ES2345194T3 - Deteccion de glucosa que tambien contienen un alfa hidroxiacido o una beta dicetona. - Google Patents
Deteccion de glucosa que tambien contienen un alfa hidroxiacido o una beta dicetona. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para detectar la presencia o la concentración de glucosa en una muestra que puede también contener un alfa hidroxiácido o una beta dicetona, que comprende: a) exponer la muestra a un compuesto seleccionado del grupo constituido por: 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(ciclo- hexanocarboxamido)hexilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(carbo- xietil)amino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(N-6-(9-antracenocarboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(3-carboxipropionamido)hexilamino]metil]antraceno; N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(3-carboxipropanamidoetil)aminohexil]]aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida; y N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)aminohexil]] aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida; y sus sales; y b) medir cualquier cambio en la fluorescencia emitida por el compuesto para determinar de ese modo la presencia o la concentración de glucosa en dicha muestra, en el que la presencia del alfa hidroxiácido o de la beta dicetona no interfiere con dicha determinación.
Description
Detección de glucosa que también contienen un
\alpha-hidroxiácido o una
\beta-dicetona.
La presente invención se refiere a la detección
de glucosa en muestras que pueden también contener compuestos
potencialmente interferentes, tales como
\alpha-hidroxiácidos o
\beta-dicetonas.
La complejación de hidratos de carbono, incluida
la glucosa, con ácido fenilborónico se ha conocido durante mucho
tiempo y la reversibilidad de esa interacción ha servido como base
para la separación cromatográfica de azúcares. Específicamente, en
1959, Lorand y Edwards informaron de constantes de asociación para
las asociaciones acuosas de ácido fenilborónico con numerosos
polioles saturados; las interacciones de unión variaban de muy
débiles (por ejemplo, etilenglicol, K_{d} = 360 mM) a
moderadamente fuertes (por ejemplo, glucosa, K_{d} = 9,1 mM).
Véase J. Yoon, y col., Bioorganic and Medicinal Chemistry 1 (4):
267-271 (1993). Se cree que el mecanismo de unión
tiene lugar a través del enlace de grupos hidroxilo adyacentes en la
glucosa a los grupos hidroxilo en un resto boronato.
La patente de EEUU Nº 5.503.770 (James, y col.)
describe un compuesto fluorescente que contiene ácido borónico que
emite fluorescencia de una alta intensidad tras la unión a los
sacáridos, incluida la glucosa. El compuesto fluorescente tiene una
estructura molecular que comprende un fluoróforo, al menos un resto
de ácido fenilborónico y al menos un átomo de nitrógeno amínico
donde el átomo de nitrógeno está dispuesto en la proximidad del
resto de ácido fenilborónico para producir la interacción de manera
intramolecular con el ácido borónico. Tal interacción causa de ese
modo la emisión de fluorescencia por parte del compuesto tras la
unión al sacárido. Véase también T. James, y col., J. Am. Chem.
Soc. 117 (35): 8982-8987 (1995).
Además, en la técnica se conocen detectores
fluorescentes que usan un compuesto que contiene ácido
antrilborónico para detectar la glucosa en la sangre. Por ejemplo,
J. Yoon, y col., J. Am. Chem. Soc. 114: 5874-5875
(1992) describen que el ácido antrilborónico puede usarse como
quimiodetector fluorescente para señalar la unión de hidratos de
carbono, incluidas la unión de glucosa y de fructosa.
Desafortunadamente, los compuestos que
interactúan con la glucosa de la forma descrita anteriormente
también tienen una tendencia a interactuar con otros compuestos que
tienen grupos hidroxilo, reduciendo de este modo la especificidad
de un ensayo de glucosa, especialmente cuando se analizan muestras
fisiológicas que pueden contener cantidades interferentes de
lactato, acetoacetato, etc. Por ejemplo, algunos pacientes
diabéticos también desarrollan acidosis láctica, en la que los
niveles de lactato de la sangre son superiores a 5 mmol/litro. Por
consiguiente, sigue existiendo una gran necesidad de ensayos de
glucosa que sean relativamente insensibles a los compuestos con
hidroxilos potencialmente interferentes, tales como el lactato.
En un aspecto, la presente invención está
dirigida a un procedimiento para detectar la presencia o la
concentración de glucosa en una muestra que pueda contener también
un \alpha-hidroxiácido o una
\beta-dicetona, que comprende:
a) exponer la muestra a un compuesto
- a)
- exponer la muestra a un compuesto seleccionado del grupo constituido por:
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(ciclohe- xanocarboxamido)hexilamino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(car-boxietil)amino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(N-6-(9-antracenocarboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(3-carboxipropionamido)hexilamino]metil]antraceno;
- N-(3-metacrilamidopropil)-4-[[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(3-carboxipropanamidoetil)aminohexil]]aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida; y
- N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)aminohexil]]aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida; y sus sales; y
- b)
- medir cualquier cambio en la fluorescencia emitida por el compuesto para determinar de ese modo la presencia o concentración de glucosa en dicha muestra, en el que la presencia del alfa hidroxiácido o de la beta dicetona no interfiere con dicha determinación
y
b) medir cualquier cambio en la fluorescencia
emitida por el compuesto para determinar de ese modo la presencia o
concentración de glucosa en dicha muestra, en el que la presencia
del \alpha-hidroxiácido o de la
\beta-dicetona no interfiere sustancialmente con
dicha determinación.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención está
dirigida a un compuesto seleccionado del grupo constituido por
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(ciclohexanocar-
boxamido)hexilamino]metil]antraceno;
boxamido)hexilamino]metil]antraceno;
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(carboxietil)amino]metil]antraceno;
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(N-6-(9-antracencarboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno;
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(3-carboxipropionamido)hexilamino]metil]antraceno;
N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(3-carboxipropanamidoetil)aminohexil]]aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida;
N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)aminohexil]]aminoetil-
amino]naftalen-1,8-dicarboximida; y sus sales.
amino]naftalen-1,8-dicarboximida; y sus sales.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención está
dirigida a un sistema de detección que comprende un compuesto
descrito anteriormente.
La figura 1 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 420 nm) de un indicador según se describe
en el Ejemplo 1.
La figura 2 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 428 nm) de un indicador según se describe
en el Ejemplo 2.
La figura 3 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 428 nm) de un indicador según se describe
en el Ejemplo 3.
La figura 4 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 427 nm) de un indicador según se describe
en el Ejemplo 4.
La figura 5 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 540 nm) de un indicador según se describe
en el Ejemplo 5.
La figura 6 ilustra los espectros de absorbancia
de un indicador según se describe en el Ejemplo 6.
Las figuras 7 y 8 ilustran la relación de las
absorbancias (450 nm/530 nm) de un indicador según se describe en
el Ejemplo 6.
La figura 9 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 550 nm) de un indicador según se describe
en el Ejemplo 6.
La figura 10 ilustra el espectro de
fluorescencia, en ausencia de glucosa y en presencia de glucosa 100
mM, de un indicador según se describe en el Ejemplo 6.
La figura 11 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 550 nm), en presencia de glucosa y
lactato, de un indicador según se describe en el Ejemplo 6.
La figura 12 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 525 nm) de un indicador expuesto a glucosa
según se describe en el Ejemplo 10.
La figura 13 ilustra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 530 nm) de un indicador expuesto a lactato
según se describe en el Ejemplo 10.
La figura 14 muestra la emisión de fluorescencia
relativa (I a 430 nm) de un indicador expuesto a glucosa y lactato
según se describe en el Ejemplo 11.
La figura 15 muestra la emisión de fluorescencia
relativa (I a 430 nm) de un indicador expuesto a glucosa y lactato
según se describe en el Ejemplo 12.
La figura 16 ilustra la fluorescencia de un
indicador expuesto a glucosa y lactato según se describe en el
Ejemplo 13.
En un aspecto, la presente invención proporciona
una manera para detectar la presencia o la concentración de glucosa
en una muestra que puede contener también compuestos interferentes,
tales como \alpha-hidroxiácidos o
\beta-dicetonas. Tales compuestos potencialmente
interferentes incluyen lactato, acetoacetato, ácido
\beta-hidroxibutírico, etc.
La presente invención se lleva a cabo usando un
compuesto indicador según se especifica en las reivindicaciones,
que es capaz de reconocer la glucosa en una muestra, pero que tiene
menos probabilidad de reconocer los compuestos interferentes en la
muestra. El compuesto indicador tiene al menos dos elementos de
reconocimiento para la glucosa, orientados de manera tal que la
interacción entre el compuesto indicador y la glucosa sea más
estable que la interacción entre el compuesto indicador y los
compuestos interferentes.
Los elementos de reconocimiento adecuados
incluyen los restos que son capaces de sufrir una interacción, de
preferencia reversible, con la glucosa, en especial con los grupos
diol presentes en la glucosa. Se conocen varios de tales elementos
de reconocimiento, e incluyen de preferencia el ácido borónico, el
ión boronato, el ácido arsenioso, el ión arsenito, el ácido
telúrico, el ión telurato, el ácido germánico, el ión germanato,
etc. Los elementos de reconocimiento de más preferencia son los que
contienen boro. Se entenderá que hasta el uso, los elementos de
reconocimiento pueden estar protegidos con un grupo protector. Tales
grupos son bien conocidos, e incluyen el neopentilglicol, el
pinacol, etc. El elemento de reconocimiento protegido puede
desprotegerse en el medio en el que se ha de usarse el compuesto
(véase, por ejemplo, Ejemplo 5).
Los elementos de reconocimiento están de
preferencia espaciados en el compuesto indicador por una distancia
adecuada uno del uno para permitir que al menos dos de los elementos
de reconocimiento interactúen con una molécula de glucosa, dando
como resultado mayor especificidad. En general, los elementos de
reconocimiento pueden tener una separación de hasta aproximadamente
30 átomos entre ellos. De preferencia, los elementos de
reconocimiento están orientados de tal manera que puedan estar
separados por aproximadamente 6 \ring{A} cuando interactúan con
la glucosa.
Los compuestos indicadores de la presente
invención tienen una característica detectable (fluorescencia) que
cambia de una manera dependiente de la concentración cuando el
compuesto se expone a una muestra que contiene glucosa. Se conocen
muchas de tales características, por ejemplo, los compuestos
indicadores pueden incluir un resto luminiscente (fluorescente o
fosforescente) o quimioluminiscente, un resto basado en la
absorbancia, etc. Los compuestos indicadores pueden incluir un
resto donador de energía y un resto aceptor de energía, cada uno
espaciado de manera que se produzca un cambio detectable cuando el
compuesto indicador interactúa con la glucosa. Los compuestos
indicadores pueden incluir un fluoróforo y un inactivador,
configurados de manera tal que el fluoróforo sea inactivado por el
inactivador en ausencia de glucosa. En esa situación, cuando la
glucosa está presente, el indicador sufre un cambio en la
configuración que hace que el inactivador se desplace a una
distancia suficiente del fluoróforo para que se emita la
fluorescencia. Inversamente, el fluoróforo y el inactivador pueden
configurarse de manera tal que en ausencia de glucosa, estén
suficientemente separados y el fluoróforo emita fluorescencia; tras
la interacción con la glucosa, el fluoróforo y el inactivador se
desplazan hasta una posición suficientemente próxima para causar la
inactivación. El concepto de cambio en la configuración está
descrito con más detalle en nuestra solicitud Nº de serie 09/754.219
en tramitación con la presente, presentada el 5 de enero de 2001,
con el título "Detección de analitos".
Como alternativa, los indicadores pueden incluir
un resto tal como un fluoróforo capaz de interactuar con el
elemento de reconocimiento u otro resto dispuesto espacialmente con
respecto al elemento de reconocimiento de manera tal que en
ausencia de glucosa, el fluoróforo emita fluorescencia. Tras la
adición de glucosa, la glucosa compite con la interacción entre el
fluoróforo y el elemento de reconocimiento, o con la interacción
entre el fluoróforo y el otro resto dispuesto espacialmente con
respecto al elemento de reconocimiento, causando una reducción en
la fluorescencia. Un ejemplo de ese concepto se ilustra en el
Ejemplo 6. Se reconocerá también que los indicadores pueden
elegirse de manera tal que el fluoróforo no emita fluorescencia, o
emita un nivel relativamente bajo de fluorescencia, cuando el
fluoróforo interactúa con el elemento de reconocimiento o con el
otro resto dispuesto espacialmente con respecto al elemento de
reconocimiento en ausencia de glucosa. Tras la adición de glucosa,
la glucosa compite con la interacción entre el fluoróforo y el
elemento de reconocimiento, o con la interacción entre el
fluoróforo y el otro resto dispuesto espacialmente con respecto al
elemento de reconocimiento, causando un aumento en la
fluorescencia.
Otros restos detectables incluyen aquellos cuya
fluorescencia está afectada por la interacción de la glucosa a
través de la transferencia fotoinducida de electrones o efectos
inductivos. Estos incluyen los quelatos de lantánido que se dan a
conocer en la Solicitud U.S. Nº de serie 09/265.979 en tramitación,
presentada el 11 de marzo de 1999 (y publicada como Solicitud
Internacional según el PCT WO 99/46600 el 16 de septiembre de
1999); hidrocarburos poliaromáticos y sus derivados; cumarinas;
BoDiPy; dansilo; catecoles; etc. Otra clase de restos incluye
aquellos cuyo espectro de absorbancia cambia tras la interacción del
compuesto indicador con la glucosa, incluyendo el rojo de
alizarina, etc. Otra clase de restos incluye aquellos cuya
fluorescencia es modulada por efectos de proximidad, por ejemplo,
pares donador/aceptor de energía tales como dansilo/dabsilo,
etc.
De preferencia, la característica detectable es
un cambio espectral detectable, tal como cambios en las
características de absorción (por ejemplo, cambio espectral y/o de
absortividad), en el tiempo de vida fluorescente (determinado por
la medición del dominio de tiempos o del dominio de frecuencias),
intensidad fluorescente, anisotropía o polarización fluorescente;
un cambio espectral del espectro de emisión; un cambio en el
decaimiento de anisotropía con el tiempo (determinado por la
medición del dominio de tiempos o del dominio de frecuencias),
etc.
Los compuestos indicadores de la presente
invención, si son solubles, pueden utilizarse directamente en
disolución si se desea. Por otra parte, si la aplicación deseada
así lo exige, los compuestos indicadores pueden inmovilizarse (por
ejemplo por atrapamiento mecánico o por unión covalente o iónica)
sobre o dentro de una superficie insoluble o de una matriz tal como
vidrio, plástico, materiales poliméricos, etc. Cuando el compuesto
indicador está atrapado, por ejemplo, dentro de otro polímero, el
material de atrapamiento debe ser, de preferencia, suficientemente
permeable a la glucosa para permitir la interacción adecuada entre
la glucosa y el compuesto indicador.
Si los compuestos indicadores son poco solubles
o insolubles en agua, pero aún se desea la detección en un medio
acuoso, el compuesto indicador puede copolimerizarse con un monómero
hidrófilo para formar una macromolécula hidrófila como se describe
en la solicitud U.S. Nº de serie 09/632.624 en tramitación,
presentada el 4 de agosto de 2000.
Se entenderá también que los presentes
compuestos y sistemas de detección pueden estar en forma polimérica.
Por consiguiente, un compuesto integral (conteniendo elementos de
reconocimiento y el resto detectable) podría unirse a un polímero
existente, o el compuesto integral en forma monomérica podría
polimerizarse o copolimerizarse con otro monómero adecuado para
formar un polímero. Como alternativa, podrían copolimerizarse dos
componentes monoméricos separados (por ejemplo, uno que contenga
los elementos de reconocimiento y uno que contenga un resto
detectable) de modo que el polímero resultante contendrá todos los
elementos necesarios del sistema (véase Ejemplo 6).
Existen numerosos usos para los compuestos
indicadores de la presente invención, incluidos usos como
indicadores en los campos de la energía, medicina y agricultura.
Por ejemplo, los compuestos indicadores pueden utilizarse para
detectar niveles inferiores o niveles superiores de glucosa en
tampones o líquidos fisiológicos, tales como sangre, plasma, suero,
líquido intersticial, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva,
líquido intraocular, linfa, lágrimas o sudor, proporcionando de
este modo información valiosa para diagnosticar o combatir
enfermedades tales como la diabetes y la insuficiencia
suprarrenal.
La producción médica/farmacéutica de glucosa
para la aplicación terapéutica en seres humanos exige supervisión y
control.
Los usos para la presente invención en
agricultura incluyen la detección de niveles de glucosa en soja y
otros productos agrícolas. La glucosa debe controlarse
cuidadosamente en las decisiones críticas de la cosecha para
productos de tan elevado valor como las uvas del vino. Como la
glucosa es la fuente de carbono y la materia prima más costosa en
los procesos de fermentación, la supervisión de la glucosa para el
óptimo control de la velocidad de alimentación de la reacción es
importante en la producción del alcohol. La mezcla de la reacción y
el control de la concentración de glucosa también son críticos para
el control de calidad durante la producción de refrescos y bebidas
fermentadas, que consume las mayores cantidades de glucosa y
azúcares fermentables (diol vecinal) internacionalmente.
Cuando los compuestos indicadores incorporan
sustituyentes indicadores fluorescentes, en la técnica se conocen
diversas técnicas de detección. Por ejemplo, los compuestos de la
invención pueden utilizarse en los dispositivos de detección de
fluorescencia (por ejemplo, Patente de EEUU Nº 5.517.313) o pueden
unirse a un material polimérico tal como papel del ensayo para la
inspección visual. Esta última técnica permitiría, por ejemplo, la
medición de la glucosa de una manera análoga a la determinación del
pH con una tira de papel tornasol. Los compuestos descritos en el
presente documento pueden utilizarse también como simples reactivos
con instrumentación analítica convencional de laboratorio tal como
espectrofluorómetros o analizadores clínicos como los fabricados por
Shimadzu, Hitachi, Jasco, Beckman y otros. Estas moléculas también
podrían proporcionar la transducción de señales químicas/ópticas
específicas de analito para detectores basados en fibra óptica y
fluorómetros analíticos como los fabricados por Ocean Optics
(Dunedin, Florida), u Oriel Optics.
La Patente de EEUU Nº 5.517.313 describe un
dispositivo de detección de fluorescencia en el que pueden
utilizarse los compuestos de la presente invención para determinar
la presencia o la concentración de glucosa en un medio líquido. El
dispositivo de detección comprende una disposición estratificada de
una matriz que contiene moléculas del indicador fluorescente (en
adelante en el presente documento "matriz fluorescente"), un
filtro de paso alto y un fotodetector. En este dispositivo, una
fuente luminosa, de preferencia un diodo luminiscente ("LED"),
está localizada al menos parcialmente dentro del material indicador,
o en una guía de ondas sobre la que está dispuesta la matriz del
indicador, tal que la luz incidente de la fuente luminosa hace que
las moléculas del indicador emitan luz fluorescente. El filtro de
paso alto permite que la luz emitida alcance el fotodetector,
filtrando al mismo tiempo la luz incidente dispersada de la fuente
luminosa. La fluorescencia de las moléculas del indicador utilizado
en el dispositivo descrito en la Patente de EEUU Nº 5.517.313 es
modulada, por ejemplo, atenuada o aumentada, por la presencia local
de glucosa.
En el detector descrito en la Patente de EEUU Nº
5.517.313, el material que contiene la molécula del indicador es
permeable al analito. Por consiguiente, el analito puede difundir en
el material desde el medio de prueba circundante, afectando de ese
modo a la fluorescencia emitida por los compuestos indicadores. La
fuente luminosa, el material que contiene el compuesto indicador,
el filtro de paso alto y el fotodetector están configurados tal que
al menos una parte de la fluorescencia emitida por los compuestos
indicadores impacte en el fotodetector, generando una señal
eléctrica que es indicativa de la concentración de glucosa en el
medio circundante.
De acuerdo con otras posibles formas de
realización para usar los compuestos indicadores de la presente
invención, se describen también dispositivos de detección en las
Patentes de EEUU Nº 5.910.661, 5.917.605 y 5.894.351.
Los compuestos de la presente invención también
pueden utilizarse en un dispositivo implantable, por ejemplo para
controlar de manera continua los niveles de glucosa en sangre in
vivo. Dispositivos adecuados están descritos en, por ejemplo,
la Solicitud de patente U.S. Nº de serie 09/383.148 en tramitación
con la presente, presentada el 26 de agosto de 1999, así como en
las Patentes de EEUU Nº 5.833.603, 6.002.954 y 6.011.984.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser preparados por personas expertas en la técnica sin una excesiva
experimentación usando mecanismos de reacción y reactivos fácilmente
conocidos, por ejemplo incluyendo los mecanismos de reacción que
son coherentes con los procedimientos generales que se describen a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
A una suspensión de sal clorhidrato de
N-(3-aminopropil)metacrilamida (11,82 g, 66,0
mmoles, 3,0 equiv.) y DBMP (10 mg como inhibidor) en 250 ml de
CHCl_{3} a 0ºC se le añadió gota a gota DIEA (18,5 g, 25,0 ml,
144 mmoles, 6,5 equiv.) durante un período de 20 minutos. Se dejó
calentar la mezcla hasta 25ºC y a continuación se volvió a enfriar
hasta 0ºC. A la mezcla enfriada se le añadió gota a gota una
disolución de 9-clorometilantraceno (5,0 g, 22
mmoles) en CHCl_{3} (100 ml) durante un período de 1 hora.
Posteriormente se agitó la mezcla a 25ºC durante 1 hora, a 50ºC
durante 12 horas y a continuación a 70ºC durante 2 horas. En este
momento se lavó la mezcla con 4 porciones de 60 ml de agua y las
fases acuosas combinadas se extrajeron con CH_{2}Cl_{2}. Los
extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro, se dejó decantar y se concentró en vacío. El material
bruto se purificó por medio de cromatografía en gel de sílice (gel
de sílice de resolución rápida, CH_{3}OH/CH_{2}Cl_{2} al
2-5%) dando 2,44 g (33%) de un producto sólido.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,39 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 90/10, véase con UV
(254/366), tinción de nihidrina.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución de
9-[3-(metacrilamido)propilamino]-metilantraceno
(2,44 g, 7,34 mmoles) y DBMP (10 mg como inhibidor) en 200 ml
CHCl_{3} a 0ºC se le añadió DIEA (2,85 g, 3,84 ml, 22,0 mmoles,
3,0 equiv.) en porciones durante un período de 10 minutos, seguido
por la adición gota a gota de una disolución de neopentiléster del
ácido (2-bromometilfenil)borónico (2,49 g,
8,81 mmoles, 1,2 equiv.) durante un período de 30 minutos.
Posteriormente se agitó la mezcla a 25ºC durante 20 horas. En este
momento se lavó la mezcla con agua y las fases acuosas combinadas
se extrajeron con CH_{2}Cl_{2}. Los extractos orgánicos
combinados se secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se dejó
decantar y se concentró en vacío. El material bruto se purificó por
medio de cromatografía en gel de sílice (gel de sílice de
resolución rápida, CH_{3}OH al
2-5%/CH_{2}Cl_{2}) dando 2,50 g (76%) de un
sólido cristalino ligeramente amarillo.
Pf: 72-73ºC.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,36 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 90/10, véase con UV
(254/366), tinción de nihidrina.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución de
9-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)-bencil]-N-[3-(metacrilamido)
propilamino]metilantraceno (0,0490 g, 0,105 mmoles) y
cloruro de
[3-(metacrilamido)propil]-trimetilamonio
(MAPTAC, disolución acuosa al 50% en peso, 0,48 g, 0,90 ml, 2,1
mmoles, 20 equiv.) en 1,5 ml de etilenglicol se le añadió
4,4'-azobis(ácido cianovalérico) (0,008 g, 0,03
mmoles, 1,4% en moles del monómero total). La disolución se purgó
con gas argón durante 5 minutos y a continuación se calentó hasta
60ºC en la oscuridad durante 18 horas. En este momento se enfrió la
disolución viscosa hasta 25ºC, se diluyó con 5 ml de agua y se
dializó a través de una membrana de acetato de celulosa (MWCO 3500)
frente a 3 x 4 l de agua.
El material dializado se concentró hasta
sequedad dando 0,339 g (68%) de un sólido vítreo amarillo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la fluorescencia
del copolímero (que contiene un único elemento de reconocimiento)
preparado en este ejemplo por medio de glucosa y lactato. La Figura
1 muestra la emisión de fluorescencia normalizada (I/I_{0} a 420
nm) de disoluciones del copolímero 0,5 mg/ml (relación molar 1:20)
en PBS que contenían a) glucosa 0-20 mM; b) lactato
0-20 mM. Los espectros se registraron usando un
espectrofluorómetro RF-5301 de Shimadzu con
excitación a 365 nm; rendijas de excitación a 1,5 nm; rendijas de
emisión a 5 nm; temperatura ambiente. Las barras de error son
desviaciones estándar con valores por duplicado para cada punto de
datos. La fluorescencia del copolímero se vio afectada por la
presencia de glucosa y lactato.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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A una disolución de
2-(2-aminoetoxi)etanol (31,4 g, 30,0 ml, 299
mmoles, 20,9 equiv.) en 40 ml de CHCl_{3} a 23ºC se le añadió
9,10-bis(clorometil)antraceno (3,94 g,
14,3 mmoles). Se agitó la disolución en la oscuridad durante 67
horas. En este momento se añadieron 100 ml de CH_{2}Cl_{2} y se
lavó con 1 porción de 50 ml y 2 porciones de 100 ml de NaHCO_{3}
(disolución acuosa saturada). El extracto orgánico se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró dando 4,67 g
(79%) de un polvo amarillo. El producto (aproximadamente 85% puro
por RP-HPLC) se siguió usando como tal.
Condiciones de HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP
1100, columna 201TP de 10 x 250 mm de Vydac, inyección de 0,100 ml,
2 ml/min, detección a 370 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN
(HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 15,6 minutos.
Se agitó una disolución de
9,10-bis[[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metil]antraceno
(4,02 g, 9,75 mmoles), DIEA (12,6 g, 17,0 ml, 97,5 mmoles, 10,0
equiv.) y neopentiléster del ácido
(2-bromometilfenil)borónico (13,7 g, 48
mmoles, 4,9 equiv.) en 125 ml de CHCl_{3} a 23ºC en la oscuridad
durante 46 horas. En este momento se concentró la mezcla de
reacción inicialmente mediante evaporación rotativa, a continuación
usando una bomba de vacío para eliminar DIEA. Se purificó el
residuo por medio de cromatografía en columna con alúmina (alúmina
neutra activada 150 g, CH_{3}OH al
0-3%/CH_{2}Cl_{2}) dando 5,67 g (70%) de un
aceite viscoso que solidificó tras el reposo. El producto
(aproximadamente 85% puro por RP-HPLC) se siguió
usando como tal.
TLC: placas de alúmina básica de Merck,
Fr 0,33 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 95/5, véase con UV
(254/366).
Condiciones de HPLC: Cromatógrafo de HPLC
HP 1100, columna Vydac 201TP de 10 x 250 mm, inyección de 0,100 ml,
2 ml/min, detección a 370 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN
(HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 18,8 minutos.
Se agitó una disolución de
9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)bencil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]-metil)antraceno
(0,298 g, 0,359 mmoles), ácido metacrílico (0,304 g, 0,300 ml, 3,53
mmoles, 9,84 equiv.), DCC (0,965 g, 4,68 mmoles, 13,0 equiv.) y
N,N-dimetil-aminopiridina (0,020 g,
0,16 mmoles, 0,46 equiv.) en 15 ml de CH_{2}Cl_{2} a 23ºC en la
oscuridad durante 4 horas. En este momento se filtró la mezcla de
reacción y se concentró por medio de evaporación rotativa. Se
purificó el residuo por medio de cromatografía en columna con
alúmina (alúmina neutra activada 50 g, CH_{3}OH al
0-4%/CH_{2}Cl_{2}) dando 0,150 g (47%) de un
sólido amarillo.
EM BAR: Calculado para C52H66B2N2O9 [M]+
885; Hallado [M + 1]+ 886.
TLC: placas de alúmina básica de Merck,
Fr 0,45 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 95/5, véase con UV
(254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna Vydac 201TP de 10 x 250 mm, inyección de 0,100 ml, 2 ml/min,
detección a 370 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al
0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al 10-80%
durante 18 minutos, B al 80-100% durante 2 minutos,
B al 100% durante 2 minutos, tiempo de retención 21 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución de cloruro de
[2-(metacriloxi)etil]trimetil-amonio
(TMAMA, disolución acuosa al 70% en peso, 0,344 g de monómero, 1,66
mmoles, 50 equiv.) en 0,600 ml de agua se le añadió una disolución
de
9-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)-bencil]-N-[2-(2-metacroiloxietoxi)
etilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]-dioxaborinan-2-il)bencil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]antraceno
(0,0024 g, 0,0033 mmoles) en 3,00 ml de MeOH. A esta mezcla se le
añadió 4,4'-azobis(ácido
4-cianovalérico) (0,0075 g, 0,027 mmoles, 1,6% en
moles del monómero total). La disolución se filtró a través de un
filtro de membrana de 0,45 \mu, se purgó con gas nitrógeno y a
continuación se calentó en la oscuridad a 55ºC durante 16 horas. En
este momento se enfrió la disolución viscosa hasta 25ºC y se
concentró en vacío. Se diluyó el residuo con 20 ml agua y se filtró
a través de un filtro de membrana de 0,2 \mu. La disolución
polimérica se dializó a través de una membrana de acetato de
celulosa (MWCO 3500) frente a 2 x 4 l de agua. De la diálisis se
obtuvieron 38,5 ml de disolución polimérica. La concentración de una
porción de esta disolución hasta sequedad indicó 0,0075 g de
polímero por 1,0 ml de disolución. Rendimiento total del polímero de
0,289 g (77%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la fluorescencia
del copolímero (que contiene dos elementos de reconocimiento)
preparado en este ejemplo por medio de glucosa, lactato y
acetoacetato. La Figura 2 muestra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I0 a 428 nm) de una disolución de copolímero de
antraceno bis boronato-TMAMA 1,5 mg/ml (relación
molar 1:50) en PBS que contenía a) glucosa 0-20 mM;
b) lactato 0-20 mM; c) acetoacetato de litio
0-20 mM. Los espectros se registraron usando un
espectrofluorómetro RF-5301 de Shimadzu con
excitación a 365 nm; rendijas de excitación a 1,5 nm; rendijas de
emisión a 1,5 nm y a temperatura ambiente. La fluorescencia del
copolímero se vio afectada por la presencia de glucosa, pero no por
la presencia de lactato o de acetoacetato.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se agitó una disolución de clorhidrato de
terc-butiléster de \beta-alanina
(3,06 g, 16,8 mmoles, 5,09 equiv.), DIEA (4,27 g, 5,75 ml, 33,0
mmoles, 10,00 equiv.) y
9,10-bis(clorometil)antraceno (0,910
g, 3,31 mmoles) en 75 ml CHCl_{3} a 23ºC en la oscuridad durante
93 horas. En este momento se filtro la disolución y se lavó con 1
porción de 40 ml y 2 porciones de 60 ml de NaHCO_{3} (disolución
acuosa saturada). El extracto orgánico se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró dando un sólido
bruto amarillo. El residuo se purificó por medio de cromatografía
en columna de gel de sílice (gel de grado 30 g, CH_{3}OH al
0-3%/CH_{2}Cl_{2}) dando 1,06 g (65%) de un
producto viscoso amarillo-anaranjado.
El producto se siguió utilizando como tal.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,33 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 95/5, véase con UV
(254/366).
Se agitó una disolución de
9,10-bis[[2-(terc-butoxicarbonil)-etilamino]metil]antraceno
(1,60 g, 3,25 mmoles), DIEA (4,45 g, 6,00 ml, 34,4 mmoles, 10,6
equiv.) y neopentiléster del ácido
(2-bromometilfenil)borónico (4,80 g, 17,0
mmoles, 5,22 equiv.) en 30 ml de CHCl_{3} a 23ºC en la oscuridad
durante 4,5 días. En este momento se añadieron a la mezcla 45 ml de
CHCl_{3} y se lavó la mezcla con 2 porciones de 25 ml de
NaHCO_{3} (disolución acuosa saturada). El extracto orgánico se
secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró dando
un aceite bruto rojizo. Se purificó el residuo por medio de
cromatografía en columna con alúmina (100 g de alúmina neutra
activada, CH_{3}OH al 0-3%/CH_{2}Cl_{2}) dando
aproximadamente 3,5 g de un sólido naranja. El producto se
disolvió, seguido por la formación de un precipitado blanco (sal HBr
de DIEA). La disolución se filtró y el filtrado se concentró dando
2,72 g (93%) de un sólido naranja. EL producto (pureza > 80% por
medio de RP-HPLC) se siguió utilizando como tal.
TLC: placas de alúmina básica de Merck,
Fr 0,66 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 95/5, véase con UV
(254/366).
Condiciones de HPLC: Cromatógrafo de HPLC
HP 1100, columna 201TP de 10 x 250 mm de Vydac, inyección de 0,100
ml, 2 ml/min, detección a 370 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B =
MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 23,9 minutos.
Se agitó una disolución de
9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)bencil]-N-[2-(terc-butoxicarbonil)etilamino]metil]-antraceno
(0,556 g, 0,620 mmoles) en 5 ml de TFA al 20%/CH_{2}Cl_{2} a
23ºC en la oscuridad durante 25 horas. En este momento se concentró
la mezcla de reacción bajo una corriente de gas N_{2}. Se trituró
el residuo con 3 porciones de 10 ml de éter. El sólido residual se
secó en vacío dando 0,351 g (87%) de un polvo esponjoso
amarillo.
EM BAR: Matriz de glicerol; Calculado
para C_{42}H_{46}B_{2}N_{2}O_{10} (aducto bis glicerol)
[M]^{+} 760; Hallado [M]^{+} 760.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,025
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,5 ml, detección a 360 nm,
A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B
al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B
al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 16,7 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la fluorescencia
del compuesto indicador (que contiene dos elementos de
reconocimiento) preparado en este ejemplo por medio de glucosa y
lactato. La Figura 3 muestra la fluorescencia (a 428 nm) de
disoluciones 75 \muM de indicador bis carboxilato
bis-boronato-antraceno en PBS que
contenían a) glucosa 0-10 mM, lactato 0 mM; b)
glucosa 0-10 mM, lactato 2 mM; c) glucosa
0-10 mM, lactato 5 mM. Los espectros se registraron
usando un espectrofluorómetro RF-5301 de Shimadzu
con excitación a 365 nm; rendijas de excitación a 1,5 nm; rendijas
de emisión a 1,5 nm y a temperatura ambiente. Todos los puntos se
midieron por triplicado, con barras de \pm 1 DE incluidas. La
presencia de lactato no afectó sustancialmente la modulación de la
fluorescencia del indicador por medio de glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se agitó una suspensión de
9,10-bis(clorometil)antraceno (1,5 g,
5,45 mmoles), DIEA (28,17 g, 38,00 ml, 218 mmoles, 40 equiv.), sal
clorhidrato de N-(3-aminopropil)metacrilamida
(9,76 g, 54,5 mmoles, 10,0 equiv.) y 5 mg de BHT en 200 ml de
CHCl_{3} a 23ºC en la oscuridad durante 4 días a 40ºC. En este
momento se aumentó la temperatura hasta 45ºC y la mezcla se agitó
durante 3 días más. En este momento se había formado un precipitado.
La mezcla se filtró y se disolvió el producto sólido en la mínima
cantidad de CH_{2}Cl_{2}. Durante la noche se formó un sólido
cristalino amarillo, la sal bis clorhidrato del producto deseado
(3,15 g, cuantitativo).
TLC: placas de alúmina básica de Merck,
Fr 0,31 con CH_{2}Cl_{2}/CH3OX 90/10, véase con UV
(254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,100
ml, 0,75 ml/min, detección a 360 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B =
MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 15,0 minutos.
Se agitó una disolución de
9,10-bis[3-(metacrilamido)-propilamino]metilantraceno
(0,650 g, 1,34 mmoles de la amina libre), DIEA (0,612 g, 0,825 ml,
4,74 mmoles, 3,55 equiv.), neopentiléster del ácido
(2-bromometilfenil)borónico (1,34 g, 4,74
mmoles, 3,55 equiv.) y BHT (5 mg como inhibidor) en 20 ml de
CHCl_{3} a 23ºC en la oscuridad durante 5 días. En este momento
se concentró la mezcla de reacción en vacío y se purificó el residuo
por medio de cromatografía en alúmina (200 g de alúmina neutra
activada, CH_{3}OH al 0-2%/CH_{2}Cl_{2}) dando
0,465 g (39%) de un aceite amarillo muy viscoso.
TLC: placas de alúmina básica de Merck,
Fr 0,59 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 90/10, véase con UV
(254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, detección a 360 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B =
MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 16,9 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una disolución de
N,N-dimetilacrilamida (al 40% en peso) y
N,N=-metilenbisacrilamida (al 0,8% en peso) en etilenglicol. Se
combinaron
9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]-dioxaborinan-2-il)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metilantraceno
(17,8 mg, 2x10^{-5} moles) y 40 \mul de persulfato de amonio
acuoso (al 5% en peso) con 1 ml de disolución de monómero
etilenglicol. La disolución resultante se colocó en una caja seca
purgada con nitrógeno. Se añadió una disolución acuosa de
N,N,N=,N=-tetrametiletilendiamina (80 \mul, al 5% en peso) a la
formulación del monómero para acelerar la polimerización. La
formulación resultante se vertió en un molde construido a partir de
portaobjetos para microscopio y un separador de acero inoxidable de
100 micrómetros. Tras dejar permanecer el molde durante 8 horas en
atmósfera de nitrógeno, se le colocó en disolución salina tamponada
de fosfato (PBS) (PBS 10 mM, pH = 7,4), se separaron los
portaobjetos de microscopio y se retiró el hidrogel. Se lavó el
hidrogel con 100 ml de PBS que contenía sal laurilsulfato de sodio 1
mM y sal de sodio de EDTA 1 mM durante 3 días, cambiando la
disolución todos los días, seguido por el lavado con DMF/PBS (10/90
en vol., 3 x 100 ml) y finalmente con PBS (pH = 7,4, 3 x 100 ml).
El polímero de hidrogel resultante se conservó en PBS (PBS 10 mM,
pH = 7,4) que contenía azida de sodio al 0,2% en peso y sal de sodio
de EDTA 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la fluorescencia
del compuesto indicador (que contiene dos elementos de
reconocimiento) preparado en este ejemplo por medio de glucosa,
lactato y acetoacetato. La Figura 4 muestra la emisión de
fluorescencia normalizada (I/I_{0} a 427 nm) de un hidrogel que
contenía la molécula de reconocimiento de la glucosa de este
ejemplo en PBS 10 mM, pH 7,4 que contenía NaN_{3} al 0,2% y EDTA 1
mM con diversas cantidades de L-lactato de sodio,
acetoacetato de litio o
\alpha-D-glucosa. Los datos se
registraron usando un espectrofluorómetro RF-5301
de Shimadzu con excitación a 365 nm (rendija = 3 nm) y emisión a 427
nm (rendija = 3 nm) a baja sensibilidad a 37ºC usando un soporte de
muestras con temperatura controlada. Las cubetas que contenían 3 ml
de la disolución deseada se equilibraron a 37ºC durante 15 minutos
antes de la medición. Se tomó la medición de cada muestra de
hidrogel en cuatro muestras independientes. Las barras de error son
desviaciones estándar con valores por cuadruplicado de cada punto
de los datos. Los hidrogeles que contenían una molécula de
reconocimiento de la glucosa se prepararon como se describió
anteriormente. Los hidrogeles se montaron en portaobjetos de vidrio
y se cubrieron con malla de nailon en cubetas de PMMA a 450 para la
luz incidente. Se prepararon las disoluciones de
L-lactato de sodio [Aldrich] 1, 5, 10 y 20 mM,
acetoacetato de litio [Aldrich] 5, 10 y 20 mM y
\alpha-D-glucosa 1, 2, 4, 5, 10 y
20 mM en PBS 10 mM, pH 7,4 que contenía NaN_{3} al 0,2% y EDTA 1
mM. La fluorescencia del copolímero se vio afectada por la
presencia de glucosa, pero no por la presencia de lactato o de
acetoacetato.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se agitó una suspensión de anhídrido
4-bromo-1,8-naftálico
(10,0 g, 36,1 mmol) y dietilacetal de aminoacetaldehído (4,81 g,
5,26 ml, 36,1 mmol, 1 equiv.) en 45 ml de EtOH a 45ºC durante 3
días. En este momento se filtró la suspensión resultante, lavando
con EtOH y se secó el residuo dando 13,3 g (94%) de un producto
sólido marrón claro.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,17 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 98/2, véase con UV
(254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,5 ml, detección a 360 nm,
A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B
al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B
al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 24,2 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó una disolución de
N-(2,2-dietoxietil)-4-bromo-1,8-naftalimida
(0,797 g, 2,03 mmol) y n-butilamina (1,48 g, 2,00
ml, 20,2 mmol, 9,96 equiv.) en 8 ml de NMP a 45ºC durante 66 horas.
En este momento la suspensión resultante se dejó enfriar hasta 25ºC
y a continuación se filtró. El residuo se disolvió con 50 ml de éter
y se extrajo 3 veces con 50 ml de agua. El extracto orgánico se
secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró dando
un polvo bruto amarillo. El material bruto se purificó por medio de
cromatografía en gel de sílice (gel de grado 25 g, CH_{3}OH al
0-1%/CH_{2}Cl_{2}) dando 0,639 g (82%) de un
polvo amarillo.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,71 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 95/5, véase con UV
(254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,5 ml, detección a 450 nm,
A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B
al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B
al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 23,5 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una disolución de
N-(2,2-dietoxietil)-4-butilamino-1,8-naftalimida
(0,622 g, 1,62 mmol) y ácido p-toluensulfónico
monohidrato (0,010 g, 0,053 mmol, 0,032 equiv.) en 25 ml de acetona
a 25ºC durante 18 horas. En este momento se concentró la disolución
y el residuo se purificó por medio de cromatografía en gel de sílice
(gel de grado 25 g, CH_{3}OH al
0-1%/CH_{2}Cl_{2}) dando 0,470 g (94%) de un
sólido naranja.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,61 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 95/5, véase con UV
(254/366).
RMN de ^{1}H (400 MHZ, CDCl_{3}): \delta
1,03 (t, 3H, J = 7,3 Hz), 1,53 (m, 2H), 1,78 (m, 2H), 3,38 (t, 2H,
J = 7,2 Hz), 5,02 (s, 2H), 6,64 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,52 (dd, 1H, J
= 7,4, 8,3 Hz), 8,08 (dd, 1H, J = 1 Hz, 8,5 Hz), 8,38 (d, 1H, J =
8,3 Hz), 8,46 (dd, 1 H, J = 1,0, 7,3 Hz), 9,75 (s, 1H).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,5 ml, detección a 450 nm,
A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B
al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B
al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 19,6 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una suspensión de
4-dimetilaminobenzaldehído (1,00 g, 6,70 mmol),
Na_{2}SO_{4} (6,70 g, 47,2 mmol, 7,04 equiv.) y
1,6-diaminohexano (3,89 g, 33,5 mmol, 5,00 equiv.)
en 20 ml de EtOH anhidro en la oscuridad a 25ºC bajo una atmósfera
de gas nitrógeno durante 18 horas. En este momento se filtró la
disolución y se añadió NaBH_{4} (1,73 g, 45,8 mmol, 6,84 equiv.)
al filtrado. La suspensión se agitó a 25ºC durante 5 horas. En este
momento se concentró la mezcla de reacción y se disolvió el residuo
en 50 ml de agua y se extrajo 3 veces con 50 ml de éter. Los
extractos orgánicos combinados se lavaron 2 veces con 50 ml de agua.
Los extractos acuosos combinados se extrajeron 2 veces con 50 ml de
éter. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre
Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró dando 1,35 g (81%) de un
aceite viscoso.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,58 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/iPrNH_{2} 80/15/5, véase
con tinción de nihidrina, UV (254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,5 ml, detección a 280 nm,
A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B
al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B
al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 13,3 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión de
N-(2-oxoetil)-4-butilamino-1,8-naftalimida
(0,346 g, 1,11 mmol) en 25 ml MeOH anhidro se le añadió una
disolución de
N-(4-dimetilamino-bencil)-1,6-diaminohexano
(0,554 g, 2,22 mmol, 2,00 equiv.) y ácido acético (0,067 g, 1,1
mmol, 1,0 equiv.) en 20 ml de MeOH anhidro. A esta mezcla se le
añadió una disolución de NaCNBH_{3} (0,070 g, 1,1 mmol, 1,0
equiv.) en 5 ml de MeOH anhidro. La mezcla de reacción se agitó a
25ºC durante 15 horas. En este momento se eliminó el MeOH por medio
de evaporación rotativa y el residuo se disolvió en 30 ml de agua.
La disolución se ajustó a pH 2 con HCl 1 N y a continuación se agitó
durante 1 hora a 25ºC. En este momento la disolución se ajustó a pH
12 con NaOH 1 N y posteriormente se extrajo 3 veces con 50 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Los extractos orgánicos combinados se lavaron 3
veces con 50 ml de agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se
filtró y se concentró dando un aceite bruto marrón. El material
bruto se purificó por medio de cromatografía en gel de sílice (gel
de grado 35 g de resolución rápida, al CH_{3}OH
0-50%/CH_{2}Cl_{2}, a continuación
CH_{3}OH/CH_{2}Cl_{2}/iPrNH_{2} 45/50/5) dando 0,190 g (32%)
del producto diamina.
EM BAR: Calculado para
C_{33}H_{45}N_{5}O_{2} [M]^{+} 544; Hallado
[M]^{+} 544.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,42 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 80/20, véase con tinción de
nihidrina y UV (254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,5 ml, detección a 450 nm,
A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B
al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B
al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 17,6 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución de
N-2-[6-N-(N-4-dimetilaminobencil)-aminohexil]aminoetil)-4-butilamino-1,8-naftalimida
(0,150 g, 0,276 mmoles) y DIEA (0,355 g, 0,478 ml, 2,81 mmoles,
10,0 equiv.) en 5 ml de CHCl_{3} se le añadió una disolución de
neopentiléster del ácido
(2-bromometilfenil)borónico (0,390 g, 1,38
mmoles, 5,00 equiv.) en 2 ml de CHCl_{3}. Posteriormente se agitó
la disolución a 25ºC durante 27 horas. En este momento se concentró
la mezcla y se purificó el residuo por medio de cromatografía en
columna con alúmina (100 g de alúmina neutra activada, CH_{3}OH
al 0-5%/CH_{2}Cl_{2}) dando 0,024 g (19%) de un
aceite viscoso marrón.
EM BAR (matriz de glicerol): Calculado
para C_{53}H_{67}B_{2}N_{5}O_{8} [M]^{+} 924
(aducto bis glicerol en lugar de bis neopentiléster de ácidos
borónicos); Hallado [M]^{+} 924.
TLC: Placas de alúmina neutra de Merck,
Fr 0,62 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 80/20, véase con UV
(254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,5 ml, detección a 450 nm,
A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente B al
10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% 2 minutos,
tiempo de retención 20,7 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto ácido bis borónico libre usado en
los estudios de glucosa es el resultado de la disolución de
N-2-[6-N-(N-4-dimetil-aminobencil)-6-N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)bencil]aminohexil]-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)bencil]aminoetil-4-butilamino-1,8-naftalimida
en el sistema tampón MeOH/PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la fluorescencia
del compuesto indicador (que contiene dos elementos de
reconocimiento) preparado en esta muestra por medio de glucosa y
lactato. La Figura 5 muestra la emisión de fluorescencia
normalizada (I/I_{0} a 535 nm) de disoluciones 0,015 mM del
compuesto indicador en MeOH/PBS 70/30 que contenían a) glucosa
0-20 mM; b) lactato 0-20 mM. Los
espectros se registraron usando un espectrofluorómetro
RF-5301 de Shimadzu con excitación a 450 nm;
rendijas de excitación a 1,5 nm; rendijas de emisión a 1,5 nm y a
temperatura ambiente. Las barras de error son desviaciones estándar
con valores por triplicado para cada punto de datos. La
fluorescencia del indicador se vio afectada por la presencia de
glucosa, pero no se vio sustancialmente afectada por la presencia
de lactato.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se combinó sal de sodio del ácido
3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracenosulfónico
(1,4 g, 3,9 mmoles) con 30 ml de ácido clorosulfónico y se calentó
a 90ºC durante 5 horas, tras lo cual se enfrió la disolución hasta
0ºC y se vertió en 100 g de hielo. Una vez fundido el hielo se
extrajo la disolución con CH_{2}Cl_{2} (3 x 100 ml), se
combinaron los extractos de cloruro de metileno, se secó con
Na_{2}SO_{4} y se evaporó produciendo 0,87 g de sólido
(Rendimiento del 66%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron cloruro de
3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracenosulfonilo
(96 mg, 0,28 mmoles) y clorhidrato de
N-(3-aminopropil)metacrilamida (108 mg, 0,6
mmoles) con 20 ml de CH_{2}Cl_{2}. A esta suspensión se le
añadió Et_{3}N (303 mg, 3 mmoles). La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 24 horas, se filtró y se evaporó el
disolvente. El sólido resultante se sometió a cromatografía en
columna en SiO_{2} (10 g) con CH_{2}Cl_{2}/MeOH (90/10) como
un eluyente. Se obtuvo el producto como un sólido rojo (80 mg,
rendimiento del 64%).
EM BAR: Calculado para
C_{21}H_{20}N_{2}O_{7}S [M]^{+} 445; Hallado
[M]^{+} 445.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,100
ml,, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 2 ml, detección a 370 nm, A
= agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B al
10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% 2 minutos,
tiempo de retención 17,67 minutos.
Se agitó una disolución de sal clorhidrato de
N-(3-aminopropil)metacrilamida (3,00 g, 16,8
mmoles, 2,21 equiv.), DIEA (6,5 g, 8,8 ml, 50 mmoles, 6,6 equiv.),
tereftaldicarboxaldehído (1,02 g, 7,60 mmoles) y Na_{2}SO_{4}
(10,7 g, 75,3 mmoles, 9,91 equiv.) en 75 ml de MeOH anhidro en la
oscuridad a 25ºC durante 18 horas. En este momento se añadió más
Na_{2}SO_{4} (10,7 g, 75,3 mmoles, 9,91 equiv.) y se agitó de
manera continua durante otras 6 horas. En este momento se filtró la
disolución y se añadió NaBH_{4} (1,73 g, 45,7 mmoles, 6,01 equiv.)
al filtrado en porciones y se agitó posteriormente a 25ºC durante
21 horas. La suspensión se filtró a través de Celite y se concentró
el fitrado. El residuo se disolvió en 100 ml de CH_{2}Cl_{2} y
se lavó 1 vez con 25 ml con NaHCO_{3} acuoso saturado. El
extracto orgánico se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró
y se concentró dando un aceite viscoso. El producto se siguió usando
como tal.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna 201TP de 10 x 250 mm de Vydac, inyección de 0,100 ml, 2,00
ml/min, detección a 260 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN
(HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 15,8 minutos.
Se agitó una disolución de
\alpha,\alpha=-bis[3-(metacrilamido)-propilamino)-1,4-xileno
(2,94 g, 7,61 mmoles), DIEA (2,97 g, 4,00 ml, 23,0 mmoles, 3,02
equiv.), neopentiléster del ácido
(2-bromometil-fenil)borónico
(6,50 g, 23,0 mmoles, 3,02 equiv.) y BHT (5 mg como inhibidor) en 75
ml de CH_{2}Cl_{2} a 25ºC, en la oscuridad durante 28 horas. En
este momento se lavó la mezcla 1 vez con 25 ml de NaHCO_{3} acuoso
saturado. El extracto orgánico se secó sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro, se filtró y se concentró. Al residuo se le añadieron 200
ml de éter y la suspensión se agitó durante 18 horas. Se filtró la
suspensión y el residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2}, se filtró
y se concentró el filtrado. Al residuo sólido se le añadieron 150 ml
de éter y la suspensión se agitó durante 18 horas. En este momento
se filtró la suspensión dando 1,98 g (33%) de un polvo coposo
rosa.
EM BAR: Calculado para
C_{46}H_{64}B_{2}N_{4}O_{6} [M]^{+} 790; Hallado
[M + 1]^{+} 791.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, detección a 280 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B =
MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 13,4 minutos.
Se preparó una disolución de etilenglicol que
contenía acrilamida al 30% en peso y
N,N'-metilenobisacrilamida al 0,8% en peso. Se
combinaron N-[3-(metacrilamido)
propil]-3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracenosulfonamida
(1,5 mg, 3,38 x 10^{-6} moles) y
\alpha,\alpha'-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]-1,4-xileno
(28 mg, 3,54 x 10^{-5} moles) con 800 \mul de disolución de
monómero etilenglicol y 40 \mul de persulfato de amonio acuoso al
5% en peso. Esta formulación se colocó en una caja seca purgada con
nitrógeno junto con un molde construido a partir de portaobjetos de
vidrio para microscopio y un separador de acero inoxidable de 100
micrómetros. Se añadió una disolución acuosa de
-N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (40
\mul, al 5% en peso) a la disolución del monómero para acelerar
la polimerización y la formulación final se vertió en un molde de
vidrio. Se dejó el molde bajo atmósfera de nitrógeno durante 16
horas, tras lo cual se sumergió en PBS (pH = 7,4) y se separaron
los portaobjetos para obtener un polímero de hidrogel en la forma de
una película fina. La película fina de hidrogel resultante se lavó
con 100 ml de disolución salina tamponada de fosfato que contenía
sal de sodio de laurilsulfato 1 mM durante 3 días, cambiando la
disolución todos los días, seguido por el lavado con MeOH/PBS
(20/80 en vol., 3 x 100 ml) y finalmente con PBS (pH = 7,4, 3 x 100
ml). El polímero de hidrogel se conservó en PBS (PBS 10 mM, pH =
7,4) que contenía azida de sodio al 0,2% en peso y sal de sodio de
EDTA 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la absorbancia del
hidrogel indicador (que contiene dos elementos de reconocimiento)
preparado en este ejemplo por medio de glucosa y lactato. El gel de
acrilamida se montó en una celda de PMMA de la misma manera según
se describió en el Ejemplo 4. La disolución salina tamponada de
fosfato (PBS), pH = 7,4 que contenía la cantidad deseada de glucosa
o lactato de sodio se calentó hasta 37ºC en un baño de agua y se
colocó en la celda de PMMA que contenía el gel tras lo cual se dejó
equilibrar la celda de PMMA durante 15 minutos a 37ºC. La medición
de la absorbancia para cada concentración de glucosa o de lactato
se llevó a cabo por triplicado. Para cada medición, se usó la
absorbancia a 650 nm como blanco, se restó la A (650 nm) de todos
los valores de A (450 nm) y A (530 nm).
La Figura 6 muestra los espectros de absorbancia
para el gel de acrilamida (30%) que contenía monómero de rojo de
alizarina S 4 mM y monómero de ácido bis borónico 44 mM con y sin
glucosa. La Figura 7 muestra el efecto de la glucosa en la
absorbancia del gel de acrilamida (30%) que contenía monómero de
rojo de alizarina S 4 mM y monómero de ácido bis borónico 44 mM. La
Figura 8 muestra el efecto del lactato de sodio en la absorbancia
del gel de acrilamida (30%) que contenía monómero de rojo de
alizarina S 4 mM y monómero de ácido bis borónico 44 mM. La
absorbancia del indicador se vio afectada por la presencia de
glucosa, pero no se vio sustancialmente afectada por la presencia
de lactato.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la fluorescencia
de un gel de acrilamida sintetizado sustancialmente según este
Ejemplo 6 (excepto en que se usaron 1,9 mg de
N-[3-(metacrilamido)-propil-3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracenosulfonamida
y 35 mg de
\alpha,\alpha'-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)-bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]-1,4-xileno).
El experimento se llevó a cabo en un
espectrofluorómetro RF-5301 PC de Shimadzu equipado
con un dispositivo de temperatura variable (excitación a 470 nm,
rendijas 3/10 nm, alta sensibilidad). El gel de acrilamida se fijó
a una pieza de un portaobjetos de vidrio que se pegó en una celda de
fluorescencia de PMMA en un ángulo de 45º. Se llenó la celda con
2,5 ml de PBS (pH = 7,4) y se calentó hasta 37ºC. Se prepararon
disoluciones madre de glucosa (100 mM y 500 mM) en PBS (pH = 7,4) y
se calentaron a 37ºC en un baño de agua. Se añadió una alícuota de
disolución madre de glucosa calentada a la celda de PMMA de manera
periódica mientras se controlaba la intensidad de la fluorescencia
a 550 nm en función del tiempo (1 medición cada 2 minutos). Se midió
la concentración de glucosa en la celda de PMMA usando un
analizador de glucosa YSI Model 2300 STAT plus. Los resultados, que
se muestran en la Figura 9, muestran que la adición de glucosa
reduce la intensidad de la fluorescencia del hidrogel indicador. El
mismo efecto se observa en la Figura 10, que muestra el efecto de
la glucosa en el espectro de fluorescencia del mismo tipo de
gel.
gel.
Se cree que ese efecto se produce por las
siguientes consideraciones. El monómero metacrilamida de rojo de
alizarina S (molécula informadora) contiene una funcionalidad diol
vecinal y funcionalidad monomérica (véase la estructura a
continuación). En disolución acuosa y en disolventes orgánicos, el
rojo de alizarina S y los monómeros de elementos de reconocimiento
bis-boronato (véase la estructura a continuación)
son capaces de reaccionar de manera reversible unos con otros para
formar un éster boronato. La molécula de éster boronato formada en
esta reacción reversible es fluorescente, mientras que el monómero
de rojo de alizarina S por sí mismo no muestra virtualmente emisión
de fluorescencia en disolución acuosa y en disolventes orgánicos,
tales como MeOH. Por consiguiente, tras unirse al elemento de
reconocimiento de la glucosa, el rojo de alizarina S cambia sus
propiedades ópticas, tales como la absorbancia y el rendimiento
cuántico de fluorescencia, por ejemplo.
Puede prepararse una disolución de rojo de
alizarina S con funcionalidad monomérica y elemento de
reconocimiento de glucosa con funcionalidad monomérica junto con un
monómero de hidrogel y un agente reticulador. La copolimerización
de la mezcla produce un material de hidrogel que puede difundir a
diversas moléculas de tamaño pequeño y mediano; por consiguiente es
capaz de detectar y cuantificar analitos. Un analito, tal como la
glucosa por ejemplo, penetrará por difusión en la matriz de
hidrogel y desplazará la molécula informadora previamente unida al
elemento de reconocimiento. Este acontecimiento provoca un cambio en
las propiedades ópticas de la película de hidrogel ya que contiene
ahora un número mayor de moléculas informadoras no unidas al
elemento de reconocimiento.
También se determinó la modulación de la
fluorescencia del compuesto indicador (que contiene dos elementos
de reconocimiento) preparado en este ejemplo por medio de glucosa y
lactato. El experimento se llevó a cabo en un espectrofluorómetro
RF-5301 PC de Shimadzu equipado con un dispositivo
de temperatura variable (excitación a 470 nm, rendijas 5/10 nm,
baja sensibilidad). El gel de acrilamida se fijó a una pieza de un
portaobjetos de vidrio que se pegó en una celda de fluorescencia de
PMMA en un ángulo de 45º. Se llenó la celda con 2,5 ml de PBS (pH =
7,4) y se calentó a 37ºC en un baño de agua. Se prepararon
disoluciones madre de glucosa (100 mM y 500 mM) en PBS (pH = 7,4) y
se calentaron a 37ºC en un baño de agua. Se añadió una alícuota de
disolución madre de lactato calentada a la celda de PMMA de manera
periódica mientras se controlaba la intensidad de la fluorescencia
a 550 nm en función del tiempo (1 medición cada 2 minutos), hasta
que la concentración de lactato alcanzó 8 nM. Posteriormente se
añadió una alícuota de disolución madre de glucosa calentada a la
celda de PMMA de manera periódica mientras se controlaba la
intensidad de la fluorescencia a 550 nm en función del tiempo (1
medición cada 2 minutos). Se midió la concentración de la glucosa en
la celda de PMMA usando un analizador de glucosa YSI Model 2300
STAT plus. Los resultados, que se muestran en la Figura 11,
muestran que la adición de lactato no tuvo un efecto significativo
en la intensidad de la fluorescencia del hidrogel indicador, y la
posterior adición de glucosa redujo la intensidad de la
fluorescencia del hidrogel indicador.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
A una suspensión de
9,10-bis(clorometil)antraceno (5,18 g,
18,8 mmoles, 3,99 equiv.) en 200 ml de NMP se le añadió
2-(2-aminoetoxi)etanol (0,495 g, 0,475 ml,
4,71 mmoles). La mezcla se agitó en la oscuridad durante 17 horas.
En este momento se concentró la mezcla de reacción hasta
aproximadamente 50 ml bajo vacío a 50ºC. Se purificó el residuo por
medio de cromatografía en gel de sílice (gel de sílice de grado 150
g, CH_{3}OH/CH_{2}Cl_{2} al 0-10%) dando
0,425 g (24%) de un sólido amarillo/naranja.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,72 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 70/30, véase con UV
(254/366), tinción de ninhidrina.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna 201TP de 10 x 250 mm de Vydac, inyección de 0,100 ml, 2
ml/min, detección a 370 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN
(HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 16,1 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión de sal clorhidrato de
N-(3-aminopropil)metacrilamida (3,08 g, 17,2
mmoles, 4,2 equiv.), DIEA (5,19 g, 7,00 ml, 40,1 mmoles, 9,8
equiv.) y 3 mg de BHT en 125 ml de CHCl_{3} a 23ºC se le añadió
gota a gota una disolución de sal clorhidrato de
9-clorometil-10-[[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]-metil]antraceno
(1,56 g, 4,10 mmoles) en 25 ml de CHCl_{3}. Posteriormente se
agitó la mezcla en la oscuridad durante 92 horas. En este momento
se filtró la mezcla de reacción y se lavó 2 veces con 40 ml de
NaHCO_{3} (disolución acuosa saturada). El extracto orgánico se
secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró dando
un sólido pegajoso naranja que se purificó por medio de
cromatografía en alúmina (50 g de alúmina neutra activada,
CH_{3}OH/CH_{2}Cl_{2} al 0-5%) dando 0,364 g
(20%) de un sólido naranja.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,16 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 70/30, véase con UV
(254/366), tinción de ninhidrina.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna 201TP de 10 x 250 mm de Vydac, inyección de 0,100 ml, 2
ml/min, detección a 370 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN
(HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 16,85 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una disolución de
9-[[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]-metil]-10-[[(3-metacrilamido)propilamino]metil]-antraceno
(0,343 g, 0,763 mmoles), DIEA (0,965 g, 1,30 ml, 9,8 equiv.) y
neopentiléster del ácido
(2-bromometilfenil)borónico (1,09 g, 3,85
mmoles, 5,0 equiv.) en 20 ml CHCl_{3} a 23ºC en la oscuridad
durante 25 horas. En este momento se concentró la mezcla de
reacción inicialmente por medio de evaporación rotativa, a
continuación usando una bomba de vacío para eliminar DIEA. Se
purificó el residuo por medio de cromatografía en columna con
alúmina (40 g de alúmina neutra activada, CH_{3}OH al
0-10%/CH_{2}Cl_{2}) dando 0,299 g (46%) de un
sólido naranja amarillo. Este compuesto puede copolimerizarse con
un monómero adecuado como se describió previamente, desprotegerse y
usarse para detectar glucosa.
EM BAR: Calculado para
C_{51}H_{65}B_{2}N_{3}O_{7} [M]^{+} 854; Hallado
[M + 1]^{+} 855.
TLC: placas de alúmina básica de Merck,
Fr 0,35 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH al 95/5, véase con UV
(254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna 201TP de 10 x 250 mm de Vydac, inyección de 0,100 ml, 2
ml/min, detección a 370 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN
(HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 19,7 minutos.
\newpage
Ejemplo
8
Se agitó una disolución de
9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)bencil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]-antraceno
(0,100 g, 0,120 mmoles; véase Ejemplo 2), ácido metacrílico (0,112
g, 0,110 ml, 1,30 mmoles, 10,8 equiv.), DCC (0,316 g, 1,53 mmoles,
12,8 equiv.) y
N,N-dimetilamino-piridina (0,014 g,
0,11 mmoles, 0,92 equiv.) en 5 ml de CH_{2}Cl_{2} a 0ºC durante
1 hora, a continuación a 23ºC durante 22 horas. En este momento se
filtró la mezcla de reacción y se concentró por medio de evaporación
rotativa. Se purificó el residuo por medio de cromatografía en
columna con alúmina (30 g de alúmina neutra activada, CH_{3}OH al
0-2%/CH_{2}Cl_{2}) dando 0,030 g (26%) de un
sólido amarillo. Este compuesto puede copolimerizarse con un
monómero adecuado como se describió previamente, desprotegerse y
usarse para detectar glucosa.
EM BAR: Calculado para
C_{56}H_{70}B_{2}N_{2}O_{10} [M]^{+} 953; Hallado
[M]^{+} 951 (pico débil del ión molecular).
TLC: placas de alúmina básica de Merck,
Fr 0,67 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 95/5, véase con UV
(254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,100
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de2 ml, detección a 370 nm, A =
agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B al
10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 19,6 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se agitó una suspensión de
9,10-bis(clorometil)antraceno (0,28 g,
1 mmoles), DIEA (7,0 ml, 40 mmoles),
mono-t-butoxicarbonil
1,5-diaminopentano (3,75 g, 10 mmoles) y 50 ml de
CHCl_{3} en la oscuridad durante 2 días a 45ºC. La disolución se
lavó con disolución saturada de H_{2}O/NaHCO_{3}, se secó la
fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó el disolvente. El
residuo se purificó por medio de cromatografía en alúmina (40 g de
alúmina neutra activada, CH_{2}Cl_{2}/MeOH 95/5% en vol.) dando
0,55 g de aceite viscoso. Este material se usó como tal para la
siguiente etapa.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una disolución de
9,10-bis[[5-(t-BOC)-aminopentilamino]metil]antraceno
(0,3 g, 0,49 mmoles), DIEA (0,35 ml, 2 mmoles) y neopentiléster del
ácido (2-bromometilfenil)borónico (0,566 g,
2,0 mmoles) en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} en la oscuridad durante 2
días a 25ºC. En este momento se concentró la mezcla de reacción en
vacío y se purificó el residuo por medio de cromatografía en alúmina
(60 g de alúmina neutra activada, de CH_{2}Cl_{2}/MeOH 98/2% en
vol.) dando 0,401 g de aceite amarillo. Este material se usó como
tal en la siguiente etapa.
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\vskip1.000000\baselineskip
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Se disolvió
9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)bencil]-N-[5-(t-BOC)-aminopentilamino]metil]antraceno
(0,4 g, 0,39 mmoles) en 20 ml de CH_{2}Cl_{2}/TFA (80/20% en
vol.). La disolución se agitó durante 12 horas, se evaporó el
disolvente y se lavó el residuo con 10 ml de éter. Se obtuvo un
total de 373 mg de sólido (rendimiento del 72%). El producto
resultó aproximadamente 80% puro por medio de
RP-HPLC. Este compuesto puede copolimerizarse con
un monómero adecuado como se describió previamente, desprotegerse y
usarse para detectar
glucosa.
glucosa.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
Columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,050
ml, 0,75 ml/min, detección a 360 nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B =
MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B al 10% 2 minutos, B al
10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 16,0 minutos.
\newpage
Ejemplo
10
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Se combinaron
N-t-Boc-etilenodiamina
(Fluka, 1,6 g, 10 mmoles) y anhídrido
4-bromo-1,8-naftálico
(Aldrich, 2,77 g, 10 mmoles) con 60 ml de etanol anhidro, la
suspensión se agitó a 60ºC durante 20 horas, se enfrió hasta
temperatura ambiente y se filtró. El sólido obtenido se lavó con 30
ml de EtOH frío y se secó bajo vacío. Rendimiento: 3,84 g (91%).
RMN (CDCl_{3}): 1,28 (9H, s); 3,52 (2H, t); 4,35 (2H, t); 4,92
(1H, s); 7,84 (1H, t); 8,04 (1H, d); 8,42 (1H, d); 8,58 (1H, d);
8,67 (1H, d).
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Se combinó N-metiletilendiamina
(1,48 g, 20 mmoles) con 2 ml de
1-metil-2-pirrolidinona
(NMP) seguido por la adición de
N-2-(terc-butoxicarbonil)aminoetil-4-bromonaftalen-1,8-dicarboximida
(0,35 g, 0,845 mmoles). La disolución resultante se agitó a 45ºC
durante 40 horas tras lo que se evaporaron NMP y
N-metiletilendiamina bajo vacío. El residuo
obtenido se sometió a cromatografía en columna (20 g de gel de
sílice, inicialmente CH_{2}Cl_{2}/MeOH (90/10), a continuación
CH_{2}Cl_{2}/MeOH/Et_{3}N (75/20/5)). Se obtuvo un sólido
amarillo (0,311 g, rendimiento del 89%). La pureza se controló por
medio de RP-HPLC.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron
N-2-(terc-butoxicarbonil)aminoetil-4-(N'-metilaminoetilamino)naftalen-1,8-dicarboximida
(0,3 g, 0,73 mmoles), ácido 2-bromometilfenil
borónico, éster de pinacol (0,6 g, 2 mmoles),
N,N-diisopropil-N-etilamina
(1,3 ml, 8 mmoles) y 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. La disolución se
agitó durante 20 horas, seguido por la adición de 2 g de resina
PS-Trisamina (Argonaut Technologies, 3,38 mmol/g).
La mezcla de reacción y la resina se agitaron durante 10 horas tras
lo que se eliminó la resina por filtración y se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (2 x 20 ml). Las disoluciones de CH_{2}Cl_{2}
combinadas se evaporaron y secó bajo vacío.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió disolución de cloruro de metileno que
contenía TFA al 20% en vol. y triisopropil silano al 5% en vol. al
residuo naranja resultante. La disolución resultante se agitó a
temperatura ambiente durante 10 horas, tras lo que se evaporó el
disolvente y el residuo se trituró con éter dando un sólido
amarillo. El sólido se filtró y se secó en vacío (rendimiento: 580
mg). La pureza se controló por medio de RP-HPLC. El
sólido se usó como tal en la siguiente etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron sal del ácido trifluoroacético de
N-aminoetil-4-(N'-aminoetileno-N''-[2-(borono)bencil]metilamino)naftalen-1,8-dicarboximida
(0,225 g, 0,4 mmoles), ácido
3-carboxi-5-nitrofenilborónico
(0,085 g, 0,4 mmoles), difenilfosforil azida (0,13 ml, 0,6 mmoles)
y 2 ml de DMF anhidro. Se añadió
N,N-diisopropil-N-etilamina
(0,7 ml, 4 mmoles) y la disolución se agitó durante 20 horas. Se
añadió éter (10 ml) a la mezcla de reacción y el residuo insoluble
se separó y se sometió a ultrasonido con 5 ml de CH_{2}Cl_{2}
dando un sólido naranja que se filtró y se secó bajo vacío (38 mg,
rendimiento: 15%). La pureza se controló por medio de
RP-HPLC. RMN (dmso-d6/D20, 90/10):
\delta 2,32 (3H, s); 2,82 (2H, t); 3,58 (2H, t); 3,65 (2H, t),
3,70 (2H, s); 6,65 (1H, d); 7,0-7,3 (4H, m); 7,68
(1H, t); 8,18 (1H, d); 8,42 (1H, d); 8,47 (1H, d);
8,1-8,35 (3H, m).
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento se llevó a cabo en
MeOH/disolución salina tamponada de fosfato, (PBS, 10 mM, pH = 7,4).
La concentración de
N-(3-borono-5-nitrobenzamido)etil-4-(N'-aminoetileno-N''-[2-(borono)bencil]metilamino)naftalen-1,8-dicarboximida
en MeOH/PBS, (50/50% en vol.) era 15 M. La concentración de glucosa
se hizo variar desde 0 mM hasta 50 mM, y la concentración de
L-lactato de sodio se hizo variar desde 0 mM hasta 7
mM. El experimento se llevó a cabo en un espectrofluorómetro
RF-5301 PC de Shimadzu: la longitud de onda de
excitación se estableció en 430 nm, la emisión se controló en el
intervalo de 480 a 650 nm, ancho de rendija 3/1,5 nm, alta
sensibilidad de fotomultiplicador.
Los resultados se muestran en las Figuras 12 y
13, que muestran que la fluorescencia del indicador de este ejemplo
se vio afectada por la presencia de glucosa, pero no por la
presencia de lactato.
\newpage
Ejemplo
11
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\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución de
3-aminopropilmetacrilamida (0,775 g, 5,45 mmol, 10,0
equiv.) y N-(6-aminohexil)carbamato de
terc-butilo (1,18 g, 5,45 mmol, 10,0 equiv.) y
varios cristales de BHT en 200 ml de CHCl_{3} se le añadió
9,10-bis(clorometil)antraceno (0,150
g, 0,545 mmol). La mezcla de reacción se agitó posteriormente en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 4 días. En este momento se
evaporó el CHCl_{3} y el residuo se disolvió en 100 ml de éter. Se
extrajo la fase orgánica 8 veces con 125 ml de NaHCO_{3} acuoso
saturado y 5 veces con 200 ml de tampón fosfato (0,4 M, pH 7,0). El
pH de los lavados combinados de tampón fosfato se ajustó a pH 11
añadiendo Na_{2}CO_{3} (disolución acuosa saturada), seguido
por la extracción 5 veces con 300 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se
concentraron las fases orgánicas combinadas y se disolvió el
residuo en 5 ml de una disolución de TFA al 20% en CH_{2}Cl_{2}.
La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. En este
momento se extrajo la mezcla de reacción 4 veces con 10 ml de
NaHCO_{3} acuoso saturado. Se ajustó el pH de las fases acuosas
combinadas a pH 11 añadiendo Na_{2}CO_{3} (disolución acuosa
saturada), seguido por la extracción 4 veces con 75 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Los extractos orgánicos combinados se secaron
sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró en vacío
dando 0,068 g (27%) de
producto.
producto.
TLC: a) placas de gel de sílice 60 de
Merck, Fr 0,16 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 70/30, véase con UV
(254/366), antes de la desprotección; Fr 0,27 con
CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/iPrNH_{2} 85/14,5/0,5, véase con UV
(254/366), producto final.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 8 x 100 mm de Waters, inyección de 0,100
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 0,400 ml, detección a 360
nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de
B al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos,
B al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 15,5 minutos.
A una disolución de
9-[N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-N-[6-aminohexilamino)metil]antraceno
(1,68 g, 3,63 mmol) y unos pocos cristales de BHT en 20 ml de
CH_{2}Cl_{2} a temperatura ambiente se le añadió gota a gota
una disolución de éster N-hidroxisuccinimida del
ácido ciclohexanocarboxílico (0,845 g, 3,76 mmol, 1,03 equiv.)
durante un período de 1 hora. La reacción se agitó posteriormente en
la oscuridad a temperatura ambiente durante 16 horas. En este
momento se concentró la mezcla de reacción en vacío y se disolvió el
residuo en 105 ml de una disolución de éter/CH_{2}Cl_{2} 90/15.
Se extrajo la fase orgánica 4 veces con 225 ml de tampón fosfato
(0,4 M, pH 7,0). El pH de los lavados combinados de tampón fosfato
se ajustó a pH 11 añadiendo Na_{2}CO_{3} (disolución acuosa
saturada), seguido por la extracción 6 veces con 500 ml de
CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró en vacío dando
1,2 g (60%) de producto.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,30 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/iPrNH_{2} 85/14,5/0,5,
véase con UV (254/366).
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 8 x 100 mm de Waters, inyección de 0,100
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 0,400 ml, detección a 360
nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de
B al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos,
B al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% 2
minutos, tiempo de retención 17,4 minutos.
Se agitó una disolución de
9-[N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[6-(ciclohexanocarboxamido)hexilamino]metil]-antraceno
(1,0 g, 1,8 mmol), DIEA (1,81 g, 2,44 ml, 14,0 mmol, 7,8 equiv.),
pinacol éster del ácido 2-bromometilfenilborónico
(2,14 g, 7,20 mmol, 4,0 equiv.) y unos pocos cristales de BHT en 30
ml de CHCl_{3} en la oscuridad a temperatura ambiente durante 60
horas. En este momento se concentró la mezcla de reacción y el
residuo
(9-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[6-(ciclohexanocarboxamido)hexilamino]metil]antraceno)
se suspendió en 150 ml de éter. La fase orgánica se lavó 4 veces
con 50 ml de tampón fosfato (0,4 M, pH 7,0). La fase orgánica se
concentró y se disolvió el residuo en éter en 200 ml de HCl acuoso
0,1 N. La fase acuosa se lavó 3 veces con 50 ml de éter: acetato de
etilo 1:1; y se ajustó el pH a pH 11 añadiendo Na_{2}CO_{3}
(disolución acuosa saturada), seguido por la extracción 3 veces con
150 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas combinadas se
secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró en
vacío dando un compuesto oleoso rojo. El residuo se disolvió en
éter y se concentró en vacío dando 1,17 g (85%) de un producto
sólido amarillo.
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,59 con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH 80/20, véase con UV
(254/366)
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 8 x 100 mm de Waters, inyección de 0,100
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 0,400 ml, detección a 360
nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de
B al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos,
B al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% 2
minutos, tiempo de retención 19,6 minutos.
RMN de ^{1}H
(d_{6}-acetona/D_{2}O 9:1): \delta 0,90
(m, 2H), 1,03 (m, 2H), 1,18-1,30 (m, 6H),
1,35-1,48 (4H), 1,62 (m, 1H,
O=C-CH(CH_{2})CH_{2}),
1,66-1,75 (m, 7H), 1,77 (m, 2H,
N-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-N),
2,52 (m, 2H, N-CH_{2}-CH_{2}-),
2,63 (m, 2H, N-CH_{2}-CH_{2}-),
2,98 (m, 4H,-CH_{2}-NH-C=O), 3,98
(s, 4H, benceno-CH_{2}-N), 4,57
(s, 2H, antraceno-CH_{2}-N), 4,59
(s, 2H, antraceno-CH_{2}-N), 5,20
(t, 1H, J = 1,5 Hz, C=CH_{2}), 5,46 (s, 1H, C=CH_{2}),
7,4-7,5 (m, 8H, Ar-H), 7,52 (m, 2H,
Ar-H), 7,95 (m, 2H, Ar-H), 8,23 (m,
4H, Ar-H)
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una disolución de
N,N-dimetilacrilamida (al 40% en peso) y
N,N'-metilenobisacrilamida (al 0,8% en peso) en
tampón fosfato, pH = 7,4, 200 mM. Se combinaron
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-borono-bencil)-N-[6-(ciclohexanocarboxamido)hexilamino]metil]antraceno
(18 mg, 2,15 x 10^{-5} moles) y 60 mg de fructosa con 2 ml de
MeOH. Esta disolución se sometió a ultrasonido hasta la disolución
de toda la fructosa y posteriormente se evaporó dando un sólido. A
este sólido se le añadió 1 ml de disolución de tampón fosfato que
contenía monómeros. Tras someter a ultrasonido durante 10 minutos
se filtró esta disolución a través de un filtro de membrana de PTFE
0,2 \muM. Se combinó persulfato de amonio acuoso (20 \mul, al
5% en peso) con la formulación. La disolución resultante se colocó
en caja seca purgada con nitrógeno. Se añadió una disolución acuosa
de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (40 \mul, al
5% en peso) a la formulación del monómero para acelerar la
polimerización. La formulación resultante se vertió en un molde
construido a partir de portaobjetos de vidrio para microscopio y un
separador de acero inoxidable de 100 micrómetros. Tras dejar
permanecer el molde durante 8 horas en atmósfera de nitrógeno, se lo
colocó en disolución salina tamponada de fosfato (pH = 7,4), se
separaron los portaobjetos de microscopio y se retiró el hidrogel.
Se lavó el hidrogel con 100 ml de (PBS) que contenía sal
laurilsulfato de sodio 1 mM y sal de sodio de EDTA 1 mM durante 3
días, cambiando la disolución todos los días, seguido por el lavado
con EtOH/PBS (20/80 en vol., 3 x 100 ml) y finalmente con PBS (pH =
7,4, 3 x 100 ml). El polímero de hidrogel resultante se conservó en
PBS (pH = 7,4) que contenía azida de sodio al 0,02% en peso y sal
tetrasódica de EDTA 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la fluorescencia
de la película de hidrogel de indicador
6-(ciclohexanocarboxamido)hexilamina/DMA preparada en este
ejemplo por medio de glucosa y lactato. La Figura 14 muestra la
emisión de fluorescencia relativa (I a 430 nm) de la película de
hidrogel en PBS (pH 7,4 que contenía NaN_{3} al 0,02% y EDTA 1 mM)
que contenía \alpha-D-glucosa 0 a
20 mM, L-lactato de sodio 0 a 10 mM, y
\alpha-D-glucosa
0-20 mM en presencia de L-lactato
de sodio 4 mM. La película de hidrogel (disco de 100 \mum de
espesor, 8 mm de diámetro) se montó en una cubeta de PMMA en un
ángulo de 45º. Todas las mediciones se realizaron a 37ºC en un
espectrofluorómetro RF-5301 de Shimadzu con
excitación a 370 nm (rendija = 3 nm) y emisión a 430 nm (rendija = 3
nm) a baja sensibilidad de fotomultiplicador. Se controlaron las
concentraciones de glucosa y de L-lactato de sodio
usando el analizador de glucosa YSI Model 2300 STAT plus. Las
barras de error son desviaciones estándar con valores por triplicado
para cada punto de datos. La fluorescencia se vio afectada por la
presencia de glucosa, pero no por la presencia de lactato. Además,
la presencia de lactato (4 mM) no tuvo efecto significativo en la
curva de calibración de la glucosa 0-20 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Nombre químico:
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(carboxietil)amino]metil]antraceno
(desprotegido)
Fórmula química:
C_{40}H_{45}B_{2}N_{3}O_{7}
PM: 701,4
Aspecto físico: polvo amarillo pálido
Solubilidad: PBS/metanol, metanol,
etanol, cloroformo, diclorometano
Indicador protegido:
9-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[2-(carboxietil)amino]metil]antraceno.
A una disolución de
3-aminopropilmetacrilamida (12,9 g, 90,7 mmol, 4,99
equiv.), terc-butiléster de
\beta-alanina (13,2 g, 90,9 mmol, 5,00 equiv.) y
varios cristales de BHT en 700 ml de CHCl_{3} se le añadió
9,10-bis(clorometil)antraceno (5,00
g, 18,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó posteriormente en la
oscuridad a 30ºC durante 88 horas. En ese momento, se evaporó el
CHCl_{3} y el residuo se disolvió en 500 ml de éter. La disolución
se agitó durante 1 hora, tiempo durante el que precipitaron sales a
partir de la disolución. La disolución de éter se filtró y
posteriormente se extrajo 10 veces con 350 ml de NaHCO_{3} acuoso
saturado. La fase de éter se extrajo además 6 veces con 350 ml de
tampón fosfato (0,2 M, pH 6,5). El pH de los lavados combinados de
tampón fosfato se ajustó a pH 11-12 añadiendo
Na_{2}CO_{3} (disolución acuosa saturada), seguido por la
extracción 6 veces con 500 ml de CH_{2}Cl_{2}. Las fases
orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se
filtró y se concentró en vacío dando un producto bruto aceitoso. El
producto bruto se purificó por medio de cromatografía en gel de
sílice (gel de sílice de grado 50 g de resolución rápida,
MeOH/CH_{2}Cl_{2} al 0-5% gradiente en etapas)
dando 2,04 g de un sólido pegajoso amarillo (23%).
TLC: placas de gel de sílice 60 de Merck,
Fr 0,29 con 90/10 CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH, véase con UV
(254/366) y tinción de ninhidrina.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
Columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,100
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,500 ml, detección a 280
nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de
B al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos,
B al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% 2
minutos, tiempo de retención 17,0 minutos.
Se agitó una disolución de
9-[N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(terc-butoxicarbonil)etilamino]metil]antraceno
(1,5 g, 3,1 mmol), DIEA (3,16 g, 4,26 ml, 24,4 mmol, 7,9 equiv.),
pinacol éster del ácido 2-bromometilfenilborónico
(3,64 g, 12,2 mmol, 3,9 equiv.) y unos pocos cristales de BHT en 50
ml de CHCl_{3} en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16
horas. En este momento se concentró la mezcla de reacción y el
residuo se suspendió en 200 ml de éter. La fase de éter se extrajo
3 veces con 125 ml de tampón fosfato (0,2 M, pH 7,0), se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró en vacío dando un
producto bruto. Se trituró el residuo con hexanos dando 2,14 g
(76%) de un sólido blanco.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
Columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,200
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,500 ml, detección a 280
nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de
B al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos,
B al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% 2
minutos, tiempo de retención 19,2 minutos.
Se agitó una disolución de
9-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[2-(terc-butoxicarbonil)etilamino]metil]antraceno
(0,294 g, 0,319 mmol) en 5 ml de TFA al 20%/CH_{2}Cl_{2} en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 22 horas. En este momento
se concentró la mezcla de reacción y el residuo se trituró con éter.
El residuo se disolvió en 5 ml de acetona/agua 90:10 y se agitó
durante 2 horas. En este momento se concentró la mezcla de reacción
y el residuo se trituró con agua y PBS (pH 7,4 que contenía
NaN_{3} al 0,02% y EDTA 1 mM) dando como resultado la
recuperación de 0,062 g (28%) de un sólido amarillo claro.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
Columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,100
ml, 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 1,500 ml, detección a 280
nm, A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente
de B al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18
minutos, B al 80-100% durante 2 minutos, B al 100%
2 minutos, tiempo de retención 17,4 minutos.
EM BAR: Matriz de glicerol; Calculado
para C_{46}H_{53}B_{2}N_{3}O_{7} (aducto bis glicerol)
[M]^{+} 813; Hallado [M + 2]^{+} 815.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una disolución de
N,N-dimetilacrilamida (al 40% en peso) y
N,N'-metilenobisacrilamida (al 0,8% en peso) en
tampón fosfato, pH = 7,4, 200 mM. Se combinaron
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(carboxietil)amino]metil]antraceno
(14 mg, 2,0 x 10^{-5} moles) y 60 mg de fructosa con 2 ml de
MeOH. Esta disolución se sometió a ultrasonido hasta la disolución
de toda la fructosa y posteriormente se evaporó dando un sólido. A
este sólido se le añadió 1 ml de disolución de tampón fosfato que
contenía monómeros. Tras someter a ultrasonido durante 10 minutos
se filtró esta disolución a través de un filtro de PTFE 0,2 \muM.
Con la formulación se combinó persulfato de amonio acuoso (20
\mul, al 5% en peso). La disolución resultante se colocó en caja
seca purgada con nitrógeno. Se añadió una disolución acuosa de
N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (40 \mul, al 5%
en peso) a la formulación del monómero para acelerar la
polimerización. La formulación resultante se vertió en un molde
construido a partir de portaobjetos para microscopio y un separador
de acero inoxidable de 100 micrómetros. Tras dejar permanecer el
molde durante 8 horas en atmósfera de nitrógeno, se lo colocó en
disolución salina tamponada de fosfato (10 mM, pH = 7,4), se
separaron los portaobjetos de microscopio y se retiró el hidrogel.
Se lavó el hidrogel con 100 ml de (PBS) que contenía sal
laurilsulfato de sodio 1 mM y sal de sodio de EDTA 1 mM durante 3
días, cambiando la disolución todos los días, seguido por el lavado
con EtOH/PBS (20/80 en vol., 3 x 100 ml) y finalmente con PBS (pH =
7,4, 3 x 100 ml). El polímero de hidrogel resultante se conservó en
PBS (pH = 7,4) que contenía azida de sodio al 0,02% en peso y sal
tetrasódica de EDTA 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la modulación de la fluorescencia
de la película de hidrogel de indicador
2-(carboxietil)amina/DMA preparada en este ejemplo por medio
de glucosa y lactato. La Figura 15 muestra la emisión de
fluorescencia relativa (I a 430 nm) de la película de hidrogel en
PBS (pH 7,4 que contenía NaN_{3} al 0,02% y EDTA 1 mM) que
contenía \alpha-D-glucosa 0 a 20
mM, L-lactato de sodio 0 a 10 mM y glucosa
0-20 mM en presencia de L-lactato
de sodio 3 mM. La película de hidrogel (disco de 100 \mum de
espesor, 8 mm de diámetro) se montó en una cubeta de PMMA en un
ángulo de 45º. Todas las mediciones se realizaron a 37ºC en un
espectrofluorómetro RF-5301 de Shimadzu con
excitación a 370 nm (rendija = 3 nm) y emisión a 430 nm (rendija = 3
nm) a baja sensibilidad de fotomultiplicador. Se controlaron las
concentraciones de glucosa y de lactato de L-sodio
usando el analizador de glucosa YSI Model 2300 STAT plus. Los datos
se representaron gráficamente como el promedio de los valores por
triplicado para cada punto de datos. La fluorescencia se vio
afectada por la presencia de glucosa, pero no por la presencia de
lactato. Además, la presencia de lactato (4 mM) no tuvo efecto
significativo en la curva de calibración de la glucosa
0-20 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Nombre químico:
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(N-6-(9-antracenocarboxamido)hexilamino-carbonil)etilamino]metil]antraceno
(desprotegido)
Fórmula química:
C_{73}H_{87}B_{2}N_{5}O_{7}
PM: 1168
Aspecto físico: polvo amarillo pálido
Solubilidad: PBS/metanol, metanol,
etanol, cloroformo, diclorometano
Compuesto protegido con pinacol:
9-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[3-(N-6-(9-antracenocarboxamido)-hexilaminocarboniletilaminometil]antraceno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinó ácido
antraceno-9-carboxílico (1,2 g, 5,4
x 10^{-3} moles) con 15 ml de cloruro de tionilo. La disolución
se sometió a reflujo durante 2 horas seguido por la evaporación de
los componentes volátiles. El sólido obtenido se secó bajo alto
vacío durante 24 horas dando 1,3 g de material (rendimiento
cuantitativo). Este material se usó como tal en la siguiente
etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió gota a gota cloruro de
9-antracenoílo (1,3 g, 5,4 mmoles) en 50 ml de
CH_{2}Cl_{2} anhidro a 11,6 g de hexametilenodiamina (100
mmoles) en 100 ml de CH_{2}Cl_{2} a 0ºC. La disolución se agitó
a 0ºC durante 1 hora, a continuación se dejó calentar hasta
temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se evaporó el
disolvente y se añadieron 200 ml de agua al residuo. Esta mezcla se
sometió a ultrasonido y se agitó durante 1 hora, a continuación se
filtró. El sólido filtrado se secó bajo vacío durante 24 horas. Se
añadió MeOH (50 ml) y 2 ml de HCl conc. al sólido, seguido por la
evaporación de MeOH. Se lavó el sólido resultante con
CH_{2}Cl_{2}/MeOH (90/10% en vol.) caliente y se recristalizó
desde MeOH, dando 0,51 g del producto (26%). La pureza del producto
se controló por HPLC.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,1 ml,
caudal 0,75 ml/min, ciclo de inyección 2 ml, 280 nm detección, A =
agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B al
10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B al
80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 16,5 min.
Se combinó
9-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[2-carboxietilamino]metil]antraceno
(40 mg, 4,5 x 10^{-5} moles) con sal del ácido clorhídrico de
N-(6-aminohexil)-antraceno-9-carboxamida
(20 mg, 5,6 x 10^{-5} moles), difenilfosforil azida (15,4 mg, 5,6
x 10^{-5} moles) y 2 ml de DMF. Se añadió diisopropiletilamina
(39 20 \mul, 2,44 x10^{-4} moles) a la mezcla y la disolución se
agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La DMF se evaporó
bajo alto vacío, el residuo se disolvió en 50 ml de EtOAc y se lavó
con agua (3 x 10 ml). Se separó la disolución de EtOAc, se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se evaporó produciendo 46 mg de sólido
(rendimiento del 87%). La pureza del material se controló por
HPLC.
HPLC: Cromatógrafo de HPLC HP 1100,
columna NovaPak HR C18 de 5 x 100 mm de Waters, inyección de 0,1 ml,
caudal 0,75 ml/min, ciclo de inyección de 2 ml, detección a 280 nm,
A = agua (HFBA al 0,1%) y B = MeCN (HFBA al 0,1%), gradiente de B
al 10% 2 minutos, B al 10-80% durante 18 minutos, B
al 80-100% durante 2 minutos, B al 100% durante 2
minutos, tiempo de retención 20,42 min.
Espectro de masas BAR, matriz de
glicerol: calculado para C_{67}H_{75}B_{2}N_{5}O_{9}
(aducto bis glicerol) [M]^{+}=1116, hallado
[M+1]^{+}=1117.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una disolución al 50% en peso de
2-hidroxietilmetacrilato (4,75 g) y ácido
metacrílico (0,25 g) en tampón fosfato, pH = 7,4, 200 mM. Se
combinaron indicador de glucosa (11 mg, 1,0 x 10^{-5}
moles) y 60 mg de fructosa con 2 ml de MeOH. Esta disolución se
sometió a ultrasonido hasta disolución de toda la fructosa y se
evaporó para dar un sólido. A este sólido se le añadió 1 ml de
disolución de tampón fosfato que contenía monómeros. Tras someter a
ultrasonido durante 10 minutos, se filtró esta disolución a través
de un filtro de PTFE 0,2 \muM. Con la formulación se combinó
persulfato de amonio acuoso (20 \mul, al 5% en peso). La
disolución resultante se colocó en caja seca purgada con nitrógeno.
Se añadió una disolución acuosa de
N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (40 \mul, al 5%
en peso) a la formulación del monómero para acelerar la
polimerización. La formulación resultante se vertió en un molde
construido a partir de portaobjetos para microscopio y un separador
de acero inoxidable de 100 micrómetros. Tras dejar permanecer el
molde durante 8 horas en atmósfera de nitrógeno, se lo colocó en
disolución salina tamponada de fosfato (10 mM, pH = 7,4), se
separaron los portaobjetos de microscopio y se retiró el hidrogel.
Se lavó el hidrogel con 100 ml de disolución salina tamponada de
fosfato (PBS) que contenía sal laurilsulfato de sodio 1 mM y sal
tetrasódica de EDTA 1 mM durante 3 días, cambiando la disolución
todos los días, seguido por el lavado con EtOH/PBS (20/80 en vol.,
3 x 100 ml) y finalmente con PBS (pH = 7,4, 3 x 100 ml). El polímero
de hidrogel resultante se conservó en PBS (10 mM, pH = 7,4) que
contenía azida de sodio al 0,02% en peso y sal tetrasódica de
EDTA
1 mM.
1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento se llevó a cabo en un
espectrofluorómetro RF-5301 de Shimadzu equipado con
un dispositivo de temperatura variable. La longitud de onda de
excitación se estableció en 370 nm, rendijas 3/3 nm, baja
sensibilidad de fotomultiplicador, la emisión se exploró desde 400
hasta 600 nm. Se controlaron las concentraciones de glucosa y de
L-lactato de sodio usando el analizador de glucosa
YSI Model 2300 STAT plus.
La película de hidrogel (disco redondo de 100
\mum de espesor, 8 mm de diámetro) se montó en una cubeta de PMMA
en un ángulo de 45º. La disolución salina tamponada de fosfato
(PBS), pH = 7,4 que contenía la cantidad deseada de glucosa,
L-lactato de sodio y glucosa con
L-lactato de sodio se calentó hasta 37ºC en un baño
de agua y se colocó en la celda de PMMA que contenía el hidrogel
montado. Tras cada adición se dejó equilibrar la celda de PMMA
durante 45 minutos a 37ºC. Las mediciones de intensidad de
fluorescencia para cada concentración de glucosa/lactato se
realizaron en dos muestras distintas y se usó un valor promedio en
la curva de calibración. Se obtuvieron las curvas de calibración
(Intensidad de fluorescencia a 430 nm frente a concentración) para
glucosa, L-lactato de sodio y glucosa en presencia
de L-lactato de sodio 3 mM. Los resultados se
muestran en la Figura 16.
\newpage
Ejemplo
14
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
9-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)bencil]-N-[6-(3-carboxipropionamido)hexilamino]metil]antraceno.
\vskip1.000000\baselineskip
9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(3-carboxipropionamido)hexilamino]metil]antraceno.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis puede llevarse a cabo de manera
análoga al Ejemplo 11 usando
9-[N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-N-[6-(hexilamino)metil]antraceno
como el material de partida. Por el contrario, el material de
partida amina se hace reaccionar con el éster
N-hidroxisuccinimida (NHS) del mono metil éster del
ácido succínico en lugar del éster NHS del ácido
ciclohexanocarboxílico usado en el Ejemplo 11. Es necesaria una
etapa adicional de hidrólisis básica para completar la síntesis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre químico:
N-(3-Metacrilamidopropil)-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(3-carboxipropanamidoetil)aminohexil]]aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida
Fórmula química:
C_{47}H_{60}B_{2}N_{6}O_{10}
P.M.: 890
El compuesto puede sintetizarse como se muestra
a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
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\newpage
Ejemplo
16
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Nombre químico:
N-Butil-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)aminohexil]]aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida
Fórmula química:
C_{44}H_{57}B_{2}N_{5}O_{7}
P.M.: 789,5
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
El compuesto puede sintetizarse como se muestra
a continuación:
Claims (9)
1. Un procedimiento para detectar la presencia o
la concentración de glucosa en una muestra que puede también
contener un alfa hidroxiácido o una beta dicetona, que
comprende:
- a)
- exponer la muestra a un compuesto seleccionado del grupo constituido por:
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(ciclo- hexanocarboxamido)hexilamino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(carbo- xietil)amino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(N-6-(9-antracenocarboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(3-carboxipropionamido)hexilamino]metil]antraceno;
- N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(3-carboxipropanamidoetil)aminohexil]]aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida; y
- N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)aminohexil]] aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida; y sus sales; y
- b)
- medir cualquier cambio en la fluorescencia emitida por el compuesto para determinar de ese modo la presencia o la concentración de glucosa en dicha muestra, en el que la presencia del alfa hidroxiácido o de la beta dicetona no interfiere con dicha determinación.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la muestra es un líquido biológico.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que el líquido biológico se selecciona del grupo constituido por
sangre, plasma, suero, líquido intersticial, líquido
cefalorraquídeo, orina, saliva, líquido intraocular, linfa,
lágrimas, sudor y tampones fisiológicos.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el compuesto se expone a la muestra en disolución.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el compuesto está inmovilizado sobre o dentro de un soporte
sólido.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que el soporte sólido es una matriz polimérica.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el compuesto está asociado con un dispositivo implantable, y
en el que la etapa a) tiene lugar in vivo.
8. Un compuesto seleccionado del grupo
constituido por:
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(ciclo- hexanocarboxamido)hexilamino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(carbo- xietil)amino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(N-6-(9-antracenocarboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno;
- 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobencil)-N-[6-(3-carboxipropionamido)hexilamino]metil]antraceno;
- N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(3-carboxipropanamidoetil)aminohexil]]aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida;
- N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)bencil]-[6-(N-[2-(borono)bencil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)aminohexil]] aminoetilamino]naftalen-1,8-dicarboximida; y sus sales.
9. Un sistema de detección para detectar la
presencia o la concentración de glucosa en una muestra que puede
también contener un alfa hidroxiácido o una beta dicetona, que
comprende un compuesto según la reivindicación 8.
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| US36388502P | 2002-03-14 | 2002-03-14 | |
| US363885P | 2002-03-14 | ||
| US10/187,903 US6800451B2 (en) | 2001-01-05 | 2002-07-03 | Detection of glucose in solutions also containing an alpha-hydroxy acid or a beta-diketone |
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