PT1490359E - DETECÆO DE GLUCOSE EM SOLUÃŽES CONTENDO TAMBéM UM ALFAHIDROXIáCIDO OU UMA BETA-DICETONA - Google Patents
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Description
ΡΕ1490350 1 DESCRIÇÃO "DETECÇÁO DE GLUCOSE EM SOLUÇOES CONTENDO TAMBÉM UM ALFA-HIDROXIÁCIDO OU UMA BETA—DICETONA"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Área da Invenção A presente invenção relaciona-se com a detecção de glucose em amostras que podem também conter compostos potencialmente interferentes, tais como α-hidroxiácidos ou β-dicetonas. 2. Descrição da Técnica Relacionada A complexação de hidratos de carbono, incluindo a glucose, com ácido fenil borónico é conhecida desde há muito e a reversibilidade dessa interacção serviu como base para a separação cromatográfica de açucares. Especifi-camente, em 1959, Lorand e Edwards relataram as constantes de associação para associações aquosas de ácidofenil-borónico com muitos polióis saturados; as interacções de ligação variavam desde muito fraca (e.g., etilenoglicol, Kd=360 mM) a moderadamente forte (e.g., glucose, Kd=9,l mM). Ver J. Yoon et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry 1(4):267-71 (1993). Julga-se que o mecanismo de ligação 2 ΡΕ1490350 ocorra através da ligaçao de grupos hidroxilo adjacentes na glucose a grupos hidroxilo num grupo boronado. A Patente U.S. 5 503 770 (James et al.) descreve um composto fluorescente contendo ácido borónico, que emite fluorescência com elevada intensidade aquando da ligação a sacarideos, incluindo a glucose. O composto fluorescente possui uma estrutura molecular que inclui um fluoróforo, pelo menos um grupo de ácido fenilborónico e pelo menos uma amina fornecedora de azoto, estando o átomo de azoto dispensado na proximidade do grupo de ácido fenilborónico, de modo a interagir intramolecularmente com o ácido borónico. Tal interacção provoca a emissão de fluorescência pelo composto, aquando da ligação a um sacarídeo. Ver também T. James et al., J. Am. Chem. Soc. 117 (35):8982-87 (1995) .
Adicionalmente, também são conhecidos na arte sensores fluorescentes utilizando compostos contendo ácido antrilborónico para detecção de glucose no sangue. Por exemplo, J. Yoon et al., J. Am. Chem. Soc. 114:5874-5875 (1992), descreve que pode ser utilizado ácido antrilborónico como sensor químico fluorescente para assinalar a ligação a hidratos de carbono, incluindo a ligação de glucose e frutose.
Infelizmente, os compostos que interagem com a glucose, na forma descrita acima, também têm uma tendência para interagir com outros compostos possuindo grupos 3 ΡΕ1490350 hidroxilo, reduzindo assim a especificidade de um ensaio à glucose, especialmente quando se ensaiam amostras fisiológicas, que podem conter quantidades de lactato, acetoacetato, etc. que interferem. Por exemplo, alguns pacientes com diabetes também desenvolvem acidose láctica, em que os níveis de lactato no sangue são superiores a 5 mmol/litro. Assim, existe uma grande necessidade de ensaios de glucose que sejam relativamente insensíveis a compostos hidroxilo potencialmente interferentes, como o lactato.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Num aspecto, a presente invenção dirige-se a um método para detecção da presença ou concentração de glucose numa amostra, que pode também conter um α-hidroxiácido ou uma β-dicetona, que compreende: a) a exposição da amostra a um composto selec-cionado do grupo que consiste em: 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(ciclo-hexanocarbo-xamido)hexilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-aminojmetil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxietil)-amino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[3 —(N—6 —(9-antracene-carboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno; 4 ΡΕ1490350 9-[Ν-(2-boronobenzil)-Ν-[3-(metacrilamido)propil-amino]-metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(3-carboxipropio-namido)hexilamino]metil]antraceno; N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[[2-(borono)-benzil]-[6-(N-[2-(borono)benzil]-6-N-(3-carboxipropana-midoetil)amino-hexil]]aminoetilamino]-naftaleno-1,8-dicarboximida; N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)benzil]-[6-(N-[2-(borono)benzil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)amino-hexil]]-aminoetilamino]-naftaleno-1,8-dicarboximida; e seus sais; e b) medição de qualquer alteração na fluorescência emitida pelo composto para assim determinar a presença ou concentração de glucose na amostra referida, não interferindo a presença de um α-hidroxiácido ou uma β-dicetona, substancialmente com tal determinação.
Noutro aspecto, a presente invenção diriqe-se a um composto seleccionado do grupo que consiste em 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(ciclo-hexanocarbo-xamido)hexilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxietil)-amino]metil]antraceno ; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[3 —(N—6 —(9-antracene-carboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno; 5 ΡΕ1490350 9- [Ν-(2-boronobenzil)-Ν-[3-(metacrilamido)propil-amino]-metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(3-carboxipropio-namido)hexilamino]metil]antraceno; N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[[2-(borono)-benzil]-[6-(N-[2-(borono)benzil]-6-N-(3-carboxipropana-midoetil)amino-hexil]]aminoetilamino]-naftaleno-1, 8-dicarboximida; N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)benzil]- [6-(N-[2-(borono)benzil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)amino-hexil]]-aminoetilamino]-naftaleno-1,8-dicarboximida; e seus sais.
Noutro aspecto, a presente invenção dirige-se a um sistema de detecção que compreende um composto descrito acima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra a emissão de fluorescência normalizada (I/I0 Θ 420 nm) de um indicador, como descrito no Exemplo 1. A Figura 2 ilustra a emissão de fluorescência normalizada (I/Io @ 428 nm) de um indicador, como descrito no Exemplo 2. A Figura 3 ilustra a emissão de fluorescência normalizada (I/Io Θ 428 nm) de um indicador, como descrito no Exemplo 3. 6 ΡΕ1490350 A Figura 4 ilustra a emissão de fluorescência normalizada (I/Io 0 427 nm) de um indicador, como descrito no Exemplo 4. A Figura 5 ilustra a emissão de fluorescência normalizada (I/Io 0 540 nm) de um indicador, como descrito no Exemplo 5. A Figura 6 ilustra o espectro de absorbância de um indicador, como descrito no Exemplo 6.
As Figuras 7-8 ilustram a relação da absorbância (450 nm/530 nm) de um indicador, como descrito no Exemplo 6 . A Figura 9 ilustra a emissão de fluorescência normalizada (I/Io @ 550 nm) de um indicador, como descrito no Exemplo 6. A Figura 10 ilustra o espectro de fluorescência, em ausência de glucose e em presença de 100 mM de glucose, de um indicador, como descrito no Exemplo 6. A Figura 11 ilustra a emissão de fluorescência normalizada (I/Io a 550 nm), em presença de glucose e lactato, de um indicador, como descrito no Exemplo 6. A Figura 12 ilustra a emissão de fluorescência 7 ΡΕ1490350 normalizada (I/I0 a 525 nm) de um indicador exposto a glucose, como descrito no Exemplo 10. A Figura 13 ilustra a emissão de fluorescência normalizada (I/I0 a 530 nm) de um indicador exposto a lactato, como descrito no Exemplo 10. A Figura 14 mostra a emissão de fluorescência relativa (I a 430 nm) de um indicador exposto a glucose e lactato, como descrito no Exemplo 11. A Figura 15 mostra a emissão de fluorescência relativa (I a 430 nm) de um indicador exposto a glucose e lactato, como descrito no Exemplo 12. A Figura 16 mostra a emissão de fluorescência de um indicador exposto a glucose e lactato, como descrito no Exemplo 13.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Num aspecto, a presente invenção proporciona uma via para detecção da presença ou concentração de glucose numa amostra que pode conter compostos interferentes, tais como α-hidroxiácidos ou β-dicetonas. Tais compostos potencialmente interferentes incluem lactato, acetoacetato, ácido β-hidroxi butirico, etc. A presente invenção é realizada utilizando um ΡΕ1490350 composto indicador, como especificado nas reivindicações, que é capaz de reconhecer glucose numa amostra, mas que é menos propenso a reconhecer compostos interferentes na amostra. 0 composto indicador possui pelo menos dois elementos de reconhecimento para a glucose, orientados de modo a que interacção entre o composto indicador e a glucose seja mais estável do que a interacção entre o composto indicador e os compostos interferentes.
Elementos de reconhecimento adequados incluem grupos que são capazes de uma interacção, preferencialmente reversível, com a glucose, especialmente com os grupos diol presentes na glucose. São conhecidos diversos desses grupos e incluem, preferencialmente, ácido borónico, ião boronato, ácido arsenioso, ião arsenito, ácido telúrico, ião telu-rato, ácido germânico, ião germanato, etc. São mais preferidos os elementos de reconhecimento contendo boro. Deve ser tomado em consideração que até à utilização, os elementos de reconhecimento podem estar protegidos com um grupo de protecção. Tais grupos são bem conhecidos e incluem neopentil glicol, pinacol, etc. 0 elemento de reconhecimento protegido pode ser desprotegido no meio em que o composto é utilizado (ser, e.g., Exemplo 5).
Os elementos de reconhecimento estão preferencialmente espaçados no composto indicador, numa distância adequada para permitir que pelo menos dois dos elementos de reconhecimento interajam com a molécula de glucose, resultando numa especificidade aumentada. Em geral, os 9 ΡΕ1490350 elementos de reconhecimento podem possuir entre eles, um espaçador com até 30 átomos. Os elementos de reconhecimento estão, preferencialmente, orientados, de modo a que seja possível estarem a uma distância de cerca de 6 Â, quando interagem com a glucose.
Os compostos indicadores da presente invenção possuem uma qualidade detectável (fluorescência) que muda de uma forma dependente da concentração, quando o composto é exposto a uma amostra contendo glucose. São conhecidas muitas dessas qualidades, por exemplo compostos indicadores que incluem um grupo luminescente (fluorescente ou fosforescente) ou quimioluminescente, etc. Os compostos indicadores podem incluir um grupo dador de energia e um grupo receptor de energia, cada um deles espaçado de modo a que haja uma alteração detectável quando o composto indicador interage com a glucose. Os compostos indicadores podem incluir um fluoróforo e um neutralizador, configurado de modo a que o fluoróforo seja neutralizado pelo neutralizador na ausência de glucose. Nesta situação, quando a glucose está presente, o indicador sofre uma alteração configuracional que provoca o afastamento do neutralizador até uma distância suficiente do fluoróforo para ser emitida fluorescência. De igual modo, o fluoróforo e o neutralizador podem estar configurados de modo a que, na ausência de glucose, estejam suficientemente separados para que o fluoróforo emita fluorescência; aquando da interacção com a glucose o fluoróforo e o neutralizador movem-se até uma distância suficiente para provocar a neutralização. O 10 ΡΕ1490350 conceito de alteração configuracional é descrito com mais detalhe no nosso pedido de patente co-pendente N°. de Série 09/754,219, apresentado em 5 de Janeiro de 2001, intitulado "Detection of Analytes".
Alternativamente, o indicador pode incluir um grupo, como um fluoróforo capaz de interagir com o elemento de reconhecimento ou outro grupo espacialmente disposto em relação ao elemento de reconhecimento, de modo a que na ausência de glucose, o fluoróforo emita fluorescência. Aquando da adição de glucose, ela compete com a interacção entre o fluoróforo e o elemento de reconhecimento, ou a interacção entre o fluoróforo e o outro grupo disposto espacialmente em relação ao elemento de reconhecimento, provocando a redução na fluorescência. Um exemplo desse conceito é ilustrado no Exemplo 6. Também será reconhecido que os indicadores podem ser escolhidos de modo a que o fluoróforo não emita fluorescência, ou um nivel relativamente baixo de fluorescência, quando o fluoróforo interage com o elemento de reconhecimento ou outro grupo disposto espacialmente em relação ao elemento de reconhecimento, na ausência de glucose. Aquando da adição de glucose, ela compete com a interacção entre o fluoróforo e o elemento de reconhecimento, ou a interacção entre o fluoróforo e o outro grupo disposto espacialmente em relação ao elemento de reconhecimento, provocando um aumento de fluorescência.
Outros grupos detectáveis incluem aqueles cuja 11 ΡΕ1490350 fluorescência é afectada por interacção com glucose via transferência fotoinduzida de electrões ou efeitos indutores. Estes incluem os quelatos de lantanideos revelados no pedido de patente co-pendente N°. de Série U.S. 09/265,979, apresentado em 11 de Março de 1999 (e publicado como Pedido de Patente Internacional PCT WO 99/46600 em 16 de Setembro de 1999), hidrocarbonetos poliaromáticos e seus derivados; cumarinas; BoDiPy; dansilo, catecóis, etc. Outra classe de produtos incluem aqueles cujo espectro de absorvância se altera aquando da interacção do composto indicador com a glucose, incluindo vermelho de alizarina, etc. Outra classe de produtos inclui aquele cuja fluorescência é modulada por efeitos de proximidade, e.g., pares dador de energia/receptor, tal como dansilo/dabsilo, etc. A qualidade detectável, é, preferencialmente, uma alteração espectral detectável, tais como alterações nas caracteristicas absortivas (e.g., absorvância e/ou desvio espectral), na duração de extinção da fluorescência (determinada no domínio temporal ou no domínio da medida de frequências), intensidade de fluorescência, anisotropia da fluorescência ou polarização; desvio espectral do espectro de emissão; alterações na resolução temporal do decaimento anisotrópico (determinada no domínio temporal ou no domínio da medida de frequências), etc. Os compostos indicadores da presente invenção, se solúveis, podem ser utilizados directamente na solução, se assim desejado. Por outro lado, se a aplicação desejada assim o requerer, os compostos indicadores podem ser imobilizados (tal como por aprisiona- 12 ΡΕ1490350 mento mecânico ou por ligação covalente ou iónica) em ou sobre uma superfície ou matriz insolúvel, tal como vidro, plástico, materiais poliméricos, etc. Quando o composto indicador está aprisionado dentro, por exemplo, de outro polímero, o material de aprisionamento deve preferencialmente ser suficientemente permeável para permitir uma inte-racção sustentável entre a glucose e o composto indicador.
Se os compostos indicadores forem pouco solúveis ou insolúveis em água, mas se for desejada a detecção num meio aquoso, o composto indicador pode ser co-polimerizado com um monómero hidrofílico para formar uma macromolécula hidrofílica, como descrito no pedido de patente co-pendente N°. de Série U.S. 09/632,624, apresentado em 4 de Agosto de 2000 .
Também deve ser considerado que os presentes compostos e sistemas de detecção podem estar sob forma polimérica. Assim, um composto integral (contendo elementos de reconhecimento e grupo detectável) e um polímero existente, ou o composto integral, sob forma monomérica, pode ser polimerizado ou copolimerizado com outro monómero adequado para formar um polímero. Alternativamente, dois componentes monoméricos separados (e.g., um contendo os elementos de reconhecimento e um contendo o grupo detectável) podem ser copolimerizados de modo a que o polímero resultante contenha todos os elementos necessários do sistema (ver o Exemplo 6). 13 ΡΕ1490350
Existem muitas utilizações para os compostos indicadores da presente invenção, incluindo utilizações como indicadores nas áreas da energia, medicina e agricultura. Por exemplo, os compostos indicadores podem ser utilizados para detectar níveis baixos ou elevados de glucose em tampões ou fluidos fisiológicos, tais como sangue, plasma, soro, fluido intersticial, fluido cérebro-espinal, urina, saliva, fluido intraocular, linfa, lágrimas ou suor, proporcionando assim informação valiosa para diagnóstico ou monitorização de doenças tais como diabetes e insuficiência adrenal. A produção médica/farmacêutica de glucose para aplicações em terapia humana necessita de monitorização e controlo.
Utilizações da presente invenção em agricultura, incluem detecção de níveis de glucose em soja e outros produtos agrícolas. A glucose deve ser cuidadosamente monitorizada para decisões de colheita críticas para produtos de valor elevado, como a uva para vinho. Dado que a glucose é a fonte de carbono mais dispendiosa e matéria prima para os processos de fermentação a monitorização da glucose para um controlo óptimo de abastecimento do reactor é importante na produção de álcool combustível. A mistura no reactor e o controlo da concentração de glucose para a produção de refrigerantes e bebidas fermentadas, que internacionalmente consomem a maior quantidade de glucose e açucares fermentáveis (diol vicinal). 14 ΡΕ1490350
Quando os compostos indicadores incorporam subs-tituintes indicadores fluorescentes, também são conhecidas da arte, diversas técnicas de detecção. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser utilizados em dispositivos sensiveis à fluorescência (e.g., Patente U.S. N°. 5,517,313) ou podem ser ligados a material polimérico, tal como papel indicador, para inspecção visual. Esta última técnica permite, por exemplo, a determinação de glucose da forma análoga à determinação do pH utilizando uma tira de papel de tornassol. Os compostos aqui descritos também podem ser utilizados como reagentes simples com instrumentação analítica de bancada, tal como os espectrofluo-rómetros ou analisadores clínicos fabricados por Shimadzu, Hitachi, Jasco, Beckman e outros. Estas moléculas também proporcionarão analitos específicos para a transducção de sinal químico/óptico para sensores com base em fibra óptica e fluorómetros analíticos como os fabricados por Ocean Optics (Dunedin, Florida) ou Oriel Optics. A Patente U.S. 5,517,313 descreve um dispositivo sensível à fluorescência em que os compostos da presente invenção podem ser utilizados para determinar a presença ou concentração de glucose num meio líquido. 0 dispositivo sensível compreende uma estrutura em camadas de uma matriz contendo a molécula indicadora fluorescente, um filtro de elevado débito e um fotodetector. Neste dispositivo, uma fonte de luz, preferencialmente um diodo emissor de luz ("LED") está localizado, pelo menos parcialmente, no 15 ΡΕ1490350 material indicador ou num guia de ondas, sobre o qual é colocada a matriz, de modo que a luz incidente emitida pela fonte luminosa provoca a fluorescência das moléculas do indicador. 0 filtro passa-alto permite que a luz emitida atinja o fotodetector, filtrando a luz incidente refrac-tada. A fluorescência das moléculas indicadoras empregues no dispositivo descrito na Patente U.S. 5,517,313 é modulada, e.g., atenuada ou intensificada, pela presença local de glucose.
No sensor descrito na Patente U.S. 5,517,313, o material que contém a molécula indicadora é permeável ao analito. Assim, o analito pode difundir-se pelo material, a partir do meio de teste, afectando assim a fluorescência emitida pelos compostos indicadores. A fonte de luz, o material contendo o composto indicador, o filtro passa-alto e o fotodetector estão configurados de modo a que pelo menos uma parte da fluorescência emitida pelos compostos indicadores incida no fotodetector, gerando um sinal eléctrico que é indicativo da concentração de glucose no meio ambiente.
De acordo com outras realizações possíveis para utilização dos compostos indicadores da presente invenção, também são descritos dispositivos sensíveis nas Patentes U.S. N°s. 5 910 661, 5 917 605 e 5 894 351.
Os compostos da presente invenção também podem ser utilizados num dispositivo implantável, para, por 16 ΡΕ1490350 exemplo, monitorizar continuamente, os níveis de glucose no sangue, in vivo. Dispositivos adequados são descritos, por exemplo, no pedido de patente co-pendente N°. de Série U.S. 09/383,148, apresentado em 26 de Agosto de 1999, assim como nas Patentes U.S. N°s. 5,833,603, 8,002,954 e 6,011,984.
Os compostos da presente invenção podem ser preparados por técnicos da área, sem grande experimentação, utilizando reacções, mecanismos e reagentes conhecidos e que sejam consistentes com os procedimentos gerais descritos abaixo.
Exemplo 1
Co-polímero solúvel em água de derivado de antraceno e MAPTAC I. Síntese do indicador mono-boronato-antraceno co-polimerizado em polímero solúvel em água: A. 9-[3-(metacrilamido)propilamino]metilantraceno
Adicionou-se DIEA (18,5 g, 25,0 mL, 144 mmol, 6,5 equiv.) gota a gota, ao longo de 20 minutos, a uma suspensão de sal cloridrato de N-(3-aminopropil)metilacrilamida (11,82 g, 66,0 mmol, 3,0 equiv.) e de DBMP (10 mg como inibidor) em 150 mL de CHC13, a 0°C. Deixou-se a mistura aquecer até 25°C e voltou a arrefecer-se até 0°C. Adiei- 17 ΡΕ1490350 onou-se gota a gota, ao longo de uma hora, à mistura arrefecida, uma solução de 9-clorometilantraceno (5,0 g, 22 mol) em CHCL3 (100 mL) . Agitou-se depois a mistura a 25°C durante uma hora, a 50°C durante 12 horas e a 70°C durante 2 horas. Lavou-se depois a mistura com 4 porções de 60 mL de água e extraíram-se os extractos aquosos combinados com CH2CI2. Secaram-se os extractos orgânicos combinados sobre Na2SC>4 anidro, decantou-se e concentrou-se in vacuo. Purificou-se o material crú por cromatografia em silica gel (cromatografia com pressão de azoto, 2-5% de CH3OH/CH2CI2) para dar 2,44 g (33%) de um produto sólido. TLC: placas Merck silica gel 60, Rf 0,39 com 90/10 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366), corante de ninhidrina. B. 9-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzi1]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metilantraceno
Adicionou-se DIEA (2,85 g, 3,84 mL, 22,0 mmol, 3,0 equiv.), em porções, ao longo de 10 minutos, seguido pela adição gota a gota de uma solução de ester neopentílico de ácido (2-bromometilfenil)borónico (2,49 g, 8,81 mmol, 1,2 equiv.), ao longo de um período de 30 minutos, a uma solução de 9-[3-(metacrilamido)propilamino]-metilantraceno (2,44 g, 7,34 mmol) e de DBMP (10 mg como inibidor) em 200 mL de CHC13, a 0°C. Subsequentemente, agitou-se a mistura a 25°C durante 20 horas. Lavou-se 18 ΡΕ1490350 depois a mistura com água e extrairam-se os extractos aquosos combinados com CH2CI2. Secaram-se os extractos orgânicos combinados sobre Na2S04 anidro, decantou-se e concentrou-se in vacuo. Purificou-se o material crú por cromatografia em silica gel (cromatografia com pressão de azoto, 2-5% de CH3OH/CH2CI2) para dar 2,50 g (76%) de um sólido cristalino levemente amarelado.
P.f.: 72-73 °C TLC: placas Merck silica gel 60, Rf 0,36 com 90/10 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366), corante de ninhidrina. C. Co-polimero solúvel em água de 9—[N—[2—(5,5— dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzi1]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metilantraceno e MAPTAC (relação molar 1:20)
Adicionou-se 4.4'-azobis (ácido cianovalérico) (0,008 g, 0,03 mol, 1,4 mol % do total de monómero) a uma solução de 9-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metilantraceno (0,0490 g, 0,105 mmol) e cloreto de [3-(metacril-amido)propil]-trimetilamónio (MAPTAC, solução aquosa de 50% em peso, 0,48 g, 0,90 mL, 2,1 mmol, 20 equiv.) em 1,5 mL de etilenoglicol. Purgou-se a solução com árgon gasoso durante 5 minutos e aqueceu-se a 60°C, no escuro, durante 18 horas. 19 ΡΕ1490350
Arrefeceu-se a solução viscosa até 25°C diluiu-se com 5 mL de água e dializou-se através de uma membrana de acetato de celulose (MWCO 3500) contra 3 x 4 L de água. Concentrou-se o material dializado até à secura para dar 0,339 g (68%) de um sólido vítreo amarelo. II. Modulação de Fluorescência com Glucose e
Lactato
Determinou-se a modulação da fluorescência do co-polímero (que contém um único elemento de reconhecimento) preparado neste exemplo, pela glucose e lactato. A Figura 1 mostra a emissão fluorescente normalizada (I/I0 @ 420 nm) de soluções a 0,5 mg/mL de copolímero (relação molar 1:20) em PBS, contendo a) 0-20 mM de glucose; b) 0-20 mM de lactato. Os espectros foram registados utilizando um espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301 com excitação a 365 nm; fenda de excitação a 1,5 nm; fenda de emissão a 5 nm; temperatura ambiente. As barras de erro são desvios padrão com valores duplicados para cada pondo. A fluorescência do copolímero foi afectada pela presença de glucose e lactato.
Exemplo 2
Modulação pela glucose e potenciais interferências fisiológicas, do indicação de bis-boronato covalentemente ligado a vim polímero solúvel em água. 20 ΡΕ1490350 I. Síntese do monómero isolado do indicador bis-boronato-antraceno
A. 9,10-bis[[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]- antraceno
Adicionou-se 9,10-bis(clorometil)antraceno (3,94 g, 14,3 iranol) a uma solução de 2-(2-aminoetoxi)etanol (31,4 g, 30,0 mL, 299 mmol, 20,9 equiv.) em 40 mL de CHC13, a 23°C. Agitou-se a solução no escuro durante 67 horas. Adicionaram-se 100 mL de CH2CI2 e lavou-se com porções de 1 x 50 mL e 2 x 100 mL de NaHCCh (solução aquosa saturada) . Secou-se o extracto orgânico sobre Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se para dar 4,67 g (79%) de um pó amarelo. 0 produto (pureza de -85% por RP-HPLC) transitou tal e qual para o passo seguinte.
Condições de HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Vydec 201TP, 10 x 250 mm, injecção de 0,100 mL, 2 mL/min., detecção a 370 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MECN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 15,6 min. 21 ΡΕ1490350
Β. 9,10-bis[Ν-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxabori-nan-2-il)benzil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]-antraceno
Agitou-se, no escuro, durante 46 horas, uma solução de 9,10-bis[[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]-antraceno (4,02 g, 9,75 mmol), DIEA (12,6 g, 17,0 mL, 97,5 mmol, 10, 0 equiv) e de ester enopentilico do ácido (2- bromometilfenil)borónico (13,7 g, 48 mmol, 4,9 equiv.) em 1125 mL de CHC1 a 23°C. Concentrou-se então a mistura reaccional, inicialmente por evaporação rotativa e utilizando depois uma bomba de vácuo para remoção do DIEA. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de alumina (150 g de alunina neutra activada, 0-3% de CH30H/CH2C12) para dar 5,67 g (70%) de um óleo viscoso que solidificou em repouso. 0 produto (pureza de -85% por RP-HPLC) transitou tal e qual para o passo seguinte. 22 ΡΕ1490350 TLC: placas Merck de alumina básica, Rf 0,33 com 95/5 de CH2CI2/CH3OH, visualizado com UV (254/366).
Condições de HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Vydec 201TP, 10 x 250 mm, injecção de 0,100 mL, 2 mL/min., detecção a 370 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MECN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 18,8 min.
C. 9-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2- il)benzil]-N-[2-(2-metacroiloxietoxi)etilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]antraceno (monómero isolado de metacrilato)
Agitou-se no escuro, durante 4 horas, uma solução de 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)-benzil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]antraceno 23 ΡΕ1490350 (0,298 g, 0,359 mmol), ácido metacrílico (0,304 g, 0,300 mL, 3,53 mmol, 9,84 equiv.), DCC (0,965 g, 4,68 mmol, 13,0 equiv.) e N,N-dimetil-aminopiridina (0,020 g, 0,16 mmol, 0,46 equiv.) em 15 mL de CH2CI2, a 23°C. Filtrou-se depois a mistura reacional, filtrou-se e purificou-se por evaporação rotativa. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de alumina (50 g de alumina neutra activada, 0-4% de CH3OH/CH2CI2) para dar 0,150 g (47%) de um sólido amarelo. FAB MS: Cale, para C52H66B2N2O9 [M]+ 885; Encon trado [M+l]+ 886. TLC: placas Merck de alumina básica, Rf 0,45 com 95/5 de CH2CI2/CH3OH, visualizado com UV (254/366).
Condições de HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Vydec 201TP, 10 x 250 mm, injecção de 0, 10 0 mL, 2 mL/min., detecçao a 370 nm, A = água (com 0 , 1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min. , 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min. , 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 21 min. D. Copolímero solúvel em água de 9-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[2-(2-meta-croiloxietoxi)etilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)etil-amino]metil]-antraceno e TMAMA (relação molar 1:50) - 24 - ΡΕ1490350
Adicionou-se a uma solução de cloreto de [2-(metacriloxi)etil]trimetilamónio (TMAMA, 70% em solução aquosa, 0,344 g de monómero, 1,66 mmol, 50 equiv.) em 0,600 mL de água, uma solução de 9-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]-dioxaborinan-2-il)benzi1]-N-[2-(2-metacroiloxietoxi)etil-amino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzi1]-N-[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]-antraceno (0,0024 g, 0,033mmol) em 3,00 mL de MeOH. Adicionou-se, a esta mistura, 4,4'-azobis(ácido 4-cianovalérico) (0,0075 g, 0,027 mmol, 1,6 mol % do total de monómero). Filtrou-se a solução através de um filtro de membrana de 0,45 μιη, purgou-se com azoto gasoso e aqueceu-se no escuro, a 55°C, durante 16 horas. Arrefeceu-se depois a solução viscosa até 25°C e concentrou-se in vacuo. Diluiu-se o resíduo com 20 mL de água e filtrou-se através de um filtro de membrana de 0,2 μιη. Dializou-se a solução de polímero através de uma membrana de acetato de celulose (MWCO 3500) contra 2 x 4 L de água. A partir da diálise obtiveram-se 38,5 mL de solução de polímero. A concentração de uma porção desta solução até à secura, indicou 0,0075 g de polímero por 1,0 mL de solução. Rendimento global de 0,289 g (77%) de polímero. II. Modulação da fluorescência com glucose, lactato e acetoacetato
Determinou-se a modulação da fluorescência do copolímero (que ontem dois elementos de reconhecimento) preparado neste exemplo, pela glucose, lactato e acetoacetato. A Figura 2 mostra a emissão de fluorescência normalizada (I/1o @ 428 nm) de uma solução a 1,5 mg/mL do 25 ΡΕ1490350 copolímero antraceno bis boronato-TMAMA (relação molar 1:50) em PBS, contendo a) 0-20 mM de glucose; b) 0-20 mM de lactato e c) 0-20 mM de acetoacetato de litio. Os espectros foram registados utilizando um espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301 com excitação a 365 nm; fenda de excitação a 1,5 nm; fenda de emissão a 5 nm; temperatura ambiente. A fluorescência do copolímero foi afectada pela presença de glucose, mas não pela presença de lactato ou acetoacetato.
Exemplo 3
Efeito do lactato em solução sobre o efeito dose resposta da glucose sobre a fluorescência do indicador bis-boronato-antraceno
A. 9,10-bis[[2-(terc-butiloxicarbonil)etilamino]-metil]-antraceno
Agitou-no no escuro, durante 93 horas, uma solução de cloridrato do ester terc-butílico de β-alanina (3,06 g, 16,8 mmol, 5,09 equiv.), DIEA (4,27 g, 5,75 mL, 33,0 mmol, 10,00 equiv.) e 9,10-bis(clorometil)antraceno (0,910 g, 3,31 mmol) em 75 mL de CHC13, a 23 °C. Filtrou-se depois a solução e lavou-se com porções (1 x 40 ml e 2 x 60 mL) de NaHCCh (solução aquosa saturada). Secaram-se os 26 ΡΕ1490350 extractos orgânicos sobre Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se para dar um sólido amarelo cru. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel (30 g de gel de gravidade, 0-3% de CH3OH/CH2CI2), para dar 1,06 g (65%) de um líguido amarelo-alaranjado viscoso. O produdo transitou para o passo seguinte sem outro processamento. TLC: placas Merck sílica gel 60, Rf 0,33 com 95/5 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366).
B. 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxabori-nan-2-il)benzil]-N-[2-(terc-butiloxicarbonil)etilamino]-metil]antraceno
Agitou-se, no escuro, durante 4,5 dias, uma solução de 9,10-bis[[2-(terc-butiloxicarbonil)etilamino] metil] -antraceno (1,60 g, 3,25 mmol), DIEA (4,45 g, 6,00 mL, 10,6 equiv.) e ester neopentílico do ácido (2-bromo-metilf enil) borónico (4,80 g, 17,0 mol, 5,22 equiv.) em 30 mL de CHCI3, a 23 °C. Adicionaram-se 45 mL de CHCI3 à mistura e lavou-se esta com 2 porções de 25 mL de NaHCC>3 (solução aquosa saturada). Secou-se o extracto orgânico 27 ΡΕ1490350 sobre Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se para dar um óleo avermelhado cru. Purificou-se o resíduo por cromato-grafia em coluna de alumina (100 g de alumina neutra activada, 0-3% de CH3OH/CH2CI2) para dar 3,5 g de um sólido laranja. Dissolveu-se o produto, seguindo-se a formação de um precipitado branco (sal de DIEA-HBr). Filtrou-se a solução e concentrou-se o filtrado para dar 2,72 g (93%) de um sólido laranja. 0 produto (pureza >80% por RP-HPLV) transitou para o passo seguinte tal e qual. TLC: placas Merck de alumina básica, Rf 0,66 com 95/5 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366).
Condições de HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Vydec 201TP, 10 x 250 mm, injecção de 0,100 mL, 2 mL/min., detecção a 370 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 23,9 min.
28 ΡΕ1490350 C. 9,10-bis[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxi-etil)amino]metil]antraceno
Agitou-se no escuro, durante 25 horas, a 23°C, uma solução de 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxabo-rinan-2-il)benzil]-N-[2-(terc-butiloxicarbonil)etilamino]-metil] antraceno (0,556 g, 0,620 mmol) em 5 mL de 20% de TFA/CH2CI2. Concentrou-se depois a mistura sob fluxo de N2 gasoso. Triturou-se o resíduo com 3 porções de 10 mL de éter. Secou-se o sólido residual in vacuo para dar 0,351 g (87%) de um pó amarelo macio. FAB MS: matriz de glicerol; Cale, para C42H46B2N2O10 (aducto bis glicerol) [M]+ 760; Encontrado [M] + 760 .
Condições de HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,025 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,5 mL, detecção a 360 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 16,7 min. D. Modulação da Fluorescência com Glucose e
Lactato
Determinou-se a modulaçao do composto indicador (que contém dois elementos de reconhecimento) preparado 29 ΡΕ1490350 neste exemplo, pela glucose e lactato. A Figura 3 mostra a fluorescência (a 428 nm) de soluções a 75 μιη de indicador bis carboxilato bis-boronato-antraceno em PBS, contendo a) 0-10 mM de glucose, 0 mM de lactato; b) 0-10 mM de glucose, 2 mM de lactato e c) 0-10 mM de glucose, 5 mM de lactato. Os espectros foram registados utilizando um espectrofluo-rómetro Shimadzu RF-5301 com excitação a 365 nm; fenda de excitação a 1,5 nm; fenda de emissão a 1,5 nm; temperatura ambiente. Todos os pontos foram medidos em triplicado, tendo-se incluído barras de erro SD ±1. A presença de lactato não afectou substancialmente a modulação de fluorescência do indicador pela glucose.
Exemplo 4
Selectividade do Indicador de Glucose de Bis-boronato para a. Glucose vs. Lactato e Acetoacetato, Quando o Indicador está Covalentemente Imobilizado em Hidrogel. I. Preparação do Monómero com Duplo Metacrilato
30 ΡΕ1490350 A. 9,10-bis[3-(metacrilamido)propilamino]-metil- antraceno
Uma suspensão de 9,10-bis(clorometil)antraceno (1,5 g, 5,45 mmol), DIEA (28,17 g, 38,00 mL, 218 mmol, 40 equiv.), sal cloridrato de N-(3-aminopropil)metacrilamida (9,76 g, 54,5 mmol, 10,0 equiv.) e ~5 mg de BHT em 200 mL de CHCI3 a 23 °C, foi agitada no escuro, durante 4 dias a 40°C. Após este período, aumentou-se a temperatura até 45°C e agitou-se a mistura durante mais 3 dias. Por esta altura, tinha-se formado um precipitado. Filtrou-se a mistura e dissolveu-se o produto sólido na quantidade mínima de CH2CI2. Um sólido cristalino amarelo, o sal bis cloridrato do produto desejado, formou-se durante a noite (3,15 g, quantitativo). TLC: placas Merck de alumina básica, Rf 0,31 com 90/10 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366).
Condições de HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,100 mL, 0,75 mL/min., detecção a 360 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 15,0 min. 31 ΡΕ1490350
Β. 9,10-bis[Ν-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxabori-nan-2-il)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]-metil-antraceno (monómero duplo de metacrilamida)
Agitou-se no escuro, a 23°C, durante 5 dias, uma solução de 9,10-bis[3-(metacrilamido)propilamino]-metilan-traceno (0,650 g, 1,34 mmol de amina livre), DIEA (0,612 g, 0,825 mL, 4,74 mmol, 3,55 equiv.), ester neopentilico do ácido (2-bromometilfenil)borónico (1,34 g, 4,74 mmol, 3,55 equiv.) e BHT (5 mg, como inibidor) em 20 mL de CHCI3. Concentrou-se então a mistura reaccional in vacuo e purificou-se o resíduo por cromatografia em alumina (200 g de alumina activada neutra, 0-2% de CH3OH/CH2CI2) para dar 0,465 g (39%) de um óleo amarelo muito viscoso. 32 ΡΕ1490350 TLC: placas Merck de alumina básica, Rf 0,59 com 90/10 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366). HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna
Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,050 mL, 0,75 mL/min., detecção a 360 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 16,9 min. C. Preparação de hidrogel de N,Ndimetilacrilamida com indicador de glucose
Preparou-se uma solução de N,N-dimetilacrilamida (40% em peso) e de N,N= -metilenobisacrilamida (0,8% em peso) em etilenoglicol. Combinaram-se 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzi1]-N-[3-(metacrilami-do) propilamino] metilantraceno (17,8 mg, 2xl0~5 mol) e 40 μΒ de persulfato de amónio aquoso (5% em peso) com 1 mL de monómero de etilenoglicol. Colocou-se a solução resultante numa caixa de luvas purgada com azoto. Adicionou-se uma solução aquosa de N,N,N=, N=-tetrametiletilenediamina (80 μΒ, 5% em peso) à formulação de monómero, para acelarar a polimerização. Verteu-se a formulação resultante num molde construído a partir de lâminas de microscópio e um espaçador de aço inoxidável de 100 micron. Depois de ter sido mantido durante 8 horas em aatmosfera de azoto, colocou-se o molde em salina tamponada com fosfato (PBS) 33 ΡΕ1490350 (10 mM de PBS, pH = 7,4), separaram-se as lâminas de microscópio e removeu-se o hidrogel. Lavou-se o hidrogel com 100 mL de PBS contendo 1 mM de sal sódico de lauril sulfato e 1 mM de sal sódico deEDTA durante 3 dias, sendo a solução mudada diariamente, seguido por lavagem com DMF/PBS (10/90 em volume, 3 x 100 mL) e finalmente com PBS (pH = 7,4, 3 x 100 mL) contendo 0,2% em peso de azida de sódio e 1 mM de sal sódico de EDTA. II. Modulação da Fluorescência com Glucose, Lactato e Acetoacetato
Determinou-se a modulação da fluorescência do composto indicador (que contém dois elementos de reconhecimento) preparado neste exemplo, pela glucose, lactato e acetoacetato. A Figura 4 mostra a emissão normalizada de fluorescência (I/Io a 427 nm) de um hidrogel contendo a molécula de reconhecimento da glucose deste exemplo, em 10 mM de PBS, pH 7,4, contendo 0,2% de NaN3 e 1 mM de EDTA contendo diversas quantidades de L-lactato de sódio, acetoacetato de litio ou α-D-glucose. Os dados foram registados utilizando um espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301 com excitação a 365 nm; fenda = 3 nm) e emissão a 427 nm (fenda = 3 nm), com baixa sensitividade, a 37°C, utilizando um suporte de amostras com temperatura controlada. As cuvetes contendo 3 mL da solução desejada foram equilibradas a 370C durante 15 minutos, antes da leitura. Cada amostra de hidrogel foi medida em quatro amostras independentes. As barras de erro são desvios padrão, com valores 34 ΡΕ1490350 em quadruplicado para cada ponto de dados. 0 hidrogel contendo uma molécula de reconhecimento de glucose foi preparado como descrito anteriormente. Os hidrogeles foram montados em lâminas de vidro e cobertos com rede de poliés-ter em cuvetes de PMMA a 45° em relação á luz incidente. Prepararam-se soluções de L-lactato de sódio (Aldrich) 1, 5, 10 e 20 mM, de acetoacetato de litio (Aldrich), 5, 10 e 20 mM e de s-D-glucose 1, 2, 4, 5, 10 e 20 mM em PBS a 10 mM, pH 7,4, contendo 0,2% de NaN3 e 1 mM de EDTA. A fluorescência do copolímero foi afectada pela presença de glucose, mas não pela presença de lactato ou acetoacetato.
Exemplo 5
Selectividade da glucose vs. lactato, utilizando a geração de sinal de reconhecimento e sinal de neutralização de proximidade do bis-boronato A. N-(2,2-dietoxietil)-4-bromo-l,8-naftalimida
Agitou-se a 45°C, durante 3 dias, uma suspensão de anidrido 4-bromo-l,8-naftálico (10,0 g, 36,1 mmol) e acetal dietilico de aminoacetaldeido (4,81 g, 5,26 mL, 36, 1 mmol, 1 equiv.) em 45 mL de EtOH. Filtrou-se a suspensão resultante, lavou-se com EtOH e secou-se o resíduo para dar 13,3 g (94%) de um produto sólido castanho claro. TLC: placas Merck sílica gel 60, Rf 0,17 com 98/2 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366). 35 ΡΕ1490350
Condições de HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,050 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,5 mL, detecção a 360 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 24,2 min. B. N-(2,2-dietoxietil)-4-butilamino-l,8-nafta- limida
Aqueceu-se a 45°C durante 66 horas, uma solução de N-(2,2-dietoxietil)-4-bromo-l,8-naftalimida (0,797 g, 2,03 mmol) e n-butilamina (1,48 g, 2,00 mL, 20,2 mmol, 9,96 equiv.) em 8 mL de NMP. Deixou-se a suspensão resultante arrefecer até 25°C e filtrou-se. Dissolveu-se o resíduo em 50 mL de éter e extraiu-se com 3 x 50 mL de água. Secou-se o extracto orgânico sobre Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se para dar um pó amarelo cru. Este material cru foi purificado por cromatografia em sílica gel (25 g de gel de gravidade, 0-1% CH3OH/CH2CI2) para dar 0,639 g (82%) de um pó amarelo. TLC: placas Merck sílica gel 60, Rf 0,71 com 95/5 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366).
Condições de HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,050 36 ΡΕ1490350 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,5 mL, detecção a 450 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 23,5 min. C. N-(2-oxoetil)-4-butilamino-l,8-naftalimida
Agitou-se a 25°C durante 18 horas, uma solução de N-(2,2-dietoxietil)-4-butilamino-l,8-naftalimida (0,622 g, 1,62 mmol) e ácido p-toluenossulfónico mono hidratado (0,010 g, 0,053 mmol, 0,032 equiv.) em 25 mL de acetona. Concentrou-se então a solução e purificou-se o resíduo por cromatografia em sílica gel (25 g, gel de gravidade, 0-1% de CH3OH/CH2CI2) para dar 0,470 g (94%) de um sólido laranja. TLC: placas Merck sílica gel 60, Rf 0,61 com 95/5 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366). XH RMN ( 400 MHz, CDCI3) ; δ 1 , 03 (t, 3H, J = 7, Hz) , 1,53 (m, 2H) , 1,78 (m, 2H), 3,38 (t, 2H, J = 7,2 Hz) 5, 02 (s, 2H) , 6,64 (d, 1H, J = 8 ,6 Hz) , 7 , 52 (dd, 1H, J 7,4, 8,3 Hz), 8, 08 (dd , 1H, J = 1 Hz, 8 ,5 Hz), 8,38 (d, 1H J = i 3,3 Hz) , 8,46 (dd, 1H, J = 1, 0, 7,3 Hz) , 9, , 75 (s , 1H) 4 HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,050 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,5 mL, detecção a 450 nm, A = 37 ΡΕ1490350 água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 19,6 min. D. N-(4-dimetilaminobenzil)-1,6-diamino-hexano
Agitou-se no escuro, a 25°C, sob atmosfera de azoto, durante 18 horas, uma suspensão de 4-dimetilaminobenzaldeido (1,00 g, 6,70 mmol), Na2S04 (6,70, 47,2 mmol, 7,04 equiv.) e 1,6-diamino-hexano (3,89 g, 33,5 mmol, 5,00 equiv.) em 20 mL de EtOH anidro.Filtrou-se então a solução e adicionou-se NaBH4 (1,73 g, 45,8 mmol, 6,48 equiv.) ao filtrado. Agitou-se a suspensão a 25°C durante 5 horas. Concentrou-se a mistura reaccional dissolveu-se o resíduo em 50 mL de água e extraiu-se com 3 x 50 mL de éter. Lavaram-se os extractos orgânicos combinados com 2 x 50 mL de água. Extrairam-se os extractos aquosos concentrados com 2 x 50 mL de éter. Secaram-se os extractos orgânicos combinados sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se para dar 1,35 g (81%) de um óleo viscoso. TLC: placas Merck sílica gel 60, Rf 0,58 com 85/15/5 de CH2Cl2/CH3OH/iPrNH2, observado com coloração com ninhidrina, UV (254/366). HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0, 050 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,5 mL, detecção a 280 nm, A = 38 ΡΕ1490350 água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 13,3 min. E. N-2-[6-N-(Ν-4-dimetilaminobenzil)amino-hexil]-aminoetil)-4-butilamino-l,8-naftalimida
Adicionou-se a uma suspensão de N-(2-oxoetil)-4-butilamino-1,8-naftalimida (0,346 g, 1,11 mmol) em 25 mL de MeOH anidro, uma solução de N-(4-dimetilamino-benzil)-1,6-diamino-hexano (0,554 g, 2,22 mmol, 2,00 equiv.) e ácido acético (0, 067 g, 1,1 mmol, 1,0 equiv.) em 20 mL de MeOH anidro. A esta mistura, adicionou-se uma solução de NaCNBH3 (0, 0 70 g, 1,1 mmol, 1,0 equiv.) em 5 mL de MeOH anidro. Agitou-se a mistura reaccional a 25°C, durante 15 horas. Removeu-se então o MeOH por evaporação rotativa e dissolveu-se o resíduo em 30 mL de água. Ajustou-se o pH da solução para 2 com HC1 IN e agitou-se durante 1 hora a 25°C. Ajustou-se o pH da solução para 12 com NaOH IN e subsequentemente extraiu-se com 3 x 50 mL de CH2CI2. Lavaram-se os extractos orgânicos combinados com 3 x 50 mL de água, secou-se sobre Na2SC>4 anidro, filtrou-se e concentrou-se para dar um óleo castanho cru. Purificou-se o material cru por cromatografia em sílica gel (35 g de gel para pressão de azoto, 0-50% de CH3OH/CH2CI2, depois 45/50/5 de CH30H/CH2C12/ iPrNH2) para dar 0,190 g (32%) do produto diamina. 39 ΡΕ1490350 FAB MS: Cale. para C33H45N5O2: [M]+ 544; Encontrado [M]+ 544. TLC: placas Merck sílica gel 60, Rf 0,42 com 80/20 de CH2CI2/CH3OH, observado com coloração com ninhidrina, UV (254/366). HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0, 050 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,5 mL, detecção a 450 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 17,6 min. F. N-2-[6-N-(Ν-4-dimetilaminobenzil)-6-N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]amino-hexil]—[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]aminoetil-4-butilamino-1,8-naftalimida]
Adicionou-se a uma solução de N-2-[6-N-(N-4-dimetilaminobenzil)amino-hexil]-aminoetil)-4-butilamino-1,8-naftalimida (0,150 g, 0,276 mmol) e DIEA (0,355g, 0,478 mL, 2,81 mmol, 10,0 equiv.) em 5 mL de CHCI3, uma solução de ester neopentílico de ácido (2-bromometilfenil)borónico (0,390 g, 1,38 mmol, 5,00 equiv.) em 2 mL de CHCI3. Agitou-se subsequentemente a solução a 25 °C durante 2 7 horas. Concentrou-se então a mistura e purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de alumina (100 g, alumina neutra 40 ΡΕ1490350 activada, 0-5% de CH30H/CH2C12) para dar 0,024 g (19%) de um óleo castanho viscoso. FAB MS: (matriz de glicerol) Cale. para C53H67B2N508 [M]+ 924 (aducto bis-glicerol no lugar do ester bis neopentilico dos ácidos borónico); Encontrado [M]+ 924. TLC: placas Merck de alumina neutra, Rf 0,62 com 80/20 de CH2C12/CH30H, observado com UV (254/366). HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,050 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,5 mL, detecção a 450 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 20,7 min. G. N-2-[6-N-(Ν-4-dimetilaminobenzil)-6-N-[2- (borono)benzil]-amino-hexil]-[2-(borono)benzil]amino-etil-4-butilamino-l,8-naftalimida (nBuF-hexa-Q bis-boronato) O produto ácido bis-borónico livre utilizado nos estudos da glucose, resulta da dissolução de N-2-[6-N-(N-4-dimetil-amiobenzil)-6-N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxabori-nan-2-il)benzil]amino-hexil]-[2-(5,5-dimetil-[l,3,2]dioxa-borinan-2-il)benzil]aminoetil-4-butilamino-1,8-naftalimida no sistema tampão MeOH/PBS.] 41 ΡΕ1490350 H. Modulação da fluorescência com glucose e lactato
Determinou-se a modulação da fluorescência do composto indicador (que contém dois elementos de reconhecimento) preparado neste exemplo, pela glucose e pelo lactato. A Figura 5 mostra a emissão de fluorescência normalizada (I/Io 0 535 nm) de soluções 0,015 mM do composto indicador em MeOH/PBS, 70/30, contendo a) 0-20 mM de glucose; b) 0-20 mM de lactato. Os espectros foram registados utilizando um espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301 com excitação a 450 nm; fenda de excitação a 1,5 nm; fenda de emissão a 1,5 nm; temperatura ambiente. As barras de erro são desvios padrão com valores em triplicado para cada ponto. A fluorescência do indicador foi afectada pela presença de glucose, mas não substancialmente afectada pela presença de lactato.
Exemplo 6
Efeito da glucose ou do lactato sobre o gel de acrilamida contendo N-[3-(metacrilamido)propil]-3,4-di-hidroxi-9,10-dioxo-2-antracenossulfonamida (monómero S de Vermelho de Alizarina) e α,α'-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxabori-nan-2-il)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]-1,4-xileno (monómero do ácido bis-borónico) A. Cloreto de 3,4-di-hidroxi-9,10-dioxo-2-antra- cenossulfonilo 42 ΡΕ1490350
Combinou-se sal sódico do ácido 3,4-di-hidroxi- 9.10- dioxo-2-antracenossulfonilo (1,4 g, 3,9 mmol) com 30 mL de ácido clorossulfónico e aqueceu-se a 90°C durante 5 horas, após o que se arrefeceu a solução até 0°C e verteu-se em 100 g de gelo. Após fusão do gelo, extraiu-se a solução com CH2CI2 (3 x 100 mL) , combinaram-se os extractos de cloreto de metileno, secou-se sobre Na2SC>4 e evaporou-se para produzir 0,87 g de sólido (rendimento: 66%). B. N-[3-(metacrilamido)propil]-3,4-di-hidroxi- 9.10- dioxo-2-antracenos-sulfonamida
Combinaram-se cloreto de 3,4-di-hidroxi-9,10-dioxo-2-antracenossulfonilo (96 mg, 0,28 mmol) e cloridrato de N—(3-aminopropil) metacrilamida (108 mg, 0,6 mmol) em 20 mL de CH2CI2. Adicionou-se a esta suspensão Et3N (303 mg, 3 mmol) . Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 24 horas, filtrou-se e evaporou-se o solvente. Sujeitou-se o sólido resultante a cromatografia em coluna com Si02 (10 g) , eluindo com CH2Cl2/MeOH (90/10). Obteve-se o produto como um sólido vermelho (80 mg, rendimento de 64%). FAB MS: Calculada para C21H20N2O7S: M+ 445;
Encontrado M+ 445. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna
Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,100 mL,
0,75 mL/min., loop de injecção, 2 mL, detecção a 370 nm, A 43 ΡΕ1490350 = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 17,67 min. C. a,a'-bis[3-(metacrilamido)propilamino]-1,4- xileno
Agitou-se no escuro, a 25°C, durante 18 horas, uma solução de sal cloridrato de N-(3-aminopropil)meta-crilamida (3,00 g, 16,8 mmol, 2,21 equiv.), DIEA (6,5 g, 8,8 mL, 50 mmol, 6,6 equiv.), tereftaldicarboxaldeido (1,02 g, 7,60 mmol) e Na2SC>4 (10,7 g, 75,3 mmol, 9,91 equiv.) em 75 mL de MeOH anidro. Adicionou-se então mais Na2S04 (10,7 g, 75,3 mmol, 9,91 equiv.) e continuou-se a agitação durante mais 6 horas. Filtrou-se depois a solução, adicionou-se NaBH4 (1,73 g, 45,7 mmol, 6,01 equiv.), em porções, ao filtrado e agitou-se a 25°C durante 21 horas. Filtrou-se a suspensão através de Celite e concentrou-se o filtrado. Dissolveu-se o residuo em 100 mL de CH2C12 e lavou-se com 1 x 25 mL de NaHC03 aquoso saturado. Secou-se o extracto orgânico sobre Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se para dar um óleo viscoso. O produto transitou para o passo seguinte tal e qual. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Vydec 201TP, 10 x 250 mm, injecção de 0,100 mL, 2,00 mL/min., detecção a 260 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MECN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10- 44 ΡΕ1490350 80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 15,8 min. D. a,a'=-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxabori-nan-2-il)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]-1,4-xileno
Agitou-se no escuro, a 25°C, durante 28 horas, uma solução de α,α'=-bis[3-(metacrilamido)propilamino]-1,4-xileno (2,94 g, 7,61 mmol), DIEA (2,97 g, 4,00 mL, 23,0 mmol, 3,02 equiv.), ester neopentilico do ácido (2-bromometilfenil)borónico (6,50 g, 23,0 mmol, 3,02 equiv.) e BHT (5 mg, como inibidor) em 75 mL de CH2CI2· Lavou-se então a mistura com 1 x 25 mL de NaHC03 aquoso saturado. Secou-se o extracto orgânico sobre Na2SC>4 anidro, filtrou-se e concentrou-se Adicionaram-se ao resíduo 200 mL de éter e agitou-se a suspensão durante 18 horas. Filtrou-se a suspensão, dissolveu-se o resíduo em CH2CI2,filtrou-se e concentrou-se o filtrado. Adicionaram-se ao resíduo sólido 150 mL de éter e agitou-se a suspensão durante 18 horas. Filtrou-se então a suspensão, dando 1,98 g (33%) de um leve pó rosa. FAB MS: Cale. para C46H64B2N406: [M]+ 790; Encon trado [M+l]+ 791. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna
Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0, 050 mL, 45 ΡΕ1490350 0,75 mL/min., detecção a 280 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 13,4 min. E. Preparação do gel de acrilamida contendo N-[3-(metacrilamido)propil]-3,4-di-hidroxi-9,10-dioxo-2-antra-cenossulfonamida (monómero S de Vermelho de Alizarina) e a, a'-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)ben-zil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]-1,4-xileno
Preparou-se uma solução de etilenoglicol contendo 30% em peso de acrilamida e 0,8% em peso de N,N'-metilenebisacrilamida. Combinaram-se N-[3-(metacrilamido)-propil]-3,4-di-hidroxi-9,10-dioxo-2-antracenossulfonamida (1,5 mg, 3,38 x 10“6 mol) e α,α'-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]-1,4-xileno (28 mg, 3,54 x 10~5 mol) com 800 μΙ; de solução de monómero de etilenoglicol e 40 μΐϋ de solução aquosa a 5% em peso de persulfato de amónio. Colocou-se esta formulação numa caixa de luvas purgada com azoto, conjuntamente com um molde construído a partir de lâminas de microscópio e um espaçador de aço inoxidável de 100 micron. Adicionou-se uma solução aquosa de Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametiletilenediamina (40 μΐ, 5% em peso) à formulação de monómero para acelarar a polimerização e verteu-se a formulação final no molde de vidro. Deixou-se o molde sob atmosfera de azoto durante 16 horas, após o que se emergiu 46 ΡΕ1490350 em PBS (pH = 7,4) e separaram-se as lâminas de vidro para se obter o polímero de hidrogel sob a forma de uma película fina. Lavou-se a fina película de hidrogel com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato contendo 1 mM de sal sódico de lauril sulfato durante 3 dias, sendo a solução mudada diariamente, seguido por lavagem com MeOH/PBS (20/80 em volume, 3 x 100 mL) e finalmente com PBS (pH =7,4, 3 x 100 mL). Conservou-se o polímero de hidrogel em PBS (PBS 10 mM, pH = 7,4), contendo 0,2% em peso de azida de sódio e 1 mM de sal sódico de EDTA. F. Modulação da Absorvância com Glucose e Lactato
Determinou-se a modulação da fluorescência do hidrogel indicador (que contém dois elementos de reconhecimento) preparado neste exemplo, pela glucose e pelo lactato. Montou-se o gel de acrilamida numa célula de PMMA da forma descrita no Exemplo 4. Aqueceu-se a 37°C, e banho de água, a solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7,4) contendo a quantidade desejada de glucose ou lactato de sódio e colocou-se na célula de PMMA contendo o gel, após o que se deixou a célula de PMMA equilibrar durante 15 min. a 37°C. As medições de absorbância para cada uma das concentrações de glucose ou de acetato, foram conduzidas em triplicado. Para cada medida foi utilizada absorbância a 650 nm como branco, A(650 nm) e foi substraída de todos os valores de A(450 nm) e de A(530 nm). A Figura 6 mostra o espectro de absorbância para ΡΕ1490350 - 47 - o gel de acrilamida (30%) contendo 4 mM de monómero S de Vermelho de Alizarina e 44 mM de monómero de ácido bis-borónico, com e sem glucose. A Figura 7 mostra o efeito da glucose sobre a absorbância do gel de acrilamida (30%) contendo 4 mM de monómero de Vermelho de Alizarina S e 44 mM de monómero de ácido bis-borónico. A Figura 8 mostra o efeito do lactato de sódio sobre a absorbância do gel de acrilamida (30%) contendo 4 mM de monómero S de Vermelho de Alizarina e 44 mM de monómero de ácido bis-borónico. A absorbância do indicador foi afectada pela presença de glucose, mas não substancialmente afectada pela presença de lactato. G. Modulação de Fluorescência com Glucose e
Lactato
Determinou-se a modulação da fluorescência de um gel de acrilamida sintetizado substancialmente de acordo com este exemplo 6 (excepto por se ter utilizado 1,9 mg de N-[3-(metacrilamido)-propil]-3,4-di-hidroxi-9,10-dioxo-2-antracenossulfonamida e 35 mg de α,α'-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[3-(metacrilamido) propilamino]-1,4-xileno). A experiência foi conduzida num espectrofluo-rímetro Shimadzu RF-5301 PC equipado com um acessório de temperatura variável (excitação a 470 nm, fendas 3/10 nm, alta sensibilidade) . O gel de acrilamida foi ligado a uma 48 ΡΕ1490350 lâmina de vidro que se colou numa célula PMMA para fluorescência, num ângulo de 45°. Encheu-se a célula com 2,5 mL de PBS (pH =7,4) e aqueceu-se a 37°C. Prepararam-se soluções mãe de glucose (100 mM e 500 mM) em PBS (pH = 7,4) e aqueceram-se a 37°C em banho de água. Adicionou-se periodicamente uma aliquota de solução mãe de glucose aquecida à célula de PMNA, enquanto se monitorizava a intensidade da fluorescência a 550 nm, em função do tempo (1 medição cada 2 minutos) . A concentração de glucose na célula de PMNA foi medida utilizando um analisador de glucose YSI, modelo 2300 STAT plus. Os resultados, mostrados na Figura 9, mostram que a adição de glucose reduz a intensidade da fluorescência do hidrogel indicador. 0 mesmo efeito é observado na Figura 10, que mostra o efeito da glucose sobre o espectro de fluorescência do mesmo tipo de gel.
Julga-se que este efeito ocorra devido às considerações que se seguem. O monómero metacrilato do Vermelho de Alizarina S (molécula repórter) contém uma funcionalidade diol vicinal e funcionalidade monómero (ver a estrutura abaixo). EM solução aquosa e em solventes orgânicos o Vermelho de Alizarina S e os elementos monoméricos de reconhecimento bis-boronato (ver a estrutura abaixo), são capazes de reagir reversivelmente um com o outro para formar um ester boronato. A molécula ester de boronato formada nesta reacção reversível é fluorescente, enquanto que o monómero de Vermelho de Alizarina S, por si 49 ΡΕ1490350 só, não revela virtualmente nenhuma emissão fluorescente, em solução aquosa ou em solventes orgânicos, como o MeOH. Assim, aquando da liqação ao elemento de reconhecimento da glucose, o Vermelho de Alizarina S altera as suas propriedades óticas, tais como absorbância e quantidade de fluorescência, por exemplo.
Uma solução de Vermelho de Alizarina S com funcionalidade monómero e um elemento de reconhecimento de glucose com funcionalidade monómero, pode ser preparada, com um hidrogel monomérico e um promotor de ligações cruzadas. A copolimerização desta mistura produz um hidrogel onde se podem difundir diversas moléculas de tamanho pequeno e médio; assim, é capaz de detectar e quantificar um analito. Um analito, tal como a glucose, por exemplo, difundir-se-á para o interior da matiz do hidrogel e deslocará a molécula repórter, anteriormente ligada ao elemento de reconhecimento.
Determinou-se a modulação da fluorescência do composto indicador (que contém dois elementos de reconheci- 50 ΡΕ1490350 mento), preparado neste exemplo, pela glucose e pelo lactato. Esta experiência foi conduzida num espectrofluo-rímetro Shimadzu RF-5301 PC equipado com um acessório de temperatura variável (excitação a 470 nm, fendas 5/10 nm, baixa sensibilidade). O gel de acrilamida foi ligado a uma lâmina de vidro que se colou numa célula PMMA para fluorescência, num ângulo de 45°. Encheu-se a célula com 2,5 mL de PBS (pH =7,4) e aqueceu-se a 37°C num banho de água. Preparou-se uma solução mãe de lactato de sódio (100 mM) em PBS (pH = 7,4) e aqueceu-se a 37°C num banho de água. Prepararam-se soluções mãe de glucose (100 mM e 500 mM) em PBS (pH = 7,4) e aqueceram-se a 37°C em banho de água. Adicionou-se periodicamente uma aliquota de solução mãe de lactato aquecido à célula de PMNA, enquanto se monitorizava a intensidade da fluorescência a 550 nm, em função do tempo (1 medição cada 2 minutos), até a concentração de lactato atingir 8 mM. Adicionou-se, depois, periodicamente uma aliquota de solução mãe de glucose aquecida à célula de PMNA, enquanto se monitorizava a intensidade da fluorescência a 550 nm, em função do tempo (1 medição cada 2 minutos) . A concentração de glucose na célula de PMNA foi medida utilizando um analisador de glucose YSI, modelo 2300 STAT plus. Os resultados, mostrados na Figura 11, mostram que a adição de lactato não teve efeito significativo sobre a intensidade de fluorescência do hidrogel indicador, e a subsequente adição de glucose reduziu a intensidade da fluorescência do hidrogel indicador. O mesmo efeito é observado na Figura 10. ΡΕ1490350 51
Exemplo 7
Monómero isolado de metacrilato de bis-boronato-antraceno α
A. Sal cloridrato de 9-clorometil-10-[[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]antraceno
Adicionou-se 2-(2-aminoetoxi)etanol (0,495 g, 0,475 mL, 4,71 mmol) a uma suspensão de 9,10-bis(cloro-metil)antraceno (5,18 g, 18,8 mmol, 3,99 equiv.) em 200 mL de NMP. Agitou-se a mistura no escuro durante 17 horas. Concentrou-se então a mistura reaccional até ~50 mL, sob vacuo a 50°C. Purificou-se o residuo por cromatografia em sílica gel (150 g, sílica gel de gravidade, 0-10% de CH2OH/CH2CI2) para dar 0,425 g (24%) de um sólido amarelo alaranjado. TLC: placas Merck sílica gel 60, Rf 0,72 com 70/30 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366), coloração com ninhidrina. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Vydac 52 ΡΕ1490350 201ΤΡ, 10 χ 250 mm, injecção de 0,100 mL, 2 mL/min., detecção a 370 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MECN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 16,1 min.
B. 9-[[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]-10- [[(3-metacrilamido)propilamino]metil]antraceno
Adicionou-se, gota a gota, uma solução de sal cloridrato de 9-clorometil-10-[[2-(2-hidroxietoxi)-etil-amino]metil]antraceno (1,56 g, 4,10 mmol) em 25 mL de CHCI3 a uma suspensão de sal cloridrato de N-(3-aminopropil)-metacrilamida (3,08 g, 17,2 mmol, 4,2 equiv.), DIEA (5,19 g, 7,00 mL, 40,1 mmol, 9,8 equiv.) e ~3 mg de BHT em 125 mL de CHCI3 a 25°C. Subsequentemente, agitou-se a mistura no escuro durante 92 horas. Filtrou-se então a mistura reaccional e lavou-se com 2 x 40 mL de NaHCCb (solução aquosa saturada). Secou-se o extracto orgânico sobre Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se para dar um sólido laranja pegajoso que foi purificado por cromatografia em alumina (50 g de alumina neutra activada, 0-5% de CH3OH/CH2CI2) para dar 0,364 g (20%) de um sólido laranja. 53 ΡΕ1490350 TLC: placas Merck sílica gel 60, Rf 0,16 com 70/30 de CH2C12/CH30H, observado com UV (254/366), coloração com ninhidrina. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Vydac 201TP, 10 x 250 mm, injecção de 0,100 mL, 2 mL/min., detecção a 370 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MECN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 16,85 min.
‘-Ar C. 9-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2- il)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metil]antraceno (Monómero simples de metacrilamida) 54 ΡΕ1490350
Agitou-se no escuro, durante 25 horas, uma solução de 9-[ [2-(2-hidroxietoxi)etilamino]metil]-10-[[(3-metacrilamido)propilamino]metil]antraceno (0,343 g, 0,763 mmol), DIEA (0,965 g, 1,30 mL, 9,8 equiv.) e ester neopen-tílico do ácido (2-bromometilfenil)borónico (1,09 g, 3,85 mmol, 5,0 equiv.) em 20 mL de CHCI3, a 23°C. Concentrou-se então a mistura reaccional, inicialmente por evaporação rotativa, depois utilizando uma bomba de vácuo para remoção de DIEA. Purificou-se o resíduo cromatografia em coluna de alumina (40 g de alumina neutra activada, 0-10% de CH3OH/CH2CI2) para dar 0,299 g (46%) de um sólido amarelo alaranjado. Este composto pode ser copolimerizado com um monómero adequado, como descrito anteriormente, desprotegido e utilizado para detectar a glucose. FAB MS: Cale. para C5iH65B2N307: [M]+ 854; Encon trado [M+l]+ 855. TLC: placas Merck de alumina básica, Rf 0,35 com 95/5 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366). HPLC: cromatografo de HPLC HP 1100, coluna Vydac 201TP, 10 x 250 mm, injecção de 0,100 mL, 2 mL/min., detecção a 370 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MECN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 19,7 mm. ΡΕ1490350 55
Exemplo δ
Monómero duplo de metacrilato de bis-boronato-antraceno
A. 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxa-bori-nan-2-il)benzil]-N-[2-(2-metacroiloxietoxi)etilamino]-metil]antraceno
Agitou-se uma solução de 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[2-(2-hidroxi-etoxi)etilamino]metil]antraceno (0,100 g, 0,120 mmol; ver Exemplo 2), ácido metacrilico (0,112 g, 0,110 mL, 1,30 mmol, 10,8 equiv.), DCC (0,316 g, 1,53 mmol, 12,8 equiv.) e N,N-dimetilamino-piridina (0,014 g, 0,11 mmol, 0,92 equiv.) em 5 mL de CH2CI2, durante 1 hora a 0°C e depois a 23°C durante 22 horas. Filtrou-se então a mistura reaccional e concentrou-se por evaporação rotativa. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de alumina (30 g de 56 ΡΕ1490350 alumina activada neutra, 0-2% CH3OH/CH2CI2) para dar 0, 030 g (26%) de um sólido amarelo. Este composto pode ser copolimerizado com um monómero adequado, como descrito anteriormente, desprotegido e utilizado para detecção de glucose. FAB MS: Cale. para C56H70B2N2O10: [M]+ 953; Encon trado [M]+ 951 (pico de ião molecular fraco). TLC: placas Merck de alumina básica, Rf 0,67 com 95/5 de CH2C12/CH30H, observado com UV (254/366). HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna
Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,100 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção: 2 mL, detecção a 370 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 19,6 min.
Exemplo 9 5-Aminopentilo duplo de bis-boronato-antraceno
57 ΡΕ1490350 A. 9,10-bis[[5-(t-BOC)-aminopentilamino]metil]- antraceno
Agitou-se no escuro, durante 2 dias, a 45°C, uma suspensão de 9,10-bis(clorometil)antraceno (0,28 g, 1 mmol), DIEA (7,0 mL, 40 mmol), mono-t-butoxicarbonilo 1,5-diaminopentano (3,75 g, 10 mmol) em 50 mL de CHCI3. Lavou-se a solução com solução aquosa saturada de NaHC03, secou-se a fase orgânica (Na2S04) e evaporou-se o solvente. Purificou-se o residuo por cromatografia em alumina (40 g de alumina neutra activada, 95/5% em volume de CH2Cl2/MeOH) para dar 0,55 g de um óleo viscoso. Este óleo foi utilizado sem processamento adicional no passo seguinte.
B. 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxabo- rinan-2-il)benzil]-N-[5-(t-BOC)-aminopentilamino]metil]-antraceno 58 ΡΕ1490350
Agitou-se no escuro, durante 2 dias, a 25°C, uma solução de 9,10-bis[[5-(t-BOC)-aminopentilamino]metil]-antraceno (0,3 g, 0,49 iranol) , DIEA (0,35 mL, 2 mmol) e ester neopentílico do ácido (2-bromometilfenil)borónico (0,566 g, 2,0 mmol) em 20 mL de CH2CI2. Concentrou-se então a mistura reaccional in vacuo e purificou-se o resíduo por cromatografia em alumina (60 g de alumina neutra activada, 98/2% em volume de CH2Cl2/MeOH) para dar 0,401 g de um óleo amarelo. Este óleo foi utilizado sem processamento adicional no passo seguinte. a»
C. Sal 9,10-bis[N-(2-boronobenzil)-N-[5—amino- pentilamino]metil]antraceno do ácido trifluoroacético
Dissolveu-se 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetil-[1,3,2]— dioxaborinan-2-il)benzil]-N-[5-(t-BOC)aminopentilamino]-metil] antraceno (0,4 g, 0,39 mmol) em 20 mL de CH2C12/TFA 59 ΡΕ1490350 (80/20% em volume). Agitou-se a solução durante 12 horas, evaporou-se o solvente e lavou-se o resíduo com 10 mL de éter. Obtiveram-se um total de 3 73 mg (72% de rendimento) de sólido. 0 produto tinha uma pureza de -80%, segundo RP-HPLC. Este composto pode ser copolimerizado com um monómero adequado, como descrito anteriormente, desprotegido e utilizado para detecção de glucose. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,050 mL, 0,75 mL/min., detecção a 360 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 16,0 min.
Exemplo 10 i-aoc HN^
60 ΡΕ1490350 A. N-2-(terc-butiloxicarbonil)aminoetil-4-bromo-naftaleno-1,8-dicarboximida
Combinaram-se N-t-Boc-etilenodiamina (Fluka, 1,6 g, 10 mmol) e anidrido 4-bromo-l,8-naftálico (Aldrich, 2,77 g, 10 mmol) com 60 mL de etanol anidro, agitou-se a suspensão a 60°C durante 20 horas, arrefeceu-se até à temperatura ambiente e filtrou-se. Lavou-se o sólido obtido com 30 mL de EtOH frio e secou-se sob vácuo.
Rendimento: 3,84 g (91%). RMN (CDC13) : 1,28 (9H, s); 3,52 (2H, t); 4,35 (2H, t); 4,92 (1H, s); 7,84 (1H, t); 8,04 (1H, d); 8,42 (1H, d); 8,58 (1H, d); 8,67 (1H, d).
B. N-2-(terc-butiloxicarbonil)aminoetil-4-(Ν'-metilaminoetilamino)naftaleno-1,8-dicarboximida
Combinou-se N-metiletilenodiamina (1,48 g, 20 mmol) com 2 mL de l-metil-2-pirrolidinona (NMP), seguindo-se a adição de N-2-(terc-butiloxicarbonil)aminoetil-4-bromonaftaleno-1,8-dicarboximida (0,35 g, 0,845 mmol). Agitou-se a solução resultante a 45°C durante 40 horas, 61 ΡΕ1490350 após o que se evaporaram, sob vácuo, a NMP e a N-metiletilenodiamina. Sujeitou-se o resíduo obtido a cromatografia em coluna (20 g de sílica gel, inicialmente CH2Cl2/MeOH (90/10), depois CH2Cl2/MeOH/Et3N (75/20/5). Obteve-se um sólido amarelo (0,311 g, 89% de rendimento). A pureza foi verificada por RP-HPLC.
C. Sal N-aminoetil-4-(N'-aminoetilene-N''-[2- (borono)benzil]metilamino)naftaleno-1,S-dicarboximida de ácido trifluoroacético
Combinaram-se N-2-(terc-butiloxicarbonil)amino-etil-4-(Ν'-metilaminoetilamino)naftaleno-1,8-dicarboximida (0,3 g, 0,73 mmol), ester pinacólico do ácido 2-bromometilfenil borónico (0,6 g, 2 mmol), N,N-diisopropil-N-etilamina (1,3 mL, 8 mmol) e 10 mL de CH2C12. Agitou-se a solução durante 20 horas, seguindo-se a adição de 2 g de resina PS-Trisamine (Argonaut Technologies, 3,28 mmol/g). Agitaram-se a mistura reaccional e a resina durante 10 horas, após o que se removeu a resina por filtração. E lavou-se com CH2C12 (2 x 20 mL). Evaporaram-se as soluções combinadas de CH2C12 e secaram-se sob vácuo. 62 ΡΕ1490350
Adicionou-se ao resíduo laranja resultante, uma solução de cloreto de metileno contendo 20% em volume de TFA e 5% em volume de triisopropil silano. Agitou-se a solução resultante à temperatura ambiente durante 10 horas, após o que se evaporou o solvente e se triturou o resíduo com éter para se obter um sólido amarelo. Filtrou e secou-se o sílido in vacuum (rendimento: 580 mg) . A pureza do material foi verificada por RP-HPLC. 0 sólido foi utilizado sem outro processamento no passo seguinte. D. N-(3-Borono-5-nitrobenzamido)etil-4-(N'-amino-etileno-N''—[2—(borono)benzil]metilamino)neftaleno-1,8-dicarboximida separou-se
Combinaram-se sal N-aminoetil-4-(N'-aminoetilene-N' ' — [2 —(borono)benzil]metilamino)naftaleno-l,8-dicarboxi-mida de ácido trifluoroacético (0,225 g, 0,4 mmol), ácido 3-carboxi-5-nitrofenilborónico (0,085 g, 0,4 mmol), dife-nilfosforilazida (0,13 mL, 0,6 mmol) e 2 mL de DMF anidro. Adicionou-se N,N-diisopropil-n-etil amina (0,7 mL, 4 mmol) a agitou-se a solução durante 20 horas. Adicionou-se éter (10 mL) à mistura reaccional, separou-se o resíduo 63 ΡΕ1490350 insolúvel e tratou-se com ultrasons com 5 mL de CH2C12, para dar um sólido laranja que se filtrou e secou sob vácuo (38 mg, 15% de rendimento). A pureza do sólido foi verificada por RP-HPLC. RMN (dmso-d6/D20, 90/10): d 2,32 (3H, s) ; 2, 82 (2H, t) ; 3,58 (2H, t); 3,65 (2H, t) ; 3, 70 (2H, s) ; 6,65 (1H, d) ; 7,0-7,3 (4H, m) ; 7,68 (1H, t) ; 8,18 \—1 d) ; 8,42 (1H, d) ; 8,47 (1H, d); 8, 1-8,35 (3H, m) . E. Teste de N-(3-borono-5-nitrobenzamido)etil-4-(N'-aminoetileno-N''—[2—(borono)benzil]metilamino)-nefta-leno-1,8-dicarboximida quanto à interacção com glucose, monitorizado pela fluorescência
Esta experiência foi conduzida em MeOH/solução salina tamponada com fosfato (PBS, 10 mM, pH=7,4). A concentração de N-(3-borono-5-nitrobenzamido)etil-4-(Ν'-aminoetileno-N' ' — [2 —(borono)benzil]metilamino)neftaleno-1,8-dicarboximida em MeOH/PBS (50/50% em vol.) era de 15 M. A concentração de glucose variou de 0 mM a 50 mM e a concentração de L-lactato de sódio variou de 0 mM a 7 mM. A experiência foi conduzida espectrofluorimetro Shimadzu RF-5301 PC: comprimento de onda de excitação regulado para 430 nm, a emissão foi monitorizada no intervalo 480-650 nm, largura de fenda, 3/1,5 nm, alta sensibilidade de PMT.
Os resultados são mostrados nas Figuras 12 e 13, que mostram que a fluorescência do indicador deste exemplo foi afectada pela presença de glucose, mas não pela presença de lactato. ΡΕ1490350 — 64 —
Exemplo 11
Monómero indicador 6-(ciclo-hexanocarboxamido)hexilamina
A. 9-[N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-ΙΟ Ν- [(6-amino-hexilamino)metil]antraceno
Adicionou-se 9,10-bis(clorometil)antraceno (0,150 g, 0,545 mmol) a uma solução de 3-aminopropilmetacrilamida (0,775 g, 5,45 mmol, 10,0 equiv.) e N-(6-amino-hexil)car-bamato terc-butilico (1,18 g, 5,45 mmol, 10,0 equiv.) e vários cristais de BHT, em 200 mL de CHCI3. Agitou-se a mistura reaccional no escuro e à temperatura ambiente durante 4 dias. No fim deste período, o CHCI3 tinha evaporado e dissolveu-se o resíduo em 100 mL de éter. Extraiu-se a camada orgânica com 8 x 125 mL de solução aquosa saturada de NaHCCd e 5 x 200 mL de tampão fosfato (0,4 M, pH 7,0). Ajustou-se o pH das lavagens combinadas de tampão fosfato para pH 11 por adição de solução aquosa 65 ΡΕ1490350 saturada de Na2CC>3, seguido por extracção com 5 x 300 mL de CH2CI2. Concentraram-se as camadas orgânicas combinadas e dissolveu-se o resíduo em 5 mL de uma solução a 20% de TFA em CH2CI2. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 horas. Extraiu-se depois a mistura reaccional com 4 x 10 mL de solução aquosa saturada de NaHCCh. Ajustou-se o pH das camadas aquosas combinadas com solução aquosa saturada de Na2CC>3, para pH 11, seguido por extracção com 4 x 75 mL de CH2CI2. Secaram-se os extractos orgânicos combinados sobre Na2SC>4 anidro, filtrou-se e concentrou-se in vacuo para dar 0,068 g (27%) de produto. TLC: a) Placas Merck de sílica gel 60, Rf 0,16 com 70/30 de CH2C1 2/CH3OH, observado com UV (254/366) , antes da desprotecção; Rf 0,27 com 85/14,5/0,5 de CH2C1 2/CH3OH/ iPrNH2, observado com UV (254/366), produto final. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters, NovaPak HR C18, 8 x 100 mm, injecção de 0,100 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 0,400 ml, detecção a 360 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 15,5 min.
66 ΡΕ1490350 Β. 9-[Ν-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10- [N-[6-(ciclo-hexanocarboxamido)hexilamino]metil]antraceno
Adicionou-se gota a gota, ao longo de uma hora, uma solução de ester N-hidroxisuccinimídico do ácido ciclo-hexanocarboxílico (0,845 g, 3,76 mmol, 1,03 equiv.) a uma solução de 9-[N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-N-[(6-amino-hexilamino)metil]antraceno (1,68 g, 3,63 mmol) e alguns cristais de BHT em 20 mL de CH2C12, à temperatura ambiente. Agitou-se depois a reacção no escuro e à temperatura ambiente, durante 16 horas. Concentrou-se então a mistura reaccional in vacuo e dissolveu-se o residuo em 105 mL de uma solução 90/15 de éter/CH2Cl2. Extraiu-se a camada orgânica com 4 x 225 mL de tampão fosfato (0,4 M, pH 7,0) . A
Ajustou-se o pH das lavagens combinadas de tampão fosfato para pH 11 por adição de solução aquosa saturada de Na2C03, seguido por extracção com 6 x 500 mL de CH2C12. Secaram-se os extractos orgânicos combinados sobre Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se in vacuo para dar 1,2 g (60%) de produto. TLC: Placas Merck de sílica gel 60, Rf 0,30 com 85/14,5/0,5 de CH2Cl2/CH3OH/iPrNH2, observado com UV (254/366) . coluna HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100 67 ΡΕ1490350
Waters, NovaPak HR C18, 8 x 100 mm, injecção de 0,100 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 0,400 ml, detecção a 360 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 17,4 min.
C. 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)- propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(ciclo-hexenocarboxilamido)hexilamino]metil]antraceno
Agitou-se no escuro, à temperatura ambiente e durante 16 horas, uma solução de 9-[N-[3-(metacrilamido)-propilamino]metil]-10-[N-[6-(ciclo-hexano-carboxamido)hexilamino ] metil ] antraceno (1,0 g, 1,8 mmol), DIEA (1,81 g, 2,44 mL, 14,0 mmol, 7,8 equiv.), ester pinacólico de ácido 2-bromometilfenilborónico e alguns cristais de BHT em 30 mL de CHCI3. Concentrou-se depois o a mistura reaccional e suspendeu-se o resíduo, (9-[N-[2-(4,4,5,5—tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)benzil]-N-[3-(meta-crilamido)propilamino]-metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5—tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)-benzil]-N-[6-(ciclo-hexanocarboxamido)hexilamino]metil]- 68 ΡΕ1490350 antraceno, em 150 mL de éter. Lavou-se a camada orgânica com 4 x 50 mL de tampão fosfato (0,4 M, pH 7,0). Concentrou-se a camada orgânica e dissolveu-se o resíduo dissolvido em éter, em 200 mL de HC1 aquoso, 0,1 N. Lavou-e a camada aquosa com 3 x 50 mL de éter: acetato de etilo 1:1, e ajustou-se o pH para 11 por adição de solução aquosa saturada de Na2C03, seguindo-se a extracção com 3 x 150 mL de CH2CI2. Secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre Na2S04 anidro, filtrou-se e concentrou-se in vacuo para dar um composto oleoso vermelho. Dissolveu-se o resíduo em éter e concentrou-se in vacuo para dar 1,17 g (85%) de um produto sólido amarelo. TLC: Placas Merck de sílica gel 60, Rf 0,59 com 80/20 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366). HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters, NovaPak HR C18, 8 x 100 mm, injecção de 0,100 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 0,400 ml, detecção a 360 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 19,6 min. 1H RMN (d6-acetona/D20, 9:1): δ 0,90 (m, 2H), 1,03 (m, 2H), 1,18-1,30 (m, 6H) , 1,35-1, 48 (4H), 1,62 (m, 1H, 0=C-CH(CH2)CH2) , 1,66-1, 75 (m, 7H) , 1,77 (m, 2H, N-CH2-CH2-CH2-N) , 2,52 (m, 2H, N-CH2-CH2-) , 2,63 (m, 2H, N-CH2-CH2-) , 2,98 (m, 4H, -CH2-NH-C=0) , 3,98 (s, 4H, benzeno-CH2-N) , 69 ΡΕ1490350 4,57 (s, 2H, antraceno-CH2-N) , 4,59 (s, 2H, antraceno-CH2- N) , 5,20 (t, 1H, J = 1,5 Hz, C=CH2) , 5,46 (s, 1H, C=CH2) , 7,4-7,5 (m, 8H, Ar-H), 7,52 (m, 2H, Ar-H), 7,95 (m, 2H, Ar-H), 8,23 (m, 4H, Ar-H). D. Hidrogel de Ν,Ν-dimetilacrilamida com 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(ciclohexenocarboxilamido)-hexilamino]metil]antraceno
Preparou-se uma solução de Ν,Ν-dimetilacrilamida (40% em peso) e de N,N'-metilenebisacrilamida (0,8% em peso) em tampão fosfato, pH 7, 4, 200 mM. Combinaram-se 9- [N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]metil] -10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(ciclohexenocarboxil-amido)-hexilamino]metil]antraceno (18 mg, 2,15 x 10-5 mol) e 60 mg de frutose com 2 mL de MeOH. Tratou-se esta solução com ultrasons até toda a frutose se ter dissolvido e subsequentemente, evaporou-se para dar um sólido. A este sólido adicionou-se 1 mL de solução tampão de fosfato contendo monómeros. Após tratamento com ultrasons durante 10 minutos, filtou-se esta solução através de membrana de PTFE de 0,2 μιη. Combinou-se persulfato de amónio aquoso (20 mL, 5% em peso) com a formulação. Colocou-se a solução resultante numa caixa de luvas purgada com azoto. Adicionou-se uma solução aquosa de N,N,N',N'-tetrametiletilenediamina (40 μL, 5% em peso) à formulação de monómero para acelarar a polimerização. Verteu-se a formulação resultante num molde construído lâminas de vidro para microscopia e um 70 ΡΕ1490350 espaçador, de aço inoxidável, de 100 μΜ vidro. Depois de ser ter deixado o molde sob atmosfera de azoto durante 8 horas, separaram-se as lâminas de vidro e removeu-se o hidrogel. Lavou-se o hidrogel com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1 mM de sal sódico de lauril sulfato e 1 mM de sal tetrasódico de EDTA, durante 3 dias, sendo a solução mudada diariamente, seguido por lavagem com EtOH/PBS (20/80 em volume, 3 x 100 mL) e finalmente com PBS (pH = 7,4, 3 x 100 mL) . A película de hidrogel resultante foi mantida em PBS (pH = 7,4), contendo 0,02% em peso de azida de sódio e 1 mM de sal tetrasódico de EDTA. E. Modulação de Fluorescência com Glucose
Determinou-se a modulação da fluorescência do indicador 6-(ciclo-hexanocarboxamido)hexilamina/película de hidrogel de DMA preparado neste exemplo, pela glucose e pelo lactato. A Figura 14 mostra a emissão de fluorescência relativa (I a 430 nm) da película de hidrogel em PBS (pH 7,4, contendo 0,02% de NaN3 e 1 mM de EDTA), contendo 0 a 20 mM de a-D-glucose, 0 a 10 mM de L-lactato de sódio e 0-10 mM de α-D-glucose, em presença de 4 mM de L-lactato de sódio. A película de hidrogel (100 μιη de espessura, disco com 8 mm de diâmetro) foi montada num ângulo de 45a, numa cuvete para PMMA. Todas as medidas foram efectuadas a 37°C num espectrofluorémetro Shimadzu RF-5301 com excitação a 370 nm (fenda = 3 nm)e emissão a 430 nm (fenda = 3 nm) , em baixa sensibilidade PMT. Verificaram-se as concentrações de 71 ΡΕ1490350 glucose e de L-lactato de sódio utilizando um analisador de glucose YSI Model 2300 STAT plus. As barras de erro são desvios padrão com valores em triplicado para cada ponto. A fluorescência foi afectada pela presença de glucose, mas não pela presença de lactato. Adicionalmente, a presença de lactato (4 mM) não teve efeito significativo sobre a curva de calibração 0-20 mM da glucose.
Exemplo 12
Monómero indicador 2-(carboxietil)amina
Nome químico: 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(meta-crilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxietil)amino]metil]antraceno (não protegido). Fórmula química: C40H45B2N3O7 P.M.: 701,4
Aspecto físico: pó amarelo pálido 72 ΡΕ1490350
Solubilidade: PBS/metanol, metanol, etanol, clorofórmio, diclorometano
Indicador protegido: 9-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano) benzil] -N-[2-(carboxietil)amino]metil]antraceno I. Síntese
A. 9-[N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(terc-butoxicarbonil)etilamino]metil]antraceno
Adicionou-se 9,10-bis(clorometil)antraceno (5,00 g, 18,2 mmol) a uma solução de 3-aminopropilmetacrilamida (12,9 g, 90,7 mmol 4,99 equiv.), ester terc-butilico de β-alanina (13,2 g, 90,9 mmol, 5,00 equiv.) e vários cristais de BHT em 700 mL de CHCI3. Agitou-se a mistura reaccional no escuro, a 30°C, durante 88 horas. Evaporou-se então o CHCI3 e dissolveu-se o resíduo em 500 mL de éter. Agitou-se a solução durante 1 hora, altura em que os sais precipitaram da solução. Filtrou-se a solução de éter e extraiu-se subsequentemente com 10 x 350 mL solução aquosa saturada de NaHCCL. Extraiu-se ainda a camada de éter com 6 73 ΡΕ1490350 χ 350 mL de tampão fosfato (0,2 M, pH 6,5). Ajustou-se o pH das lavagens com tampão fosfato para pH 11-12 por adição de Na2CC>3 (solução aquosa saturada), seguido por xtracção com 6 x 500 mL de CH2C12. Secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se in vacuo para dar um produto cru oleoso. Purificou-se o produto cru por cromatografia em sílica gel (50 g de sílica gel para cromatografia com pressão de azoto, gradiente em passo de 0-5% de MeOH/CH2Cl2) para dar 2,04 g de um sólido pegajoso amarelo (23%). TLC: Placas Merck de sílica gel 60, Rf 0,29 com 90/10 de CH2CI2/CH3OH, observado com UV (254/366), coloração com ninhidrina. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,100 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,500 ml, detecção a 280 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 17,0 min.
74 ΡΕ1490350 Β. 9-[Ν-[2-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaboro-lano)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]-metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolano)-benzil]-N-[2-(terc-butoxocarbonil)etilamioamino]metil]-antraceno
Agitou-se no escuro, à temperatura ambiente, durante 16 horas, uma solução de 9-[N-[3-(metacrilamido )propilamino]metil]-10-[N-[2-(terc-butoxicarbonil)etil-amino]metil]antraceno (1,5 g, 3,1 mmol), DIEA (3,16 g, 4,36 mL, 24,4 mmol, 7,9 equiv.), ester pinacólico do ácido 2-bromometilfenilborónico (3,64 g, 12,2 mmol, 3,9 equiv.) e alguns cristais de BHT, em 50 mL de CHCI3. Concentrou-se então a mistura reaccional e suspendeu-se o resíduo em 200 mL de éter. Extraiu-se a camada de éter com 3 x 125 mL de tampão fosfato (0,2 M, pH 7,0), secou-se sobre Na2SC>4 anidro, filtrou-se e concentrou-se in vacuo para dar um produto cru. Triturou-se o resíduo com hexanos para dar 2,14 g (76%) de um sólido branco. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna
Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,200 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,500 ml, detecção a 280 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 19,2 min. 75 ΡΕ1490350
C. 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)- propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxi-etil)amino]metil]antraceno
Agitou-se no escuro, à temperatura ambiente, durante 22 horas, uma solução de 9-[N-[2-(4,4,5,5-tetra-metil-1,3,2-dioxaborolano)benzil]-N-[3-(metacril-amido)-propilamino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-l, 3,2-dioxaborolano)-benzil]-N-[2-(terc-butoxicarbonil)-etilami-no]metil]antraceno (0,294 g, 0,319 mmol) em 5 mL de 20% de TFA/CH2CI2. Concentrou-se então a mistura reaccional e o resíduo triturado com éter. Dissolveu-se o resíduo em 5 mL de acetona/água, 90:10, e agitou-se durante 2 horas. Concentrou-se depois a mistura reaccional e triturou-se o resíduo com água e PBS (pH 7,4, contendo 0,02% de NaN3 e 1 mM de EDTA). Resultando na recuperação de 0,062 g (28%) de um sólido amarelo claro. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna
Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,100 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 1,500 ml, detecção a 280 76 ΡΕ1490350 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 17,4 min. FAB MS: matriz de glicerol: Cale. para C46H53B2N3O7 (aducto bis-glicerol) [M]+ 813; Encontrado [M + 2]+ 815. D. Hidrogel de N,N-dimetilacrilamida com 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxietil)amino]metil]antraceno
Preparou-se uma solução de N,N-dimetilacrilamida (40% em peso) e N,N'-metilenobisacrilamida (0,8% em peso) em tampão fosfato, pH = 7,4, 200 mM. Combinaram-se 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxietil)amino]metil]antraceno (14 mg, 2,0 x 10-5 mol) e 60 mg de frutose, em 2 mL de MeOH. Tratou-se esta solução com ultrasons até toda a frutose se ter dissolvido e evaporou-se para dar um sólido. A este sólido adicionou-se 1 mL de solução tampão de fosfato contendo monómeros. Após tratamento com ultrasons durante 10 minutos, filtou-se esta solução através de um filtro de membrana de PTFE de 0,2 μιη. Combinou-se persulfato de amónio aquoso (20 mL, 5% em peso) com a formulação. Colocou-se a solução resultante numa caixa de luvas purgada com azoto. Adicionou-se uma solução aquosa de N,N,N',N'-tetrametiletilenediamina (40 μL, 5% em peso) à formulação de monómero para acelarar a polimerização. 77 ΡΕ1490350
Verteu-se a formulação resultante num molde construído lâminas de vidro para microscopia e um espaçador, de aço inoxidável, de 100 μΜ. Depois de ter sido mantido sob atmosfera de azoto durante 8 horas, colocou-se o molde em solução salina tamponada com fosfato (10 mM, pH= 7,4), separaram-se as lâminas de vidro e removeu-se o hidrogel. Lavou-se o hidrogel com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1 mM de sal sódico de lauril sulfato e 1 mM de sal tetrasódico de EDTA, durante 3 dias, sendo a solução mudada diariamente, seguido por lavagem com EtOH/PBS (20/80 em volume, 3 x 100 mL) e finalmente com PBS (pH = 7,4, 3 x 100 mL) . A película de hidrogel resultante foi mantida em PBS (10 mM, pH = 7,4), contendo 0,02% em peso de azida de sódio e 1 mM de sal tetrasódico de EDTA. II. Modulação da Fluorescência com Glucose
Determinou-se a modulação da fluorescência do indicador 2-(carboxietil)amina/película de hidrogel de DMA preparado neste exemplo, pela glucose e pelo lactato. A Figura 15 mostra a emissão de fluorescência relativa (I a 430 nm) da película de hidrogel em PBS (pH 7, 4, contendo 0,02% de NaN3 e 1 mM de EDTA), contendo 0 a 20 mM de a-D- glucose, 0 a 10 mM de L-lactato de sódio e 0-20 mM de glucose, em presença de 3 mM de L-lactato de sódio. A película de hidrogel (100 μιη de espessura, disco com 8 mm de diâmetro) foi montada num ângulo de 45°, numa cuvete para PMMA. Todas as medidas foram efectuadas a 37°C num espectrofluorémetro Shimadzu RF-5301 com excitação a 370 nm 78 ΡΕ1490350 (fenda = 3 nm) e emissão a 430 nm (fenda = 3 nm) , em baixa sensibilidade PMT. Verificaram-se as concentrações de glucose e de L-lactato de sódio utilizando um analisador de glucose YSI Model 2300 STAT plus. Os dados são registados como a media de valores em triplicado para cada ponto. A fluorescência foi afectada pela presença de glucose, mas não pela presença de lactato. Adicionalmente, a presença de lactato (4 mM) não teve efeito significativo sobre a curva de calibração 0-20 mM da glucose.
Exemplo 13
Indicador fluorescente de glucose contendo dois grupos de detecção
Nome químico: 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(meta-crilamido)propilamino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(N-6-(9-antracenecarboxamido)hexilaminocarbonil)etil-amino]metil]antraceno (não protegido) 79 ΡΕ1490350 Fórmula química: C73H87B2N5O7 Aspecto físico: pó amarelo claro
Solubilidade: PBS/metanol, metanol, etanol, clorofórmio, diclorometano
Composto protegido com pinacol: 9 —[N—[2 —(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)benzil]-N-[3-(metacril-amido)propilamino]-metil]-10-[N-[2 —(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano)-benzil]-N-[3-(N-6-(9-antracenecar-boxamido)hexilaminocarbonil)etil-aminometil]antraceno. I. Síntese
A. Cloreto de 9-antracenoílo:
Combinou-se ácido antraceno-9-carboxílico (1,2 g, 5,4 x 1CT3 mol) com 15 mL de cloreto de tionilo. Aqueceu-se a solução em refluxo durante 2 horas, seguido por evaporação dos componentes voláteis. Secou-se o sólido obtido sob vácuo elevado, durante 24 horas, para dar 1,3 g de material (rendimento quantitativo). Este material foi utilizado sem processamento adicional no passo seguinte. 80 ΡΕ1490350
B. Sal N(6-amino-hexil)-antracene-9-carboxamida do ácido clorídrico
Adicionou-se gota a gota, cloreto de 9-antrace-noílo (1,3 g, 5,4 inmol) em 50 mL de CH2CI2 anidro, a 11,6 g de hexametilenediamina (100 mmol) em 100 mL de CH2CI2 a 0°C. Agitou-se a solução durante 1 hora a 0°C, deixou-se aquecer até à temperatura ambiente e agitou-se até ao dia seguinte. Evaporou-se o solvente e adicionaram-se 200 mL de água ao resíduo. Tratou-se esta mistura com ultrasons, agitou-se durante 1 hora e filtrou-se. Secou-se o sólido filtrado, sob vácuo, durante 24 horas. Adicionaram-se ao sólido MeOH (50 mL) e 2 mL de HC1 concentrado, seguindo-se a evaporação do MeOH. Lavou-se o sólido resultante com CH2Cl2/MeOH quente (90/10, % em volume) e recristalizou-se a partir de MeOH, dando 0,51 g de produto (26%) . A pureza do produto foi verificada por HPLC. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,1 mL, 0,75 mL/min., "loop" de injecção, 2 mL, detecção a 280 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA), gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 81 ΡΕ1490350 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 16,5 min.
C. 9-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaboro- lano)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolano)-benzil]-N-[3-(N-6-(9-antracenecarboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino-metil]antraceno
Combinaram-se 9-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaboro-lano)benzil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]-metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolano)-benzil]-N-[2-carboxietilamino]metil]antraceno (40 mg, 4,5 x 10~5 mol) com sal N-(6-amino-hexil)-antraceno-9-carboxamida do ácido clorídrico (20 mg, 5,6 x 10“5 mol), difenilfos-forilazida (15,4 mg, 5,6 x 10~5 mol) e 2 mL de DMF. Adicionou-se diisopropilet ilamina (39 20 mL, 2,44 x 10~4 mol) à mistura e agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 24 horas. Evaporou-se o DMF sob vácuo elevado, 82 ΡΕ1490350 dissolveu-se o resíduo em 50 mL de EtOAC e lavou-se com água (3 x 10 mL). Separou-se a solução com EtOAc, secou-se (Na2S04) e evaporou-se, produzindo 46 mg de sólido (87% de rendimento). A pureza do material foi verificada por HPLC. HPLC: cromatógrafo de HPLC HP 1100, coluna
Waters, NovaPak HR C18, 5 x 100 mm, injecção de 0,1 mL, 0,75 mL/min.de débito, "loop" de injecção, 2 mL, detecção a 280 nm, A = água (com 0,1% de HFBA) e B = MeCN (com 0,1% de HFBA) , gradiente 10% de B durante 2 min., 10-80% de B ao longo de 18 min., 80-100% de B ao longo de 2 min., 100% de B durante 2 min., tempo de retenção, 20,42 min. FAB MS, matriz de glicerol: Calculada para C67H75B2N3O9 (aducto bis-glicerol) [M]+ 1116; Encontrado [M+l]+ 1117. II. Efeito da glucose sobre a fluorescência do indicador imobilizado na palícula de hidrogel
Preparação de hidrogel de ΗΕΜΆ/ácido metacrilico com indicador de glucose
Preparou-se uma solução a 50% em peso de 2-hidroxietilmetacrilato (4,75 g) e ácido metacrilico (0,25 g) em tampão fosfato, pH=7,4, 200 mM. Combinaram-se o indicador de glucose (11 mg, 1,0 x 10-5 mol) e 60 mg de frutose com 2 mL de MeOH. Tratou-se esta solução com ultrasons até toda a frutose se ter dissolvido e evaporou- 83 ΡΕ1490350 se para dar um sólido. A este sólido adicionou-se 1 mL de solução tampão de fosfato contendo monómeros. Após tratamento com ultrasons durante 10 minutos, filtou-se esta solução através de membrana de PTFE de 0,2 μπι. Combinou-se persulfato de amónio aquoso (20 μΕ, 5% em peso) com a formulação. Colocou-se a solução resultante numa caixa de luvas purgada com azoto. Adicionou-se uma solução aquosa de N, N, N ' , N '-tetramet ilet ilenediamina (40 μΐϋ, 5% em peso) à formulação de monómero para acelarar a polimerização. Verteu-se a formulação resultante num molde construído com lâminas de vidro para microscopia e um espaçador de aço inoxidável, de 100 μΜ. Depois de ser ter deixado o molde sob atmosfera de azoto durante 8 horas, colocou-se solução salina tamponada com fosfato, (10 mM, pH=7,4) separaram-se as lâminas de vidro e removeu-se o hidrogel. Lavou-se o hidrogel com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1 mM de sal sódico de lauril sulfato e 1 mM de sal tetrasódico de EDTA, durante 3 dias, sendo a solução mudada diariamente, seguido por lavagem com EtOH/PBS (20/80 em volume, 3 x 100 mL) e finalmente com PBS (pH =7,4, 3 x 100 mL) . A película de hidrogel resultante foi mantida em PBS (10 mM, pH = 7,4), contendo 0,02% em peso de azida de sódio e 1 mM de sal tetrasódico de EDTA.
Efeito da glucose e do L-lactato de sódio sobre a película de hidrogel contendo o indicador de glucose
Esta experiência foi conduzida num espectrofluo-rimetro Shimadzu RF-5301 PC equipado com um acessório de 84 ΡΕ1490350 temperatura variável. O comprimento de onda de excitação foi reguladp para 370 nm, fendas 3/3 nm, baixa sensibilidade PMT, a emissão foi pesquisada entre 400 e 600 nm. As concentrações de glucose e de L-lactato de sódio foram verificadas utilizando um analisador de glucose YSI Model 2300 STAT plus.
Montou-se a película de hidrogel (100 μιη de espessura, forma redonda - 8 mm de diâmetro) numa cuvete para PMMA, num ângulo de 45°. Aqueceram-se em banho de água, a 37°C solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH=7,4, contendo as quantidades desejadas de glucose, L-lactato de sódio e glucose com L-lactato de sódio e colocaram-se na célula de PMMA contendo a montagem de hidrogel. Após cada adição, deixou-se a célula de PMMA equilibrar durante 45 minutos a 37°C. Realizaram-se medições da intensidade de fluorescência para cada concentração de glucose/acetato em duas amostras diferentes e utilizou-se o valor médio na curva de calibração. Obtiveram-se curvas de calibração (intensidade de fluorescência a 430 nm vs. concentração para a glucose, L-lactato de sódio e glucose em presença de 3 mM de L-lactato de sódio. Os resultados são mostrados na Figura 16.
Exemplo 14
Monómero indicador 6-(carboxipropionamido)hexilamino) 85 ΡΕ1490350
Composto protegido com pinacol: 9-[N-[2-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolano)benzil]-N-[6-(3-carboxipropionamido)hexilamino]metil]antraceno
Composto não protegido: 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(3-carboxipropio-namido)hexilamino]metil]antraceno. Síntese: A síntese pode ser efectuada de forma análoga à do Exemplo 11, utilizando 9-[N-[3-(metacrilamido)-propil-amino]metil]-10-N-[6-(hexilamino)metil]antraceno como material de partida. Em contraste, faz-se reagir o material de partida amina com os esteres N-hidroxisuccinimida (NHS) do ester mono metílico do ácido succínico, em vez dos esteres NHS do ácido ciclofexanocarboxílico utilizado no Exemplo 11. É necessário um passo adicional de hidrólise da base para completar a síntese. ΡΕ1490350 86
Exemplo 15
Indicador de glucose/monómero excitado com luz visível
Nome químico: N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[[2-(borono)benzil]-[6-(N-[2-(borono)benzil]-6-N-(3-carbo-xipropanamidoetil)amino-hexil]]aminoetilamino]naftaleno-1,8-dicarboximida ΡΕ1490350 87 Fórmula química: C47H6oB2N6Oio P. m. : 8 9 0 O composto pode ser sintetizado como mostrado abaixo:
^y^y-;0 VíS^ «N.
ΡΕ1490350
Exemplo 16
Indicador alternado de glucose/monómero excitado com luz visível
Nome químico: N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)benzil]-[6-(N-[2-(borono)benzi1]-6-N-(2-metacrilamidoetil)amino-hexil]]aminoetilamino]naftaleno-1,8-dicarboximida Fórmula química: C44H57B2N5O7 P. m. : 789,5 0 composto pode ser sintetizado como mostrado abaixo: ΡΕ1490350 89
ΗΗ
Lisboa, 2 de Julho de 2010
Claims (9)
- ΡΕ1490350 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para detecção da presença ou concentração de glucose numa amostra, que pode também conter um alfa-hidroxiácido ou uma beta-dicetona, compreendendo: a) exposição da amostra a um composto selec-cionado do grupo que consiste em: 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(ciclo-hexano-carbo-xamido)hexilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxietil)-amino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(N-6-(9-antracene-carboxamido)hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]-metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(3-carboxipropio-namido)hexilamino]metil]antraceno; N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[[2-(borono)-benzil]-[6-(N-[2-(borono)benzil]-6-N-(3-carboxipropana-midoetil)amino-hexil]]aminoetilamino]-naftaleno-1, 8-dicarboximida; N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)benzil]-[6-(N-[2-(borono )benzil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)amino-hexil]]-aminoetilamino] -naftaleno-1,8-dicarboximida; e seus sais; e 2 ΡΕ1490350 b) medição de qualquer alteração na fluorescência emitida pelo composto, para assim se determinar a presença ou concentração de glucosena referida amostra, em que a presença de um alfa-hidroxiácido ou uma beta-dicetona não interfere com a referida determinação.
- 2. Método da reivindicação 1, em que a amostra é um fluido fisiológico.
- 3. Método da reivindicação 2, em que o fluido fisiológico é seleccionado do grupo que consiste em sangue, plasma, soro, fluido intersticial, fluido cerebroespinal, urina, saliva, fluido intraocular, linfa, lágrimas, suor e tampões fisiológicos.
- 4. Método da reivindicação 1, em que o composto é exposto à amostra em solução.
- 5. Método da reivindicação 1, em que o composto é imobilizado ou num suporte sólido.
- 6. Método da reivindicação 5, em que o suporte sólido é uma matriz polimérica.
- 7. Método da reivindicação 1, em que o composto está associado a um dispositivo implantável, e em que o passo a) se realiza in vivo.
- 8. Composto seleccionado do grupo que consiste em: 3 ΡΕ1490350 9- [Ν-(2-boronobenzil)-Ν-[3-(metacrilamido)propil-aminojmetil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(ciclo-hexano-carbo-xamido)hexilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[2-(carboxietil)-amino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(N-6-(9-antracene-carboxamido) hexilaminocarbonil)etilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobenzil)-N-[3-(metacrilamido)propil-amino]-metil]-10-[N-(2-boronobenzil)-N-[6-(3-carboxipropio-namido)hexilamino]metil]antraceno; N-(3-metacrilamidopropil)-4-[2-N-[[2-(borono)-benzil]-[6-(N-[2-(borono)benzil]-6-N-(3-carboxipropana-midoetil)amino-hexil]]aminoetilamino]-naftaleno-1, 8-dicarboximida; N-butil-4-[2-N-[[2-(borono)benzil]-[6-(N-[2-(borono) benzil]-6-N-(2-metacrilamidoetil)amino-hexil]]-amino-etilamino]-naftaleno-1,8-dicarboximida; e seus sais.
- 9. Sistema de detecção para detecção da presença ou concentração de glucose numa amostra que pode também conter um alfa-hidroxiácido ou uma beta-dicetona, compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 8. Lisboa, 2 de Julho de 2010
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