＤＴＡを含む１０１１Ｍトリス塩酸緩衝液に溶解
して加えた。上記溶液を氷上で超音波破砕し、更に遠心
分離を行ない、沈漬を得た。更に沈渣を１Ｍ食塩を含む
トリス塩酸緩衝液に懸濁させ、超音波破砕を行ない、次
いで遠心分離し、沈渣を得た。

上記操作を更に２回繰返した後、得られた沈渣をウルト
ロゲルＡｃＡ３４　（ＬＢＫ社ＩＪ）のゲルクロマトグ
ラフィー及び逆相クロマトグラフィーに供し、５Ｏ８−
ＰＡＧＥで単一のスポットを与える組換えヒトＩＬ−２
（ｒヒトＩＬ−２）を得た。

参考例２：５）−１基を介して酵素標識されたＩＬ−２
抗体のｌ：　ａｂ’　フラグメントの製造参考例１で得
たｒヒトＩＬ−２から、ＩＬ−２抗体のＦ　ａｂ’　フ
ラグメントを下記■により調製し、次いで下記■の方法
に従い、該Ｆ　ａｂ’　フラグメントにＳＨ基を介して
酵素標識して所望の標識抗体を製造した。

■　参考例１で得たｒヒトＩＬ−２の０．１１１０／ｍ
ｆ２ＰＢｓ溶液に、７０インドの完全アジュバント液を
等岳加えて懸濁液を作成し、数羽のウサギ（Ｎｅｗ−Ｚ
ｅａｌａｎｄ　　ＷｈｉｔｅＲａｂｂｉｔ　、体重３．
０〜３．５に！］）に、ＩＬ−２として１回合２０〜１
０００μｇ／ウサギを、２１間毎に皮下投与した。６回
投与後、採血して抗血清を得た。

上記抗血清より、石川らの方法（Ｊ。

ｌｍ１ｕｎｏａｓｓａｙ、　４．２０９　（１９８３）
　）に従って、硫安分画及びジエチルアミノエチル−セ
ルロースカラム分画を行なってＩ！ＩＩＧを採取し、次
いでペプシン分解及び還元処理して、ｌ”　ａｂ’　を
収得した。

上記Ｆ　ａｂ’を、精製標品ヒトＩＬ−２を用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーにて精製して、所望のＩ
Ｌ−２抗体のｌ：ａｂ’　フラグメント（抗Ｉ　Ｌ　−
２Ｆａｂ’　）　ｔＡＲり。

■　スフシミジル　４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート［３ｕｃｃｉｍｉ
ｄｙｌ　４−　（Ｎ　−ａ＋ａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈ
ｙｌ　）　−ｃｙｃ＋ｏｈｅｘａｎｅ　−１−ｃａｒｂ
ｏｘｙ＋ａｔｅ　：　Ｚ　ｔｅｂｅｎＣｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏ、、　Ｌｔｄ、］を用いたヒンジ法（Ｊ。

Ｉｎ＋ｍｕｎｏａｓｓａｙ、　４．２０９　（１９８３
）　）に従い、ＰＯＸ　［Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐ
ｅｒｏｘｉｄａｓｅ　：ベーリンガーマンハイム社製（
Ｂ　ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ　ａｎｎｈｅｉｍＧＩｌｂ
Ｈ］を、上記■で得た抗ＩＬ−２Ｆａｂ’にＳＨ基を介
して結合させて、本発明に第２抗体として使用する目的
の標識抗体を得た。

参考例３：不溶化ＩＬ−２モノクローナル抗体の’ＩＪ
造本発明に第１抗体として使用する不溶化ＩＬ−２モノク
ローナル抗体を、下記■〜■の方法に従い製造した。

■　免疫抗原（ＩＬ−２−β−ｇａｌ融合蛋白質）の製
造ヒトＩＬ−２と大腸菌β−ｇａｌ　との融合蛋白質を以
下に示す遺伝子組換え技術に従い、大腸菌を用いて製造
した。

融合蛋白質発現プラスミド構築の概略図を第２図に示す
。

β−ｇａｌ遺伝子を含む出発プラスミドとしては、ｐＯ
ＦＲ２ＣＧ、　Ｍ、　Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、　Ｃ，ａｐ
Ｒｈｙｓ　、　Ｍ、　Ｌ、　１３ｅｒ＋＋＋ａｎ　、　
３．　Ｈａａ＋ｐａｒ　、　Ｄ。

Ｊ　ａｃｋｓｏｎ、　Ｔ　、　Ｊ　、　Ｓ　１ｌｈａｖ
ｙ、　Ｊ　、　ＷｅｉｓｅＩｌ＋ａｎａｎｄ　Ｍ、　Ｚ
ｗｅｉｇ、　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　ＡＣａｄ　
、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８０．４４３２−４４３６　（１９８３））を
用いた。またヒトＩＬ−２を含むプラスミド（トリプト
ファンプロモーターを含む）としては、参考例１の■で
得たＩ）　ｔｒｉ）　Ｉ　Ｌ２Ｄ、８をそれぞれ用いた
。

参考例１の■で得たプラスミドＥｌｔｒＤＩＬ２Ｄ８を
、制限酵素Ｘｂａ工で切断し、次いでＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノーフラグメント）を用いて処理し、更に制
限Ｒ’Ｊ素ＥＣ０ＲＩで切断して、トリプトファンプロ
モーター及びヒトＩＬ−２の部分配列（Ｎ端側５９個の
アミノ酸配列に相当するＤＮＡ配列）を含む約５００　
ｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動法により
単離した。

一方、プラスミドｐＯＲＦ２を制限酵素Ｂａ１ＩＩで切
断し、次いでＤＮＡポリメラーゼエ〈クレノーフラグメ
ント）を用いて処理し、更に制限酵素ＥＣ０ＲＩで切断
して、β−ｇａｌをコードする遺伝子Ｉａｃ　Ｚ　（正
確にはそのＮ端側５アミノ酸に相当するＤＮＡ配列が欠
落している）を含むＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気
泳動法により単離した。

得られたＤＮＡ断片と、上記で得た約５００　ｂｐのＤ
ＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、結合物
で大腸菌ＪＡ２２１　（Ｎａｋａｉｕｒａ　、　Ｋ、　
ｅｔａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　、　１８．１１０９−１１１
７（１９７９））を形質転換させ、形質転換株より所望
の融合蛋白質発現プラスミドｐ　ｔｒｐΔＩＬ２−Ｉａ
ｃＺＤ８を含む大腸菌ＪＡ２２１を得た。

得られた形質転換株の保有するプラスミドのＩＬ−２及
びＩａｃ　Ｚ遺伝子をコードしている部分のＤＮＡ塩基
配列及びアミノ酸配列は、下記第１表の通りであった。

第　　１　　表ｐ　ｔｒｐΔＩＬ２−ｌａｃ　ＺＤ８のＩＬ−２と１ａ
ｃＺの遺伝子をコードしている部分のＤＮＡ１基配列と
アミノ酸配列上記で得た形質転換大腸菌を、アンピシリ
ン２５μＱ／−を含むＬＢ培地２００舗中で３７℃で１
晩培養後、２５μｇ／−アンピシリンを含むＬＢ培地１
０１２に植菌し、３７℃で８．５時間培養した。

培養液より遠心分離により集菌した後、得られた菌体を
５０１Ｍエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ
）を含む５０−Ｍトリス塩酸！！衝液（Ｄ　Ｈ８）５０
ｍＧに懸濁させ、これに１０１１（Ｊ／舖リすチーム５
ｍＧを加え、氷上で３０分間処理した後、超音波破砕し
、遠心分離（１０万×ｇ、２０分）した。得られた沈渣
を１０１Ｍリン酸緩衝液５０ｍＧに懸濁させ、超音波破
砕し、遠心分離（１０万Ｘ（１，２０分間）し、更に得
られた沈渣を再度１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁させ、超
音波破砕し、遠心分離（１０万×り、２０分間）して、
免疫抗原とする目的の融合蛋白質を得た。

該融合蛋白質は、これに含まれるβ−ｇａｌの性質を利
用して、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シドが結合したアガロースを用いて、アフイニテイクロ
マトグラフイーによる精製を行ない得る。

■　モノクローナル抗体の製造く免疫抗原によるマウスの感作〉上記■で得た免疫抗原を生理食塩水溶液を用いて１０ｍ
９融合蛋白質／ＩＩＩＱの濃度にｒ１４製した。

上記で調製した抗原液を、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスにＩＬ
ｇ融合倶白質／マウスとなる量で初回皮下投与し、以後
２週間間隔で８回同濃度で同様に投与して、供試動物を
感作させた。

〈細胞融合のための感作リンパ球の調製〉上記最終投与
の４日後に、マウスの牌臓より、牌細胞を取り出した。

該ｌｌＩＬ中に存在する赤血球を、０．８３％塩化アン
モニウム液で４℃で３分間処理して融解除去した。

上記により得られた細胞を感作リンパ球とし、これを数
回ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。

く融合用ミエローマ細胞のａ製〉ＨＧＰＲＴ欠損ＢＡＬＢ／ｃ由来ｏ３−Ｘ６３−Ａ（Ｊ
８−Ｕ１ミニｏ−ｖ　（Ｇ、　Ｇａ１ｆｒｅ　ａｎｄ　
Ｃ。

ＭｆｌＳ（Ｏｉｎ　、　Ｍｅｔｈｏｄ　１ｎＥｎｚｙ＋
＋ｏｌｏｇｙ　、　Ｖｏｌ。

７３、ｐ３（１９８１））を、１０％牛脂児血清（Ｆｅ
２）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に８−７ザブア
ニン１００μＭを加えた培地中で継代培養し、これをミ
エローマ細胞として用いた。

〈融合細胞（ハイブリドーマ）の作成〉上記ミエローマ
細胞１Ｘ１０７個を、上記で調製した感作牌細胞Ｉ　Ｘ
　１０８個と混合し０、得られる細胞混合物を５００ｘ
ａで遠心後、これに３５％ポリエチレングリコール２０
００　（和光純薬社製）の１鵬を加えて、［ｌ胞融合さ
せた。細胞融合操作は、マイルスタインの方法に従った
。

ＨＡＴ培地で増殖してくるハイブリドーマを、ＢＡＬＢ
／Ｃ胸腺細胞をフィーダーセルとして使用して、限界希
釈法によりクローニングした。

かくして後記する免疫測定法により抗ＩＬ−２抗体活性
を有することの明らかな、目的のモノクローナル抗体産
生能を有するクローンを得た。

〈目的抗体産生クローンの検索〉上記でクローニングされた各クローンの培養上清の抗Ｉ
Ｌ−２抗体活性を以下の酵素免疫測定法により測定し、
目的抗体産生りＯ−ンを検索した。

〈酵素免疫測定法〉参考例１の■で得たｒヒトＩＬ−２を、ＰＢＳ緩衝液（
ｐＨ７，２）に溶解し、４℃で２４時間静置して、酵素
免疫用プレート（フロー・ラボラトリーズ社製）に結合
させた。

一方、それぞれの抗体（各りＯ−ンの培養上清）を１０
％ＦＣ８を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で２．４．８．
１６．３２．６４．１２８．２５６．５１２及び１０２
４倍に希釈し、それらのそれぞれ１００μＱを、上記ｒ
ｔＬ−２を結合させた酵素免疫用プレートの各ウェルに
入れ、３７℃で１時間反応させた。

未反応物質を洗浄除去後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスグロブリン抗体（イー、ライ。ラボラトリーズ（
Ｅ、Ｙ、Ｌａｂ、ＬＩＳＡ）社製）の１００ＬｔＱを各
ウェルに加えて、３７℃で１時間反応させた。次に洗浄
により未反応抗体を除去した侵、オルトフェニレンジア
ミン溶液（２，５ａ＋ｇ／−マキシロベイン緩衝液；ク
エンＷ１７ｏ、リン酸２ナトリウム２３．８９ａ及び３
％過酸化水素液５ＩＩＩ２を蒸留水で１９に希釈した液
）１００μＱを各ウェルに加えて反応を停止させた後、
マイクロプレート光度計で波長４９２ｎｍの吸光度を測
定して、測定値を抗体値とする。

前記でクローニングされた各クローンの培養上清につい
て上記酵素免疫測定法により測定された結果（１０２４
倍希釈した時の値）を、下記第２表に示す。

第　　２　　表クローンＮｏ、　　　　抗体値（吸光度４９２ｎｍ）３
　　　　　　　０．３９４１１　　　　　　　０．５９４１４　　　　　　　０．４０７１９　　　　　　　０．４１６２７　　　　　　　０．３８６３９　　　　　　　０．３２８４３　　　　　　　１．１７１５２　　　　　　　０．９３２５８　　　　　　　１．１８４２３”　　　　　　　０．０７６但しクローンＮｏ、２３′Ａの値は、原液（未希釈）の
ものである。

上記第２表より、クローンＮ００３．１１．１４．１９
．２７．３９．４３．５２及び５８により産生されるモ
ノクローナル抗体は、遺伝子組換え技術により製造され
たｒヒトＩＬ−２と結合することが判明した。

また之等のクローンは、全てＩｇＧ１サブクラスに属す
ることが確認された。

くモノクローナル抗体の製造〉上記でクローニングされたクローンＮｏ、３９を、ＢＡ
ＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内に移植する方法により、及び
＾密度連続培養装置（柴田バリオ硝子株式会社製）を用
いた細胞培養法により、それぞれ培養増殖させて、該ク
ローンから所望のモノクローナル抗体を人聞に調製した
（Ｇ、ＧａＨｒｅａｎｄ　ｃ、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　、
　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｇｏ＋ｏｏｙ　。

Ｖｏｌ、７３．０３　（１９８１））。

免疫グロブリンは、硫酸アンモニウム塩析法及びＤＥＡ
Ｅイオン交換りＯマドグラフィーにより精製した（医化
学実験法講座４、免疫化学、中白書店発行、１９７２年
、第７５−９０頁）。

■　モノクローナル抗体の不溶化上記■で得られたヒトＩＬ−２モノクローナル抗体を、
物理的吸着法（Ｓ　、　Ｈａｓｈｉｄａ他、Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、　　Ａｃｔａ、、１３５，２６３　（１９８
３））に従い、ポリスチレンビーズ［直径３．２１１１
１゜Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　　Ｐｌａｓｔｉｃ　　Ｂａ１
ｌ　Ｇｏ、、　］に吸着させて、本発明に第１抗体とし
て使用する不溶化抗体を得た。

実施例１参考例１の■で得たｒヒトＩＬ−２を、スタンダードと
して、０．１％ＢＳＡ、１００　ｍＭＮａ　ＣＱ及び０
．１％Ｎａ　Ｎ３を含む１１０ｌ１１リン酸塩緩衝液（
１）Ｈ７，０）で段階希釈系列（５０μＱ／チユーブ）
を作成した。

このチューブに、前記で得た第１抗体（ビーズ）１個及
び正常マウス血清５０μＱを加えて、３７℃で４時間イ
ンキュベートした。反応液を除去し、ビーズを０．１Ｍ
　　ＮａＣＱを含む１０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７
，０）で２回洗浄後、館記で得た第２抗体の、０．ＩＭ
　　ＮａＣｌ２及び０．１％ＢＳＡを含む１０＋ａＭリ
ン酸塩緩衝液（ｐｌ−１７，０）溶液１５０μＱを加え
（第２抗体２０口Ｑ／チューブ及び正常ウサギＦ　（ａ
ｂ’　）　２１００ｎ！ＩＩ／チユーブ）、２０℃で４
時間インキュベートした。

同様にしてビーズを洗浄した後、ビーズに結合した酵素
活性を螢光測定法により測定した。

即ち、ｐ−ヒドロキシフエニルプロピオン酸０．２５ｇ
を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）５０ｍＧに溶
解し、この１０μＱに上記ビーズ及び０．０２５％ＢＳ
Ａ及び１００ｎ＋Ｍ　　ＮａＣＱを含む１０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）２５０μＱを加えて３０℃で５
分間インキュベートした。

０．０３％Ｈ２Ｏ２水溶液の０．０５１１１１２を加え
て反応を開始し、反応は３０℃で１０〜６０分間行なっ
た。０．１Ｍグリシン−Ｎａ　ＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，
３）の２．５−を加えることにより、反応を停止し、螢
光を測定した（　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　：３２０　ｎ
ｍ、　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　：　４０２　ｎｍ、　−１ン
トロール＝０．２ｆＡＱ／ＱキニンのｌＮ１１ｉ！！酸
水溶液］。

結果を第３図に示す。図において横軸はチューブ当りの
スタンダード１ｔ（ｏｃｔ）を、縦軸はコントロールの
０．２μ（１／ＩＩＩＱキニンの螢光強度を１００とし
た時の螢光強度を示す。

第３図より、本発明方法によれば、極めて高感度な測定
が、正確に行ない得ることが判る。

実施例２慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の関部液をサンプルとし
て、上記実施例１の方法により、ＩＬ−２ｓ度を測定し
た。

結果を下記第３表に示す。

表中ＮＤは測定限界以下を示す。尚、コントロールとす
る正常人もＮＯであった。

第　　３　　表患　　　者　　　　　　　ＩＬ−２１１１度　（＋’１
ｇ／　ＴｎＱ　）Ｊ−１０，４３０Ｊ−２１，０６Ｊ−３Ｎ　ＤＪ−４０，２３４Ｊ−５Ｎ　０Ｊ−６０，２２０Ｊ−７Ｎ　０Ｊ−８０，３２０Ｊ−９０，４０８Ｊ−１００，５０８Ｊ−１１０，４９６Ｊ−１２０，７６４実施例３実施例２と同様にして、抗ＤＮＡ抗体陽性のヒト血清サ
ンプルを用いてＩＬ−２Ｉ１１度を測定した。

その結果、３８サンプル中１４サンプルにＩＬ−２８度
が測定され、その平均ハ０．４２４ｎａ／ｒｒＥＪであ
うた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＨｌＧ５−３とｐＡＴ１５３とからヒトＩ
Ｌ−２発現プラスミドｐｔｒｌ）ＩＬ２［）を構築する
概略図を示す。第２図はｐｔｒｐｌＬ２Ｄ８とｐＯＦＲ２とからＩＬ−
２−β−ｇａｌ融合蛋白質発現プラスミドｐ　ｔｒｐΔ
ＩＬ２−＋ａｃｚｏｓを構築する概略図を示す。第３図は実施例１に従う酵素免疫測定法の結果を示すグ
ラフである。（以　上）第２図第３図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）サンドイッチ法による酵素免疫測定法において、
第１抗体として不溶化されたＩＬ−２モノクローナル抗
体を用い、第２抗体としてＳＨ基を介して酵素標識され
たＩＬ−２抗体のＦａｂ′フラグメントを用いることを
特徴とするＩＬ−２の測定法。