JP6485349B2 - 細胞培養器 - Google Patents
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Description
1.下記式(a)で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式(b)で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体:
2.上記式(a)及び(b)で表される有機基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式(A)及び(B):
3.mが1であり、Ra及びRbが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、上記2に記載の細胞培養容器;
4.上記共重合体が、さらに下記式(C)又は(D):
5.Tc及びTdが、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、Udが、水素原子を表し、Rc及びRdが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、上記4に記載の細胞培養容器;
6.下記式(a)で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式(b)で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体:
コーティングされた容器を−200℃乃至200℃にて乾燥させる工程
を含む、細胞培養容器の製造方法;
8.上記式(a)及び(b)で表される有機基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式(A)及び(B):
8.コーティング工程が、共重合体を含むワニスを用いて実施される、上記6又は7に記載の製造方法;
9.共重合体を含むワニスが、予めpH調整されている、上記8に記載の製造方法;
10.さらに、コーティングされた細胞培養容器を、乾燥工程前及び/又は後に、洗浄する工程を含む、上記6乃至9何れかに記載の製造方法;
11.乾燥工程後の洗浄が、水及び電解質を含む水溶液からなる群より選ばれる少なくとも1種の溶媒を用いて実施される、上記10に記載の製造方法;
12.さらに、コーティングされた細胞培養容器を、乾燥後に、放射線処理にて滅菌する工程を含む、上記6乃至11何れかに記載の製造方法;
13.上記1乃至5何れかに記載の細胞培養容器又は上記6乃至12何れかに記載の製造方法により製造された細胞培養容器を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法;
14.細胞培養容器中の培地が、ナノファイバー形成し細胞又は組織を浮遊させる効果を有する多糖類を含むことを特徴とする、上記13に記載の細胞凝集塊の製造方法;
15.多糖類が脱アシル化ジェランガムであることを特徴とする、上記14に記載の細胞凝集塊の製造方法。
本発明の第一の態様は、下記式(a)で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式(b)で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体:
本発明における細胞とは、動物或いは植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、DNAを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞(多能性幹細胞等)、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞(細胞株)、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞(たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞)、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞(例えば、臍帯血由来のCD34陽性細胞)、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液(臍帯血を含む)、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ES細胞、胚性生殖幹細胞、iPS細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。
がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてHBC−4、BSY−1、BSY−2、MCF−7、MCF−7/ADR RES、HS578T、MDA−MB−231、MDA−MB−435、MDA−N、BT−549、T47D、ヒト子宮頸がん細胞株としてHeLa、ヒト肺がん細胞株としてA549、EKVX、HOP−62、HOP−92、NCI−H23、NCI−H226、NCI−H322M、NCI−H460、NCI−H522、DMS273、DMS114、ヒト大腸がん細胞株としてCaco−2、COLO−205、HCC−2998、HCT−15、HCT−116、HT−29、KM−12、SW−620、WiDr、ヒト前立腺がん細胞株としてDU−145、PC−3、LNCaP、ヒト中枢神経系がん細胞株としてU251、SF−295、SF−539、SF−268、SNB−75、SNB−78、SNB−19、ヒト卵巣がん細胞株としてOVCAR−3、OVCAR−4、OVCAR−5、OVCAR−8、SK−OV−3、IGROV−1、ヒト腎がん細胞株としてRXF−631L、ACHN、UO−31、SN−12C、A498、CAKI−1、RXF−393L、786−0、TK−10、ヒト胃がん細胞株としてMKN45、MKN28、St−4、MKN−1、MKN−7、MKN−74、皮膚がん細胞株としてLOX−IMVI、LOX、MALME−3M、SK−MEL−2、SK−MEL−5、SK−MEL−28、UACC−62、UACC−257、M14、白血病細胞株としてCCRF−CRM、K562、MOLT−4、HL−60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、HEK293(ヒト胎児腎細胞)、MDCK、MDBK、BHK、C−33A、AE−1、3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(登録商標)、Vero等が含まれる。肝細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、HepG2、Hep3B、HepaRG(登録商標)、JHH7、HLF、HLE、PLC/PRF/5、WRL68、HB611、SK−HEP−1、HuH−4、HuH−7等が挙げられる。
本発明の細胞培養容器を構成する、共重合体がコーティングされる容器は、当技術分野で使用され得る任意の形態の容器類であればよく、例えば、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン(登録商標)バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等が挙げられる。好ましくは、6〜1536穴のマルチウェルプレート及びシャーレが挙げられる。
本発明の細胞培養容器は、容器の表面の少なくとも一部が、特定の共重合体でコーティングされていることを特徴とする。本発明に係る共重合体は、下記式(a)で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式(b)で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体:
本発明において、「ハロゲン化物イオン」は、ハロゲン原子のアニオンを意味し、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンが挙げられ、好ましくは、塩化物イオンである。
本発明において、「無機酸イオン」とは、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン又はホウ酸イオンを意味する。
上記An−として好ましいのは、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンであり、特に好ましいのはハロゲン化物イオンである。
上記共重合体中における第三成分、例えば、上記式(C)又は(D)で表される2官能性モノマーから誘導される架橋構造の割合は、0モル%乃至50モル%である。
本発明に係る共重合体の合成方法としては、一般的なアクリルポリマー又はメタクリルポリマー等の合成方法であるラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合などの方法により合成することができる。その形態は溶液重合、懸濁重合、乳化重合、塊状重合など種々の方法が可能である。
本発明の第二の態様は、下記式(a)で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式(b)で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体:
コーティングされた容器を−200℃乃至200℃にて乾燥させる工程
を含む、細胞培養容器の製造方法である。
本発明の細胞培養容器の製造方法のコーティング工程では、共重合体を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする。例えば、容器が丸底のマルチウェルプレートである場合、ウェルのくぼみの部分のみをコーティングしてもよいが、プレート全体をコーティングしてもよい。ここで、容器及び共重合体は、それぞれ前述の項目<容器>及び<共重合体>で述べた通りである。
コーティング工程後、コーティングされた容器を−200℃乃至200℃の温度にて乾燥させる。乾燥により、上記コーティング膜形成用組成物中の溶媒を取り除くと共に、本発明に係る共重合体の式(a)及び式(b)同士がイオン結合を形成して基体へ完全に固着する。本発明の血液フィルターのコーティングの膜厚は、好ましくは10〜1000Åであり、さらに好ましくは10〜500Åである。本発明者らは、本発明の細胞培養容器の製造方法では、高温での処理を要さず、低温での処理により、所望の特性を有するコーティングが容器の表面に形成され、しかも数十乃至数百Å程度の薄い膜厚にも係らず、耐久性に優れることを見出した。
本発明の第三の態様は、本発明の細胞培養容器及び本発明の製造方法により得られた細胞培養容器(以下、両者を合わせて「本発明の細胞培養容器」という)を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法である。本発明の細胞培養容器を用いると、細胞凝集塊の容器の表面(壁面)への付着が抑制され、かつコーティングの培養液への溶出が抑制されることから、容器からの刺激のない状態で細胞凝集塊を培養することができる。細胞凝集塊は、好ましくは、本発明の細胞培養容器中で細胞又は組織を浮遊させる効果を有する多糖類(特に、脱アシル化ジェランガム)を含むことを特徴とする培地を用いて培養される。そのような培地の具体的な組成や、培養方法は、例えば、国際公開第2014/017513号公報に開示されている。
リン含有化合物を含む原料の、各リン含有化合物の濃度(質量%)測定は、31P−NMRにより行った。下記標準物質を用いて原料中に含まれる各リン含有化合物の絶対濃度(絶対質量%)を算出した。
・モード:逆ゲートデカップリングモード(定量モード)
・装置:varian 400 MHz
・溶媒:CD3OD(重メタノール)(30重量%)
・回転数:0 Hz
・データポイント:64000
・フリップ角:90°
・待ち時間:70 s
・積算回数:16回,n=4,
・標準物質:トリメチルリン酸+D2O (75%TMP溶液を調製)
アシッドホスホオキシエチルメタアクリレート(製品名;ホスマーM、ユニケミカル社製、乾固法100℃・1時間における不揮発分:91.8%、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート(44.2質量%)、リン酸ビス[2−(メタクリロイルオキシ)エチル](28.6質量%)、その他の物質(27.2質量%)の混合物)6.00gに純水12.40gを加え十分に溶解し、エタノール12.40g、メタクリル酸2−(ジメチルアミノ)エチル4.12g(東京化成工業(株)社製)、2、2’−アゾ(2−メチル−N−(2−ヒドロキシエチル)プロピオンアミド)(製品名;VA−086、和光純薬社製)0.10gを20℃以下に保ちながら順に加え滴下ロートに導入した。一方で、純水471.13g、エタノール37.20gを冷却管付きの3つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。この状態を維持しつつ、混合液を導入した滴下ロートをセットし、0.5時間で混合液を純水とエタノールの沸騰液内に滴下した。滴下後、24時間環境を維持した状態で加熱撹拌することで固形分約2質量%の透明重合液506.05gを得た。得られた透明液体のGFCにおける重量平均分子量は約810,000であった。その後、共重合体含有ワニス1.00gに、純水0.9g、エタノール0.1gを加えて十分に攪拌し、表面処理剤L1(固形分1質量%)を調製した。
アシッドホスホオキシエチルメタアクリレート(製品名;ホスマーM、ユニケミカル(株)社製、乾固法100℃・1時間における不揮発分:91.8%、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート(44.2質量%)、リン酸ビス[2−(メタクリロイルオキシ)エチル](28.6質量%)、その他の物質(27.2質量%)の混合物)10.00gに純水68.88gを加え十分に溶解し、エタノール29.52g、メタクリル酸2−(ジメチルアミノ)エチル7.63g(東京化成工業(株)社製)、2,2’−アゾビス[N−(2―カルボキシエチル)−2−メチルプロピオンアミジン](製品名;VA−057、和光純薬工業(株)社製)0.09gを20℃以下に保ちながら順に加え滴下ロートに導入した。一方で、純水373.89g、エタノール29.52gを冷却管付きの3つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。この状態を維持しつつ、混合液を導入した滴下ロートをセットし、0.5時間で混合液を純水とエタノールの沸騰液内に滴下した。滴下後、24時間環境を維持した状態で加熱撹拌することで固形分約3.5質量%の透明重合液509.60gを得た。得られた透明液体のGFCにおける重量平均分子量は約280,000であった。その後、共重合体含有ワニス1.00gに、純水1.56g、エタノール0.94gを加えて十分に攪拌し、表面処理剤L2(固形分1質量%)を調製した。
以下の各処理工程を順番に実施し、本発明における細胞培養容器を調製した。
処理1:合成例1或いは2で作成した表面処理剤(L1又はL2)を、メッシュサイズが0.22μmのフィルターを用いてろ過した後、96穴細胞培養プレート(下記試験例参照)のウェルに200μL(固形分1質量%)/ウェルとなるよう添加し、室温にて1時間静置後、余剰の表面処理剤を除去した。
<方法−1>:通常条件
コーティング済みの96穴タイタープレートを遮光・防湿・酸素バリヤー性を持つアルミ/PETラミネートフィルムからなるチャック付ガス不透過性包装容器(製品名;ラミジップAL−22、生産日本社製)に入れ、大気雰囲気下で密封し、約24時間以上放置してからガンマ線を15kGy照射し滅菌を行った。
<方法−2>:真空条件
コーティング済みの96穴タイタープレートを遮光・防湿・酸素バリヤー性を持つアルミ/PETラミネートフィルムからなるチャック付ガス不透過性包装容器(製品名;ラミジップAL−22、生産日本社製)に入れ、バキュームシーラーを用いて真空下で加熱密封し、約24時間以上放置してからガンマ線を15kGy照射し滅菌を行った。
<方法−3>:酸化防止剤・乾燥剤同梱・真空条件
コーティング済みの96穴タイタープレートと、乾燥剤(製品名;シリカゲルMix、豊田化工社製)と、脱酸素剤(製品名;セキュールAP−500、ニッソーファイン社製)を遮光・防湿・酸素バリヤー性を持つアルミ/PETラミネートフィルムからなるチャック付ガス不透過性包装容器(製品名;ラミジップAL−22、生産日本社製)に入れ、バキュームシーラーを用いて真空下で加熱密封し、約24時間以上放置してからガンマ線を15kGy照射し滅菌を行った。;
(コーティングプレートの調製)
実施例1に示したコーティング法により平底96穴細胞培養プレート(BDバイオサイエンス社製、#351172)のウェルを、表面処理剤L1又はL2にてコーティングした。この際、γ線滅菌方法は<方法−1>を用いた。陰性対象としては、コーティング処理をしていないプレートを用いた。陽性対照のサンプルとしては、市販の細胞低接着プレート(コーニング社製、#3474)を用いた。
細胞は、ヒト胎児腎細胞株Hek293(DSファーマバイオメディカル社製)、ヒト肝癌細胞株HepG2(DSファーマバイオメディカル社製)、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7(DSファーマバイオメディカル社製)を用いた。
それら細胞の培養に用いた培地は、Hek293:10%(v/v)FBSを含むEMEM培地(WAKO社製)、HepG2:10%(v/v)FBSを含むDMEM培地(WAKO社製)、RAW264.7:10%(v/v)FBSを含むDMEM/F−12培地(シグマ社製)を用いた。細胞は、37℃CO2インキュベーター内にて5%二酸化炭素濃度を保った状態で、直径10cmのシャーレ(培地10mL)を用いて2日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をPBS5mlで洗浄した後、トリプシン−EDTA溶液(インビトロジェン社製)1mLを添加して細胞を剥がし、上記の培地10mLにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離(久保田商事株式会社製、型番5900、1500rpm/3分、室温)後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
上記にて調製したプレートに対して、それぞれの細胞懸濁液を2×104cells/wellとなるように各100μL加えた。その後、5%二酸化炭素濃度を保った状態で、37℃で4日間CO2インキュベーター内にて静置した。
培養4日間後、表面処理剤L1又はL2にてコーティングした平底96穴タイタープレート、陰性対照、陽性対照に対する細胞の付着を倒立型顕微鏡(オリンパス社製、CKX31)による観察に基づき比較した。その結果を下記表1に示す。また、細胞観察の代表例として表面処理剤L1でコーティングしたプレートにて培養したHepG2細胞の顕微鏡写真(倍率:40倍)を図1に示す。
(コーティングプレートの調製)
実施例1に示したコーティング法により平底96穴細胞培養プレート(BDバイオサイエンス社製、#351172)のウェルを、表面処理剤L1にてコーティングした。この際、γ線滅菌方法は<方法−1><方法−2><方法−3>を用いた。陰性対象としては、コーティング処理をしていないプレートを用いた。
細胞は、ヒト胎児腎細胞株Hek293(DSファーマバイオメディカル社製)を用いた。本細胞の培養には、10%(v/v)FBSを含むEMEM培地(WAKO社製)を用いた。細胞は、37℃CO2インキュベーター内にて5%二酸化炭素濃度を保った状態で、直径10cmのシャーレ(培地10mL)を用いて2日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をPBS5mlで洗浄した後、トリプシン−EDTA溶液(インビトロジェン社製)1mLを添加して細胞を剥がし、上記の培地10mLにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離(久保田商事株式会社製、型番5900、1500rpm/3分、室温)後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
上記にて調製したプレートに対して、Hek293細胞懸濁液を2×104cells/wellとなるように各100μL加えた。その後、5%二酸化炭素濃度を保った状態で、37℃で4日間CO2インキュベーター内にて静置した。
培養4日間後、表面処理剤L1にてコーティングした平底96穴タイタープレート及び陰性対照に対する細胞の付着を倒立型顕微鏡(オリンパス社製、CKX31)による観察に基づき比較した。その結果を下記表2に示す。
(コーティングプレートの調製)
実施例1に示したコーティング法によりU字底96穴細胞培養プレート(BDバイオサイエンス社製、#353227)のウェルを、表面処理剤L1又はL2にてコーティングした。この際、γ線滅菌は実施しなかった。陰性対象としては、コーティング処理をしていないプレートを用いた。陽性対照のサンプルとしては、市販の細胞低接着プレート(住友ベークライト社製、#MS−9096U)を用いた。
細胞は、ヒト肝癌細胞株HepG2(DSファーマバイオメディカル社製)を用いた。本細胞の培養には、10%(v/v)FBSを含むDMEM培地(WAKO社製)を用いた。細胞は、37℃CO2インキュベーター内にて5%二酸化炭素濃度を保った状態で、直径10cmのシャーレ(培地10mL)を用いて2日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をPBS5mlで洗浄した後、トリプシン−EDTA溶液(インビトロジェン社製)1mLを添加して細胞を剥がし、上記の培地10mLにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離(久保田商事株式会社製、型番5900、1500rpm/3分、室温)後、上清を除き、上記の培地或いは終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地を用いて細胞懸濁液をそれぞれ調製した。ここで、0.015%(w/v)の脱アシルジェランガムを添加した培地は以下の様に調製した。すなわち、脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli−Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を10%(v/v)FBSを含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムとなるようによく撹拌しながら添加した。
上記にて調製したプレートに対して、それぞれの細胞懸濁液を2×103cells/wellとなるように各100μL加えた。その後、5%二酸化炭素濃度を保った状態で、37℃で5日間CO2インキュベーター内にて静置した。
培養5日間後、表面処理剤L1又はL2にてコーティングしたU字底96穴タイタープレート、陰性対照、陽性対照に対する細胞の付着を倒立型顕微鏡(オリンパス社製、CKX31)による観察に基づき比較した。その結果を下記表3に示す。また、細胞観察の代表例として表面処理剤L1にてコーティングしたプレートにて培養したHepG2細胞の顕微鏡写真(倍率:40倍)を図2に示す。
Claims (14)
- 下記式(a)で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式(b)で表される有機基を含む繰り返し単位とを含み、細胞の付着抑制能を有する(メタ)アクリルポリマー:
式中、
Ua1、Ua2は、水素原子を表し、Ub1、Ub2及びUb3は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数1乃至5の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、そしてAn−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す
が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞の容器表面への付着が抑制された細胞培養容器。 - 上記式(a)及び(b)で表される有機基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式(A)及び(B):
式中、
Ua1、Ua2は、水素原子を表し、Ta、Tb、Ub1、Ub2及びUb3は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数1乃至5の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Qa及びQbは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ra及びRbは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1乃至10の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、An−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し、そしてmは、0乃至6の整数を表す
で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位である、請求項1に記載の細胞培養容器。 - mが1であり、Ra及びRbが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、請求項2に記載の細胞培養容器。
- 上記(メタ)アクリルポリマーが、さらに下記式(C)又は(D):
式中、
Tc、Td及びUdは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数1乃至5の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Rc及びRdは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1乃至10の直鎖又は分岐アルキレン基を表す
で表されるモノマーから誘導される架橋構造を含む、請求項1乃至3何れかに記載の細胞培養容器。 - Tc及びTdが、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、Udが、水素原子を表し、Rc及びRdが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、請求項4に記載の細胞培養容器。
- 下記式(a)で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式(b)で表される有機基を含む繰り返し単位とを含み、細胞の付着抑制能を有する(メタ)アクリルポリマー:
式中、Ua1、Ua2は、水素原子を表し、Ub1、Ub2及びUb3は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数1乃至5の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、そしてAn−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す
を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする工程;及び
コーティングされた細胞培養容器を−200℃乃至200℃にて乾燥させる工程
を含む、細胞の容器表面への付着が抑制された細胞培養容器の製造方法。 - 上記式(a)及び(b)で表される有機基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式(A)及び(B):
式中、
Ua1、Ua2は、水素原子を表し、Ta、Tb、Ub1、Ub2及びUb3は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数1乃至5の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Qa及びQbは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ra及びRbは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1乃至10の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、An−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し、そしてmは、0乃至6の整数を表す
で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位である、請求項6に記載の製造方法。 - コーティング工程が、上記(メタ)アクリルポリマーを含むワニスを用いて実施される、請求項6又は7に記載の製造方法。
- 上記(メタ)アクリルポリマーを含むワニスが、予めpH調整されている、請求項8に記載の製造方法。
- さらに、コーティングされた細胞培養容器を、乾燥工程前及び/又は後に、洗浄する工程を含む、請求項6乃至9何れか1項に記載の製造方法。
- 乾燥工程後の洗浄が、水及び電解質を含む水溶液からなる群より選ばれる少なくとも1種の溶媒を用いて実施される、請求項10に記載の製造方法。
- 請求項1乃至5何れか1項に記載の細胞培養容器又は請求項6乃至11何れか1項に記載の製造方法により製造された細胞培養容器を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法。
- 細胞培養容器中の培地が、細胞又は組織を浮遊させる効果を有する多糖類を含むことを特徴とする、請求項12に記載の細胞凝集塊の製造方法。
- 多糖類が脱アシル化ジェランガムであることを特徴とする、請求項13に記載の細胞凝集塊の製造方法。
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